酵素基質としての新規フェノキサジノン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｏｎｅ）誘導体、及び、ペプチダーゼ活性を有する微生物の検出における指標としてのその使用
【課題】酵素基質としての新規フェノキサジノン誘導体、及び、ペプチダーゼ活性を有する微生物の検出における指標としてのその使用
【解決手段】本発明は、下記一般式を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである新規の酵素基質、これを含む反応媒体、並びに、少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するためのその使用に関する。
【解決手段】本発明は、下記一般式を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである新規の酵素基質、これを含む反応媒体、並びに、少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するためのその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチダーゼ活性を検出するための新規の発色性酵素基質に関する。上記基質は、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において、酵素加水分解により物理化学的なシグナルを発する段階を含む用途に使用できる。既存の基質の大部分は蛍光性であるのに対し、本発明の発色性基質は着色を生じ、この着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるので、微生物検出用のゲル化媒体においてこの発色性基質を特に使用できる。
【０００２】
また、本発明は、この基質を含む反応媒体、並びに、グラム陰性菌、グラム陽性菌及びペプチダーゼ活性を示す酵母を検出するための上記基質又は上記媒体の使用、並びに、その使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
「アミノペプチダーゼ」という名称は一般的に、アミノ酸のアシル基と第一級アミンの間のアミド基を加水分解して切断できる酵素に対して付与され、「ペプチダーゼ」という名称は、ペプチドのアシル基と第一級アミンの間のアミド基を加水分解して切断できる酵素に対して付与される。本出願においては、「ペプチダーゼ」という用語は、必要に応じて、上記に定義したペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼの両方を指す可能性がある。
【０００４】
ペプチダーゼ活性検出用の拡散しない発色性酵素基質が文献中に記載されていて、従来技術から既に公知である。例えば、この基質は、本出願人による特許文献１及び特許文献２の範囲内に含まれる。しかし、この基質には、合成が困難であり、純度が低く、かつ、収率が低いといった様々な問題がある。また、培養基中で使用する際には、培養基の組成を非常に正確に定義しなければ着色を観察できない。現在のところ文献に記載されている基質のうちこの基質以外では、混合培養において固形媒体中で使用して微生物を検出できるものはない。
【０００５】
フェノキサジノンに由来する物質は蛍光を発することができることが知られている。上記物質は、
−例えば非特許文献１中に記載されるように、酸−塩基指示薬として、又は、
−非特許文献２中に記載されるように、例えばタンパク質のコンホメーション変化を追従するための、蛍光標識として使用可能である。
【０００６】
フェノキサジノン誘導体は以前は酵素基質としては使用されていなかった。
【特許文献１】ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９８／０４７３５
【特許文献２】ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９９／３８９９５
【非特許文献１】Ｓｔｕｚｋａ，Ｖ．ら，１９６３，Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８，１３９９−１４０７
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｊ．ら，２００１，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７３（１３），２９２０−２９２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明によれば、ペプチダーゼ活性を示す微生物を検出するための新規の発色性酵素基質が提案される。また、本発明は、この基質を含む反応媒体、及び、ペプチダーゼ活性を検出するための上記基質又は上記媒体の使用、及び、その使用方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実際、本出願人は予想外にも、発色性フェノキサジノン誘導体の発する着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるため、培養基中のコロニーの着色の変化によりペプチダーゼ活性を実証できることから、これを使用することによりペプチダーゼ活性を示す微生物を検出可能であることを発見した。
【０００９】
本発明の基質を含む反応媒体に試験する微生物を播種すると、この微生物が基質を加水分解できない場合にはコロニーの色は無色から白色となる。一方、この微生物が本発明の基質を加水分解できる場合には、コロニーが着色される。
【００１０】
本発明のフェノキサジノン誘導体は、発色性かつ蛍光性であり、検出感度が良好であるという利点を有する。
【００１１】
従って、本発明の主題は、
式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
【００１３】
：の発色性酵素基質であって、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００１４】
【化２】
【００１５】
：のナフタレン環、又は、式：
【００１６】
【化３】
【００１７】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００１８】
【化４】
【００１９】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し
（但し、
（ｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、Ｒ３及びＲ４は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表し（但し、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、Ｒ６はハロゲン原子を表す）、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない。
【００２０】
本発明によれば、「アリール」という用語は特に、Ｃ６〜Ｃ１０芳香環、特にフェニル環、ベンジル環、１−ナフチル環又は２−ナフチル環を意味するものとする。アラルキル基のアリール部についても同様である。
【００２１】
また、本発明による、アラルキル基及びカルボキシアルキル基におけるアルキルは、Ｃ１〜Ｃ６である。
【００２２】
「Ｃ１〜Ｃ６のアルキル」という用語は、炭素原子を１〜６つ有する直鎖又は分岐のアルキルを意味するものとする。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基及びヘキシル基を挙げることができる。
【００２３】
「ハロゲン原子」という用語は、塩素、臭素、ヨウ素及びフッ素を意味するものとする。
【００２４】
「ヘテロ原子」という用語は、Ｏ、Ｎ又はＳ等の炭素原子以外の原子を意味するものとする。
【００２５】
Ｒ’及びＲ’’により形成可能な複素環の大きさは任意であってよいが、５〜７員環であることが好ましい。
【００２６】
複素環の例としては、モルホリン環、ピペラジン環、ピペリジン環、ピロリジン環及びイミダゾリジン環が含まれる。
【００２７】
本発明に記載される置換基Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４によって形成される様々なナフタレン環及びクマリン環は、破線を含んで表され、この破線は対応する置換基を伴って完成されてより明瞭となり、また、本発明の式（Ｉ）のフェノキサジノン誘導体におけるこれらの環の位置は外観上確認できる。
【００２８】
本発明によるブロック基には、アミンを保護可能な当業者に公知の任意のブロック基が含まれる。例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｎ−ｔＢＯＣ）、９−フルオレニルオキシカルボニル基、スクシニル基等の可溶性基、又は、ピペコリン酸等の代謝不可能なアミノ酸、すなわち非天然アミノ酸が挙げられる。
【００２９】
ブロック基は、本発明の化合物中に系統的には存在していない。従って、本発明の化合物がブロック基を有していない（Ｘがない）場合、本発明の化合物は塩化物、臭化物又はトリフルオロ酢酸塩等の塩の形態である。
【００３０】
式（Ｉ）中においてＡで表すアミノ酸は、当業者に公知の任意のアミノ酸である。
【００３１】
本発明のある実施形態によれば、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大１０つのアミノ酸を有するペプチドを表す。基質にかかるコストの都合上、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大４つのアミノ酸を有するペプチドを表すことが好ましい。
【００３２】
ある実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉ）：
【００３３】
【化５】
【００３４】
：を有し、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００３５】
【化６】
【００３６】
：のナフタレン環、又は、式：
【００３７】
【化７】
【００３８】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００３９】
【化８】
【００４０】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
（但し：
（ｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、Ｒ３及びＲ４は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
（但し：
（ｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環又はクマリン環を形成する場合、Ｒ６は水素原子を表し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４が自身が結合しているフェニル環と共にベンゼン環を形成する場合、Ｒ６はハロゲン原子を表す）、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない。
【００４１】
別の実施形態によれば、本発明の化合物は、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成するか、そうでなければＲ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成するか、そうでなければＲ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、他の置換基は上述の通りであり、但し、Ｒ１／Ｒ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環又はクマリン環を形成する場合、Ｒ３／Ｒ４が自身が結合しているフェニル環と共に同時にナフタレン環を形成することはなく、逆の場合も同じであるような式（Ｉ）の化合物から選択される。
【００４２】
従って、この実施形態によれば、上記酵素基質は下記式（Ｉ）：
【００４３】
【化９】
【００４４】
：の化合物であって、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００４５】
【化１０】
【００４６】
：のナフタレン環、又は、式：
【００４７】
【化１１】
【００４８】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００４９】
【化１２】
【００５０】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し（但し：Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４のうち一方のみが自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成する）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない。
【００５１】
本発明のある実施形態によれば、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大１０つのアミノ酸を有するペプチドを表す。Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大４つのアミノ酸を有するペプチドを表すことが好ましい。
【００５２】
特定の実施形態によれば、本発明の化合物は下記式（Ｉａ）：
【００５３】
【化１３】
【００５４】
：を有する酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００５５】
式（Ｉａ）の化合物は、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、かつ、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素原子である式（Ｉ）の化合物である。
【００５６】
好ましくは、式（Ｉａ）の化合物において、Ｒ５は水素原子を表し、Ｒ６は水素原子又は塩素原子等のハロゲン原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない。
【００５７】
別の特定の実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉｂ）：
【００５８】
【化１４】
【００５９】
：の酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００６０】
式（Ｉｂ）の化合物は、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成し、かつ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６がそれぞれ水素原子である式（Ｉ）の化合物である。
【００６１】
好ましくは、本発明の式（Ｉｂ）の化合物において、Ｒ５は水素原子であり、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基又はカルボキシアルキル基を表すか、そうでなければＲ７及びＲ８は自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない。
【００６２】
更に別の特定の実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉｃ）：
【００６３】
【化１５】
【００６４】
：の酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９，Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００６５】
式（Ｉｃ）の化合物は、Ｒ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、かつ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ水素原子である式（Ｉ）の化合物である。
【００６６】
好ましくは、式（Ｉｃ）の化合物において、Ｒ５、Ｒ６及びＲ９基はそれぞれ水素原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない。
【００６７】
更に別の実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉｄ）：
【００６８】
【化１６】
【００６９】
：の酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００７０】
式（Ｉｄ）の化合物は、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物である。
【００７１】
本発明の化合物は、Ｒ１／Ｒ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、又は、Ｒ１／Ｒ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成する場合、又は、Ｒ３／Ｒ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、又は、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合のいずれにおいても、Ｒ１／Ｒ２基及びＲ３／Ｒ４基が形成する環に応じたいくつかの製造方法によって調製可能である。
【００７２】
従って、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム１に表す方法によって調製可能である。
【００７３】
【化１７】
【００７４】
上記スキーム１によれば、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は次のように調製される。適切な２−アミノ−５−ニトロフェノール化合物（ａ）と、予め沸点まで加熱した後で２５℃に冷却した適切なハロゲン化１，４−ナフトキノン（ｂ）とを反応させて、対応する９−ニトロベンゾ［ａ］フェノキサジノン（ｃ）を形成する。続いて、この化合物ｃを、銅ＩＩアセチルアセトナートを予め水素化ホウ素ナトリウムと反応させた混合物と反応させて、化合物（ｄ）を形成する。その後、化合物（ｄ）を、一種以上の任意に保護されたアミノ酸（６）と共に約−１２℃に冷却した浴中で反応させて、式（Ｉ）の化合物を得る。注目すべきは、言うまでもなく、Ａが単一のアミノ酸である場合、化合物（６）中のＡ’は化合物（Ｉ）のＡに相当し、更に水酸基を含むということである。言い換えると、Ａが単一のアミノ酸である場合、Ａ’の末端は−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、Ａは−Ｃ（Ｏ）−を介して−ＮＨ−に結合していて−ＯＨを有していないということである。また、Ａが少なくとも２つのアミノ酸の鎖である場合には、Ａ’の末端アミノ酸は上記の通りである、すなわち、Ａの末端アミノ酸に関して、水酸基を更に含む。
【００７５】
Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、かつ、Ｒ６が水素原子である式（Ｉａ）の化合物は、下記のスキーム１ａ中に記載する方法によって調製可能である。
【００７６】
【化１８】
【００７７】
このスキーム１ａによれば、式（Ｉａ）の化合物は次のように調製される。適切な３−アセトアミドフェノール化合物（１）と亜硝酸ナトリウム（Ｘ＝Ｎａ）又は亜硝酸カリウム（Ｘ＝Ｋ）等の亜硝酸塩（２）とを−３℃において反応させる。続いて、こうして得られたニトロソアセトアミドフェノール（３）と１，３−ジヒドロキシナフタレン（４）とをブタノール等の溶媒中で、約７０℃に加熱して濃硫酸を添加し、９０℃まで加熱し続けた後冷却することにより反応させ、適切な９−アセトアミドベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンを形成する。続いて、この化合物を穏やかに濃縮した硫酸と共に加熱することによって加水分解し、９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（５）を得る。最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００７８】
Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム２に表す方法によって調製可能である。
【００７９】
【化１９】
【００８０】
上記スキーム２によれば、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成し、かつ、式（Ｉ）の化合物の概略的な定義の中で示されるようにＲ６が水素原子である式（Ｉ）の化合物は、次のように調製される。適切なｐ−フェニレンジアミン誘導体（７）を化合物（８）の存在下で酸化及び塩素化して、Ｗｉｌｌｓｔａｅｔｔｅｒ及びＭａｙｅｒの方法（１９０４，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，３７：１４９８）によりＮ，Ｎ’−ジクロロ−ｐ−ベンゾキノンジイミン（９）を得る。続いて、この化合物をアルコール溶液中で５，７−ジヒドロキシクマリン（１０）と反応させ、適切な７−アミノ−１，２−ピロニルフェノキサジン−３−オン（１１）を得る。最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００８１】
式（Ｉ）の化合物においてＲ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成している式（Ｉｂ）の化合物は、言うまでもなく、上記の方法で調製可能である。
【００８２】
従って、Ｒ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム３に表す方法によって調製可能である。
【００８３】
【化２０】
【００８４】
上記スキーム３によれば、Ｒ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、次のように調製される。適切な２−ナフトール（１２）と適切な４−ニトロフェノール（１３）とをＦｉｓｃｈｅｒ及びＨｅｐｐの方法（参照：３６．２，１８０７，１９０３）によって縮合して、適切なナフトフェノキサゾン（１４）を得る。続いて、この化合物（１４）をＫｅｈｒｍａｎ及びＧｏｔｔｒａｕの方法（参照：３８，２５７４，１９０５）によってヒドロキシルアミン塩酸塩（１５）と反応させ、ヒドロキシイミン及びアミノケトン（それぞれ化合物１６及び１７）を得る。最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００８５】
式（Ｉ）の化合物においてＲ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成している式（Ｉｃ）の化合物は、言うまでもなく、上記の方法で調製可能である。
【００８６】
最後に、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する本発明の式（Ｉ）の化合物（式（Ｉｄ）の化合物）は、下記スキーム４に表す方法によって調製可能である。
【００８７】
【化２１】
【００８８】
上記スキーム４によれば、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、次のように調製される。適切な１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸（１８）と適切な２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（１９）とを縮合して、適切なジナフトキサゾンスルホン酸（２０）を得る。続いて、この化合物（２０）をアンモニウムの存在下で加熱してアミノジナフトキサゾン（２１）を得る。この方法の最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００８９】
上記の方法において、開始反応物質（化合物（１）、（２）、（４）、（６）、（７）、（８）、（１０）、（１２）、（１３）、（１５）、（１８）及び（１９））は、特にアルドリッチ社から、市販されており入手可能である。
【００９０】
また、本発明の主題は、少なくとも一種の上記式（Ｉ）の発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した反応媒体に関する。
【００９１】
事実上、本発明の化合物を含む反応媒体中に又はその上にペプチダーゼ活性を示す微生物を播種すると、着色が生じ、この着色は反応媒体中に又はその上に拡散せずにコロニーの中に集まる。
【００９２】
「本発明の反応媒体」という用語は、少なくとも一種の微生物の少なくとも一種の酵素活性を顕現させることができる媒体を意味するものとする。
【００９３】
この反応媒体は、視覚化用の媒体のみとしても使用可能であり、また、培養基及び視覚化用の媒体の両方としても使用可能である。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応媒体が、本発明の特定の実施形態を構成する培養基でもある。
【００９４】
反応媒体は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形媒体」という用語は、例えばゲル化媒体を意味するものとする。
【００９５】
微生物を培養するために微生物学において従来から使用される固形媒体は寒天であるが、ゼラチン又はアガロースも使用可能である。例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒ、Ｔｒｙｐｃａｓｅ ｓｏｙ ａｇａｒ、マッコンキー寒天（Ｍａｃ Ｃｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用可能である。
【００９６】
反応媒体が培養基でもある場合、この反応媒体はゲル状であることが好ましい。
【００９７】
反応媒体中における寒天の量は、２〜４０ｇ／ｌ、好ましくは９〜２５ｇ／ｌである。
【００９８】
本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用可能である。
【００９９】
反応媒体中における本発明の酵素基質の濃度は０．０２５〜０．４０ｇ／ｌ、有利には０．０５ｇ／ｌである。というのは、この基質濃度である場合には着色のコントラストが良好だからである。
【０１００】
反応媒体は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも一種の他の基質を含んでいてよい。この他の基質の酵素加水分解により、本発明の基質によって検出されるシグナルとは異なる（例えば、色の異なる又は蛍光の異なる）検出可能なシグナルが生じるため、一種以上の微生物について検出、識別及び／又は定量等の実証が可能である。
【０１０１】
他の特異的な基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコシド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）若しくは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）等のインドキシル型の基質、又は、微生物の検出に使用される他の任意の基質を挙げることができる。
【０１０２】
他の特異的な酵素基質の濃度は、一般的に０．０１〜２ｇ／ｌである。当業者であれば、使用する基質に応じて上記濃度を容易に決定できるであろう。
【０１０３】
また、反応媒体は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、無機物、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩又は金属塩等の一種以上の成分を組み合わせて含んでいてよい。媒体の例が、本出願人によるヨーロッパ特許ＥＰ６５６４２１及びＰＣＴ出願ＷＯ９９／０９２０７中に記載されている。
【０１０４】
従って、本発明の酵素基質及び反応媒体は、ペプチダーゼ活性を有する微生物の分析において有用である。
【０１０５】
従って、本発明の主題はまた、少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための、式（Ｉ）の発色性酵素基質又は上記反応媒体の使用である。
【０１０６】
また、本発明は、
少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための方法であって、
・上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の他の酵素活性と共に顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
にも関する。
【０１０７】
上記播種段階及びインキュベート段階は、当業者に広く知られている。
【０１０８】
例えば、インキュベート時の温度は３７℃である。また、インキュベート時の雰囲気は、嫌気的であっても好気的であってもよい。しかし、酵素活性が良好となるため、インキュベートは好気的条件下で実施されるのが好ましい。
【０１０９】
上記顕現は、反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まる着色の変化を視覚化することにより、肉眼で実施される。
【０１１０】
本発明の酵素基質によって分析可能な微生物としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び酵母を挙げることができる。
【０１１１】
グラム陰性菌としては、次の属の細菌を挙げることができる：シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プローテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ菌、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属及びレジオネラ属。
【０１１２】
グラム陽性菌としては、次の属の細菌を挙げることができる：エンテロコッカス菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス、リステリア菌、クロストリジウム属、マイコバクテリウム属及びコリネバクテリウム属。
【０１１３】
酵母の例としては、次の属の酵母が含まれる：カンジダ属、クリプトコッカス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【０１１４】
分析する生体試料は、唾液、血液、尿若しくは糞便といった任意の臨床試料、又は、その分析が臨床医による診断を援助可能な他の任意の試料である。また、上記試料は、病原微生物が存在しないことを確認する必要のある又は汚染叢数を計数する必要のある又は特定の微生物を検出する必要のある、食品産業及び／又は医薬産業に由来する製品又はこれらの産業における原料の試料であってもよい。
【０１１５】
Ａがアラニンである本発明の発色性基質は、グラム陰性菌とグラム陽性菌とを識別可能であるという利点を有する。
【０１１６】
従って、本発明の別の主題は、
細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがアラニンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
からなる。
【０１１７】
Ａがプロリンである発色性基質は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母とを識別可能であるという利点を有する。
【０１１８】
従って、本発明の別の主題は、
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがプロリンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・インキュベートしておき、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
本発明は以下の実施例によってより明瞭に理解されるであろう。しかし、これらの実施例はいかなる制限を加えるものでもない。
【実施例１】
【０１２０】
「９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈである化合物（５））の合成」
１．１＜２−ニトロソ−５−アセトアミドフェノールの調製＞
３−アセトアミドフェノール（アルドリッチ社）９ｇを、水酸化ナトリウム２．８ｇを含む水溶液（１００ｍｌ）中に溶解させた。この溶液を氷塩浴を使用して−３℃に冷却し、亜硝酸ナトリウム５ｇを水（１２ｍｌ）中に溶解させた溶液を添加した。
【０１２１】
得られた溶液を撹拌しながら、この溶液中に、リン酸を等量の水（２５ｍｌ）で希釈した溶液を分液漏斗を使用して添加した。この添加は、温度が０℃以下に維持されるような速度で実施した。その後、赤褐色の沈殿が形成された。更に１時間激しく撹拌した後でｐＨを測定し、酸性（ｐＨ＜２）であること確認した。
【０１２２】
こうして得られた濃厚な懸濁液をろ過し、残渣を冷水で入念に洗浄して、過剰な酸及び塩を除去した。適切な吸引を実施した後、残渣を減圧デシケーター中で乾燥させた。２−ニトロソ−５−アセトアミドフェノール７．３６ｇが収率６８．６％で得られた。
【０１２３】
１．２＜９−アセトアミドベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
撹拌及び７０℃に加熱しながら、上記１．１項で得られた粗生成物１．８ｇ及び１，３−ジヒドロキシナフタレン（アルドリッチ社）１．６０ｇをブタン−１−オール５０ｍｌ中に溶解させた。この加熱した溶液中に濃硫酸１ｇを滴下し、９０℃になるまで加熱を続けた。３０分後、この混合物を冷却した。固体相を吸引ろ過によって除去し、少量のエタノールで洗浄した。乾燥させた後、表題の化合物が収率７６％で得られた。
【０１２４】
得られた物質を、移動相として酢酸エチル／トルエン（３：１）を使用して、シリカゲル板上の薄層クロマトグラフィーに供した。オレンジ色がかった淡黄色のスポットが得られた（Ｒｆ＝０．８）。
【０１２５】
１．３＜９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
撹拌及び１００℃に加熱しながら、上記１．２項で得られた化合物１．５ｇを最少量の硫酸及び水（１：１）の中に溶解させて水中に希釈し、続いて酢酸エチル中に抽出したところ、出発物質は薄層クロマトグラフィーによって全く検出されなかった。こうして得られた濃色溶液を撹拌し、数分間加熱して温度を沸点まで上昇させた後、冷却して氷水浴（３００ｍｌ）中に添加した。沈殿した塩基を微細に砕いて４０℃に加熱し、一晩静置した。上清液を沈殿により分離させ、生成物の懸濁液をろ過して水で洗浄した。乾燥させた後、所望の物質が収率７８％で得られた。
【実施例２】
【０１２６】
「９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ１／Ｒ２がナフタレンを形成し、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ、Ａ＝アミノ酸かつＸ＝Ｎ−ｔ−ＢＯＣである式（Ｉ）の化合物）のアミノアシル化」
加熱しながら、実施例１中で得られた関連のあるアミノ化合物０．５２ｇ（２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（高速液体クロマトグラフィー級品）１５ｍｌ中に溶解させ、その後テトラヒドロフラン１０ｍｌ中に溶解させた。この溶液を、（ナトリウムホウ素水和物（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）／酢酸から得られた）水素、及び、触媒として１０％パラジウム−炭素０．１ｇを使用して三口フラスコ中で水素化した。外観が濃紫色から蛍光性の緑色に変化した。この水素化は３０分間継続して実施し、フラスコを閉じて一晩静置した。
【０１２７】
Ｎ−ｔＢＯＣで保護されたアミノ酸３ｍｍｏｌを無水ＴＨＦ１０ｍｌ中に溶解させ、得られた物質を−１２℃に冷却した（氷／塩浴）。この冷却した溶液にＮ−メチルモルホリン０．３３ｇ（３．３ｍｍｏｌ）を添加した後、クロロギ酸イソブチル０．４２ｇ（３．１ｍｍｏｌ）を−１２℃〜−９℃においてゆっくりと添加した。５分後、再度酸化しないように水素を導入しながら、上記の還元アミン溶液を撹拌している中にこの無水反応混合物を添加し、得られた混合物を少なくとも−５℃まで前冷却した。１０分後、フラスコを閉じて内容物を室温において更に５時間撹拌した。
【０１２８】
反応混合物をろ過して、溶媒（ＴＨＦ）をロータリーエバポレーターで除去した。水／氷の混合物を激しく撹拌している中に上記のＤＭＦ溶液を添加し、沈殿をろ過して水で洗浄し、風乾させた。粗生成物をジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解させ、希水酸化ナトリウム溶液（０．２Ｍ）で洗浄した後、水で洗浄した。硫酸マグネシウムによって乾燥させ、溶媒を除去した。
【０１２９】
ある場合には、円錐形のシリカゲルを使用してＤＣＭ抽出物をろ過することによって、薄層クロマトグラフィーで観察される傾向のある原料物質を完全に除去した。
【０１３０】
本実施例中で得られた化合物は、次の方法で脱保護可能である：この化合物を少量の酢酸エチル中に溶解させ、塩化水素で飽和した等量の酢酸エチルと共に１時間撹拌した。過剰量の無水エーテルを添加し、沈殿した塩酸塩を迅速にろ過して除去した後、更にエーテル又はエーテル／無機物を添加して洗浄し、真空中で乾燥させた。
【実施例３】
【０１３１】
「９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ１／Ｒ２がナフタレンを形成し、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ、Ｒ６＝−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’かつＲ’＝Ｃ２Ｈ５である式Ｉの化合物）の合成」
３．１＜エチル１，３−ジヒドロキシナフトエートの調製＞
マロン酸ジエチル及び塩化フェニルアセチルからＭｅｙｅｒ及びＢｌｏｃｈの方法（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌ．，Ｖｏｌ ３，ｐ１３２）によってこの化合物を製造した。
【０１３２】
３．２＜９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
加熱及び７０℃で撹拌しながら、２−ニトロソ−５−アセトアミドフェノール１．８ｇ（１０ｍｍｏｌ）及びエチル１，３−ジヒドロキシナフトエート２．０８ｇ（９ｍｍｏｌ）をブタノール６０ｍｌ中に溶解させた。濃硫酸をゆっくりと滴下し、得られた溶液を約９０℃に徐々に加熱した。３０分後、反応混合物を冷却し、５℃で一晩維持した。
【０１３３】
赤色の生成物を吸引ろ過によって除去し、少量のエタノールで洗浄した。
【０１３４】
乾燥させた後、９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンが収率６５％で得られた。
【０１３５】
３．３＜９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
上記３．２項で得られた９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンを硫酸（３ｍｌ）及びエタノール（３ｍｌ）の混合物中に溶解させた。徐々に水（１ｍｌ）を添加しながら、この混合物を８０℃に加熱した。アミン特有の紫色が迅速に現われた。この試料を水で希釈して酢酸エチル中に抽出したものについて薄層クロマトグラフィーにより９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンが完全に検出されなくなるまで、加水分解を続けた。
【０１３６】
この反応混合物を氷冷水１５０ｍｌ中に添加し、生成物を吸引ろ過によって回収して水で洗浄し、乾燥させた。生成物が収率８５％で得られた。
【実施例４】
【０１３７】
「９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンのアミノアシル化」
実施例３中で得られた生成物を使用し、また、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃで保護された適切なアミノ酸を使用して、実施例２中に記載する工程を実施した。
【０１３８】
アミノ化化合物の脱保護は、トリフルオロ酢酸２ｍｌ中に溶解させた後、エーテルから沈澱させることによって実施した。このようにしてオレンジ色粉末状の生成物が得られ、薄層クロマトグラフィーによれば均質であった。
【実施例５】
【０１３９】
「９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ１／Ｒ２がナフタレンを形成し、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝ＨかつＲ６＝Ｃｌである式Ｉの化合物）の合成」
５．１＜９−ニトロ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
純度９５％の２−アミノニトロフェノール（アルドリッチ社）１．５４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、予め温度を沸点まで加熱した後２５℃に冷却した２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン（Ｆｌｕｋａ社）２．２６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のエタノール懸濁液中に添加した。この混合物を撹拌し、無水酢酸ナトリウム１ｇを添加した。数時間後、オレンジ色がかった褐色の沈殿が形成された。２４時間撹拌し続けた後、固体を吸引ろ過によって分離して乾燥させ、加熱した酢酸から再結晶させた（収率６５％）。
【０１４０】
５．２＜９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
エタノール１０ｍｌ中に懸濁した銅ＩＩアセチルアセトナート１３０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を水素化ホウ素ナトリウム０．１８ｇ（５ｍｍｏｌ）と共に室温で撹拌し、この物質の触媒作用により褐色の化合物が形成された。（約１０分間）。上記５．１項で得られた化合物１．２９ｇ（４ｍｍｏｌ）をプロパン−１−オール１０ｍｌ中に懸濁した懸濁液をこの混合物に添加し、その後水素化ホウ素ナトリウム０．３７ｇ（１０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を３０℃において３時間撹拌した。
【０１４１】
冷却した後、この反応混合物を氷／水混合物中に添加し、続いてろ過によって粗生成物を回収し、乾燥させた。加熱したブタン−１−オール中にこれを溶解させ、ろ過して銅を含む物質を除去することによって精製した。濃縮した後に結晶化させることにより、表題の化合物０．６８ｇが得られた。
【実施例６】
【０１４２】
「９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンのアミノアシル化」
実施例５中で得られた生成物を使用し、また、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃで保護された適切なアミノ酸を使用して、実施例２中に記載する工程を実施した。
【０１４３】
アミノ化化合物の脱保護は、実施例２中に記載される方法も実施した。
【実施例７】
【０１４４】
「５−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−９−オン（Ｒ３／Ｒ４がナフタレンを形成し、かつ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｒ９＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
７．１＜ナフトフェノキサゾンの調製＞
上記Ｆｉｓｈｅｒ及びＨｅｐｐの方法とほぼ同様の方法により、縮合剤として塩化亜鉛を使用することによって、４−ニトロソフェノール及び２−ナフトールの縮合を氷酢酸中で実施した。
【０１４５】
加熱したトルエン／無機物から収率２５％で粗生成物を再結晶させた。
【０１４６】
ここで使用される４−ニトロソフェノールはＦｌｕｋａ社から入手した市販品であり、次の工程によって変換されたものである。エーテル中に溶解させ、Ｐｈａｓｅ−Ｓｅｐ紙でろ過してＮｏｒｉｔｅと共に１時間撹拌することによってこの生成物を精製した。ろ過した後、このエーテル溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させて量を減らし、冷却して純粋なニトロソフェノールの結晶を得た。
【０１４７】
７．２＜アミン物質の調製＞
上記Ｋｅｈｒｍａｎｎ及びＧｏｔｔｒａｕの方法によって、上記７．１項で得られたナフトフェノキサゾン３．０ｇ及びヒドロキシルアミン塩酸塩３．０ｇを無水エタノール２００ｍｌと混合し、この混合物を沸点まで徐々に加熱した。ナフトフェノキサゾンの赤色は徐々にオレンジ色に変化し、塩基の塩酸塩の沈澱が生じた。沈殿をろ過により除去して少量のエタノールで洗浄した後乾燥させることによって、塩酸塩が収率６３％で得られた。
【０１４８】
こうして得られた塩１ｇを水と共に加熱して分解させた後冷却することによって、遊離の塩基の緑色の残渣が得られた。溶解させるために十分量のＨＣｌを添加しながら、生成物をろ過して４０℃のエタノール数ｍｌ中に溶解させた。蛍光性の紫がかった赤色の溶液を十分量の無水酢酸ナトリウムと共に加熱して、遊離の塩基（濃緑色の針状金属）を得た。生成物をろ過して熱水で洗浄し、収率９７％となるまで乾燥させた。
【実施例８】
【０１４９】
「７−アミノ−１，２−（３’，４’−シクロペンテノ−２’−ピロニル）−フェノキサジン−３−オン（Ｒ１／Ｒ２がクマリンを形成し、Ｒ７及びＲ８が自身が結合している２つの炭素原子と共にシクロペンテンを形成し、かつ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
８．１＜５，７−ジヒドロキシ−３，４−シクロペンテノクマリンの調製＞
フロログルシノール３．０２ｇ（２４ｍｍｏｌ）及びエチル２−オキソシクロペンタンカルボキシレート３．１２ｇ（２０ｍｍｏｌ）を小型フラスコ中で少量のエタノールを使用して混合した。この混合物を冷却した後で撹拌している中に、硫酸／水の７５質量％の混合物３０ｍｌを添加した。室温で４８時間撹拌を継続した。得られた半固形の物質を、氷／水の混合物を入念に撹拌している中に添加してろ過した。残渣を水で入念に洗浄し、吸引により排水させて風乾させた。
【０１５０】
エタノールから再結晶させることによって得られた生成物は、薄層クロマトグラフィーによれば均質であった。収率は２．８ｇであった。
【０１５１】
８．２＜表題の化合物の調製＞
上記８．１項で得られた５，７−ジヒドロキシ−３，４−シクロペンテノクマリン２．１８ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加熱したエタノール４０ｍｌ中に溶解させ、これを撹拌している中に１，４−ジクロロ−ｐ−ベンゾキノンジイミン１．７４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を水浴上で数分間ゆっくりと還流させると、その間に液体の色が濃紫色になった。更に２０分間還流させた後、酢酸塩２ｇを含む氷／水の混合物２５０ｍｌ中に反応混合物を添加した。染料は、紺青色の沈殿として分離された。こうして得られた沈殿を吸引ろ過によって除去し、水で洗浄した。酢酸及びブタン−１−オールから再結晶させることにより、乾燥した生成物（１．５ｇ）を取得することができた。
【実施例９】
【０１５２】
「７−アミノ−１，２−（４’−メチル−２’−ピロニル）フェノキサジン−３−オン（Ｒ１／Ｒ２がクマリンを形成し、Ｒ８がメチル基であり、かつ、Ｒ７＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
９．１＜５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンの調製＞
フロログルシノール２．７７ｇ（２２ｍｍｏｌ）とアセト酢酸エチル２．６ｇ（２０ｍｍｏｌ）の混合物を溶解させて冷却し、半固形の塊に硫酸／水（７５％（ｗ／ｗ））の混合物４０ｍｌを迅速に添加した。この混合物を２４時間撹拌している間に、半固形の塊が形成された。酢酸ナトリウム５ｇを含む氷／水の混合物（３００ｍｌ）の中にこれを添加し、沈殿を吸引ろ過によって回収した。
【０１５３】
水で洗浄して乾燥させる工程を繰り返した後、粗生成物を加熱したエタノールから再結晶させることにより、クマリン３．０５ｇが得られた。
【０１５４】
９．２＜７−アミノ−１，２−（４’−メチル−２’−ピロニル）フェノキサジン−３−オンの調製＞
５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン１．９２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、無水メタノール５０ｍｌ中に溶解させた。発熱を緩和して生成物の塩素化を低減するため、この溶液を加熱して撹拌している中に尿素７．５ｇ（０．１２５ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を撹拌しながら２時間還流させ、その中に１，４−ジクロロベンゾキノンジイミン１．７４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を添加した。
【０１５５】
酢酸ナトリウム１０ｇを含む水／氷の混合物を入念に撹拌し、この中に上記濃紫色の溶液を添加した。濃紫色の沈殿を吸引ろ過によって除去し、乾燥させた。粗生成物を５０℃に加熱したメタノール２００ｍｌ中に懸濁し、この混合物を入念に撹拌している中に亜ジチオン酸ナトリウム５ｇと炭酸ナトリウム５ｇとを水２０ｍｌ中に溶解させた溶液を徐々に添加することによって、精製した。黄褐色の沈殿が形成された。
【０１５６】
この反応混合物を迅速にろ過することによって、ジヒドロ化合物の状態の染料の沈殿を分離させた。少量の亜ジチオン酸ナトリウムを含む氷／水の混合物でこれを洗浄し、これにより湿った沈殿をメタノール１００ｍｌ中に移した。この溶液を急速に撹拌して４０℃に加熱し、水を徐々に添加することによって無色の染料（ジヒドロ化合物の状態）を再度酸化させ、濃紫褐色の沈殿を取得できた。最後に、ろ過により回収した後で乾燥させた染料の酸化及び沈澱を、水１００ｍｌを添加することによって停止させた。薄層クロマトグラフィーにより紫色の化合物のみが示され、この化合物の少量はジヒドロ化合物の状態であることが分かった。
【実施例１０】
【０１５７】
「７−アミノ−１，２−（３’−カルボキシエチル−４’−メチル−２’−ピロニル）フェノキサジン−３−オン（Ｒ１／Ｒ２がクマリンを形成し、Ｒ７がカルボキシエチル基であり、Ｒ８がメチル基であり、かつ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
１０．１＜５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン酸エチルの調製＞
フロログルシノール２．７７ｇ（２２ｍｍｏｌ）及びアセチルグルタル酸ジエチル４．６０ｇ（２０ｍｍｏｌ）を混合して冷却し、硫酸／水の７５質量％混合物３５ｍｌと共に撹拌した。４８時間撹拌を継続した。こうして得られた物質を氷／水の混合物を撹拌している中に添加することによって分離し、吸引ろ過を実施した。残渣を水で入念に洗浄して風乾させた。
【０１５８】
こうして得られた物質を、エタノール中に懸濁して水酸化カリウム水溶液（３モル等量）と共に撹拌することによって、遊離の酸に直接変換した。４時間後、ｐＨ２の２Ｍ塩酸を添加することによって酸が沈殿した。多量の沈殿を吸引ろ過により除去して水で洗浄し、吸引によって排水させた。風乾させた後、所望の物質３．８ｇが得られた。
【０１５９】
１０．２＜表題の化合物の調製＞
この化合物を、１，４−ジクロロ−ｐ−ベンゾキノンジイミン及び上記１０．１項で得られた酸（等モル）を使用して、実施例８．１と同様に調製した。この反応混合物を氷／水の混合物中に添加し、塩酸を添加してｐＨ２にすることによって、遊離のカルボン酸の状態の染料を完全に沈澱させた。得られた乾燥物質は２．２ｇであった。
【実施例１１】
【０１６０】
「ロイシン−ペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１１．１＜検出用の媒体の調製＞
ｂｉｏｇｅｌｙｔｏｎｅ（ビオメリュー社）１．４ｇ、肉抽出物（ビオメリュー社）０．８４ｇ、ＮａＣｌ（メルク社）２．２４ｇ、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社）水溶液２８０μｌ（濃度１０ｇ／ｌ）及びＥｕｒｏｐｅａｎ ａｇａｒ（ビオメリュー社）４．２ｇを混合することにより、検出用の媒体を調製した。
【０１６１】
その後、実施例２中で得られた本発明の基質（アミノ酸がロイシン（ロイシン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｌｅｕ−ＡＢＰ））である）か、そうでなければ、従来技術の基質（ロイシン−アミノメチルクマリン（Ｌｅｕ−ＡＭＣ、ＢＡＣＨＥＭ社））を次の方法で添加した。浸透水（ｏｓｍｏｓｅｄ ｗａｔｅｒ）２８０ｍｌをこの媒体に添加し、この混合物を水浴中で１００℃において溶解させた。この混合物を１２１℃において１５分間オートクレーブし、水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１６２】
その後、ＤＭＳＯ（メルク社）中に溶解させた基質を、表１中に示す濃度に従って添加した。
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
その後、媒体をペトリ皿中に添加した。
【０１６５】
１１．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株１０株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの着色、拡散及びこの着色の濃さについて記録した。
【０１６６】
１１．３＜結果＞
結果は、着色の濃さを０〜４の任意のスケールを基準として、また、拡散を０〜４の任意のスケールを基準として表した。この結果を下記表２中に示す。表中、
−Ｔａはインキュベート時間、Ｃｂは増殖直径（ｍｍ）、Ｉｃは着色の濃さ、Ｃｏｄはコロニーの色、また、Ｄｅは拡散に相当し、
−Ｂは蛍光性青色、また、Ｒはピンク色に相当する。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
上記表１及び表２中に示す結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによってロイシン−ペプチダーゼ活性を示す微生物を0に分析できること、また、従来技術の基質と比較してコロニー周辺への拡散が非常に少ないことが実証される。
【実施例１２】
【０１６９】
「プロリル−ペプチダーゼを示す微生物の検出」
１２．１＜検出用の媒体の調製＞
酵母抽出物（ビオメリュー社）１．６８ｇ、ｂｉｏｃａｓｅ（ビオメリュー社）１．４ｇ、麦芽抽出物（ビオメリュー社）１．２６ｇ、グルコース（メルク社）０．０８ｇ及び寒天（ビオメリュー社）３．９２ｇを混合することによって、検出用の媒体を調製した。
【０１７０】
この粉末に浸透水２８０ｍｌを添加した後、この混合物を水浴中で１００℃において溶解させた。生成物を２つのフラスコ中に１４０ｍｌずつに分けた。１２１℃において１５分間オートクレーブを実施し、生成物を水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１７１】
その後、Ｌ−プロリル−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｐｒｏ−ＡＭＣ、ＢＡＣＨＥＭ社）を第一のフラスコ中に添加し（コントロール）、続いて、Ｌ−プロリル−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｐｒｏ−ＡＢＰ、実施例２中で得られたアミノ酸がＬ−プロリンである本発明の基質）を最終濃度５０ｍｇ／ｌとなるように第二のフラスコ中に添加した。
【０１７２】
１２．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株９株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの大きさ、着色及びこの着色の濃さについて記録した。
【０１７３】
１２．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表３中に示す。
【０１７４】
表３：従来技術の基質Ｐｒｏ−ＡＭＣ及び本発明の基質Ｐｒｏ−ＡＢＰによる微生物のプロリル−ペプチダーゼ活性
【０１７５】
【表３】
【０１７６】
上記表中で示した結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによってプロリル−ペプチダーゼ活性を示す微生物の分析、特にＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母の分離が明らかに可能となることが実証される。
【実施例１３】
【０１７７】
「アラニル−ペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１３．１＜検出用の媒体の調製＞
ｂｉｏｇｅｌｙｔｏｎｅ（ビオメリュー社）３．６ｇ、肉抽出物（ビオメリュー社）２．１６ｇ、麦芽抽出物（ビオメリュー社）１．２６ｇ、ＮａＣｌ（メルク社）５．７６ｇ及び寒天（ビオメリュー社）１０．８ｇを混合することによって、検出用の媒体を調製した。
【０１７８】
この粉末に浸透水７２０ｍｌを添加した後、この混合物を水浴中で５０℃において溶解させた。生成物を２つのフラスコ中に３６０ｍｌずつに分けた。１２１℃において１５分間オートクレーブを実施し、生成物を水浴中で１００℃まで冷却した。
【０１７９】
その後、Ｌ−アラニル−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｌａ−ＡＭＣ、ＢＡＣＨＥＭ社）を最終濃度５０ｍｇ／ｌとなるように第一のフラスコ中に添加し（コントロール）、続いて、Ｌ−アラニル−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ａｌａ−ＡＢＰ、実施例２中で得られたアミノ酸がＬ−アラニンである本発明の基質）を最終濃度２５ｍｇ／ｌとなるように第二のフラスコ中に添加した。
【０１８０】
１３．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株２５株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの大きさ、着色及びこの着色の濃さについて記録した。
【０１８１】
１３．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表４中に示す。
【０１８２】
表４：従来技術の基質Ａｌａ−ＡＭＣ及び本発明の基質Ａｌａ−ＡＢＰによる微生物のアラニル−ペプチダーゼ活性
【０１８３】
【表４】
【０１８４】
上記の表中で示した結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによってアラニル−ペプチダーゼ活性を示す微生物の分析、特にグラム陽性菌（活性を示さない）とグラム陰性菌（活性を示す）との分離が明らかに可能となることが実証される。
【実施例１４】
【０１８５】
「β−アラニンペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１４．１＜検出用の媒体の調製＞
Ｃｏｌｕｍｂｉａ媒体３００ｍｌを水浴中で１００℃において溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブした。その後、生成物を水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１８６】
この媒体を３つのフラスコ中に１００ｍｌずつに分け、この中に、アミノ酸がβ−アラニンである実施例４及び６の基質（それぞれ、β−アラニン−９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（β−Ａｌａ−ＡＣＡＰ）及びβ−アラニン−９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（β−Ａｌａ−ＡＣＨＰ））をＤＭＳＯ中に溶解させたものを、５０℃において下記表５中に示す濃度に従って添加した。
【０１８７】
【表５】
【０１８８】
その後、媒体をペトリ皿中に添加した。
【０１８９】
１４．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株９株を生理食塩水中に懸濁したものを、上記１４．１項中で調製した媒体上に、多点接種法により１０００００ｃｆｕ／点の割合で播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニー（菌株１つあたりコロニー１つ）の外観を調べた。
【０１９０】
１４．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表６中に示す。表中、ＲＰは淡いピンク色を示す。
【０１９１】
【表６】
【０１９２】
上記の表中に示す結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによって、（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株に特異的であって他の菌株は有していない）β−アラニンペプチダーゼ活性を示す微生物の分析が明らかに可能となることが実証される。
【実施例１５】
【０１９３】
「Ａが少なくとも二種のアミノ酸である基質を使用することによるアラニンペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１５．１＜検出用の媒体の調製＞
Ｃｏｌｕｍｂｉａ媒体１０００ｍｌを水浴中で１００℃において溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブした。その後、これを水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１９４】
この媒体を５つのフラスコ中に２００ｍｌずつに分け、この中に、Ａが以下であるような実施例２の基質を５０℃において添加した。基質はそれぞれＤＭＳＯ中に溶解させ、最終濃度５０ｍｇ／ｌで使用する。
−媒体１；Ｌ−アラニン（Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ａ−ＡＢＰ））、
−媒体２；Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン（Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ−［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＡＡ−ＡＢＰ））、
−媒体３；Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン（Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＡＡＡ−ＡＢＰ））、
−媒体４；Ｌ−アラニン−グリシン（Ｌ−アラニン−グリシン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＡＧ−ＡＢＰ））、また、
−媒体５；グリシン−Ｌ−アラニン（グリシン−Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＧＡ−ＡＢＰ）。
【０１９５】
その後、媒体をペトリ皿中に添加した。
【０１９６】
１５．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株９株を生理食塩水中に懸濁したものを、上記１５．１項中で調製した媒体上のコロニー中に、多点接種法により１５０００ｃｆｕ／点の割合で播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
【０１９７】
１５．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表７及び表８中に示す。表中、Ｒはピンク色、ＲＰは淡いピンク色、また、Ｉは無色を示す。
【０１９８】
【表７】
【０１９９】
【表８】
【０２００】
表７及び表８中に示す結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによって、この基質のアミノ酸鎖長に関わらず、アラニンペプチダーゼ活性を有する微生物株の酵素発現の検出が明らかに可能となることが実証される。また、対象菌株に応じてアミノ酸の性質及び数を変えて基質の特異性及び感受性又は毒性の両方を変化させることにより、対象対象菌株の分析が可能である。
【実施例１６】
【０２０１】
「本発明の基質と従来技術の基質との併用による微生物の検出」
１６．１＜検出用の媒体の調製＞
酵母抽出物３．３ｇ、Ｂｉｏｃａｓｅ２．７５ｇ、麦芽抽出物２．４７５ｇ、グルコース０．１６５ｇ及び寒天７．７ｇを混合し、浸透水５５０ｍｌを添加した。
【０２０２】
この混合物を水浴中で１００℃において溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブした。その後、これを水浴中で５０℃まで冷却した。
【０２０３】
実施例２中で調製した本発明の基質（アミノ酸がプロリンである）を０．０５ｇ／ｌの割合で添加し、従来技術の他の基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコシドを０．０５ｇ／ｌの割合で添加した。
【０２０４】
その後、媒体をペトリ皿中に分けた。
【０２０５】
１６．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株１２株を生理食塩水中に懸濁し、上記１６．１項中で調製した媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
【０２０６】
１６．３＜結果＞
下記の表９中に示す結果は、増殖の大きさ（ｍｍ）、活性及び色を示し、Ｔａはインキュベート時間、Ｒはピンク色、Ｏはオレンジ色、Ｖは緑色、Ｔは青緑色、Ｍは褐色、ＧＯはオレンジがかった灰色、また、ＧＶは灰色がかった緑色を示す。
【０２０７】
【表９】
【０２０８】
上記の表９中に示す結果から、菌株が示す酵素活性の着色特性は以下のように明瞭に観察されることが分かる：
−プロリンペプチダーゼ活性のみを有する菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の場合は、本発明の基質の加水分解によってピンク色からオレンジ色に着色し、
−β−グルコシダーゼ活性のみを有する菌株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｃｉｕｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の場合は、従来技術の基質の加水分解によって青緑色に着色し、また、
−二種の酵素活性を有する菌株（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｌｅｂｓｅｌｌｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の場合は、ピンク色／オレンジ色及び青緑色の二種の着色に由来して緑色から褐色に着色する。
【０２０９】
従って、各菌株に特異的ないくつかの異なる酵素活性は、これらの代謝により検出可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチダーゼ活性を検出するための新規の発色性酵素基質に関する。上記基質は、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において、酵素加水分解により物理化学的なシグナルを発する段階を含む用途に使用できる。既存の基質の大部分は蛍光性であるのに対し、本発明の発色性基質は着色を生じ、この着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるので、微生物検出用のゲル化媒体においてこの発色性基質を特に使用できる。
【０００２】
また、本発明は、この基質を含む反応媒体、並びに、グラム陰性菌、グラム陽性菌及びペプチダーゼ活性を示す酵母を検出するための上記基質又は上記媒体の使用、並びに、その使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
「アミノペプチダーゼ」という名称は一般的に、アミノ酸のアシル基と第一級アミンの間のアミド基を加水分解して切断できる酵素に対して付与され、「ペプチダーゼ」という名称は、ペプチドのアシル基と第一級アミンの間のアミド基を加水分解して切断できる酵素に対して付与される。本出願においては、「ペプチダーゼ」という用語は、必要に応じて、上記に定義したペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼの両方を指す可能性がある。
【０００４】
ペプチダーゼ活性検出用の拡散しない発色性酵素基質が文献中に記載されていて、従来技術から既に公知である。例えば、この基質は、本出願人による特許文献１及び特許文献２の範囲内に含まれる。しかし、この基質には、合成が困難であり、純度が低く、かつ、収率が低いといった様々な問題がある。また、培養基中で使用する際には、培養基の組成を非常に正確に定義しなければ着色を観察できない。現在のところ文献に記載されている基質のうちこの基質以外では、混合培養において固形媒体中で使用して微生物を検出できるものはない。
【０００５】
フェノキサジノンに由来する物質は蛍光を発することができることが知られている。上記物質は、
−例えば非特許文献１中に記載されるように、酸−塩基指示薬として、又は、
−非特許文献２中に記載されるように、例えばタンパク質のコンホメーション変化を追従するための、蛍光標識として使用可能である。
【０００６】
フェノキサジノン誘導体は以前は酵素基質としては使用されていなかった。
【特許文献１】ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９８／０４７３５
【特許文献２】ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９９／３８９９５
【非特許文献１】Ｓｔｕｚｋａ，Ｖ．ら，１９６３，Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８，１３９９−１４０７
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｊ．ら，２００１，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７３（１３），２９２０−２９２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明によれば、ペプチダーゼ活性を示す微生物を検出するための新規の発色性酵素基質が提案される。また、本発明は、この基質を含む反応媒体、及び、ペプチダーゼ活性を検出するための上記基質又は上記媒体の使用、及び、その使用方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実際、本出願人は予想外にも、発色性フェノキサジノン誘導体の発する着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるため、培養基中のコロニーの着色の変化によりペプチダーゼ活性を実証できることから、これを使用することによりペプチダーゼ活性を示す微生物を検出可能であることを発見した。
【０００９】
本発明の基質を含む反応媒体に試験する微生物を播種すると、この微生物が基質を加水分解できない場合にはコロニーの色は無色から白色となる。一方、この微生物が本発明の基質を加水分解できる場合には、コロニーが着色される。
【００１０】
本発明のフェノキサジノン誘導体は、発色性かつ蛍光性であり、検出感度が良好であるという利点を有する。
【００１１】
従って、本発明の主題は、
式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
【００１３】
：の発色性酵素基質であって、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００１４】
【化２】
【００１５】
：のナフタレン環、又は、式：
【００１６】
【化３】
【００１７】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００１８】
【化４】
【００１９】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し
（但し、
（ｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、Ｒ３及びＲ４は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表し（但し、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、Ｒ６はハロゲン原子を表す）、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない。
【００２０】
本発明によれば、「アリール」という用語は特に、Ｃ６〜Ｃ１０芳香環、特にフェニル環、ベンジル環、１−ナフチル環又は２−ナフチル環を意味するものとする。アラルキル基のアリール部についても同様である。
【００２１】
また、本発明による、アラルキル基及びカルボキシアルキル基におけるアルキルは、Ｃ１〜Ｃ６である。
【００２２】
「Ｃ１〜Ｃ６のアルキル」という用語は、炭素原子を１〜６つ有する直鎖又は分岐のアルキルを意味するものとする。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基及びヘキシル基を挙げることができる。
【００２３】
「ハロゲン原子」という用語は、塩素、臭素、ヨウ素及びフッ素を意味するものとする。
【００２４】
「ヘテロ原子」という用語は、Ｏ、Ｎ又はＳ等の炭素原子以外の原子を意味するものとする。
【００２５】
Ｒ’及びＲ’’により形成可能な複素環の大きさは任意であってよいが、５〜７員環であることが好ましい。
【００２６】
複素環の例としては、モルホリン環、ピペラジン環、ピペリジン環、ピロリジン環及びイミダゾリジン環が含まれる。
【００２７】
本発明に記載される置換基Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４によって形成される様々なナフタレン環及びクマリン環は、破線を含んで表され、この破線は対応する置換基を伴って完成されてより明瞭となり、また、本発明の式（Ｉ）のフェノキサジノン誘導体におけるこれらの環の位置は外観上確認できる。
【００２８】
本発明によるブロック基には、アミンを保護可能な当業者に公知の任意のブロック基が含まれる。例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｎ−ｔＢＯＣ）、９−フルオレニルオキシカルボニル基、スクシニル基等の可溶性基、又は、ピペコリン酸等の代謝不可能なアミノ酸、すなわち非天然アミノ酸が挙げられる。
【００２９】
ブロック基は、本発明の化合物中に系統的には存在していない。従って、本発明の化合物がブロック基を有していない（Ｘがない）場合、本発明の化合物は塩化物、臭化物又はトリフルオロ酢酸塩等の塩の形態である。
【００３０】
式（Ｉ）中においてＡで表すアミノ酸は、当業者に公知の任意のアミノ酸である。
【００３１】
本発明のある実施形態によれば、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大１０つのアミノ酸を有するペプチドを表す。基質にかかるコストの都合上、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大４つのアミノ酸を有するペプチドを表すことが好ましい。
【００３２】
ある実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉ）：
【００３３】
【化５】
【００３４】
：を有し、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００３５】
【化６】
【００３６】
：のナフタレン環、又は、式：
【００３７】
【化７】
【００３８】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００３９】
【化８】
【００４０】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
（但し：
（ｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、Ｒ３及びＲ４は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
（但し：
（ｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環又はクマリン環を形成する場合、Ｒ６は水素原子を表し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４が自身が結合しているフェニル環と共にベンゼン環を形成する場合、Ｒ６はハロゲン原子を表す）、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない。
【００４１】
別の実施形態によれば、本発明の化合物は、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成するか、そうでなければＲ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成するか、そうでなければＲ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、他の置換基は上述の通りであり、但し、Ｒ１／Ｒ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環又はクマリン環を形成する場合、Ｒ３／Ｒ４が自身が結合しているフェニル環と共に同時にナフタレン環を形成することはなく、逆の場合も同じであるような式（Ｉ）の化合物から選択される。
【００４２】
従って、この実施形態によれば、上記酵素基質は下記式（Ｉ）：
【００４３】
【化９】
【００４４】
：の化合物であって、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００４５】
【化１０】
【００４６】
：のナフタレン環、又は、式：
【００４７】
【化１１】
【００４８】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【００４９】
【化１２】
【００５０】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し（但し：Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４のうち一方のみが自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成する）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない。
【００５１】
本発明のある実施形態によれば、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大１０つのアミノ酸を有するペプチドを表す。Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大４つのアミノ酸を有するペプチドを表すことが好ましい。
【００５２】
特定の実施形態によれば、本発明の化合物は下記式（Ｉａ）：
【００５３】
【化１３】
【００５４】
：を有する酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００５５】
式（Ｉａ）の化合物は、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、かつ、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素原子である式（Ｉ）の化合物である。
【００５６】
好ましくは、式（Ｉａ）の化合物において、Ｒ５は水素原子を表し、Ｒ６は水素原子又は塩素原子等のハロゲン原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない。
【００５７】
別の特定の実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉｂ）：
【００５８】
【化１４】
【００５９】
：の酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００６０】
式（Ｉｂ）の化合物は、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成し、かつ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６がそれぞれ水素原子である式（Ｉ）の化合物である。
【００６１】
好ましくは、本発明の式（Ｉｂ）の化合物において、Ｒ５は水素原子であり、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基又はカルボキシアルキル基を表すか、そうでなければＲ７及びＲ８は自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない。
【００６２】
更に別の特定の実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉｃ）：
【００６３】
【化１５】
【００６４】
：の酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９，Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００６５】
式（Ｉｃ）の化合物は、Ｒ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、かつ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ水素原子である式（Ｉ）の化合物である。
【００６６】
好ましくは、式（Ｉｃ）の化合物において、Ｒ５、Ｒ６及びＲ９基はそれぞれ水素原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない。
【００６７】
更に別の実施形態によれば、本発明の化合物は式（Ｉｄ）：
【００６８】
【化１６】
【００６９】
：の酵素基質であって、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは上記に定義する通りである。
【００７０】
式（Ｉｄ）の化合物は、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物である。
【００７１】
本発明の化合物は、Ｒ１／Ｒ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、又は、Ｒ１／Ｒ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成する場合、又は、Ｒ３／Ｒ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、又は、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合のいずれにおいても、Ｒ１／Ｒ２基及びＲ３／Ｒ４基が形成する環に応じたいくつかの製造方法によって調製可能である。
【００７２】
従って、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム１に表す方法によって調製可能である。
【００７３】
【化１７】
【００７４】
上記スキーム１によれば、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は次のように調製される。適切な２−アミノ−５−ニトロフェノール化合物（ａ）と、予め沸点まで加熱した後で２５℃に冷却した適切なハロゲン化１，４−ナフトキノン（ｂ）とを反応させて、対応する９−ニトロベンゾ［ａ］フェノキサジノン（ｃ）を形成する。続いて、この化合物ｃを、銅ＩＩアセチルアセトナートを予め水素化ホウ素ナトリウムと反応させた混合物と反応させて、化合物（ｄ）を形成する。その後、化合物（ｄ）を、一種以上の任意に保護されたアミノ酸（６）と共に約−１２℃に冷却した浴中で反応させて、式（Ｉ）の化合物を得る。注目すべきは、言うまでもなく、Ａが単一のアミノ酸である場合、化合物（６）中のＡ’は化合物（Ｉ）のＡに相当し、更に水酸基を含むということである。言い換えると、Ａが単一のアミノ酸である場合、Ａ’の末端は−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、Ａは−Ｃ（Ｏ）−を介して−ＮＨ−に結合していて−ＯＨを有していないということである。また、Ａが少なくとも２つのアミノ酸の鎖である場合には、Ａ’の末端アミノ酸は上記の通りである、すなわち、Ａの末端アミノ酸に関して、水酸基を更に含む。
【００７５】
Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成し、かつ、Ｒ６が水素原子である式（Ｉａ）の化合物は、下記のスキーム１ａ中に記載する方法によって調製可能である。
【００７６】
【化１８】
【００７７】
このスキーム１ａによれば、式（Ｉａ）の化合物は次のように調製される。適切な３−アセトアミドフェノール化合物（１）と亜硝酸ナトリウム（Ｘ＝Ｎａ）又は亜硝酸カリウム（Ｘ＝Ｋ）等の亜硝酸塩（２）とを−３℃において反応させる。続いて、こうして得られたニトロソアセトアミドフェノール（３）と１，３−ジヒドロキシナフタレン（４）とをブタノール等の溶媒中で、約７０℃に加熱して濃硫酸を添加し、９０℃まで加熱し続けた後冷却することにより反応させ、適切な９−アセトアミドベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンを形成する。続いて、この化合物を穏やかに濃縮した硫酸と共に加熱することによって加水分解し、９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（５）を得る。最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００７８】
Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム２に表す方法によって調製可能である。
【００７９】
【化１９】
【００８０】
上記スキーム２によれば、Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成し、かつ、式（Ｉ）の化合物の概略的な定義の中で示されるようにＲ６が水素原子である式（Ｉ）の化合物は、次のように調製される。適切なｐ−フェニレンジアミン誘導体（７）を化合物（８）の存在下で酸化及び塩素化して、Ｗｉｌｌｓｔａｅｔｔｅｒ及びＭａｙｅｒの方法（１９０４，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，３７：１４９８）によりＮ，Ｎ’−ジクロロ−ｐ−ベンゾキノンジイミン（９）を得る。続いて、この化合物をアルコール溶液中で５，７−ジヒドロキシクマリン（１０）と反応させ、適切な７−アミノ−１，２−ピロニルフェノキサジン−３−オン（１１）を得る。最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００８１】
式（Ｉ）の化合物においてＲ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共にクマリン環を形成している式（Ｉｂ）の化合物は、言うまでもなく、上記の方法で調製可能である。
【００８２】
従って、Ｒ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム３に表す方法によって調製可能である。
【００８３】
【化２０】
【００８４】
上記スキーム３によれば、Ｒ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、次のように調製される。適切な２−ナフトール（１２）と適切な４−ニトロフェノール（１３）とをＦｉｓｃｈｅｒ及びＨｅｐｐの方法（参照：３６．２，１８０７，１９０３）によって縮合して、適切なナフトフェノキサゾン（１４）を得る。続いて、この化合物（１４）をＫｅｈｒｍａｎ及びＧｏｔｔｒａｕの方法（参照：３８，２５７４，１９０５）によってヒドロキシルアミン塩酸塩（１５）と反応させ、ヒドロキシイミン及びアミノケトン（それぞれ化合物１６及び１７）を得る。最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００８５】
式（Ｉ）の化合物においてＲ３及びＲ４が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成している式（Ｉｃ）の化合物は、言うまでもなく、上記の方法で調製可能である。
【００８６】
最後に、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する本発明の式（Ｉ）の化合物（式（Ｉｄ）の化合物）は、下記スキーム４に表す方法によって調製可能である。
【００８７】
【化２１】
【００８８】
上記スキーム４によれば、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する式（Ｉ）の化合物は、次のように調製される。適切な１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸（１８）と適切な２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（１９）とを縮合して、適切なジナフトキサゾンスルホン酸（２０）を得る。続いて、この化合物（２０）をアンモニウムの存在下で加熱してアミノジナフトキサゾン（２１）を得る。この方法の最後の段階は、スキーム１の最後の段階と同じである。
【００８９】
上記の方法において、開始反応物質（化合物（１）、（２）、（４）、（６）、（７）、（８）、（１０）、（１２）、（１３）、（１５）、（１８）及び（１９））は、特にアルドリッチ社から、市販されており入手可能である。
【００９０】
また、本発明の主題は、少なくとも一種の上記式（Ｉ）の発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した反応媒体に関する。
【００９１】
事実上、本発明の化合物を含む反応媒体中に又はその上にペプチダーゼ活性を示す微生物を播種すると、着色が生じ、この着色は反応媒体中に又はその上に拡散せずにコロニーの中に集まる。
【００９２】
「本発明の反応媒体」という用語は、少なくとも一種の微生物の少なくとも一種の酵素活性を顕現させることができる媒体を意味するものとする。
【００９３】
この反応媒体は、視覚化用の媒体のみとしても使用可能であり、また、培養基及び視覚化用の媒体の両方としても使用可能である。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応媒体が、本発明の特定の実施形態を構成する培養基でもある。
【００９４】
反応媒体は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形媒体」という用語は、例えばゲル化媒体を意味するものとする。
【００９５】
微生物を培養するために微生物学において従来から使用される固形媒体は寒天であるが、ゼラチン又はアガロースも使用可能である。例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒ、Ｔｒｙｐｃａｓｅ ｓｏｙ ａｇａｒ、マッコンキー寒天（Ｍａｃ Ｃｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用可能である。
【００９６】
反応媒体が培養基でもある場合、この反応媒体はゲル状であることが好ましい。
【００９７】
反応媒体中における寒天の量は、２〜４０ｇ／ｌ、好ましくは９〜２５ｇ／ｌである。
【００９８】
本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用可能である。
【００９９】
反応媒体中における本発明の酵素基質の濃度は０．０２５〜０．４０ｇ／ｌ、有利には０．０５ｇ／ｌである。というのは、この基質濃度である場合には着色のコントラストが良好だからである。
【０１００】
反応媒体は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも一種の他の基質を含んでいてよい。この他の基質の酵素加水分解により、本発明の基質によって検出されるシグナルとは異なる（例えば、色の異なる又は蛍光の異なる）検出可能なシグナルが生じるため、一種以上の微生物について検出、識別及び／又は定量等の実証が可能である。
【０１０１】
他の特異的な基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコシド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）若しくは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）等のインドキシル型の基質、又は、微生物の検出に使用される他の任意の基質を挙げることができる。
【０１０２】
他の特異的な酵素基質の濃度は、一般的に０．０１〜２ｇ／ｌである。当業者であれば、使用する基質に応じて上記濃度を容易に決定できるであろう。
【０１０３】
また、反応媒体は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、無機物、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩又は金属塩等の一種以上の成分を組み合わせて含んでいてよい。媒体の例が、本出願人によるヨーロッパ特許ＥＰ６５６４２１及びＰＣＴ出願ＷＯ９９／０９２０７中に記載されている。
【０１０４】
従って、本発明の酵素基質及び反応媒体は、ペプチダーゼ活性を有する微生物の分析において有用である。
【０１０５】
従って、本発明の主題はまた、少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための、式（Ｉ）の発色性酵素基質又は上記反応媒体の使用である。
【０１０６】
また、本発明は、
少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための方法であって、
・上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の他の酵素活性と共に顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
にも関する。
【０１０７】
上記播種段階及びインキュベート段階は、当業者に広く知られている。
【０１０８】
例えば、インキュベート時の温度は３７℃である。また、インキュベート時の雰囲気は、嫌気的であっても好気的であってもよい。しかし、酵素活性が良好となるため、インキュベートは好気的条件下で実施されるのが好ましい。
【０１０９】
上記顕現は、反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まる着色の変化を視覚化することにより、肉眼で実施される。
【０１１０】
本発明の酵素基質によって分析可能な微生物としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び酵母を挙げることができる。
【０１１１】
グラム陰性菌としては、次の属の細菌を挙げることができる：シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プローテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ菌、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属及びレジオネラ属。
【０１１２】
グラム陽性菌としては、次の属の細菌を挙げることができる：エンテロコッカス菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス、リステリア菌、クロストリジウム属、マイコバクテリウム属及びコリネバクテリウム属。
【０１１３】
酵母の例としては、次の属の酵母が含まれる：カンジダ属、クリプトコッカス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【０１１４】
分析する生体試料は、唾液、血液、尿若しくは糞便といった任意の臨床試料、又は、その分析が臨床医による診断を援助可能な他の任意の試料である。また、上記試料は、病原微生物が存在しないことを確認する必要のある又は汚染叢数を計数する必要のある又は特定の微生物を検出する必要のある、食品産業及び／又は医薬産業に由来する製品又はこれらの産業における原料の試料であってもよい。
【０１１５】
Ａがアラニンである本発明の発色性基質は、グラム陰性菌とグラム陽性菌とを識別可能であるという利点を有する。
【０１１６】
従って、本発明の別の主題は、
細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがアラニンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
からなる。
【０１１７】
Ａがプロリンである発色性基質は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母とを識別可能であるという利点を有する。
【０１１８】
従って、本発明の別の主題は、
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがプロリンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・インキュベートしておき、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
本発明は以下の実施例によってより明瞭に理解されるであろう。しかし、これらの実施例はいかなる制限を加えるものでもない。
【実施例１】
【０１２０】
「９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈである化合物（５））の合成」
１．１＜２−ニトロソ−５−アセトアミドフェノールの調製＞
３−アセトアミドフェノール（アルドリッチ社）９ｇを、水酸化ナトリウム２．８ｇを含む水溶液（１００ｍｌ）中に溶解させた。この溶液を氷塩浴を使用して−３℃に冷却し、亜硝酸ナトリウム５ｇを水（１２ｍｌ）中に溶解させた溶液を添加した。
【０１２１】
得られた溶液を撹拌しながら、この溶液中に、リン酸を等量の水（２５ｍｌ）で希釈した溶液を分液漏斗を使用して添加した。この添加は、温度が０℃以下に維持されるような速度で実施した。その後、赤褐色の沈殿が形成された。更に１時間激しく撹拌した後でｐＨを測定し、酸性（ｐＨ＜２）であること確認した。
【０１２２】
こうして得られた濃厚な懸濁液をろ過し、残渣を冷水で入念に洗浄して、過剰な酸及び塩を除去した。適切な吸引を実施した後、残渣を減圧デシケーター中で乾燥させた。２−ニトロソ−５−アセトアミドフェノール７．３６ｇが収率６８．６％で得られた。
【０１２３】
１．２＜９−アセトアミドベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
撹拌及び７０℃に加熱しながら、上記１．１項で得られた粗生成物１．８ｇ及び１，３−ジヒドロキシナフタレン（アルドリッチ社）１．６０ｇをブタン−１−オール５０ｍｌ中に溶解させた。この加熱した溶液中に濃硫酸１ｇを滴下し、９０℃になるまで加熱を続けた。３０分後、この混合物を冷却した。固体相を吸引ろ過によって除去し、少量のエタノールで洗浄した。乾燥させた後、表題の化合物が収率７６％で得られた。
【０１２４】
得られた物質を、移動相として酢酸エチル／トルエン（３：１）を使用して、シリカゲル板上の薄層クロマトグラフィーに供した。オレンジ色がかった淡黄色のスポットが得られた（Ｒｆ＝０．８）。
【０１２５】
１．３＜９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
撹拌及び１００℃に加熱しながら、上記１．２項で得られた化合物１．５ｇを最少量の硫酸及び水（１：１）の中に溶解させて水中に希釈し、続いて酢酸エチル中に抽出したところ、出発物質は薄層クロマトグラフィーによって全く検出されなかった。こうして得られた濃色溶液を撹拌し、数分間加熱して温度を沸点まで上昇させた後、冷却して氷水浴（３００ｍｌ）中に添加した。沈殿した塩基を微細に砕いて４０℃に加熱し、一晩静置した。上清液を沈殿により分離させ、生成物の懸濁液をろ過して水で洗浄した。乾燥させた後、所望の物質が収率７８％で得られた。
【実施例２】
【０１２６】
「９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ１／Ｒ２がナフタレンを形成し、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ、Ａ＝アミノ酸かつＸ＝Ｎ−ｔ−ＢＯＣである式（Ｉ）の化合物）のアミノアシル化」
加熱しながら、実施例１中で得られた関連のあるアミノ化合物０．５２ｇ（２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（高速液体クロマトグラフィー級品）１５ｍｌ中に溶解させ、その後テトラヒドロフラン１０ｍｌ中に溶解させた。この溶液を、（ナトリウムホウ素水和物（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）／酢酸から得られた）水素、及び、触媒として１０％パラジウム−炭素０．１ｇを使用して三口フラスコ中で水素化した。外観が濃紫色から蛍光性の緑色に変化した。この水素化は３０分間継続して実施し、フラスコを閉じて一晩静置した。
【０１２７】
Ｎ−ｔＢＯＣで保護されたアミノ酸３ｍｍｏｌを無水ＴＨＦ１０ｍｌ中に溶解させ、得られた物質を−１２℃に冷却した（氷／塩浴）。この冷却した溶液にＮ−メチルモルホリン０．３３ｇ（３．３ｍｍｏｌ）を添加した後、クロロギ酸イソブチル０．４２ｇ（３．１ｍｍｏｌ）を−１２℃〜−９℃においてゆっくりと添加した。５分後、再度酸化しないように水素を導入しながら、上記の還元アミン溶液を撹拌している中にこの無水反応混合物を添加し、得られた混合物を少なくとも−５℃まで前冷却した。１０分後、フラスコを閉じて内容物を室温において更に５時間撹拌した。
【０１２８】
反応混合物をろ過して、溶媒（ＴＨＦ）をロータリーエバポレーターで除去した。水／氷の混合物を激しく撹拌している中に上記のＤＭＦ溶液を添加し、沈殿をろ過して水で洗浄し、風乾させた。粗生成物をジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解させ、希水酸化ナトリウム溶液（０．２Ｍ）で洗浄した後、水で洗浄した。硫酸マグネシウムによって乾燥させ、溶媒を除去した。
【０１２９】
ある場合には、円錐形のシリカゲルを使用してＤＣＭ抽出物をろ過することによって、薄層クロマトグラフィーで観察される傾向のある原料物質を完全に除去した。
【０１３０】
本実施例中で得られた化合物は、次の方法で脱保護可能である：この化合物を少量の酢酸エチル中に溶解させ、塩化水素で飽和した等量の酢酸エチルと共に１時間撹拌した。過剰量の無水エーテルを添加し、沈殿した塩酸塩を迅速にろ過して除去した後、更にエーテル又はエーテル／無機物を添加して洗浄し、真空中で乾燥させた。
【実施例３】
【０１３１】
「９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ１／Ｒ２がナフタレンを形成し、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ、Ｒ６＝−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’かつＲ’＝Ｃ２Ｈ５である式Ｉの化合物）の合成」
３．１＜エチル１，３−ジヒドロキシナフトエートの調製＞
マロン酸ジエチル及び塩化フェニルアセチルからＭｅｙｅｒ及びＢｌｏｃｈの方法（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌ．，Ｖｏｌ ３，ｐ１３２）によってこの化合物を製造した。
【０１３２】
３．２＜９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
加熱及び７０℃で撹拌しながら、２−ニトロソ−５−アセトアミドフェノール１．８ｇ（１０ｍｍｏｌ）及びエチル１，３−ジヒドロキシナフトエート２．０８ｇ（９ｍｍｏｌ）をブタノール６０ｍｌ中に溶解させた。濃硫酸をゆっくりと滴下し、得られた溶液を約９０℃に徐々に加熱した。３０分後、反応混合物を冷却し、５℃で一晩維持した。
【０１３３】
赤色の生成物を吸引ろ過によって除去し、少量のエタノールで洗浄した。
【０１３４】
乾燥させた後、９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンが収率６５％で得られた。
【０１３５】
３．３＜９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
上記３．２項で得られた９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンを硫酸（３ｍｌ）及びエタノール（３ｍｌ）の混合物中に溶解させた。徐々に水（１ｍｌ）を添加しながら、この混合物を８０℃に加熱した。アミン特有の紫色が迅速に現われた。この試料を水で希釈して酢酸エチル中に抽出したものについて薄層クロマトグラフィーにより９−アセトアミド−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンが完全に検出されなくなるまで、加水分解を続けた。
【０１３６】
この反応混合物を氷冷水１５０ｍｌ中に添加し、生成物を吸引ろ過によって回収して水で洗浄し、乾燥させた。生成物が収率８５％で得られた。
【実施例４】
【０１３７】
「９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンのアミノアシル化」
実施例３中で得られた生成物を使用し、また、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃで保護された適切なアミノ酸を使用して、実施例２中に記載する工程を実施した。
【０１３８】
アミノ化化合物の脱保護は、トリフルオロ酢酸２ｍｌ中に溶解させた後、エーテルから沈澱させることによって実施した。このようにしてオレンジ色粉末状の生成物が得られ、薄層クロマトグラフィーによれば均質であった。
【実施例５】
【０１３９】
「９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｒ１／Ｒ２がナフタレンを形成し、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝ＨかつＲ６＝Ｃｌである式Ｉの化合物）の合成」
５．１＜９−ニトロ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
純度９５％の２−アミノニトロフェノール（アルドリッチ社）１．５４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、予め温度を沸点まで加熱した後２５℃に冷却した２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン（Ｆｌｕｋａ社）２．２６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のエタノール懸濁液中に添加した。この混合物を撹拌し、無水酢酸ナトリウム１ｇを添加した。数時間後、オレンジ色がかった褐色の沈殿が形成された。２４時間撹拌し続けた後、固体を吸引ろ過によって分離して乾燥させ、加熱した酢酸から再結晶させた（収率６５％）。
【０１４０】
５．２＜９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの調製＞
エタノール１０ｍｌ中に懸濁した銅ＩＩアセチルアセトナート１３０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を水素化ホウ素ナトリウム０．１８ｇ（５ｍｍｏｌ）と共に室温で撹拌し、この物質の触媒作用により褐色の化合物が形成された。（約１０分間）。上記５．１項で得られた化合物１．２９ｇ（４ｍｍｏｌ）をプロパン−１−オール１０ｍｌ中に懸濁した懸濁液をこの混合物に添加し、その後水素化ホウ素ナトリウム０．３７ｇ（１０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を３０℃において３時間撹拌した。
【０１４１】
冷却した後、この反応混合物を氷／水混合物中に添加し、続いてろ過によって粗生成物を回収し、乾燥させた。加熱したブタン−１−オール中にこれを溶解させ、ろ過して銅を含む物質を除去することによって精製した。濃縮した後に結晶化させることにより、表題の化合物０．６８ｇが得られた。
【実施例６】
【０１４２】
「９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンのアミノアシル化」
実施例５中で得られた生成物を使用し、また、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃで保護された適切なアミノ酸を使用して、実施例２中に記載する工程を実施した。
【０１４３】
アミノ化化合物の脱保護は、実施例２中に記載される方法も実施した。
【実施例７】
【０１４４】
「５−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−９−オン（Ｒ３／Ｒ４がナフタレンを形成し、かつ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｒ９＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
７．１＜ナフトフェノキサゾンの調製＞
上記Ｆｉｓｈｅｒ及びＨｅｐｐの方法とほぼ同様の方法により、縮合剤として塩化亜鉛を使用することによって、４−ニトロソフェノール及び２−ナフトールの縮合を氷酢酸中で実施した。
【０１４５】
加熱したトルエン／無機物から収率２５％で粗生成物を再結晶させた。
【０１４６】
ここで使用される４−ニトロソフェノールはＦｌｕｋａ社から入手した市販品であり、次の工程によって変換されたものである。エーテル中に溶解させ、Ｐｈａｓｅ−Ｓｅｐ紙でろ過してＮｏｒｉｔｅと共に１時間撹拌することによってこの生成物を精製した。ろ過した後、このエーテル溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させて量を減らし、冷却して純粋なニトロソフェノールの結晶を得た。
【０１４７】
７．２＜アミン物質の調製＞
上記Ｋｅｈｒｍａｎｎ及びＧｏｔｔｒａｕの方法によって、上記７．１項で得られたナフトフェノキサゾン３．０ｇ及びヒドロキシルアミン塩酸塩３．０ｇを無水エタノール２００ｍｌと混合し、この混合物を沸点まで徐々に加熱した。ナフトフェノキサゾンの赤色は徐々にオレンジ色に変化し、塩基の塩酸塩の沈澱が生じた。沈殿をろ過により除去して少量のエタノールで洗浄した後乾燥させることによって、塩酸塩が収率６３％で得られた。
【０１４８】
こうして得られた塩１ｇを水と共に加熱して分解させた後冷却することによって、遊離の塩基の緑色の残渣が得られた。溶解させるために十分量のＨＣｌを添加しながら、生成物をろ過して４０℃のエタノール数ｍｌ中に溶解させた。蛍光性の紫がかった赤色の溶液を十分量の無水酢酸ナトリウムと共に加熱して、遊離の塩基（濃緑色の針状金属）を得た。生成物をろ過して熱水で洗浄し、収率９７％となるまで乾燥させた。
【実施例８】
【０１４９】
「７−アミノ−１，２−（３’，４’−シクロペンテノ−２’−ピロニル）−フェノキサジン−３−オン（Ｒ１／Ｒ２がクマリンを形成し、Ｒ７及びＲ８が自身が結合している２つの炭素原子と共にシクロペンテンを形成し、かつ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
８．１＜５，７−ジヒドロキシ−３，４−シクロペンテノクマリンの調製＞
フロログルシノール３．０２ｇ（２４ｍｍｏｌ）及びエチル２−オキソシクロペンタンカルボキシレート３．１２ｇ（２０ｍｍｏｌ）を小型フラスコ中で少量のエタノールを使用して混合した。この混合物を冷却した後で撹拌している中に、硫酸／水の７５質量％の混合物３０ｍｌを添加した。室温で４８時間撹拌を継続した。得られた半固形の物質を、氷／水の混合物を入念に撹拌している中に添加してろ過した。残渣を水で入念に洗浄し、吸引により排水させて風乾させた。
【０１５０】
エタノールから再結晶させることによって得られた生成物は、薄層クロマトグラフィーによれば均質であった。収率は２．８ｇであった。
【０１５１】
８．２＜表題の化合物の調製＞
上記８．１項で得られた５，７−ジヒドロキシ−３，４−シクロペンテノクマリン２．１８ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加熱したエタノール４０ｍｌ中に溶解させ、これを撹拌している中に１，４−ジクロロ−ｐ−ベンゾキノンジイミン１．７４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を水浴上で数分間ゆっくりと還流させると、その間に液体の色が濃紫色になった。更に２０分間還流させた後、酢酸塩２ｇを含む氷／水の混合物２５０ｍｌ中に反応混合物を添加した。染料は、紺青色の沈殿として分離された。こうして得られた沈殿を吸引ろ過によって除去し、水で洗浄した。酢酸及びブタン−１−オールから再結晶させることにより、乾燥した生成物（１．５ｇ）を取得することができた。
【実施例９】
【０１５２】
「７−アミノ−１，２−（４’−メチル−２’−ピロニル）フェノキサジン−３−オン（Ｒ１／Ｒ２がクマリンを形成し、Ｒ８がメチル基であり、かつ、Ｒ７＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
９．１＜５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンの調製＞
フロログルシノール２．７７ｇ（２２ｍｍｏｌ）とアセト酢酸エチル２．６ｇ（２０ｍｍｏｌ）の混合物を溶解させて冷却し、半固形の塊に硫酸／水（７５％（ｗ／ｗ））の混合物４０ｍｌを迅速に添加した。この混合物を２４時間撹拌している間に、半固形の塊が形成された。酢酸ナトリウム５ｇを含む氷／水の混合物（３００ｍｌ）の中にこれを添加し、沈殿を吸引ろ過によって回収した。
【０１５３】
水で洗浄して乾燥させる工程を繰り返した後、粗生成物を加熱したエタノールから再結晶させることにより、クマリン３．０５ｇが得られた。
【０１５４】
９．２＜７−アミノ−１，２−（４’−メチル−２’−ピロニル）フェノキサジン−３−オンの調製＞
５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン１．９２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、無水メタノール５０ｍｌ中に溶解させた。発熱を緩和して生成物の塩素化を低減するため、この溶液を加熱して撹拌している中に尿素７．５ｇ（０．１２５ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を撹拌しながら２時間還流させ、その中に１，４−ジクロロベンゾキノンジイミン１．７４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を添加した。
【０１５５】
酢酸ナトリウム１０ｇを含む水／氷の混合物を入念に撹拌し、この中に上記濃紫色の溶液を添加した。濃紫色の沈殿を吸引ろ過によって除去し、乾燥させた。粗生成物を５０℃に加熱したメタノール２００ｍｌ中に懸濁し、この混合物を入念に撹拌している中に亜ジチオン酸ナトリウム５ｇと炭酸ナトリウム５ｇとを水２０ｍｌ中に溶解させた溶液を徐々に添加することによって、精製した。黄褐色の沈殿が形成された。
【０１５６】
この反応混合物を迅速にろ過することによって、ジヒドロ化合物の状態の染料の沈殿を分離させた。少量の亜ジチオン酸ナトリウムを含む氷／水の混合物でこれを洗浄し、これにより湿った沈殿をメタノール１００ｍｌ中に移した。この溶液を急速に撹拌して４０℃に加熱し、水を徐々に添加することによって無色の染料（ジヒドロ化合物の状態）を再度酸化させ、濃紫褐色の沈殿を取得できた。最後に、ろ過により回収した後で乾燥させた染料の酸化及び沈澱を、水１００ｍｌを添加することによって停止させた。薄層クロマトグラフィーにより紫色の化合物のみが示され、この化合物の少量はジヒドロ化合物の状態であることが分かった。
【実施例１０】
【０１５７】
「７−アミノ−１，２−（３’−カルボキシエチル−４’−メチル−２’−ピロニル）フェノキサジン−３−オン（Ｒ１／Ｒ２がクマリンを形成し、Ｒ７がカルボキシエチル基であり、Ｒ８がメチル基であり、かつ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈである式Ｉの化合物）の合成」
１０．１＜５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン酸エチルの調製＞
フロログルシノール２．７７ｇ（２２ｍｍｏｌ）及びアセチルグルタル酸ジエチル４．６０ｇ（２０ｍｍｏｌ）を混合して冷却し、硫酸／水の７５質量％混合物３５ｍｌと共に撹拌した。４８時間撹拌を継続した。こうして得られた物質を氷／水の混合物を撹拌している中に添加することによって分離し、吸引ろ過を実施した。残渣を水で入念に洗浄して風乾させた。
【０１５８】
こうして得られた物質を、エタノール中に懸濁して水酸化カリウム水溶液（３モル等量）と共に撹拌することによって、遊離の酸に直接変換した。４時間後、ｐＨ２の２Ｍ塩酸を添加することによって酸が沈殿した。多量の沈殿を吸引ろ過により除去して水で洗浄し、吸引によって排水させた。風乾させた後、所望の物質３．８ｇが得られた。
【０１５９】
１０．２＜表題の化合物の調製＞
この化合物を、１，４−ジクロロ−ｐ−ベンゾキノンジイミン及び上記１０．１項で得られた酸（等モル）を使用して、実施例８．１と同様に調製した。この反応混合物を氷／水の混合物中に添加し、塩酸を添加してｐＨ２にすることによって、遊離のカルボン酸の状態の染料を完全に沈澱させた。得られた乾燥物質は２．２ｇであった。
【実施例１１】
【０１６０】
「ロイシン−ペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１１．１＜検出用の媒体の調製＞
ｂｉｏｇｅｌｙｔｏｎｅ（ビオメリュー社）１．４ｇ、肉抽出物（ビオメリュー社）０．８４ｇ、ＮａＣｌ（メルク社）２．２４ｇ、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社）水溶液２８０μｌ（濃度１０ｇ／ｌ）及びＥｕｒｏｐｅａｎ ａｇａｒ（ビオメリュー社）４．２ｇを混合することにより、検出用の媒体を調製した。
【０１６１】
その後、実施例２中で得られた本発明の基質（アミノ酸がロイシン（ロイシン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｌｅｕ−ＡＢＰ））である）か、そうでなければ、従来技術の基質（ロイシン−アミノメチルクマリン（Ｌｅｕ−ＡＭＣ、ＢＡＣＨＥＭ社））を次の方法で添加した。浸透水（ｏｓｍｏｓｅｄ ｗａｔｅｒ）２８０ｍｌをこの媒体に添加し、この混合物を水浴中で１００℃において溶解させた。この混合物を１２１℃において１５分間オートクレーブし、水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１６２】
その後、ＤＭＳＯ（メルク社）中に溶解させた基質を、表１中に示す濃度に従って添加した。
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
その後、媒体をペトリ皿中に添加した。
【０１６５】
１１．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株１０株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの着色、拡散及びこの着色の濃さについて記録した。
【０１６６】
１１．３＜結果＞
結果は、着色の濃さを０〜４の任意のスケールを基準として、また、拡散を０〜４の任意のスケールを基準として表した。この結果を下記表２中に示す。表中、
−Ｔａはインキュベート時間、Ｃｂは増殖直径（ｍｍ）、Ｉｃは着色の濃さ、Ｃｏｄはコロニーの色、また、Ｄｅは拡散に相当し、
−Ｂは蛍光性青色、また、Ｒはピンク色に相当する。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
上記表１及び表２中に示す結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによってロイシン−ペプチダーゼ活性を示す微生物を0に分析できること、また、従来技術の基質と比較してコロニー周辺への拡散が非常に少ないことが実証される。
【実施例１２】
【０１６９】
「プロリル−ペプチダーゼを示す微生物の検出」
１２．１＜検出用の媒体の調製＞
酵母抽出物（ビオメリュー社）１．６８ｇ、ｂｉｏｃａｓｅ（ビオメリュー社）１．４ｇ、麦芽抽出物（ビオメリュー社）１．２６ｇ、グルコース（メルク社）０．０８ｇ及び寒天（ビオメリュー社）３．９２ｇを混合することによって、検出用の媒体を調製した。
【０１７０】
この粉末に浸透水２８０ｍｌを添加した後、この混合物を水浴中で１００℃において溶解させた。生成物を２つのフラスコ中に１４０ｍｌずつに分けた。１２１℃において１５分間オートクレーブを実施し、生成物を水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１７１】
その後、Ｌ−プロリル−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｐｒｏ−ＡＭＣ、ＢＡＣＨＥＭ社）を第一のフラスコ中に添加し（コントロール）、続いて、Ｌ−プロリル−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｐｒｏ−ＡＢＰ、実施例２中で得られたアミノ酸がＬ−プロリンである本発明の基質）を最終濃度５０ｍｇ／ｌとなるように第二のフラスコ中に添加した。
【０１７２】
１２．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株９株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの大きさ、着色及びこの着色の濃さについて記録した。
【０１７３】
１２．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表３中に示す。
【０１７４】
表３：従来技術の基質Ｐｒｏ−ＡＭＣ及び本発明の基質Ｐｒｏ−ＡＢＰによる微生物のプロリル−ペプチダーゼ活性
【０１７５】
【表３】
【０１７６】
上記表中で示した結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによってプロリル−ペプチダーゼ活性を示す微生物の分析、特にＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母の分離が明らかに可能となることが実証される。
【実施例１３】
【０１７７】
「アラニル−ペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１３．１＜検出用の媒体の調製＞
ｂｉｏｇｅｌｙｔｏｎｅ（ビオメリュー社）３．６ｇ、肉抽出物（ビオメリュー社）２．１６ｇ、麦芽抽出物（ビオメリュー社）１．２６ｇ、ＮａＣｌ（メルク社）５．７６ｇ及び寒天（ビオメリュー社）１０．８ｇを混合することによって、検出用の媒体を調製した。
【０１７８】
この粉末に浸透水７２０ｍｌを添加した後、この混合物を水浴中で５０℃において溶解させた。生成物を２つのフラスコ中に３６０ｍｌずつに分けた。１２１℃において１５分間オートクレーブを実施し、生成物を水浴中で１００℃まで冷却した。
【０１７９】
その後、Ｌ−アラニル−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｌａ−ＡＭＣ、ＢＡＣＨＥＭ社）を最終濃度５０ｍｇ／ｌとなるように第一のフラスコ中に添加し（コントロール）、続いて、Ｌ−アラニル−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ａｌａ−ＡＢＰ、実施例２中で得られたアミノ酸がＬ−アラニンである本発明の基質）を最終濃度２５ｍｇ／ｌとなるように第二のフラスコ中に添加した。
【０１８０】
１３．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株２５株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの大きさ、着色及びこの着色の濃さについて記録した。
【０１８１】
１３．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表４中に示す。
【０１８２】
表４：従来技術の基質Ａｌａ−ＡＭＣ及び本発明の基質Ａｌａ−ＡＢＰによる微生物のアラニル−ペプチダーゼ活性
【０１８３】
【表４】
【０１８４】
上記の表中で示した結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによってアラニル−ペプチダーゼ活性を示す微生物の分析、特にグラム陽性菌（活性を示さない）とグラム陰性菌（活性を示す）との分離が明らかに可能となることが実証される。
【実施例１４】
【０１８５】
「β−アラニンペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１４．１＜検出用の媒体の調製＞
Ｃｏｌｕｍｂｉａ媒体３００ｍｌを水浴中で１００℃において溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブした。その後、生成物を水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１８６】
この媒体を３つのフラスコ中に１００ｍｌずつに分け、この中に、アミノ酸がβ−アラニンである実施例４及び６の基質（それぞれ、β−アラニン−９−アミノ−６−カルボエトキシベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（β−Ａｌａ−ＡＣＡＰ）及びβ−アラニン−９−アミノ−６−クロロベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（β−Ａｌａ−ＡＣＨＰ））をＤＭＳＯ中に溶解させたものを、５０℃において下記表５中に示す濃度に従って添加した。
【０１８７】
【表５】
【０１８８】
その後、媒体をペトリ皿中に添加した。
【０１８９】
１４．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株９株を生理食塩水中に懸濁したものを、上記１４．１項中で調製した媒体上に、多点接種法により１０００００ｃｆｕ／点の割合で播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニー（菌株１つあたりコロニー１つ）の外観を調べた。
【０１９０】
１４．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表６中に示す。表中、ＲＰは淡いピンク色を示す。
【０１９１】
【表６】
【０１９２】
上記の表中に示す結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによって、（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株に特異的であって他の菌株は有していない）β−アラニンペプチダーゼ活性を示す微生物の分析が明らかに可能となることが実証される。
【実施例１５】
【０１９３】
「Ａが少なくとも二種のアミノ酸である基質を使用することによるアラニンペプチダーゼ活性を示す微生物の検出」
１５．１＜検出用の媒体の調製＞
Ｃｏｌｕｍｂｉａ媒体１０００ｍｌを水浴中で１００℃において溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブした。その後、これを水浴中で５０℃まで冷却した。
【０１９４】
この媒体を５つのフラスコ中に２００ｍｌずつに分け、この中に、Ａが以下であるような実施例２の基質を５０℃において添加した。基質はそれぞれＤＭＳＯ中に溶解させ、最終濃度５０ｍｇ／ｌで使用する。
−媒体１；Ｌ−アラニン（Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ａ−ＡＢＰ））、
−媒体２；Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン（Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ−［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＡＡ−ＡＢＰ））、
−媒体３；Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン（Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＡＡＡ−ＡＢＰ））、
−媒体４；Ｌ−アラニン−グリシン（Ｌ−アラニン−グリシン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＡＧ−ＡＢＰ））、また、
−媒体５；グリシン−Ｌ−アラニン（グリシン−Ｌ−アラニン−９−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＧＡ−ＡＢＰ）。
【０１９５】
その後、媒体をペトリ皿中に添加した。
【０１９６】
１５．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株９株を生理食塩水中に懸濁したものを、上記１５．１項中で調製した媒体上のコロニー中に、多点接種法により１５０００ｃｆｕ／点の割合で播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
【０１９７】
１５．３＜結果＞
段落１１．３中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表７及び表８中に示す。表中、Ｒはピンク色、ＲＰは淡いピンク色、また、Ｉは無色を示す。
【０１９８】
【表７】
【０１９９】
【表８】
【０２００】
表７及び表８中に示す結果から、本発明の発色性酵素基質を使用することによって、この基質のアミノ酸鎖長に関わらず、アラニンペプチダーゼ活性を有する微生物株の酵素発現の検出が明らかに可能となることが実証される。また、対象菌株に応じてアミノ酸の性質及び数を変えて基質の特異性及び感受性又は毒性の両方を変化させることにより、対象対象菌株の分析が可能である。
【実施例１６】
【０２０１】
「本発明の基質と従来技術の基質との併用による微生物の検出」
１６．１＜検出用の媒体の調製＞
酵母抽出物３．３ｇ、Ｂｉｏｃａｓｅ２．７５ｇ、麦芽抽出物２．４７５ｇ、グルコース０．１６５ｇ及び寒天７．７ｇを混合し、浸透水５５０ｍｌを添加した。
【０２０２】
この混合物を水浴中で１００℃において溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブした。その後、これを水浴中で５０℃まで冷却した。
【０２０３】
実施例２中で調製した本発明の基質（アミノ酸がプロリンである）を０．０５ｇ／ｌの割合で添加し、従来技術の他の基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコシドを０．０５ｇ／ｌの割合で添加した。
【０２０４】
その後、媒体をペトリ皿中に分けた。
【０２０５】
１６．２＜微生物菌株の播種＞
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株１２株を生理食塩水中に懸濁し、上記１６．１項中で調製した媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
【０２０６】
１６．３＜結果＞
下記の表９中に示す結果は、増殖の大きさ（ｍｍ）、活性及び色を示し、Ｔａはインキュベート時間、Ｒはピンク色、Ｏはオレンジ色、Ｖは緑色、Ｔは青緑色、Ｍは褐色、ＧＯはオレンジがかった灰色、また、ＧＶは灰色がかった緑色を示す。
【０２０７】
【表９】
【０２０８】
上記の表９中に示す結果から、菌株が示す酵素活性の着色特性は以下のように明瞭に観察されることが分かる：
−プロリンペプチダーゼ活性のみを有する菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の場合は、本発明の基質の加水分解によってピンク色からオレンジ色に着色し、
−β−グルコシダーゼ活性のみを有する菌株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｃｉｕｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の場合は、従来技術の基質の加水分解によって青緑色に着色し、また、
−二種の酵素活性を有する菌株（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｌｅｂｓｅｌｌｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の場合は、ピンク色／オレンジ色及び青緑色の二種の着色に由来して緑色から褐色に着色する。
【０２０９】
従って、各菌株に特異的ないくつかの異なる酵素活性は、これらの代謝により検出可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発色性酵素基質であって、
下記式（Ｉ）：
【化１】
：に相当し、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【化２】
：のナフタレン環、又は、式：
【化３】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【化４】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
（但し、
（ｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に前記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、Ｒ３及びＲ４は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表し（但し、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、Ｒ６はハロゲン原子を表す）、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない
ことを特徴とする発色性酵素基質。
【請求項２】
Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４のうち一方のみが自身が結合しているフェニル環と共に請求項１に記載の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成する
ことを特徴とする請求項１に記載の発色性酵素基質。
【請求項３】
下記式（Ｉａ）：
【化５】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項２に記載の発色性酵素基質。
【請求項４】
Ｒ５は水素原子を表し、Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項３に記載の発色性酵素基質。
【請求項５】
下記式（Ｉｂ）：
【化６】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項２に記載の発色性酵素基質。
【請求項６】
Ｒ５は水素原子であり、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基又はカルボキシアルキル基を表すか、そうでなければＲ７及びＲ８は自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項５に記載の発色性酵素基質。
【請求項７】
下記式（Ｉｃ）：
【化７】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９，Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項２に記載の発色性酵素基質。
【請求項８】
Ｒ５、Ｒ６及びＲ９基はそれぞれ水素原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項７に記載の発色性酵素基質。
【請求項９】
下記式（Ｉｄ）：
【化８】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項１に記載の発色性酵素基質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の発色性酵素基質の少なくとも一種を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した反応媒体。
【請求項１１】
培養基である
ことを特徴とする請求項１０に記載の媒体。
【請求項１２】
ゲル状である
ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の媒体。
【請求項１３】
少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発色性酵素基質又は請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体の使用。
【請求項１４】
少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための方法であって、
・請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の他の酵素活性と共に顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがアラニンである請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがプロリンである請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・インキュベートしておくこと、及び、
・Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１】
発色性酵素基質であって、
下記式（Ｉ）：
【化１】
：に相当し、
式中、
−Ｒ１及びＲ２は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【化２】
：のナフタレン環、又は、式：
【化３】
：の任意に置換されたクマリン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
−Ｒ３及びＲ４は、自身が結合しているフェニル環と共に式：
【化４】
：の任意に置換されたナフタレン環を形成するか、
−そうでなければ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基、−ＳＯ３Ｈ基又はスルホンアミド基を表し、
（但し、
（ｉ）Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に前記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、Ｒ３及びＲ４は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない）、
−Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表し（但し、Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、Ｒ６はハロゲン原子を表す）、
−Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ７及びＲ８は、自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、
−Ｒ９は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−ＣＯ２Ｈ基又は−ＳＯ３Ｈ基を表し（但し、Ｒ９が水素原子ではない場合にはＲ５が水素原子である）、
−Ｒ’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
−Ｒ’’は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表すか、
−そうでなければ、Ｒ’及びＲ’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない
ことを特徴とする発色性酵素基質。
【請求項２】
Ｒ１／Ｒ２及びＲ３／Ｒ４のうち一方のみが自身が結合しているフェニル環と共に請求項１に記載の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成する
ことを特徴とする請求項１に記載の発色性酵素基質。
【請求項３】
下記式（Ｉａ）：
【化５】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項２に記載の発色性酵素基質。
【請求項４】
Ｒ５は水素原子を表し、Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項３に記載の発色性酵素基質。
【請求項５】
下記式（Ｉｂ）：
【化６】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項２に記載の発色性酵素基質。
【請求項６】
Ｒ５は水素原子であり、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アラルキル基、アリール基又はカルボキシアルキル基を表すか、そうでなければＲ７及びＲ８は自身が結合している２つの炭素原子と共にＣ４〜Ｃ６環を形成し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項５に記載の発色性酵素基質。
【請求項７】
下記式（Ｉｃ）：
【化７】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９，Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項２に記載の発色性酵素基質。
【請求項８】
Ｒ５、Ｒ６及びＲ９基はそれぞれ水素原子を表し、Ａはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Ｘはｔ−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項７に記載の発色性酵素基質。
【請求項９】
下記式（Ｉｄ）：
【化８】
：に相当し、式中、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは請求項１に定義する通りである
ことを特徴とする請求項１に記載の発色性酵素基質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の発色性酵素基質の少なくとも一種を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した反応媒体。
【請求項１１】
培養基である
ことを特徴とする請求項１０に記載の媒体。
【請求項１２】
ゲル状である
ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の媒体。
【請求項１３】
少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発色性酵素基質又は請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体の使用。
【請求項１４】
少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び／又は定量するための方法であって、
・請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の他の酵素活性と共に顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがアラニンである請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母とＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種及びＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ種の酵母とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Ａがプロリンである請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・インキュベートしておくこと、及び、
・Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ種の酵母の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。
【公表番号】特表２００７−５０１０１８（Ｐ２００７−５０１０１８Ａ）
【公表日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３０４３７（Ｐ２００６−５３０４３７）
【出願日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０１９３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１５３６
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０１９３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１５３６
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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