酸性多糖類の迅速定量法
【課題】培養液中に含有する酸性多糖の定量方法を提供するとともに、その方法を利用した培養プロセスのモニタリング方法を提供する。
【解決手段】
下記ステップを少なくとも含む、酸性多糖の定量方法；
工程１：１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドと、酸性多糖を含有する試料を共存させる、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する。
下記ステップを少なくとも含む、培養プロセスをモニタリング方法；
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地と１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドを共存させる、
工程Ｃ：培養時間に対する吸収波長の変化を測定する。
【解決手段】
下記ステップを少なくとも含む、酸性多糖の定量方法；
工程１：１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドと、酸性多糖を含有する試料を共存させる、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する。
下記ステップを少なくとも含む、培養プロセスをモニタリング方法；
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地と１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドを共存させる、
工程Ｃ：培養時間に対する吸収波長の変化を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液中の酸性多糖の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＧＡＧｓ：動物組織由来のグリコサミノグリカン
ＢＧＡＧｓ：バクテリア由来のグリコサミノグリカン
ＡＬＧ：アルギン酸
ＧＥＬ：ジェランガム
ＸＮＴ：キサンタンガム
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＣＨ：コンドロイチン
ＧｌｃＵＡ：グルクロン酸
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｋ５Ｐ：大腸菌Ｋ５株（Escherichia coli serotype O10:K5(L):H4 （ATCC23506）、Escherichia coli serotype O2a,2b:K5(L):H4 （ATCC23500）あるいは、Escherichia coli serotype O12:K5(L) （ATCC23508））より産生される酸性多糖であって、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格（ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−４）ｎをもつものである。（ここで、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、α１−４はα１−４グリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
Ｋ４Ｐ：大腸菌Ｋ４株（Escherichia coli serotype O5:K4(L):H4）より産生される酸性多糖であって、ＣＨ骨格（ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４）ｎをもつものである。（ここで、β１−３はβ１−３グリコシド結合を、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＨＰ：ヘパリン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＤＳ：デルマタン硫酸
多くのバクテリアは主要な成分が多糖類である莢膜を保持している。それら多糖は様々な単糖を構成成分としており、アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）が産生するＡＬＧ、スフィンゴモナス・エロディア（Sphingomonas elodea）が産生するＧＥＬ及びキサントモナス・キャンペストリス（Xanthomonas campestris）が産生するＸＮＴは構成糖としてウロン酸を含有する酸性多糖である。また、連鎖球菌や大腸菌等に属する菌株の中に、ＧＡＧｓと糖鎖構造が一致する多糖、つまりＢＧＡＧｓを生産するものが知られている。
【０００３】
さらに、ＡＬＧ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、並びにＢＧＡＧｓの一種であるストレプトコッカス・エクィ（Streptococcus equi）等の連鎖球菌が産生するＨＡは、特殊なレオロジー特性のために、食品、医薬品及び化粧品等の産業に広く使用されている(非特許文献1〜6)。
【０００４】
ＢＧＡＧｓであるＫ５ＰやＫ４Ｐは大腸菌Ｋ５株及びＫ４株によって産生される多糖であり、それぞれＨＳ／ＨＰ及びＣＳ／ＤＳと同じ糖鎖骨格構造を有している。そのため、医薬用途における当該多糖の商業応用はかなり期待されており、実際に多くの研究者がこれらのＢＧＡＧｓを原料として様々なＧＡＧミミックを調製することを試みている。しかし、ＨＡを除くＢＧＡＧｓの生産性は商業的に応用するためには十分ではない。従って生産菌の育種及び醗酵プロセスの改善が必須である。
【０００５】
発酵プロセスを正確にコントロールするためには、プロセスを通して、基質や生成物等、発酵過程の物質収支を正確かつ迅速にモニタリングすることが重要である。また、生産菌の育種では多数の試料を処理する必要もある。発色試薬としてカルバゾール又はフェノール等を用いた、比色分析法により少量の多糖類を含む試料の分析が知られているが、中性糖等の妨害物質の存在により分析が阻害されることが知られている。バクテリアの培養物中には様々な妨害物質が存在しているため、そこに含まれる多糖類を分析するためには、当該試料を前処理することが必須である。また場合によってはいくつかのステップからなる精製が必要となることもあり、分析の結果を得るまでにかなりの時間がかかることとなる。さらにこれら発色試薬と多糖との反応性は多糖を構成する単糖の種類に依存する。つまり、発色試薬の各種単糖に対する反応性が異なる。そのために、今まではＢＧＡＧｓ等の多糖の培養液中の濃度を測定する現実的な方法が知られていなかった。
【０００６】
一方、カチオン性のカルボシアニン染料は、酸性多糖類を染色するために良く用いられている。特に、１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイド(以下「ステインズ・オール」という。) の可視スペクトルが酸性多糖の存在下で変化することと、その変化が分子の中のウロン酸残基の数に依存することが知られている（非特許文献７）。
【０００７】
しかしながら、これらの結果は全て精製されたＨＡやペクチン（ポリガラクツロン酸）を測定したものであり、培養液のような不純物共存下において、ステインズ・オールを用い酸性多糖を選択的に定量する方法は知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】ウェン−ピン チェン（Wen-Pin Chen）ら、１９８５年, アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Appl. Environ Microbiol.）第４９巻、第３号、ｐｐ.５４３−５４６
【非特許文献２】ザォ ワン（Xia Wang）ら、２００６年、アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Appl. Environ Microbiol.）第７２巻 第５号 ｐｐ.３３６７−３３７４
【非特許文献３】Ｎ Ｅ ハーディング（N E Harding）ら、１９８７年、ジャーナル オブ バクテリオロジー（J Bacteriol.）第１６９巻、第６号 ｐｐ２８５４−２８６１
【非特許文献４】ジャン Ｋ（Jann, K.）ら、１９９２年、カナディアン ジャーナル オブ マイクロバイオロジー（Can. J. Microbiol.）、第３８巻、ｐｐ７０５−７１０
【非特許文献５】ニミッヒ Ｗ（Nimmich, W.）ら、１９９７年、ジャーナル オブ クリニカル マイクロバイオロジー （J. Clin. Microbiol.）、第３５巻 第５号、ｐｐ１１１２−１１１７
【非特許文献６】デアンジェラス Ｐ Ｌ（DeAngelis, P. L.）ら、２００２年、 カルボハイドレートリサーチ（Carbohydr. Res.）、第３３７号、ｐｐ１５４７−１５５２
【非特許文献７】エドストローム Ｒ．Ｄ．（Edstrom R. D.）ら、１９７３年、アチーブス オブ バイオケミストリー アンド バイオフィジックス（Arch. Biochem. Biophys.）、第１５５巻、ｐｐ３０７−３１４
【非特許文献８】ヴァン Ｗ． Ｆ．（Vann W. F.）ら、１９８１年、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Eur. J. Biochem）、第１１６巻、ｐｐ３５９−３６４
【非特許文献９】マンゾニ Ｍ.（Manzoni M.）ら、１９９６年、バイオテクノロジー レターズ（Biotech. Lett.）、第１８巻、ｐｐ３８３−３８６
【非特許文献１０】アライ Ｍ.（Arai M.）ら、１９９２年、バイオケミストリー アンド バイオフィジックス アクタ（Biochem. Biophys. Acta.）第１１１７巻、ｐｐ６０−７０
【非特許文献１１】ホーマー（Homer K. A.）ら、１９９３年、アナリティカル バイオケミストリー（Anal. Biochem）、第２１４巻、ｐｐ４３５−４４１
【非特許文献１２】リドホルト（Lidholt, K.）ら、１９９７年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー （J. Biol. Chem.）、第２７２巻、ｐｐ２６８２−２６８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、今まで測定が困難であった培養液中に含有する酸性多糖の定量方法を提供するとともに、その方法を利用した培養プロセスのモニタリング方法並びにキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、酸性多糖をステインズ・オール溶液と共存させることによって、各酸性多糖に特異的な吸収スペクトルを持った複合体が形成されること及び培養液中の阻害物質としてリン酸イオン、塩化物イオン、ペプトン類を見いだし、さらにこれにより培養液中の酸性多糖を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、下記工程を少なくとも含む、酸性多糖の定量方法(以下、「本発明方法１」という)を提供する。
工程１：ステインズ・オールと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる工程、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する工程。
【００１２】
上記試料中の酸性多糖はバクテリアにより産生された酸性多糖であってもよい。
【００１３】
また、酸性多糖を含有する試料は、酸性多糖を含む培地であってもよい。
【００１４】
本発明方法１は、工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度を３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、特に培地や塩化物イオン濃度が高い試料（例えば、塩化物イオン濃度が１２０ｍＭ以上の試料）について定量する場合に、工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度を３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【００１５】
また、本発明方法１は試料中にペプトンを含む場合にも測定することができ、その場合には、工程２における測定対象となる共存液中のペプトン濃度を０．２％（w/v）以下になるように調整する工程をさらに含むことがより好ましい。
【００１６】
また、上記試料中の酸性多糖は、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれる、いずれか１種類の酸性多糖であることが好ましい。
【００１７】
また本発明方法１では、酸性多糖を含有する試料が２種類以上の酸性多糖を含有する場合には、測定する酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素を共存させる工程を、工程１の前にさらに含むことによって測定できる。
【００１８】
また上記２種類以上の酸性多糖は、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれる２種類以上の酸性多糖であることが好ましく、酸性多糖を分解する酵素は、ヒアルロニダーゼ、スフィンガナーゼ、キサンタンリアーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼからなる群から選ばれる、１又は２種類以上の分解酵素であることが好ましい。
【００１９】
ただし、上記工程は必ずしもこの工程を含む必要は無く、後述の各酸性多糖の好ましい測定波長の範囲を選択することによって、測定したい酸性多糖を定量することもできる。
【００２０】
また本発明方法１は、試料中の酸性多糖がＨＡ又はＧＥＬであるとき、工程２における吸光度を測定するときの波長が６３０〜６７０ｎｍであることが好ましく、６５０ｎｍであることがより好ましい。また、試料中の酸性多糖がＸＮＴ又はＫ５Ｐであるとき、工程２における吸光度を測定するときの波長が６１０〜６３０ｎｍであることが好ましく、６２０ｎｍであることがより好ましい。また試料中の酸性多糖がＡＬＧ又はＸＮＴであるとき、工程２における吸光度を測定するときの波長が４７０〜４９０ｎｍであることが好ましく、４８０ｎｍであることがより好ましい。また試料中の酸性多糖がＫ４Ｐであるときは、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０〜６５０ｎｍであることが好ましく、６３０ｎｍであることがより好ましい。
【００２１】
また本発明方法１は、工程２における測定対象となる共存液をｐＨ５〜８になるように調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【００２２】
また本発明は、酸性多糖を産生するバクテリアの醗酵プロセスをモニタリングする方法であって、
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する工程、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地とステインズ・オールを共存させる工程、
工程Ｃ：工程Ｂにより得られた共存液の吸光度を測定する工程、
を少なくとも含む方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。
【００２３】
本発明方法２において酸性多糖を産生するバクテリアがＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、又はＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアであることが好ましく、中でもＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアがストレプトコッカス属バクテリア由来のＨＡ合成酵素を保持しており、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ５株由来のＮ−アセチルヘパロサン合成酵素を保持しており、、ＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ４株由来のＣＨ合成酵素を保持していることが極めて好ましい。
【００２４】
また本発明は、構成成分としてステインズ・オールを少なくとも含むことを特徴とする、本発明方法１又は２の方法により酸性多糖を測定するキット（以下、「本発明キット」という。）を提供する。
【００２５】
本発明キットは、構成として、さらに酸性多糖標準溶液又は検量線が書かれた表を含むことができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明方法は、酸性多糖生産菌を培養することによって得られた酸性多糖を精製することなしに容易に定量することができ、また精製せず簡便に定量できることから、酸性多糖の製造プロセスにおけるモニタリング等に応用できることから極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明方法１
本発明方法１は、下記工程を少なくとも含む酸性多糖の定量方法である。
工程１：ステインズ・オールと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる工程、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する工程。
【００２８】
ここにいう「ステインズ・オール」とは、カチオンのカルボシアニン染料の一つである、１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドのことを言う。このステインズ・オールはシグマ社等から購入することができる。
【００２９】
また、このステインズ・オールは、本発明方法に影響を及ぼさない限りにおいて添加剤と共存させておくことができる。
【００３０】
ここにいう添加剤とは、ｐＨ調節剤（例えば測定されるｐＨに適した緩衝剤）や安定化剤、保存剤、キレート剤、酸化防止剤等が挙げられる。
【００３１】
またここにいう「酸性多糖」とは、ヘキソサミン（Ｄ−グルコサミン又はＤ−ガラクトサミン）とウロン酸（Ｄ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸）又は中性ヘキソース（Ｄ−ガラクトース）の二糖ユニットの繰り返し構造を持つ糖鎖、多糖構造中の一部に硫酸又はリン酸エステルを持つ糖類、或いはその両方の構造を持つ糖鎖であって、天然から得られる酸性多糖のみならず、遺伝子工学的に産生された酸性多糖等も含まれる。具体的にはＣＨ、ＣＳ、ＨＳ、ＨＰ、６位脱硫酸化ＨＰ、２位脱硫酸化ＨＰ、Ｎ−脱硫酸化ＨＰ、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ、Ｋ４Ｐ及びそれらの塩が例示される。
【００３２】
また本発明方法１における「ＨＡ」、「ＧＥＬ」、「ＸＮＴ」、「ＡＬＧ」、「Ｋ５Ｐ」及び「Ｋ４Ｐ」はそれぞれの酸性多糖が有する骨格を持つものであれば、その由来は限定されない。例えば天然から得られるもの、バクテリアの培養により得られたもの、遺伝子工学的に産生されたもの、人工的に酵素合成したもの等も含む概念で用いるものとする。より具体的には、例えばＫ４Ｐを例に挙げると、大腸菌Ｋ４株より産生された酸性多糖はもちろんのこと、これと同じ骨格を有する酸性多糖を化学的に合成したものも包含するものである。
【００３３】
工程１において、ステインズ・オールと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる方法及び条件は、これらの分子が互いに接触し、溶解した状態で複合体を形成する条件である限りにおいて特に限定されない。例えば、酸性多糖を含有する試料にステインズ・オールを含有する溶液を添加してもよく、ステインズ・オールを含有する溶液に酸性多糖を含有する試料を添加してもよく、また、両者を同時に添加することにより共存させても良い。
【００３４】
上記「共存」する条件としては、例えばｐＨ３〜１３の範囲で行われることが好ましく、ｐＨ４〜８の範囲で行われることがより好ましく、ｐＨ５〜８で行われることがさらに好ましい。また当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝溶液中で行われることがより好ましい。
【００３５】
上記緩衝溶液としては具体的にマッキルバインの広域緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が例示される。
【００３６】
また「共存」させる温度としては、例えば０℃〜５０℃の条件下で共存させることが好ましく、１０℃〜４０℃で共存させることが好ましく、特に２０℃〜３０℃で共存させることが極めて好ましい。また、上記の酸性多糖等に反応したステインズ・オールの吸光度変化は速やかに生じるが、その後徐々に変化してしまうため、ステインズ・オールとの共存後６０分以内、好ましくは３０分以内、最も好ましくは１０分以内に吸光度を測定することが好ましい。
【００３７】
また、共存時におけるステインズ・オールの濃度としては、測定する酸性多糖の種類やその他の条件により適宜選択することができる。後述する実施例の条件で共存させる場合ステインズ・オール溶液の濃度は、０．５〜１．５ｍＭの範囲であることが好ましい。また、ＨＡを定量する場合には０．５〜０．６ｍＭの濃度のステインズ・オール溶液を共存させることが特に好ましい。
【００３８】
また、工程２における共存液の吸光度を測定する方法も特に限定されず、通常の吸光光度計等を用いて測定することができる。
【００３９】
また共存液中の酸性多糖の濃度を測定するためには、濃度が既知の酸性多糖標準液を用いて、ステインズ・オールとの複合体を形成させた後の吸光度の値（又はある波長における吸光度と他の波長における吸光度との比の値）と酸性多糖濃度との関係について予め検量線や関係式を作成しておき、酸性多糖濃度が未知の共存液についての測定結果をその検量線や関係式を用いて酸性多糖濃度に変換することで求めることができる。
【００４０】
また上記試料中の酸性多糖は、上述したようにその由来は限定されることはなく、バクテリアにより産生された酸性多糖であってもよい。
【００４１】
ここにいうバクテリアとしては、酸性多糖を産生するバクテリアであれば特に限定されず、具体的に例示すると、ＡＬＧを産生するアゾトバクター・ビネランジー（Azotbaceter vinelandii）、ＧＥＬを産生するスフィンゴモナス・エロディア（Sphingomonas elodea）、ＸＮＴを産生するキサントモナス・キャンペストリス（Xanthomonas campestris）、ＨＡを産生するストレプトコッカス・エクィ（Streptococcus equi）、Ｋ５Ｐを産生するＫ５株由来の大腸菌又はＫ４Ｐを産生するＫ４株由来の大腸菌等が例示される。
【００４２】
これらのバクテリアはＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）や東京大学医科学研究所、ザ・インターナショナル・エスケリキア・アンド・クレビシエラ・センター（ＷＨＯ）、スタテンス・セーラム・インシチチュート（The International Escherichia and Klebsiella Centre(WHO),Statens Serum Institut）などにより入手することができる。
【００４３】
また本発明方法１は後述する実施例からわかるように、測定される試料が必ずしも精製されている必要がなく、酸性多糖を含有する試料は、酸性多糖を含む培地であってもよい。
【００４４】
また本発明方法１は、工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度が３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【００４５】
後述する実施例からわかるよう塩化物イオン濃度が１００ｍＭを超えると大幅に吸光度が減少する。また一般的な培地中の塩化物イオン濃度は１５０ｍＭ程度であることから、本発明方法１を培地中の酸性多糖の測定する場合や塩化物イオン濃度が高い試料（例えば塩化物イオン濃度が１２０ｍＭ以上の試料）に適用する場合には工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度が１００ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことがより好ましい。
【００４６】
上記共存液中の無機塩の濃度は、導電率を測定することにより調べることができる。水溶液中においては、イオン輸送によって電流が流れることから、共存液中に存在するイオンの量が増加すれば、高い導電率を有することとなる。また、導電率を測定するには導電率計（例えば、カスタニーＬＡＢ導電率計ＤＳ−１２、堀場製作所製）を用いて簡便に測定できる。
【００４７】
また、上記塩化物イオン濃度を調整する方法は特に限定されず、例えば蒸留水等の希釈液により希釈することによって調整することができる。例えば、上述したように一般的な培地において塩化物イオン濃度は１５０ｍＭ程度であることから、培地中の酸性多糖を測定する際には、分析の前に蒸留水などにより５倍以上に希釈することにより、正確な測定が可能になる。
【００４８】
上記希釈液としては、本発明方法１における吸光度の測定に影響を及ぼすものでない限り特に限定されない。この希釈液としては、蒸留水や上述した緩衝液等を用いることができる。
【００４９】
また本発明方法１では、酸性多糖を含有する試料がペプトンを含む試料であってもよく、その場合は測定時における共存液中のペプトン濃度が０．２％（w/v）以下になるように調整する工程をさらに含むことがより好ましい。
【００５０】
また本発明方法１における「ペプトン」とは、牛乳カゼイン、獣肉、大豆タンパク質等をペプシン、トリプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素、或いは酸で部分的に加水分解して乾燥した粉末であり、微生物の栄養源として培地に添加されているものである。
【００５１】
上記ペプトン濃度は、上記塩化物イオン濃度を調整する方法と同様に、希釈液により希釈することにより調整することができる。
【００５２】
また実施例からもわかるように、ピーナッツ及び大豆由来のペプトンに関してはその濃度が０．２％（w/v）以下においても測定に影響を及ぼすため、本発明方法１を用いる際にはこのような物質を含む培地を用いず、また培地に添加しないことが好ましい。
【００５３】
本発明方法１ではペプトンや塩の濃度が低ければ、酸性多糖を含む試料が中性糖など不純物を含んでいてもそれらに影響されることなく酸性多糖を定量することができる。従って試料中の酸性多糖は、必ずしも精製されている必要がない。
【００５４】
また、本発明方法１の工程１及び工程２を少なくとも含む工程は、これ以外の工程をさらに含んでいても良い。例えば、上記ペプトンを除去する工程や脱塩カラム等を用いて前処理する工程を追加しても良い。
【００５５】
上記ペプトンを除去する方法としてはセントリコン（ミリポア社製）等の遠心限外ろ過ユニットを用いて高分子を回収し、再溶解する等の前処理を行えばよい。
【００５６】
また、本発明方法１において酸性多糖を含有する試料中に含まれる酸性多糖は、先に例示したものが好ましいが、中でもＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれるいずれか１種類の酸性多糖であることが好ましい。
【００５７】
また本発明方法１は、２種類以上の酸性多糖を含有する試料である場合、測定対象とする酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素を共存させる工程を、工程１の前にさらに含むことにより、所望の酸性多糖を定量することができる。
【００５８】
試料中に含まれる酸性多糖としては、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれる２種類以上の酸性多糖であることが好ましく、測定対象とする酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素としては、ヒアルロニダーゼ、スフィンガナーゼキサンタンリアーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヘパリチナーゼ又はコンドロイチナーゼからなる群から選ばれる、１種類以上の分解酵素であることが好ましい。
【００５９】
ここで、ＨＡはヒアルロニダーゼ、ＧＥＬはスフィンガナーゼ、ＸＮＴはキサンタンリアーゼ、ＡＬＧはアルギン酸リアーゼ、Ｋ５Ｐはペパリチナーゼ、Ｋ４Ｐはコンドロイチナーゼを用いることによりそれぞれ分解することができる。
【００６０】
本発明方法１で用いる「ヒアルロニダーゼ」、「スフィンガナーゼ」、「キサンタンリアーゼ」、「アルギン酸リアーゼ」、「ヘパリチナーゼ」及び「コンドロイチナーゼ」はそれぞれの酸性多糖を分解する酵素全てを包含する意味で用いられる。例えば「ヘパリチナーゼ」はヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼII等のＫ５Ｐを分解する酵素を全て包含する意味で用いられる。
【００６１】
またそれぞれの分解酵素は測定対象となる酸性多糖を分解せずかつ測定しない酸性多糖を分解する酵素であれば特に限定されず、試料中に含まれる酸性多糖の種類に応じて個別に設定することができる。
【００６２】
２種類の酸性多糖を同時に含有する試料の具体的な測定方法としては、例えばＨＡとＫ５Ｐを同時に含有する試料中のＨＡを測定する場合、該試料にヘパリチナーゼ（ヘパリチナーゼはＨＡを分解しない）を添加処理した後、さらにステインズ・オールを共存させ、吸光度を測定することにより定量することが例示できる。
【００６３】
また将来、組み換え技術によって作り出されたバクテリアが、２種類以上の酸性多糖を同時に産生した場合も、それらの分解酵素と組み合わせることによって、それら酸性多糖をそれぞれ定量することができる。
【００６４】
また工程２における共存液を測定する際の好ましい吸収波長の範囲は、共存させる酸性多糖の種類により異なり、各酸性多糖−ステインズ・オール共存液の極大吸収波長における吸光度の少なくとも８０％程度の吸光度を持つ範囲で測定することが好ましく、極大吸収波長であることが最も好ましい。
【００６５】
具体的には、試料中の酸性多糖がＨＡ又はＧＥＬである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が６３０〜６７０ｎｍであることが好ましく、６４０〜６６０ｎｍであることがより好ましく、６５０ｎｍであることが極めて好ましい。また、試料中の酸性多糖がＸＮＴ又はＫ５Ｐである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が６１０〜６３０ｎｍであることが好ましく、６１５〜６２５ｎｍであることがより好ましく、６２０ｎｍであることが極めて好ましい。また、試料中の酸性多糖がＡＬＧ又はＸＮＴである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が４７０〜４９０ｎｍであることが好ましく、４７５〜４８５ｎｍであることがより好ましく、４８０ｎｍであることが極めて好ましい。また試料中の酸性多糖がＫ４Ｐである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０〜６５０ｎｍであることが好ましく、６２５〜６４０ｎｍであることがより好ましく、６３０ｎｍであることが極めて好ましい。
【００６６】
また、後述する実施例からわかるようにｐＨが３以下の試料に関しては、共存液の吸光度が劇的に低下することから、測定対象となる共存液のｐＨが３以下である場合は、工程２における測定対象となる共存液をｐＨ４〜１３となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、ｐＨを４〜８となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、ｐＨ５〜８となるように調整する工程をさらに含むことがさらに好ましい。
＜２＞本発明方法２
本発明方法２は、酸性多糖を産生するバクテリアの醗酵プロセスをモニタリングする方法であって、
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する工程、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地とステインズ・オールを共存させる工程、
工程Ｃ：工程Ｂにより得られた共存液の吸光度を測定する工程、
を少なくとも含む方法である。
【００６７】
本発明方法２における「発酵プロセスのモニタリング」とは、発酵プロセスの進行の有無又は進行の程度の測定をすることやバクテリアの酸性多糖産生活性を測定することを言う。またマイクロリーダー等を用いることにより複数の検体に関しても容易に測定がすることができる。
【００６８】
また、本発明方法２は、発酵プロセスをモニタリングすることにより、酸性多糖を産生するバクテリアのスクリーニングに用いることができる。
【００６９】
また本発明方法２におけるモニタリングの方法についても特に限定されることはなく、培養後の任意の時間の１点について吸光度を測定することによりモニタリングしてもよく、２点以上の任意の時間における吸光度を測定することによりモニタリングすることもできる。
【００７０】
本発明方法２の工程Ｂにおける共存方法としては、培養後の精製等の工程を考慮すると各定量時に培地の一部をステインズ・オールと共存させ、吸収波長を測定し、その吸光度の変化を測定することが好ましい。
【００７１】
また本発明方法２をスクリーニングの目的として用いる場合は、培地にステインズ・オールを添加した後培養を行い、その培養時間に対する吸光度の変化を測定することもできる。
【００７２】
上記酸性多糖を産生するバクテリアとしては、具体的には本発明方法１で例示されたバクテリアを例示することができるが、ＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、又はＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアであることが好ましく、その中でも特にＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアがストレプトコッカス属バクテリア由来のＨＡ合成酵素を保持したバクテリアであり、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ５株由来のＮ−アセチルヘパロサン合成酵素を保持したバクテリアであり、ＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ４株由来のＣＨ合成酵素を保持したバクテリアであることがより好ましい。
【００７３】
上記ＨＡ骨格を有する酸性多糖とは（ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４）ｎ構造を持つものであり、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖とは（ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−４）ｎ構造を持つものであり、ＣＨ骨格を有する酸性多糖とは（ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４）ｎ構造を持つものをいう。（ここで、「β１−３」はβ１−３グリコシド結合を、「β１−４」はβ１−４グリコシド結合を、「α１−４」はα１−４グリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
本発明方法２における「ステインズ・オール」、「酸性多糖」及び「共存」等の意義並びに「共存」等の好ましい「ｐＨ」、「温度」、「ステインズ・オールの濃度」及び「工程２における好ましい測定波長」等の条件に関しては本発明方法１と同じである。
【００７４】
＜３＞本発明キット
本発明キットは、構成成分としてステインズ・オールを少なくとも含むことを特徴とする、前記の本発明方法１に記載の方法により酸性多糖を測定するキットである。
【００７５】
本発明キットを用いることにより、本発明方法１及び本発明方法２を容易に実施することができる。
【００７６】
本発明キットの様態は、上記本発明方法１及び２を簡便に実施するためのキットであれば特に限定されず、さらに、共存液を希釈するための希釈液、検量線を作成の用の標準となる既知濃度のＧＡＧｓ等の酸性多糖標準品、マイクロタイタープレート等を構成成分として加えることができる。
【００７７】
また本発明キットは、上記酸性多糖の標準品の代わりに検量線が書かれた表をキットの構成として含むことができ、またその両方を含むこともできる。キットの具体的な構成としては実施例を参照されたい。
【００７８】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法１及び２に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００７９】
本発明キットにおける「ステインズ・オール」、「酸性多糖」等の用語は本発明方法１と同様の意味で用いられ、本発明キットを使用する際の「共存」等の意義並びに「共存」等の好ましい「ｐＨ」、「温度」、「ステインズ・オールの濃度」及び「工程２における好ましい測定波長」等の条件に関しても本発明方法１と同様である。
【実施例】
【００８０】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）材料
以下の実施例においては下記の材料を使用した。
【００８１】
LURIA BROTH BASE nutrient medium (LB 培地)、BactoTM Tryptic Soy Broth、BactoTM ペプトン、カザミノ酸及び酵母エキスはディフコ社から購入した。トウモロコシ、綿実、小麦の麦芽、ピーナッツ及び大豆から調製した植物ペプトン類はオリエンタル酵母社から購入した。セチトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡ）、メタノール、フェノール、アスコルビン酸、CaCl2、１，４−ジオキサン、寒天及びグルコースは和光純薬工業社より購入した。ＨＡ及びＡＬＧはナカライテクス社から購入した、ステインズ・オール（１−エチル−２−［３−（３−エチルナフト−［１，２−ｄ］チアゾリン−２インデン）−２−メチルプロペニル］ナフト−［１，２−ｄ］チアゾリウムブロマイド）及びＧＥＬはシグマ社から購入した。ＸＮＴはピノア社から購入した。
（２）使用した微生物
ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp. zooepidamicus） は医科学研究所（東京大学）から購入した。Ｋ４株由来の大腸菌（Escherichia coli O5:K4:H4）はザ・インターナショナル・エスケリキア・アンド・クレビシエラ・センター（ＷＨＯ）、スタテンス・セーラム・インスティチュート（The International Escherichia and Klebsiella Centre(WHO),Statens Serum Institut）から、Ｋ５株由来の大腸菌（E. coli 010:K5:H4 (ATCC No.23506)） はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から購入した。
（３）培養条件
バクテリアはLBプレートにて生育させた。発酵には3LのＣＹＧ培地(カザミノ酸;2.0％（w/v）、酵母エキス;0.5％（w/v）、グルコース;0.2 ％（w/v）、アデカノール LG-109RR;100ppm、ｐＨ7.2)を含有する５Ｌのファーメンター(サクラ精機社製)を用いた。また接種量、温度、通気量、攪拌速度の条件はそれぞれ、１％（w/v）、３７℃、１vvm、５００rpmとした。
（４）Ｋ５多糖類（Ｋ５Ｐ）とＫ４多糖類（Ｋ４Ｐ）の調製
Ｋ５Ｐはヴァンらの方法に従って調製した（非特許文献８）。具体的には、培養物から菌体を取り除くために、大腸菌Ｋ５株の２４時間齢培養物を４℃、8,000rpmで２０分間遠心分離した。得られた上澄み液にＣＴＡを終濃度が0.5％（v/v）になるように添加した。 遠心分離法で沈殿物を回収した後、１ＭのCaCl2（５０ml）に溶解し、７５mlのエタノールと混合しＫ５Ｐを沈殿させた。次いで遠心分離によって沈殿物を回収し、蒸留水(５０ml)に溶解した。 溶液に含まれるタンパク質をフェノール抽出により除去し、Ｋ５Ｐをエタノール沈殿させ回収した。これらのステップを５回繰り返した後、得られた沈殿物を蒸留水に溶解し、それを凍結乾燥した。
【００８２】
Ｋ４Ｐはマンゾニらの方法に従って調製した（非特許文献９）。具体的には、培養物から菌体を取り除くために、大腸菌Ｋ４株の16時間齢培養物を４℃、8,000rpmで２０分間遠心分離した。スパイラルカートリッジS1Y10(分子量遮断;10kDa、ミリポア社製)を用いた限外濃縮法によって上澄み液を濃縮した。その後４倍量のエタノールと濃縮液を混合し、Ｋ４Ｐの沈殿を生成させた。得られた酸性多糖は真菌由来のプロテアーゼを用いた酵素消化とエタノール分画を用いて精製した後、凍結乾燥した。
【００８３】
これらの酸性多糖の純度は、アライらの方法に従ってGPC-HPLC分析にて評価した（非特許文献１０）。各酸性多糖の純度は90%以上であった（図1）。
（５）試薬の調製
試験に供した酸性多糖（Ｋ５Ｐ、Ｋ４Ｐ、ＨＡ、ＡＬＧ、ＧＥＬ及びＸＮＴ）は終濃度が１mg/mlになるように蒸留水に溶解し、標準液とした。 少量ずつ分注した後、それらを−２０℃で保存した。１ｍＭの酢酸と0.5ｍＭのアスコルビン酸を含有する1,4-ジオキサンの５０％（v/v）、水溶液にステインズ・オールを終濃度が1ｍＭになるように溶解し、ステインズ・オール溶液とした。なお、当該溶液は４℃下、暗所にて２週間は安定だった。
実施例１：酸性多糖の定量
各酸性多糖の分析はホーマーらの方法に従い実施した（非特許文献１１）。上記調製により得られた各試料溶液５０μｌをそれぞれ試験管に移し、４５０μｌのステインズ・オール溶液と５００μｌの蒸留水と順次、添加した。その後、該共存液を1.5 ｍｌのガラスセルに移し、分光器UV-160A(島津社製)を用いて酸性多糖毎に適切な波長で吸光度を測定した。
【００８４】
すべての分析は３回実施し、平均値を記した。 マイクロアッセイでは、１７μlの試料溶液を96穴マイクロプレートに移し、１２５μlのステインズ・オール溶液と１５０μlの蒸留水と順次、添加した後、マイクロプレートリーダーSK601（生化学工業社製）を用いて各酸性多糖に適切な波長で共存液の吸光度を測定した。
【００８５】
染料溶液に各酸性多糖を５μｇずつ添加した際に生じたスペクトル変化を図２〜４に示した。ＨＡを添加することによって、６５０ｎｍに新しい吸収ピークが出現した（図２）。
一方、Ｋ４Ｐ又はＫ５Ｐとステインズ・オールとの共存液については明確なピークは見られなかったが、６１０〜６４０ｎｍの範囲に吸収の肩が出現した。ステインズ・オール溶液を参照として測定した場合、Ｋ４Ｐ及びＫ５Ｐのステインズ・オール共存液のスペクトルはそれぞれ、６３０ｎｍ、６２０ｎｍで極大吸収を示した（図３）。同様に、ウロン酸含有多糖であるＡＬＧ、ＧＥＬ及びＸＮＴもステインズ・オールとの複合体を形成し、それらの極大吸収はそれぞれ４８０、６５０、６２０ｎｍであることが明らかになった（図４）。また、ＸＮＴのステインズ・オール共存液においては４８０ｎｍにも極大吸収が出現した。
【００８６】
これらの測定の結果よりＨＡ及びＧＥＬの最適な測定波長は６５０ｎｍであり、Ｋ５Ｐは６２０ｎｍ、Ｋ４Ｐは６３０ｎｍ、ＡＬＧでは４８０ｎｍ、ＸＮＴでは６２０又は４８０ｎｍであることを示した。また、実施例２以降の酸性多糖−ステインズ・オール共存液の吸光度の測定はそれぞれ上記の最適な波長にて行うこととした。
【００８７】
また、酸性多糖−ステインズ・オール複合体は室温で少なくとも６０分間は安定であることを確認した。
実施例２：測定範囲の検討
本発明方法１で測定できる酸性多糖の濃度範囲を決定するために、様々な濃度に調製した酸性多糖溶液をステインズ・オール溶液に添加し、実施例１で得られた波長で吸光度を測定した。本発明方法１を用いた各酸性多糖の検量線を図５に示した。ＨＡに関しては、６５０ｎｍで測定した吸光度と濃度との間に正の相関が観察され、その直線性は100μg/mlまで維持されていた。一方、他の酸性多糖の場合にも吸光度と濃度の間に正の相関が観察され、検量線の直線性は250μg/mlまで維持されていた。また、これらの酸性多糖類の分析範囲の下限は2μg/mlであった。また当該方法は、上述した波長の固定波長フィルタが装備された96穴プレートリーダー分光光度計を用いたＢＧＡＧｓ等の酸性多糖のマイクロアッセイにおいても同様の結果を観察した。ＡＬＧ（r2値：0.995）を除き、試験したすべての酸性多糖の定量分析における検量線のr2値は0.998以上だった。比較のために、ＧＡＧｓの定量法であるカルバゾール−硫酸法の検量線を標準物質であるＤ−グルクロノラクトンを用いて作成したが、その直線性は100μg/mlまで維持されていた。どちらの測定方法でも測定範囲は同様な結果であったが、従来の方法（約１時間）に比べて、短時間（１５分以下）で測定できる等、ステインズ・オール法は従来法に比べはるかに優れていた。また、この分析方法は従来の方法の干渉物質であるグルコースなど中性糖の存在下においても影響を受けず、マイクロアッセイを採用することによって多検体の同時測定も可能である。
実施例３：酸性多糖−ステインズ・オール複合体形成に及ぼすｐＨ及び塩の影響
異なるｐＨにおけるＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度の相対的な強度の変化について調べるために、ＨＡ及びＫ５Ｐの水溶液を、２０ ｍＭ マッキルバインバッファー（ｐＨ２．２４−ｐＨ８．２４）、２０ｍＭ ホウ酸バッファー（ｐＨ８．１８−ｐＨ１０．０５）及び１００ｍＭのＮａＯＨ溶液（ｐＨ１３．４）を用いて調製し、実施例１に記載された方法でステインズ・オール共存液の吸光度を測定した。その結果を図６に示す。分析におけるＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度はｐＨ４からｐＨ８までの範囲ではｐＨに依存せず、ほぼ一定の値を示した。またｐＨ９付近において吸光度の減少が多少見られたがｐＨ１３程度までは問題なく測定することが可能であった。しかし、ｐＨ３の条件下では、これらの酸性多糖−ステインズ・オール共存液の吸光度が劇的に減少した。ｐＨ３以下の条件ではカルボキシル基のイオン化が抑制されるために、酸性多糖とステインズ・オールとの複合体の形成が阻害されると考えられる。従って、当該方法による分析の至適ｐＨはｐＨ４〜８の範囲であることがわかった。また特別なバクテリアを除いて、多くのバクテリアが生育できるｐＨの範囲はｐＨ５〜８までであり、ＢＧＡＧｓの生産菌である大腸菌と連鎖状球菌もｐＨの範囲がｐＨ５〜８でよい成長を示した。これらの結果は、細菌培養液のｐＨについては特に前処理を行わなくても、当該分析法によって細菌培養液中のＢＧＡＧｓの濃度が測定できることを示唆している。
【００８８】
次に、BaCl2、CaCl2、MgCl2、MnCl2及びNaClなどの塩類を用いて、各々のカチオンの存在下における複合体の吸光度をそれらの非存在下における値と比較した。NaイオンとMnイオンを除き、１０ ｍＭの塩の存在の下でＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度は減少した（表1）。
【００８９】
【表１】
【００９０】
特に、Pbイオン又はBaイオンの共存下においては酸性多糖−ステインズ・オール共存液の吸光度が著しく低下した。しかし、上記イオンの濃度を１ｍＭまで減少させたところ、この干渉効果は大幅に低減した。また、Ｋ５Ｐと酢酸ナトリウムを用いた試験において、Ｎａイオンの濃度が２５０ｍＭに達しても、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度の減少はほとんど見られなかったことからＮａイオンの影響は無視できるものと考えられる。（図７）。またNaCl及びNa2HPO4以外の無機塩類に関しては、一般的な培地の中の濃度は１０ｍＭ未満であることから、細菌培養液中のＢＧＡＧｓ等の酸性多糖の濃度を測定する際にカチオンの影響は無視できる。培地中のリン酸イオンと塩化物イオンの濃度は１０ｍＭよりかなり高いことから、Ｋ５Ｐをモデル化合物として、分析の精度に対するこれらアニオンの影響を評価した。上記酢酸ナトリウムを用いた実験で２５０ｍＭのＮａイオンが分析に対して影響を及ぼさないことがわかっているので、NaClとNaH2PO4を使ってＫ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度への塩化物イオンとリン酸イオンの効果を比較した。アニオンの濃度が３０ｍＭを超えない限り、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール複合体の形成に作用することなく吸光度の変化はほとんど見られなかった（図８）。しかし、アニオンの濃度が３０ｍＭを超えるとその濃度に依存して、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度は徐々に低下した。特に、塩化物イオンの濃度が１００ｍＭを越えた時に、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度は大幅に減少した。培地中のNaClの濃度は導電率の測定結果から算出できるが、BactoTM Tryptic Soy Broth（ＴＳＢ）など一般的な培地に含まれるNaClはおよそ１５０ｍＭと推察される。従って、培地中の酸性多糖の濃度を定量する際、NaClの干渉を避けるため、培養サンプルを分析の前に蒸留水によって少なくとも5倍に希釈するべきである。
実施例４：吸光度に対するステインズ・オール溶液の濃度依存性
ステインズ・オール溶液の最適な濃度を調べるため、先ず１００μg/mlのＨＡ又はＫ５Ｐに各濃度のステインズ・オール溶液（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125及び0.156ｍＭ）を添加した共存液のスペクトルを比較した。ネガティブコントロールとしては蒸留水を用いた。共存液は各酸性多糖５０μｌにステインズ・オール溶液４５０μｌ、蒸留水５００μｌを順次添加することにより得た。その結果、ステインズ・オール溶液の濃度が2.5ｍＭ以上では、試料が蒸留水である場合でも、それぞれの最適な波長において吸光度が上昇した。また、ステインズ・オール溶液の濃度が0.4ｍＭ以下の条件では、ほとんど発色せず、蒸留水と比較したものとほとんど変わらなかった。次に、ステインズ・オール溶液の濃度を0.3〜1.5ｍＭの範囲について詳細に検討した。その結果、ＨＡでは、0.5〜0.6ｍＭの濃度において高い吸光度を示した。一方、Ｋ５Ｐについては、0.5〜1.5ｍＭの範囲で吸光度が一定であった（図８）。
実施例５：培養液中におけるＢＧＡＧｓ量の測定
次に、培地中に含まれる他の構成成分が与える本発明方法の分析精度への影響を調べた。
【００９１】
まず、ペプトン、グルコース及び無機塩類から構成されるＴＳＢとステインズ・オールの共存液のスペクトル解析を実施した。ＴＳＢとステインズ・オールとを共存させたとき、ＨＡ−ステインズ・オール共存液と類似したスペクトルが観察された（図９）。しかし、ＴＳＢを蒸留水で１０倍に希釈することにより、その影響は無視できることもわかった。前記実施例に記載したように培地中のグルコースや無機塩類が本測定法に影響しないので、この結果はステインズ・オールがＴＳＢ中に含まれるペプトンと複合体を形成することによって、波長６１０〜６５０ｎｍに新たな吸収を持つことを示唆している。そこで、他のペプトンでも同様の複合体が形成されるかどうかを評価した。
【００９２】
ＴＳＢに含まれるペプトン含量は２％（w/v）であるので、同様の濃度で比較した。その結果、比較したすべてのペプトンで同様のスペクトルを観察した。次に、１０倍希釈液を用いてスペクトルの変化を比較した。図１０に６１０ｎｍ、６２０ｎｍ、６３０ｎｍ及び６５０ｎｍにおけるペプトン−ステインズ・オール共存液の吸光度の結果を示した。ＴＳＢにおける主要なペプトンであるBactoTMペプトンは、６５０ｎｍ又は６３０ｎｍに弱い吸収が観察されたが、トウモロコシ、綿実及び麦芽由来の植物ペプトン並びにカザミノ酸は酸性多糖−ステインズ・オール複合体と競合する波長の吸収を示さなかった。一方、ピーナッツ又は大豆由来のペプトンの場合、１０倍希釈液においてもなお高い吸収が観察された。特に、６３０ｎｍの吸光度はＫ４Ｐ濃度に換算すると２０〜３０μg/mlに匹敵した。これらの結果は、ある種のペプトンで例外が認められるが、ペプトン濃度が0.2％（w/v）以下であれば、一般的な細菌培養用ペプトンが本発明分析方法に影響しないことを示した。次に、本検討の発酵実験に使用したＣＹＧ培地を用いた確認試験を実施した。ＣＹＧ培地には２％（w/v）のカザミノ酸が含まれているので、１０倍に希釈したＣＹＧ培地を用いて調製したＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液とＢＧＡＧｓ水溶液を用いたＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度を比較した。１０倍に希釈したＣＹＧ培地を用いて調製したＢＧＡＧｓ溶液の結果はＢＧＡＧｓ水溶液の結果と極めてよく一致した。これらの結果から、今回の発酵試験では培養液の希釈率を１０倍に設定した。従って、本方法の分析範囲の下限は２μg/mlであるので、培養液中のＢＧＡＧｓ等、酸性多糖を測定する際の濃度の下限は２０μg/mlであることを確認した。
【００９３】
次に本発明方法の応用として発酵プロセスの経時変化について検討した。図１１〜１２はそれぞれＣＹＧ培地を用いた時のＢＧＡＧｓ（順にＨＡ、Ｋ５Ｐ）の発酵プロセスの経時変化を示したものである。対数増殖期には、すべてのＢＧＡＧｓはほとんど生産されなかったが、減衰増殖期から定常期にかけてそれらは急速に生産された。細菌培養物におけるＫ５Ｐ及びＨＡの最大の生産性はそれぞれ、0.401、及び0.501g/Lであった。次いで、大腸菌Ｋ５株の２４時間フラスコ培養物を用いて、ステインズ・オール法とカルバゾール法によってＫ５Ｐ含量を測定した。異なる３バッチにおけるＫ５Ｐ含量を両測定方法で見積もった結果を表２に示した。両方の分析結果は非常によく合致していた。これらの結果は、この分析方法が、ＢＧＡＧｓ等、酸性多糖の発酵プロセスをモニタリングするための強力な分析ツールとなりうることを示唆している。
【００９４】
【表２】
【００９５】
次に、複数の酸性多糖が共存している試料の測定を測定対象以外の酸性多糖を分解する酵素を用いて測定した場合影響が無いかどうかを調べるため、下記のサンプル１〜６の共存液のスペクトルを測定した。
サンプル１：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、蒸留水 １８０μｌ
サンプル２：1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、蒸留水 １８０μｌ
サンプル３：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、蒸留水 １６０μｌ
サンプル４：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、バッファー１ １００μｌ、2 units/ml コンドロイチナーゼＡＢＣ ２０μｌ、蒸留水 ４０μｌ
サンプル５：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、バッファー２ １００μｌ、0.1 units/ml ヘパリチナーゼ ２０μｌ、蒸留水 ４０μｌ
サンプル６：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、バッファー１ １００μｌ、2 units/ml コンドロイチナーゼＡＢＣ２０μｌ、0.1 units/ml ヘパリチナーゼ ２０μｌ、蒸留水 ２０μｌ
コントロール：バッファー１ １００μｌ、蒸留水 １００μｌ
上記バッファー１は５０ｍＭ Tris-HCl，５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ）（ｐＨ６．２）を用い、バッファー２は１００ｍＭ ＡｃＮａ，１０ｍＭ 酢酸カルシウム（（ＡｃＯ）２Ｃａ） （ｐＨ７．０）を用いた。サンプル４〜６については３７℃で３時間酵素反応をさせた後、熱失活したものを測定サンプルとした。それぞれのサンプル５０μｌに、１ｍＭステインズ・オール溶液４５０μｌ及び蒸留水５００μｌを順次添加し、それぞれ最適な波長にて測定した。測定スペクトルからコントロールのスペクトルを差し引いた結果を図１３に示す。図に示すように測定波長が重なってしまうような酸性多糖が共存する試料においても、測定対象以外の酸性多糖を予め酵素で分解することにより問題なく測定できることがわかる。
【００９６】
これらの結果により本発明方法は標準液だけでなく様々な不純物が含まれる培養液等におけるＢＧＡＧｓの分析において高い再現性と精度を持つことがわかった。また、この分析方法は従来の比色分析法と比べ簡単であり、マイクロリーダー等を用いることによって多検体にも容易に対応できることがわかった。
実施例６：カラムクロマトグラフィー法によるＢＧＡＧｓ精製への応用
Ｋ４Ｐ精製用クロマトグラフィー担体として、陰イオン交換体担体であるＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２（ワットマン社製）を用いた。
【００９７】
２倍量の蒸留水で希釈した遠心上清液をＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２を詰めた５０ｍＬ用量のラジアルフローカラム（セプラジェン社製）にアプライした。カラムを１００ｍＭ食塩水（２５０ｍＬ）で洗浄した後、３００ｍＭ食塩水（２５０ｍＬ）と５００ｍＭ食塩水（１５０ｍＬ）でカラムを溶出した。溶出液は１５ｍＬずつ分画した。
【００９８】
食塩濃度を５０ｍＭ以下に下げるために、各分画は蒸留水で１０倍に希釈した。ステインズオール分析法を用いてＫ４Ｐの分析を行った６３０ｎｍの固定波長フィルタが装着された９６穴プレートリーダー分光光度計を用いて測定した結果を図１４に示した。Ｋ４Ｐの溶出カラム用量の１．２倍量の溶出液（３００ｍＭ食塩水）をカラムに通液したところ
より始まり、溶出液量がカラム容量３倍に達したところで終了した。また得られた結果が正しいかどうかを確認するため、ＧＡＧの定量法として既に確立しているカルバゾール法でも測定を行った。カルバゾール法においても同様の結果が得られた。
【００９９】
Ｋ４Ｐを回収するために、Ｋ４Ｐ含有画分を濃縮した後、同量のエタノールと混合した。遠心分離法で回収された沈殿物を蒸留水に再溶解した。脱塩を行うために、当該溶液はコットンセルロース透析膜（Ｃｅｌｌｕ−Ｓｅｐ Ｈ１、分子量カットオフ：１０００、フナコシ社製）を用いて流水中で透析を行った。透析内液を凍結乾燥することによって、淡い象牙色のパウダー５８．６ｍｇを得た。
【０１００】
当該パウダーは、コンドロイチン分解酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）により部分的に分解された。また、リドホルトらの方法（非特許文献１２）により脱フルコトシル化処理を行った試料は、コンドロイチナーゼＡＢＣによって、不飽和二糖であるコンドロΔＤｉ−０Ｓまで完全に分解されたことから、Ｋ４Ｐであることを確認した。
実施例７：本発明キット
以下の構成からなる本発明キットを作成した。
１． ステインズ・オール （１ｍｇ） １本
２． ステインズ・オール溶解液（１ｍＭ酢酸、０．５ｍＭアスコルビン酸、１，４−ジオキサン水溶液を含む） １本
３． マッキルバイン緩衝溶液（ｐＨ７） １本
４． 各種酸性多糖標準液
標準液１（1mg/ml ＨＡ溶液） １本
標準液２（1mg/ml Ｋ５Ｐ溶液） １本
標準液３（1mg/ml Ｋ４Ｐ溶液） １本
標準液４（1mg/ml ＡＬＧ溶液） １本
標準液５（1mg/ml ＧＥＬ溶液） １本
標準液６（1mg/ml ＸＮＴ溶液） １本
５． マイクロタイタープレート １枚
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】調製したＫ４Ｐ及びＫ５ＰをGPC-HPLC分析した結果を示す図である。
【図２】ＨＡを添加した際に生じたスペクトル変化を示す図である。
【図３】Ｋ４Ｐ又はＫ５Ｐを添加した際に生じたスペクトル変化を示す図である。
【図４】ＡＬＧ、ＧＥＬ又はＸＮＴを添加した際に生じたスペクトル変化を示す図である。
【図５】各酸性多糖の検量線を示す図である。
【図６】ＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度のｐＨ依存性を示す図である。
【図７】Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度のアニオン濃度依存性を示す図である。
【図８】ＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度のステインズ・オール溶液の濃度依存性を示す図である。
【図９】ＴＳＢ培地中のＨＡ−ステインズ・オール共存液のスペクトルを示す図である。
【図１０】各測定波長におけるペプトンの影響を示す図である。
【図１１】ＨＡ量の経時的変化を示す図である。
【図１２】Ｋ５Ｐ量の経時的変化を示す図である。
【図１３】ＨＡとＫ５Ｐが共存した溶液に各分解酵素を用いた時のスペクトルを示す図である。
【図１４】陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるＫ４Ｐの溶出プロファイルを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液中の酸性多糖の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＧＡＧｓ：動物組織由来のグリコサミノグリカン
ＢＧＡＧｓ：バクテリア由来のグリコサミノグリカン
ＡＬＧ：アルギン酸
ＧＥＬ：ジェランガム
ＸＮＴ：キサンタンガム
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＣＨ：コンドロイチン
ＧｌｃＵＡ：グルクロン酸
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｋ５Ｐ：大腸菌Ｋ５株（Escherichia coli serotype O10:K5(L):H4 （ATCC23506）、Escherichia coli serotype O2a,2b:K5(L):H4 （ATCC23500）あるいは、Escherichia coli serotype O12:K5(L) （ATCC23508））より産生される酸性多糖であって、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格（ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−４）ｎをもつものである。（ここで、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、α１−４はα１−４グリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
Ｋ４Ｐ：大腸菌Ｋ４株（Escherichia coli serotype O5:K4(L):H4）より産生される酸性多糖であって、ＣＨ骨格（ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４）ｎをもつものである。（ここで、β１−３はβ１−３グリコシド結合を、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＨＰ：ヘパリン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＤＳ：デルマタン硫酸
多くのバクテリアは主要な成分が多糖類である莢膜を保持している。それら多糖は様々な単糖を構成成分としており、アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）が産生するＡＬＧ、スフィンゴモナス・エロディア（Sphingomonas elodea）が産生するＧＥＬ及びキサントモナス・キャンペストリス（Xanthomonas campestris）が産生するＸＮＴは構成糖としてウロン酸を含有する酸性多糖である。また、連鎖球菌や大腸菌等に属する菌株の中に、ＧＡＧｓと糖鎖構造が一致する多糖、つまりＢＧＡＧｓを生産するものが知られている。
【０００３】
さらに、ＡＬＧ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、並びにＢＧＡＧｓの一種であるストレプトコッカス・エクィ（Streptococcus equi）等の連鎖球菌が産生するＨＡは、特殊なレオロジー特性のために、食品、医薬品及び化粧品等の産業に広く使用されている(非特許文献1〜6)。
【０００４】
ＢＧＡＧｓであるＫ５ＰやＫ４Ｐは大腸菌Ｋ５株及びＫ４株によって産生される多糖であり、それぞれＨＳ／ＨＰ及びＣＳ／ＤＳと同じ糖鎖骨格構造を有している。そのため、医薬用途における当該多糖の商業応用はかなり期待されており、実際に多くの研究者がこれらのＢＧＡＧｓを原料として様々なＧＡＧミミックを調製することを試みている。しかし、ＨＡを除くＢＧＡＧｓの生産性は商業的に応用するためには十分ではない。従って生産菌の育種及び醗酵プロセスの改善が必須である。
【０００５】
発酵プロセスを正確にコントロールするためには、プロセスを通して、基質や生成物等、発酵過程の物質収支を正確かつ迅速にモニタリングすることが重要である。また、生産菌の育種では多数の試料を処理する必要もある。発色試薬としてカルバゾール又はフェノール等を用いた、比色分析法により少量の多糖類を含む試料の分析が知られているが、中性糖等の妨害物質の存在により分析が阻害されることが知られている。バクテリアの培養物中には様々な妨害物質が存在しているため、そこに含まれる多糖類を分析するためには、当該試料を前処理することが必須である。また場合によってはいくつかのステップからなる精製が必要となることもあり、分析の結果を得るまでにかなりの時間がかかることとなる。さらにこれら発色試薬と多糖との反応性は多糖を構成する単糖の種類に依存する。つまり、発色試薬の各種単糖に対する反応性が異なる。そのために、今まではＢＧＡＧｓ等の多糖の培養液中の濃度を測定する現実的な方法が知られていなかった。
【０００６】
一方、カチオン性のカルボシアニン染料は、酸性多糖類を染色するために良く用いられている。特に、１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイド(以下「ステインズ・オール」という。) の可視スペクトルが酸性多糖の存在下で変化することと、その変化が分子の中のウロン酸残基の数に依存することが知られている（非特許文献７）。
【０００７】
しかしながら、これらの結果は全て精製されたＨＡやペクチン（ポリガラクツロン酸）を測定したものであり、培養液のような不純物共存下において、ステインズ・オールを用い酸性多糖を選択的に定量する方法は知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】ウェン−ピン チェン（Wen-Pin Chen）ら、１９８５年, アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Appl. Environ Microbiol.）第４９巻、第３号、ｐｐ.５４３−５４６
【非特許文献２】ザォ ワン（Xia Wang）ら、２００６年、アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Appl. Environ Microbiol.）第７２巻 第５号 ｐｐ.３３６７−３３７４
【非特許文献３】Ｎ Ｅ ハーディング（N E Harding）ら、１９８７年、ジャーナル オブ バクテリオロジー（J Bacteriol.）第１６９巻、第６号 ｐｐ２８５４−２８６１
【非特許文献４】ジャン Ｋ（Jann, K.）ら、１９９２年、カナディアン ジャーナル オブ マイクロバイオロジー（Can. J. Microbiol.）、第３８巻、ｐｐ７０５−７１０
【非特許文献５】ニミッヒ Ｗ（Nimmich, W.）ら、１９９７年、ジャーナル オブ クリニカル マイクロバイオロジー （J. Clin. Microbiol.）、第３５巻 第５号、ｐｐ１１１２−１１１７
【非特許文献６】デアンジェラス Ｐ Ｌ（DeAngelis, P. L.）ら、２００２年、 カルボハイドレートリサーチ（Carbohydr. Res.）、第３３７号、ｐｐ１５４７−１５５２
【非特許文献７】エドストローム Ｒ．Ｄ．（Edstrom R. D.）ら、１９７３年、アチーブス オブ バイオケミストリー アンド バイオフィジックス（Arch. Biochem. Biophys.）、第１５５巻、ｐｐ３０７−３１４
【非特許文献８】ヴァン Ｗ． Ｆ．（Vann W. F.）ら、１９８１年、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Eur. J. Biochem）、第１１６巻、ｐｐ３５９−３６４
【非特許文献９】マンゾニ Ｍ.（Manzoni M.）ら、１９９６年、バイオテクノロジー レターズ（Biotech. Lett.）、第１８巻、ｐｐ３８３−３８６
【非特許文献１０】アライ Ｍ.（Arai M.）ら、１９９２年、バイオケミストリー アンド バイオフィジックス アクタ（Biochem. Biophys. Acta.）第１１１７巻、ｐｐ６０−７０
【非特許文献１１】ホーマー（Homer K. A.）ら、１９９３年、アナリティカル バイオケミストリー（Anal. Biochem）、第２１４巻、ｐｐ４３５−４４１
【非特許文献１２】リドホルト（Lidholt, K.）ら、１９９７年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー （J. Biol. Chem.）、第２７２巻、ｐｐ２６８２−２６８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、今まで測定が困難であった培養液中に含有する酸性多糖の定量方法を提供するとともに、その方法を利用した培養プロセスのモニタリング方法並びにキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、酸性多糖をステインズ・オール溶液と共存させることによって、各酸性多糖に特異的な吸収スペクトルを持った複合体が形成されること及び培養液中の阻害物質としてリン酸イオン、塩化物イオン、ペプトン類を見いだし、さらにこれにより培養液中の酸性多糖を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、下記工程を少なくとも含む、酸性多糖の定量方法(以下、「本発明方法１」という)を提供する。
工程１：ステインズ・オールと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる工程、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する工程。
【００１２】
上記試料中の酸性多糖はバクテリアにより産生された酸性多糖であってもよい。
【００１３】
また、酸性多糖を含有する試料は、酸性多糖を含む培地であってもよい。
【００１４】
本発明方法１は、工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度を３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、特に培地や塩化物イオン濃度が高い試料（例えば、塩化物イオン濃度が１２０ｍＭ以上の試料）について定量する場合に、工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度を３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【００１５】
また、本発明方法１は試料中にペプトンを含む場合にも測定することができ、その場合には、工程２における測定対象となる共存液中のペプトン濃度を０．２％（w/v）以下になるように調整する工程をさらに含むことがより好ましい。
【００１６】
また、上記試料中の酸性多糖は、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれる、いずれか１種類の酸性多糖であることが好ましい。
【００１７】
また本発明方法１では、酸性多糖を含有する試料が２種類以上の酸性多糖を含有する場合には、測定する酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素を共存させる工程を、工程１の前にさらに含むことによって測定できる。
【００１８】
また上記２種類以上の酸性多糖は、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれる２種類以上の酸性多糖であることが好ましく、酸性多糖を分解する酵素は、ヒアルロニダーゼ、スフィンガナーゼ、キサンタンリアーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼからなる群から選ばれる、１又は２種類以上の分解酵素であることが好ましい。
【００１９】
ただし、上記工程は必ずしもこの工程を含む必要は無く、後述の各酸性多糖の好ましい測定波長の範囲を選択することによって、測定したい酸性多糖を定量することもできる。
【００２０】
また本発明方法１は、試料中の酸性多糖がＨＡ又はＧＥＬであるとき、工程２における吸光度を測定するときの波長が６３０〜６７０ｎｍであることが好ましく、６５０ｎｍであることがより好ましい。また、試料中の酸性多糖がＸＮＴ又はＫ５Ｐであるとき、工程２における吸光度を測定するときの波長が６１０〜６３０ｎｍであることが好ましく、６２０ｎｍであることがより好ましい。また試料中の酸性多糖がＡＬＧ又はＸＮＴであるとき、工程２における吸光度を測定するときの波長が４７０〜４９０ｎｍであることが好ましく、４８０ｎｍであることがより好ましい。また試料中の酸性多糖がＫ４Ｐであるときは、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０〜６５０ｎｍであることが好ましく、６３０ｎｍであることがより好ましい。
【００２１】
また本発明方法１は、工程２における測定対象となる共存液をｐＨ５〜８になるように調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【００２２】
また本発明は、酸性多糖を産生するバクテリアの醗酵プロセスをモニタリングする方法であって、
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する工程、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地とステインズ・オールを共存させる工程、
工程Ｃ：工程Ｂにより得られた共存液の吸光度を測定する工程、
を少なくとも含む方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。
【００２３】
本発明方法２において酸性多糖を産生するバクテリアがＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、又はＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアであることが好ましく、中でもＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアがストレプトコッカス属バクテリア由来のＨＡ合成酵素を保持しており、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ５株由来のＮ−アセチルヘパロサン合成酵素を保持しており、、ＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ４株由来のＣＨ合成酵素を保持していることが極めて好ましい。
【００２４】
また本発明は、構成成分としてステインズ・オールを少なくとも含むことを特徴とする、本発明方法１又は２の方法により酸性多糖を測定するキット（以下、「本発明キット」という。）を提供する。
【００２５】
本発明キットは、構成として、さらに酸性多糖標準溶液又は検量線が書かれた表を含むことができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明方法は、酸性多糖生産菌を培養することによって得られた酸性多糖を精製することなしに容易に定量することができ、また精製せず簡便に定量できることから、酸性多糖の製造プロセスにおけるモニタリング等に応用できることから極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明方法１
本発明方法１は、下記工程を少なくとも含む酸性多糖の定量方法である。
工程１：ステインズ・オールと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる工程、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する工程。
【００２８】
ここにいう「ステインズ・オール」とは、カチオンのカルボシアニン染料の一つである、１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドのことを言う。このステインズ・オールはシグマ社等から購入することができる。
【００２９】
また、このステインズ・オールは、本発明方法に影響を及ぼさない限りにおいて添加剤と共存させておくことができる。
【００３０】
ここにいう添加剤とは、ｐＨ調節剤（例えば測定されるｐＨに適した緩衝剤）や安定化剤、保存剤、キレート剤、酸化防止剤等が挙げられる。
【００３１】
またここにいう「酸性多糖」とは、ヘキソサミン（Ｄ−グルコサミン又はＤ−ガラクトサミン）とウロン酸（Ｄ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸）又は中性ヘキソース（Ｄ−ガラクトース）の二糖ユニットの繰り返し構造を持つ糖鎖、多糖構造中の一部に硫酸又はリン酸エステルを持つ糖類、或いはその両方の構造を持つ糖鎖であって、天然から得られる酸性多糖のみならず、遺伝子工学的に産生された酸性多糖等も含まれる。具体的にはＣＨ、ＣＳ、ＨＳ、ＨＰ、６位脱硫酸化ＨＰ、２位脱硫酸化ＨＰ、Ｎ−脱硫酸化ＨＰ、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ、Ｋ４Ｐ及びそれらの塩が例示される。
【００３２】
また本発明方法１における「ＨＡ」、「ＧＥＬ」、「ＸＮＴ」、「ＡＬＧ」、「Ｋ５Ｐ」及び「Ｋ４Ｐ」はそれぞれの酸性多糖が有する骨格を持つものであれば、その由来は限定されない。例えば天然から得られるもの、バクテリアの培養により得られたもの、遺伝子工学的に産生されたもの、人工的に酵素合成したもの等も含む概念で用いるものとする。より具体的には、例えばＫ４Ｐを例に挙げると、大腸菌Ｋ４株より産生された酸性多糖はもちろんのこと、これと同じ骨格を有する酸性多糖を化学的に合成したものも包含するものである。
【００３３】
工程１において、ステインズ・オールと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる方法及び条件は、これらの分子が互いに接触し、溶解した状態で複合体を形成する条件である限りにおいて特に限定されない。例えば、酸性多糖を含有する試料にステインズ・オールを含有する溶液を添加してもよく、ステインズ・オールを含有する溶液に酸性多糖を含有する試料を添加してもよく、また、両者を同時に添加することにより共存させても良い。
【００３４】
上記「共存」する条件としては、例えばｐＨ３〜１３の範囲で行われることが好ましく、ｐＨ４〜８の範囲で行われることがより好ましく、ｐＨ５〜８で行われることがさらに好ましい。また当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝溶液中で行われることがより好ましい。
【００３５】
上記緩衝溶液としては具体的にマッキルバインの広域緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が例示される。
【００３６】
また「共存」させる温度としては、例えば０℃〜５０℃の条件下で共存させることが好ましく、１０℃〜４０℃で共存させることが好ましく、特に２０℃〜３０℃で共存させることが極めて好ましい。また、上記の酸性多糖等に反応したステインズ・オールの吸光度変化は速やかに生じるが、その後徐々に変化してしまうため、ステインズ・オールとの共存後６０分以内、好ましくは３０分以内、最も好ましくは１０分以内に吸光度を測定することが好ましい。
【００３７】
また、共存時におけるステインズ・オールの濃度としては、測定する酸性多糖の種類やその他の条件により適宜選択することができる。後述する実施例の条件で共存させる場合ステインズ・オール溶液の濃度は、０．５〜１．５ｍＭの範囲であることが好ましい。また、ＨＡを定量する場合には０．５〜０．６ｍＭの濃度のステインズ・オール溶液を共存させることが特に好ましい。
【００３８】
また、工程２における共存液の吸光度を測定する方法も特に限定されず、通常の吸光光度計等を用いて測定することができる。
【００３９】
また共存液中の酸性多糖の濃度を測定するためには、濃度が既知の酸性多糖標準液を用いて、ステインズ・オールとの複合体を形成させた後の吸光度の値（又はある波長における吸光度と他の波長における吸光度との比の値）と酸性多糖濃度との関係について予め検量線や関係式を作成しておき、酸性多糖濃度が未知の共存液についての測定結果をその検量線や関係式を用いて酸性多糖濃度に変換することで求めることができる。
【００４０】
また上記試料中の酸性多糖は、上述したようにその由来は限定されることはなく、バクテリアにより産生された酸性多糖であってもよい。
【００４１】
ここにいうバクテリアとしては、酸性多糖を産生するバクテリアであれば特に限定されず、具体的に例示すると、ＡＬＧを産生するアゾトバクター・ビネランジー（Azotbaceter vinelandii）、ＧＥＬを産生するスフィンゴモナス・エロディア（Sphingomonas elodea）、ＸＮＴを産生するキサントモナス・キャンペストリス（Xanthomonas campestris）、ＨＡを産生するストレプトコッカス・エクィ（Streptococcus equi）、Ｋ５Ｐを産生するＫ５株由来の大腸菌又はＫ４Ｐを産生するＫ４株由来の大腸菌等が例示される。
【００４２】
これらのバクテリアはＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）や東京大学医科学研究所、ザ・インターナショナル・エスケリキア・アンド・クレビシエラ・センター（ＷＨＯ）、スタテンス・セーラム・インシチチュート（The International Escherichia and Klebsiella Centre(WHO),Statens Serum Institut）などにより入手することができる。
【００４３】
また本発明方法１は後述する実施例からわかるように、測定される試料が必ずしも精製されている必要がなく、酸性多糖を含有する試料は、酸性多糖を含む培地であってもよい。
【００４４】
また本発明方法１は、工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度が３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【００４５】
後述する実施例からわかるよう塩化物イオン濃度が１００ｍＭを超えると大幅に吸光度が減少する。また一般的な培地中の塩化物イオン濃度は１５０ｍＭ程度であることから、本発明方法１を培地中の酸性多糖の測定する場合や塩化物イオン濃度が高い試料（例えば塩化物イオン濃度が１２０ｍＭ以上の試料）に適用する場合には工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度が１００ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことがより好ましい。
【００４６】
上記共存液中の無機塩の濃度は、導電率を測定することにより調べることができる。水溶液中においては、イオン輸送によって電流が流れることから、共存液中に存在するイオンの量が増加すれば、高い導電率を有することとなる。また、導電率を測定するには導電率計（例えば、カスタニーＬＡＢ導電率計ＤＳ−１２、堀場製作所製）を用いて簡便に測定できる。
【００４７】
また、上記塩化物イオン濃度を調整する方法は特に限定されず、例えば蒸留水等の希釈液により希釈することによって調整することができる。例えば、上述したように一般的な培地において塩化物イオン濃度は１５０ｍＭ程度であることから、培地中の酸性多糖を測定する際には、分析の前に蒸留水などにより５倍以上に希釈することにより、正確な測定が可能になる。
【００４８】
上記希釈液としては、本発明方法１における吸光度の測定に影響を及ぼすものでない限り特に限定されない。この希釈液としては、蒸留水や上述した緩衝液等を用いることができる。
【００４９】
また本発明方法１では、酸性多糖を含有する試料がペプトンを含む試料であってもよく、その場合は測定時における共存液中のペプトン濃度が０．２％（w/v）以下になるように調整する工程をさらに含むことがより好ましい。
【００５０】
また本発明方法１における「ペプトン」とは、牛乳カゼイン、獣肉、大豆タンパク質等をペプシン、トリプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素、或いは酸で部分的に加水分解して乾燥した粉末であり、微生物の栄養源として培地に添加されているものである。
【００５１】
上記ペプトン濃度は、上記塩化物イオン濃度を調整する方法と同様に、希釈液により希釈することにより調整することができる。
【００５２】
また実施例からもわかるように、ピーナッツ及び大豆由来のペプトンに関してはその濃度が０．２％（w/v）以下においても測定に影響を及ぼすため、本発明方法１を用いる際にはこのような物質を含む培地を用いず、また培地に添加しないことが好ましい。
【００５３】
本発明方法１ではペプトンや塩の濃度が低ければ、酸性多糖を含む試料が中性糖など不純物を含んでいてもそれらに影響されることなく酸性多糖を定量することができる。従って試料中の酸性多糖は、必ずしも精製されている必要がない。
【００５４】
また、本発明方法１の工程１及び工程２を少なくとも含む工程は、これ以外の工程をさらに含んでいても良い。例えば、上記ペプトンを除去する工程や脱塩カラム等を用いて前処理する工程を追加しても良い。
【００５５】
上記ペプトンを除去する方法としてはセントリコン（ミリポア社製）等の遠心限外ろ過ユニットを用いて高分子を回収し、再溶解する等の前処理を行えばよい。
【００５６】
また、本発明方法１において酸性多糖を含有する試料中に含まれる酸性多糖は、先に例示したものが好ましいが、中でもＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれるいずれか１種類の酸性多糖であることが好ましい。
【００５７】
また本発明方法１は、２種類以上の酸性多糖を含有する試料である場合、測定対象とする酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素を共存させる工程を、工程１の前にさらに含むことにより、所望の酸性多糖を定量することができる。
【００５８】
試料中に含まれる酸性多糖としては、ＨＡ、ＧＥＬ、ＸＮＴ、ＡＬＧ、Ｋ５Ｐ及びＫ４Ｐからなる群から選ばれる２種類以上の酸性多糖であることが好ましく、測定対象とする酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素としては、ヒアルロニダーゼ、スフィンガナーゼキサンタンリアーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヘパリチナーゼ又はコンドロイチナーゼからなる群から選ばれる、１種類以上の分解酵素であることが好ましい。
【００５９】
ここで、ＨＡはヒアルロニダーゼ、ＧＥＬはスフィンガナーゼ、ＸＮＴはキサンタンリアーゼ、ＡＬＧはアルギン酸リアーゼ、Ｋ５Ｐはペパリチナーゼ、Ｋ４Ｐはコンドロイチナーゼを用いることによりそれぞれ分解することができる。
【００６０】
本発明方法１で用いる「ヒアルロニダーゼ」、「スフィンガナーゼ」、「キサンタンリアーゼ」、「アルギン酸リアーゼ」、「ヘパリチナーゼ」及び「コンドロイチナーゼ」はそれぞれの酸性多糖を分解する酵素全てを包含する意味で用いられる。例えば「ヘパリチナーゼ」はヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼII等のＫ５Ｐを分解する酵素を全て包含する意味で用いられる。
【００６１】
またそれぞれの分解酵素は測定対象となる酸性多糖を分解せずかつ測定しない酸性多糖を分解する酵素であれば特に限定されず、試料中に含まれる酸性多糖の種類に応じて個別に設定することができる。
【００６２】
２種類の酸性多糖を同時に含有する試料の具体的な測定方法としては、例えばＨＡとＫ５Ｐを同時に含有する試料中のＨＡを測定する場合、該試料にヘパリチナーゼ（ヘパリチナーゼはＨＡを分解しない）を添加処理した後、さらにステインズ・オールを共存させ、吸光度を測定することにより定量することが例示できる。
【００６３】
また将来、組み換え技術によって作り出されたバクテリアが、２種類以上の酸性多糖を同時に産生した場合も、それらの分解酵素と組み合わせることによって、それら酸性多糖をそれぞれ定量することができる。
【００６４】
また工程２における共存液を測定する際の好ましい吸収波長の範囲は、共存させる酸性多糖の種類により異なり、各酸性多糖−ステインズ・オール共存液の極大吸収波長における吸光度の少なくとも８０％程度の吸光度を持つ範囲で測定することが好ましく、極大吸収波長であることが最も好ましい。
【００６５】
具体的には、試料中の酸性多糖がＨＡ又はＧＥＬである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が６３０〜６７０ｎｍであることが好ましく、６４０〜６６０ｎｍであることがより好ましく、６５０ｎｍであることが極めて好ましい。また、試料中の酸性多糖がＸＮＴ又はＫ５Ｐである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が６１０〜６３０ｎｍであることが好ましく、６１５〜６２５ｎｍであることがより好ましく、６２０ｎｍであることが極めて好ましい。また、試料中の酸性多糖がＡＬＧ又はＸＮＴである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が４７０〜４９０ｎｍであることが好ましく、４７５〜４８５ｎｍであることがより好ましく、４８０ｎｍであることが極めて好ましい。また試料中の酸性多糖がＫ４Ｐである場合、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０〜６５０ｎｍであることが好ましく、６２５〜６４０ｎｍであることがより好ましく、６３０ｎｍであることが極めて好ましい。
【００６６】
また、後述する実施例からわかるようにｐＨが３以下の試料に関しては、共存液の吸光度が劇的に低下することから、測定対象となる共存液のｐＨが３以下である場合は、工程２における測定対象となる共存液をｐＨ４〜１３となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、ｐＨを４〜８となるように調整する工程をさらに含むことが好ましく、ｐＨ５〜８となるように調整する工程をさらに含むことがさらに好ましい。
＜２＞本発明方法２
本発明方法２は、酸性多糖を産生するバクテリアの醗酵プロセスをモニタリングする方法であって、
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する工程、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地とステインズ・オールを共存させる工程、
工程Ｃ：工程Ｂにより得られた共存液の吸光度を測定する工程、
を少なくとも含む方法である。
【００６７】
本発明方法２における「発酵プロセスのモニタリング」とは、発酵プロセスの進行の有無又は進行の程度の測定をすることやバクテリアの酸性多糖産生活性を測定することを言う。またマイクロリーダー等を用いることにより複数の検体に関しても容易に測定がすることができる。
【００６８】
また、本発明方法２は、発酵プロセスをモニタリングすることにより、酸性多糖を産生するバクテリアのスクリーニングに用いることができる。
【００６９】
また本発明方法２におけるモニタリングの方法についても特に限定されることはなく、培養後の任意の時間の１点について吸光度を測定することによりモニタリングしてもよく、２点以上の任意の時間における吸光度を測定することによりモニタリングすることもできる。
【００７０】
本発明方法２の工程Ｂにおける共存方法としては、培養後の精製等の工程を考慮すると各定量時に培地の一部をステインズ・オールと共存させ、吸収波長を測定し、その吸光度の変化を測定することが好ましい。
【００７１】
また本発明方法２をスクリーニングの目的として用いる場合は、培地にステインズ・オールを添加した後培養を行い、その培養時間に対する吸光度の変化を測定することもできる。
【００７２】
上記酸性多糖を産生するバクテリアとしては、具体的には本発明方法１で例示されたバクテリアを例示することができるが、ＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、又はＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアであることが好ましく、その中でも特にＨＡ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアがストレプトコッカス属バクテリア由来のＨＡ合成酵素を保持したバクテリアであり、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ５株由来のＮ−アセチルヘパロサン合成酵素を保持したバクテリアであり、ＣＨ骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ４株由来のＣＨ合成酵素を保持したバクテリアであることがより好ましい。
【００７３】
上記ＨＡ骨格を有する酸性多糖とは（ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４）ｎ構造を持つものであり、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖とは（ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−４）ｎ構造を持つものであり、ＣＨ骨格を有する酸性多糖とは（ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４）ｎ構造を持つものをいう。（ここで、「β１−３」はβ１−３グリコシド結合を、「β１−４」はβ１−４グリコシド結合を、「α１−４」はα１−４グリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
本発明方法２における「ステインズ・オール」、「酸性多糖」及び「共存」等の意義並びに「共存」等の好ましい「ｐＨ」、「温度」、「ステインズ・オールの濃度」及び「工程２における好ましい測定波長」等の条件に関しては本発明方法１と同じである。
【００７４】
＜３＞本発明キット
本発明キットは、構成成分としてステインズ・オールを少なくとも含むことを特徴とする、前記の本発明方法１に記載の方法により酸性多糖を測定するキットである。
【００７５】
本発明キットを用いることにより、本発明方法１及び本発明方法２を容易に実施することができる。
【００７６】
本発明キットの様態は、上記本発明方法１及び２を簡便に実施するためのキットであれば特に限定されず、さらに、共存液を希釈するための希釈液、検量線を作成の用の標準となる既知濃度のＧＡＧｓ等の酸性多糖標準品、マイクロタイタープレート等を構成成分として加えることができる。
【００７７】
また本発明キットは、上記酸性多糖の標準品の代わりに検量線が書かれた表をキットの構成として含むことができ、またその両方を含むこともできる。キットの具体的な構成としては実施例を参照されたい。
【００７８】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法１及び２に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００７９】
本発明キットにおける「ステインズ・オール」、「酸性多糖」等の用語は本発明方法１と同様の意味で用いられ、本発明キットを使用する際の「共存」等の意義並びに「共存」等の好ましい「ｐＨ」、「温度」、「ステインズ・オールの濃度」及び「工程２における好ましい測定波長」等の条件に関しても本発明方法１と同様である。
【実施例】
【００８０】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）材料
以下の実施例においては下記の材料を使用した。
【００８１】
LURIA BROTH BASE nutrient medium (LB 培地)、BactoTM Tryptic Soy Broth、BactoTM ペプトン、カザミノ酸及び酵母エキスはディフコ社から購入した。トウモロコシ、綿実、小麦の麦芽、ピーナッツ及び大豆から調製した植物ペプトン類はオリエンタル酵母社から購入した。セチトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡ）、メタノール、フェノール、アスコルビン酸、CaCl2、１，４−ジオキサン、寒天及びグルコースは和光純薬工業社より購入した。ＨＡ及びＡＬＧはナカライテクス社から購入した、ステインズ・オール（１−エチル−２−［３−（３−エチルナフト−［１，２−ｄ］チアゾリン−２インデン）−２−メチルプロペニル］ナフト−［１，２−ｄ］チアゾリウムブロマイド）及びＧＥＬはシグマ社から購入した。ＸＮＴはピノア社から購入した。
（２）使用した微生物
ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp. zooepidamicus） は医科学研究所（東京大学）から購入した。Ｋ４株由来の大腸菌（Escherichia coli O5:K4:H4）はザ・インターナショナル・エスケリキア・アンド・クレビシエラ・センター（ＷＨＯ）、スタテンス・セーラム・インスティチュート（The International Escherichia and Klebsiella Centre(WHO),Statens Serum Institut）から、Ｋ５株由来の大腸菌（E. coli 010:K5:H4 (ATCC No.23506)） はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から購入した。
（３）培養条件
バクテリアはLBプレートにて生育させた。発酵には3LのＣＹＧ培地(カザミノ酸;2.0％（w/v）、酵母エキス;0.5％（w/v）、グルコース;0.2 ％（w/v）、アデカノール LG-109RR;100ppm、ｐＨ7.2)を含有する５Ｌのファーメンター(サクラ精機社製)を用いた。また接種量、温度、通気量、攪拌速度の条件はそれぞれ、１％（w/v）、３７℃、１vvm、５００rpmとした。
（４）Ｋ５多糖類（Ｋ５Ｐ）とＫ４多糖類（Ｋ４Ｐ）の調製
Ｋ５Ｐはヴァンらの方法に従って調製した（非特許文献８）。具体的には、培養物から菌体を取り除くために、大腸菌Ｋ５株の２４時間齢培養物を４℃、8,000rpmで２０分間遠心分離した。得られた上澄み液にＣＴＡを終濃度が0.5％（v/v）になるように添加した。 遠心分離法で沈殿物を回収した後、１ＭのCaCl2（５０ml）に溶解し、７５mlのエタノールと混合しＫ５Ｐを沈殿させた。次いで遠心分離によって沈殿物を回収し、蒸留水(５０ml)に溶解した。 溶液に含まれるタンパク質をフェノール抽出により除去し、Ｋ５Ｐをエタノール沈殿させ回収した。これらのステップを５回繰り返した後、得られた沈殿物を蒸留水に溶解し、それを凍結乾燥した。
【００８２】
Ｋ４Ｐはマンゾニらの方法に従って調製した（非特許文献９）。具体的には、培養物から菌体を取り除くために、大腸菌Ｋ４株の16時間齢培養物を４℃、8,000rpmで２０分間遠心分離した。スパイラルカートリッジS1Y10(分子量遮断;10kDa、ミリポア社製)を用いた限外濃縮法によって上澄み液を濃縮した。その後４倍量のエタノールと濃縮液を混合し、Ｋ４Ｐの沈殿を生成させた。得られた酸性多糖は真菌由来のプロテアーゼを用いた酵素消化とエタノール分画を用いて精製した後、凍結乾燥した。
【００８３】
これらの酸性多糖の純度は、アライらの方法に従ってGPC-HPLC分析にて評価した（非特許文献１０）。各酸性多糖の純度は90%以上であった（図1）。
（５）試薬の調製
試験に供した酸性多糖（Ｋ５Ｐ、Ｋ４Ｐ、ＨＡ、ＡＬＧ、ＧＥＬ及びＸＮＴ）は終濃度が１mg/mlになるように蒸留水に溶解し、標準液とした。 少量ずつ分注した後、それらを−２０℃で保存した。１ｍＭの酢酸と0.5ｍＭのアスコルビン酸を含有する1,4-ジオキサンの５０％（v/v）、水溶液にステインズ・オールを終濃度が1ｍＭになるように溶解し、ステインズ・オール溶液とした。なお、当該溶液は４℃下、暗所にて２週間は安定だった。
実施例１：酸性多糖の定量
各酸性多糖の分析はホーマーらの方法に従い実施した（非特許文献１１）。上記調製により得られた各試料溶液５０μｌをそれぞれ試験管に移し、４５０μｌのステインズ・オール溶液と５００μｌの蒸留水と順次、添加した。その後、該共存液を1.5 ｍｌのガラスセルに移し、分光器UV-160A(島津社製)を用いて酸性多糖毎に適切な波長で吸光度を測定した。
【００８４】
すべての分析は３回実施し、平均値を記した。 マイクロアッセイでは、１７μlの試料溶液を96穴マイクロプレートに移し、１２５μlのステインズ・オール溶液と１５０μlの蒸留水と順次、添加した後、マイクロプレートリーダーSK601（生化学工業社製）を用いて各酸性多糖に適切な波長で共存液の吸光度を測定した。
【００８５】
染料溶液に各酸性多糖を５μｇずつ添加した際に生じたスペクトル変化を図２〜４に示した。ＨＡを添加することによって、６５０ｎｍに新しい吸収ピークが出現した（図２）。
一方、Ｋ４Ｐ又はＫ５Ｐとステインズ・オールとの共存液については明確なピークは見られなかったが、６１０〜６４０ｎｍの範囲に吸収の肩が出現した。ステインズ・オール溶液を参照として測定した場合、Ｋ４Ｐ及びＫ５Ｐのステインズ・オール共存液のスペクトルはそれぞれ、６３０ｎｍ、６２０ｎｍで極大吸収を示した（図３）。同様に、ウロン酸含有多糖であるＡＬＧ、ＧＥＬ及びＸＮＴもステインズ・オールとの複合体を形成し、それらの極大吸収はそれぞれ４８０、６５０、６２０ｎｍであることが明らかになった（図４）。また、ＸＮＴのステインズ・オール共存液においては４８０ｎｍにも極大吸収が出現した。
【００８６】
これらの測定の結果よりＨＡ及びＧＥＬの最適な測定波長は６５０ｎｍであり、Ｋ５Ｐは６２０ｎｍ、Ｋ４Ｐは６３０ｎｍ、ＡＬＧでは４８０ｎｍ、ＸＮＴでは６２０又は４８０ｎｍであることを示した。また、実施例２以降の酸性多糖−ステインズ・オール共存液の吸光度の測定はそれぞれ上記の最適な波長にて行うこととした。
【００８７】
また、酸性多糖−ステインズ・オール複合体は室温で少なくとも６０分間は安定であることを確認した。
実施例２：測定範囲の検討
本発明方法１で測定できる酸性多糖の濃度範囲を決定するために、様々な濃度に調製した酸性多糖溶液をステインズ・オール溶液に添加し、実施例１で得られた波長で吸光度を測定した。本発明方法１を用いた各酸性多糖の検量線を図５に示した。ＨＡに関しては、６５０ｎｍで測定した吸光度と濃度との間に正の相関が観察され、その直線性は100μg/mlまで維持されていた。一方、他の酸性多糖の場合にも吸光度と濃度の間に正の相関が観察され、検量線の直線性は250μg/mlまで維持されていた。また、これらの酸性多糖類の分析範囲の下限は2μg/mlであった。また当該方法は、上述した波長の固定波長フィルタが装備された96穴プレートリーダー分光光度計を用いたＢＧＡＧｓ等の酸性多糖のマイクロアッセイにおいても同様の結果を観察した。ＡＬＧ（r2値：0.995）を除き、試験したすべての酸性多糖の定量分析における検量線のr2値は0.998以上だった。比較のために、ＧＡＧｓの定量法であるカルバゾール−硫酸法の検量線を標準物質であるＤ−グルクロノラクトンを用いて作成したが、その直線性は100μg/mlまで維持されていた。どちらの測定方法でも測定範囲は同様な結果であったが、従来の方法（約１時間）に比べて、短時間（１５分以下）で測定できる等、ステインズ・オール法は従来法に比べはるかに優れていた。また、この分析方法は従来の方法の干渉物質であるグルコースなど中性糖の存在下においても影響を受けず、マイクロアッセイを採用することによって多検体の同時測定も可能である。
実施例３：酸性多糖−ステインズ・オール複合体形成に及ぼすｐＨ及び塩の影響
異なるｐＨにおけるＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度の相対的な強度の変化について調べるために、ＨＡ及びＫ５Ｐの水溶液を、２０ ｍＭ マッキルバインバッファー（ｐＨ２．２４−ｐＨ８．２４）、２０ｍＭ ホウ酸バッファー（ｐＨ８．１８−ｐＨ１０．０５）及び１００ｍＭのＮａＯＨ溶液（ｐＨ１３．４）を用いて調製し、実施例１に記載された方法でステインズ・オール共存液の吸光度を測定した。その結果を図６に示す。分析におけるＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度はｐＨ４からｐＨ８までの範囲ではｐＨに依存せず、ほぼ一定の値を示した。またｐＨ９付近において吸光度の減少が多少見られたがｐＨ１３程度までは問題なく測定することが可能であった。しかし、ｐＨ３の条件下では、これらの酸性多糖−ステインズ・オール共存液の吸光度が劇的に減少した。ｐＨ３以下の条件ではカルボキシル基のイオン化が抑制されるために、酸性多糖とステインズ・オールとの複合体の形成が阻害されると考えられる。従って、当該方法による分析の至適ｐＨはｐＨ４〜８の範囲であることがわかった。また特別なバクテリアを除いて、多くのバクテリアが生育できるｐＨの範囲はｐＨ５〜８までであり、ＢＧＡＧｓの生産菌である大腸菌と連鎖状球菌もｐＨの範囲がｐＨ５〜８でよい成長を示した。これらの結果は、細菌培養液のｐＨについては特に前処理を行わなくても、当該分析法によって細菌培養液中のＢＧＡＧｓの濃度が測定できることを示唆している。
【００８８】
次に、BaCl2、CaCl2、MgCl2、MnCl2及びNaClなどの塩類を用いて、各々のカチオンの存在下における複合体の吸光度をそれらの非存在下における値と比較した。NaイオンとMnイオンを除き、１０ ｍＭの塩の存在の下でＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度は減少した（表1）。
【００８９】
【表１】
【００９０】
特に、Pbイオン又はBaイオンの共存下においては酸性多糖−ステインズ・オール共存液の吸光度が著しく低下した。しかし、上記イオンの濃度を１ｍＭまで減少させたところ、この干渉効果は大幅に低減した。また、Ｋ５Ｐと酢酸ナトリウムを用いた試験において、Ｎａイオンの濃度が２５０ｍＭに達しても、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度の減少はほとんど見られなかったことからＮａイオンの影響は無視できるものと考えられる。（図７）。またNaCl及びNa2HPO4以外の無機塩類に関しては、一般的な培地の中の濃度は１０ｍＭ未満であることから、細菌培養液中のＢＧＡＧｓ等の酸性多糖の濃度を測定する際にカチオンの影響は無視できる。培地中のリン酸イオンと塩化物イオンの濃度は１０ｍＭよりかなり高いことから、Ｋ５Ｐをモデル化合物として、分析の精度に対するこれらアニオンの影響を評価した。上記酢酸ナトリウムを用いた実験で２５０ｍＭのＮａイオンが分析に対して影響を及ぼさないことがわかっているので、NaClとNaH2PO4を使ってＫ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度への塩化物イオンとリン酸イオンの効果を比較した。アニオンの濃度が３０ｍＭを超えない限り、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール複合体の形成に作用することなく吸光度の変化はほとんど見られなかった（図８）。しかし、アニオンの濃度が３０ｍＭを超えるとその濃度に依存して、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度は徐々に低下した。特に、塩化物イオンの濃度が１００ｍＭを越えた時に、Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度は大幅に減少した。培地中のNaClの濃度は導電率の測定結果から算出できるが、BactoTM Tryptic Soy Broth（ＴＳＢ）など一般的な培地に含まれるNaClはおよそ１５０ｍＭと推察される。従って、培地中の酸性多糖の濃度を定量する際、NaClの干渉を避けるため、培養サンプルを分析の前に蒸留水によって少なくとも5倍に希釈するべきである。
実施例４：吸光度に対するステインズ・オール溶液の濃度依存性
ステインズ・オール溶液の最適な濃度を調べるため、先ず１００μg/mlのＨＡ又はＫ５Ｐに各濃度のステインズ・オール溶液（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125及び0.156ｍＭ）を添加した共存液のスペクトルを比較した。ネガティブコントロールとしては蒸留水を用いた。共存液は各酸性多糖５０μｌにステインズ・オール溶液４５０μｌ、蒸留水５００μｌを順次添加することにより得た。その結果、ステインズ・オール溶液の濃度が2.5ｍＭ以上では、試料が蒸留水である場合でも、それぞれの最適な波長において吸光度が上昇した。また、ステインズ・オール溶液の濃度が0.4ｍＭ以下の条件では、ほとんど発色せず、蒸留水と比較したものとほとんど変わらなかった。次に、ステインズ・オール溶液の濃度を0.3〜1.5ｍＭの範囲について詳細に検討した。その結果、ＨＡでは、0.5〜0.6ｍＭの濃度において高い吸光度を示した。一方、Ｋ５Ｐについては、0.5〜1.5ｍＭの範囲で吸光度が一定であった（図８）。
実施例５：培養液中におけるＢＧＡＧｓ量の測定
次に、培地中に含まれる他の構成成分が与える本発明方法の分析精度への影響を調べた。
【００９１】
まず、ペプトン、グルコース及び無機塩類から構成されるＴＳＢとステインズ・オールの共存液のスペクトル解析を実施した。ＴＳＢとステインズ・オールとを共存させたとき、ＨＡ−ステインズ・オール共存液と類似したスペクトルが観察された（図９）。しかし、ＴＳＢを蒸留水で１０倍に希釈することにより、その影響は無視できることもわかった。前記実施例に記載したように培地中のグルコースや無機塩類が本測定法に影響しないので、この結果はステインズ・オールがＴＳＢ中に含まれるペプトンと複合体を形成することによって、波長６１０〜６５０ｎｍに新たな吸収を持つことを示唆している。そこで、他のペプトンでも同様の複合体が形成されるかどうかを評価した。
【００９２】
ＴＳＢに含まれるペプトン含量は２％（w/v）であるので、同様の濃度で比較した。その結果、比較したすべてのペプトンで同様のスペクトルを観察した。次に、１０倍希釈液を用いてスペクトルの変化を比較した。図１０に６１０ｎｍ、６２０ｎｍ、６３０ｎｍ及び６５０ｎｍにおけるペプトン−ステインズ・オール共存液の吸光度の結果を示した。ＴＳＢにおける主要なペプトンであるBactoTMペプトンは、６５０ｎｍ又は６３０ｎｍに弱い吸収が観察されたが、トウモロコシ、綿実及び麦芽由来の植物ペプトン並びにカザミノ酸は酸性多糖−ステインズ・オール複合体と競合する波長の吸収を示さなかった。一方、ピーナッツ又は大豆由来のペプトンの場合、１０倍希釈液においてもなお高い吸収が観察された。特に、６３０ｎｍの吸光度はＫ４Ｐ濃度に換算すると２０〜３０μg/mlに匹敵した。これらの結果は、ある種のペプトンで例外が認められるが、ペプトン濃度が0.2％（w/v）以下であれば、一般的な細菌培養用ペプトンが本発明分析方法に影響しないことを示した。次に、本検討の発酵実験に使用したＣＹＧ培地を用いた確認試験を実施した。ＣＹＧ培地には２％（w/v）のカザミノ酸が含まれているので、１０倍に希釈したＣＹＧ培地を用いて調製したＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液とＢＧＡＧｓ水溶液を用いたＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度を比較した。１０倍に希釈したＣＹＧ培地を用いて調製したＢＧＡＧｓ溶液の結果はＢＧＡＧｓ水溶液の結果と極めてよく一致した。これらの結果から、今回の発酵試験では培養液の希釈率を１０倍に設定した。従って、本方法の分析範囲の下限は２μg/mlであるので、培養液中のＢＧＡＧｓ等、酸性多糖を測定する際の濃度の下限は２０μg/mlであることを確認した。
【００９３】
次に本発明方法の応用として発酵プロセスの経時変化について検討した。図１１〜１２はそれぞれＣＹＧ培地を用いた時のＢＧＡＧｓ（順にＨＡ、Ｋ５Ｐ）の発酵プロセスの経時変化を示したものである。対数増殖期には、すべてのＢＧＡＧｓはほとんど生産されなかったが、減衰増殖期から定常期にかけてそれらは急速に生産された。細菌培養物におけるＫ５Ｐ及びＨＡの最大の生産性はそれぞれ、0.401、及び0.501g/Lであった。次いで、大腸菌Ｋ５株の２４時間フラスコ培養物を用いて、ステインズ・オール法とカルバゾール法によってＫ５Ｐ含量を測定した。異なる３バッチにおけるＫ５Ｐ含量を両測定方法で見積もった結果を表２に示した。両方の分析結果は非常によく合致していた。これらの結果は、この分析方法が、ＢＧＡＧｓ等、酸性多糖の発酵プロセスをモニタリングするための強力な分析ツールとなりうることを示唆している。
【００９４】
【表２】
【００９５】
次に、複数の酸性多糖が共存している試料の測定を測定対象以外の酸性多糖を分解する酵素を用いて測定した場合影響が無いかどうかを調べるため、下記のサンプル１〜６の共存液のスペクトルを測定した。
サンプル１：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、蒸留水 １８０μｌ
サンプル２：1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、蒸留水 １８０μｌ
サンプル３：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、蒸留水 １６０μｌ
サンプル４：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、バッファー１ １００μｌ、2 units/ml コンドロイチナーゼＡＢＣ ２０μｌ、蒸留水 ４０μｌ
サンプル５：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、バッファー２ １００μｌ、0.1 units/ml ヘパリチナーゼ ２０μｌ、蒸留水 ４０μｌ
サンプル６：1 mg/ml ＨＡ ２０μｌ、1 mg/ml Ｋ５Ｐ ２０μｌ、バッファー１ １００μｌ、2 units/ml コンドロイチナーゼＡＢＣ２０μｌ、0.1 units/ml ヘパリチナーゼ ２０μｌ、蒸留水 ２０μｌ
コントロール：バッファー１ １００μｌ、蒸留水 １００μｌ
上記バッファー１は５０ｍＭ Tris-HCl，５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ）（ｐＨ６．２）を用い、バッファー２は１００ｍＭ ＡｃＮａ，１０ｍＭ 酢酸カルシウム（（ＡｃＯ）２Ｃａ） （ｐＨ７．０）を用いた。サンプル４〜６については３７℃で３時間酵素反応をさせた後、熱失活したものを測定サンプルとした。それぞれのサンプル５０μｌに、１ｍＭステインズ・オール溶液４５０μｌ及び蒸留水５００μｌを順次添加し、それぞれ最適な波長にて測定した。測定スペクトルからコントロールのスペクトルを差し引いた結果を図１３に示す。図に示すように測定波長が重なってしまうような酸性多糖が共存する試料においても、測定対象以外の酸性多糖を予め酵素で分解することにより問題なく測定できることがわかる。
【００９６】
これらの結果により本発明方法は標準液だけでなく様々な不純物が含まれる培養液等におけるＢＧＡＧｓの分析において高い再現性と精度を持つことがわかった。また、この分析方法は従来の比色分析法と比べ簡単であり、マイクロリーダー等を用いることによって多検体にも容易に対応できることがわかった。
実施例６：カラムクロマトグラフィー法によるＢＧＡＧｓ精製への応用
Ｋ４Ｐ精製用クロマトグラフィー担体として、陰イオン交換体担体であるＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２（ワットマン社製）を用いた。
【００９７】
２倍量の蒸留水で希釈した遠心上清液をＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２を詰めた５０ｍＬ用量のラジアルフローカラム（セプラジェン社製）にアプライした。カラムを１００ｍＭ食塩水（２５０ｍＬ）で洗浄した後、３００ｍＭ食塩水（２５０ｍＬ）と５００ｍＭ食塩水（１５０ｍＬ）でカラムを溶出した。溶出液は１５ｍＬずつ分画した。
【００９８】
食塩濃度を５０ｍＭ以下に下げるために、各分画は蒸留水で１０倍に希釈した。ステインズオール分析法を用いてＫ４Ｐの分析を行った６３０ｎｍの固定波長フィルタが装着された９６穴プレートリーダー分光光度計を用いて測定した結果を図１４に示した。Ｋ４Ｐの溶出カラム用量の１．２倍量の溶出液（３００ｍＭ食塩水）をカラムに通液したところ
より始まり、溶出液量がカラム容量３倍に達したところで終了した。また得られた結果が正しいかどうかを確認するため、ＧＡＧの定量法として既に確立しているカルバゾール法でも測定を行った。カルバゾール法においても同様の結果が得られた。
【００９９】
Ｋ４Ｐを回収するために、Ｋ４Ｐ含有画分を濃縮した後、同量のエタノールと混合した。遠心分離法で回収された沈殿物を蒸留水に再溶解した。脱塩を行うために、当該溶液はコットンセルロース透析膜（Ｃｅｌｌｕ−Ｓｅｐ Ｈ１、分子量カットオフ：１０００、フナコシ社製）を用いて流水中で透析を行った。透析内液を凍結乾燥することによって、淡い象牙色のパウダー５８．６ｍｇを得た。
【０１００】
当該パウダーは、コンドロイチン分解酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）により部分的に分解された。また、リドホルトらの方法（非特許文献１２）により脱フルコトシル化処理を行った試料は、コンドロイチナーゼＡＢＣによって、不飽和二糖であるコンドロΔＤｉ−０Ｓまで完全に分解されたことから、Ｋ４Ｐであることを確認した。
実施例７：本発明キット
以下の構成からなる本発明キットを作成した。
１． ステインズ・オール （１ｍｇ） １本
２． ステインズ・オール溶解液（１ｍＭ酢酸、０．５ｍＭアスコルビン酸、１，４−ジオキサン水溶液を含む） １本
３． マッキルバイン緩衝溶液（ｐＨ７） １本
４． 各種酸性多糖標準液
標準液１（1mg/ml ＨＡ溶液） １本
標準液２（1mg/ml Ｋ５Ｐ溶液） １本
標準液３（1mg/ml Ｋ４Ｐ溶液） １本
標準液４（1mg/ml ＡＬＧ溶液） １本
標準液５（1mg/ml ＧＥＬ溶液） １本
標準液６（1mg/ml ＸＮＴ溶液） １本
５． マイクロタイタープレート １枚
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】調製したＫ４Ｐ及びＫ５ＰをGPC-HPLC分析した結果を示す図である。
【図２】ＨＡを添加した際に生じたスペクトル変化を示す図である。
【図３】Ｋ４Ｐ又はＫ５Ｐを添加した際に生じたスペクトル変化を示す図である。
【図４】ＡＬＧ、ＧＥＬ又はＸＮＴを添加した際に生じたスペクトル変化を示す図である。
【図５】各酸性多糖の検量線を示す図である。
【図６】ＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度のｐＨ依存性を示す図である。
【図７】Ｋ５Ｐ−ステインズ・オール共存液の吸光度のアニオン濃度依存性を示す図である。
【図８】ＢＧＡＧｓ−ステインズ・オール共存液の吸光度のステインズ・オール溶液の濃度依存性を示す図である。
【図９】ＴＳＢ培地中のＨＡ−ステインズ・オール共存液のスペクトルを示す図である。
【図１０】各測定波長におけるペプトンの影響を示す図である。
【図１１】ＨＡ量の経時的変化を示す図である。
【図１２】Ｋ５Ｐ量の経時的変化を示す図である。
【図１３】ＨＡとＫ５Ｐが共存した溶液に各分解酵素を用いた時のスペクトルを示す図である。
【図１４】陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるＫ４Ｐの溶出プロファイルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を少なくとも含む、酸性多糖の定量方法；
工程１：１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる工程、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する工程。
【請求項２】
酸性多糖がバクテリアにより産生されたものである請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
酸性多糖を含有する試料が酸性多糖を含有する培地であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度が３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項５】
酸性多糖を含有する試料の塩化物濃度が１２０ｍＭ以上である請求項４に記載の定量方法。
【請求項６】
酸性多糖を含有する試料がペプトンを含有するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項７】
工程２における測定対象となる共存液中のペプトン濃度が０．２％（w/v）以下となるように調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の定量方法。
【請求項８】
試料中の酸性多糖が、ヒアルロン酸、ジェランガム、キサンタンガム、アルギン酸、大腸菌Ｋ５株により産生された多糖及び大腸菌Ｋ４株により産生された多糖からなる群から選ばれる、いずれか１種類の酸性多糖であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項９】
２種類以上の酸性多糖を含有する試料に、測定対象とする酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素を共存させる工程を、工程１の前にさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１０】
試料中の酸性多糖が、ヒアルロン酸、大腸菌Ｋ４株により産生された多糖、大腸菌Ｋ５株により産生された多糖、キサンタンガム、アルギン酸及びジェランガムからなる群から選ばれる、２種類以上の酸性多糖であることを特徴とする、請求項９に記載の定量方法。
【請求項１１】
酸性多糖を分解する酵素が、ヒアルロニダーゼ、スフィンガナーゼ、キサンタンリアーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼからなる群から選ばれる、１又は２種類以上の分解酵素であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の定量方法。
【請求項１２】
試料中の酸性多糖がヒアルロン酸又はジェランガムであり、工程２において吸光度を測定するときの波長が６３０〜６７０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１３】
試料中の酸性多糖がキサンタンガム又は大腸菌Ｋ５株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６１０〜６３０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれかに１項に記載の定量方法。
【請求項１４】
試料中の酸性多糖がアルギン酸又はキサンタンガムであり、工程２における吸光度を測定するときの波長が４７０〜４９０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１５】
試料中の酸性多糖が大腸菌Ｋ４株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０〜６５０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１６】
試料中の酸性多糖がヒアルロン酸又はジェランガムであり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６５０ｎｍである、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１７】
試料中の酸性多糖がキサンタンガム又は大腸菌Ｋ５株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０ｎｍである、請求項１３に記載の定量方法。
【請求項１８】
試料中の酸性多糖がアルギン酸又はキサンタンガムであり、工程２において吸光度を測定するときの波長が４８０ｎｍである、請求項１４に記載の定量方法。
【請求項１９】
試料中の酸性多糖が大腸菌Ｋ４株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６３０ｎｍである、請求項１５に記載の定量方法。
【請求項２０】
工程２における測定対象となる共存液をｐＨ５〜８になるように調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項２１】
酸性多糖を産生するバクテリアの醗酵プロセスをモニタリングする方法であって、
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する工程、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地と１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドを共存させる工程、
工程Ｃ：工程Ｂにより得られた共存液の吸光度を測定する工程、
を少なくとも含む方法。
【請求項２２】
酸性多糖を産生するバクテリアがヒアルロン酸骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア又はコンドロイチン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒアルロン酸骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアがストレプトコッカス属バクテリア由来のヒアルロン酸合成酵素を保持しており、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ５株由来のＮ−アセチルヘパロサン合成酵素を保持しており、コンドロイチン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチン合成酵素を保持していることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
構成成分として１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドを少なくとも含むことを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により酸性多糖を測定するキット。
【請求項２５】
構成としてさらに酸性多糖標準溶液又は検量線が書かれた表を含むことを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
【請求項１】
下記工程を少なくとも含む、酸性多糖の定量方法；
工程１：１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドと、酸性多糖を含有する試料を溶液中にて共存させる工程、
工程２：工程１で得られた共存液の吸光度を測定する工程。
【請求項２】
酸性多糖がバクテリアにより産生されたものである請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
酸性多糖を含有する試料が酸性多糖を含有する培地であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
工程２における測定対象となる共存液中の塩化物イオン濃度が３０ｍＭ以下となるように調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項５】
酸性多糖を含有する試料の塩化物濃度が１２０ｍＭ以上である請求項４に記載の定量方法。
【請求項６】
酸性多糖を含有する試料がペプトンを含有するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項７】
工程２における測定対象となる共存液中のペプトン濃度が０．２％（w/v）以下となるように調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の定量方法。
【請求項８】
試料中の酸性多糖が、ヒアルロン酸、ジェランガム、キサンタンガム、アルギン酸、大腸菌Ｋ５株により産生された多糖及び大腸菌Ｋ４株により産生された多糖からなる群から選ばれる、いずれか１種類の酸性多糖であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項９】
２種類以上の酸性多糖を含有する試料に、測定対象とする酸性多糖以外の酸性多糖を分解する酵素を共存させる工程を、工程１の前にさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１０】
試料中の酸性多糖が、ヒアルロン酸、大腸菌Ｋ４株により産生された多糖、大腸菌Ｋ５株により産生された多糖、キサンタンガム、アルギン酸及びジェランガムからなる群から選ばれる、２種類以上の酸性多糖であることを特徴とする、請求項９に記載の定量方法。
【請求項１１】
酸性多糖を分解する酵素が、ヒアルロニダーゼ、スフィンガナーゼ、キサンタンリアーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼからなる群から選ばれる、１又は２種類以上の分解酵素であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の定量方法。
【請求項１２】
試料中の酸性多糖がヒアルロン酸又はジェランガムであり、工程２において吸光度を測定するときの波長が６３０〜６７０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１３】
試料中の酸性多糖がキサンタンガム又は大腸菌Ｋ５株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６１０〜６３０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれかに１項に記載の定量方法。
【請求項１４】
試料中の酸性多糖がアルギン酸又はキサンタンガムであり、工程２における吸光度を測定するときの波長が４７０〜４９０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１５】
試料中の酸性多糖が大腸菌Ｋ４株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０〜６５０ｎｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項１６】
試料中の酸性多糖がヒアルロン酸又はジェランガムであり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６５０ｎｍである、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１７】
試料中の酸性多糖がキサンタンガム又は大腸菌Ｋ５株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６２０ｎｍである、請求項１３に記載の定量方法。
【請求項１８】
試料中の酸性多糖がアルギン酸又はキサンタンガムであり、工程２において吸光度を測定するときの波長が４８０ｎｍである、請求項１４に記載の定量方法。
【請求項１９】
試料中の酸性多糖が大腸菌Ｋ４株により産生された多糖であり、工程２における吸光度を測定するときの波長が６３０ｎｍである、請求項１５に記載の定量方法。
【請求項２０】
工程２における測定対象となる共存液をｐＨ５〜８になるように調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項２１】
酸性多糖を産生するバクテリアの醗酵プロセスをモニタリングする方法であって、
工程Ａ：酸性多糖を産生するバクテリアを培養する工程、
工程Ｂ：該バクテリアを培養している培地と１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドを共存させる工程、
工程Ｃ：工程Ｂにより得られた共存液の吸光度を測定する工程、
を少なくとも含む方法。
【請求項２２】
酸性多糖を産生するバクテリアがヒアルロン酸骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリア又はコンドロイチン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒアルロン酸骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアがストレプトコッカス属バクテリア由来のヒアルロン酸合成酵素を保持しており、Ｎ−アセチルヘパロサン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ５株由来のＮ−アセチルヘパロサン合成酵素を保持しており、コンドロイチン骨格を有する酸性多糖を産生するバクテリアが大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチン合成酵素を保持していることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
構成成分として１−エチル−２−[３−(３−エチルナフト−[１、２−ｄ]チアゾリン−２イリデン)−２−メチルプロペニル]ナフト−[１、２−ｄ]チアゾリウムブロマイドを少なくとも含むことを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により酸性多糖を測定するキット。
【請求項２５】
構成としてさらに酸性多糖標準溶液又は検量線が書かれた表を含むことを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−２９５４５０（Ｐ２００８−２９５４５０Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１９１６８（Ｐ２００８−１１９１６８）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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