金属ポルフィリンによるＣ型肝炎感染症の治療
本発明は、金属ポルフィリンによるＣ型肝炎感染症の治療に関する。特に、本発明は、ＮＳ５Ａタンパク質が、ポリタンパク質切断、インターフェロン応答及び細胞内シグナル伝達経路に関与することにより、ＨＣＶのＲＮＡの複製において重要な役割を果たすという発見に基づく。金属ポルフィリン、例えば亜鉛ポルフィリンが、ユビキチン−プロテアソーム分解経路におけるＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の翻訳後のダウンレギュレーションを誘導することが見出されている。すなわち、金属ポルフィリンを使用して、ＮＳ５Ａタンパク質の異化に関するユビキチン−プロテアソーム経路を活性化することができる。その結果、金属ポルフィリンを使用して、ＨＣＶに感染した細胞におけるＨＣＶのウイルス複製を顕著に抑制することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎感染症の治療のための方法及び製剤に関する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫにより与えられたＲＯ１−ＤＫ３８８２５の下で米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる肝臓の血液感染性の感染性疾患である。ＨＣＶは、肝硬変及び肝癌を含む急性肝炎及び慢性肝疾患の主因である。Ｃ型肝炎は、世界で１億８０００万人を超える人々に感染しており、米国で４００万人の人々に感染していると推定されている。Ｃ型肝炎は、米国における肝臓移植の主要な原因であり、米国において１年に約１００００人〜２００００人の死亡はＨＣＶ感染症に起因する。
【０００４】
ＨＣＶは、長さおよそ９．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、フラビウイルス科におけるヘパシウイルス属の唯一の既知のメンバーである。ＨＣＶは、後に構造タンパク質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２）及び非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ）にプロセシングされる、およそ３０１０個のアミノ酸を有する単一のポリタンパク質をコードする。非構造ウイルスタンパク質は、新たなプラス鎖ウイルスゲノムの生成のための複製鋳型として働くマイナス鎖ＲＮＡの合成を開始する。非構造５Ａ（ＮＳ５Ａ）タンパク質は、ＨＣＶタンパク質の重要な構成要素であり、機能がほとんど未知の４４７アミノ酸のリン酸化亜鉛−金属タンパク質である。最近の研究により、ＮＳ５Ａが、ウイルスのＲＮＡ複製に関しては直接的に、並びにウイルスに有利なように宿主細胞環境を調整すること、及びＪＦＨ１に感染した細胞におけるＣ型肝炎ウイルス粒子の集合により間接的に、ＨＣＶの複製において重要な役割を果たすことが示されている。
【０００５】
ＨＣＶ感染症に対する治療の最も一般的な形態は、ペグ化インターフェロンα及び抗ウイルス薬リバビリンの組合せである。治療期間は、遺伝子型にもよるが、一般的に２４週間又は４８週間である。治療の適応は、確定診断されたＣ型肝炎ウイルス感染症及び持続的な肝機能検査異常を有する患者を含む。しかしながらこの治療は、治療された者のうち４６％もの者には持続的なウイルス学的応答をもたらすことができない。該治療は、「インフルエンザ様」症候群から重度の有害事象（貧血、循環器系の事象、及び精神医学的な問題、例えば自殺又は自殺念慮を含む）までにわたる好ましくない副作用も有する。またペグ化インターフェロンα及びリバビリンの組合せに基づく現在の治療は高価であり、一般的に発展途上国の患者には費用がかかりすぎる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＨＣＶ感染症の治療のための新たな治療に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、感染した細胞におけるＮＳ５Ａ細胞のレベルを低減させることによってＨＣＶ感染症に罹患している細胞又は哺乳動物を治療する方法及び製剤を提供することにより、上述の必要性の少なくとも幾つかを満たす。ＮＳ５Ａタンパク質レベルの低減は、本発明に従って、金属ポルフィリンを用いてＣ型肝炎感染症を治療することにより達成される。特に、本発明は、ＮＳ５Ａタンパク質が、ポリタンパク質切断、インターフェロン応答及び細胞内シグナル伝達経路に関与することによりＨＣＶのＲＮＡ複製において主要な役割を果たすという発見に基づく。金属ポルフィリン、例えば亜鉛ポルフィリンが、ユビキチン−プロテアソーム分解経路においてＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の翻訳後のダウンレギュレーションを誘導することが見出されている。すなわち、金属ポルフィリンを使用して、ＮＳ５Ａタンパク質異化に関するユビキチン−プロテアソーム経路を活性化することができる。結果として、金属ポルフィリンを使用して、ＨＣＶに感染した細胞におけるＨＣＶのウイルス複製を顕著に抑制することができる。
【０００８】
本発明では、金属ポルフィリンが、約１９．８時間から約１．２時間までＮＳ５Ａタンパク質の半減期を減少させること、及びＮＳ５Ａのポリユビキチン化を顕著に誘導することにより、ＮＳ５Ａタンパク質の安定性を低減させることが見出されている。結果として、ＨＣＶのＲＮＡ複製を顕著に低減させることができる。ユビキチン（Ｕｂ）は初めに、８．５ｋＤの推定分子量を有し、７６アミノ酸から構成される、真核生物細胞において高度に保存された低分子タンパク質として同定された。ユビキチン−プロテアソーム分解経路は、多くの細胞プロセス、例えば細胞周期、ＤＮＡ修復、胚発生、転写及びアポトーシスの制御における重要な制御システムとして一般に認められている。ユビキチン−プロテアソーム経路では、タンパク質基質は初めに、複数のユビキチン分子との共有結合により分解のために標識され（ポリユビキチン化）、その後２６Ｓプロテアソーム（２０００ｋＤａのＡＴＰ依存性タンパク質分解複合体）により加水分解される。したがって、ＮＳ５Ａタンパク質のポリユビキチン化の誘導は、ＨＣＶのＲＮＡ複製の低減をもたらし得る。金属ポルフィリンを使用して、ＨＣＶタンパク質を安定に発現するヒトヘパトーマ細胞においてＮＳ５Ａタンパク質レベルを用量依存的にダウンレギュレートすることができることがさらに見出されている。
【０００９】
１つの好ましい実施形態では、ＨＣＶ感染症を治療する方法は、亜鉛ポルフィリン、例えば亜鉛メソポルフィリン（ＺｎＭＰ）又は亜鉛プロトポルフィリンで、感染した細胞を処理する工程を含む。ＺｎＭＰ及びＺｎＰＰの両方が、ＮＳ５Ａのポリユビキチン化を誘導し、抗ウイルス活性を示すことが見出されている。亜鉛ポルフィリンは、概して無傷肝細胞によって容易に取り込まれるため、ＨＣＶ感染症の治療において特に有用であることが見出されている。
【００１０】
１つの実施形態では、本発明は、ＨＣＶ感染症の治療のための製剤にも関する。１つの特定の実施の形態では、本発明は、亜鉛ポルフィリンとアルブミンとを含む製剤を提供する。亜鉛ポルフィリンは、アルブミン複合体として投与された場合、非毒性であり、肝臓及び脾臓により優先的に取り込まれる。
【００１１】
さらなる１つの実施形態では、金属ポルフィリンを他の抗ウイルス治療薬と組み合わせて使用して、相加効果又は相乗効果をもたらすことができることが発見されている。例えば、本発明による製剤は、金属ポルフィリンと１つ以上のインターフェロン、例えばα−インターフェロン、β−インターフェロン及び／又はγ−インターフェロンとの組合せを含み得る。
【００１２】
したがって、本発明は、ＨＣＶ感染症の治療のための方法及び製剤を提供する。
【００１３】
このように本発明を包括的な用語で説明したが、添付の図面（必ずしも正確な縮尺で描かれていない）を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１Ｂ】Ｃｏｎ１細胞におけるＮＳ５Ａに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１Ｃ】ＣＮＳ３細胞におけるコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１Ｄ】ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図２Ａ】ＤＭＳＯ、メソポルフィリン及び塩化亜鉛と比較して、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図２Ｂ】スズメソポルフィリンと比較して、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図３】ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛キレート剤Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＥＰＮ）の効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図４Ａ】亜鉛メソポルフィリンで処理した肝細胞においてＮＳ５Ａタンパク質のおおよその半減期を決定するための、シクロヘキシミド［ＣＨＸ］（タンパク質合成の阻害剤）の存在下におけるＮＳ５Ａのタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロットである。
【図４Ｂ】パネルＡにおけるバンドの強度を示す棒グラフである。
【図４Ｃ】ＮＳ５Ａタンパク質の半減期に対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すグラフである。
【図５Ａ】ＺｎＭＰ、及び種々の濃度のエポキソミシン又はＭＧ１３２で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示すウエスタンブロットである。
【図５Ｂ】ＺｎＭＰ、及び種々の濃度のエポキソミシン又はＭＧ１３２で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示す正規化した棒グラフである。
【図５Ｃ】ＺｎＭＰの非存在下でエポキソミシン又はＭＧ１３２で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示すウエスタンブロットである。
【図６Ａ】ＺｎＭＰ処理後、免疫沈降（ＩＰ）の前のＮＳ５Ａの分解を示すウエスタンブロット分析を示す図であり、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａのダウンレギュレーションを示す。
【図６Ｂ】ＺｎＭＰ処理後のＮＳ５Ａのポリユビキチン化を対照と比較して示す、免疫沈降及びイムノブロッティング（ＩＢ）分析を示す図である。
【図６Ｃ】パネルＢにおいてＮＳ５Ａタンパク質が免疫沈降したことを示すイムノブロッティング（ＩＢ）分析を示す図である。
【図７Ａ】Ｃｏｎ１細胞におけるＨＣＶのＲＮＡに対するＺｎＭＰの用量効果を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】Ｃｏｎ１細胞におけるＨＣＶタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図７Ｃ】ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図７Ｄ】ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図８Ａ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示すウエスタンブロット分析を示す図である。
【図８Ｂ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図８Ｃ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における２４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示すウエスタンブロット分析を示す図である。
【図８Ｄ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における２４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図８Ｅ】Ｊ６／ＪＦＨ１のＲＮＡをトランスフェクトしたＨｕｈ−７．５細胞におけるＨＣＶのＲＮＡ複製に対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図８Ｆ】Ｊ６／ＪＦＨ１ ＨＣＶに感染したＨｕｈ−７．５細胞におけるＨＣＶのＲＮＡ複製に対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図９Ａ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対するα−インターフェロンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図９Ｂ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図９Ｃ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対するα−インターフェロン及び亜鉛メソポルフィリンの組合せの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１０】細胞毒性に対するＺｎＭＰの用量効果及び経時効果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明を以下に、全てではないが幾つかの本発明の実施形態を示す添付の図面を参照してより十分に説明する。実際に、これらの発明は多くの様々な形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定するものと解釈すべきではない。むしろこれらの実施形態は、本開示が、適用される法的要件を満たすように提示されるものである。全体を通じて、類似の番号は類似の要素を表す。
【００１６】
本発明は、金属ポルフィリンによりＣ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法に関する。一実施形態では、本発明は、ＨＣＶに感染した細胞を処理する方法、特に金属ポルフィリンにより患者におけるＣ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法に関する。本発明の実施形態は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療のための金属ポルフィリンを含む医薬製剤にも関する。好ましい一実施形態では、本発明は、亜鉛ポルフィリンによりＣ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法に関する。
【００１７】
本発明の発明者らは、金属ポルフィリンを使用して、ＨＣＶ複製を阻害することによりＨＣＶ感染症を治療することができることを発見した。ＮＳ５Ａは、ポリタンパク質切断、インターフェロン応答及び細胞内シグナル伝達経路に関与することによりＨＣＶの複製において重大な役割を果たす。本発明では、金属ポルフィリンによって宿主細胞におけるＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の量を制御することにより、ＨＣＶ複製が低減すると考えられている。理論に拘束されることを望むものではないが、金属ポルフィリンが、ＮＳ５Ａタンパク質のユビキチン−プロテアソーム分解経路を媒介することにより、ＨＣＶに感染した細胞におけるＨＣＶのウイルス複製を抑制すると考えられている。結果として、感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の量を顕著に低減させることにより、ＨＣＶのＲＮＡの複製を低減させることができる。
【００１８】
本発明では、金属ポルフィリンが、約１９．８時間から約１．２時間にＮＳ５Ａタンパク質の半減期を減少させることによりＮＳ５Ａタンパク質の安定性を低減させること、及びＮＳ５Ａのポリユビキチン化を顕著に誘導することが見出されている。結果として、ＨＣＶのＲＮＡの複製を顕著に低減させることができる。ユビキチン（Ｕｂ）は初めに、８．５ｋＤの推定分子量を有し、７６アミノ酸から構成される、真核生物細胞において高度に保存された低分子タンパク質として同定された。ユビキチン−プロテアソーム分解経路は、多くの細胞プロセス、例えば細胞周期、ＤＮＡ修復、胚発生、転写及びアポトーシスの制御における重要な制御システムとして一般に認められている。ユビキチン−プロテアソーム経路では、タンパク質基質は初めに、複数のユビキチン分子との共有結合により分解のために標識され（ポリユビキチン化）、その後２６Ｓプロテアソーム（２０００ｋＤａのＡＴＰ依存性タンパク質分解複合体）により加水分解される。したがって、ＮＳ５Ａタンパク質のポリユビキチン化の誘導は、ＨＣＶのＲＮＡの複製の低減をもたらし得る。亜鉛ポルフィリンを使用して、ＨＣＶタンパク質を安定に発現するヒトヘパトーマ細胞においてＮＳ５Ａタンパク質レベルを用量依存的にダウンレギュレートすることができることがさらに見出されている。
【００１９】
一実施形態では、ＮＳ５Ａタンパク質の半減期を、約０．５〜３時間に低減させ、好ましくは約０．８〜１．５時間、より好ましくは約１〜１．２時間に低減させる。上述したように、ＮＳ５Ａタンパク質の半減期の低減は、ＨＣＶの複製能力に対する顕著な効果を有する。
【００２０】
金属ポルフィリンは、１つの炭素原子又は１つの窒素原子の架橋がそれぞれピロールを連結して特徴的なテトラピロール環構造（該テトラピロール環には金属イオンが挿入されている）を形成する大環状化合物である。ポルフィリン構造は、それと結合した様々なリガンド及び部分も含み得る。好適な金属の例は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＣｕを含み得るがこれらに限定されない。好ましい一実施形態では、本発明における使用のための金属ポルフィリンは、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム及びコバルトプロトポルフィリン、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。本発明において使用することができる金属ポルフィリンの他の有機金属誘導体は、例えば、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールを含む。
【００２１】
本発明は、治療的に有効な量及び／又は予防的な量の、金属ポルフィリン又はその製薬学的に許容可能な塩を含有する製剤を、治療を必要とする患者に投与することにより、ＨＣＶ感染症を治療及び／又は改善する方法を提供する。「治療的に有効な量」は、或る哺乳動物に対する活性成分（例えば金属ポルフィリン又はその製薬学的に許容可能な塩）の量が、ＨＣＶ感染症を治療及び／又は改善するのに効果的であることを意味する。好ましい一実施形態では、本発明は、ヒト患者におけるＨＣＶ感染症を治療及び／又は改善する方法に関する。
【００２２】
一実施形態では、本発明の金属ポルフィリン製剤の剤形（組成物）は、１単位当たり約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分、特に１単位当たり約１０〜８０ミリグラムの活性成分、例えば１単位当たり約１４〜７５ミリグラム、２０〜７０ミリグラム、３５〜６５ミリグラム、４０〜５０ミリグラム、又は約４０〜４５ミリグラムの活性成分を含有し得る。一実施形態では、金属ポルフィリンの単位用量は、一般的に５〜１０００ｍｇを含有し、好ましくは３０〜５００ｍｇ、特に５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ又は５００ｍｇを含有する。
【００２３】
一実施形態では、金属ポルフィリンを含有する製剤を１日１回以上、例えば１日２回、３回又は４回投与することができ、７０ｋｇの成体に対する総１日量は通常１００〜３０００ｍｇの範囲である。代替的には単位用量は、２〜２０ｍｇの金属ポルフィリンを含有していてもよく、上述の１日量を与えるために必要に応じて複数回に分けて投与してもよい。これらの医薬組成物では、活性成分は通常、製剤の総重量に基づき約０．５〜９５重量％の量で存在する。
【００２４】
様々な実施形態によれば、本発明の製剤を様々な方法で（例えば経腸的に及び静脈内に）、それを必要とする患者に投与することができる。例えば、本発明による製剤を、液体、固体、ゲル、又はそれらの組合せの形態で調製することができる。好ましい一実施形態では、本発明による製剤は、固体用量形態、例えば錠剤又はカプセルで提供される。
【００２５】
ＨＣＶ感染症の治療に使用するために、一般的な指針として、金属ポルフィリンの１日当たりの経口投与量は、一般的に約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
【００２６】
例えば、錠剤又はカプセルの形態での経口投与のために、活性成分を、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等を含むがこれらに限定されない経口用、非毒性の製薬学的に許容可能な不活性担体と組み合わせることができる。さらに、望ましい又は必要な場合には、好適な結合剤、滑剤、崩壊剤及び着色剤を、混合物中に組み込むこともできる。好適な結合剤は、デンプン、ゼラチン、天然の糖（例えばグルコース又はβ−ラクトース）、コーン甘味剤、天然及び合成のガム（例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等を含み得る。これらの剤形において使用される滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を含み得る。崩壊剤は、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
一実施形態では、金属ポルフィリンが約１０：１〜１：１のモル比でヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）と結合した製剤において金属ポルフィリンを投与する。ヒト血清アルブミンの使用は、金属ポルフィリンの肝細胞中への取り込みを増強するのを助ける。さらに、アルブミン複合体として投与した場合、該製剤は非毒性であり、肝臓及び脾臓によって優先的に取り込まれる。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本発明の金属ポルフィリンを含有する製剤を、標的指向性（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ）の薬剤担体である可溶性ポリマーと結合させることもできる。このようなポリマーは、例えば、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド−ポリリジンを含み得る。一実施形態では、本発明の製剤を、薬剤の制御放出を達成するのに有用な種類の生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及びポリグリコール酸のコポリマー、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアシレート、並びに架橋された又は両親媒性のヒドロゲルのブロックコポリマーと結合させることができる。
【００２９】
本発明の特定の実施形態では、本発明の金属ポルフィリン及び／又はその組成物を、少なくとも１つの他の治療剤との併用療法に使用することができる。本発明の化合物及び／又はその組成物並びに治療剤は、相加的に、又はより好ましくは相乗的に作用し得る。本発明の化合物及び／又はその組成物を、他の治療剤（複数可）の投与と同時に投与してもよく、又は他の治療剤（複数可）の投与の前に若しくはその後に投与してもよい。
【００３０】
一実施形態では、本発明の化合物及び／又はその組成物は、ＨＣＶの治療又は予防に効果的であることが知られている他の抗ウイルス剤又は他の治療法との併用療法に使用される。具体的な例として、本発明は、既知の抗ウイルス剤、例えばインターフェロン−α、リバビリン（例えば米国特許第４，５３０，９０１号を参照されたい）、テラプレビル、ＨＣＶプロテアーゼ及びポリメラーゼ阻害剤と、組み合わせて使用することができる本発明の金属ポルフィリン化合物及び／又はその組成物の組合せを投与することによりＨＣＶ感染症を治療する方法を提供する。
【００３１】
さらに別の具体的な例では、本発明の化合物及び／又はその組成物を、インターフェロン、例えばα−インターフェロン、β−インターフェロン及び／又はγ−インターフェロンと組み合わせて使用することができる。インターフェロンは修飾されていなくてもよく、又はポリエチレングリコールのような部分で修飾されていてもよい（ペグ化インターフェロン）。多くの好適な非ペグ化インターフェロン及びペグ化インターフェロンが市販されており、例えば組換えインターフェロンアルファ−２ｂ、例えばＩｎｔｒｏｎ−Ａインターフェロン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ケニルワース、ニュージャージー州から入手可能）、組換えインターフェロンアルファ−２ａ、例えばＲｏｆｅｒｏｎインターフェロン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、ナットレー、ニュージャージー州から入手可能）、組換えインターフェロンアルファ−２Ｃ、例えばＢｅｒｏｆｏｒアルファ２インターフェロン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ， Ｉｎｃ．、リッジフィールド、コネティカット州から入手可能）、インターフェロンアルファ−ｎ１、天然アルファインターフェロンの精製混合物、例えばＳｕｍｉｆｅｒｏｎ（大日本住友製薬株式会社、日本から入手可能）若しくはＷｅｌｌｆｅｒｏｎインターフェロンアルファ−ｎ１（ＩＮＳ）（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｌｔｄ．、ロンドン、英国から入手可能）、又はコンセンサスアルファインターフェロン、例えば米国特許第４，８９７，４７１号及び同４，６９５，６２３号（特にその実施例７、実施例８又は実施例９）に記載されているもの、並びに特定の製品（Ｔｈｒｅｅ Ｒｉｖｅｒｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、クランベリー・タウンシップ、ペンシルバニア州から入手可能）、又はインターフェロンアルファ−ｎ３、天然アルファインターフェロンの混合物、（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより製造され、商品名ＡｌｆｅｒｏｎでＰｕｒｄｕｅ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃｏ．、ノーウォーク、コネティカット州から入手可能）、ペグ化インターフェロン−２ｂ（商品名ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ Ａで、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ケニルワース、ニュージャージー州から入手可能）、並びにペグ化インターフェロン−２ａ（商品名ＰｅｇａｓｙｓでＨｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、ナットレー、ニュージャージー州から入手可能）を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
特定の一実施形態では、本発明は、金属ポルフィリンとインターフェロンとの組合せを含むＨＣＶ感染症の治療のための医薬製剤を提供する。一実施形態では、該製剤は、１単位当たり約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（ＢＷ）の金属ポルフィリン、及び１単位当たり約０．５〜５ｍｃｇ／ｋｇ（ＢＷ）のインターフェロンを含む。
【００３３】
以下の実施例は例示のみのために示すものであり、本発明を限定するものとは決して解釈すべきでない。
【実施例】
【００３４】
以下の記載は、ＨＣＶ感染症の治療における金属ポルフィリンの使用を評価するために使用した試薬及び手順の簡単な説明である。
【００３５】
［試薬及び抗体］
亜鉛メソポルフィリン（ＺｎＭＰ）を、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ローガン、ユタ州）から購入した。
亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）を、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ローガン、ユタ州）から購入した。
スズメソポルフィリン（ＳｎＭＰ）メソポルフィリンを、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ローガン、ユタ州）から購入した。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ（フェアローン、ニュージャージー州）から購入した。
マウス抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａモノクローナル抗体を、Ｖｉｒｏｇｅｎ（ウォータータウン、マサチューセッツ州）から取得した。
ウサギ抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａポリクローナル抗体を、Ｖｉｒｏｇｅｎ（ウォータータウン、マサチューセッツ州）から取得した。
マウス抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体を、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ（ゴールデン、コロラド州）から取得した。
ヤギ抗ヒトＧＡＰＤＨポリクローナル抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（サンタクルーズ、カリフォルニア州）から購入した。
ＥＣＬ−Ｐｌｕｓを、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から取得した。
エポキソミシン及びＭＧ１３２を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から取得した。
ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬を、Ｐｉｅｒｃｅ（ロックフォード、イリノイ州）から取得した。
ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、ＨｙＣｌｏｎｅ（ローガン、ユタ州）から取得した。
ＴＲＩｚｏｌ及びｚｅｏｃｉｎを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）から購入した。
Ｇ４１８を、Ｇｉｂｃｏ（グランドアイランド、ニューヨーク州）から取得した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を、Ｐｒｏｍｅｇａ（マディソン、ウィスコンシン州）から取得した。
プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルヴィル、アイオワ州）により合成されたものとした。
勾配４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＩｍｍｕｎＢｌｏｔ ＰＶＤＦ膜を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）から購入した。
【００３６】
［細胞培養］
細胞株９−１３、ＣＮＳ３及びＨｕｈ−７／Ｔ７は、Ｄｒ．Ｒａｌｆ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（ハイデルベルグ大学（ハイデルベルグ、独国））から提供を受けた。複製ＨＣＶ非構造領域を含有する９−１３細胞は、ＨＣＶのＮＳ３からＮＳ５Ｂを安定に発現する。ＣＮＳ３細胞は、ＨＣＶのコアからＮＳ３（Ｃｏｎ１単離体の１位〜１２３３位のアミノ酸残基、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２３８７９９）を安定に発現する。Ｈｕｈ−７／Ｔ７細胞は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現する。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、及び９−１３細胞に関しては５００μｇ／ｍＬのＧ４１８、ＣＮＳ３細胞に関しては１０μｇ／ｍＬのｚｅｏｃｉｎ、又はＨｕｈ−７／Ｔ７細胞に関しては５μｇ／ｍＬのｚｅｏｃｉｎを添加したＤＭＥＭにおいて維持した。Ｃｏｎ１（サブタイプ１ｂ）全長レプリコンＨｕｈ−７．５細胞（Ｃｏｎ１細胞）は、Ｄｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ Ｍ．Ｒｉｃｅ（ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク州）から提供を受けた。Ｃｏｎ１細胞株は、ポリペプチドの２２０４位のアミノ酸において高度に適応的なセリンからイソロイシンへの置換を有する全長ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンを含有するＨｕｈ−７．５細胞集団である。Ｃｏｎ１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、並びに０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び選択抗生物質として７５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＤＭＥＭにおいて維持した。
【００３７】
［ウエスタンブロット］
ウエスタンブロットを、Hou et al.の「亜鉛メソポルフィリンが転写因子Ｂａｃｈ１の迅速かつ顕著な分解を誘導し、ＨＯ−１をアップレギュレートする（Ｚｉｎｃ ｍｅｓｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｍａｒｋｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｂａｃｈ１ ａｎｄ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＨＯ−１）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００８；１７７９：１９５−２０３に記載のように、本発明者らの研究室の標準的なプロトコルを使用して行った。簡潔に述べると、全タンパク質（３０〜５０μｇ）を勾配４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ＩｍｍｕｎＢｌｏｔ ＰＶＤＦ膜上への電気泳動転写の後、膜を、５％脱脂粉乳及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で１時間ブロッキングし、その後一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体の希釈倍率は以下の通りとした。抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ抗体については１：２０００、並びに抗ＨＣＶコア抗体については１：５０００。その後膜を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（希釈倍率１：１００００）と共に１時間インキュベートした。最後に、結合した抗体を、製造業者のプロトコルに従ってＥＣＬ−Ｐｌｕｓ化学発光システムにより可視化した。Ｋｏｄａｋの１ＤＶ３．６コンピュータ式画像化システム（ロチェスター、ニューヨーク州）を使用して、ウエスタンブロッティング後に得られた各特異的バンドの相対的な光学密度を測定した。データを、１の値を割り当てられた対照（ビヒクルで処理した細胞により得られた値に対応する）に対する百分率として表す。
【００３８】
［ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ又はｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤのトランスフェクション］
ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ構築物及びｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤ構築物（遺伝子型１ｂ）は、Ｄｒ．Ｒ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（ハイデルベルグ大学、ハイデルベルグ、独国）から贈呈された。ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤ構築物は、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性部位のＧＤＤモチーフをＧＮＤへと変化させる１アミノ置換を有するｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤの複製欠損変異体であった。ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ又はｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤのトランスフェクションを、以下の手順に記載したように行った。簡潔に述べると、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現するＨｕｈ−７／Ｔ７細胞を、トランスフェクションの１日前に２４ウェルプレートに播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。製造業者の取扱説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により、細胞を、０．８μｇ／ウェルのｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ又はｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤを４８時間トランスフェクトした。
【００３９】
［ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ＨＣＶのＲＮＡのトランスフェクション及び感染］
ＨＣＶ感染性クローンｐＪ６／ＪＦＨ１は、Ｄｒ．Ｃ．Ｒｉｃｅ（ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク州）から提供を受けた。全長キメラゲノムを、Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌにより記載されたように、感染性Ｊ６（遺伝子型２ａ）由来のコア−ＮＳ２遺伝子領域、及び感染性ＪＦＨ１（遺伝子型２ａ）由来のＮＳ３−ＮＳ５Ｂ遺伝子領域を使用して構築した。ＨＣＶ Ｊ６／ＪＦＨ１のＲＮＡを生成するために、ｐＪ６／ＪＦＨ１プラスミドを、ＸｂａＩで直線化し、エタノール沈殿、プロテイナーゼＫでの消化、フェノール−クロロホルム抽出により精製した。直線化したプラスミドを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、オースティン、テキサス州）を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用した。ＨＣＶのＲＮＡのトランスフェクションのために、Ｈｕｈ−７．５細胞を、トランスフェクションの１日前に２４ウェルプレートに播き、７０〜８０％コンフルエンスをトランスフェクトした。２μｇ／ウェルのＨＣＶのＲＮＡ及び４μＬ／ウェルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用することにより、１：２のＲＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比率で、細胞を４８時間トランスフェクトした。ＨＣＶ感染のために、ＨＣＶのＲＮＡを４８時間トランスフェクトした細胞からの細胞培養上清を収集し、０．２０μｍフィルターを通して濾過し、２４ウェルプレートにおいてナイーブＨｕｈ−７．５細胞を７２時間感染させた。
【００４０】
［免疫沈降（ＩＰ）］
免疫沈降を、製造業者のプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、細胞を、低温の放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、並びに各々１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチン）中に回収した。試料を、プロテインＡ／Ｇアガロースにより４℃で１０分間予め清掃し（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）、その後一次抗体と共に４℃で一晩穏やかに回転させながらインキュベートし、その後プロテインＡ／Ｇビーズで４℃で１時間インキュベートした。ビーズを遠沈させ、ＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄した。タンパク質試料を、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上における電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ウエスタンブロット分析に関して記載したように、結合したユビキチンを抗ユビキチン抗体を使用して検出した。
【００４１】
［定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
処理した細胞からの全ＲＮＡを抽出し、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌに記載されるようにｃＤＮＡを合成した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）のＭｙｉＱ（商標）単色リアルタイムＰＣＲ検出システム、及びｉＱ（商標）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＳｕｐｅｒｍｉｘリアルタイムＰＣＲキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行った。鋳型を含まずかつ逆転写酵素を含まない試料を陰性対照として含むものとし、該試料は予想通り無視できる程度のシグナルしか産生しなかった（Ｃｔ値＞３５）。倍率の変化値を、同じ試料中のＧＡＰＤＨの量に対して正規化した後で比較Ｃｔ分析により算出した。
【００４２】
［タンパク質半減期の決定］
９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰの存在下又は非存在下において１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）と共にインキュベートした。ウエスタンブロットを、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用して行った。ウエスタンブロットのバンド強度を、デンシトメトリー分析により測定した。ＧＡＰＤＨのバンドを、タンパク質負荷量に関して補正するための内部標準として使用した。
【００４３】
［細胞生存度アッセイ］
処理した細胞の細胞毒性に対するＺｎＭＰの効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して、代謝的に活性な細胞の存在を示すＡＴＰの存在の定量化に基づいて生細胞の数を決定することにより測定した。細胞を、処理の２４時間前に２５００〜５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播いた。細胞を、表示した濃度のＺｎＭＰで、２時間、６時間及び２４時間、三連で（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）処理し、等容量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウェルの細胞培養培地に添加した。発光を、積分時間が０．２５〜１秒間に設定されたＢｉｏ−Ｔｅｋ（ウィヌースキ、バーモント州）のＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーにおいて読み取った。発光の減少を、細胞の細胞毒性の指標とした。
【００４４】
［統計解析］
初期の解析により、結果が正規分布していることが示された。したがって、パラメトリックな統計手法を使用した。スチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡを使用して（必要に応じて）、試料間の差異を解析した。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とみなした。実験を少なくとも３回繰り返して、同様の結果を得た。全ての実験が、各処理群に関して少なくとも三連の試料を含むものとした。単一の実験からの代表的な結果を示す。統計解析を、ＳＡＳ研究所（カリー、ノースカロライナ州）のＪＭＰ４．０．４ソフトウェアにより行った。
【００４５】
［実施例１］
この実施例では、ＺｎＭＰによるＨＣＶタンパク質のダウンレギュレーションを調査した。種々の濃度のＺｎＭＰ（０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ）に４時間曝露した９−１３細胞及びＣｏｎ１細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベル、ＣＮＳ３細胞におけるコアタンパク質レベル、並びにｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤ（Ｃｏｎ１の複製欠損変異体をコードするプラスミド）をトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルを評価した。処理後、細胞を回収し、全タンパク質を単離した。タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体、抗ＨＣＶコア抗体又はＧＡＰＤＨ特異的抗体で探索し、ＮＳ５Ａ、コア又はＧＡＰＤＨに対応するバンドを、上で記載したようなＥＣＬ−Ｐｌｕｓ化学発光により検出した。図において、ＮＳ５Ａの量又はコアタンパク質レベルを、処理により変化しないＧＡＰＤＨに対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を１と設定した。データを、三連の試料からの平均値±ＳＥとして示す。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００４６】
図１Ａ及び図１Ｂのウエスタンブロットに示すように、細胞をＺｎＭＰに曝露することにより、９−１３細胞及びＣｏｎ１細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルの用量依存的な顕著な減少がもたらされた。さらに、亜鉛ポルフィリンの効果は選択的かつ特異的であった。すなわち、図１Ｃ及び図１Ｄに見ることができるように、ＣＮＳ３細胞、及びｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＨＣＶコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果は検出不可能であった。付随する棒グラフにより、金属ポルフィリンの投与がＮＳ５Ａタンパク質のレベルを有意に低減させることができることが示される。例えば、ＮＳ５Ａタンパク質レベルは、約１μＭのポルフィリンの投与に関する約６０％から、約５μＭのポルフィリンの投与に関する約８０％〜９０％まで低減した。特に、１０μＭの用量の亜鉛ポルフィリンの投与がＮＳ５Ａタンパク質のレベルを４時間後に約９０％〜９５％低減させたことを見ることができる。
【００４７】
加えて、タンパク質レベルは、１０μＭの遊離メソポルフィリン又はＺｎＣｌ２により影響を受けないことが観察された。図２Ａでは、ＤＭＳＯ、メソポルフィリン及び塩化亜鉛と比較して、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛ポルフィリンの効果を比較する。この実施例では、９−１３細胞をＺｎＭＰ、遊離メソポルフィリン（Ｍｅｓｏ）又はＺｎＣｌ２に４時間曝露し、その後全タンパク質の抽出を行った。ウエスタンブロットを、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体及びＧＡＰＤＨ特異的抗体を使用して行った。ＺｎＭＰはＮＳ５Ａタンパク質のレベルを減少させたが、単独でのメソポルフィリン及び亜鉛は、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対して、もし有したとしても相対的に非常に小さい効果しか有しなかったことを見ることができる。
【００４８】
別の競合的ＨＯ阻害剤であるスズメソポルフィリン（ＳｎＭＰ）は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞においてＢａｃｈ１タンパク質レベルをダウンレギュレートし、ＨＯ−１遺伝子発現を誘導することが最近報告された。図２Ｂでは、９−１３細胞でのＮＳ５ＡのダウンレギュレーションにおけるＺｎＭＰ及びＳｎＭＰの効果を比較した。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰ又は１０μＭのＳｎＭＰで表示した時間（０時間、２時間、４時間、６時間）処理し、その後細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する回収用緩衝液を使用して回収した。５０μｇの全タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ特異的抗体で検出し、その後ＥＣＬ Ｐｌｕｓ化学発光により発色させた。図２Ｂに示すように、ＺｎＭＰは、わずか２時間のＺｎＭＰへの曝露後、ＮＳ５Ａタンパク質レベルを顕著かつ迅速に減少させた。対照的に、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対するＳｎＭＰの検出可能な効果は観察されなかった。ＮＳ５Ａタンパク質の相対量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を１と設定した。データを、三連の試料からの平均値±ＳＥとして示す。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００４９】
［実施例２］
実施例２では、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛キレート剤Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＥＰＮ）の効果を調査した。９−１３細胞を、ＺｎＭＰ処理の３０分前に、表示した濃度のＴＥＰＮで処理し、その後細胞を、ＺｎＭＰ、又は対照としての単独でのビヒクル（ＤＭＳＯ）に４時間曝露した。全タンパク質を抽出した。ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを、ウエスタンブロットにより測定した。棒グラフは定量的な結果を示す。ＮＳ５Ａタンパク質の相対量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。単独でのビヒクル由来のＮＳ５Ａのバンド強度を１に設定した。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。図３に示すように、亜鉛キレート剤ＴＥＰＮは、９−１３細胞におけるＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａタンパク質レベルの著しいダウンレギュレーションに影響を及ぼさなかった。
【００５０】
［実施例３］
実施例３では、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａタンパク質のダウンレギュレーションを、該ダウンレギュレーションが翻訳後レベルで起こるか否かを決定するために調査した。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰの存在下又は非存在下において１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で表示した期間（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間）処理し、その後細胞を回収し、全タンパク質を単離した。タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離して、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体又はＧＡＰＤＨ特異的抗体を使用して、ウエスタンブロットによりＮＳ５Ａ又はＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを検出した。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＺｎＭＰ及びシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルは、大きくかつ迅速に低減した。ＺｎＭＰで処理していない９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルもＣＨＸにより減少したが、その程度ははるかに低かった。１０μＭの濃度のＺｎＭＰが、ＮＳ５Ａタンパク質の半減期（ｔ１／２）を１９．８時間から１．２時間まで減少させた（図４Ｃ）。図４Ｂ及び図４Ｃでは、図４Ａにおけるバンドの強度を、デンシトメトリーにより定量化した。非処理の試料（０時間）由来のＮＳ５Ａのバンド強度を１と設定した。
【００５１】
［実施例４］
哺乳動物において、タンパク質分解に関する２つの異なる系（リソソーム系及びユビキチン−プロテアソーム系）が見出されている。プロテアソーム依存性の分解経路は、主要なタンパク質分解経路の１つである。ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａタンパク質の分解がプロテアソーム依存性であるか否かを理解するために、９−１３細胞を、ＺｎＭＰ（５μＭ、１０μＭ）、並びに選択したプロテアソーム阻害剤、エポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）及びＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）で処理した。９−１３細胞を、ＺｎＭＰ処理の３０分前に、表示した濃度のＭＧ１３２又はエポキソミシンで処理した。その後細胞を、ＺｎＭＰ、又は対照としての単独でのビヒクルに４時間曝露した。全タンパク質を抽出した。ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを、上で記載したようにウエスタンブロットにより測定した。
【００５２】
図５Ａは、ＺｎＭＰ（５μＭ、１０μＭ）、及び種々の濃度のエポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）又はＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示すウエスタンブロットである。図５Ｂは、図５Ａに示した結果に関する正規化した棒グラフである。単独でのエポキソミシン又はＭＧ１３２は、９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに影響を及ぼさないことが見出された。エポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）及びＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）は、低い方の濃度のＺｎＭＰ（５μＭ）に曝露した細胞におけるＮＳ５Ａの分解を完全に抑制した。対照的に、ＺｎＭＰ（１０μＭ）、及びエポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）又はＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）で処理した細胞は、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａの分解の有意な逆転を示し、プロテアソーム依存性の分解経路がＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの分解に関与することが示唆された。２０μＭのエポキソミシンに曝露した細胞は十分に成長できず、この濃度のエポキソミシンは細胞に対して毒性を有することが示されたため、これらの実施例において使用されるエポキソミシンの最高濃度は１０μＭであった。図５Ｂでは、図５Ａにおけるバンドの強度を、デンシトメトリーにより定量化し、３つの実験から相対平均強度±ＳＥを算出し、プロットした。ＮＳ５Ａタンパク質の量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。単独でのビヒクル由来のＮＳ５Ａのバンド強度を１に設定した。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００５３】
［実施例５］
この実施例は、ＺｎＭＰがＮＳ５Ａタンパク質の分解を媒介するメカニズムについての洞察を得るために、ＺｎＭＰがＮＳ５Ａのポリユビキチン化を誘導するか否かを調査する。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰを用いずに又は用いて４時間処理した。全タンパク質を、その後のウエスタンブロット又は免疫沈降分析のために抽出した。免疫沈降を、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体を使用して実施した。ＮＳ５Ａのユビキチン結合［ポリユビキチン化ＮＳ５Ａ、（Ｕｂ）ｎ−ＮＳ５Ａ］を、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体を使用する免疫沈降、及び抗ユビキチン抗体を使用するイムノブロットにより検証した。免疫沈降前のＮＳ５Ａタンパク質レベルのウエスタンブロット分析により、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａのダウンレギュレーションが示される（図６Ａ）。図６Ｂでは、ＺｎＭＰ処理又はビヒクル（ＤＭＳＯ）のみによる処理の後のＮＳ５Ａのユビキチン化を比較した。分子量マーカーの位置（キロダルトン）を、ゲルの左に表示する。角括弧は、ポリユビキチン化ＮＳ５Ａを示す。アスタリスクは、交差反応している免疫グロブリン重鎖を示す。図６Ｃは、抗ＮＳ５Ａ抗体によるイムノブロット分析を示し、これはＮＳ５Ａタンパク質がパネルＢにおいて免疫沈降したことを示している。角括弧は、ＮＳ５Ａを含有する移動度がより低いバンドを示す。これらのバンドは、ポリユビキチン化ＮＳ５Ａを表し得る。
【００５４】
この結果は、ＺｎＭＰが、亜鉛メソポルフィリンによるＮＳ５Ａの分解に寄与するＮＳ５Ａのポリユビキチン化を誘導することを示唆している。
【００５５】
［実施例６］
ＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの分解がＨＣＶ複製の阻害において役割を果たすことができるか否かを評価するために、Ｃｏｎ１全長ＨＣＶレプリコンＨｕｈ−７．５細胞を、種々の濃度のＺｎＭＰで２４時間処理した。全ＲＮＡ及び全タンパク質を抽出した。ＨＣＶウイルスのＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、ＨＣＶコア、ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質のレベルをウエスタンブロットにより測定した。データを、平均値±ＳＥとして示す（ｎ＝３）。＊は、ビヒクルのみと異なる（ＺｎＭＰ、０μＭ）（Ｐ＜０．０５）。対照であるビヒクル単独は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの量を変化させなかったが、ＺｎＭＰでの処理は、ウイルスＲＮＡレベル（図７Ａ）及びＨＣＶタンパク質レベル（図７Ｂ）の用量依存的な低減をもたらし、ＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの迅速な分解により、ＨＣＶのＲＮＡ複製の低減、及びその後のＨＣＶタンパク質の発現の減少がもたらされ得ることを示唆した。その後本発明者らは、ＮＳ５ＡがＺｎＭＰの実際の標的であり、ＨＣＶのＲＮＡ複製、及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果は、ＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの迅速な分解に対する二次的なものであるか否かについて疑問を抱いた。この目的のために、本発明者らは、Ｈｕｈ−７／Ｔ７細胞においてＤＮＡプラスミドｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤから発現されるＨＣＶタンパク質（該タンパク質の発現は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼと関連せず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのみと関連すると考えられる）を用いて並列実験を行った。２４時間のＺｎＭＰ処理後、ＺｎＭＰは、ＮＳ５Ａタンパク質レベルを用量依存的に顕著に減少させたが、ＨＣＶコアタンパク質レベルは影響を受けないままであった（図７Ｃ）。本発明者らは、ＺｎＭＰが、Ｈｕｈ−７／Ｔ７細胞においてｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤからＨＣＶタンパク質が発現される系（該系では該タンパク質の発現がウイルスＲＮＡポリメラーゼと部分的に関連すると考えられる）においてコアの低減をもたらす（図７Ｄ）が、コアの低減は、Ｃｏｎ１レプリコン系（該系では、ＨＣＶタンパク質の発現がウイルスＲＮＡポリメラーゼと関連していた）における効果よりはるかに小さいことをさらに観察した。
【００５６】
［実施例７］
この実施例は、ＺｎＭＰが、新規なＪＦＨ１ベースの（遺伝子型２ａ）ＨＣＶ細胞培養系においてＮＳ５Ａタンパク質をダウンレギュレートし、抗ウイルス活性を示すか否かを調査する。Ｈｕｈ−７．５細胞に、２μｇ／ウェルのＪ６／ＪＦＨ１ ＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によりトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、表示した濃度のＺｎＭＰ、又は対照としてのＤＭＳＯで４時間又は２４時間処理し、細胞を回収し、全ＲＮＡ及び全タンパク質を抽出した。ＨＣＶのＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、ＨＣＶコア、ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルをウエスタンブロットにより測定した。ＺｎＭＰにより、ＮＳ５Ａタンパク質レベルの迅速かつ著しい減少がもたらされたが、コアタンパク質レベルは４時間のＺｎＭＰ処理後には影響を受けず、２４時間のＺｎＭＰへの曝露後に減少を示した（図８Ａ〜図８Ｄ）。Ｊ６／ＪＦＨ１をトランスフェクトした及び感染させた細胞培養系においてＺｎＭＰがＨＣＶのＲＮＡの複製／感染を阻害するか否かをさらに検証するために、本発明者らは、ＺｎＭＰ処理後のＨＣＶのＲＮＡの発現を分析した。１０μＭのＺｎＭＰは、ＨＣＶのＲＮＡレベルを、ＨＣＶをトランスフェクトした細胞では約７０％ＨＣＶに感染した細胞では約９０％、顕著に減少させた（図８Ｅ及び図８Ｆ）。
【００５７】
［実施例８］
この実施例は、ＺｎＭＰ単独又はＩＦＮ単独に関する結果と比較して、ＺｎＭＰと組み合わせたインターフェロン（ＩＦＮ）の相加効果又は相乗効果が存在するか否かを決定するために、ＺｎＭＰをインターフェロンと組み合せることの効果を探求した。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰ若しくはＩＦＮα、又は両方の組合せで種々の時間（０時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、２４時間）処理し、その後細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する回収用緩衝液を使用して回収した。５０μｇのタンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ特異的抗体で探索し、その後ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬により発色させた。ＮＳ５Ａタンパク質の相対量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を１に設定した。データを、三連の試料からの平均値±ＳＥとして示す。＊はビヒクルのみと異なり（Ｐ＜０．０５）、＃はＩＦＮ単独又はＺｎＭＰ単独と異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００５８】
図９Ａに見ることができるように、２４時間のＩＦＮ処理はＮＳ５Ａタンパク質レベルを有意に減少させたが、ＩＦＮで１０時間未満処理した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果は検出不可能であった。図９Ｂでは、ＺｎＭＰが、わずか２時間処理した細胞においてＮＳ５Ａタンパク質レベルの迅速かつ顕著なダウンレギュレーションを誘導したが、ＺｎＭＰでの１０時間及び２４時間の処理後、ＮＳ５Ａタンパク質がわずかに増大したことを見ることができる。図９Ｃに示すように、ＩＮＦとＺｎＭＰとの組合せが、２４時間処理した細胞において、ＺｎＭＰ単独又はＩＦＮ単独に関する結果と比較してＮＳ５Ａタンパク質発現に対する相加的な効果を示した。したがって、ＩＮＦとＺｎＭＰとの組合せが、ＨＣＶ感染症の治療に関して、いずれか単独での治療と比較して相加効果及び／又は相乗効果を有することを見ることができる。さらに、この効果が、わずか２時間の処理から２４時間を超える処理まで、長期間にわたる試験であることを見ることができる。
【００５９】
［実施例９］
この実施例では、金属ポルフィリンの細胞毒性を評価した。９−１３細胞を、処理の２４時間前に９６ウェルプレート中に播種した。細胞を、表示した濃度のＺｎＭＰと共に０時間、２時間、６時間、２４時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を、積分時間を０．２５〜１秒間に設定したＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーにおけるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイのために添加した。発光の減少を、細胞の細胞毒性の指標とした。＊は、ビヒクルと異なり（Ｐ＜０．０５）、データは三連の測定値の平均値±ＳＥを表す。図１０に見ることができるように、２〜２４時間のＺｎＭＰ（１〜１０μＭ）、又は２〜６時間のＺｎＭＰ（２０μＭ）は、細胞生存度に対して有意な効果を有しなかったが、２４時間の２０μＭの濃度のＺｎＭＰは、９−１３細胞において有意な細胞毒性を引き起こした（ｐ＜０．０５）。したがって、６時間までについては２０μＭを超えないＺｎＭＰ濃度、又は２４時間までについては最大１０μＭのＺｎＭＰ濃度を使用した。
【００６０】
本明細書に記載の本発明の多くの変更及び他の実施形態が、前述の明細書及び添付の図面に提示される教示の利益を有する、本発明が関連する当業者の頭に浮かぶことだろう。したがって、本発明が、開示される特定の実施形態に限定されるものではないこと、並びに変更及び他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。特定の用語を本明細書中において用いているが、これらは包括的かつ説明的な意味においてのみ使用しており、限定目的で使用するものではない。
【図１】
【図２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎感染症の治療のための方法及び製剤に関する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫにより与えられたＲＯ１−ＤＫ３８８２５の下で米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる肝臓の血液感染性の感染性疾患である。ＨＣＶは、肝硬変及び肝癌を含む急性肝炎及び慢性肝疾患の主因である。Ｃ型肝炎は、世界で１億８０００万人を超える人々に感染しており、米国で４００万人の人々に感染していると推定されている。Ｃ型肝炎は、米国における肝臓移植の主要な原因であり、米国において１年に約１００００人〜２００００人の死亡はＨＣＶ感染症に起因する。
【０００４】
ＨＣＶは、長さおよそ９．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、フラビウイルス科におけるヘパシウイルス属の唯一の既知のメンバーである。ＨＣＶは、後に構造タンパク質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２）及び非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ）にプロセシングされる、およそ３０１０個のアミノ酸を有する単一のポリタンパク質をコードする。非構造ウイルスタンパク質は、新たなプラス鎖ウイルスゲノムの生成のための複製鋳型として働くマイナス鎖ＲＮＡの合成を開始する。非構造５Ａ（ＮＳ５Ａ）タンパク質は、ＨＣＶタンパク質の重要な構成要素であり、機能がほとんど未知の４４７アミノ酸のリン酸化亜鉛−金属タンパク質である。最近の研究により、ＮＳ５Ａが、ウイルスのＲＮＡ複製に関しては直接的に、並びにウイルスに有利なように宿主細胞環境を調整すること、及びＪＦＨ１に感染した細胞におけるＣ型肝炎ウイルス粒子の集合により間接的に、ＨＣＶの複製において重要な役割を果たすことが示されている。
【０００５】
ＨＣＶ感染症に対する治療の最も一般的な形態は、ペグ化インターフェロンα及び抗ウイルス薬リバビリンの組合せである。治療期間は、遺伝子型にもよるが、一般的に２４週間又は４８週間である。治療の適応は、確定診断されたＣ型肝炎ウイルス感染症及び持続的な肝機能検査異常を有する患者を含む。しかしながらこの治療は、治療された者のうち４６％もの者には持続的なウイルス学的応答をもたらすことができない。該治療は、「インフルエンザ様」症候群から重度の有害事象（貧血、循環器系の事象、及び精神医学的な問題、例えば自殺又は自殺念慮を含む）までにわたる好ましくない副作用も有する。またペグ化インターフェロンα及びリバビリンの組合せに基づく現在の治療は高価であり、一般的に発展途上国の患者には費用がかかりすぎる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＨＣＶ感染症の治療のための新たな治療に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、感染した細胞におけるＮＳ５Ａ細胞のレベルを低減させることによってＨＣＶ感染症に罹患している細胞又は哺乳動物を治療する方法及び製剤を提供することにより、上述の必要性の少なくとも幾つかを満たす。ＮＳ５Ａタンパク質レベルの低減は、本発明に従って、金属ポルフィリンを用いてＣ型肝炎感染症を治療することにより達成される。特に、本発明は、ＮＳ５Ａタンパク質が、ポリタンパク質切断、インターフェロン応答及び細胞内シグナル伝達経路に関与することによりＨＣＶのＲＮＡ複製において主要な役割を果たすという発見に基づく。金属ポルフィリン、例えば亜鉛ポルフィリンが、ユビキチン−プロテアソーム分解経路においてＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の翻訳後のダウンレギュレーションを誘導することが見出されている。すなわち、金属ポルフィリンを使用して、ＮＳ５Ａタンパク質異化に関するユビキチン−プロテアソーム経路を活性化することができる。結果として、金属ポルフィリンを使用して、ＨＣＶに感染した細胞におけるＨＣＶのウイルス複製を顕著に抑制することができる。
【０００８】
本発明では、金属ポルフィリンが、約１９．８時間から約１．２時間までＮＳ５Ａタンパク質の半減期を減少させること、及びＮＳ５Ａのポリユビキチン化を顕著に誘導することにより、ＮＳ５Ａタンパク質の安定性を低減させることが見出されている。結果として、ＨＣＶのＲＮＡ複製を顕著に低減させることができる。ユビキチン（Ｕｂ）は初めに、８．５ｋＤの推定分子量を有し、７６アミノ酸から構成される、真核生物細胞において高度に保存された低分子タンパク質として同定された。ユビキチン−プロテアソーム分解経路は、多くの細胞プロセス、例えば細胞周期、ＤＮＡ修復、胚発生、転写及びアポトーシスの制御における重要な制御システムとして一般に認められている。ユビキチン−プロテアソーム経路では、タンパク質基質は初めに、複数のユビキチン分子との共有結合により分解のために標識され（ポリユビキチン化）、その後２６Ｓプロテアソーム（２０００ｋＤａのＡＴＰ依存性タンパク質分解複合体）により加水分解される。したがって、ＮＳ５Ａタンパク質のポリユビキチン化の誘導は、ＨＣＶのＲＮＡ複製の低減をもたらし得る。金属ポルフィリンを使用して、ＨＣＶタンパク質を安定に発現するヒトヘパトーマ細胞においてＮＳ５Ａタンパク質レベルを用量依存的にダウンレギュレートすることができることがさらに見出されている。
【０００９】
１つの好ましい実施形態では、ＨＣＶ感染症を治療する方法は、亜鉛ポルフィリン、例えば亜鉛メソポルフィリン（ＺｎＭＰ）又は亜鉛プロトポルフィリンで、感染した細胞を処理する工程を含む。ＺｎＭＰ及びＺｎＰＰの両方が、ＮＳ５Ａのポリユビキチン化を誘導し、抗ウイルス活性を示すことが見出されている。亜鉛ポルフィリンは、概して無傷肝細胞によって容易に取り込まれるため、ＨＣＶ感染症の治療において特に有用であることが見出されている。
【００１０】
１つの実施形態では、本発明は、ＨＣＶ感染症の治療のための製剤にも関する。１つの特定の実施の形態では、本発明は、亜鉛ポルフィリンとアルブミンとを含む製剤を提供する。亜鉛ポルフィリンは、アルブミン複合体として投与された場合、非毒性であり、肝臓及び脾臓により優先的に取り込まれる。
【００１１】
さらなる１つの実施形態では、金属ポルフィリンを他の抗ウイルス治療薬と組み合わせて使用して、相加効果又は相乗効果をもたらすことができることが発見されている。例えば、本発明による製剤は、金属ポルフィリンと１つ以上のインターフェロン、例えばα−インターフェロン、β−インターフェロン及び／又はγ−インターフェロンとの組合せを含み得る。
【００１２】
したがって、本発明は、ＨＣＶ感染症の治療のための方法及び製剤を提供する。
【００１３】
このように本発明を包括的な用語で説明したが、添付の図面（必ずしも正確な縮尺で描かれていない）を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１Ｂ】Ｃｏｎ１細胞におけるＮＳ５Ａに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１Ｃ】ＣＮＳ３細胞におけるコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１Ｄ】ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図２Ａ】ＤＭＳＯ、メソポルフィリン及び塩化亜鉛と比較して、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図２Ｂ】スズメソポルフィリンと比較して、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図３】ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛キレート剤Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＥＰＮ）の効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図４Ａ】亜鉛メソポルフィリンで処理した肝細胞においてＮＳ５Ａタンパク質のおおよその半減期を決定するための、シクロヘキシミド［ＣＨＸ］（タンパク質合成の阻害剤）の存在下におけるＮＳ５Ａのタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロットである。
【図４Ｂ】パネルＡにおけるバンドの強度を示す棒グラフである。
【図４Ｃ】ＮＳ５Ａタンパク質の半減期に対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すグラフである。
【図５Ａ】ＺｎＭＰ、及び種々の濃度のエポキソミシン又はＭＧ１３２で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示すウエスタンブロットである。
【図５Ｂ】ＺｎＭＰ、及び種々の濃度のエポキソミシン又はＭＧ１３２で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示す正規化した棒グラフである。
【図５Ｃ】ＺｎＭＰの非存在下でエポキソミシン又はＭＧ１３２で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示すウエスタンブロットである。
【図６Ａ】ＺｎＭＰ処理後、免疫沈降（ＩＰ）の前のＮＳ５Ａの分解を示すウエスタンブロット分析を示す図であり、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａのダウンレギュレーションを示す。
【図６Ｂ】ＺｎＭＰ処理後のＮＳ５Ａのポリユビキチン化を対照と比較して示す、免疫沈降及びイムノブロッティング（ＩＢ）分析を示す図である。
【図６Ｃ】パネルＢにおいてＮＳ５Ａタンパク質が免疫沈降したことを示すイムノブロッティング（ＩＢ）分析を示す図である。
【図７Ａ】Ｃｏｎ１細胞におけるＨＣＶのＲＮＡに対するＺｎＭＰの用量効果を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】Ｃｏｎ１細胞におけるＨＣＶタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図７Ｃ】ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図７Ｄ】ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対する様々な濃度の亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図８Ａ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示すウエスタンブロット分析を示す図である。
【図８Ｂ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図８Ｃ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における２４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示すウエスタンブロット分析を示す図である。
【図８Ｄ】ＪＦＨ１ベースの細胞培養系における２４時間の処理後のＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図８Ｅ】Ｊ６／ＪＦＨ１のＲＮＡをトランスフェクトしたＨｕｈ−７．５細胞におけるＨＣＶのＲＮＡ複製に対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図８Ｆ】Ｊ６／ＪＦＨ１ ＨＣＶに感染したＨｕｈ−７．５細胞におけるＨＣＶのＲＮＡ複製に対するＺｎＭＰの効果を示す棒グラフである。
【図９Ａ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対するα−インターフェロンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図９Ｂ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛メソポルフィリンの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図９Ｃ】９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対するα−インターフェロン及び亜鉛メソポルフィリンの組合せの効果を示すウエスタンブロット及び付随する棒グラフである。
【図１０】細胞毒性に対するＺｎＭＰの用量効果及び経時効果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明を以下に、全てではないが幾つかの本発明の実施形態を示す添付の図面を参照してより十分に説明する。実際に、これらの発明は多くの様々な形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定するものと解釈すべきではない。むしろこれらの実施形態は、本開示が、適用される法的要件を満たすように提示されるものである。全体を通じて、類似の番号は類似の要素を表す。
【００１６】
本発明は、金属ポルフィリンによりＣ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法に関する。一実施形態では、本発明は、ＨＣＶに感染した細胞を処理する方法、特に金属ポルフィリンにより患者におけるＣ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法に関する。本発明の実施形態は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療のための金属ポルフィリンを含む医薬製剤にも関する。好ましい一実施形態では、本発明は、亜鉛ポルフィリンによりＣ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法に関する。
【００１７】
本発明の発明者らは、金属ポルフィリンを使用して、ＨＣＶ複製を阻害することによりＨＣＶ感染症を治療することができることを発見した。ＮＳ５Ａは、ポリタンパク質切断、インターフェロン応答及び細胞内シグナル伝達経路に関与することによりＨＣＶの複製において重大な役割を果たす。本発明では、金属ポルフィリンによって宿主細胞におけるＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の量を制御することにより、ＨＣＶ複製が低減すると考えられている。理論に拘束されることを望むものではないが、金属ポルフィリンが、ＮＳ５Ａタンパク質のユビキチン−プロテアソーム分解経路を媒介することにより、ＨＣＶに感染した細胞におけるＨＣＶのウイルス複製を抑制すると考えられている。結果として、感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の量を顕著に低減させることにより、ＨＣＶのＲＮＡの複製を低減させることができる。
【００１８】
本発明では、金属ポルフィリンが、約１９．８時間から約１．２時間にＮＳ５Ａタンパク質の半減期を減少させることによりＮＳ５Ａタンパク質の安定性を低減させること、及びＮＳ５Ａのポリユビキチン化を顕著に誘導することが見出されている。結果として、ＨＣＶのＲＮＡの複製を顕著に低減させることができる。ユビキチン（Ｕｂ）は初めに、８．５ｋＤの推定分子量を有し、７６アミノ酸から構成される、真核生物細胞において高度に保存された低分子タンパク質として同定された。ユビキチン−プロテアソーム分解経路は、多くの細胞プロセス、例えば細胞周期、ＤＮＡ修復、胚発生、転写及びアポトーシスの制御における重要な制御システムとして一般に認められている。ユビキチン−プロテアソーム経路では、タンパク質基質は初めに、複数のユビキチン分子との共有結合により分解のために標識され（ポリユビキチン化）、その後２６Ｓプロテアソーム（２０００ｋＤａのＡＴＰ依存性タンパク質分解複合体）により加水分解される。したがって、ＮＳ５Ａタンパク質のポリユビキチン化の誘導は、ＨＣＶのＲＮＡの複製の低減をもたらし得る。亜鉛ポルフィリンを使用して、ＨＣＶタンパク質を安定に発現するヒトヘパトーマ細胞においてＮＳ５Ａタンパク質レベルを用量依存的にダウンレギュレートすることができることがさらに見出されている。
【００１９】
一実施形態では、ＮＳ５Ａタンパク質の半減期を、約０．５〜３時間に低減させ、好ましくは約０．８〜１．５時間、より好ましくは約１〜１．２時間に低減させる。上述したように、ＮＳ５Ａタンパク質の半減期の低減は、ＨＣＶの複製能力に対する顕著な効果を有する。
【００２０】
金属ポルフィリンは、１つの炭素原子又は１つの窒素原子の架橋がそれぞれピロールを連結して特徴的なテトラピロール環構造（該テトラピロール環には金属イオンが挿入されている）を形成する大環状化合物である。ポルフィリン構造は、それと結合した様々なリガンド及び部分も含み得る。好適な金属の例は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＣｕを含み得るがこれらに限定されない。好ましい一実施形態では、本発明における使用のための金属ポルフィリンは、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム及びコバルトプロトポルフィリン、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。本発明において使用することができる金属ポルフィリンの他の有機金属誘導体は、例えば、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールを含む。
【００２１】
本発明は、治療的に有効な量及び／又は予防的な量の、金属ポルフィリン又はその製薬学的に許容可能な塩を含有する製剤を、治療を必要とする患者に投与することにより、ＨＣＶ感染症を治療及び／又は改善する方法を提供する。「治療的に有効な量」は、或る哺乳動物に対する活性成分（例えば金属ポルフィリン又はその製薬学的に許容可能な塩）の量が、ＨＣＶ感染症を治療及び／又は改善するのに効果的であることを意味する。好ましい一実施形態では、本発明は、ヒト患者におけるＨＣＶ感染症を治療及び／又は改善する方法に関する。
【００２２】
一実施形態では、本発明の金属ポルフィリン製剤の剤形（組成物）は、１単位当たり約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分、特に１単位当たり約１０〜８０ミリグラムの活性成分、例えば１単位当たり約１４〜７５ミリグラム、２０〜７０ミリグラム、３５〜６５ミリグラム、４０〜５０ミリグラム、又は約４０〜４５ミリグラムの活性成分を含有し得る。一実施形態では、金属ポルフィリンの単位用量は、一般的に５〜１０００ｍｇを含有し、好ましくは３０〜５００ｍｇ、特に５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ又は５００ｍｇを含有する。
【００２３】
一実施形態では、金属ポルフィリンを含有する製剤を１日１回以上、例えば１日２回、３回又は４回投与することができ、７０ｋｇの成体に対する総１日量は通常１００〜３０００ｍｇの範囲である。代替的には単位用量は、２〜２０ｍｇの金属ポルフィリンを含有していてもよく、上述の１日量を与えるために必要に応じて複数回に分けて投与してもよい。これらの医薬組成物では、活性成分は通常、製剤の総重量に基づき約０．５〜９５重量％の量で存在する。
【００２４】
様々な実施形態によれば、本発明の製剤を様々な方法で（例えば経腸的に及び静脈内に）、それを必要とする患者に投与することができる。例えば、本発明による製剤を、液体、固体、ゲル、又はそれらの組合せの形態で調製することができる。好ましい一実施形態では、本発明による製剤は、固体用量形態、例えば錠剤又はカプセルで提供される。
【００２５】
ＨＣＶ感染症の治療に使用するために、一般的な指針として、金属ポルフィリンの１日当たりの経口投与量は、一般的に約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
【００２６】
例えば、錠剤又はカプセルの形態での経口投与のために、活性成分を、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等を含むがこれらに限定されない経口用、非毒性の製薬学的に許容可能な不活性担体と組み合わせることができる。さらに、望ましい又は必要な場合には、好適な結合剤、滑剤、崩壊剤及び着色剤を、混合物中に組み込むこともできる。好適な結合剤は、デンプン、ゼラチン、天然の糖（例えばグルコース又はβ−ラクトース）、コーン甘味剤、天然及び合成のガム（例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等を含み得る。これらの剤形において使用される滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を含み得る。崩壊剤は、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
一実施形態では、金属ポルフィリンが約１０：１〜１：１のモル比でヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）と結合した製剤において金属ポルフィリンを投与する。ヒト血清アルブミンの使用は、金属ポルフィリンの肝細胞中への取り込みを増強するのを助ける。さらに、アルブミン複合体として投与した場合、該製剤は非毒性であり、肝臓及び脾臓によって優先的に取り込まれる。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本発明の金属ポルフィリンを含有する製剤を、標的指向性（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ）の薬剤担体である可溶性ポリマーと結合させることもできる。このようなポリマーは、例えば、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド−ポリリジンを含み得る。一実施形態では、本発明の製剤を、薬剤の制御放出を達成するのに有用な種類の生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及びポリグリコール酸のコポリマー、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアシレート、並びに架橋された又は両親媒性のヒドロゲルのブロックコポリマーと結合させることができる。
【００２９】
本発明の特定の実施形態では、本発明の金属ポルフィリン及び／又はその組成物を、少なくとも１つの他の治療剤との併用療法に使用することができる。本発明の化合物及び／又はその組成物並びに治療剤は、相加的に、又はより好ましくは相乗的に作用し得る。本発明の化合物及び／又はその組成物を、他の治療剤（複数可）の投与と同時に投与してもよく、又は他の治療剤（複数可）の投与の前に若しくはその後に投与してもよい。
【００３０】
一実施形態では、本発明の化合物及び／又はその組成物は、ＨＣＶの治療又は予防に効果的であることが知られている他の抗ウイルス剤又は他の治療法との併用療法に使用される。具体的な例として、本発明は、既知の抗ウイルス剤、例えばインターフェロン−α、リバビリン（例えば米国特許第４，５３０，９０１号を参照されたい）、テラプレビル、ＨＣＶプロテアーゼ及びポリメラーゼ阻害剤と、組み合わせて使用することができる本発明の金属ポルフィリン化合物及び／又はその組成物の組合せを投与することによりＨＣＶ感染症を治療する方法を提供する。
【００３１】
さらに別の具体的な例では、本発明の化合物及び／又はその組成物を、インターフェロン、例えばα−インターフェロン、β−インターフェロン及び／又はγ−インターフェロンと組み合わせて使用することができる。インターフェロンは修飾されていなくてもよく、又はポリエチレングリコールのような部分で修飾されていてもよい（ペグ化インターフェロン）。多くの好適な非ペグ化インターフェロン及びペグ化インターフェロンが市販されており、例えば組換えインターフェロンアルファ−２ｂ、例えばＩｎｔｒｏｎ−Ａインターフェロン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ケニルワース、ニュージャージー州から入手可能）、組換えインターフェロンアルファ−２ａ、例えばＲｏｆｅｒｏｎインターフェロン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、ナットレー、ニュージャージー州から入手可能）、組換えインターフェロンアルファ−２Ｃ、例えばＢｅｒｏｆｏｒアルファ２インターフェロン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ， Ｉｎｃ．、リッジフィールド、コネティカット州から入手可能）、インターフェロンアルファ−ｎ１、天然アルファインターフェロンの精製混合物、例えばＳｕｍｉｆｅｒｏｎ（大日本住友製薬株式会社、日本から入手可能）若しくはＷｅｌｌｆｅｒｏｎインターフェロンアルファ−ｎ１（ＩＮＳ）（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｌｔｄ．、ロンドン、英国から入手可能）、又はコンセンサスアルファインターフェロン、例えば米国特許第４，８９７，４７１号及び同４，６９５，６２３号（特にその実施例７、実施例８又は実施例９）に記載されているもの、並びに特定の製品（Ｔｈｒｅｅ Ｒｉｖｅｒｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、クランベリー・タウンシップ、ペンシルバニア州から入手可能）、又はインターフェロンアルファ−ｎ３、天然アルファインターフェロンの混合物、（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより製造され、商品名ＡｌｆｅｒｏｎでＰｕｒｄｕｅ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃｏ．、ノーウォーク、コネティカット州から入手可能）、ペグ化インターフェロン−２ｂ（商品名ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ Ａで、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ケニルワース、ニュージャージー州から入手可能）、並びにペグ化インターフェロン−２ａ（商品名ＰｅｇａｓｙｓでＨｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、ナットレー、ニュージャージー州から入手可能）を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
特定の一実施形態では、本発明は、金属ポルフィリンとインターフェロンとの組合せを含むＨＣＶ感染症の治療のための医薬製剤を提供する。一実施形態では、該製剤は、１単位当たり約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（ＢＷ）の金属ポルフィリン、及び１単位当たり約０．５〜５ｍｃｇ／ｋｇ（ＢＷ）のインターフェロンを含む。
【００３３】
以下の実施例は例示のみのために示すものであり、本発明を限定するものとは決して解釈すべきでない。
【実施例】
【００３４】
以下の記載は、ＨＣＶ感染症の治療における金属ポルフィリンの使用を評価するために使用した試薬及び手順の簡単な説明である。
【００３５】
［試薬及び抗体］
亜鉛メソポルフィリン（ＺｎＭＰ）を、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ローガン、ユタ州）から購入した。
亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）を、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ローガン、ユタ州）から購入した。
スズメソポルフィリン（ＳｎＭＰ）メソポルフィリンを、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ローガン、ユタ州）から購入した。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ（フェアローン、ニュージャージー州）から購入した。
マウス抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａモノクローナル抗体を、Ｖｉｒｏｇｅｎ（ウォータータウン、マサチューセッツ州）から取得した。
ウサギ抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａポリクローナル抗体を、Ｖｉｒｏｇｅｎ（ウォータータウン、マサチューセッツ州）から取得した。
マウス抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体を、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ（ゴールデン、コロラド州）から取得した。
ヤギ抗ヒトＧＡＰＤＨポリクローナル抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（サンタクルーズ、カリフォルニア州）から購入した。
ＥＣＬ−Ｐｌｕｓを、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から取得した。
エポキソミシン及びＭＧ１３２を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から取得した。
ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬を、Ｐｉｅｒｃｅ（ロックフォード、イリノイ州）から取得した。
ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、ＨｙＣｌｏｎｅ（ローガン、ユタ州）から取得した。
ＴＲＩｚｏｌ及びｚｅｏｃｉｎを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）から購入した。
Ｇ４１８を、Ｇｉｂｃｏ（グランドアイランド、ニューヨーク州）から取得した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を、Ｐｒｏｍｅｇａ（マディソン、ウィスコンシン州）から取得した。
プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルヴィル、アイオワ州）により合成されたものとした。
勾配４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＩｍｍｕｎＢｌｏｔ ＰＶＤＦ膜を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）から購入した。
【００３６】
［細胞培養］
細胞株９−１３、ＣＮＳ３及びＨｕｈ−７／Ｔ７は、Ｄｒ．Ｒａｌｆ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（ハイデルベルグ大学（ハイデルベルグ、独国））から提供を受けた。複製ＨＣＶ非構造領域を含有する９−１３細胞は、ＨＣＶのＮＳ３からＮＳ５Ｂを安定に発現する。ＣＮＳ３細胞は、ＨＣＶのコアからＮＳ３（Ｃｏｎ１単離体の１位〜１２３３位のアミノ酸残基、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２３８７９９）を安定に発現する。Ｈｕｈ−７／Ｔ７細胞は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現する。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、及び９−１３細胞に関しては５００μｇ／ｍＬのＧ４１８、ＣＮＳ３細胞に関しては１０μｇ／ｍＬのｚｅｏｃｉｎ、又はＨｕｈ−７／Ｔ７細胞に関しては５μｇ／ｍＬのｚｅｏｃｉｎを添加したＤＭＥＭにおいて維持した。Ｃｏｎ１（サブタイプ１ｂ）全長レプリコンＨｕｈ−７．５細胞（Ｃｏｎ１細胞）は、Ｄｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ Ｍ．Ｒｉｃｅ（ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク州）から提供を受けた。Ｃｏｎ１細胞株は、ポリペプチドの２２０４位のアミノ酸において高度に適応的なセリンからイソロイシンへの置換を有する全長ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンを含有するＨｕｈ−７．５細胞集団である。Ｃｏｎ１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、並びに０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び選択抗生物質として７５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＤＭＥＭにおいて維持した。
【００３７】
［ウエスタンブロット］
ウエスタンブロットを、Hou et al.の「亜鉛メソポルフィリンが転写因子Ｂａｃｈ１の迅速かつ顕著な分解を誘導し、ＨＯ−１をアップレギュレートする（Ｚｉｎｃ ｍｅｓｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｍａｒｋｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｂａｃｈ１ ａｎｄ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＨＯ−１）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００８；１７７９：１９５−２０３に記載のように、本発明者らの研究室の標準的なプロトコルを使用して行った。簡潔に述べると、全タンパク質（３０〜５０μｇ）を勾配４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ＩｍｍｕｎＢｌｏｔ ＰＶＤＦ膜上への電気泳動転写の後、膜を、５％脱脂粉乳及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で１時間ブロッキングし、その後一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体の希釈倍率は以下の通りとした。抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ抗体については１：２０００、並びに抗ＨＣＶコア抗体については１：５０００。その後膜を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（希釈倍率１：１００００）と共に１時間インキュベートした。最後に、結合した抗体を、製造業者のプロトコルに従ってＥＣＬ−Ｐｌｕｓ化学発光システムにより可視化した。Ｋｏｄａｋの１ＤＶ３．６コンピュータ式画像化システム（ロチェスター、ニューヨーク州）を使用して、ウエスタンブロッティング後に得られた各特異的バンドの相対的な光学密度を測定した。データを、１の値を割り当てられた対照（ビヒクルで処理した細胞により得られた値に対応する）に対する百分率として表す。
【００３８】
［ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ又はｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤのトランスフェクション］
ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ構築物及びｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤ構築物（遺伝子型１ｂ）は、Ｄｒ．Ｒ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（ハイデルベルグ大学、ハイデルベルグ、独国）から贈呈された。ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤ構築物は、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性部位のＧＤＤモチーフをＧＮＤへと変化させる１アミノ置換を有するｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤの複製欠損変異体であった。ｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ又はｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤのトランスフェクションを、以下の手順に記載したように行った。簡潔に述べると、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現するＨｕｈ−７／Ｔ７細胞を、トランスフェクションの１日前に２４ウェルプレートに播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。製造業者の取扱説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により、細胞を、０．８μｇ／ウェルのｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤ又はｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤを４８時間トランスフェクトした。
【００３９】
［ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ＨＣＶのＲＮＡのトランスフェクション及び感染］
ＨＣＶ感染性クローンｐＪ６／ＪＦＨ１は、Ｄｒ．Ｃ．Ｒｉｃｅ（ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク州）から提供を受けた。全長キメラゲノムを、Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌにより記載されたように、感染性Ｊ６（遺伝子型２ａ）由来のコア−ＮＳ２遺伝子領域、及び感染性ＪＦＨ１（遺伝子型２ａ）由来のＮＳ３−ＮＳ５Ｂ遺伝子領域を使用して構築した。ＨＣＶ Ｊ６／ＪＦＨ１のＲＮＡを生成するために、ｐＪ６／ＪＦＨ１プラスミドを、ＸｂａＩで直線化し、エタノール沈殿、プロテイナーゼＫでの消化、フェノール−クロロホルム抽出により精製した。直線化したプラスミドを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、オースティン、テキサス州）を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用した。ＨＣＶのＲＮＡのトランスフェクションのために、Ｈｕｈ−７．５細胞を、トランスフェクションの１日前に２４ウェルプレートに播き、７０〜８０％コンフルエンスをトランスフェクトした。２μｇ／ウェルのＨＣＶのＲＮＡ及び４μＬ／ウェルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用することにより、１：２のＲＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比率で、細胞を４８時間トランスフェクトした。ＨＣＶ感染のために、ＨＣＶのＲＮＡを４８時間トランスフェクトした細胞からの細胞培養上清を収集し、０．２０μｍフィルターを通して濾過し、２４ウェルプレートにおいてナイーブＨｕｈ−７．５細胞を７２時間感染させた。
【００４０】
［免疫沈降（ＩＰ）］
免疫沈降を、製造業者のプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、細胞を、低温の放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、並びに各々１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチン）中に回収した。試料を、プロテインＡ／Ｇアガロースにより４℃で１０分間予め清掃し（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）、その後一次抗体と共に４℃で一晩穏やかに回転させながらインキュベートし、その後プロテインＡ／Ｇビーズで４℃で１時間インキュベートした。ビーズを遠沈させ、ＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄した。タンパク質試料を、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上における電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ウエスタンブロット分析に関して記載したように、結合したユビキチンを抗ユビキチン抗体を使用して検出した。
【００４１】
［定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
処理した細胞からの全ＲＮＡを抽出し、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌに記載されるようにｃＤＮＡを合成した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）のＭｙｉＱ（商標）単色リアルタイムＰＣＲ検出システム、及びｉＱ（商標）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＳｕｐｅｒｍｉｘリアルタイムＰＣＲキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行った。鋳型を含まずかつ逆転写酵素を含まない試料を陰性対照として含むものとし、該試料は予想通り無視できる程度のシグナルしか産生しなかった（Ｃｔ値＞３５）。倍率の変化値を、同じ試料中のＧＡＰＤＨの量に対して正規化した後で比較Ｃｔ分析により算出した。
【００４２】
［タンパク質半減期の決定］
９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰの存在下又は非存在下において１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）と共にインキュベートした。ウエスタンブロットを、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用して行った。ウエスタンブロットのバンド強度を、デンシトメトリー分析により測定した。ＧＡＰＤＨのバンドを、タンパク質負荷量に関して補正するための内部標準として使用した。
【００４３】
［細胞生存度アッセイ］
処理した細胞の細胞毒性に対するＺｎＭＰの効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して、代謝的に活性な細胞の存在を示すＡＴＰの存在の定量化に基づいて生細胞の数を決定することにより測定した。細胞を、処理の２４時間前に２５００〜５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播いた。細胞を、表示した濃度のＺｎＭＰで、２時間、６時間及び２４時間、三連で（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）処理し、等容量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウェルの細胞培養培地に添加した。発光を、積分時間が０．２５〜１秒間に設定されたＢｉｏ−Ｔｅｋ（ウィヌースキ、バーモント州）のＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーにおいて読み取った。発光の減少を、細胞の細胞毒性の指標とした。
【００４４】
［統計解析］
初期の解析により、結果が正規分布していることが示された。したがって、パラメトリックな統計手法を使用した。スチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡを使用して（必要に応じて）、試料間の差異を解析した。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とみなした。実験を少なくとも３回繰り返して、同様の結果を得た。全ての実験が、各処理群に関して少なくとも三連の試料を含むものとした。単一の実験からの代表的な結果を示す。統計解析を、ＳＡＳ研究所（カリー、ノースカロライナ州）のＪＭＰ４．０．４ソフトウェアにより行った。
【００４５】
［実施例１］
この実施例では、ＺｎＭＰによるＨＣＶタンパク質のダウンレギュレーションを調査した。種々の濃度のＺｎＭＰ（０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ）に４時間曝露した９−１３細胞及びＣｏｎ１細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベル、ＣＮＳ３細胞におけるコアタンパク質レベル、並びにｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤ（Ｃｏｎ１の複製欠損変異体をコードするプラスミド）をトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＮＳ５Ａ及びコアタンパク質レベルを評価した。処理後、細胞を回収し、全タンパク質を単離した。タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体、抗ＨＣＶコア抗体又はＧＡＰＤＨ特異的抗体で探索し、ＮＳ５Ａ、コア又はＧＡＰＤＨに対応するバンドを、上で記載したようなＥＣＬ−Ｐｌｕｓ化学発光により検出した。図において、ＮＳ５Ａの量又はコアタンパク質レベルを、処理により変化しないＧＡＰＤＨに対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を１と設定した。データを、三連の試料からの平均値±ＳＥとして示す。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００４６】
図１Ａ及び図１Ｂのウエスタンブロットに示すように、細胞をＺｎＭＰに曝露することにより、９−１３細胞及びＣｏｎ１細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルの用量依存的な顕著な減少がもたらされた。さらに、亜鉛ポルフィリンの効果は選択的かつ特異的であった。すなわち、図１Ｃ及び図１Ｄに見ることができるように、ＣＮＳ３細胞、及びｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤをトランスフェクトしたＨｕｈ−７／Ｔ７細胞におけるＨＣＶコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果は検出不可能であった。付随する棒グラフにより、金属ポルフィリンの投与がＮＳ５Ａタンパク質のレベルを有意に低減させることができることが示される。例えば、ＮＳ５Ａタンパク質レベルは、約１μＭのポルフィリンの投与に関する約６０％から、約５μＭのポルフィリンの投与に関する約８０％〜９０％まで低減した。特に、１０μＭの用量の亜鉛ポルフィリンの投与がＮＳ５Ａタンパク質のレベルを４時間後に約９０％〜９５％低減させたことを見ることができる。
【００４７】
加えて、タンパク質レベルは、１０μＭの遊離メソポルフィリン又はＺｎＣｌ２により影響を受けないことが観察された。図２Ａでは、ＤＭＳＯ、メソポルフィリン及び塩化亜鉛と比較して、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛ポルフィリンの効果を比較する。この実施例では、９−１３細胞をＺｎＭＰ、遊離メソポルフィリン（Ｍｅｓｏ）又はＺｎＣｌ２に４時間曝露し、その後全タンパク質の抽出を行った。ウエスタンブロットを、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体及びＧＡＰＤＨ特異的抗体を使用して行った。ＺｎＭＰはＮＳ５Ａタンパク質のレベルを減少させたが、単独でのメソポルフィリン及び亜鉛は、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対して、もし有したとしても相対的に非常に小さい効果しか有しなかったことを見ることができる。
【００４８】
別の競合的ＨＯ阻害剤であるスズメソポルフィリン（ＳｎＭＰ）は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞においてＢａｃｈ１タンパク質レベルをダウンレギュレートし、ＨＯ−１遺伝子発現を誘導することが最近報告された。図２Ｂでは、９−１３細胞でのＮＳ５ＡのダウンレギュレーションにおけるＺｎＭＰ及びＳｎＭＰの効果を比較した。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰ又は１０μＭのＳｎＭＰで表示した時間（０時間、２時間、４時間、６時間）処理し、その後細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する回収用緩衝液を使用して回収した。５０μｇの全タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ特異的抗体で検出し、その後ＥＣＬ Ｐｌｕｓ化学発光により発色させた。図２Ｂに示すように、ＺｎＭＰは、わずか２時間のＺｎＭＰへの曝露後、ＮＳ５Ａタンパク質レベルを顕著かつ迅速に減少させた。対照的に、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対するＳｎＭＰの検出可能な効果は観察されなかった。ＮＳ５Ａタンパク質の相対量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を１と設定した。データを、三連の試料からの平均値±ＳＥとして示す。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００４９】
［実施例２］
実施例２では、ＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する亜鉛キレート剤Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＥＰＮ）の効果を調査した。９−１３細胞を、ＺｎＭＰ処理の３０分前に、表示した濃度のＴＥＰＮで処理し、その後細胞を、ＺｎＭＰ、又は対照としての単独でのビヒクル（ＤＭＳＯ）に４時間曝露した。全タンパク質を抽出した。ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを、ウエスタンブロットにより測定した。棒グラフは定量的な結果を示す。ＮＳ５Ａタンパク質の相対量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。単独でのビヒクル由来のＮＳ５Ａのバンド強度を１に設定した。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。図３に示すように、亜鉛キレート剤ＴＥＰＮは、９−１３細胞におけるＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａタンパク質レベルの著しいダウンレギュレーションに影響を及ぼさなかった。
【００５０】
［実施例３］
実施例３では、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａタンパク質のダウンレギュレーションを、該ダウンレギュレーションが翻訳後レベルで起こるか否かを決定するために調査した。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰの存在下又は非存在下において１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で表示した期間（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間）処理し、その後細胞を回収し、全タンパク質を単離した。タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離して、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体又はＧＡＰＤＨ特異的抗体を使用して、ウエスタンブロットによりＮＳ５Ａ又はＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを検出した。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＺｎＭＰ及びシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルは、大きくかつ迅速に低減した。ＺｎＭＰで処理していない９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルもＣＨＸにより減少したが、その程度ははるかに低かった。１０μＭの濃度のＺｎＭＰが、ＮＳ５Ａタンパク質の半減期（ｔ１／２）を１９．８時間から１．２時間まで減少させた（図４Ｃ）。図４Ｂ及び図４Ｃでは、図４Ａにおけるバンドの強度を、デンシトメトリーにより定量化した。非処理の試料（０時間）由来のＮＳ５Ａのバンド強度を１と設定した。
【００５１】
［実施例４］
哺乳動物において、タンパク質分解に関する２つの異なる系（リソソーム系及びユビキチン−プロテアソーム系）が見出されている。プロテアソーム依存性の分解経路は、主要なタンパク質分解経路の１つである。ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａタンパク質の分解がプロテアソーム依存性であるか否かを理解するために、９−１３細胞を、ＺｎＭＰ（５μＭ、１０μＭ）、並びに選択したプロテアソーム阻害剤、エポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）及びＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）で処理した。９−１３細胞を、ＺｎＭＰ処理の３０分前に、表示した濃度のＭＧ１３２又はエポキソミシンで処理した。その後細胞を、ＺｎＭＰ、又は対照としての単独でのビヒクルに４時間曝露した。全タンパク質を抽出した。ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを、上で記載したようにウエスタンブロットにより測定した。
【００５２】
図５Ａは、ＺｎＭＰ（５μＭ、１０μＭ）、及び種々の濃度のエポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）又はＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）で処理した９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果を示すウエスタンブロットである。図５Ｂは、図５Ａに示した結果に関する正規化した棒グラフである。単独でのエポキソミシン又はＭＧ１３２は、９−１３細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに影響を及ぼさないことが見出された。エポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）及びＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）は、低い方の濃度のＺｎＭＰ（５μＭ）に曝露した細胞におけるＮＳ５Ａの分解を完全に抑制した。対照的に、ＺｎＭＰ（１０μＭ）、及びエポキソミシン（５μＭ、１０μＭ）又はＭＧ１３２（１０μＭ、２０μＭ）で処理した細胞は、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａの分解の有意な逆転を示し、プロテアソーム依存性の分解経路がＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの分解に関与することが示唆された。２０μＭのエポキソミシンに曝露した細胞は十分に成長できず、この濃度のエポキソミシンは細胞に対して毒性を有することが示されたため、これらの実施例において使用されるエポキソミシンの最高濃度は１０μＭであった。図５Ｂでは、図５Ａにおけるバンドの強度を、デンシトメトリーにより定量化し、３つの実験から相対平均強度±ＳＥを算出し、プロットした。ＮＳ５Ａタンパク質の量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。単独でのビヒクル由来のＮＳ５Ａのバンド強度を１に設定した。＊は、ビヒクルのみと異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００５３】
［実施例５］
この実施例は、ＺｎＭＰがＮＳ５Ａタンパク質の分解を媒介するメカニズムについての洞察を得るために、ＺｎＭＰがＮＳ５Ａのポリユビキチン化を誘導するか否かを調査する。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰを用いずに又は用いて４時間処理した。全タンパク質を、その後のウエスタンブロット又は免疫沈降分析のために抽出した。免疫沈降を、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体を使用して実施した。ＮＳ５Ａのユビキチン結合［ポリユビキチン化ＮＳ５Ａ、（Ｕｂ）ｎ−ＮＳ５Ａ］を、抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体を使用する免疫沈降、及び抗ユビキチン抗体を使用するイムノブロットにより検証した。免疫沈降前のＮＳ５Ａタンパク質レベルのウエスタンブロット分析により、ＺｎＭＰによるＮＳ５Ａのダウンレギュレーションが示される（図６Ａ）。図６Ｂでは、ＺｎＭＰ処理又はビヒクル（ＤＭＳＯ）のみによる処理の後のＮＳ５Ａのユビキチン化を比較した。分子量マーカーの位置（キロダルトン）を、ゲルの左に表示する。角括弧は、ポリユビキチン化ＮＳ５Ａを示す。アスタリスクは、交差反応している免疫グロブリン重鎖を示す。図６Ｃは、抗ＮＳ５Ａ抗体によるイムノブロット分析を示し、これはＮＳ５Ａタンパク質がパネルＢにおいて免疫沈降したことを示している。角括弧は、ＮＳ５Ａを含有する移動度がより低いバンドを示す。これらのバンドは、ポリユビキチン化ＮＳ５Ａを表し得る。
【００５４】
この結果は、ＺｎＭＰが、亜鉛メソポルフィリンによるＮＳ５Ａの分解に寄与するＮＳ５Ａのポリユビキチン化を誘導することを示唆している。
【００５５】
［実施例６］
ＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの分解がＨＣＶ複製の阻害において役割を果たすことができるか否かを評価するために、Ｃｏｎ１全長ＨＣＶレプリコンＨｕｈ−７．５細胞を、種々の濃度のＺｎＭＰで２４時間処理した。全ＲＮＡ及び全タンパク質を抽出した。ＨＣＶウイルスのＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、ＨＣＶコア、ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質のレベルをウエスタンブロットにより測定した。データを、平均値±ＳＥとして示す（ｎ＝３）。＊は、ビヒクルのみと異なる（ＺｎＭＰ、０μＭ）（Ｐ＜０．０５）。対照であるビヒクル単独は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの量を変化させなかったが、ＺｎＭＰでの処理は、ウイルスＲＮＡレベル（図７Ａ）及びＨＣＶタンパク質レベル（図７Ｂ）の用量依存的な低減をもたらし、ＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの迅速な分解により、ＨＣＶのＲＮＡ複製の低減、及びその後のＨＣＶタンパク質の発現の減少がもたらされ得ることを示唆した。その後本発明者らは、ＮＳ５ＡがＺｎＭＰの実際の標的であり、ＨＣＶのＲＮＡ複製、及びコアタンパク質レベルに対するＺｎＭＰの効果は、ＺｎＭＰに媒介されるＮＳ５Ａの迅速な分解に対する二次的なものであるか否かについて疑問を抱いた。この目的のために、本発明者らは、Ｈｕｈ−７／Ｔ７細胞においてＤＮＡプラスミドｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＮＤから発現されるＨＣＶタンパク質（該タンパク質の発現は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼと関連せず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのみと関連すると考えられる）を用いて並列実験を行った。２４時間のＺｎＭＰ処理後、ＺｎＭＰは、ＮＳ５Ａタンパク質レベルを用量依存的に顕著に減少させたが、ＨＣＶコアタンパク質レベルは影響を受けないままであった（図７Ｃ）。本発明者らは、ＺｎＭＰが、Ｈｕｈ−７／Ｔ７細胞においてｐＦＫ−Ｃｏｎ１／ＧＤＤからＨＣＶタンパク質が発現される系（該系では該タンパク質の発現がウイルスＲＮＡポリメラーゼと部分的に関連すると考えられる）においてコアの低減をもたらす（図７Ｄ）が、コアの低減は、Ｃｏｎ１レプリコン系（該系では、ＨＣＶタンパク質の発現がウイルスＲＮＡポリメラーゼと関連していた）における効果よりはるかに小さいことをさらに観察した。
【００５６】
［実施例７］
この実施例は、ＺｎＭＰが、新規なＪＦＨ１ベースの（遺伝子型２ａ）ＨＣＶ細胞培養系においてＮＳ５Ａタンパク質をダウンレギュレートし、抗ウイルス活性を示すか否かを調査する。Ｈｕｈ−７．５細胞に、２μｇ／ウェルのＪ６／ＪＦＨ１ ＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によりトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、表示した濃度のＺｎＭＰ、又は対照としてのＤＭＳＯで４時間又は２４時間処理し、細胞を回収し、全ＲＮＡ及び全タンパク質を抽出した。ＨＣＶのＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、ＨＣＶコア、ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルをウエスタンブロットにより測定した。ＺｎＭＰにより、ＮＳ５Ａタンパク質レベルの迅速かつ著しい減少がもたらされたが、コアタンパク質レベルは４時間のＺｎＭＰ処理後には影響を受けず、２４時間のＺｎＭＰへの曝露後に減少を示した（図８Ａ〜図８Ｄ）。Ｊ６／ＪＦＨ１をトランスフェクトした及び感染させた細胞培養系においてＺｎＭＰがＨＣＶのＲＮＡの複製／感染を阻害するか否かをさらに検証するために、本発明者らは、ＺｎＭＰ処理後のＨＣＶのＲＮＡの発現を分析した。１０μＭのＺｎＭＰは、ＨＣＶのＲＮＡレベルを、ＨＣＶをトランスフェクトした細胞では約７０％ＨＣＶに感染した細胞では約９０％、顕著に減少させた（図８Ｅ及び図８Ｆ）。
【００５７】
［実施例８］
この実施例は、ＺｎＭＰ単独又はＩＦＮ単独に関する結果と比較して、ＺｎＭＰと組み合わせたインターフェロン（ＩＦＮ）の相加効果又は相乗効果が存在するか否かを決定するために、ＺｎＭＰをインターフェロンと組み合せることの効果を探求した。９−１３細胞を、１０μＭのＺｎＭＰ若しくはＩＦＮα、又は両方の組合せで種々の時間（０時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、２４時間）処理し、その後細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する回収用緩衝液を使用して回収した。５０μｇのタンパク質を、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＮＳ５Ａ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ特異的抗体で探索し、その後ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬により発色させた。ＮＳ５Ａタンパク質の相対量を、処理により変化しないＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。ビヒクルのみで処理した細胞についての値を１に設定した。データを、三連の試料からの平均値±ＳＥとして示す。＊はビヒクルのみと異なり（Ｐ＜０．０５）、＃はＩＦＮ単独又はＺｎＭＰ単独と異なる（Ｐ＜０．０５）。
【００５８】
図９Ａに見ることができるように、２４時間のＩＦＮ処理はＮＳ５Ａタンパク質レベルを有意に減少させたが、ＩＦＮで１０時間未満処理した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルに対する効果は検出不可能であった。図９Ｂでは、ＺｎＭＰが、わずか２時間処理した細胞においてＮＳ５Ａタンパク質レベルの迅速かつ顕著なダウンレギュレーションを誘導したが、ＺｎＭＰでの１０時間及び２４時間の処理後、ＮＳ５Ａタンパク質がわずかに増大したことを見ることができる。図９Ｃに示すように、ＩＮＦとＺｎＭＰとの組合せが、２４時間処理した細胞において、ＺｎＭＰ単独又はＩＦＮ単独に関する結果と比較してＮＳ５Ａタンパク質発現に対する相加的な効果を示した。したがって、ＩＮＦとＺｎＭＰとの組合せが、ＨＣＶ感染症の治療に関して、いずれか単独での治療と比較して相加効果及び／又は相乗効果を有することを見ることができる。さらに、この効果が、わずか２時間の処理から２４時間を超える処理まで、長期間にわたる試験であることを見ることができる。
【００５９】
［実施例９］
この実施例では、金属ポルフィリンの細胞毒性を評価した。９−１３細胞を、処理の２４時間前に９６ウェルプレート中に播種した。細胞を、表示した濃度のＺｎＭＰと共に０時間、２時間、６時間、２４時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を、積分時間を０．２５〜１秒間に設定したＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーにおけるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイのために添加した。発光の減少を、細胞の細胞毒性の指標とした。＊は、ビヒクルと異なり（Ｐ＜０．０５）、データは三連の測定値の平均値±ＳＥを表す。図１０に見ることができるように、２〜２４時間のＺｎＭＰ（１〜１０μＭ）、又は２〜６時間のＺｎＭＰ（２０μＭ）は、細胞生存度に対して有意な効果を有しなかったが、２４時間の２０μＭの濃度のＺｎＭＰは、９−１３細胞において有意な細胞毒性を引き起こした（ｐ＜０．０５）。したがって、６時間までについては２０μＭを超えないＺｎＭＰ濃度、又は２４時間までについては最大１０μＭのＺｎＭＰ濃度を使用した。
【００６０】
本明細書に記載の本発明の多くの変更及び他の実施形態が、前述の明細書及び添付の図面に提示される教示の利益を有する、本発明が関連する当業者の頭に浮かぶことだろう。したがって、本発明が、開示される特定の実施形態に限定されるものではないこと、並びに変更及び他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。特定の用語を本明細書中において用いているが、これらは包括的かつ説明的な意味においてのみ使用しており、限定目的で使用するものではない。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルを低減させる工程を含むＣ型肝炎ウイルス感染症に罹患している哺乳動物を治療する方法。
【請求項２】
前記ＮＳ５Ａタンパク質のポリユビキチン化を増強する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記感染した細胞を金属ポルフィリンで処理することによりＨＣＶを抑制する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記金属ポルフィリンが、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＳ５Ａタンパク質が、約０．５〜３時間に低減した半減期を有する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＳ５Ａタンパク質が、約１〜１．２時間に低減した半減期を有する請求項３に記載の方法。
【請求項７】
治療を必要とする宿主におけるＣ型肝炎ウイルス感染症の治療のための方法であって、治療的に有効な量の金属ポルフィリンを前記宿主に投与する工程を含む方法。
【請求項８】
前記金属ポルフィリンが、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールからなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＨＣＶに感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の量を約６０〜９５％低減させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記金属ポルフィリンがアルブミン複合体を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
インターフェロンを投与する工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＣＶに感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の半減期を約１〜１．２時間に低減させる工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
投与される前記金属ポルフィリンの量が、前記宿主の体重１キログラム当たり約０．１〜２０ミリグラムである請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記金属ポルフィリンを経口投与する工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
治療を必要とする患者におけるＨＣＶ感染症を治療するための方法であって、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールからなる群から選択される活性成分の治療的に有効な量を前記宿主に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
インターフェロンを投与する工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＣＶに感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の半減期を約１〜１．２時間に低減させる工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
投与される前記金属ポルフィリンの量が、前記患者の体重１キログラム当たり約０．１〜２０ミリグラムである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
約１０：１〜１：１のモル比でヒト血清アルブミンと結合した亜鉛プロトポルフィリンを約１０〜８０ミリグラム含むＨＣＶ感染症の治療のための医薬製剤。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質レベルを低減させる工程を含むＣ型肝炎ウイルス感染症に罹患している哺乳動物を治療する方法。
【請求項２】
前記ＮＳ５Ａタンパク質のポリユビキチン化を増強する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記感染した細胞を金属ポルフィリンで処理することによりＨＣＶを抑制する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記金属ポルフィリンが、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＳ５Ａタンパク質が、約０．５〜３時間に低減した半減期を有する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＳ５Ａタンパク質が、約１〜１．２時間に低減した半減期を有する請求項３に記載の方法。
【請求項７】
治療を必要とする宿主におけるＣ型肝炎ウイルス感染症の治療のための方法であって、治療的に有効な量の金属ポルフィリンを前記宿主に投与する工程を含む方法。
【請求項８】
前記金属ポルフィリンが、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールからなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＨＣＶに感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の量を約６０〜９５％低減させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記金属ポルフィリンがアルブミン複合体を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
インターフェロンを投与する工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＣＶに感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の半減期を約１〜１．２時間に低減させる工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
投与される前記金属ポルフィリンの量が、前記宿主の体重１キログラム当たり約０．１〜２０ミリグラムである請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記金属ポルフィリンを経口投与する工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
治療を必要とする患者におけるＨＣＶ感染症を治療するための方法であって、亜鉛メソポルフィリン、亜鉛プロトポルフィリン、ヘム、亜鉛ジュウテロポルフィリン、亜鉛ジュウテロポルフィリンビスグリコール、コバルトプロトポルフィリン、コバルトメソポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリン、コバルトジュウテロポルフィリンビスグリコール、ヘム、鉄メソポルフィリン、鉄ジュウテロポルフィリン及び鉄ジュウテロポルフィリンビスグリコールからなる群から選択される活性成分の治療的に有効な量を前記宿主に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
インターフェロンを投与する工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＣＶに感染した細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の半減期を約１〜１．２時間に低減させる工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
投与される前記金属ポルフィリンの量が、前記患者の体重１キログラム当たり約０．１〜２０ミリグラムである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
約１０：１〜１：１のモル比でヒト血清アルブミンと結合した亜鉛プロトポルフィリンを約１０〜８０ミリグラム含むＨＣＶ感染症の治療のための医薬製剤。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ−７Ｂ】
【図７Ｃ−７Ｄ】
【図８Ａ−８Ｄ】
【図８Ｅ−８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ−７Ｂ】
【図７Ｃ−７Ｄ】
【図８Ａ−８Ｄ】
【図８Ｅ−８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５０４６５３（Ｐ２０１２−５０４６５３Ａ）
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０２７０（Ｐ２０１１−５３０２７０）
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５９３９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４００６３
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５１１０８５００２）ザ・シャーロット‐メクレンバーグ・ホスピタル・オーソリティ，ドゥーイング・ビジネス・アズ・キャロライナズ・メディカル・センター (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５９３９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４００６３
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５１１０８５００２）ザ・シャーロット‐メクレンバーグ・ホスピタル・オーソリティ，ドゥーイング・ビジネス・アズ・キャロライナズ・メディカル・センター (2)
【Ｆターム（参考）】
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