酵素機能電極、バイオセンサ、及び燃料電池
【課題】安定して高電位を維持することができる酵素機能電極、その酵素電極を利用したバイオセンサ及び燃料電池を提供すること。
【解決手段】酵素機能電極１は、電極１１と、特定の基質９を酸化する酵素３と、を備え、前記基質９から前記酵素３を介して前記電極１１に電子が伝達されるものであって、前記酵素３は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットI（５）およびサブユニットIII（７）から構成されることを特徴とする。
【解決手段】酵素機能電極１は、電極１１と、特定の基質９を酸化する酵素３と、を備え、前記基質９から前記酵素３を介して前記電極１１に電子が伝達されるものであって、前記酵素３は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットI（５）およびサブユニットIII（７）から構成されることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばアルコール等の特定の基質から電子を引き抜く脱水素酵素の特性を利用する酵素機能電極、該酵素機能電極を利用して上記基質濃度を測定するバイオセンサ、及び上記基質を燃料として発電する燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素機能電極は、例えばアルコール、グルコース等の特定の基質（標的物質）を検知するセンサとして利用されており、特に、それら標的物質以外の成分の影響を受け難い利点を有するバイオセンサが各分野で広く利用されている。こうしたバイオセンサとしては、例えば、インシュリン療法で血中のグルコース濃度を制御している糖尿病患者に必要とされる血糖値センサ、疲労度の測定に必要とされる乳酸センサ、ワインなどのアルコール飲料や食料品の品質をモニタリングするために用いられるアルコールセンサなどが知られている。
【０００３】
また、やはり酵素機能電極を利用して、例えばグルコースやエタノールなどの基質を燃料として発電するバイオ電池（例えば体内埋め込み型の電池や、環境負荷の少ない電池等）が近年着目されている。こうしたバイオ電池は、化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する燃料電池の一種であり、
・白金等の貴金属を触媒に用いる必要がない。
・燃料のクロスオーバーによるエネルギー損失が発生しない。
・一酸化炭素等による触媒被毒が発生しない。
・室温稼動など動作条件が穏やかである。
といった多くの利点を有している。
【０００４】
このようなバイオセンサやバイオ電池（燃料電池）で使用される酵素機能電極に利用される酵素としては、酸素との反応性がないとの理由から脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が望ましいことが知られている。そして、生物が有する脱水素酵素には、例えば、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補因子とするもの、ＦＡＤ（フラビンアデニンヌクレオチド）を補因子とするもの、ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）を補因子とするもの、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）を補因子とするもの等がある。
【０００５】
このうち、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子とする酵素を用いる場合、電極からＮＡＤ（Ｐ）が漏れる問題があり、それを防止する目的で、ＮＡＤ（Ｐ）をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）等の高分子に固定する試みや、電極上に化学結合で固定する試みが行われてはいるが、いずれの試みでも、得られる電流は極めて小さい。また、ＮＡＤ（Ｐ）は電極上で電子を伝達する際に、不可逆性のダイマーになる傾向があり、それが原因で出力が低下するといった不具合も有している。このように、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子とする酵素は、バイオセンサやバイオ電池に応用するとき、信頼性の低下や劣化を招く要因を有している。
【０００６】
そこで近年は、ＰＱＱを補因子とする酵素をバイオセンサやバイオ電池の酵素として用いる検討がなされ始めている。このような酵素としては、例えば、膜結合型のグルコース脱水素酵素（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ由来）、可溶性のグルコース脱水素酵素（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．３４−１由来）、膜結合型のアルコール脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．３３由来）、可溶性のアルコール脱水素酵素（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来）等がある。
【０００７】
その中でも、バイオマスから生産可能なエタノールを酸化できる酵素は、環境に優しいバイオ電池用の触媒として注目されている。アルコールを燃料とする酵素機能電極に用いる酵素としては、特に、グルコノバクター由来の膜結合型アルコール脱水素酵素（ＡＤＨｔｙｐｅIII）が注目されている。例えば、非特許文献１に見られるように、グルコノバクター由来のＡＤＨｔｙｐｅIIIをグラファイト電極やカーボン電極、カーボンスクリーンプリント電極に固定して、電子メディエータを用いないで、アルコールの酸化電流を得る手段が開発されている。また、非特許文献２では、導電性高分子のポリピロール内にＡＤＨｔｙｐｅIIIを固定することで、アルコールの酸化電流を得ることに成功している。さらに、非特許文献３では、テトラブチルアンモニウムブロマイド（ＴＢＡＢ）により形成される、多孔質なナフィオン膜にＡＤＨｔｙｐｅIIIを固定した、酵素機能電極が、バイオ電池として働くことを示している。
【非特許文献１】Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ（エレクトロアナリシス） １４（２００２） ４３−４９
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（アナリティカル・ケミストリー） ７１（１９９９） ３５８１−３５８６
【非特許文献３】ＰＭＳＥ ９２（２００５） １９２−１９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した、ＰＱＱを補酵素としたＡＤＨｔｙｐｅIIIは、アルコールから奪った電子を先ずサブユニットI内のＰＱＱに渡す。電子は、引き続き、同じサブユニットI内に存在するヘムＣI、サブユニットII内のヘムＣII１と順次移動し、最終的にはヘムＣII２またはヘムＣII３にまで渡される。
【０００９】
ｐＨ７．０溶液におけるＡＤＨｔｙｐｅIIIのヘムＣIの電位は−１３０ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであるが、ＣII1の電位は４９ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであり、ＣII２およびＣII３の電位はいずれも１８８ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであるから、酵素内における電子の移動先であるヘムＣIIの酸化還元電位は、ヘムＣIの電位よりも高い。そのため、ヘムＣIからヘムＣIIを経て電極に電子が移動するときの電位差は、ヘムＣIから直接電極に電子移動する際の電位差よりも小さくなり、結果として、電極の性能が悪くなってしまう。
本発明は、以上の点に鑑みなされたものであり、安定して高電位を維持することができる酵素機能電極、その酵素電極を利用したバイオセンサ及び燃料電池を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）請求項１記載の酵素機能電極は、電極上に特定の基質を酸化する酵素を備え、基質から酵素を介して電極に電子が伝達される酵素機能電極であって、その酵素は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットIおよびサブユニットIIIから構成されるもの（以下、「ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）」とする）である。
【００１１】
このような構造を有する酵素機能電極では、サブユニットIのヘムＣIからサブユニットIIのヘムＣIIに電子が伝達することはなく、それが原因で起きる電圧降下も生じない。その結果、本発明の酵素機能電極を、例えば、バイオ電池のアノードに用いた場合、カソード極との間の酸化還元電位差で決まる電位は、従来のように、ＡＤＨｔｙｐｅIIIをそのまま活用する場合よりも、２００〜３００ｍＶ大きくなる。
【００１２】
また、サブユニットIIは疎水性表面を持ち、膜内に入り込む領域であるが、そのサブユニットIIを除くことで、本発明が備える酵素（アルコール脱水素酵素）は、界面活性剤を使用せずとも可溶化することが可能となり、酵素を固定化する手段やハンドリングなどの面で、膜蛋白質のような制限を受けなくて済む。
（２）請求項２の酵素機能電極では、酵素のうち、ヘムの存在する面が前記電極と接触する。このことにより、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）から電極に直接電子を伝達させることができる。この場合、酵素機能電極は、電子メディエータを備えなくても良いので、電子メディエータが酵素機能電極から外れて対極と反応し、クロスオーバー現象を引き起こしてしまうようなことがない。その結果、カソード極とアノード極との間のセパレータを無くすことが可能となる。
【００１３】
ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）と電極間の直接電子伝達を実現するためには、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のヘムＣI部周辺の露出部におけるアミノ酸において、疎水性、または極性非電荷の割合を高めることが好ましい。この場合、天然に存在するＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を用いても良いし、ヘムＣI部周辺の露出部におけるアミノ酸の組成を疎水性または極性非電荷の特性に改変したものを用いても良い。
【００１４】
また、酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを用いることも可能である。この場合、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が基質の酸化で得た電子を効率的に電極に渡すことが可能となり、電流量の向上が期待できる。特に、ヘムＣI部周辺の表面特性が電極面と反対の場合など、ヘムＣI部と電極面の距離が離れている場合でも、効率的に、電極に電子を伝達することができる。
（３）請求項３記載の酵素機能電極では、酵素が、グルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）が有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来である。この酵素のサブユニットIのヘムＣI周辺の露出面におけるアミノ酸組成は、その殆どが疎水性アミノ酸であり、アルギニンのみが電荷を帯びているアミノ酸である。その結果、請求項３記載の酵素機能電極では、電子メディエータを用いなくても、電極への効率的な電子伝達が可能となる。
（４）請求項４記載の酵素機能電極では、電極が、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料から成る。この材料を用いることにより、電極表面の形状や構造に制限されることなく、酵素から電極への電子伝達が容易に実現されるようになる。
（５）請求項５記載の酵素機能電極は、酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを備える。このことにより、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が基質の酸化で得た電子を効率的に電極に渡すことが可能となり、電流量の向上が可能となる。特に、ヘムＣI部周辺の表面特性が電極面と反対の場合など、ヘムＣI部と電極面の距離が離れている場合でも、効率的に、電極に電子を伝達することができる。
（６）請求項６記載のバイオセンサは、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備える。
【００１５】
本発明のバイオセンサは、備えている酵素機能電極の酵素により酸化される基質の濃度を的確に測定することができる。すなわち、酵素機能電極に電子メディエータを用いない場合は、ＡＤＨｔｙｐｅIIIのサブユニットIに存在するヘムＣIの酸化還元電位よりも正側の電位を電極に与えることにより、基質から酵素を介して電極に電子が伝達されることで得られる電流値として、基質の濃度が検知されるようになる。また、酵素機能電極に電子メディエータを用いる場合は、その電子メディエータよりも正側の電位を電極に与えることにより、基質から酵素を介して電極に電子が伝達されることで得られる電流値として、基質の濃度が検知されるようになる。本発明のバイオセンサとしては、例えば、アルコールの濃度を測定するバイオセンサが挙げられる。
（７）請求項７記載の燃料電池は、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備える。
【００１６】
本発明の燃料電池は、例えば、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極からなるアノード極と、酸素に電子を伝達することのできる触媒又は酵素のいずれかを保持するカソード極とを備え、アノード極とカソード極とが電気的に結合されるとともに、それら各電極間がイオン導電性を有する物質で隔てられる構造を有する。本発明の燃料電池は、上記構造を有することにより、アルコール燃料で発電できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明にかかる酵素機能電極、及びそれを用いたバイオセンサ及び燃料電池（バイオ電池）の実施の形態について、図１〜図６を参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態である酵素機能電極１の構造を模式的に示すものである。この酵素機能電極１は、特定の基質（標的物質）９を酸化する脱水素酵素３を触媒として、上記基質９から電極１１へと電子を伝達するものである。すなわち、酵素機能電極１は、特定の基質９を酸化する酵素３が電極１１の表面に固定されており、この酵素３が基質９を酸化することにより基質９から電子（ｅ-）が引き抜かれて酸化物１３が得られるとともに、酵素３が還元されることにより酵素３から電極１１に電子が伝達される。
【００１８】
酵素機能電極１で用いる酵素３は、サブユニットI（符合５）およびサブユニットIII（符合７）で構成される。この酵素３は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（グルコノバクター・サブオキシダンス）由来のキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（ＡＤＨｔｙｐｅIII）のサブユニットIおよびサブユニットIIIで構成される蛋白質からなる。酵素３から電極１１への電子の伝達は、このチトクロームＣI部位５ａを介して行われる。
【００１９】
また、チトクロームＣI部位５ａは、電子を放出する能力を有するヘム鉄が隣接するアミノ酸とともに外部に向けて露出する構造を有している。そして、これらヘム鉄に隣接するアミノ酸は、アルギニン以外は、疎水性アミノ酸が多く、電荷を有していないアミノ酸の割合が高くなっており、チトクロームＣI部位５ａの表面には、いわゆる疎水面が形成されている。この疎水面は、電極１１の表面に近接している。これにより、ヘム鉄と電極１１の表面との親和性が高められるとともに、ヘム鉄を電極１１の表面に近づけることができるようになるため、チトクロームＣI部位５ａから電極１１に直接電子を効率的に伝達することが可能になる。
【００２０】
図２は、本発明の他の実施形態である酵素機能電極の構造を模式的に示すものである。図２に示すように、酵素機能電極１では、特定の基質９を酸化する酵素３が電子メディエータ１５に化学結合しており、電子メデイエータ１５は電極１１の表面に固定されている。酵素３が基質９を酸化することにより、基質９から電子（ｅ-）が引き抜かれて酸化物１３が得られるとともに、酵素３が還元されることにより、酵素３から電子メディエータ１５に電子が伝達され、引き続き、電子メディエータ１５から電極１１に電子が伝達される。酵素３は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（グルコノバクター・サブオキシダンス）由来のキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（ＡＤＨｔｙｐｅIII）のサブユニットIおよびサブユニットIIIで構成される蛋白質からなる。
【００２１】
酵素機能電極１で検知することのできる基質９としては、例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、１、２−プロパンジオール等のアルコールが挙げられる。
電極１１としては、電極表面の形状や構造に制限されることなく、導電性のある物質なら全てのものを用いることができ、例えば、カーボン材、導電性金属、半導体材料および金属酸化物などを用いることができる。このうち、特に好ましいものはカーボン材である。このようなカーボン材としては、例えばカーボン紙、（カーボンスクリーンプリント電極）、カーボンフェルト、カーボンブラック、カーボンパウダー、カーボンペースト、カーボン繊維、単層カーボンナノチューブ、２層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブアレイ、グラッシーカーボン、ダイヤモンドコート、メソポーラスカーボングラファイト、多結晶グラファイトおよび熱分解黒鉛等が挙げられる。またこれらうち、特にメソポーラスカーボングラファイト等の多孔質な構造を有する電極１１を用いれば、その多孔質内部にＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を物理的に固定することができるため、電極１１の耐熱性や寿命の向上を図ることができる。また、カーボンナノチューブを含む電極１１を用いれば、カーボンナノチューブにＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を直接固定することができるため、カーボンナノチューブの有する高い比表面積により高い電流密度を確保することが可能となる。
【００２２】
電極１１の表面は疎水性であるか、疎水性の官能基で修飾されていることが好ましい。こうすることにより、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のＣ１露出面に形成される疎水面と、疎水性の電極１１の表面とが近づきやすくなるため、チトクロームＣ１から外部に向けて露出するヘム鉄と電極１１の表面とが近づきやすくなる。
【００２３】
酵素機能電極１において、酵素３、すなわち、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を電極１１に固定する方法としては、例えば、図３（ａ）〜（ｃ）に示す方法がある。なお、図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、電極１１の表面に酵素３が固定される構造を模式的に示す断面図である。
【００２４】
すなわち、図３（ａ）に示すように、酵素３は、電極１１の表面に形成された電極孔１７内に固定することができる。この場合、酵素３は、電極１１の表面に物理的に吸着されても良いし、電極１１の表面上にゲル状物質で固定されても良いし、電極１１の表面を被膜する高分子の中に物理的に固定されても良いし、電極１１の表面上のポテンシャル場にしたがって物理的に吸着されても良い。
【００２５】
また、図３（ｂ）に示すように、酵素３は、パウダー状に加工された電極材（例えばカーボンペースト）１１ａの中に混合されていても良い。ここで、パウダー状に加工された電極材１１ａにおけるパウダー粒子の大きさは特に制限されない。また、パウダー間をバインダーで固めても良いし、パウダー間にリン脂質等を含ませて酵素３の流動性を持たせても良いし、パウダー間に各種物質を入れても良い。
【００２６】
また、図３（ｃ）に示すように、酵素３を、電極１１の表面の官能基１９と架橋剤２１による化学結合を通じて固定しても良い。電極１１の表面の官能基１９としては、例えば、アミノ基、チオール基、カルボニル基および水酸基等が挙げられ、官能基１９の鎖長は短いほど好ましい。また、架橋剤２１としては、例えば、水溶性カルボニルイミド、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコール・ジグリシジル・エステル、ジメチルピメミリデイトおよびジメチルスベリミデイト等が挙げられる。
【００２７】
なお、これら図３（ａ）〜（ｃ）に示す電極構造は、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）に電子メデイエータ（図示略）が接する構造であっても良い。電子メディエータと、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）との間は、化学的な結合を介して固定しても良い。
更に、これら図３（ａ）〜（ｃ）に示す電極構造においては、電極１１の表面がさらにイオン導電性を有するゲル状物質を主成分とする保護材２３で保護されていても良い。この保護材２３は、ゲル状物質以外に適宜の膜材等も使用することができる。こうした膜材やゲル状物質としては、例えば、陽イオンを含むナフィオン樹脂（商品名、Ｄｕ Ｐｏｎｔ社製）、光架橋性のスチルバゾリウム化ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、アガロースゲル、アルギン酸ゲルおよびアクリルアミドゲル等が挙げられる。こうした膜材やゲル状物質にイオン化物を適当な割合で混合することにより、酵素３から電極１１に電子を伝達する反応と、電極１１がプロトンを放出する反応とを両立させることが可能となるため、酵素３から電極１１への電子伝達能力をさらに高めることができる。
【００２８】
図４は、酵素機能電極１を用いた３電極式の電気化学測定用セル２５の構造を模式的に示すものである。図４に示すように、電気化学測定用セル２５は、作用電極Ｗ、参照電極Ｒおよび対極Ａから構成されており、このうち作用電極Ｗとして、上述したグラッシーカーボン電極にＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いる。また、参照電極Ｒとして、Ａｇ／ＡｇＣｌ（銀／塩化銀）電極を用い、対極Ａとして白金電極を用いる。
【００２９】
このような電気化学測定用セル２５において、作用電極Ｗに電圧が加えられると、作用電極Ｗの表面にて酸化還元反応が起こり、その印加電圧が参照電極Ｒの電位の基準とされ、電位制御回路によりその電位が制御される。ここで、電気化学測定用セル２５中に基質として、例えば、一定濃度のエタノールを加えると、作用電極Ｗおよび対極Ａ間にエタノールの酸化電流が流れ、電流測定回路にてその電流値が測定される。
【００３０】
図５は、こうした原理に基づき、酵素機能電極１を利用してセルＣｅ中の基質濃度を検知するバイオセンサの一例を模式的に示すものである。図５に示すように、このバイオセンサ２７も、図４に例示した電気化学測定用セル２５と同様に、作用電極Ｗ、参照電極Ｒおよび対極Ａを備えている。また、作用電極Ｗとしても、図４におけるセル２５と同様に、グラッシーカーボン電極にＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いる。ここで、セルＣｅ中に基質として、例えばエタノールを添加し、その添加量を段階的に増やしていくと、エタノール濃度の増加に伴って電流値の上昇が観察される。このように、作用電極Ｗとして、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いることにより、基質濃度を測定可能なバイオセンサ２７を得ることができる。
【００３１】
また、図６は、酵素機能電極１を利用して検知される基質を燃料として発電する燃料電池の一例を模式的に示すものである。燃料電池２９は、燃料供給タンク３１から燃料が供給される燃料拡散電極（アノード極）３３と、空気供給タンク３５から空気が供給される空気拡散電極（カソード極）３７とを有する。また、これらアノード極３３とカソード極３７との間には電解質膜３９が充填されている。そして、アノード極３３の電解質膜３９側には酵素担持面４１が形成されており、カソード極３７の電解質膜３９側には触媒担持面４３が形成されている。ここで、上記アノード極３３は、グラッシーカーボン電極の酵素担持面４１に、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を固定したものであり、上述した酵素機能電極１と同様のものである。また、カソード極３７は白金電極であり、その触媒担持面４３には白金が固定されている。
【００３２】
このような燃料電池２９において、燃料として基質であるエタノールが供給されると、アノード極３３ではエタノールがＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）により酸化されることで水素が発生するとともに酸化還元反応電流が得られ、カソード極３７では供給される空気（酸素）と電解質膜４１を通じて得られる水素との反応により水が生成される。すなわち、基質を燃料とした発電が行われるようになる。なお、カソード極３７の触媒担持面４３に固定される触媒としては、白金以外にも、例えば、ジアホラーゼ酵素、プルオキシターゼ酵素、およびその他酸素の還元を実現する錯体触媒等を用いることができる。
【００３３】
以上に説明した、この実施の形態にかかる酵素機能電極１、該酵素機能電極１を利用した電気化学測定用セル２５、バイオセンサ２７、又は燃料電池２９によれば、以下に列記するような効果が得られる。
【００３４】
（１）酵素機能電極１が備える酵素３は、グルコノバクター・サブオキシダンスが有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来であり、サブユニットIIを持たない、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）からなる。サブユニットIのヘムＣIの酸化還元電位は、サブユニットIIの酸化還元電位よりも低いので、サブユニットIIを含まない酵素３の酸化還元電位は、従来のアルコール脱水素酵素よりも低くなる。
【００３５】
そのため、酵素機能電極１を備えたセンサを用いて、基質（例えばエタノール等のアルコール）の酸化により発生する酸化電流を検知する場合、酵素機能電極１について設定する酸化還元電位値を、従来のアルコール脱水素酵素電極を用いた時よりも、広い範囲内（特に低い酸化還元電位で）で設定することが可能となる。その結果、測定サンプル内に存在するビタミン類などの夾雑物由来の酸化還元ピークと重ならない酸化還元電位値を、酵素機能電極１について設定することが可能となり、より信頼性の高いセンサを実現することができる。また、酵素機能電極としての出力向上も可能である。
【００３６】
（２）電極１１の材料は、電極１１の表面の形状や構造によって制限されることがなく、例えば、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料とすることができる。このため、電極１１の材料として、例えば、電極１１への溶液の浸透が発生しにくく、出力低下の発生が抑制される材料を選択することができる。また、特にカーボン材を電極１１として用いれば、上記ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）におけるチトクロームＣ１部とカーボン材との間の電子伝達能力に優れているため、酵素３から電極１１への電子伝達がより円滑に実現されるようになる。
【００３７】
（３）電極１１の表面は、疎水性であるか、あるいは疎水性の官能基で修飾されているものとすることができる。この場合、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のチトクロームＣ１において外部に露出されるヘム鉄の露出部位の周辺が、疎水性アミノ酸や非電荷アミノ酸に覆われるようになる。すなわち、疎水性の電極１１の表面に対してヘム鉄がより近づきやすくなり、酵素３から電極１１への電子伝達能力がより高められる。また、チトクロームＣ１の表面に形成される疎水面と、疎水性の電極１１の表面とが近接することにより、酵素３の、電極１１の表面上でのより高い配向制御が可能となるため、酵素機能電極１のさらなる出力向上が可能となる。
【００３８】
（４）酵素３である、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）は、イオン導電性を有する膜、あるいはゲル状物質からなる保護材２３により保護することができる。これにより、酵素３から電極１１に電子を伝達する反応と、酵素３からプロトンが放出される反応とが両立されるようになり、ひいては、電子伝達能力がさらに高まる。
【００３９】
（５）酵素機能電極１を通じて基質９の濃度を測定する電気化学測定用セル２５、バイオセンサ２７を構成すれば、酵素機能電極１に用いられる酵素３により酸化される基質９の濃度を的確に測定することができる。すなわち、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のチトクロームＣ１の酸化還元電位よりも正側の電位を電極１１に与えることにより、酵素３により基質９から電子が伝達されるときに、基質９の濃度に対応する電流値が検知される。
【００４０】
（６）酵素機能電極１からなるアノード極３３と、酵素３に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極３７とを備え、アノード極３３とカソード極３７とを電気的に結合するとともに、それら各電極間をイオン導電性を有する物質で隔てる燃料電池２９を構成することもできる。これにより、酵素機能電極１に用いられる酵素３により酸化される基質９を燃料として発電する燃料電池２９であって、より発電能力の高い電池２９を安定して実現することができる。特に、ＡＤＨｔｙｐｅIIIに存在するサブユニットIIを除くことで、酵素３内で生じる電位降下を防ぐことが可能となり、より高い電位を確保できるバイオ電池２９を実現することができる。
【００４１】
次に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４２】
ａ）ＡＤＨtypeIII(Complex)の調製
糖分を多めにした培地で増殖させた、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓを遠心処理（９、０００Ｇ×１０ｍｉｎ）で回収し、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。洗浄菌体の湿重１ｇを５ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁させ、フレンチプレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）を用い、１６、０００ｐｓｉの条件下で菌を破壊した。引き続き、遠心処理（９、０００Ｇ×１０ｍｉｎ）により、菌破砕残渣を取り除いた。
【００４３】
上清を回収し、超遠心分離処理（８、６００Ｇ×９０ｍｉｎ）により膜画分を沈殿させた。膜画分を、蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍＬになるように、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁させ、終濃度が１．０％（ｗ／ｖ）になるように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた。４℃で６０ｍｉｎ間インキュベートした後、超遠心処理（８、６００Ｇ×９０ｍｉｎ）で可溶化したＡＤＨを上清にて回収し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を外液として透析処理をおこなった。
【００４４】
０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに透析済みの蛋白液をアプライし、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の濃度勾配（５−５０ｍＭ）により、ＡＤＨを溶出させた。２０−３０ｍＭのフラクション領域にＡＤＨ活性のある画分は溶出され、その画分を回収した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、ＡＤＨtypeIIIを含む蛋白溶液を得た。このＡＤＨtypeIIIは、サブユニットI、サブユニットII、及びサブユニットIIIを全て備えたもの（以下、「ＡＤＨtypeIII(Complex)」とする）である。
【００４５】
ｂ）ＡＤＨtypeIII（I/III）の調製
前記ａ）で得られた透析後の蛋白溶液を、同じ緩衝液で平衡化した、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにアプライした。０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭの酢酸緩衝液で洗浄した後、更にカラムに対して５倍容量の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄した。その際、ＡＤＨのサブユニットIIが溶出した。カラムに吸着したＡＤＨは、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度勾配（４０−１００ｍＭ）により溶出させた。
【００４６】
その結果、７０ｍＭ付近に、ＡＤＨtypeIII(Complex)が溶出された。引き続き、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度勾配（１００−２００ｍＭ）により溶出させた。さらに、カラムに対して５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）により、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）画分を溶出させた。
【００４７】
このようにして得られた３．３５ｍｇ／ｍＬ濃度のＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４００μLを、透析遠心チューブ（ＭＷＣＯ:５０、０００）で５０μLに濃縮し、４００μLの５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて攪拌後、再度、透析遠心チューブで５０μLに濃縮した。この透析遠心処理を合計３回行った。
【００４８】
このようにして得られたＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）を含む溶液を、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１ｍＬ容積）にアプライした。２５ｍＬの５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）を溶出させた。ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液は、遠心透析チューブで１５０μLに濃縮した後に回収した。この操作により、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）に吸着していた界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を取り除くことができた。
【００４９】
ｃ）酵素機能電極１の製造
酵素機能電極１は、図７（ａ）、（ｂ）に示すように、φ３ｍｍである棒状のＧＣ電極１１と、その先端付近において、ＧＣ電極１１の外周を覆うように取り付けられた筒状のゴムパッキン４５と、ＧＣ電極１１及びゴムパッキン４５の間を満たす樹脂４７とを備えている。ゴムパッキン４５の端部４５ａは、ＧＣ電極１１の上面１１ａよりも上方（図７における上方向）に張り出しており、ＧＣ電極１１の上方には、周囲をゴムパッキン４５で囲まれた液保持部４９が形成されている。
【００５０】
この液保持部４９に、前記ｂ）で得られたＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLを滴下し、さらに、１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１５μL加え、その後、市販の透析膜（ＭＷＣＯ:２５、０００）５１で液保持部４９の上方を覆い、酵素機能電極１を完成した。
【００５１】
ｄ）ＣＶ測定
前記ｃ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む、０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．２Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。その結果を図８に示す。図８から明らかなとおり、０Ｖ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ前後に、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）の酸化還元ピークが観察された。
【実施例２】
【００５２】
ａ）電子メディエータを備えた酵素機能電極１の製造
０．１Ｍ ＬｉＣｌと１ｍＭ エチレンジアミンを含むエタノール溶液中に、φ3ｍｍのＧＣ電極を浸し、０〜１４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で、１０ｍＶ／ｓの掃引速度でサイクリック・ボルタメトリー（ＣＶ）した。この処理により、電極表面にＮＨ2基が付加された。
【００５３】
このエチレンジアミン処理したＧＣ電極を用いて、基本的には前記実施例１のｃ）と同様の構造を有する酵素機能電極１を製造した。ただし、液保持部４９に入れる液は、１５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＶＩ-Ｏｓ錯体（酸化還元電位：＋１００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）１μL、前記実施例１のｂ）にて調製したＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）４μL、及び０．１２５％のグルタルアルデヒド溶液１μLとした。そして、この液を加えた後、３０℃で２ｈｒ固定するようにした。なお、ＰＶＩ-Ｏｓ錯体は電子メディエータとして機能し、グルタルアルデヒドは架橋剤として機能する。
【００５４】
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．３Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。その結果を図９に示す。Ｏｓ錯体由来の酸化還元ピークが５０ｍＶ、及び１５０ｍＶ付近に観察された。
【００５５】
引き続き、終濃度０．１％になるようにエタノールを加え、上記と同様の条件でＣＶ測定を実施した。その結果も図９に示す。エタノールを加える前のＣＶ波形と異なり、エタノールの酸化電流が観測された。
【００５６】
ｃ）定電位測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の定電位測定を実施した。エタノールを添加しない緩衝液中で電流値が安定した後、終濃度０．１％になるようにエタノールを加えた。その結果、図１０に示すように、電流が観測された。
【実施例３】
【００５７】
ａ）酵素機能電極の製造
０．１Ｍ ＬｉＣｌと、１ｍＭ エチレンジアミンとを含むエタノール溶液中にφ3ｍｍのＧＣ電極を浸し、０〜１４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で１０ｍＶ／ｓの掃引速度でサイクリック・ボルタメトリー（ＣＶ）した。この処理により、電極表面にＮＨ2基が付加された。
【００５８】
このエチレンジアミン処理したＧＣ電極を用いて、基本的には前記実施例１のｃ）と同様の構造を有する酵素機能電極１を製造した。ただし、液保持部４９に入れる液は、１５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＶＩ-Ｏｓ錯体（酸化還元電位：−１００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）１μL、前記実施例１のｂ）にて調製したＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）４μL、及び０．１２５％のグルタルアルデヒド用溶液１μLとした。そして、この液を加えた後、３０℃で２ｈｒ固定するようにした。
【００５９】
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．３Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。引き続き、終濃度０．１％になるようにエタノールを加え、上記と同様の条件でＣＶ測定を実施した。それらの結果を合わせて図１１に示す。エタノールの添加によりＣＶ波形は変化し、酸化電流が観測された。
（比較例１）
ａ）酵素機能電極の製造
基本的には、前記実施例１のｃ）と同様であるが、液保持部４９に滴下する溶液として、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLの代わりに、同量のＡＤＨtypeIII(Complex)液を用いて、酵素機能電極を製造した。ここで用いたＡＤＨtypeIII(Complex)液は、前記実施例１のａ）で回収したＡＤＨtypeIII(complex)を濃縮し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したものである。
ｂ）測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極を用い、前記実施例１のｃ）と同様の方法でＣＶ測定を実施した。その結果を図１２に示す。図１２から明らかなとおり、酸化還元ピークは全く見られなかった。
（比較例２）
ａ）電極の製造
基本的には、前記実施例２のａ）と同様であるが、液保持部４９に滴下する溶液として、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLの代わりに、同量のＡＤＨtypeIII(Complex)液を用いて電極を製造した。ここで用いたＡＤＨtypeIII(Complex)液は、前記実施例１のａ）で回収したＡＤＨtypeIII(Complex)を濃縮し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したものである。
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極を用い、前記実施例２のｂ）と同様の方法でＣＶ測定を実施した。その結果を図１３に示す。図１３から明らかなとおり、エタノールを添加する前と後とで、ＣＶ波形は変化しなかった。
【００６０】
なお、本発明は、上記実施の形態として示した構成に限らず、これらを適宜変更した、以下の態様にて実施することもできる。
例えば、上記各実施例では、酵素３を、グルコノバクター・サブオキシダンス由来のアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（I／III）とした。しかしながら、サブユニットI、II、及びIIIからなるヘテロ３量体の膜蛋白質である、ＡＤＨｔｙｐｅIIIを持つ菌株は他にも存在しており、それらの菌由来のＡＤＨｔｙｐｅIIIでも、サブユニットIIを除いた構造のものであれば、問題なく使うことができる。
【００６１】
また、グルコンアセトバクター・ユーロパエオス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）やグルコンアセトバクター・キシリナンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）など、サブユニットIIIが存在しないＡＤＨｔｙｐｅIIIもある。このような種類のＡＤＨについては、サブユニットIのみからなる、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I）を用いることができる。いずれの場合においても、サブユニットIに存在する低電位のヘムＣから電極に電子を伝達できる構造であれば、特に制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】酵素機能電極（電子メディエータなし）の構造を模式的に表す説明図である。
【図２】酵素機能電極（電子メディエータあり）の構造を模式的に表す説明図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、酵素の電極への固定態様を模式的に表す断面略図である。
【図４】酵素機能電極が適用される３極式電気化学セルの構造を模式的に表す説明図である。
【図５】酵素機能電極が適用されるバイオセンサの構造を模式的に表す平面図である。
【図６】酵素機能電極が適用される燃料電池の構造を模式的に表す説明図である。
【図７】電極の構成を表す説明図であって、（ａ）は側断面図であり、（ｂ）は上面図である。
【図８】界面活性剤を取り除いたＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【図９】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体およびＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【図１０】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体およびＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）において、終濃度０．１％のエタノールを添加した後の定電位（４００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）測定した際の電流値を表すグラフである。
【図１１】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体および酵素において、終濃度０．１％のエタノールを添加する前と後のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【図１２】ＡＤＨtypeIII(Complex)のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１３】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体１およびＡＤＨtypeIII(Complex)のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【符号の説明】
【００６３】
１・・・酵素機能電極 ３・・・酵素 ５・・・サブユニットI
７・・・サブユニットIII ９・・・基質 １１・・・電極
１３・・・酸化物 １５・・・電子メディエータ １７・・・電極孔
１９・・・官能基 ２１・・・架橋剤 ２３・・・保護材
２５・・・電気化学測定用セル ２７・・・バイオセンサ ２９・・・燃料電池
３１・・・燃料供給タンク ３３・・・アノード極 ３５・・・空気供給タンク
３７・・・カソード極 ３９・・・電解質膜 ４１・・・酵素担持面
４３・・・触媒担持面 ４５・・・ゴムパッキン ４７・・・樹脂
４９・・・液保持部 ５１・・・透析膜 Ｒ・・・参照電極
Ｗ・・・作用電極 Ａ・・・対極
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばアルコール等の特定の基質から電子を引き抜く脱水素酵素の特性を利用する酵素機能電極、該酵素機能電極を利用して上記基質濃度を測定するバイオセンサ、及び上記基質を燃料として発電する燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素機能電極は、例えばアルコール、グルコース等の特定の基質（標的物質）を検知するセンサとして利用されており、特に、それら標的物質以外の成分の影響を受け難い利点を有するバイオセンサが各分野で広く利用されている。こうしたバイオセンサとしては、例えば、インシュリン療法で血中のグルコース濃度を制御している糖尿病患者に必要とされる血糖値センサ、疲労度の測定に必要とされる乳酸センサ、ワインなどのアルコール飲料や食料品の品質をモニタリングするために用いられるアルコールセンサなどが知られている。
【０００３】
また、やはり酵素機能電極を利用して、例えばグルコースやエタノールなどの基質を燃料として発電するバイオ電池（例えば体内埋め込み型の電池や、環境負荷の少ない電池等）が近年着目されている。こうしたバイオ電池は、化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する燃料電池の一種であり、
・白金等の貴金属を触媒に用いる必要がない。
・燃料のクロスオーバーによるエネルギー損失が発生しない。
・一酸化炭素等による触媒被毒が発生しない。
・室温稼動など動作条件が穏やかである。
といった多くの利点を有している。
【０００４】
このようなバイオセンサやバイオ電池（燃料電池）で使用される酵素機能電極に利用される酵素としては、酸素との反応性がないとの理由から脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が望ましいことが知られている。そして、生物が有する脱水素酵素には、例えば、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補因子とするもの、ＦＡＤ（フラビンアデニンヌクレオチド）を補因子とするもの、ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）を補因子とするもの、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）を補因子とするもの等がある。
【０００５】
このうち、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子とする酵素を用いる場合、電極からＮＡＤ（Ｐ）が漏れる問題があり、それを防止する目的で、ＮＡＤ（Ｐ）をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）等の高分子に固定する試みや、電極上に化学結合で固定する試みが行われてはいるが、いずれの試みでも、得られる電流は極めて小さい。また、ＮＡＤ（Ｐ）は電極上で電子を伝達する際に、不可逆性のダイマーになる傾向があり、それが原因で出力が低下するといった不具合も有している。このように、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子とする酵素は、バイオセンサやバイオ電池に応用するとき、信頼性の低下や劣化を招く要因を有している。
【０００６】
そこで近年は、ＰＱＱを補因子とする酵素をバイオセンサやバイオ電池の酵素として用いる検討がなされ始めている。このような酵素としては、例えば、膜結合型のグルコース脱水素酵素（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ由来）、可溶性のグルコース脱水素酵素（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．３４−１由来）、膜結合型のアルコール脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．３３由来）、可溶性のアルコール脱水素酵素（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来）等がある。
【０００７】
その中でも、バイオマスから生産可能なエタノールを酸化できる酵素は、環境に優しいバイオ電池用の触媒として注目されている。アルコールを燃料とする酵素機能電極に用いる酵素としては、特に、グルコノバクター由来の膜結合型アルコール脱水素酵素（ＡＤＨｔｙｐｅIII）が注目されている。例えば、非特許文献１に見られるように、グルコノバクター由来のＡＤＨｔｙｐｅIIIをグラファイト電極やカーボン電極、カーボンスクリーンプリント電極に固定して、電子メディエータを用いないで、アルコールの酸化電流を得る手段が開発されている。また、非特許文献２では、導電性高分子のポリピロール内にＡＤＨｔｙｐｅIIIを固定することで、アルコールの酸化電流を得ることに成功している。さらに、非特許文献３では、テトラブチルアンモニウムブロマイド（ＴＢＡＢ）により形成される、多孔質なナフィオン膜にＡＤＨｔｙｐｅIIIを固定した、酵素機能電極が、バイオ電池として働くことを示している。
【非特許文献１】Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ（エレクトロアナリシス） １４（２００２） ４３−４９
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（アナリティカル・ケミストリー） ７１（１９９９） ３５８１−３５８６
【非特許文献３】ＰＭＳＥ ９２（２００５） １９２−１９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した、ＰＱＱを補酵素としたＡＤＨｔｙｐｅIIIは、アルコールから奪った電子を先ずサブユニットI内のＰＱＱに渡す。電子は、引き続き、同じサブユニットI内に存在するヘムＣI、サブユニットII内のヘムＣII１と順次移動し、最終的にはヘムＣII２またはヘムＣII３にまで渡される。
【０００９】
ｐＨ７．０溶液におけるＡＤＨｔｙｐｅIIIのヘムＣIの電位は−１３０ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであるが、ＣII1の電位は４９ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであり、ＣII２およびＣII３の電位はいずれも１８８ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであるから、酵素内における電子の移動先であるヘムＣIIの酸化還元電位は、ヘムＣIの電位よりも高い。そのため、ヘムＣIからヘムＣIIを経て電極に電子が移動するときの電位差は、ヘムＣIから直接電極に電子移動する際の電位差よりも小さくなり、結果として、電極の性能が悪くなってしまう。
本発明は、以上の点に鑑みなされたものであり、安定して高電位を維持することができる酵素機能電極、その酵素電極を利用したバイオセンサ及び燃料電池を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）請求項１記載の酵素機能電極は、電極上に特定の基質を酸化する酵素を備え、基質から酵素を介して電極に電子が伝達される酵素機能電極であって、その酵素は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットIおよびサブユニットIIIから構成されるもの（以下、「ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）」とする）である。
【００１１】
このような構造を有する酵素機能電極では、サブユニットIのヘムＣIからサブユニットIIのヘムＣIIに電子が伝達することはなく、それが原因で起きる電圧降下も生じない。その結果、本発明の酵素機能電極を、例えば、バイオ電池のアノードに用いた場合、カソード極との間の酸化還元電位差で決まる電位は、従来のように、ＡＤＨｔｙｐｅIIIをそのまま活用する場合よりも、２００〜３００ｍＶ大きくなる。
【００１２】
また、サブユニットIIは疎水性表面を持ち、膜内に入り込む領域であるが、そのサブユニットIIを除くことで、本発明が備える酵素（アルコール脱水素酵素）は、界面活性剤を使用せずとも可溶化することが可能となり、酵素を固定化する手段やハンドリングなどの面で、膜蛋白質のような制限を受けなくて済む。
（２）請求項２の酵素機能電極では、酵素のうち、ヘムの存在する面が前記電極と接触する。このことにより、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）から電極に直接電子を伝達させることができる。この場合、酵素機能電極は、電子メディエータを備えなくても良いので、電子メディエータが酵素機能電極から外れて対極と反応し、クロスオーバー現象を引き起こしてしまうようなことがない。その結果、カソード極とアノード極との間のセパレータを無くすことが可能となる。
【００１３】
ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）と電極間の直接電子伝達を実現するためには、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のヘムＣI部周辺の露出部におけるアミノ酸において、疎水性、または極性非電荷の割合を高めることが好ましい。この場合、天然に存在するＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を用いても良いし、ヘムＣI部周辺の露出部におけるアミノ酸の組成を疎水性または極性非電荷の特性に改変したものを用いても良い。
【００１４】
また、酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを用いることも可能である。この場合、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が基質の酸化で得た電子を効率的に電極に渡すことが可能となり、電流量の向上が期待できる。特に、ヘムＣI部周辺の表面特性が電極面と反対の場合など、ヘムＣI部と電極面の距離が離れている場合でも、効率的に、電極に電子を伝達することができる。
（３）請求項３記載の酵素機能電極では、酵素が、グルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）が有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来である。この酵素のサブユニットIのヘムＣI周辺の露出面におけるアミノ酸組成は、その殆どが疎水性アミノ酸であり、アルギニンのみが電荷を帯びているアミノ酸である。その結果、請求項３記載の酵素機能電極では、電子メディエータを用いなくても、電極への効率的な電子伝達が可能となる。
（４）請求項４記載の酵素機能電極では、電極が、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料から成る。この材料を用いることにより、電極表面の形状や構造に制限されることなく、酵素から電極への電子伝達が容易に実現されるようになる。
（５）請求項５記載の酵素機能電極は、酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを備える。このことにより、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が基質の酸化で得た電子を効率的に電極に渡すことが可能となり、電流量の向上が可能となる。特に、ヘムＣI部周辺の表面特性が電極面と反対の場合など、ヘムＣI部と電極面の距離が離れている場合でも、効率的に、電極に電子を伝達することができる。
（６）請求項６記載のバイオセンサは、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備える。
【００１５】
本発明のバイオセンサは、備えている酵素機能電極の酵素により酸化される基質の濃度を的確に測定することができる。すなわち、酵素機能電極に電子メディエータを用いない場合は、ＡＤＨｔｙｐｅIIIのサブユニットIに存在するヘムＣIの酸化還元電位よりも正側の電位を電極に与えることにより、基質から酵素を介して電極に電子が伝達されることで得られる電流値として、基質の濃度が検知されるようになる。また、酵素機能電極に電子メディエータを用いる場合は、その電子メディエータよりも正側の電位を電極に与えることにより、基質から酵素を介して電極に電子が伝達されることで得られる電流値として、基質の濃度が検知されるようになる。本発明のバイオセンサとしては、例えば、アルコールの濃度を測定するバイオセンサが挙げられる。
（７）請求項７記載の燃料電池は、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備える。
【００１６】
本発明の燃料電池は、例えば、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極からなるアノード極と、酸素に電子を伝達することのできる触媒又は酵素のいずれかを保持するカソード極とを備え、アノード極とカソード極とが電気的に結合されるとともに、それら各電極間がイオン導電性を有する物質で隔てられる構造を有する。本発明の燃料電池は、上記構造を有することにより、アルコール燃料で発電できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明にかかる酵素機能電極、及びそれを用いたバイオセンサ及び燃料電池（バイオ電池）の実施の形態について、図１〜図６を参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態である酵素機能電極１の構造を模式的に示すものである。この酵素機能電極１は、特定の基質（標的物質）９を酸化する脱水素酵素３を触媒として、上記基質９から電極１１へと電子を伝達するものである。すなわち、酵素機能電極１は、特定の基質９を酸化する酵素３が電極１１の表面に固定されており、この酵素３が基質９を酸化することにより基質９から電子（ｅ-）が引き抜かれて酸化物１３が得られるとともに、酵素３が還元されることにより酵素３から電極１１に電子が伝達される。
【００１８】
酵素機能電極１で用いる酵素３は、サブユニットI（符合５）およびサブユニットIII（符合７）で構成される。この酵素３は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（グルコノバクター・サブオキシダンス）由来のキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（ＡＤＨｔｙｐｅIII）のサブユニットIおよびサブユニットIIIで構成される蛋白質からなる。酵素３から電極１１への電子の伝達は、このチトクロームＣI部位５ａを介して行われる。
【００１９】
また、チトクロームＣI部位５ａは、電子を放出する能力を有するヘム鉄が隣接するアミノ酸とともに外部に向けて露出する構造を有している。そして、これらヘム鉄に隣接するアミノ酸は、アルギニン以外は、疎水性アミノ酸が多く、電荷を有していないアミノ酸の割合が高くなっており、チトクロームＣI部位５ａの表面には、いわゆる疎水面が形成されている。この疎水面は、電極１１の表面に近接している。これにより、ヘム鉄と電極１１の表面との親和性が高められるとともに、ヘム鉄を電極１１の表面に近づけることができるようになるため、チトクロームＣI部位５ａから電極１１に直接電子を効率的に伝達することが可能になる。
【００２０】
図２は、本発明の他の実施形態である酵素機能電極の構造を模式的に示すものである。図２に示すように、酵素機能電極１では、特定の基質９を酸化する酵素３が電子メディエータ１５に化学結合しており、電子メデイエータ１５は電極１１の表面に固定されている。酵素３が基質９を酸化することにより、基質９から電子（ｅ-）が引き抜かれて酸化物１３が得られるとともに、酵素３が還元されることにより、酵素３から電子メディエータ１５に電子が伝達され、引き続き、電子メディエータ１５から電極１１に電子が伝達される。酵素３は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（グルコノバクター・サブオキシダンス）由来のキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（ＡＤＨｔｙｐｅIII）のサブユニットIおよびサブユニットIIIで構成される蛋白質からなる。
【００２１】
酵素機能電極１で検知することのできる基質９としては、例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、１、２−プロパンジオール等のアルコールが挙げられる。
電極１１としては、電極表面の形状や構造に制限されることなく、導電性のある物質なら全てのものを用いることができ、例えば、カーボン材、導電性金属、半導体材料および金属酸化物などを用いることができる。このうち、特に好ましいものはカーボン材である。このようなカーボン材としては、例えばカーボン紙、（カーボンスクリーンプリント電極）、カーボンフェルト、カーボンブラック、カーボンパウダー、カーボンペースト、カーボン繊維、単層カーボンナノチューブ、２層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブアレイ、グラッシーカーボン、ダイヤモンドコート、メソポーラスカーボングラファイト、多結晶グラファイトおよび熱分解黒鉛等が挙げられる。またこれらうち、特にメソポーラスカーボングラファイト等の多孔質な構造を有する電極１１を用いれば、その多孔質内部にＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を物理的に固定することができるため、電極１１の耐熱性や寿命の向上を図ることができる。また、カーボンナノチューブを含む電極１１を用いれば、カーボンナノチューブにＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を直接固定することができるため、カーボンナノチューブの有する高い比表面積により高い電流密度を確保することが可能となる。
【００２２】
電極１１の表面は疎水性であるか、疎水性の官能基で修飾されていることが好ましい。こうすることにより、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のＣ１露出面に形成される疎水面と、疎水性の電極１１の表面とが近づきやすくなるため、チトクロームＣ１から外部に向けて露出するヘム鉄と電極１１の表面とが近づきやすくなる。
【００２３】
酵素機能電極１において、酵素３、すなわち、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を電極１１に固定する方法としては、例えば、図３（ａ）〜（ｃ）に示す方法がある。なお、図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、電極１１の表面に酵素３が固定される構造を模式的に示す断面図である。
【００２４】
すなわち、図３（ａ）に示すように、酵素３は、電極１１の表面に形成された電極孔１７内に固定することができる。この場合、酵素３は、電極１１の表面に物理的に吸着されても良いし、電極１１の表面上にゲル状物質で固定されても良いし、電極１１の表面を被膜する高分子の中に物理的に固定されても良いし、電極１１の表面上のポテンシャル場にしたがって物理的に吸着されても良い。
【００２５】
また、図３（ｂ）に示すように、酵素３は、パウダー状に加工された電極材（例えばカーボンペースト）１１ａの中に混合されていても良い。ここで、パウダー状に加工された電極材１１ａにおけるパウダー粒子の大きさは特に制限されない。また、パウダー間をバインダーで固めても良いし、パウダー間にリン脂質等を含ませて酵素３の流動性を持たせても良いし、パウダー間に各種物質を入れても良い。
【００２６】
また、図３（ｃ）に示すように、酵素３を、電極１１の表面の官能基１９と架橋剤２１による化学結合を通じて固定しても良い。電極１１の表面の官能基１９としては、例えば、アミノ基、チオール基、カルボニル基および水酸基等が挙げられ、官能基１９の鎖長は短いほど好ましい。また、架橋剤２１としては、例えば、水溶性カルボニルイミド、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコール・ジグリシジル・エステル、ジメチルピメミリデイトおよびジメチルスベリミデイト等が挙げられる。
【００２７】
なお、これら図３（ａ）〜（ｃ）に示す電極構造は、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）に電子メデイエータ（図示略）が接する構造であっても良い。電子メディエータと、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）との間は、化学的な結合を介して固定しても良い。
更に、これら図３（ａ）〜（ｃ）に示す電極構造においては、電極１１の表面がさらにイオン導電性を有するゲル状物質を主成分とする保護材２３で保護されていても良い。この保護材２３は、ゲル状物質以外に適宜の膜材等も使用することができる。こうした膜材やゲル状物質としては、例えば、陽イオンを含むナフィオン樹脂（商品名、Ｄｕ Ｐｏｎｔ社製）、光架橋性のスチルバゾリウム化ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、アガロースゲル、アルギン酸ゲルおよびアクリルアミドゲル等が挙げられる。こうした膜材やゲル状物質にイオン化物を適当な割合で混合することにより、酵素３から電極１１に電子を伝達する反応と、電極１１がプロトンを放出する反応とを両立させることが可能となるため、酵素３から電極１１への電子伝達能力をさらに高めることができる。
【００２８】
図４は、酵素機能電極１を用いた３電極式の電気化学測定用セル２５の構造を模式的に示すものである。図４に示すように、電気化学測定用セル２５は、作用電極Ｗ、参照電極Ｒおよび対極Ａから構成されており、このうち作用電極Ｗとして、上述したグラッシーカーボン電極にＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いる。また、参照電極Ｒとして、Ａｇ／ＡｇＣｌ（銀／塩化銀）電極を用い、対極Ａとして白金電極を用いる。
【００２９】
このような電気化学測定用セル２５において、作用電極Ｗに電圧が加えられると、作用電極Ｗの表面にて酸化還元反応が起こり、その印加電圧が参照電極Ｒの電位の基準とされ、電位制御回路によりその電位が制御される。ここで、電気化学測定用セル２５中に基質として、例えば、一定濃度のエタノールを加えると、作用電極Ｗおよび対極Ａ間にエタノールの酸化電流が流れ、電流測定回路にてその電流値が測定される。
【００３０】
図５は、こうした原理に基づき、酵素機能電極１を利用してセルＣｅ中の基質濃度を検知するバイオセンサの一例を模式的に示すものである。図５に示すように、このバイオセンサ２７も、図４に例示した電気化学測定用セル２５と同様に、作用電極Ｗ、参照電極Ｒおよび対極Ａを備えている。また、作用電極Ｗとしても、図４におけるセル２５と同様に、グラッシーカーボン電極にＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いる。ここで、セルＣｅ中に基質として、例えばエタノールを添加し、その添加量を段階的に増やしていくと、エタノール濃度の増加に伴って電流値の上昇が観察される。このように、作用電極Ｗとして、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いることにより、基質濃度を測定可能なバイオセンサ２７を得ることができる。
【００３１】
また、図６は、酵素機能電極１を利用して検知される基質を燃料として発電する燃料電池の一例を模式的に示すものである。燃料電池２９は、燃料供給タンク３１から燃料が供給される燃料拡散電極（アノード極）３３と、空気供給タンク３５から空気が供給される空気拡散電極（カソード極）３７とを有する。また、これらアノード極３３とカソード極３７との間には電解質膜３９が充填されている。そして、アノード極３３の電解質膜３９側には酵素担持面４１が形成されており、カソード極３７の電解質膜３９側には触媒担持面４３が形成されている。ここで、上記アノード極３３は、グラッシーカーボン電極の酵素担持面４１に、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を固定したものであり、上述した酵素機能電極１と同様のものである。また、カソード極３７は白金電極であり、その触媒担持面４３には白金が固定されている。
【００３２】
このような燃料電池２９において、燃料として基質であるエタノールが供給されると、アノード極３３ではエタノールがＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）により酸化されることで水素が発生するとともに酸化還元反応電流が得られ、カソード極３７では供給される空気（酸素）と電解質膜４１を通じて得られる水素との反応により水が生成される。すなわち、基質を燃料とした発電が行われるようになる。なお、カソード極３７の触媒担持面４３に固定される触媒としては、白金以外にも、例えば、ジアホラーゼ酵素、プルオキシターゼ酵素、およびその他酸素の還元を実現する錯体触媒等を用いることができる。
【００３３】
以上に説明した、この実施の形態にかかる酵素機能電極１、該酵素機能電極１を利用した電気化学測定用セル２５、バイオセンサ２７、又は燃料電池２９によれば、以下に列記するような効果が得られる。
【００３４】
（１）酵素機能電極１が備える酵素３は、グルコノバクター・サブオキシダンスが有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来であり、サブユニットIIを持たない、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）からなる。サブユニットIのヘムＣIの酸化還元電位は、サブユニットIIの酸化還元電位よりも低いので、サブユニットIIを含まない酵素３の酸化還元電位は、従来のアルコール脱水素酵素よりも低くなる。
【００３５】
そのため、酵素機能電極１を備えたセンサを用いて、基質（例えばエタノール等のアルコール）の酸化により発生する酸化電流を検知する場合、酵素機能電極１について設定する酸化還元電位値を、従来のアルコール脱水素酵素電極を用いた時よりも、広い範囲内（特に低い酸化還元電位で）で設定することが可能となる。その結果、測定サンプル内に存在するビタミン類などの夾雑物由来の酸化還元ピークと重ならない酸化還元電位値を、酵素機能電極１について設定することが可能となり、より信頼性の高いセンサを実現することができる。また、酵素機能電極としての出力向上も可能である。
【００３６】
（２）電極１１の材料は、電極１１の表面の形状や構造によって制限されることがなく、例えば、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料とすることができる。このため、電極１１の材料として、例えば、電極１１への溶液の浸透が発生しにくく、出力低下の発生が抑制される材料を選択することができる。また、特にカーボン材を電極１１として用いれば、上記ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）におけるチトクロームＣ１部とカーボン材との間の電子伝達能力に優れているため、酵素３から電極１１への電子伝達がより円滑に実現されるようになる。
【００３７】
（３）電極１１の表面は、疎水性であるか、あるいは疎水性の官能基で修飾されているものとすることができる。この場合、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のチトクロームＣ１において外部に露出されるヘム鉄の露出部位の周辺が、疎水性アミノ酸や非電荷アミノ酸に覆われるようになる。すなわち、疎水性の電極１１の表面に対してヘム鉄がより近づきやすくなり、酵素３から電極１１への電子伝達能力がより高められる。また、チトクロームＣ１の表面に形成される疎水面と、疎水性の電極１１の表面とが近接することにより、酵素３の、電極１１の表面上でのより高い配向制御が可能となるため、酵素機能電極１のさらなる出力向上が可能となる。
【００３８】
（４）酵素３である、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）は、イオン導電性を有する膜、あるいはゲル状物質からなる保護材２３により保護することができる。これにより、酵素３から電極１１に電子を伝達する反応と、酵素３からプロトンが放出される反応とが両立されるようになり、ひいては、電子伝達能力がさらに高まる。
【００３９】
（５）酵素機能電極１を通じて基質９の濃度を測定する電気化学測定用セル２５、バイオセンサ２７を構成すれば、酵素機能電極１に用いられる酵素３により酸化される基質９の濃度を的確に測定することができる。すなわち、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のチトクロームＣ１の酸化還元電位よりも正側の電位を電極１１に与えることにより、酵素３により基質９から電子が伝達されるときに、基質９の濃度に対応する電流値が検知される。
【００４０】
（６）酵素機能電極１からなるアノード極３３と、酵素３に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極３７とを備え、アノード極３３とカソード極３７とを電気的に結合するとともに、それら各電極間をイオン導電性を有する物質で隔てる燃料電池２９を構成することもできる。これにより、酵素機能電極１に用いられる酵素３により酸化される基質９を燃料として発電する燃料電池２９であって、より発電能力の高い電池２９を安定して実現することができる。特に、ＡＤＨｔｙｐｅIIIに存在するサブユニットIIを除くことで、酵素３内で生じる電位降下を防ぐことが可能となり、より高い電位を確保できるバイオ電池２９を実現することができる。
【００４１】
次に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４２】
ａ）ＡＤＨtypeIII(Complex)の調製
糖分を多めにした培地で増殖させた、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓを遠心処理（９、０００Ｇ×１０ｍｉｎ）で回収し、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。洗浄菌体の湿重１ｇを５ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁させ、フレンチプレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）を用い、１６、０００ｐｓｉの条件下で菌を破壊した。引き続き、遠心処理（９、０００Ｇ×１０ｍｉｎ）により、菌破砕残渣を取り除いた。
【００４３】
上清を回収し、超遠心分離処理（８、６００Ｇ×９０ｍｉｎ）により膜画分を沈殿させた。膜画分を、蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍＬになるように、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁させ、終濃度が１．０％（ｗ／ｖ）になるように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた。４℃で６０ｍｉｎ間インキュベートした後、超遠心処理（８、６００Ｇ×９０ｍｉｎ）で可溶化したＡＤＨを上清にて回収し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を外液として透析処理をおこなった。
【００４４】
０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに透析済みの蛋白液をアプライし、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の濃度勾配（５−５０ｍＭ）により、ＡＤＨを溶出させた。２０−３０ｍＭのフラクション領域にＡＤＨ活性のある画分は溶出され、その画分を回収した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、ＡＤＨtypeIIIを含む蛋白溶液を得た。このＡＤＨtypeIIIは、サブユニットI、サブユニットII、及びサブユニットIIIを全て備えたもの（以下、「ＡＤＨtypeIII(Complex)」とする）である。
【００４５】
ｂ）ＡＤＨtypeIII（I/III）の調製
前記ａ）で得られた透析後の蛋白溶液を、同じ緩衝液で平衡化した、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにアプライした。０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭの酢酸緩衝液で洗浄した後、更にカラムに対して５倍容量の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄した。その際、ＡＤＨのサブユニットIIが溶出した。カラムに吸着したＡＤＨは、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度勾配（４０−１００ｍＭ）により溶出させた。
【００４６】
その結果、７０ｍＭ付近に、ＡＤＨtypeIII(Complex)が溶出された。引き続き、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度勾配（１００−２００ｍＭ）により溶出させた。さらに、カラムに対して５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）により、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）画分を溶出させた。
【００４７】
このようにして得られた３．３５ｍｇ／ｍＬ濃度のＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４００μLを、透析遠心チューブ（ＭＷＣＯ:５０、０００）で５０μLに濃縮し、４００μLの５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて攪拌後、再度、透析遠心チューブで５０μLに濃縮した。この透析遠心処理を合計３回行った。
【００４８】
このようにして得られたＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）を含む溶液を、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１ｍＬ容積）にアプライした。２５ｍＬの５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）を溶出させた。ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液は、遠心透析チューブで１５０μLに濃縮した後に回収した。この操作により、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）に吸着していた界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を取り除くことができた。
【００４９】
ｃ）酵素機能電極１の製造
酵素機能電極１は、図７（ａ）、（ｂ）に示すように、φ３ｍｍである棒状のＧＣ電極１１と、その先端付近において、ＧＣ電極１１の外周を覆うように取り付けられた筒状のゴムパッキン４５と、ＧＣ電極１１及びゴムパッキン４５の間を満たす樹脂４７とを備えている。ゴムパッキン４５の端部４５ａは、ＧＣ電極１１の上面１１ａよりも上方（図７における上方向）に張り出しており、ＧＣ電極１１の上方には、周囲をゴムパッキン４５で囲まれた液保持部４９が形成されている。
【００５０】
この液保持部４９に、前記ｂ）で得られたＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLを滴下し、さらに、１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１５μL加え、その後、市販の透析膜（ＭＷＣＯ:２５、０００）５１で液保持部４９の上方を覆い、酵素機能電極１を完成した。
【００５１】
ｄ）ＣＶ測定
前記ｃ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む、０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．２Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。その結果を図８に示す。図８から明らかなとおり、０Ｖ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ前後に、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）の酸化還元ピークが観察された。
【実施例２】
【００５２】
ａ）電子メディエータを備えた酵素機能電極１の製造
０．１Ｍ ＬｉＣｌと１ｍＭ エチレンジアミンを含むエタノール溶液中に、φ3ｍｍのＧＣ電極を浸し、０〜１４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で、１０ｍＶ／ｓの掃引速度でサイクリック・ボルタメトリー（ＣＶ）した。この処理により、電極表面にＮＨ2基が付加された。
【００５３】
このエチレンジアミン処理したＧＣ電極を用いて、基本的には前記実施例１のｃ）と同様の構造を有する酵素機能電極１を製造した。ただし、液保持部４９に入れる液は、１５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＶＩ-Ｏｓ錯体（酸化還元電位：＋１００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）１μL、前記実施例１のｂ）にて調製したＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）４μL、及び０．１２５％のグルタルアルデヒド溶液１μLとした。そして、この液を加えた後、３０℃で２ｈｒ固定するようにした。なお、ＰＶＩ-Ｏｓ錯体は電子メディエータとして機能し、グルタルアルデヒドは架橋剤として機能する。
【００５４】
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．３Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。その結果を図９に示す。Ｏｓ錯体由来の酸化還元ピークが５０ｍＶ、及び１５０ｍＶ付近に観察された。
【００５５】
引き続き、終濃度０．１％になるようにエタノールを加え、上記と同様の条件でＣＶ測定を実施した。その結果も図９に示す。エタノールを加える前のＣＶ波形と異なり、エタノールの酸化電流が観測された。
【００５６】
ｃ）定電位測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の定電位測定を実施した。エタノールを添加しない緩衝液中で電流値が安定した後、終濃度０．１％になるようにエタノールを加えた。その結果、図１０に示すように、電流が観測された。
【実施例３】
【００５７】
ａ）酵素機能電極の製造
０．１Ｍ ＬｉＣｌと、１ｍＭ エチレンジアミンとを含むエタノール溶液中にφ3ｍｍのＧＣ電極を浸し、０〜１４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で１０ｍＶ／ｓの掃引速度でサイクリック・ボルタメトリー（ＣＶ）した。この処理により、電極表面にＮＨ2基が付加された。
【００５８】
このエチレンジアミン処理したＧＣ電極を用いて、基本的には前記実施例１のｃ）と同様の構造を有する酵素機能電極１を製造した。ただし、液保持部４９に入れる液は、１５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＶＩ-Ｏｓ錯体（酸化還元電位：−１００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）１μL、前記実施例１のｂ）にて調製したＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）４μL、及び０．１２５％のグルタルアルデヒド用溶液１μLとした。そして、この液を加えた後、３０℃で２ｈｒ固定するようにした。
【００５９】
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．３Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。引き続き、終濃度０．１％になるようにエタノールを加え、上記と同様の条件でＣＶ測定を実施した。それらの結果を合わせて図１１に示す。エタノールの添加によりＣＶ波形は変化し、酸化電流が観測された。
（比較例１）
ａ）酵素機能電極の製造
基本的には、前記実施例１のｃ）と同様であるが、液保持部４９に滴下する溶液として、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLの代わりに、同量のＡＤＨtypeIII(Complex)液を用いて、酵素機能電極を製造した。ここで用いたＡＤＨtypeIII(Complex)液は、前記実施例１のａ）で回収したＡＤＨtypeIII(complex)を濃縮し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したものである。
ｂ）測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極を用い、前記実施例１のｃ）と同様の方法でＣＶ測定を実施した。その結果を図１２に示す。図１２から明らかなとおり、酸化還元ピークは全く見られなかった。
（比較例２）
ａ）電極の製造
基本的には、前記実施例２のａ）と同様であるが、液保持部４９に滴下する溶液として、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLの代わりに、同量のＡＤＨtypeIII(Complex)液を用いて電極を製造した。ここで用いたＡＤＨtypeIII(Complex)液は、前記実施例１のａ）で回収したＡＤＨtypeIII(Complex)を濃縮し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したものである。
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極を用い、前記実施例２のｂ）と同様の方法でＣＶ測定を実施した。その結果を図１３に示す。図１３から明らかなとおり、エタノールを添加する前と後とで、ＣＶ波形は変化しなかった。
【００６０】
なお、本発明は、上記実施の形態として示した構成に限らず、これらを適宜変更した、以下の態様にて実施することもできる。
例えば、上記各実施例では、酵素３を、グルコノバクター・サブオキシダンス由来のアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（I／III）とした。しかしながら、サブユニットI、II、及びIIIからなるヘテロ３量体の膜蛋白質である、ＡＤＨｔｙｐｅIIIを持つ菌株は他にも存在しており、それらの菌由来のＡＤＨｔｙｐｅIIIでも、サブユニットIIを除いた構造のものであれば、問題なく使うことができる。
【００６１】
また、グルコンアセトバクター・ユーロパエオス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）やグルコンアセトバクター・キシリナンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）など、サブユニットIIIが存在しないＡＤＨｔｙｐｅIIIもある。このような種類のＡＤＨについては、サブユニットIのみからなる、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I）を用いることができる。いずれの場合においても、サブユニットIに存在する低電位のヘムＣから電極に電子を伝達できる構造であれば、特に制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】酵素機能電極（電子メディエータなし）の構造を模式的に表す説明図である。
【図２】酵素機能電極（電子メディエータあり）の構造を模式的に表す説明図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、酵素の電極への固定態様を模式的に表す断面略図である。
【図４】酵素機能電極が適用される３極式電気化学セルの構造を模式的に表す説明図である。
【図５】酵素機能電極が適用されるバイオセンサの構造を模式的に表す平面図である。
【図６】酵素機能電極が適用される燃料電池の構造を模式的に表す説明図である。
【図７】電極の構成を表す説明図であって、（ａ）は側断面図であり、（ｂ）は上面図である。
【図８】界面活性剤を取り除いたＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【図９】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体およびＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【図１０】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体およびＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）において、終濃度０．１％のエタノールを添加した後の定電位（４００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）測定した際の電流値を表すグラフである。
【図１１】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体および酵素において、終濃度０．１％のエタノールを添加する前と後のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【図１２】ＡＤＨtypeIII(Complex)のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１３】電極に固定したＰＶＩ−Ｏｓ錯体１およびＡＤＨtypeIII(Complex)のＣＶ測定の結果を表すグラフである。
【符号の説明】
【００６３】
１・・・酵素機能電極 ３・・・酵素 ５・・・サブユニットI
７・・・サブユニットIII ９・・・基質 １１・・・電極
１３・・・酸化物 １５・・・電子メディエータ １７・・・電極孔
１９・・・官能基 ２１・・・架橋剤 ２３・・・保護材
２５・・・電気化学測定用セル ２７・・・バイオセンサ ２９・・・燃料電池
３１・・・燃料供給タンク ３３・・・アノード極 ３５・・・空気供給タンク
３７・・・カソード極 ３９・・・電解質膜 ４１・・・酵素担持面
４３・・・触媒担持面 ４５・・・ゴムパッキン ４７・・・樹脂
４９・・・液保持部 ５１・・・透析膜 Ｒ・・・参照電極
Ｗ・・・作用電極 Ａ・・・対極
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、
特定の基質を酸化する酵素と、を備え、
前記基質から前記酵素を介して前記電極に電子が伝達される酵素機能電極において、
前記酵素は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットIおよびサブユニットIIIから構成されることを特徴とする酵素機能電極。
【請求項２】
前記酵素のうち、ヘムの存在する面が前記電極と接触することを特徴とする請求項１記載の酵素機能電極。
【請求項３】
前記酵素が、グルコノバクター・サブオキシダンスが有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来であることを特徴とする請求項１又は２記載の酵素機能電極。
【請求項４】
前記電極は、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料から成ることを特徴とする請求項１〜3のいずれかに記載の酵素機能電極。
【請求項５】
酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の酵素機能電極。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備えたバイオセンサ。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備えた燃料電池。
【請求項１】
電極と、
特定の基質を酸化する酵素と、を備え、
前記基質から前記酵素を介して前記電極に電子が伝達される酵素機能電極において、
前記酵素は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットIおよびサブユニットIIIから構成されることを特徴とする酵素機能電極。
【請求項２】
前記酵素のうち、ヘムの存在する面が前記電極と接触することを特徴とする請求項１記載の酵素機能電極。
【請求項３】
前記酵素が、グルコノバクター・サブオキシダンスが有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来であることを特徴とする請求項１又は２記載の酵素機能電極。
【請求項４】
前記電極は、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料から成ることを特徴とする請求項１〜3のいずれかに記載の酵素機能電極。
【請求項５】
酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の酵素機能電極。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備えたバイオセンサ。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備えた燃料電池。
【図１】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２３７０９９（Ｐ２００８−２３７０９９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８１７１４（Ｐ２００７−８１７１４）
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【出願人】（０００００４２６０）株式会社デンソー (27,639)
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【出願人】（０００００４２６０）株式会社デンソー (27,639)
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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