外因性核酸のトランスフェクションに対する細胞の自然免疫応答を抑制する方法が開示される。外因性核酸を細胞に反復送達することにより外因性核酸によりコードされるタンパク質の発現を増加させる方法、および規定されるタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸を反復送達することにより細胞を分化、分化転換または脱分化させることにより細胞の表現型を変更する方法がさらに開示される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（「ｉｖＴ−ＲＮＡ」）を細胞に反復送達して、ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物によりコードされるタンパク質の発現の高い持続されたレベルを達成することによる延長一過性トランスフェクションのための方法が提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞により発現されるタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする核酸の細胞トランスフェクションに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、広範囲の疾患および損傷に罹患する患者への移植のための組織特異的細胞の制限されない供給源として用いる可能性が、急速に現実味を帯びてきている。多くの衰弱性疾患は、単独の型の組織特異的細胞の喪失を特徴とし（パーキンソン病、ドパミン作動性ニューロン；多発性硬化症、オリゴデンドロサイト；１型糖尿病、インスリン生成β細胞）、いくつかの対照ありの臨床試験を含むいくつかの最近の研究は、細胞型特異的疾患の影響の多くを、欠損している細胞型または関連する細胞型の細胞を、体の患部領域に移植することにより種々の程度で反転できることを示している^１〜８（非特許文献１〜非特許文献８）。最終分化した多くの細胞型は培養で容易に増殖しないので、多能性細胞は、まず、拡張させ、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させて、移植に必要な多量のこれらの組織特異的細胞を生成させなければならない。この理由から、無限に増殖し、任意の細胞型に分化できるヒトＥＳ細胞の培養物の確立は、新しい細胞置換療法の開発において主要な事項であった。
【０００３】
しかし、ｈＥＳ細胞を、スクリーニングおよび再生医療の両方の用途のための組織特異的細胞の純粋な集団にｉｎ ｖｉｔｒｏ分化させるためのプロトコールを開発することは困難であることが示されている^９〜１４。利用可能なプロトコールは、望ましくない細胞型を含む培養物を生成し、多くの組織特異的細胞型の効率的な精製のために必要なマーカーがまだ発見されていない。幹細胞を任意の所望の細胞型に高い効率で分化させ、分化細胞を所望の細胞型に分化転換または脱分化もさせるための新しい技術が必要とされている。
【０００４】
細胞型は、エピゲノム、一連のクロマチン修飾、および細胞の遺伝子のそれぞれが発現される程度を確立し、有糸分裂中に娘細胞に伝達され得るその他の因子により決定される^{１５〜１８、２７〜３０}。集合的に細胞型を決定するエピジェネティックなしるしは永続的でなく^{１９〜２１}、生殖細胞形成および早期の発生中の両方^{２２〜２６}、ならびに成体の生涯にわたって書き込まれ、消去される。これらの幹細胞ニッチおよび胚性幹細胞において生じる分化は、細胞内シグナル伝達のカスケードを開始する細胞外の合図により制御され、これらは最終的に、いくつかの遺伝子を選択的にサイレンシングさせながら他のものを活性化するエピジェネティックな移行をもたらす。
【０００５】
細胞が培養において分化するにつれて受ける特異的な移行の効率を増加させる化合物について小分子のライブラリーをスクリーニングするよりもむしろ、標的細胞表現型を維持する公知の因子の発現を一過的に増加させることにより細胞の遺伝子発現プログラムを直接的に変化させる方法が必要とされる。ＲＮＡトランスフェクションは、ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質の発現を一過的に増加できるが、細胞を遺伝子的に改変することなく、この初期の発現の高いレベルを数時間超または複数回の細胞分裂中ずっと維持する技術は存在しない。
【０００６】
よって、ｉｖＴ−ＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を、同期化または非同期化細胞を用いて数日間、多くの場合複数の世代にわたって、すなわち１回より多い細胞周期にわたって持続させて、細胞のタンパク質の発現を変更させることができ、このことが次いで、遺伝子発現プログラムおよび最終的な細胞表現型の調節を可能にする技術が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ．ら、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２， １１４５−１１４７
【非特許文献２】Ｆｒｅｅｄ， Ｃ．Ｒ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｖｅｒｅ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００１）３４４， ７１０−７１９
【非特許文献３】Ｏｌａｎｏｗ， Ｃ．Ｗ．ら、Ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｆｅｔａｌ ｎｉｇｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ（２００３）５４， ４０３−４１４
【非特許文献４】Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ， Ｈ．Ｓ．ら、Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒｅ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００５）２５， ４６９４−４７０５
【非特許文献５】Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｂ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ−ｉｎｊｕｒｅｄ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（２００５）１０２， １４０６９−１４０７４
【非特許文献６】Ｉｗａｎａｍｉ， Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ（２００５）８０， １８２−１９０
【非特許文献７】Ｓｈａｐｉｒｏ， Ａ．Ｍ．ら、Ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｖｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｆｒｅｅ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｇｉｍｅｎ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２０００）３４３， ２３０−２３８
【非特許文献８】Ｒｙａｎ， Ｅ．Ａ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｅｄｍｏｎｔｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００１）５０， ７１０−７１９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明を、添付の図面の図において例として、そして限定としてではなく説明する。これらの図面においては、以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ実施形態を示す図である。
【図２】図２Ａは、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの細胞内安定性を示す図である。ＭＲＣ−５線維芽細胞に、２μｇのＨＵＳＫ転写物ＡもしくはＦまたは全長転写物Ａをトランスフェクトし、それぞれの転写産物の細胞内濃度を、トランスフェクションの２、４、１２および２４時間後に測定した。ＧＡＰＤＨを、ローディング対照として用いた。指数回帰を、ＨＵＳＫ転写物（実線）および全長転写物（点線）について示す。誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。図２Ｂは、ＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＳＴＡＴ２およびＴＬＲ３を標的にするｓｉＲＮＡ カクテル（本文および方法を参照されたい）を予備トランスフェクトし、次いで、時間０にて０．５μｇのＬｉｎ２８ ｉｖＴ−ＲＮＡおよびさらなるｓｉＲＮＡを同時トランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞を示す図である。細胞が接着した後に、２００μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡを培養培地に加えて、細胞外ＲＮＡを分解した。細胞を、記載する時間に溶解し、Ｌｉｎ２８ ｉｖＴ−ＲＮＡの量を、外因性転写物に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより測定した。指数回帰（黒色の線、Ｒ^２＝０．９６）を示す。ＧＡＰＤＨを内因性対照として用いた。誤差バーは、反復試料の標準偏差を示す。
【図３】図３Ａは、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクションの後の翻訳タンパク質ＥＡＱの発現の時間発展の例を示す図である。転写物Ａ、ＢまたはＦを、ＭＲＣ−５線維芽細胞にエレクトロポレーションにより送達し、全細胞可溶化液を、記載する時間に調製した。ウェスタンブロットを行って、コードされるタンパク質の発現の時間発展を測定した（方法を参照されたい）。コードされるタンパク質を通常発現する細胞の試料（Ｈ９ヒト胚性幹細胞）を、比較のために用いた。β−アクチン（ＡＣＴＢ）をローディング対照として用いた。図３Ｂは、より詳細なタンパク質発現時間経過の例を示し、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクション後のタンパク質発現の用量応答性を示すデータを含む図である。ＭＲＣ−５線維芽細胞に、記載するＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトし、全細胞可溶化液を、記載する時間に調製した。タンパク質は、ウェスタンブロッティングにより検出した。
【図４】図４は、異なるＲＮＡ転写物により惹起される自然免疫応答を比較する棒グラフである。Ａ：ＭＲＣ−５線維芽細胞に、２μｇの本発明のＨＵＳＫ転写物Ａ、ＢもしくはＦまたは全長転写物Ａをトランスフェクトし、ＩＦＮＢ１発現のレベルを２４時間後に測定した。ＧＡＰＤＨをローディング対照として用いた。誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。Ｂ：トランスフェクトした細胞を数日間監視し、集密度の推定を、記載する時間に行った。データ点は、明確化のためにつないでいる。
【図５】図５は、記載するように２００ｎＭのＴＰ５３ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞に対する、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクションの細胞分裂停止効果を示す図である。２日後に、細胞をトリプシン処理により懸濁し、記載するようにして３．５μｇのＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡまたは３．５μｇのＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡと２００ｎＭのＴＰ５３ ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。第０日にｓｉＲＮＡを受けた細胞だけが、第２日にさらなるｓｉＲＮＡを受けた。データ点は、明確化のためにつないでいる。
【図６】図６は、定量ＲＴ−ＰＣＲによりＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後に測定し、模擬トランスフェクトした細胞と比較した、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクション後の自然免疫関連遺伝子発現パターンを示す棒グラフである。ＧＡＰＤＨをローディング対照として用いた。誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。
【図７】図７は、インターフェロン−βノックダウン後の遺伝子発現を示す一連の棒グラフを示す図である。Ａ：ＭＲＣ−５線維芽細胞に、ＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡを予備トランスフェクトし、次いで、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとｓｉＲＮＡとを２日後に同時トランスフェクトした。遺伝子発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後に測定した。Ｂ：ＭＲＣ−５線維芽細胞に、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとを同時トランスフェクトし、ＴＬＲ３、ＲＡＲＲＥＳ３およびＩＦＮＢ１の発現を２４時間後に測定した。誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。
【図８】図８は、インターフェロン−βノックダウン後の細胞増殖を示す図である。ＭＲＣ−５線維芽細胞に、記載するｓｉＲＮＡを第０日にトランスフェクトし、次いで、２．５μｇの本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとｓｉＲＮＡとを第３日に同時トランスフェクトした。Ａ、Ｂ：ＩＦＮＢ１およびＴＰ５３の発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後に測定した。ＧＡＰＤＨをローディング対照として用いた。誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。Ｃ：細胞のそれぞれの皿の集密度を、記載する時間に推定した。図５に記載する実験と同様に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを受けなかった細胞（菱形）は、２回目のエレクトロポレーションの後に迅速に回復したが、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを受けた細胞（四角）は、およそ４８時間遅延した増殖を示した。これもまた前と同様に、ＴＰ５３ノックダウン（三角、丸）は、回復時間を約半分に短くした。しかし、ＩＦＮＢ１ノックダウン（×、丸）は、増殖に対してほとんどまたは全く影響しなかった。データ点は、明確化のためにつないでいる。
【図９】図９は、（１）の場合の自然免疫応答に関与する遺伝子のノックダウンの影響を示す図である。ＭＲＣ−５線維芽細胞に、記載するｓｉＲＮＡ（エレクトロポレーションにより２００ｎＭ）を予備トランスフェクトし、次いで、ｓｉＲＮＡと２．５μｇの本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとの両方を４８時間後に同時トランスフェクトした。遺伝子発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後に測定したが、模擬トランスフェクトした細胞と比べて示す。Ａ：ＴＬＲ３、ＳＴＡＴ２、ＶＩＳＡ、ＴＢＫ１およびＩＲＦ３の遺伝子発現を、各遺伝子をノックダウンした後に測定した。Ｂ：ＴＬＲ３、ＴＩＣＡＭ１およびＴＩＣＡＭ２の遺伝子発現を、３つ全ての遺伝子の組み合わせたノックダウンの後に測定した。Ｃ：記載するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞のＩＦＮＢ１発現。Ｄ：トランスフェクトした細胞の集密度を、記載する時間に推定した。ＳＴＡＴ２以外の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の増殖は、ｓｉＲＮＡなし対照と区別できなかった。Ａ〜Ｃの誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。Ｄのデータ点は、明確化のためにつないでいる。
【図１０】図１０は、（２）の場合の自然免疫応答に関与する遺伝子のノックダウンの影響を示す図である。Ａ、Ｂ：前の図と同様にＭＲＣ−５線維芽細胞にトランスフェクトし、遺伝子発現を測定した。Ｃ：トランスフェクトした細胞の集密度を、記載する時間に推定した。ＥＩＦ２ＡＫ２以外の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の増殖は、ｓｉＲＮＡなし対照と区別できなかった。この実験と前の実験との間のトランスフェクション後の集密度の差（第０日および第２＋日）は、エレクトロポレーション後の異なる播種密度の結果である。Ａ〜Ｂの誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。Ｃのデータ点は、明確化のためにつないでいる。
【図１１−１】図１１Ａは、自然免疫関連遺伝子の組み合わせたノックダウン後の遺伝子発現を示す図である。ここでは、ＭＲＣ−５線維芽細胞に、ｓｉＲＮＡ混合物１（４００ｎＭ ＴＰ５３、２００ｎＭ ＳＴＡＴ２および２００ｎＭ ＥＩＦ２ＡＫ２）またはｓｉＲＮＡ混合物２（４００ｎＭ ＴＰ５３、２００ｎＭ ＳＴＡＴ２、２００ｎＭ ＥＩＦ２ＡＫ２、００ｎＭ ＩＦＮＢ１、２００ｎＭ ＴＬＲ３および２００ｎＭ ＣＤＫＮ１Ａ）を第０日にトランスフェクトし、次いで、０．５μｇの本発明のＨＵＳＫ転写物ＢまたはＦおよびさらなるｓｉＲＮＡを４８後にトランスフェクトした。遺伝子発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後に測定した。ＧＡＰＤＨをローディング対照として用いた。誤差バーは、反復試料のプールされた標準偏差を示す。図１１Ｂは、０．５μｇの本発明のＬｉｎ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを４８時間間隔で２回トランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞の応答を示す図である。ＲＮＡをトランスフェクトした細胞（灰色の丸）および模擬トランスフェクトした細胞（黒色の四角）の試料をトリプシン処理し、記載する時間に計数した。データ点および誤差バーは、２回の独立した実験の平均および標準誤差を表す。データ点は、明確化のためにつないでいる。
【図１１−２】図１１Ｃは、（１１Ｂ）と同様にしてトランスフェクトしたが、第２日に模擬トランスフェクトし、第４日に０．５μｇのＬｉｎ２８またはＭｙｏＤ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのいずれかをトランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞およびＣＣＤ−１１０９Ｓｋ線維芽細胞を示す図である。遺伝子発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後にＲＴ−ＰＣＲにより測定した（第５日）。値は、模擬トランスフェクトした細胞と比べて示す。図１１Ｄは、（１１Ｂ）と同様にしてトランスフェクトしたが、ＩＦＮＢ１、ＥＩＦＡＫ２、ＳＴＡＴ２およびＴＬＲ３を標的にするｓｉＲＮＡのカクテルを第２日に、そして０．５μｇのＬｉｎ２８またはＭｙｏＤ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのいずれかとさらなるｓｉＲＮＡとを第４日にトランスフェクトした細胞を示す図である。遺伝子発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後に測定した（第５日）。値は、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞と比べて示す。ＧＡＰＤＨを内因性対照として用いた。誤差バーは、反復試料の標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの反復トランスフェクション後の細胞増殖の量を示す図である。Ａ：ＭＲＣ−５線維芽細胞に、ｓｉＲＮＡ混合物１（４００ｎＭ ＴＰ５３、２００ｎＭ ＳＴＡＴ２および２００ｎＭ ＥＩＦ２ＡＫ２）またはｓｉＲＮＡ混合物２（４００ｎＭ ＴＰ５３、２００ｎＭ ＳＴＡＴ２、２００ｎＭ ＥＩＦ２ＡＫ２、２００ｎＭ ＩＦＮＢ１、２００ｎＭ ＴＬＲ３および２００ｎＭ ＣＤＫＮ１Ａ）を第０日にトランスフェクトし、０．５μｇのＨＵＳＫ転写物Ｂを第２、３および４日にトランスフェクトした。さらなるｓｉＲＮＡを第２日および第４日に含めた。それぞれのトランスフェクション後に、細胞のおよそ１０〜１５％をタンパク質およびＲＮＡ分析のために保存し、残りを１０ｃｍ皿に播種した。それぞれの皿の集密度を、記載する時間に推定した。Ｂ：細胞に、Ａと同様にしてトランスフェクトしたが、０．５μｇのＨＵＳＫ転写物Ｆをトランスフェクトし、第３日にトランスフェクションを行わなかった。データ点は、明確化のためにつないでいる。
【図１３−１】図１３Ａは、ＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＳＴＡＴ２およびＴＬＲ３を標的にするｓｉＲＮＡのカクテルを予備トランスフェクトした後に、０．５μｇのＬｉｎ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとさらなるｓｉＲＮＡとを４８時間間隔で５回トランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞の応答を示す図である。細胞を、記載する時間に溶解し、各試料中のＬｉｎ２８タンパク質の量を、ウェスタンブロットにより評価した。ＡＣＴＢをローディング対照として用いた。図１３Ｂは、トランスフェクションの１８時間後に測定した、模擬トランスフェクトした細胞におけるレベルと比べた成熟ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡのレベルを示す図である。平滑化した線は、１回（実線）および５回（点線）トランスフェクトした細胞に相当するデータ点をつないで描かれる。Ｕ４７ ＲＮＡを内因性対照として用いた。誤差バーは、反復試料の標準誤差を示す。
【図１３−２】図１３Ｃは、ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡと、記載する本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとをトランスフェクトした細胞によるＨＭＧＡ２発現の量を示す図である。ＨＭＧＡ２発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定したが、これを、ＲＮＡを受けなかった細胞と比べて示す。図１３Ｄは、Ｓｏｘ２（黒色の四角）、Ｌｉｎ２８（黒色の丸）またはＳｏｘ２とＬｉｎ２８との両方（中抜きの三角）をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを２４時間間隔で３回トランスフェクトした細胞によるＨＭＧＡ２発現の量を示す図である。ＨＭＧＡ２発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより記載する時間に測定したが、これを、模擬トランスフェクトした細胞と比べて示す。
【図１３−３】図１３Ｅは、ＭｙｏＤ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした、５−アザ−ｄＣを用いてまたは用いずに培養したＣＣＤ−１１０９Ｓｋ成体皮膚線維芽細胞を示す図である。ＣＤＨ１５およびＤＥＳの発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより記載する時間に測定した。図１３Ｆは、（１３Ｅ）と同様にしてトランスフェクトした試料から回収した全細胞可溶化液中でウェスタンブロットにより測定したＭｙｏＤ１タンパク質のレベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
「自然免疫応答」および「自然免疫応答」経路により、プラスミド、ベクター、ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物としての形態を含む任意の形態のＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む外因性核酸のトランスフェクション、または細胞から取り出され、同じ細胞もしくは異なる細胞に再トランスフェクトし、かつ２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのような１つもしくは複数の改変を含有する核酸を含む内因性核酸に対して細胞により開始される免疫応答を意味する。
【００１１】
「自然免疫応答経路のタンパク質」または「免疫抑制タンパク質」により、タンパク質ＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５、またはそれらの生物学的に活性な断片、類似体もしくは改変体を意味する。免疫抑制タンパク質は、さらに、Ｉ型インターフェロンの発現を増加するか、もしくはその発現が細胞をＩ型インターフェロンに曝露することにより増加する任意のタンパク質またはペプチドをさらに含む。タンパク質の完全な名称は、ＴＰ５３＝腫瘍タンパク質ｐ５３；ＴＬＲ３＝ｔｏｌｌ様受容体３；ＴＬＲ７＝ｔｏｌｌ様受容体７；ＲＡＲＲＥＳ３＝レチノイン酸受容体応答因子（タザロテン誘導）３；ＩＦＮＡ１＝インターフェロン、アルファ１；ＩＦＮＡ２＝インターフェロン、アルファ２；ＩＦＮＡ４＝インターフェロン、アルファ４；ＩＦＮＡ５＝インターフェロン、アルファ５；ＩＦＮＡ６＝インターフェロン、アルファ６；ＩＦＮＡ７＝インターフェロン、アルファ７；ＩＦＮＡ８＝インターフェロン、アルファ８；ＩＦＮＡ１０＝インターフェロン、アルファ１０；ＩＦＮＡ１３＝インターフェロン、アルファ１３；ＩＦＮＡ１４＝インターフェロン、アルファ１４；ＩＦＮＡ１６＝インターフェロン、アルファ１６；ＩＦＮＡ１７＝インターフェロン、アルファ１７；ＩＦＮＡ２１＝インターフェロン、アルファ２１；ＩＦＮＫ＝インターフェロン、カッパ；ＩＦＮＢ１＝インターフェロン、ベータ１、線維芽細胞；ＩＬ６＝インターロイキン６（インターフェロン、ベータ２）；ＴＩＣＡＭ１ ｔｏｌｌ様受容体アダプター分子１；ＴＩＣＡＭ２＝ｔｏｌｌ様受容体アダプター分子２；ＭＡＶＳ＝ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質；ＳＴＡＴ１＝シグナル伝達性転写因子１、９１ｋＤａ；ＳＴＡＴ２＝シグナル伝達性転写因子２、１１３ｋＤａ；ＥＩＦ２ＡＫ２＝真核生物翻訳開始因子２−アルファキナーゼ２；ＩＲＦ３＝インターフェロン調節因子３；ＴＢＫ１＝ＴＡＮＫ結合キナーゼ１；ＣＤＫＮ１Ａ＝サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ａ（ｐ２１、Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ２Ａ＝サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（メラノーマ、ｐ１６、ＣＤＫ４を阻害する）；ＲＮＡＳＥＬ＝リボヌクレアーゼＬ（２’，５’−オリゴイソアデニル酸合成酵素依存性）；ＩＦＮＡＲ１＝インターフェロン（アルファ、ベータおよびオメガ）受容体１；ＩＦＮＡＲ２＝インターフェロン（アルファ、ベータおよびオメガ）受容体２；ＯＡＳ１＝２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素１、４０／４６ｋＤａ；ＯＡＳ２＝２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素２、６９／７１ｋＤａ；ＯＡＳ３＝２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素３、１００ｋＤａ；ＯＡＳＬ＝２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素様；ＲＢ１＝網膜芽細胞腫１；ＩＳＧ１５＝ＩＳＧ１５ユビキチン様修飾因子；ＩＳＧ２０＝インターフェロン活性化エキソヌクレアーゼ遺伝子２０ｋＤａ；ＩＦＩＴ１＝テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質１；ＩＦＩＴ２＝テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質２；ＩＦＩＴ３＝テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質３；ならびにＩＦＩＴ５＝テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質５である。
【００１２】
「コザック」により、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される効率を決定する役割を有するｍＲＮＡ分子の開始コドンの周囲の配列を意味する^４６。
【００１３】
「強力なコザック」により、（１）最大の翻訳効率を生じることが公知のコザックコンセンサス配列ＲＣＣ（ＡＵＧ）Ｇ（括弧内は開始コドン、−３位の「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）を表す）、および（２）一般式ＲＸＹ（ＡＵＧ）（式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）であり、ＹはＣまたはＧのいずれかであり、Ｘは任意の塩基である）を有するその他の強力なコザック配列も意味する。ノンコーディングヌクレオチドのうち、−３位および−１位の塩基は、強いコンセンサスおよび効率的翻訳のために最も重要である。
【００１４】
対象のタンパク質をコードする「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ」または「ｉｖＴ−ＲＮＡ」により、細胞に導入でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでタンパク質に翻訳できる任意のｉｖＴ−ＲＮＡ構築物または転写物を意味する。構築物および転写物は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡに言及する場合は本明細書において交換可能に用いられる。
【００１５】
「ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ」により、コードされるタンパク質の発現の高いレベルを達成するようにカスタマイズされたｉｖＴ−ＲＮＡ転写物または構築物を意味する。新しいｉｖＴ−ＲＮＡ転写物の名称は、それらの５’端にＨＢＢ ＵＴＲを有するのでＨＢＢ−ＵＴＲで安定化され（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）、かつコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列を含む（ＨＵＳＫ）本明細書で用いる転写物に由来する。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの実施形態の例は、模式図における以下のものを含み、ここで、「ＣＤＳ」はタンパク質コード配列を意味し、「安定ＵＴＲ」は、高度安定ｍＲＮＡ分子、好ましくはアルファもしくはベータグロビンからの非翻訳領域を意味し、５’ＵＴＲは、強力なコザック配列の５’側の１つ目のＵＴＲを意味し、３’ＵＴＲは、ＣＤＳの３’側の２つ目のＵＴＲを意味し、「ＩＲＥＳ」は、配列内リボソーム進入部位を意味し、「ｍ７Ｇ」は、７グアノシンを意味し、「ポリ（Ａ）」は、分子の３’端のポリアデノシンテイルを意味する。
５’ 安定５’ＵＴＲ−強力なコザック−ＣＤＳ ３’
５’ ＩＲＥＳを有する安定５’ＵＴＲ−強力なコザック−ＣＤＳ ３’
５’ 安定５’ＵＴＲ−強力なコザック−−−（ＣＤＳ）−安定３’ＵＴＲ ３’
５’ 安定５’ＵＴＲ−強力なコザック−−−（ＣＤＳ）−安定３’ＵＴＲ ３’ 。
【００１６】
実施形態は、転写物の３’端にポリ（Ａ）テイルをさらに含む上記のいずれか、および転写物の５’端にｍ７Ｇキャップをさらに含む上記のいずれか、および転写物の５’端にｍ７Ｇキャップと３’端にポリ（Ａ）テイルとをともに有する上記のいずれかをさらに含む。転写物がｍ７Ｇキャップを有する場合、その後の２番目のヌクレオチドは、所望により、２’−Ｏ−メチル改変を有することができる。
【００１７】
「安定ＵＴＲ」により、高度安定ｍＲＮＡからのＵＴＲ、好ましくはアルファまたはベータグロビンＵＴＲを意味する。一般的に、ＵＴＲは、ｉｖＴ−ＲＮＡによりコードされるタンパク質と比べて異種の供給源からである。しかし、安定５’ＵＴＲは、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ中のコードされるタンパク質が例えばベータまたはアルファグロビンであるならば、天然に存在するものであり得る。
【００１８】
「ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ鋳型」により、ｉｖＴ−ＲＮＡを生成する構築物に作動可能に連結した強力な転写プロモーターを有するようにカスタマイズされ、その構築物が、安定５’ＵＴＲを強力なコザック配列につなぐ第１制限部位（例えば酵素ＮｈｅＩのためのもの）と、具体的な実施形態に応じて必要であればＣＤＳを安定３’ＵＴＲにつなぐ第２制限部位（例えば酵素Ａｎｇｌのためのもの）とを有するＤＮＡ分子を意味する。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ鋳型から転写される。
【００１９】
「強いプロモーター」により、同じＤＮＡ鋳型上で同じ反応条件においてＴ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーターの活性の少なくとも約８０％〜９０％またはそれより多くを示すプロモーターを意味する。
【００２０】
発明の要旨
本発明のあるいくつかの実施形態は、本明細書で定義される自然免疫応答経路中の１つまたは複数のタンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片もしくは類似体の発現を低減する作用物質（ａｇｅｎｔ）の有効量を細胞に導入することにより、核酸のトランスフェクションに対する細胞の自然免疫応答を抑制するための方法を対象とする。ある実施形態において、作用物質は、ｓｉＲＮＡ、１つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せであり、細胞は、動物細胞、好ましくはヒト細胞である。あるいくつかの実施形態において、作用物質は、自然免疫応答経路中のタンパク質またはその生物学的に活性な断片と選択的に結合し、それによりその生物学的な活性を低減する抗体である。核酸を導入することは、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、衝撃トランスフェクション（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ペプチド媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションまたはそれらの組合せを含む当技術分野において公知の任意の方法を用いて遂行できる。
【００２１】
その他の実施形態は、ａ．）細胞の自然免疫応答を抑制し、ｂ．）前記細胞に核酸を導入することにより細胞に核酸分子をトランスフェクトする方法を対象とする。好ましい実施形態において、核酸分子は、タンパク質もしくはその生物学的断片またはＲＮＡ分子をコードし、これは、１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子（好ましくはｉｖＴ−ＲＮＡ）、および２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子または１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む。ステップａ．）およびｂ．）は、同時または連続的であり得、好ましい実施形態において、ステップａ．）およびｂ．）は、２回以上反復される。好ましい実施形態において、細胞は、動物細胞、好ましくはヒトである。トランスフェクションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで遂行できる。別の好ましい実施形態において、核酸のトランスフェクションは、１つまたは複数のタンパク質の発現を引き起こし、これが次いで、幹細胞もしくは分化細胞の分化、分化転換または脱分化を含む細胞の所望の表現型変化を引き起こす。
【００２２】
その他の実施形態は、自然免疫応答経路中の２つ以上のタンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片もしくは類似体をコードするｍＲＮＡあるいはＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズし、それにより前記２つ以上のタンパク質の発現を低減する、複数の異なるｓｉＲＮＡ、１つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組合せを含む組成物を対象とする。好ましい組成物において、ｓｉＲＮＡの混合物は、ＴＰ５３、ＳＴＡＴ２およびＥＩＦ２ＡＫ２をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ分子、またはＴＰ５３、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２およびＩＦＮＢ１をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズするｓｉＲＮＡの混合物と特異的にハイブリダイズする。その他の実施形態は、免疫抑制およびトランスフェクション法により生成される細胞を対象とする。
【００２３】
あるいくつかのその他の実施形態は、対象のタンパク質をコードする種々の高度に安定で効率的に翻訳されるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ転写物であって、その構築物が作動可能な組合せで（ｉ）安定５’ＵＴＲと、（ｉｉ）タンパク質コード配列（ＣＤＳ）に連結した強力なコザック配列とを有する転写物を対象とする。いくつかの実施形態において、転写物は、（ｉｉｉ）安定３’ＵＴＲをさらに含む。好ましいＵＴＲは、ベータおよびアルファグロビンＵＴＲである。転写物は、以下のエレメントの１つまたは複数をさらに含むことができる：転写物の３’端にポリ（Ａ）テイル、転写物の５’端に７−メチルグアノシンキャップ、および配列内リボソーム進入部位。
【００２４】
その他の実施形態は、ｉｖＴ−ＲＮＡを作製するためのＤＮＡ鋳型と、使用者が、その第１鎖が作動可能な組合せで（ｉ）安定５’ＵＴＲと、（ｉｉ）前記５’ＵＴＲをコザックコンセンサス配列につなぐことができる第１制限部位とを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成する構築物に作動可能に連結した強力な転写プロモーターを有する鋳型に対象のＣＤＳを挿入することを可能にするキットとを対象とする。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、外因性核酸のトランスフェクションに対する細胞の自然免疫応答を抑制する方法、細胞への外因性核酸の反復送達により外因性核酸によりコードされるタンパク質の発現を増加する方法、および規定されたタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を反復送達することによって細胞を分化、分化転換または脱分化させることにより細胞の表現型を変更する方法に部分的に関する。好ましい実施形態において、核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（「ｉｖＴ−ＲＮＡ」）であり、ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物によりコードされるタンパク質（「コードされるタンパク質」）の発現の高く持続したレベルは、コードされるタンパク質の発現の所望のレベルを持続するために必要なｉｖＴ−ＲＮＡを反復して細胞にトランスフェクトすることにより複数の細胞世代にわたって達成されかつ維持される。
【００２６】
好ましい実施形態において、ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質の発現は、好ましくはトランスフェクションの前に、好ましくは本明細書で定義される自然免疫応答経路中の１つもしくは複数のタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズ可能なｓｉＲＮＡおよび／あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドの量を細胞に導入し、それにより標的タンパク質の発現を低減することによって、細胞の自然免疫応答を抑制することによりさらに増加する。自然免疫応答経路中の１つもしくは複数のタンパク質の生物学的な活性を低減する抗体または小分子も、単独またはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。好ましい実施形態において、自然免疫応答は、１回目のｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの約２４〜４８時間前に抑制され、免疫応答抑制は、必要により、好ましくは少なくとも約４８時間ごとに反復して、後続の回のｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクション中にコードされるタンパク質の発現の高いレベルを持続する。
【００２７】
その他の実施形態は、任意の対象のタンパク質をコードするようにカスタマイズできる、安定で効率的に翻訳されるｉｖＴ−ＲＮＡ転写物または構築物（以下、「ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物」という）と、それらを作製するために用いられるＤＮＡ鋳型とを対象とする。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物の種々の実施形態が、定義に記載され、以下により詳細に記載される。好ましいＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの例において、コードされるタンパク質の天然に存在する５’ＵＴＲは、ベータグロビン（「ＨＢＢ」）またはアルファグロビンをコードするもののような高度安定ｍＲＮＡに由来する５’ＵＴＲ（以下、「安定５’ＵＴＲ」）で置き換えられ、天然に存在するコザック配列は、「強力なコザック」コンセンサス配列、好ましくは（ＲＣＣ（ＡＵＧ））で置き換えられる。ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物の名称は、それらの５’端にＨＢＢ ＵＴＲを有し、よって、ＨＢＢ−ＵＴＲで安定化されており（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）、かつ強力なコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列を含む（ＨＵＳＫ）本明細書で用いる転写物に由来する。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物は、タンパク質コード配列（以下、「ＣＤＳ」）の３’側に第２安定ＵＴＲ（安定３’ＵＴＲ）、３’端に翻訳を促進するためのポリ（Ａ）テイル、５’端に７−メチルグアノシンキャップ、または安定５’ＵＴＲ中に位置する配列内リボソーム進入部位（以下、「ＩＲＥＳ」）も有する。ＩＲＥＳは、ｉｖＴ−ＲＮＡへのリボソームの接着を促進して、翻訳効率を増加させる。さらにその他の実施形態は、使用者が、任意の核酸を挿入することにより鋳型およびそれらから転写されるＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをカスタマイズすることを可能にするキットを対象とする。
【００２９】
その他の実施形態は、細胞表現型に影響するかもしくはそれを制御することが公知の１つまたは複数のタンパク質をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの反復送達による延長一過性トランスフェクションにより細胞の表現型を変更する方法を対象とする。例えば、所望の表現型を有する細胞に幹細胞を分化させること、または所望の表現型を有する細胞に分化細胞を分化転換させるかもしくは幹細胞もしくはその他の前駆細胞に脱分化させること。その他の実施形態は、規定されたタンパク質をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした細胞、ならびにｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの種々の組成物を対象とする。
【００３０】
ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ設計
本発明は、コードされるタンパク質の発現の一貫して高く持続したレベルを延長された期間達成するように効率的に翻訳されるＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとよばれる改良ｉｖＴ−ＲＮＡを提供する。ＩｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションは、特に１つもしくは複数のタンパク質または特定の遺伝子の一過性過剰発現が所望される種々の細胞プロセスを研究するために広く用いられる^{３２〜３４}。ｉｖＴ−ＲＮＡを用いるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の高効率で高生存性のトランスフェクションが、最近、証明されている^３５。キャップ付加ポリアデニル化ｉｖＴ−ＲＮＡの多量のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための技術が、エレクトロポレーションおよび脂質媒介トランスフェクションを含む種々の送達技術^{４０〜４５}と同様に、最近、利用可能になっている^{３６〜３９}。
【００３１】
ほとんどのｍＲＮＡ分子の細胞内寿命は数時間だけであるが、ｍＲＮＡ分子の分解速度は、その非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在する配列エレメントにより強く影響される。ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物のＵＴＲを、より安定なｍＲＮＡ分子のものに置き換えることにより、ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物の細胞内安定性が増加し、よって、翻訳され得るタンパク質の量が増加することが示されている^４２。ｍＲＮＡ分子の安定性は、主に、その５’−および３’−ＵＴＲの配列により決定され、これらは、特定の因子と関連することにより分解を調節する^{４７〜４９}。不安定なＲＮＡ分子の５’−または３’−ＵＴＲのいずれかを、より安定なｍＲＮＡ分子からのＵＴＲで置き換えることにより、その安定性が著しく増加し、両方のＵＴＲを置き換えることにより、さらに安定性が増加することが示されている。
【００３２】
ｍＲＮＡ分子の開始コドンの周囲の配列（「コザック配列」として公知）も、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される効率を決定することにおいて重要な役割を有することが示されている^４６。最大翻訳効率を生じる最強のコザックコンセンサス配列は、ＲＣＣ（ＡＵＧ）Ｇ（以下、「コザックコンセンサス配列」という）（括弧内は開始コドンであり、−３位の「Ｒ」は、プリン（ＡまたはＧ）を表す）である。より一般的には、配列ＲＸＹ（ＡＵＧ）（式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）であり、ＹはＣまたはＧのいずれかであり、Ｘは任意の塩基である）が効率的、よって、本発明の目的について「強力なコザック配列」であると考えられる。ノンコーディングヌクレオチドのうち、−３位および−１位の塩基は、強いコンセンサスおよび効率的な翻訳のために最も重要である。理論と結び付けられることなく、開始コドンの周囲の配列に翻訳効率が依存することは、リボソームに相補的なｍＲＮＡ配列のある部分が、開始コドン付近で翻訳複合体を休止させ、翻訳開始の可能性を増加させることができる翻訳モデルにより説明されている。
【００３３】
本発明のあるいくつかの実施形態は、対象の任意のタンパク質をコードするようにカスタマイズできる安定で効率的に翻訳される改良ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物（以下、「ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物または構築物」という）と、それらを作製するために用いられるＤＮＡ鋳型とを対象とする。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物の種々の実施形態は、定義に記載される。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの最も単純な実施形態において、コードされるタンパク質の天然に存在するコザック配列を、強力なコザック配列、好ましくはコザックコンセンサス配列（ＲＣＣ（ＡＵＧ）で置き換え、天然に存在する５’ＵＴＲを、所望により配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）を含む「安定５’ＵＴＲ」で置き換える。好ましい実施形態において、コードされるタンパク質の天然に存在する５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの両方の配列を、好ましくはベータグロビン（ＨＢＢ）および／またはアルファグロビンからの安定ＵＴＲで置き換える。別の好ましい実施形態において、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物は、３’端にポリ（Ａ）テイルも有して、翻訳を促進する。ある例の実施形態を、以下に記載する。
【００３４】
ＩＲＥＳを有するかまたは有さない安定５’ＵＴＲ−強力なコザック−ＣＤＳ−安定３’Ｕ ＴＲ−ポリ（Ａ）３’
安定ＵＴＲを５’位および３’位の両方に有する実施形態において、それぞれのＵＴＲは、同じまたは異なることができるが、それぞれは、安定ｍＲＮＡに由来し、それ自体は、コードされるタンパク質をコードする内因性ｍＲＮＡの対応する天然に存在するＵＴＲとは異なる。β−グロビン遺伝子（ＨＢＢ）を、以下に記載する実験において用いた。なぜなら、これは、公知の最も安定なｍＲＮＡ分子の１つをコードするからである^４９。ＨＢＢ ＵＴＲは短く（５’−ＵＴＲ＝５０ｎｔ、３’−ＵＴＲ＝１３２ｎｔ）、よって、平均的な長さのタンパク質をコードする転写物の質量に少量しか寄与せず、高いコピー数−対−質量比率を完全転写産物に与える。例示する実施形態において、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物は、ＨＢＢ ＵＴＲを５’位と３’位との両方に含んで、細胞内安定性を最大限にした。（参考文献４２、４７〜４９を参照されたい）。ベータ−グロビンに加えて、アルファ−グロビンｍＲＮＡは、そのＵＴＲ中の特定のエレメントの結果として高い細胞内安定性を有することが公知であり、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを作製するために用いることができる。（参考文献４７と、Ｒｕｓｓｅｌｌら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ３’ Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ζ− ａｎｄ α−Ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡｓ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ａ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｔｈｅｉｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ α−ｔｏ−ζ Ｇｅｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ．」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８巻（４号）２１７３〜２１８３頁、１９９８年も参照されたい）。アクチン、コラーゲンおよび結晶体のようなその他の構造タンパク質からのＵＴＲは、長い細胞内半減期を有し（４７で引用される参考文献を参照されたい）、よって、これもまた用いることができるｍＲＮＡを有する。
【００３５】
翻訳を増加させるその他の特徴も含むことができる。例えば、ある実施形態において、構築物は、転写物へのリボソームの接着を促進して翻訳を増加させる配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する。ＩＲＥＳは、５’ＵＴＲ中のエレメントであり、よって、これは、ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物の５’端と強力なコザック配列との間である。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの別の任意選択の特徴は、５’端の７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）キャップである。転写物がＩＲＥＳを有する場合、これはｍ７Ｇキャップを有する必要はないが、両方のエレメントを用いることもできる。別の実施形態において、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡは、５’ ｍ７Ｇキャップの直後に続く２’−Ｏ−メチル改変を含有する２番目のヌクレオチドを有する。この改変は、高等真核生物の多くのｍＲＮＡの成分であり、ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される効率を増加させることが公知である。
【００３６】
あるいくつかの実施形態は、本明細書に記載する７つの異なるＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡに向けられ、そのそれぞれは、その公知の遺伝子標的、細胞分化におけるその参加、細胞型特異性の維持および遺伝子発現プログラム、ならびにそのコード配列の長さに基づいて選択されたタンパク質をコードする。７つのｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質は、５つの転写因子と１つのｍＲＮＡ結合タンパク質と１つの支配的遺伝子とを含む。転写物Ａ〜Ｇは、以下のそれぞれのヒトタンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片、類似体もしくは改変体をそれぞれがコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ構築物のことをいう。
転写物Ａ：ＯＣＴ４（ｍＲＮＡ配列番号１）、
転写物Ｂ：ＳＯＸ２（ｍＲＮＡ配列番号２）、
転写物Ｃ：ＫＬＦ４（ｍＲＮＡ配列番号３）、
転写物Ｄ：ＭＹＣ（ｍＲＮＡ配列番号４）、
転写物Ｅ：ＮＡＮＯＧ（ｍＲＮＡ配列番号５）、
転写物Ｆ：ＬＩＮ２８（ｍＲＮＡ配列番号６）および
転写物Ｇ：ＭＹＯＤ１（ｍＲＮＡ配列番号７）。
【００３７】
ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるのが望ましいその他のタンパク質は、以下に論じるように表現型決定において役割を有する以下のものを含む：Ａｓｃｌ１（ｍＲＮＡ配列番号８）、ＰＵ．１（ｍＲＮＡ配列番号９）、Ｃ／ＥＢＰα（ｍＲＮＡ配列番号１０）、Ｃ／ＥＢＰβ（ｍＲＮＡ配列番号１１）、Ｎｇｎ３（ｍＲＮＡ配列番号１２）、Ｐｄｘ１（ｍＲＮＡ配列番号１３）、Ｍａｆａ（ｍＲＮＡ配列番号１４）およびＥｓｒｒｂ（ｍＲＮＡ配列番号１５）またはそれらの生物学的に活性な断片もしくは改変体。
【００３８】
タンパク質の完全な名称は：ＯＣＴ４＝ＰＯＵクラス５ホメオボックス１；ＳＯＸ２＝ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２；ＫＬＦ４＝クルッペル様因子４（腸）；ＭＹＣ＝ｖ−ｍｙｃ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子相同体（トリ）；ＮＡＮＯＧ＝Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＬＩＮ２８＝ｌｉｎ−２８相同体（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）；ＭＹＯＤ１＝筋原性分化１；ＡＳＣＬ１＝ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体相同体１（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；ＳＰＩ１＝脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロウイルス組み込み癌遺伝子ｓｐｉ１；ＣＥＢＰＡ＝ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、アルファ；ＣＥＢＰＢ＝ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、ベータ；ＮＥＵＲＯＧ３＝ニューロゲニン３；ＰＤＸ１＝膵臓および十二指腸ホメオボックス１；ＭＡＦＡ＝ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維腫症癌遺伝子相同体Ａ（トリ）；ならびにＥＳＲＲＢ＝エストロゲン関連受容体ベータである。
【００３９】
表１は、試験したか（それらの具体的な例を含める）またはこれらの遺伝子の１つもしくは複数の同じファミリーの密接に関連するメンバーであるかのいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の名称を示す。本明細書において「類似体」という密接に関連する遺伝子ファミリーメンバーが、しばしば、同じ生物学的な活性を有し、よって、これらは交換可能に用いることができることが公知である。それぞれのタンパク質の遺伝子記号を第１列に示す。このリストは、あるいくつかの類似体および改変体を、それらのｍＲＮＡ受託番号とともに含む。
【００４０】
あるいくつかの実施形態は、表１のタンパク質またはそれらの生物学的に活性な断片、類似体もしくは改変体のいずれかをコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを対象とする。
【００４１】
【表１−１】

【００４２】
【表１−２】

ＭＹＯＤ１は、支配的遺伝子である。ＭＹＯＤ１を線維芽細胞（非筋細胞）に形質導入することが、それらを筋芽細胞（筋細胞）に分化転換させるために十分であることが示されている。支配的遺伝子は、細胞の遺伝子発現プログラムを制御する調節ネットワークの最高レベルにある遺伝子である。支配的遺伝子は、通常、複数の遺伝子の発現を直接制御する転写因子であり、それらの遺伝子の多くが、次いで、より多くの遺伝子の発現を制御して、細胞の遺伝子発現プログラムを確立する。１つまたは複数の支配的遺伝子の発現を誘導することは、多くの場合において、支配的遺伝子を通常発現する細胞型への細胞の分化、分化転換または脱分化を誘導することが示されている。７つの２本鎖ＤＮＡ鋳型も設計したが、これらは、それぞれのＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物を作製するように転写された。本明細書に記載する実験で用いた７つのｉｖＴ−ＲＮＡ転写物は、
５’ ｍ７Ｇキャップ２’−Ｏ−メチル化第２ヌクレオチド−ＩＲＥＳを有する安定５’ＵＴＲ／強力なコザック／コードされるタンパク質配列（ＣＤＳ）／安定３’ＵＴＲ／ポリＡテイル ３’
という構造を有した。
【００４３】
ｉｖＴ−鋳型アセンブリおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ＨＵＳＫ鋳型を設計して作製するための詳細を、実施例２に示す。本明細書に記載する実験で用いたＨＵＳＫ鋳型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成する構築物に作動可能に連結した強いＴ７プロモーターを５’端に含むＤＮＡ分子であり、該ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡは、最も単純な実施形態において（ｉ）安定５’ＵＴＲと、（ｉｉ）タンパク質コード配列（ＣＤＳ）に連結した強力なコザックコンセンサス配列ＲＣＣ（ＡＵＧ）Ｇとを有する。鋳型は、さらに、５’ＵＴＲをコザックコンセンサス配列につなぐ第１制限部位（以下に示すようにＮｈｅｌ部位）と、ＣＤＳを３’ＵＴＲにつなぐ第２制限部位（以下に示すようにＡｇｅｌ部位）とを含んだ。
【００４４】
その他の強いプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６を含む。例示的な鋳型は、安定ＨＢＢ ＵＴＲを有する。強力なコザック配列、ＣＤＳおよび安定３’ＵＴＲを適切な部位に挿入できる任意の制限部位を用いることができる。実施形態は、以下に示す鋳型を対象とする。
【００４５】
【化１】

あるいくつかの実施形態は、本明細書に記載する７つの鋳型（ならびに当技術分野において公知の異なるプロモーター、安定ＵＴＲ、制限部位および強力なコザック配列を有する改変体）を対象とする。好ましい実施形態において、鋳型は、タンパク質Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８およびＭｙｏＤまたはそれらの生物学的に活性な断片、類似体もしくは改変体をコードする。
【００４６】
その他の実施形態は、使用者が、対象のタンパク質をコードする任意の核酸、好ましくはｍＲＮＡを挿入することを可能にするキットを対象とする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを用いてタンパク質またはペプチドを発現するためのこのようなキットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成する構築物に作動可能に連結した強力な転写プロモーターを有し、その第１鎖が、作動可能な組合せで（ｉ）安定５’ＵＴＲと、（ｉｉ）該５’ＵＴＲをコザックコンセンサス配列につなぐ第１制限部位とを含むＤＮＡ鋳型を含む。使用者は、強力なコザックを有するＣＤＳと適当な相補的制限部位とを設計して、ＣＤＳを鋳型に結合させることができる。キットは、さらにプライマーを含んで、逆転写ＲＮＡからＣＤＳを創出してよい。ＣＤＳは、制限部位と接続されなければならず、コザックとＣＤＳとの間にいずれの間隔もあり得ないので、制限部位はコザックの５’端上になければならず、よって、コザックは、使用者のＣＤＳと接続されなければならない。
【００４７】
その他の実施形態において、キットは、以下の１つまたは複数を含んでよい：プロモーターを認識してそれと結合するポリメラーゼ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行うために適切な緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の混合物、第１および第２制限部位を認識する制限酵素、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応が一旦完了したら用いた鋳型を分解するためのＤＮアーゼ酵素溶液、５’ ｍ７Ｇキャップを生成するためのキャップ付加酵素、２番目のヌクレオチドにメチル基を付加するための２−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素、ＧＴＰの溶液、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の溶液、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ酵素（例えばＥ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＡＴＰの溶液、およびポリ（Ａ）テイル付加反応のための緩衝液。キットは、さらに、陽性対照として用いるためのＤＮＡ鋳型を含んでよい。
【００４８】
転写物合成
種々のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ鋳型を作製するために用いるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、実施例２に記載するようにＨ９ヒト胚性幹細胞から得られ、逆転写ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ：転写物Ａ＝ＯＣＴ４、転写物Ｂ＝ＳＯＸ２、転写物Ｃ＝ＫＬＦ４、転写物Ｄ＝ＭＹＣ、転写物Ｅ＝ＮＡＮＯＧ、転写物Ｆ＝ＬＩＮ２８および転写物Ｇ＝ＭＹＯＤ１から増幅された。高忠実度ポリメラーゼを、ｄｓＤＮＡ鋳型合成の全ての段階において用いて、配列の誤りを最小限にした。変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動を行って、転写物がポリアデニル化の前に予測されたサイズを有し、これらが分解されておらず、ポリアデニル化反応が、効率的な翻訳を推進するために十分な長さのポリ（Ａ）テイルを付加したことを確認した。全長転写物は、それぞれの鋳型から生成されたが、完了した反応も、早期終結転写物および分解転写物の組合せとして同定される多量の低分子量生成物を含有した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（すなわちｉｖＴ−ＲＮＡへの鋳型の転写）を約４〜３７℃、好ましくは１０℃に約２０時間下げることにより、生成される全長転写物の画分の量が劇的に増加した。４℃と１５℃の間の温度が推奨されるが、実験条件に基づいて変動してよい。キャップ付加ポリ（Ａ）＋転写物は、Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応において、上記の７つの直鎖状ｄｓＤＮＡ鋳型から合成した。
【００４９】
細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの送達
ＭＲＣ−５ヒト胎児肺線維芽細胞を、この研究のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクションのためのモデルとして選択した。なぜなら、これらは、培養が容易であり、老化の開始前に数世代の倍加を経ており、初代細胞として、腫瘍形成の可能性により患者に対して安全性におけるリスクを示し得る不死化細胞系よりも細胞に基づく療法の開発のためにより適当なモデルであるからである。さらに、ＭＲＣ−５線維芽細胞は、転写物Ａ〜Ｆによりコードされるタンパク質を内因的に発現せず、このことは、ｉｖＴ−ＲＮＡからのタンパク質翻訳の分析を容易にする。
【００５０】
２つの核酸送達技術、すなわち脂質媒介トランスフェクションおよびエレクトロポレーションが、細胞に一過的にトランスフェクトするために一般的に用いられる。脂質媒介トランスフェクションは、エンドサイトーシスによる核酸の能動的な取り込みを刺激するが、エレクトロポレーションは、核酸が高濃度で存在する溶液中に細胞が存在する間に細胞膜中の孔を一過的に開放することにより核酸を送達する。この違いのために、一般的に、脂質媒介トランスフェクションは、通常の成長に近い条件下（しばしば血清を含まないが通常の培養培地、通常の播種密度および細胞が付着培養で成長するならば培養皿に接着する）で細胞に核酸を送達するために、より適切である。
【００５１】
エレクトロポレーションおよび脂質トランスフェクション以外のトランスフェクション技術を用いることができる。これらは、１．衝撃トランスフェクション（遺伝子銃としても、微粒子銃トランスフェクションとしても知られる）、２．マグネトフェクション（Ｓｃｈｅｒｅｒら、「Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ： ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｏｒｃｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． ９巻、１０２〜１０９頁、２００２年を参照されたい）、３．ペプチド媒介トランスフェクション（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＮ−ＴＥＲ（商標）トランスフェクションシステムのような非共有結合ペプチド／ＲＮＡナノ粒子に基づくトランスフェクション、またはＲＮＡへのペプチドの共有的接着による）および４．マイクロインジェクションを含む。連続的にまたは同時にこれらの技術を用いる組合せも用いることができる。細胞に核酸を導入するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明の実施形態において用いてよい。
【００５２】
生成されたＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡが初代細胞により、コードされるタンパク質に容易に翻訳されるかを決定するために、転写物Ａ、ＢおよびＦを、ＭＲＣ−５線維芽細胞の培養物に、脂質媒介トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、方法を参照されたい）を用いて送達し、細胞を２４時間後に、各転写物によりコードされるタンパク質に対する抗体を用いて染色した。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした培養細胞の多くは明るく染色され、染色は正しく局在化されたが、模擬トランスフェクトした細胞は、低いレベルのバックグラウンド蛍光だけを示した。転写物Ａ〜Ｆによりコードされるタンパク質を通常発現するＨ９ ｈＥＳ細胞は、同様の染色パターンおよび強度を示し、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡからＭＲＣ−５線維芽細胞においてトランスフェクションの２４時間後にこれらの条件下で発現される、コードされるタンパク質のレベルが、Ｈ９細胞により内因的に発現されるレベルに匹敵することを示した。ウェスタンブロット分析は、同様の結果を生じた。
【００５３】
脂質媒介トランスフェクションは、細胞にＲＮＡを送達するための単純な方法であるが、一般的に低いレベルのエンドサイトーシスを示す初代細胞の培養物にトランスフェクトするために用いる場合は効率が悪いことが公知である。さらに、脂質は、脂質媒介トランスフェクション効率を増加させるためにしばしば用いられる補助的な核酸縮合化合物と同様に、ある程度の細胞傷害性を有する。脂質を用いてトランスフェクトされた細胞は迅速に回復し得るが、脂質媒介トランスフェクション試薬に関連するいずれの細胞傷害性も、反復してトランスフェクトされる細胞において悪化し得る。
【００５４】
上記のＭＲＣ−５線維芽細胞において達成されたＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質発現の所望のレベルに到達するために、高濃度の脂質−ＲＮＡ複合体を用いるトランスフェクションが必要であった。このレベルを超えて細胞に送達されるＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの量を増加させることにより、生存性が減少した。よって、懸濁物中の細胞のエレクトロポレーションを試した。エレクトロポレーションは能動的な取り込みを必要としないが、代わりに、細胞膜をとおして核酸を直接送達する。細胞膜をエレクトロポレーションの間だけ一過的に透過にするので付着細胞にエレクトロポレーションすることができるが、エレクトロポレーション緩衝液中の核酸の濃度は、効率的な細胞内濃度を達成するために高くなければならない（１００μｇ／ｍＬ ＲＮＡの値がしばしば用いられる）。この理由から、エレクトロポレーションは、一般的に、懸濁細胞にトランスフェクトするために最も適切であり、エレクトロポレーション手順中に細胞を高濃度で懸濁できるので、少量のＲＮＡを用いた多数の細胞へのトランスフェクションを可能にする。
【００５５】
エレクトロポレーションのパラメータは、ＭＲＣ−５線維芽細胞にｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトし、外因性転写物を特異的に検出するように設計されたプライマーを用いる定量ＲＴ−ＰＣＲによりトランスフェクション効率を測定することにより最適化した。２ｍｍギャップを有する標準的なエレクトロポレーションキュベット中で、１４５Ｖまで充電した１５０ｕＦコンデンサから、５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁した２．５×１０^６の細胞に放電することにより、高い生存性（播種の２時間後に細胞の７０〜９０％が付着性）を維持しながら、標準曲線法を用いて決定して１０，０００コピーを超えるＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡが細胞あたりに十分に反復送達された。さらなる実験により、細胞にＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを効率的にトランスフェクトするために必要な電圧が、エレクトロポレーションの間の細胞密度に依存することが明らかになった。１４５Ｖが２．５×１０^６細胞／５０μＬの密度の細胞にトランスフェクトするために必要であったが、同じ効率（細胞あたり同じコピー数）で１×１０^６細胞／５０μＬの密度で細胞にトランスフェクトするためにわずかに１１０Ｖを用いた。日常的な実験により、それぞれの具体的なトランスフェクションについての最適条件が決定される。
【００５６】
ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡは、高い細胞内安定性を有し、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡからのタンパク質翻訳は高度に効率的である。
【００５７】
未改変ｍＲＮＡをコードするｉｖＴ−ＲＮＡに対してＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの安定性および翻訳効率を比較するために、ＯＣＴ４をコードする全長転写物Ａを、天然に存在する内因性ＵＴＲと、内因性ＯＣＴ４ ｍＲＮＡに関連する未改変コザック配列とを含む内因性ｍＲＮＡ の完全配列を含む鋳型を用いて合成した。対照的に、ＨＵＳＫ転写物は、ＨＢＢ ＵＴＲと強力なコザックコンセンサス配列とを有した。ＲＮアーゼＡを培養培地に１００μｇ／ｍＬの濃度で加えて、測定を行う前に細胞外ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを排除した。それぞれのＨＵＳＫ転写物の濃度は、トランスフェクションのおよそ１７〜１８時間後に、２時間でのそのレベルの２５％に達したが、全長転写物の濃度は、トランスフェクションのおよそ１０時間後に、２時間でのそのレベルの２５％に達し、このことは、ＨＵＳＫ転写物の細胞内安定性が、対応する全長転写物のものより著しく高く、２つのＨＵＳＫ転写物Ａ／ＯＣＴ４およびＦ／ＬＩＮ２８の安定性が同等であることを示した。
【００５８】
図２Ｂは、ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡ細胞内安定性のより詳細な測定を示す。簡単に述べると、ＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＳＴＡＴ２およびＴＬＲ３を標的にするｓｉＲＮＡカクテルを予備トランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞（以下の本文および方法を参照されたい）に、０．５μｇのＬＩＮ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡとさらなるｓｉＲＮＡとを時間０にて同時トランスフェクトした。細胞が接着した後に、２００μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡを培養培地に加えて、細胞外ＲＮＡを分解した。細胞を、記載する時間に溶解し、ＬＩＮ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡの量を、外因性転写物に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより測定した。指数回帰（黒色の線、Ｒ^２＝０．９６）を示す。ＧＡＰＤＨを内因性対照として用いた。誤差バーは、反復試料の標準偏差を示す。
【００５９】
ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの翻訳効率を、ＨＢＢ ＵＴＲまたは改変コザックコンセンサス配列を有さない対応する全長転写物のものと比較するために、ＭＲＣ−５線維芽細胞に、キャップ付加ポリ（Ａ）テイル付加ＨＵＳＫ転写物Ａ／ＯＣＴ４または全長内因性転写物Ａ／ＯＣＴ４のいずれかをトランスフェクトし、コードされるタンパク質を１２時間後に抽出し、ウェスタンブロットにより分析した。結果は、エレクトロポレーションの１２時間後に、ＨＵＳＫ転写物Ａをトランスフェクトした細胞は、全長転写物をトランスフェクトした細胞のおよそ２倍多くのコードされるタンパク質を含有したことを示し、このことは、ＨＵＳＫ設計に基づくｉｖＴ−ＲＮＡを細胞にトランスフェクトすることが、全長内因性未改変転写物のトランスフェクションよりも、転写物あたり著しくより多くのコードされるタンパク質の産生をもたらすことを示した。
【００６０】
コードされるタンパク質の濃度が、ｉｖＴ−ＲＮＡを１回だけトランスフェクトした細胞において経時的にどのように変化するかを理解するために、細胞に、ＨＵＳＫ転写物Ａ／ＯＣＴ４、転写物Ｂ／ＳＯＸ２または転写物Ｆ／ＬＩＮ２８をトランスフェクトした。タンパク質を６時間ごとに４８時間抽出し、ウェスタンブロットにより分析した。ＨＵＳＫ転写物ＡまたはＢのいずれかをトランスフェクトした細胞におけるコードされるタンパク質のレベルは迅速に増加し、トランスフェクションのおよそ１２時間後にピークになり、次いで、３０時間後にほとんど検出不可能なレベルまで迅速に減少した。図３Ａ。対照的に、ＨＵＳＫ転写物Ｆによりコードされるタンパク質のレベルは迅速に増加し、その最大値にトランスフェクションのおよそ１８〜２４時間後に達し、次いで４８時間の間かなり一定のままであり、このことは、ＨＵＳＫ転写物Ｆ／ＬＩＮ２８によりコードされるタンパク質が、ＨＵＳＫ転写物Ａ／ＯＣＴ４およびＢ／ＳＯＸ２によりコードされるタンパク質よりも著しくより安定であったことを示した。さらなる分析により、ＨＵＳＫ転写物Ｆ／ＬＩＮ２８によりコードされるタンパク質が、これらの条件下でトランスフェクトした場合におよそ３日の細胞内半減期を有したことを明らかにした（示さず）。図３Ｂは、より詳細なタンパク質発現分析の例を示し、本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクション後のタンパク質発現の用量応答性を示すデータを含む。簡単に述べると、ＭＲＣ−５線維芽細胞に、記載するＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡをトランスフェクトし、全細胞可溶化液を、記載する時間に調製した。代わりに、ＭＲＣ−５線維芽細胞に、記載する量のＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡをトランスフェクトし、全細胞可溶化液をピークタンパク質発現の時間に調製した。次いで、コードされるタンパク質をウェスタンブロットにより検出した。
【００６１】
自然免疫応答の抑制は、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションから細胞をレスキューする
ｍ７Ｇキャップ付加ポリ（Ａ）テイル付加ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞は、予測されたように自然免疫応答を開始した^５４。模擬トランスフェクトした細胞は、２４時間以内に通常の集団倍加時間を達成して迅速に回復したが、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、およそ３６時間増殖できなかった。これらは次いで回復し、トランスフェクションの４８時間後にしか通常の倍加時間を達成しなかった。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの細胞分裂停止効果の持続期間は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの測定された細胞内寿命に大まかに相当した（図２Ａ）。短い（２４時間未満）および長い（４８時間より長い）寿命の両方を有するタンパク質をコードする転写物のトランスフェクションは、同様の結果を生じた（図４Ｂ）。これらの結果は、細胞増殖の低減が、コードされるタンパク質ではなくＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ自体に対する反応であることを示す。
【００６２】
ｐ５３のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンが、ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした細胞の回復速度を増加し、ｐ５３媒介細胞周期抑止および／またはアポトーシスが、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの観察された細胞分裂停止効果に寄与することを示すことが発見された（図５）。２００ｎＭのＴＰ５３ ｓｉＲＮＡを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でエレクトロポレーションされたＭＲＣ−５線維芽細胞において決定されたＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの細胞分裂停止効果は、この図に示される。細胞を、１０ｃｍ皿に、皿あたり２．５×１０^６細胞の密度で第０日に播種した。２日後に、細胞をトリプシン処理により懸濁し、記載するようにして３．５μｇのＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡまたは３．５μｇのＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡと２００ｎＭ ＴＰ５３ ｓｉＲＮＡとをエレクトロポレーションした。第０日にｓｉＲＮＡを受けた細胞だけが、第２日にさらなるｓｉＲＮＡを受けた。それぞれの皿の集密度を、数日間監視した。ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡをトランスフェクトしなかった細胞（四角、菱形）は、２回目のエレクトロポレーション後に迅速に回復して第３．５日に集密に近付いたが、ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡをトランスフェクトした細胞（三角）は、成長の遅延を示し、第６日にしか集密に近付かなかった。興味深いことに、ＴＰ５３ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞（×）は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ送達後に回復速度の増加を示し、第５日に集密に近付いたが、このことは、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの細胞分裂停止効果が、ｐ５３依存性経路の活性化を部分的に原因とし得ることを示した。ＴＰ５３は、ｐ５３として公知のタンパク質をコードするヒト遺伝子の名称である。データ点は、明確化のためにつないでいる。
【００６３】
外因性ＲＮＡトランスフェクションにより活性化されるいくつかの自然免疫経路が公知である。Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）^{５３、５４}、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）^５５およびレチノイン酸受容体応答因子（タザロテン誘導）３（ＲＡＲＲＥＳ３）^{５６〜５８}は、ヒトにおいてＲＮＡが公知の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）である３パターン認識受容体（ＰＲＲ）である。外因性ＲＮＡがこれらの受容体により一旦検出されると、これらは、培養培地中に分泌され、そこで細胞膜関連受容体と結合するサイトカインであるインターフェロン−β（ＩＦＮＢ１）を上方制御する細胞内シグナル伝達のカスケードを始動する。これらの受容体は、次いで、成長阻害、真核生物翻訳開始因子２−アルファキナーゼ２（ＥＩＦ２ＡＫ２）媒介翻訳阻害^{５９、６０}、細胞をＰＡＭＰに対して過敏化するＰＲＲの上方制御、および細胞により分泌されるＩ型インターフェロンの上方制御（これらは全て、免疫応答を増幅する）を特徴とする完全な自然免疫応答を導くシグナル伝達カスケードを始動する。さらに、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＩＳＧ２０およびＩＦＩＴ１のような多くのインターフェロン活性化遺伝子（ＩＳＧ、インターフェロン応答性遺伝子またはＩＲＧとしても公知である）が、Ｉ型インターフェロンへの曝露に応答して上方制御されるようになる。制御されなければ、自然免疫応答はアポトーシスを導くことができる。
【００６４】
ＩＦＮＢ１発現を測定するために行った定量ＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＦＮＢ１が、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした細胞において、模擬トランスフェクトした細胞と比較して、トランスフェクションの２４時間後に７５００倍過剰発現されたことが明らかになった。ＴＬＲ３およびＲＡＲＲＥＳ３の＞５０倍の過剰発現、シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）の＞１０倍の過剰発現、ならびにシグナル伝達性転写因子２（ＳＴＡＴ２）およびＥＩＦ２ＡＫ２の＞５倍の過剰発現もあり、これらのことは、Ｉ型インターフェロン応答および外因性ＲＮＡに対する細胞の過敏化を示す（図６）。
【００６５】
ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答が、ＲＮＡの長さまたは配列により影響されるかを決定するために、細胞にＨＵＳＫ転写物Ａ、ＢもしくはＦまたは全長未改変内因性転写物Ａをトランスフェクトした。ＩＦＮＢ１発現を、２４時間後に測定した（図４Ａ）。驚くべきことに、ＨＵＳＫ転写物Ｆと全長転写物Ａは、ＨＵＳＫ転写物ＡまたはＢよりも模擬トランスフェクトした細胞と比較して１０〜２０倍少ないＩＦＮＢ１過剰発現を惹起した。全長内因性転写物ＡのトランスフェクションがＨＵＳＫ転写物Ａのトランスフェクションよりも少ないＩＦＮＢ１過剰発現をもたらしたという観察結果は、全長転写物の細胞内寿命がより短いことにより説明できるとみられる。しかし、ＨＵＳＫ転写物ＦのトランスフェクションがＨＵＳＫ転写物ＡまたはＢのいずれかのトランスフェクションよりも２０倍少ないＩＦＮＢ１過剰発現をもたらしたという観察結果は、自然免疫応答が、３つ全ての転写物に存在するＨＢＢ ＵＴＲにより主に引き起こされたのでないことを示した。代わりに、これらのデータは、自然免疫応答の強さが、ＲＮＡの全体の長さまたはＣＤＳ中の配列エレメントに依存することを示す。
【００６６】
１本鎖ＲＮＡが公知のＰＡＭＰであるＰＲＲであるｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）がＭＲＣ−５線維芽細胞において発現されないという事実に基づいて（ＲＴ−ＰＣＲデータは示さず）、１本鎖ＲＮＡがＴＬＲ３を活性化することが示された。対照的に、２本鎖ＲＮＡが公知のＰＡＭＰである２つのＰＲＲであるＴＬＲ３およびＲＡＲＲＥＳ３は発現され、他者による以前の観察結果も、ｉｖＴ−ＲＮＡおよびｍＲＮＡがＴＬＲ３依存性自然免疫応答を惹起できることを示した^{５４、６１}。理論によって拘束されるものではないが、長いｓｓＲＮＡ分子が、ＴＬＲ３および／またはその他のｄｓＲＮＡ特異的ＰＲＲと結合して、それによりそれらを活性化し得る重要な２次構造を有することができる可能性がある。より２次的な構造を有するより長いｓｓＲＮＡ分子は、より２次的でない構造を有するより短いｓｓＲＮＡ分子よりも強い自然免疫応答を惹起する可能性がある。この仮説は、ＨＵＳＫ転写物Ａと比較してＨＵＳＫ転写物Ｆ転写物のトランスフェクションに起因するＩＦＮＢ１の過剰発現のより低いレベルを説明できる。なぜなら、ＨＵＳＫ転写物Ａは、ＨＵＳＫ転写物Ｆよりおよそ２倍長いからである。また、ＩＦＮＢ１過剰発現の観察された差は、試験した３つのＨＵＳＫ転写物中に存在する特定の配列エレメントによる可能性がある。
【００６７】
自然免疫応答は、公知のＰＡＭＰである外因性ＲＮＡの頻繁な反復送達に基づく延長一過性トランスフェクションのいずれの方策にとっても著しい障害になる。自然免疫応答を妨害するために、ＩＦＮＢ１を標的にするｓｉＲＮＡを細胞に導入して、その発現をノックダウンした。ＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡをＭＲＣ−５線維芽細胞に、エレクトロポレーションにより、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとともにまたはそれなしで送達した。ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞が、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に模擬トランスフェクトした細胞と比較して１０，０００倍のＩＦＮＢ１の過剰発現を示したが、ｓｉＲＮＡとＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとの両方を受けた細胞は、模擬トランスフェクトした細胞と比較してわずか５０〜１００倍のＩＦＮＢ１の過剰発現を示し、これは、９９〜９９．５％のノックダウン効率に相当した（図７Ｂ）。
【００６８】
ＲＮＡｉ機構に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの前にｓｉＲＮＡの位置を定めてそれを結合させるより長い時間を与えるために、細胞にｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションし、４８時間成長させ、次いで、ｓｉＲＮＡとＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとの両方を再びエレクトロポレーションした。日常的な実験により、ｓｉＲＮＡ施与と最初のトランスフェクションとの間のより短いかまたはより長い間隔を用いることができるかを決定できる。この実験において、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞は、模擬トランスフェクトした細胞と比べて７５００倍のＩＦＮＢ１の過剰発現を示したが、ｓｉＲＮＡを受けた細胞は、模擬トランスフェクトした細胞と比べて１５倍のＩＦＮＢ１の過剰発現を示し、これは、９９．８％のノックダウン効率に相当した（図７Ａ）。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡだけを受けた細胞においてＩＦＮＢ１過剰発現が異なることは、ＭＲＣ−５細胞により内因的に発現されるＩＦＮＢ１の非常に低いレベルにおける小さい変動による可能性がある。この理由のために、過剰発現のレベルは、実験間ではなく実験内でのみ比較すべきである。なぜなら、それぞれの実験は、独立した模擬トランスフェクション対照を有し、これに対してその実験内の全ての発現データを標準化するからである。
【００６９】
他の公知の遺伝子またはｍＲＮＡを標的にする同じ業者から商業的に入手可能なｓｉＲＮＡを用いるＭＲＣ−５線維芽細胞におけるエレクトロポレーションで観察されたノックダウン効率は、典型的には、８０％と９０％の間である（図９および図１０）。用いた商業的に入手可能なｓｉＲＮＡを、それらの製品番号とともに表Ａ１に列挙する。ｓｉＲＮＡ業者は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｂｉｏｎ、ＰｒｏｍｅｇａおよびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを含む。我々が用いたｓｉＲＮＡは全て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの「Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ」ｓｉＲＮＡであった。
【００７０】
観察されたＩＦＮＢ１ノックダウンの高い効率は、十分なＩＦＮＢ１ ｍＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構により破壊されて、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起された自然免疫応答のインターフェロン−β媒介増幅が妨害されたことを示す。このことは、自然免疫応答に関与するいくつかのその他の遺伝子が、模擬トランスフェクトした細胞と比べてまだ過剰発現しているが、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞よりもＩＦＮＢ１を標的にするｓｉＲＮＡを受けた細胞において著しくより少なく過剰発現されるとの観察結果と一貫している（図７）。特に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡだけを受けた細胞において５０〜６０倍過剰発現しているＰＲＲであるＴＬＲ３およびＲＡＲＲＥＳ３は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとの両方を受けた細胞において２０〜３０倍過剰発現している。さらに、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２およびＥＩＦ２ＡＫ２は全て、細胞にＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとを同時トランスフェクトした場合に、模擬トランスフェクトした細胞と比べて過剰発現のレベルの同様の低減を示した。
【００７１】
ｓｉＲＮＡにより媒介されるＩＦＮＢ１ノックダウンは、ＭＲＣ−５細胞においてＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答に関与するいくつかのタンパク質の過剰発現を低減させたが、自然免疫は、ＰＲＲであるＴＬＲ３およびＲＡＲＲＥＳ３の＞２０倍の過剰発現、ならびにＩＦＮＢ１、ＳＴＡＴ１およびＥＩＦ２ＡＫ２の＞５倍の過剰発現の残存により示されるように、これらの細胞において完全に阻害されなかった。ＩＦＮＢ１ノックダウンについての実験は、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクト細胞において観察される増殖の阻害にほとんどまたは全く影響しないことが観察され（図８）、このことは、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとの両方をトランスフェクトした細胞において、ＩＦＮＢ１発現の低い残存レベルが細胞の増殖を妨げるために十分であるか、またはインターフェロン−αシグナル伝達のようなインターフェロン−βとは独立した仕組みにより、細胞が増殖することが妨げられているかのいずれかであることを示す。詳細は、実施例３に示す。
【００７２】
ヒト自然免疫応答経路における公知のタンパク質は、ＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５、ならびにそれらの生物学的に活性な断片、類似体および改変体を含む。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて標的にできるこれらの自然免疫応答タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび遺伝子配列を表３に列挙し、ここでは、これらを公式受託番号で指定する。完全ｍＲＮＡおよび遺伝子配列は、容易に入手可能である。当業者は、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡを作製して、以下に記載されるような日常的な実験を用いて、種々の標的タンパク質をコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡまたはその両方の転写に干渉することにより、これらのタンパク質のいずれの発現も低減できる。その他の動物は、ヒトタンパク質と高い程度の配列相同性を有する密接に関連するタンパク質を発現する。これらの類似体も、抑制の標的にできる。自然免疫応答を開始するいずれの細胞も、ヒト細胞と同様に処理でき、ヒトにおいて働くｓｉＲＮＡおよびアンチセンスヌクレオチドの多くは、応答を抑制するためにその他の動物細胞において働く。
【００７３】
自然免疫応答は、多くの重複性を含む細胞内および細胞外のシグナル伝達経路により始動して調節されるが、多くのウイルスは、自然免疫シグナル伝達を妨害する仕組みを進化させて、持続感染を可能にしている（ｓｓＲＮＡウイルスであるＣ型肝炎による自然免疫妨害の最近の概説については、Ｂｏｄｅ、２００７年を参照されたい）。自然免疫シグナル伝達に関与する１つまたは複数の因子のＲＮＡｉノックダウンが、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答を阻害するかを試験するために、ＴＬＲ３、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＶＩＳＡ、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＴＰ５３およびＣＤＫＮ１Ａを標的にするｓｉＲＮＡの種々の組合せを、細胞にエレクトロポレーションにより送達し、４８時間後に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとさらなるｓｉＲＮＡとの２回目のエレクトロポレーションを行った。ＩＦＮＢ１およびノックダウンについて標的にされる遺伝子の発現のレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲにより２回目のエレクトロポレーションの２４時間後に測定した（図９Ａ〜Ｃ；図１０Ａ、Ｂ）。トランスフェクションは、２回の独立した実験に分けて、試料取り扱い時間を最小限にした。トランスフェクトした細胞を数日間監視し、集密度の推定を各日に行って、選択した遺伝子のノックダウンが細胞増殖に対して影響を有したかを決定した（図９Ｄ、図１０Ｃ）。
【００７４】
選択した遺伝子のいずれのノックダウンも、ＩＦＮＢ１過剰発現の著しい低減をもたらしたが、ＳＴＡＴ２またはＥＩＦ２ＡＫ２のノックダウンだけについて、細胞増殖に対する影響が観察された。よって、実施形態において、ノックダウンカクテルは、ＳＴＡＴ２もしくはＥＩＦ２ＡＫ２の発現を低減するｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＳＴＡＴ２またはＥＩＦ２ＡＫ２のいずれかをノックダウンすることの影響は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクション後の回復時間の短縮を特徴とした。両方の場合において、ｓｉＲＮＡとＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとを同時トランスフェクトした細胞は、ｓｉＲＮＡのない対照について必要であった４８時間とは反対に、およそ３６時間後に模擬トランスフェクトした細胞と同じレベルの集密度に達することが観察された。トランスフェクションのわずか２４時間後にｓｉＲＮＡのない対照と比較してノックダウン細胞の集密度の増加をもたらした（図５）ＴＰ５３ノックダウンとは反対に、ｓｉＲＮＡのない対照と比較してＳＴＡＴ２およびＥＩＦ２ＡＫ２ノックダウン細胞の集密度の増加が、トランスフェクションの４８時間後に最初に観察され、このことは、ＳＴＡＴ２またはＥＩＦ２ＡＫ２のノックダウン単独が、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答を阻害するために不十分であり、これらの遺伝子をノックダウンすることが、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡが細胞により分解された後の回復速度の増加に寄与し得ることを示した。
【００７５】
自然免疫応答は、培養培地中にインターフェロン−βのような炎症性サイトカインの蓄積を伴うので、培養培地を、トランスフェクション後すぐに少なくとも１回置き換えて（好ましくはトランスフェクション後の１５分と４８時間との間、より好ましくはトランスフェクション後の２時間と１２時間との間）、これらのサイトカインを除去し、よって、自然免疫応答をさらに抑制できる。
【００７６】
小分子阻害剤およびｓｉＲＮＡの使用に加えて、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクション後に放出されるサイトカイン（例えばＩ型インターフェロン）に対する抗体、およびこれらのサイトカインの受容体（例えばインターフェロン−アルファ受容体）に対する抗体を培養培地に加えて、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答を抑制できる（ＬａＦｌｅｕｒら、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−κ， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．」Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６巻、４３号、２００１年を参照されたい）。ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドとともにまたは単独で抗体を用いて、免疫応答を抑制できる。好ましい実施形態において、抗体は、マウス抗ヒトＩＦＮ−α／β受容体鎖２（ＣＤ１１８）（クローン：ＭＭＨＡＲ−２、ＩｇＧ２ａ、ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）のようなモノクローナル抗体である。
【００７７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの反復送達による延長一過性トランスフェクションは、複数回の細胞分裂をとおして、コードされるタンパク質発現の高いレベルを維持する
本明細書に記載する結果は、ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質の準安定発現（形質導入タンパク質発現ともいう）の増加が、培養細胞に適切なＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを、例えば約２４〜４８時間離れた間隔で頻繁に反復してトランスフェクトすることにより達成されたことを示す。この範囲は、細胞型、発現されるタンパク質などに基づいて変動する。（１）ＭＲＣ−５ヒト線維芽細胞の外因性ＲＮＡに対する自然免疫応答が、好ましくは１回目のトランスフェクション前に、自然免疫応答経路中のいくつかのタンパク質を標的にするｓｉＲＮＡカクテルを用いる組み合わせたノックダウンにより抑制され、（２）トランスフェクションが、細胞ストレスを最小限にするように設計されたエレクトロポレーションプロトコールを用いて遂行されたならば、模擬トランスフェクトした細胞と比較した、２４時間間隔での反復ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクション後の細胞増殖の通常の速度が維持できたこともさらに見出された。
【００７８】
ＨＵＳＫ転写物ＡおよびＢでの１回目のトランスフェクションの後の最初の１８〜２４時間中に初期に達成された発現の高いレベルを細胞の複数の世代、すなわち複数回の細胞分裂をとおして維持するために、前のトランスフェクションから例えば２４〜４８時間の間隔でさらなるトランスフェクションを行った。発現されたＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質の量は、免疫応答抑制を好ましくは少なくとも約４８時間ごとに反復することにより、複数回の細胞分裂にわたってさらに増加し、安定した。反復トランスフェクション法は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの反復送達による延長一過性トランスフェクションとよばれ、以下により詳細に記載される。コードされるタンパク質の長期の発現を複数回の細胞分裂をとおして達成することは、細胞を同期化し得るが、同期化させることを必要としないことに留意すべきである。免疫抑制およびトランスフェクションの頻度は、例えば細胞型および発現されるタンパク質に基づいて変動する。
【００７９】
ＩＦＮＢ１発現の低減およびトランスフェクション後の回復時間の短縮の両方により測定される、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答をある程度までそれぞれ軽減する３つの方法が同定された：１．ＴＰ５３ノックダウン、２．ＩＦＮＢ１ノックダウンによる自然免疫応答増幅妨害、および３．本明細書に記載される自然免疫抑制経路中のタンパク質を含む自然免疫シグナル伝達に関与するさらなる遺伝子のノックダウンによる自然免疫応答阻害。これらの３つの方法を組み合わせて、細胞にＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを、それぞれのコードされるタンパク質の細胞内寿命と同等のトランスフェクション頻度を用いて反復してトランスフェクトして、複数回の細胞分裂をとおして持続された高いレベルの発現を達成できるかを決定した。反復トランスフェクションの好ましい頻度は、それぞれのコードされるタンパク質の細胞内寿命とほぼ等しい。コードされるタンパク質の下流の標的が高度に安定であるならば、トランスフェクションの頻度は、例えばその下流のタンパク質の細胞内寿命により決定してよい。このことは、トランスフェクトした細胞の表現型を変更することが目標である場合に特に重要である。
【００８０】
ＭＲＣ−５線維芽細胞に、ｓｉＲＮＡ混合物１（４００ｎＭ ＴＰ５３、２００ｎＭ ＳＴＡＴ２および２００ｎＭ ＥＩＦ２ＡＫ２）またはｓｉＲＮＡ混合物２（４００ｎＭ ＴＰ５３、２００ｎＭ ＳＴＡＴ２、２００ｎＭ ＥＩＦ２ＡＫ２、２００ｎＭ ＩＦＮＢ１、２００ｎＭ ＴＬＲ３および２００ｎＭ ＣＤＫＮ１Ａ）をトランスフェクトし、次いで、数日の期間にわたってＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを反復してトランスフェクトした。ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした細胞において＞５倍過剰発現されることが以前に見出された遺伝子（ＴＬＲ３、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＢ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２およびＥＩＦ２ＡＫ２）の発現と、ＴＰ５３およびＣＤＫＮ１Ａの発現とを、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡでの１回目のトランスフェクションの２４時間後に測定して、これらの条件下でのそれぞれのｓｉＲＮＡのノックダウン効率と、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答を阻害する各ｓｉＲＮＡ混合物の効率とをともに決定した（図１１Ａ）。
【００８１】
図１３Ａ〜Ｆは、それぞれの核酸での単独または反復トランスフェクション後の種々のＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡによりコードされるタンパク質の下流の標的の応答を示す。これらの結果は一緒に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡでの反復トランスフェクションが、多くの日数にわたって持続できる機能的タンパク質の高いレベルを生じることを示す。
【００８２】
ｓｉＲＮＡ混合物１をトランスフェクトした細胞において、測定した全ての遺伝子の発現は、模擬トランスフェクトした細胞と比較して低減し、いくつかの遺伝子（ＴＬＲ３、ＩＦＮＢ１、ＳＴＡＴ２およびＥＩＦ２ＡＫ２）は＞９０％ノックダウンを示した。ｓｉＲＮＡ混合物２をトランスフェクトした細胞において、測定した遺伝子の多くの発現は、さらに低減され、これらの細胞においてＲＡＲＲＥＳ３およびＳＴＡＴ１（ｓｉＲＮＡが標的にしない２つの遺伝子）だけが、模擬トランスフェクトした細胞と比較して、＞５倍過剰発現されたが、これらはともに、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞におけるよりも著しく少なく過剰発現された。
【００８３】
図１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄならびに表１は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションからのｓｉＲＮＡトランスフェクションによるレスキューのより詳細な分析について記載する。図１１Ｂ。ＭＲＣ−５線維芽細胞に、０．５μｇのＬｉｎ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを４８時間間隔で２回トランスフェクトした。図１１Ｃは、（１１Ｂ）と同様にしてトランスフェクトしたが、第２日に模擬トランスフェクトし、第４日に０．５μｇのＬｉｎ２８またはＭｙｏＤ１をコードするＨＵｓＫｅ ｉｖＴ−ＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞を示す。遺伝子発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後にＲＴ−ＰＣＲにより測定した（第５日）。値は、模擬トランスフェクトした細胞と比べて示す。図１１Ｄは、（１１Ｂ）と同様にしてトランスフェクトしたが、第２日にＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＳＴＡＴ２およびＴＬＲ３を標的にするｓｉＲＮＡのカクテルで、そして第４日に０．５μｇのＬｉｎ２８またはＭｙｏＤ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのいずれかとさらなるｓｉＲＮＡとをトランスフェクトした細胞を示す。遺伝子発現を、２回目のトランスフェクションの２４時間後に測定した（第５日）。値は、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞と比較して示す。これらの結果は、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションが、増殖の低減および自然免疫経路における遺伝子の過剰発現を特徴とする自然免疫応答を惹起し、自然免疫経路中の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡの組合せを細胞にトランスフェクトすることにより、ｓｉＲＮＡが標的にする遺伝子の過剰発現が低減されるだけでなく、自然免疫経路中のその他の遺伝子の過剰発現も低減し、このことが、自然免疫応答の全般的な抑制を示すことも示した。表１のデータは、自然免疫経路中の少数の遺伝子（具体的にＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２およびＳＴＡＴ２）を同時にノックダウンすることが、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションから細胞をレスキューするために十分であることを明確に証明する。これらの遺伝子の組み合わせたノックダウンは、これらの条件下でｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより引き起こされた増殖の低減を排除し、よって、ｉｖＴ ＲＮＡでの頻繁な反復されたトランスフェクションを特に可能にした（細胞はそうでなければ生存しなかった）。
【００８４】
表２は、ＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２およびＳＴＡＴ２の組み合わせたノックダウンが、ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした細胞をレスキューすることを示す表を示す。ＭＲＣ−５線維芽細胞に、図１１Ｂと同様にしてトランスフェクトしたが、第０日にｓｉＲＮＡを、そして第２日および第４日に０．５μｇのＬｉｎ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとさらなるｓｉＲＮＡとをトランスフェクトした。２回目のｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に（第５日）、細胞の試料をトリプシン処理して計数した。値は、模擬トランスフェクトした細胞と比べた細胞密度を表す。
【００８５】
【表２】

図３に示すように、ＨＵＳＫ転写物Ｂのトランスフェクションは、およそ１８〜２４時間の著しいタンパク質発現をもたらしたが、ＨＵＳＫ転写物Ｆのトランスフェクションは、４８時間を超える著しいタンパク質発現をもたらした。ＨＵＳＫ転写物Ｆのトランスフェクション後の発現の時間発展のさらなる分析により、この転写物によりコードされるタンパク質が、そのピークレベルのおよそ５０％に、トランスフェクションの３日後に達したことが明らかになった。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクションは、増殖の低下をもたらしたので、これらの実験において測定したタンパク質発現の持続期間は、細胞が活性に増殖した場合よりも著しくより長かったと考えられる。
【００８６】
タンパク質の持続した高いレベルを達成するために、細胞にＨＵＳＫ転写物Ｂを２４時間間隔で３回、またはＨＵＳＫ転写物Ｆを４８時間間隔で２回トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞のそれぞれの皿の集密度を監視して、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとｓｉＲＮＡ混合物１または２との同時トランスフェクションの細胞増殖に対する影響を決定した（図１２）。細胞は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡでの１回目のトランスフェクションから回復したが、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞の多くは、２回目のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの後に、模擬トランスフェクトした細胞と比較して＞１００倍のＴＬＲ３の過剰発現および＞５０倍のＲＡＲＲＥＳ３の過剰発現により示されるように、おそらく外因性ＲＮＡに対する過敏化のために死滅した。ｓｉＲＮＡ混合物１または２のいずれかを受けた細胞は、各トランスフェクション後に高い生存性を示し、増殖の指標であるこれらの培養物の集密度は、実験をとおして模擬トランスフェクトした細胞のものの１０％以内のままであった。興味深いことに、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを２４時間間隔で３回トランスフェクトした細胞は、これらの培養物の集密度が各日におよそ１０％しか低下しないほど十分に迅速に回復した。取り扱いによる試料損失（トリプシン処理、エレクトロポレーションキュベットへのまたはそこからの移動など）と、各トランスフェクション後に細胞のおよそ１０〜１５％をタンパク質およびＲＮＡ分析のために保存したこととにより、観察された回復速度は、２４時間間隔での無限の数のトランスフェクションを可能にするのに十分高い可能性がある。
【００８７】
全細胞可溶化液を、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡでの１回目のトランスフェクション（第２日）後の１２時間ごとに調製し、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルを、ウェスタンブロットにより評価した。細胞に、ｓｉＲＮＡだけを第０日にトランスフェクトし、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡでの１回目のトランスフェクションを第２日に行った。ＡＣＴＢをローディング対照として用いた。転写物Ｆによりコードされるタンパク質のレベルは、そのピークレベルのおよそ５０％に、単独トランスフェクションの３日後に達した。対照的に、転写物Ｆで２回トランスフェクトした細胞は、１回目のトランスフェクション後の第３日をとおしてタンパク質発現の高いレベルを維持し、これは、２回目のトランスフェクション後にわずかに増加し、次いで、そのピークレベルのおよそ５０％に、第７日、すなわち１回目のトランスフェクションの５日後であって２回目（そして最後）のトランスフェクションの３日後に下落した。このタンパク質発現プロファイルは、トランスフェクトした細胞が迅速に増殖する（図１２Ｂ）という事実と一緒に、転写物Ｆによりコードされるタンパク質のほぼ定常状態レベルが、４８時間間隔の反復トランスフェクションによってさえ多くの細胞分裂にわたって維持されたことを示す。
【００８８】
しかし、対照的に、転写物Ｂによりコードされるタンパク質は、各トランスフェクションの１２時間後に高度に発現されたが、各トランスフェクションの２４時間後にはほとんど検出不可能であり、各トランスフェクションの結果として生成されたタンパク質のほとんどが、次のトランスフェクションを行う時間までに分解されたことを示した。日常的な実験により、より頻繁なトランスフェクションまたはより多量のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクションのようなタンパク質発現の所望のレベルを達成するための最良のプロトコールが決定される。
【００８９】
３日間の半減期を有するタンパク質（ＬＩＮ２８−転写物Ｆ）について、この技術を用いる２回のトランスフェクション（４８時間）は、有効タンパク質半減期を５日間に延長し、トランスフェクション後の最初の３日間にタンパク質発現の安定で高いレベルが観察された。より不安定なタンパク質（１８〜２４時間の細胞内寿命、転写物Ｂ−ＳＯＸ２）の２４時間間隔での反復トランスフェクションは、それぞれのトランスフェクションの１２時間後にタンパク質発現の高いレベルを生じ、これは次のトランスフェクションの前に低下し、このことは、より頻繁なトランスフェクションが、短い細胞内寿命を有するタンパク質の発現の安定したレベルを達成するために要求され得ることを示した。１つまたは複数のタンパク質を、トランスフェクトした細胞において表現型変化を誘導するレベルで発現させることをが目標である場合、タンパク質発現の高いレベルは、標的遺伝子のエピジェネティックな状態を改変するために各細胞周期中の短い時間だけ必要であると考えられる。日常的な実験により、遺伝子活性化を達成するために十分なタンパク質発現の安定したレベルをどのように達成するかが示される。
【００９０】
あるいくつかの実施形態は、ａ．ＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５、またはそれらの生物学的に活性な断片もしくは類似体（以下、「免疫抑制タンパク質」）からなる群より選択される自然免疫応答経路中の１つまたは複数のタンパク質の発現を低減する作用物質の有効量を細胞に導入することにより、１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラのいずれかであり得る核酸のトランスフェクションに対する細胞の自然免疫応答を抑制する方法を対象とする。好ましい実施形態において、作用物質は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの組合せである。この実施形態は、自然免疫応答を、１つもしくは複数の免疫抑制タンパク質、またはタンパク質もしくは小分子の生物学的な活性を低減する抗体を用いて抑制することをさらに含むことができる。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量により、標的タンパク質の発現を低減する量を意味する。免疫抑制タンパク質のヒトバージョンをコードするｍＲＮＡおよび遺伝子の受託番号は、表３に示す。ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質を用いる場合と同様に、ヒト免疫抑制タンパク質は、所望の生物学的な活性を有し、よって抑制の標的にできるようにヒトタンパク質との十分な量の配列相同性を有するその他の動物種における類似体を有する。当業者は、以下の関連する項に記載される日常的な実験を用いて任意のこれらのタンパク質の発現を低減するためのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製できる。
【００９１】
本明細書で用いたものを含む、免疫抑制タンパク質の多くを標的にする小型阻害ＲＮＡが、商業的に入手可能である。任意の自然免疫応答タンパク質をコードするｍＲＮＡ または遺伝子の翻訳を遮断する２以上のｓｉＲＮＡの混合物を含む組成物は、商業的に入手可能なｓｉＲＮＡの混合物の混合物を含んで、本発明の範囲内である。好ましい組成物は、以下に記載するｓｉＲＮＡ混合物１および２、ならびにＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２およびＳＴＡＴ２を標的にするｓｉＲＮＡの混合物を含む。
【００９２】
免疫抑制薬を用いて、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される免疫応答を低減してよい。ほとんどは、特定の免疫細胞（リンパ球など）の活性化を妨げて作用するが、これらの薬物のいくつかは、広範囲の細胞型においてある程度活性な経路に対して作用する。免疫抑制薬の使用は、延長一過性トランスフェクション法をｉｎ ｖｉｖｏで用いる場合に特に重要である。一般的な免疫抑制薬は、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、サリドマイド、レナリドマイド、アナキンラ、シロリムス、デフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムスおよびゾタロリムスを含む。あるいくつかの実施形態は、細胞をこれらの免疫抑制薬の１つと接触させるステップを含む、核酸をトランスフェクトした細胞における免疫応答を抑制する方法を対象とする。
【００９３】
「ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ阻害剤」とよばれるＥＩＦ２ＡＫ２によりコードされるタンパク質の阻害剤は、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売され（ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ阻害剤、カタログ番号５２７４５０）、単独または上記のｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて自然免疫応答を抑制するために用いてもよい。さらに、Ｂ１８Ｒ（「組換えＢ１８Ｒタンパク質、ワクシニアウイルスによりコードされる中和Ｉ型インターフェロン受容体；Ｉ型ＩＦＮ阻害剤」としてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．により販売される、カタログ番号１４−８１８５）のようなＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害剤を、単独または上記のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ阻害剤と組み合わせて用いて、自然免疫応答を抑制してもよい。
【００９４】
【表３−１】

【００９５】
【表３−２】

別の好ましい実施形態において、免疫抑制は、少なくとも約４８時間ごとに反復する。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、衝撃トランスフェクション、マグネトフェクション、ペプチド媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションまたはそれらの組合せにより達成できる。その他の実施形態は、細胞に、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらのキメラを含む核酸を、ａ．）前記細胞の自然免疫応答を抑制し、ｂ．）前記核酸を前記細胞に導入することによりトランスフェクトする方法を対象とする。
【００９６】
実施形態において、核酸分子は、タンパク質またはその生物学的に活性な断片もしくは類似体をコードする。核酸がＤＮＡ分子である実施形態において、これは、所望のｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ前駆体である短いヘアピンＲＮＡ）、またはｌｎＲＮＡ（遺伝子を開始できる長いノンコーディングＲＮＡ）をコードするものであってよい。核酸は、１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子および２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子または１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡ／ＲＮＡキメラであり得る。ステップａとｂの間に、細胞を、自然免疫応答の抑制およびコードされるタンパク質またはＲＮＡの翻訳をそれぞれ可能にする時間および条件下でインキュベートする。好ましい実施形態において、核酸は、１本鎖ｉｖＴ−ＲＮＡ、好ましくはＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡである。ステップａおよびｂは、逐次的または同時であり得る。好ましい実施形態において、細胞は、コードされるタンパク質または標的タンパク質の発現を所望のレベルに維持するために必要な頻度の反復免疫抑制およびトランスフェクションを受ける。別の実施形態において、ステップａ．）を初めて行う場合、これは、ステップｂ．）の約２４〜７２時間前まで行う。好ましい実施形態において、トランスフェクションの頻度は、コードされるタンパク質の細胞内寿命とほぼ等しい。別の実施形態において、トランスフェクトするステップａ．）は、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、衝撃トランスフェクション、マグネトフェクション、ペプチド媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションまたはそれらの組合せを用いて遂行される。
【００９７】
本発明の方法および構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで用いることができる。ｉｎ ｖｉｖｏならば、好ましい構築物は、細胞の永続的な遺伝的改変がないようにＲＮＡ、好ましくはＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを含有する。
【００９８】
トランスフェクトされる細胞は、動物細胞、好ましくはヒト細胞、または細菌、酵母、真菌および植物であり得る。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡでの反復トランスフェクションは、コードされるタンパク質の発現を増加し、持続させる。動物細胞と同様に、細菌、酵母および真菌は、長いヌクレオチドのトランスフェクションに応答して免疫を開始するが、免疫応答タンパク質は、動物における応答とは異なる。免疫応答の抑制および反復トランスフェクションの新しい方法も、記載される免疫応答タンパク質を標的にすることによりこれらの生物において働く。
【００９９】
今日までの実験の結果は、１つのｓｉＲＮＡトランスフェクションが、免疫応答を約４８時間抑制したことを示した。抑制の持続期間は、トランスフェクトされる細胞の型に基づいて変動し得る。よって、日常的な実験により、最適なｓｉＲＮＡ処置スケジュールが決定される。あるいくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンストランスフェクションステップは、標的タンパク質（自然免疫応答タンパク質）抑制の所望のレベルを維持するのに必要な頻度で反復される。これは、典型的には、少なくとも４８時間ごとに１回である。ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトする細胞の自然免疫応答の抑制は、後続の各ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションごとに反復できるか、またはｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションが４８時間ごとよりも頻繁であるならば、より少ない頻度であり得る。
【０１００】
あるいくつかのその他の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡのような核酸のトランスフェクションに対する自然免疫応答が抑制された細胞と、免疫抑制されかつ核酸をトランスフェクトした細胞とを対象とする。
【０１０１】
小分子阻害剤およびｓｉＲＮＡの使用に加えて、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクション後に放出されるサイトカイン（例えばＩ型インターフェロン）に対する抗体、および任意の自然免疫応答タンパク質またはこれらのサイトカインについての受容体（例えばインターフェロン−アルファ受容体）に対する抗体を培養培地に加えて、ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答を抑制できる（ＬａＦｌｅｕｒら、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−κ， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．」Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６巻、４３号、２００１年を参照されたい）。
【０１０２】
あるいくつかのその他の実施形態において、核酸送達と組み合わせた自然免疫応答を抑制する方法は、例えば一過性もしくは安定なＤＮＡトランスフェクションまたはｓｈＲＮＡのウイルス形質導入により、あるいはノックアウト動物または自然免疫応答経路中の１つもしくは複数の遺伝子の突然変異を有する動物に由来する細胞の使用またはこれらの任意の組合せにより、免疫応答を遺伝的に抑制するステップを含む。遺伝的に形質転換された細胞は、異なるｉｖＴ ＲＮＡをスクリーニングして、例えば異なる所望の表現型変化を作製するために必要なｉｖＴ ＲＮＡを見出すために用いることができる。
【０１０３】
ｉｖＴ−ＲＮＡをコードするタンパク質の発現による表現型の変更
図１３Ａ〜Ｆは、それぞれの核酸を用いる単独および反復トランスフェクション後の種々のＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡによりコードされるタンパク質の下流の標的の応答を示す。これらの結果は一緒に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡでの反復トランスフェクションが、多くの日数にわたって持続できる機能的タンパク質の高いレベルを生じることを示す。
【０１０４】
より具体的に、図１３Ａは、ＩＦＮＢ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＳＴＡＴ２およびＴＬＲ３を標的にするｓｉＲＮＡのカクテルを予備トランスフェクトした後に、０．５μｇのＬｉｎ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとさらなるｓｉＲＮＡとを４８時間間隔で５回トランスフェクトしたＭＲＣ−５線維芽細胞の応答を示す。細胞を、記載する時間に溶解し、各試料中のＬｉｎ２８タンパク質の量を、ウェスタンブロットにより評価した。ＡＣＴＢをローディング対照として用いた。この図からわかるように、Ｌｉｎ２８タンパク質発現の高いレベルが、１回目のトランスフェクションの後１０日を超えて細胞において持続された。図１３Ｂは、トランスフェクションの１８時間後に測定した、模擬トランスフェクトした細胞におけるレベルと比較した成熟ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡのレベルを示す。平滑化した線は、１回（実線）および５回（点線）トランスフェクトした細胞に相当するデータ点をつないで描かれる。Ｕ４７ ＲＮＡを内因性対照として用いた。誤差バーは、反復試料の標準誤差を示す。これらのデータは、トランスフェクトしたＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡからの細胞により生成されるコードされるタンパク質（この場合はＬｉｎ２８）が、その予測される生物学的機能を保持し、高度に活性であることを明確に示す。ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡは、Ｌｉｎ２８タンパク質の公知の標的である。予測されるように、Ｌｉｎ２８タンパク質をｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより発現することは、ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡの低下を引き起こした。
【０１０５】
図１３Ｃは、ｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡと記載する本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとをトランスフェクトした細胞によるＨＭＧＡ２発現の量を示す。ＨＭＧＡ２発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定したが、これを、ＲＮＡを受けていない細胞と比較して示す。Ｓｏｘ２タンパク質は、ＨＭＧＡ２の下方制御を引き起こすことが公知であるので、細胞にＳｏｘ２をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡをトランスフェクトした２４時間後に観察されるＨＭＧＡ２の低減は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡから生成されるＳｏｘ２タンパク質が、転写抑制因子としてのその生物学的な活性を保持し、高度に活性であったことを示す。図１３Ｄは、Ｓｏｘ２（黒色の四角）、Ｌｉｎ２８（黒色の丸）またはＳｏｘ２とＬｉｎ２８との両方（中抜きの三角）をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを２４時間間隔で３回トランスフェクトした細胞によるＨＭＧＡ２発現の量をさらに示す。ＨＭＧＡ２発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより記載する時間に測定したが、これを、模擬トランスフェクトした細胞と比べて示す。ＨＭＧＡ２は、ｌｅｔ７ ｍｉＲＮＡの公知の標的であり、ｌｅｔ７ ｍｉＲＮＡは、Ｌｉｎ２８タンパク質の公知の標的であるので、Ｌｉｎ２８をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡをトランスフェクトした細胞で観察されるＨＭＧＡ２発現の増加は、単独タンパク質をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡのトランスフェクションが、直接の標的と下流の標的との両方の発現の変化を引き起こすために十分であることを示し、このことは、細胞の遺伝子発現パターンの調節におけるＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの有用性を証明する。
【０１０６】
図１３Ｅは、ＭｙｏＤ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした、５−アザ−ｄＣを用いてまたは用いずに培養したＣＣＤ−１１０９Ｓｋ成体皮膚線維芽細胞を示す。ＣＤＨ１５およびＤＥＳの発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより記載する時間に測定した。これらの結果は、ＭｙｏＤ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡをトランスフェクトした細胞が、転写活性化因子としてのその生物学的な活性を維持するＭｙｏＤ１タンパク質を生成することを示す。さらに、これらの結果は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションを、脱メチル化剤５−アザ−ｄＣのような小分子と組み合わせて、コードされるタンパク質の効果を増進することの有用性を証明する。なぜなら、ＣＤＨ１５およびＤＥＳ（ＭｙｏＤ１の２つの標的）の発現が、５−アザ−ｄＣに曝露した細胞において、この化学物質に曝露していない細胞と比較して、およそ１０倍増進されるからである。図１３Ｆは、（１３Ｅ）と同様にしてトランスフェクトした試料から回収した全細胞可溶化液中でウェスタンブロットにより測定したＭｙｏＤ１タンパク質のレベルを示す。これらの結果は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ ＲＮＡによりコードされるタンパク質は迅速に分解され得るが、下流の標的に対する効果は、コードされるタンパク質が分解された後に長く存続できることを示す（ＣＤＨ１５の発現は、トランスフェクションの２４時間後、ＭｙｏＤ１タンパク質が分解された時間後にピークになることに留意されたい）。この結果は、トランスフェクションの目標が、以下に論じることと同様に細胞における表現型変化を引き起こすことである場合は、重要である。
【０１０７】
表４は、細胞をある型から別の型に変換するために今日までに用いられている公知のタンパク質因子および形質導入法の組合せを列挙する。しかし、これらの細胞型変換法は全て、ＤＮＡベクターに依存し、その結果、細胞は、医療用途のために安全でない可能性がある。対照的に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの反復送達による延長一過性トランスフェクションは、細胞型に影響するかまたはそれを変更することが公知のあるいくつかの内因性タンパク質の発現を増加することにより、これらのＤＮＡベクターに基づくアプローチに対して、表現型変化を達成するための安全な代替を提供する。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡのトランスフェクションおよび免疫抑制は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
【０１０８】
本発明のあるいくつかの実施形態は、細胞の表現型変化を引き起こすことが公知の特定のタンパク質をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの反復送達による延長一過性トランスフェクションにより細胞の表現型を変更する方法を対象とする。例えば、成体海馬幹細胞は、因子Ａｓｃｌ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを用いる自然免疫応答の抑制と組み合わせた反復トランスフェクションにより、オリゴデンドロサイトに分化させることができる。別の例において、膵臓外分泌細胞は、反復トランスフェクションと、因子Ｎｇｎ３およびＰｄｘ１をコードするＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを用いる自然免疫応答の抑制とにより、インスリン生成ベータ細胞に分化転換させることができる。本明細書に記載される新しい技術は、使用者が、１つまたは複数のそれぞれのＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡの所望の相対的な量を加えて、コードされるタンパク質の発現の所望のレベルを達成し、所望の表現型変化を引き起こすことを可能にする。その他の例は、表２に列挙される。１より多いタンパク質を発現させる必要がある場合、いくつかのタンパク質を単独転写物または異なる転写物にコードする選択肢があり、このことは、タンパク質発現の相対的な量のより精密な制御をもたらし得る。
【０１０９】
ｉｖＴ ＲＮＡによりコードされる１つまたは複数のタンパク質の発現を、反復トランスフェクションおよび免疫抑制を用いて増加させることにより細胞の分化、分化転換または脱分化を引き起こすその他の例は、以下の例を含む：
１．細胞が成体海馬幹細胞であり、コードされるタンパク質がＡｓｃｌ１であり、表現型変化が、オリゴデンドロサイトへの前記幹細胞の分化である；
２．細胞が神経幹細胞であり、該細胞に、それぞれＯｃｔ４、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードする異なるｉｖＴ ＲＮＡを各トランスフェクションステップにてトランスフェクトし、表現型変化が、多能性幹細胞への前記神経幹細胞の脱分化である。
３．細胞が非インスリン生成膵臓外分泌細胞であり、該細胞に、それぞれＮｇｎ３、Ｐｄｘ１およびＭａｆａタンパク質をコードする異なるｉｖＴ ＲＮＡを各トランスフェクションステップにてトランスフェクトし、表現型変化が、インスリン生成ベータ島細胞への前記非インスリン生成膵臓外分泌細胞の分化転換である；
４．細胞が線維芽細胞またはケラチノサイトであり、細胞に、それぞれＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードする異なるｉｖＴ ＲＮＡを各トランスフェクションステップにてトランスフェクトし、表現型変化が、多能性幹細胞への前記線維芽細胞の脱分化である。
５．細胞が、線維芽細胞、軟骨芽細胞、平滑筋細胞および網膜色素上皮細胞を含む群から選択されるメンバーであり、コードされるタンパク質がＭｙｏＤであり、所望の表現型変化が、筋芽細胞への前記細胞の分化転換である。
６．細胞が線維芽細胞であり、コードされるタンパク質がＰＵ．１およびＣ／ＥＢＰα／βであり、所望の表現型変化が、マクロファージへの前記線維芽細胞の分化転換である。
【０１１０】
その他の実施形態において、所望の表現型変化は、軸策のような突起の増殖、接着、遊走または成長である。
【０１１１】
【表４】

ＪｅｓｓｂｅｒｇｅｒらおよびＺｈｏｕらはともに、ｉｎ ｖｉｖｏで行われた細胞型変換実験について記載している。本発明のＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物は、ｉｎ ｖｉｖｏで用いることができ、細胞の永続的な遺伝的変化を引き起こす危険性を有さない。
【０１１２】
規定された因子をＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより発現させることに加えて、細胞において新しい遺伝子発現プログラムを確立することを、現在の細胞型により発現されるが標的細胞型により発現されないあるいくつかの因子の発現を阻害することにより増進できる。例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸およびトリコスタチンＡは、多能性幹細胞の誘導、すなわち所望の標的細胞型へのそれらの脱分化を増加させることが示されている。（Ｈｕａｎｇｆｕら、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．」Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００８年を参照されたい）。脱メチル化剤５−アザ−２’−デオキシシチジンは、多能性幹細胞への体細胞の脱分化を増進することが示されている。（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、「Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．」Ｎａｔｕｒｅ． ２００８年を参照されたい）、そしてＧ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤ＢＩＸ−０１２９４は、多能性幹細胞への神経幹細胞の脱分化を促進することが示されている。（Ｓｈｉら、「Ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．」Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２巻、２００８年を参照されたい）。さらに、これらの小分子の標的および所望の表現型変化を阻害するその他の標的は、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用により直接阻害できる。我々は、例えば、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼを標的にするｓｉＲＮＡを、単独または自然免疫応答およびｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションを抑制するように設計されたｓｉＲＮＡカクテルとの組合せで用いて、このタンパク質の発現を著しく低減できることを示している。
【０１１３】
上記のように、活性な増殖は、頻繁なトランスフェクションに伴う細胞傷害性を最小限にするために重要である。このために、増殖を抑制することが公知のいくつかの遺伝子（ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１およびＴＰ５３を含む）の発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いて低減することも、ｉｖＴ−ＲＮＡにコードされるタンパク質の発現および細胞生存性を改良する。あるいくつかの実施形態は、核酸をトランスフェクトした細胞の細胞増殖を、以下の１つまたは複数を抑制することにより増加することを対象とする：ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１およびＴＰ５３。その他の実施形態において、細胞の表現型を変更する方法は、前記細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（バルプロ酸またはトリコスタチンＡ）、５−アザ−２’−デオキシシチジンのような脱メチル化剤またはＧ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤ＢＩＸ−０１２９４と接触させて、所望の表現型変化を最適化するステップをさらに含む。
【０１１４】
医薬品の将来は、細胞型を制御するための技術に基づく療法を特徴とする。疾患または損傷で失われた細胞、組織および臓器の置換は、体の損傷された領域への移植のために新しい組織特異的細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで作製する方法を必要とする。細胞にＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質をトランスフェクトすることは、これらの組織特異的細胞を、幹細胞の分化をｉｎ ｖｉｔｒｏで導くことにより作製する手段だけでなく、細胞型の特異化および維持を制御する分子経路を、これらのプロセスに関与する種々のタンパク質を選択的に過剰発現させることにより解明する手段も提供する。ＤＮＡトランスフェクションにより細胞を形質転換することは、安定な遺伝子発現を達成する単純な方法であるが、遺伝子改変により細胞型を変化させることにより生じる安全性の問題は、再生医薬品の用途におけるこの技術の使用を制限する可能性がある。ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡでの一過性トランスフェクションにより細胞型を制御することは、以前の方法に対する改良を提供する。なぜなら、これらの分子は、それらの機能を一旦行うと、細胞により代謝され、提供者から遺伝的に区別不可能なようになるからである。ＲＮＡのトランスフェクションは、特に、２つの重要な利点を提供する：１．ＲＮＡは、妥当な長さおよび公知の配列の任意のタンパク質についてｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に合成でき、２．タンパク質の多くのコピーが、細胞により各ＲＮＡ分子から合成でき、送達されなければならない物質の量を最小限にし、よって、細胞ストレスを最小限にする。
【０１１５】
タンパク質改変体
本発明は、典型的に、特に所望の表現型変化を引き起こす対象の内因性タンパク質をコードするｍＲＮＡから作製されるｉｖＴ−ＲＮＡを用いることを対象とするが、有用で新規な特徴を提供するこれらの内因性タンパク質の生物学的に活性なタンパク質改変体に翻訳されるｉｖＴ−ＲＮＡを用いることが有用であり得る。あるいくつかのタンパク質改変体またはコードされるタンパク質は、例えば、その他の可能性のある特徴のうちで、安定性を増加させるためまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タグを含めて蛍光顕微鏡によりコードされるタンパク質のリアルタイムでの視覚化を可能にするために工学的に操作できる融合タンパク質を含む。よって、ｉｖＴ−ＲＮＡは、それぞれの内因性タンパク質に実質的に相同であるタンパク質改変体をコードできる。本発明の目的のために、タンパク質の類似体は、天然に存在し、所望の生物学的な活性を保持する実質的に相同なタンパク質を含む。
【０１１６】
本明細書で用いる場合、アミノ酸配列が、少なくとも約７０〜７５％、典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％、９７％、９８％または９９％以上相同である場合に、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は実質的に相同である。実質的に相同なアミノ酸配列は、対応する核酸配列またはその部分に、以下により詳細に記載されるストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされる。
【０１１７】
ｉｖＴ−ＲＮＡは、芳香族フェニルアラニントリプトファンチロシン疎水性ロイシンイソロイシンバリン極性グルタミンアスパラギン塩基性アルギニンリジンヒスチジン酸性アスパラギン酸グルタミン酸小さいアラニンセリンスレオニンメチオニングリシンのような保存的アミノ酸置換を有する内因性タンパク質のコード配列を含むことができる。
【０１１８】
改変体ポリペプチドは、１つもしくは複数の置換、欠失、挿入、反転、融合および短縮化またはこれらの任意の組合せによりアミノ酸配列が異なり得る。改変体ポリペプチドは、完全に機能的であり得るか、または１つもしくは複数の活性における機能を欠くことができる。
【０１１９】
完全に機能的な改変体は、典型的に、保存的変異または重要でない残基もしくは重要でない領域での変異だけを含有する。機能的改変体は、機能の変更をもたらさないかもしくは重要でない変更をもたらす類似のアミノ酸の置換も含有し得る。代わりに、このような置換は、機能にある程度の正または負の影響を与えてよい。
【０１２０】
実質的な相同性は、対象の内因性タンパク質をコードするｍＲＮＡ全体、またはその生物学的に活性な断片もしくは改変体をコードするｍＲＮＡに対してであり得る。よって、断片は、タンパク質の１つまたは複数の生物学的な活性を保持する任意の長さを含み得る。断片は、不連続であり得る（その他のアミノ酸またはポリペプチドに融合されていない）か、またはより大きいポリペプチド内にあり得る。
【０１２１】
アンチセンス核酸
本発明のその他の実施形態は、ＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５またはそれらの生物学的に活性な断片もしくは改変体もしくは類似体（以下、「免疫抑制タンパク質」）を含む自然免疫応答に関連するあるいくつかのタンパク質の発現を低減または阻害するためのアンチセンス核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）または小型阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を対象とする。標的にされる免疫抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび遺伝子配列は、受託番号により本明細書に示される。これらの公知の配列に基づいて、発現を止めるために免疫抑制タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子もしくはｍＲＮＡと十分にハイブリダイズするアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを容易に設計して、当技術分野において公知の方法を用いて工学的に作製できる。
【０１２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物および人間における疾患状態の治療において治療成分として用いられている。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド薬物は、ヒトに安全にかつ効果的に投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。よって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように構成できる有用な治療様式であり得ることが確立されている。例えばＡｇｒａｗａｌ， Ｓ．およびＺｈａｏ， Ｑ．（１９９８年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． ２巻、５１９〜５２８頁；Ａｇｒａｗａｌ， ＳおよびＺｈａｎｇ， Ｒ．（１９９７年）ＣＩＢＡ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ． ２０９巻、６０〜７８頁；ならびにＺｈａｏ， Ｑら、（１９９８年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ８巻、４５１〜４５８頁（これらの内容全体は、本明細書で完全に述べられているかのごとく本明細書に参照により組み込まれる）を参照されたい。Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ．Ｏ．ら、（１９９６年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４０巻、２００４〜２０１１頁およびＢｏｒｃｈｅｒｓらによる米国特許第６，８２８，１５１号。
【０１２３】
アンチセンス核酸を作製する方法は、当技術分野において周知である。本明細書で用いる場合、「標的核酸」との用語は、免疫抑制タンパク質をコードする核酸（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）および該タンパク質をコードする遺伝子、ならびにそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡも包含する。核酸オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、標的核酸の通常の機能に干渉し、それにより、例えばｉｖＴ−ＲＮＡの翻訳が低減する。標的核酸と特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調整は、一般的に「アンチセンス」とよばれる。干渉されるＤＮＡの機能は、複製および転写を含む。干渉されるＲＮＡの機能は、例えばタンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳およびＲＮＡが従事するかもしくはＲＮＡにより促進され得る触媒活性のような全ての生命機能を含む。標的核酸機能のこのような干渉の全体的な影響は、それぞれのタンパク質の発現の調整である。本発明の関係において、「調整」とは、免疫抑制タンパク質についての遺伝子もしくはｍＲＮＡの発現の低減または阻害を意味する。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡである。
【０１２４】
標的化プロセスは、アンチセンス相互作用のために、免疫抑制タンパク質をコードする標的遺伝子もしくはｍＲＮＡ内の１つまたは複数の部位を決定して、所望の阻害効果が達成されるようにするステップを含む。本発明の関係において、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終結コドンを包含する領域である。当技術分野において公知であるように、翻訳開始コドンは典型的に５’−ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子中で；対応するＤＮＡ分子中で５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」ともよばれる。遺伝子の少数は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧは、ｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示されている。よって、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」との用語は、それぞれの場合の開始アミノ酸は典型的にメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であるが、多くのコドン配列を包含できる。真核生物および原核生物の遺伝子は、２以上の代替開始コドンを有することがあり、これらのいずれも、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件の組の下で翻訳開始のために優先的に利用され得ることも当技術分野において公知である。本発明の関係において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにｉｎ ｖｉｖｏで用いられる１つまたは複数のコドンのことをいう。しかし、日常的な実験により、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡの最適配列が決定される。
【０１２５】
遺伝子の翻訳終結コドン（または「停止コドン」）が、３つの配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）のうちの１つを有し得ることも当技術分野において公知である。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」との用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち５’または３’）への約２５〜約５０隣接ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の部分のことをいう。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」との用語は、翻訳終結コドンからいずれかの方向（すなわち５’または３’）への約２５〜約５０隣接ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の部分のことをいう。
【０１２６】
翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域のことをいうことが当技術分野において公知のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、効率的に標的にされ得る領域でもある。その他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分のことをいい、よって５’キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むことが当技術分野において公知の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ならびに翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分のことをいい、よって翻訳終結コドンとｍＲＮＡの３’端との間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むことが当技術分野において公知の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。
【０１２７】
改変体を、転写を開始または停止するための代替シグナルの使用により生成でき、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡが１つより多い開始コドンまたは停止コドンを有することができることも、当技術分野において公知である。代替開始コドンを用いたプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを起源とする改変体は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替開始改変体」として公知である。代替停止コドンを用いるこれらの転写物は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替停止改変体」として公知である。代替停止改変体のある具体的な型は、生成される複数の転写物が、転写機構による「ポリＡ停止シグナル」のうちの１つの代替選択に起因し、それによりユニークポリＡ部位にて終結する転写物を生成する「ポリＡ改変体」である。
【０１２８】
１つまたは複数の標的部位が一旦同定されると、標的に十分に相補的であり、すなわち標的と十分な特異性でハイブリダイズして、遺伝子発現および転写またはｍＲＮＡ翻訳を阻害する所望の効果を与えるアンチセンス核酸を選択する。
【０１２９】
本発明の関係において、「ハイブリダイゼーション」は、相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆向きフーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成により対形成する相補ヌクレオ塩基である。本明細書で用いる場合、「相補的」とは、２つのヌクレオチド間の正確な対形成の能力のことをいう。例えば、核酸のある位置のヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合できるならば、該核酸と該ＤＮＡまたはＲＮＡとは、その位置にて互いに相補的であるとみなされる。該核酸と該ＤＮＡまたはＲＮＡとは、各分子中の対応する位置の十分な数が、互いに水素結合できるヌクレオチドで占められている場合、互いに相補的である。よって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、核酸とＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間に安定で特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために用いられる用語である。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子との該化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの通常の機能に干渉して有用性の喪失を引き起こし、かつ特異的結合が所望される条件下、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合に生理的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にアッセイまたは細胞培養を行う条件下で非標的配列とのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１３０】
ストリンジェンシーの種々の条件を、以下に記載されるようにハイブリダイゼーションのために用いることができる。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的核酸の配列と１００％相補的である必要がないと当技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子との該化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの通常の機能に干渉して有用性の喪失を引き起こし、かつ特異的結合が所望される条件下、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合に生理的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にアッセイを行う条件下で非標的配列とのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１３１】
本明細書で用いる場合、「低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシー、高ストリンジェンシーまたは非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」との用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件について記載する。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６（参照により組み込まれる）で見出すことができる。この参考文献に水性または非水性法が記載され、どちらも用いることができる。本明細書で言及する特異的ハイブリダイゼーション条件は、次のとおりである：１）約４５℃での６倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、その後に０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で少なくとも５０℃での２回の洗浄（洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件について５５℃まで増加できる）の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、２）約４５℃での６倍ＳＳＣ中、その後に０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃での１または複数回の洗浄の中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、３）約４５℃での６倍ＳＳＣ中、その後に０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃での１または複数回の洗浄の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに好ましくは４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、その後の０．２倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃での１または複数回の洗浄である。非常に高いストリンジェンシー条件（４）は、好ましい条件であり、そうでないと記載しない限り用いられるものである。
【０１３２】
本発明の関係における核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物のオリゴマーあるいはポリマーのことをいう「オリゴヌクレオチド」を含む。この用語は、天然に存在するヌクレオ塩基と糖と共有的ヌクレオシド間（主鎖）結合とで構成されるオリゴヌクレオチド、および同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような改変または置換オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの増進、核酸標的との親和性の増進、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増進のような所望の特性のために、天然形よりもしばしば好まれる。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラも含まれる。
【０１３３】
アンチセンス核酸は、アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、それらに限定されないがオリゴヌクレオチド模倣物を含むその他のオリゴマーアンチセンス化合物も包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約５０ヌクレオ塩基（すなわち約８〜約５０の連結されたヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、約１２〜約３０ヌクレオ塩基を含むアンチセンス核酸である。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）核酸（オリゴザイム）および標的核酸とハイブリダイズしてその発現を調整するその他の短い触媒ＲＮＡまたは触媒核酸を含む。
【０１３４】
当技術分野において公知であるように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有的に連結したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに連結し得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接ヌクレオシドを互いに共有的に連結して、直鎖状ポリマー化合物を形成する。次いで、この直鎖状ポリマー構造の両端をさらにつないで環状構造を形成できる。しかし、開放直鎖状構造が一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成すると一般的にいわれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または主鎖は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。
【０１３５】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例は、改変主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義されるように、改変主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、主鎖中にリン原子を保持するもの、および主鎖中にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のため、および当技術分野において時折参照されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有さない改変オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドとみなすことができる。好ましい改変オリゴヌクレオチド主鎖は、例えば、通常の３’−５’結合を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、３−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートならびにボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’または２’から２’結合である反転極性を有するものを含む。反転極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合にて単独の３’から３’の結合、すなわち塩基性であり得る単独反転ヌクレオシド残基（ヌクレオ塩基は喪失しているかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。種々の塩、混合塩および遊離の酸の形態も含まれる。
【０１３６】
上記のリン含有結合の調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号（これらのあるものは本出願と共通して所有され、これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）を含む。その中にリン原子を含まない好ましい改変オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合複素原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖複素原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２要素部分を有するその他のものを含む。
【０１３７】
上記のオリゴヌクレオシドの調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号（これらのあるものは本出願と共通して所有され、これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）を含む。
【０１３８】
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち主鎖はともに、新規な基で置き換えられる。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。あるこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とよばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号（これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）を含む。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５４巻、１４９７〜１５００頁で見出すことができる。
【０１３９】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドと、複素原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド、特に上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ_２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ_２−−、−−ＣＨ_２−−Ｎ（ＣＨ_３）−−Ｏ−−ＣＨ_２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として公知］、−−ＣＨ_２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ_３）−−ＣＨ_２−−、−−ＣＨ_２−−Ｎ（ＣＨ_３）−−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−−および−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ_３）−−ＣＨ_２−−ＣＨ_２−−［ここで、天然ホスホジエステル主鎖は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ_２と表される］、ならびに上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖である。上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０１４０】
改変オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換糖部分も含有してよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の１つを２’位に含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−−、Ｓ−−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−−、Ｓ−−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、これらのアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルもしくはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルで置換されてよいかまたは置換されない）。特に好ましくは、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）．ｓｕｂ．ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）．ｓｕｂ．ｎＣＨ_３）］_２（ここで、ｎおよびｍは１〜約１０である）である。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の１つを２’位に含む：Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するための基もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基、ならびに同様の特性を有するその他の置換基である。好ましい改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−−Ｏ−−（２−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥとしても公知の２’−−Ｏ−−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ、１９９５年、７８巻、４８６〜５０４頁）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい改変は、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知の以下の実施例に記載される２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、およびこれもまた本明細書の実施例に記載される２’−ジメチルアミノ−エトキシエトキシ（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノ−エトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち２’−−Ｏ−−ＣＨ_２−−Ｏ−−ＣＨ_２−−Ｎ（ＣＨ_２）_２を含む。
【０１４１】
さらに好ましい改変は、２’−ヒドロキシル基が糖の環の３’または４’炭素原子に連結し、それにより二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。結合は、好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子とを橋架けするメチレン（−−ＣＨ_２−−）_ｎ基（ここで、ｎは１または２である）である。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記載される。
【０１４２】
その他の好ましい改変は、２’−メトキシ（２’−−Ｏ−−ＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’−アリル（２’−−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−改変は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位にあってよい。好ましい２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。同様の改変を、オリゴヌクレオチド上のその他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に作製してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有してもよい。このような改変糖構造の調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号（これらのあるものは本出願と共通して所有され、これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）を含む。
【０１４３】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオ塩基（当技術分野において単純に「塩基」としばしばよばれる）改変または置換も含んでよい。本明細書で用いる場合、「未改変」または「天然」ヌクレオ塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）と、ピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変ヌクレオ塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−−Ｃ．ｉｄｅｎｔ．Ｃ−−ＣＨ_３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのようなその他の合成および天然のヌクレオ塩基を含む。さらなる改変ヌクレオ塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）のような三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のようなＧ−クランプを含む。改変ヌクレオ塩基は、プリンまたはピリミジン塩基がその他の複素環で置き換えられたもの、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも含んでよい。さらなるヌクレオ塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｉ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０年に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１年、３０巻、６１３頁により開示されるもの、ならびにＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．、１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ， Ｂ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年により開示されるものを含む。これらのヌクレオ塩基のあるいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸２重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ， Ｂ．編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３年、２７６〜２７８頁）、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合はさらにより特に、現在で好ましい塩基置換である。
【０１４４】
あるいくつかの上記の改変ヌクレオ塩基およびその他の改変ヌクレオ塩基の調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号；および第５，６８１，９４１号（これらのあるものは本出願と共通して所有され、これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）、ならびに本出願と共通して所有され、これもまた本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５，７５０，６９２号を含む。
【０１４５】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞への取り込みを増進する１つもしくは複数の部分またはコンジュゲートを化学的に連結することを含む。本発明の化合物は、第１級または第２級ヒドロキシル基のような官能基と共有結合したコンジュゲート基を含み得る。本発明のコンジュゲート基は、介入物、受容体分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増進する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増進する基を含む。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナンスリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素を含む。薬力学的特性を増進する基は、本発明の関係において、オリゴマーの取り込みを改良し、分解に対するオリゴマーの耐性を増進し、かつ／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態特性を増進する基は、本発明の関係において、オリゴマーの取り込み、分布、代謝または排出を改良する基を含む。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号（その開示全体は、本明細書に参照により組み込まれる）に開示される。コンジュゲート部分は、それらに限定されないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９８９年、８６巻、６５５３〜６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．、１９９４年、４巻、１０５３〜１０６０頁）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、１９９２年、６６０巻、３０６〜３０９頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．、１９９３年、３巻、２７６５〜２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２年、２０巻、５３３〜５３８頁）、脂肪鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１年、１０巻、１１１１〜１１１８頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０年、２５９巻、３２７〜３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３年、７５巻、４９〜５４頁）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻、３６５１〜３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０年、１８巻、３７７７〜３７８３頁）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５年、１４巻、９６９〜９７３頁）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻、３６５１〜３６５４頁）、パルミトイル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１９９５年、１２６４、２２９〜２３７頁）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、１９９６年、２７７、９２３〜９３７頁）のような脂質部分を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、薬物活性成分、例えばアスピリン、ワルファリン、フェノルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質とコンジュゲートしてもよい。オリゴヌクレオチド−薬物コンジュゲートおよびそれらの調製は、米国特許出願第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１５日にファイル）（本明細書にその全体が参照により組み込まれる）に記載される。
【０１４６】
このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号（これらのあるものは本出願と共通して所有され、これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）を含む。
【０１４７】
所定の化合物中の全ての位置が均一に改変される必要はなく、実際に、上記の改変の１つより多くが、単独化合物またはオリゴヌクレオチド中の単独ヌクレオシドに導入されていればよい。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の関係において、それぞれが少なくとも１つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドでできている２つ以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞による取り込みの増加、および／または標的核酸についての結合親和性の増加をオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが改変されている少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質としての役割を果たし得る。例えば、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡの２重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、よって、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、このことにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が大きく増進される。その結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合に、同じ標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドを用いて同等の結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動と、必要であれば当技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術とにより日常的に検出できる。
【０１４８】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記のような２つ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／もしくはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成してよいか、またはこれらは、ＤＮＡおよびＲＮＡで作製してよい（よってＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）。このような化合物は、当技術分野において、ハイブリッドまたはギャップマーともよばれている。このようなハイブリッド構造の調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号（これらのあるものは本出願と共通して所有され、これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）を含む。
【０１４９】
本発明の化合物は、その他の分子、分子構造もしくは化合物の混合物、例えばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所もしくはその他の製剤と、取り込み、分布および／または吸収を支援するために混合、カプセル化、コンジュゲートあるいは会合してもよい。このような取り込み、分布および／または吸収を支援する製剤の調製について教示する代表的な米国特許は、それらに限定されないが、米国特許第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１５８号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；および第５，５９５，７５６号（これらのそれぞれは本明細書に参照により組み込まれる）を含む。
【０１５０】
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術により簡便にかつ日常的に作製してよい。このような合成のための装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者により販売される。当技術分野において公知のこのような合成のための任意のその他の手段を、さらにまたは代わりに採用してよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような核酸を調製するために同様の技術を用いることが周知である。本発明のアンチセンス化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、生物起源のアンチセンス組成物、またはアンチセンス分子のｉｎ ｖｉｖｏ合成を導くように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【０１５１】
小型阻害ＲＮＡ
短い（１８〜３０ｂｐ）ＲＮＡの２重鎖を培養哺乳動物細胞に導入した場合に、標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害が、インターフェロン応答を誘導することなく実現できることが示されている。小型阻害ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）とよばれるあるいくつかのこれらの短いｄｓＲＮＡは、モル以下の濃度で触媒として作用して、細胞において９５％より多い標的ｍＲＮＡを切断できる。ｓｉＲＮＡ活性の仕組みおよびその用途のいくつかの記載は、Ｐｒｏｖｏｓｔら、 Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｃｅｒ、Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ． Ｊ．、２００２年１１月１日；２１巻（２１号）：５８６４〜５８７４頁；Ｔａｂａｒａら、Ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＤＥ−４ Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＲＤＥ−１， ＤＣＲ−１ ａｎｄ ａ ＤｅｘＨ−−ｂｏｘ Ｈｅｌｉｃａｓｅ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡｉ ｉｎ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃｅｌｌ ２００２年６月２８日；１０９巻（７号）：８６１〜７１頁；Ｋｅｔｔｉｎｇら、Ｄｉｃｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｉｍｉｎｇ ｉｎ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡｓ Ｇｕｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ＲＮＡｉ、Ｃｅｌｌ ２００２年９月６日；１１０巻（５号）：５６３頁；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、Ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ ＲＮＡｉ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２年、２９７巻：２０５６頁に記載されている。
【０１５２】
米国特許出願第２００４００２３３９０号（その内容全体は、本明細書で完全に述べられているかのごとく本明細書に参照により組み込まれる）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを多くの生物において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスにより誘導できることを教示している。しかし、哺乳動物細胞において、３０塩基対以上のｄｓＲＮＡは、タンパク質合成の停止およびアポトーシスによる細胞死さえ誘発する配列非特異的応答を誘導できる。最近の研究は、ＲＮＡ断片が、ＲＮＡｉの配列特異的メディエーターであることを示す（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年）。これらの小型阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による遺伝子発現の干渉は、現在、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、植物、ならびにマウス胚性幹細胞、卵母細胞および初期胚において遺伝子をサイレンシングするための天然に存在する方策として認識されている（Ｃｏｇｏｎｉら、１９９４年；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９６年；Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ、１９９８年；Ｔｉｍｍｏｎｓ、１９９８年；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８年；ＷｉａｎｎｙおよびＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ、２０００年；Ｙａｎｇら、２００１年；Ｓｖｏｂｏｄａら、２０００年）。
【０１５３】
本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉは、ＲＮＡ干渉のプロセスである。典型的なｍＲＮＡは、およそ５，０００コピーのタンパク質を生成する。ＲＮＡｉは、標的タンパク質、好ましくは免疫抑制タンパク質のｍＲＮＡにより作製されるタンパク質コピー数に干渉するかまたはそれを著しく低減するプロセスである。例えば、２本鎖の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、干渉される標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の生物学的に活性な断片のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的でそれと整合するように工学的に操作される。細胞内送達の後に、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合する。ｓｉＲＮＡ会合ＲＩＳＣは、塩基対形成相互作用により標的ｍＲＮＡと結合してそれを分解する。ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡのさらなるコピーを依然として分解できる。短いヘアピンＲＮＡおよびより長いＲＮＡ分子のようなＲＮＡのその他の形態を用いることができる。より長い分子は、例えばアポトーシスを扇動し、インターフェロン応答を誘導することにより細胞死を引き起こす。細胞死は、哺乳動物においてＲＮＡｉを達成するために大きな障害であった。なぜなら、３０ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の非特異的分解および宿主細胞の全般的な休止をもたらす防御機構を活性化したからである。約２０〜約２９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを用いて哺乳動物細胞における遺伝子特異的抑制を媒介することにより、この障害が明らかに克服される。これらのｓｉＲＮＡは、遺伝子抑制を引き起こすために十分に長いが、インターフェロン応答を誘導する長さではない。
【０１５４】
抗体
「抗体」または「複数の抗体」は、インタクトな分子、および対象のタンパク質のエピトープと特異的に結合できるそれらの断片を含む。本明細書で用いる場合、「特異的結合」とは、（１）少なくとも１×１０７Ｍ−１、および（２）非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）と結合する親和性よりも優先的に少なくとも２倍、５０倍、１００倍、１０００倍以上大きい親和性で標的タンパク質と結合する抗体の特性のことをいう。好ましい実施形態において、抗体との間の相互作用、例えば結合は、高い親和性（例えば少なくとも１０７Ｍ１、好ましくは１０８Ｍ−１と１０１０の間、または約１０９Ｍ−１の親和性定数）および特異性で生じる。
【０１５５】
「エピトープ」との用語は、抗体が結合する抗原上の抗原決定基のことをいう。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基からなり、典型的に、特定の３次元構造特徴と特定の電荷特徴とを有する。エピトープは、通常、少なくとも５つの隣接アミノ酸を有する。
【０１５６】
「抗体」および「複数の抗体」との用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化もしくはキメラ抗体、単鎖Ｆｖ抗体断片、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）_２断片を含む。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に特異的な抗体分子の不均質な集団であるが、モノクローナル抗体は、抗原内に含まれる特定のエピトープに対する抗体の均質な集団である。モノクローナル抗体は、特に有用である。
【０１５７】
対象のポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体断片は、公知の技術により作製できる。このような抗体断片は、それらに限定されないが、抗体分子のペプシン消化により生成できるＦ（ａｂ’）_２断片、およびＦ（ａｂ’）_２断片のジスルフィドブリッジを推測することにより作製できるＦａｂ断片を含む。代わりに、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築できる。例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６巻：１２７５〜１２８１頁を参照されたい。単鎖Ｆｖ抗体断片は、Ｆｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とをアミノ酸ブリッジ（例えば１５〜１８アミノ酸）により連結して単鎖ポリペプチドをもたらすことにより形成される。単鎖Ｆｖ抗体断片は、米国特許第４，９４６，７７８号に開示されるもののような標準的な技術により生成できる。
【０１５８】
一旦生成されると、抗体またはその断片を、標的ポリペプチドの認識について、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む標準的なイムノアッセイ法により試験できる。Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２年）を参照されたい。適切な抗体は、典型的に、組換えおよび天然タンパク質について等しい結合親和性を有する。
【０１５９】
「単一特異性抗体」との用語は、特定の標的、例えばエピトープについて単独の結合特異性および親和性を示す抗体のことをいう。この用語は、本明細書で用いる場合に単独分子組成の抗体またはその断片の調製物のことをいう「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含む。
【０１６０】
「組換え」抗体との用語は、本明細書で用いる場合、宿主細胞をトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入した動物（例えばマウス）から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列をその他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意のその他の手段により調製、発現、創出もしくは単離された抗体のような組換え手段により調製、発現、創出もしくは単離された抗体のことをいう。このような組換え抗体は、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、キメラ、脱免疫化、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された（例えばファージディスプレイ）抗体を含み、所望により、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含んでよい。
【０１６１】
ヒトタンパク質を指向するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウスのシステムよりもむしろヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて作製できる。対象の抗原で免疫化したこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を用いて、ヒトタンパク質からのエピトープに対する特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生成する（例えばＷｏｏｄら、国際出願ＷＯ９１／００９０６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＰＣＴパンフレットＷＯ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際出願ＷＯ９２／０３９１８；Ｋａｙら、国際出願第９２／０３９１７号；Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．ら、１９９４年Ｎａｔｕｒｅ３６８巻：８５６〜８５９頁；Ｇｒｅｅｎ， Ｌ． Ｌ．ら、１９９４年Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７巻：１３〜２１頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ．ら、１９９４年Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１巻：６８５１〜６８５５頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９３年Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７巻：３３〜４０頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３年 ＰＮＡＳ ９０巻：３７２０〜３７２４頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９１年 Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１巻：１３２３〜１３２６頁を参照されたい）。
【０１６２】
本発明において有用な抗体またはその断片は、所望の抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞により生成される組換え抗体であってもよい。組換え抗体は、公知の遺伝子工学技術により生成してよい。例えば、組換え抗体は、本発明において有用な抗体を生成するハイブリドーマ細胞からの所望の抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列、例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列をクローニングすることにより生成してよい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、次いで、両方の遺伝子がそれら自体の転写および翻訳発現制御配列に作動可能に連結するように発現ベクターに挿入する。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞に適合するように選択される。典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。原核および真核の宿主細胞を用いてよい。
【０１６３】
真核宿主細胞での発現が好ましい。なぜなら、このような細胞は、原核細胞よりも、正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性がより高いからである。しかし、正しくない折り畳みにより不活性な、生成されたいずれの抗体も、周知の方法により再生可能であることがある（ＫｉｍおよびＢａｌｄｗｉｎ、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ」、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５１巻、４５９〜８９頁（１９８２年））。宿主細胞が、軽鎖ダイマーまたは重鎖ダイマーのようなインタクトな抗体の部分を生成することが可能であり、これらも本発明による抗体相同体である。
【０１６４】
キメラ免疫グロブリン鎖を含むキメラ抗体は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術により生成できる。例えば、マウス（またはその他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を、制限酵素を用いて消化して、マウスＦｃをコードする領域を除去し、ヒトＦｅ定常領域をコードする遺伝子の等価部分で置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際出願ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８年Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０巻：１０４１〜１０４３頁）；Ｌｉｕら（１９８７年）ＰＮＡＳ ８４巻：３４３９〜３４４３頁；Ｌｉｕら、１９８７年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９巻：３５２１〜３５２６頁；Ｓｕｎら（１９８７年）ＰＮＡＳ ８４巻：２１４〜２１８頁；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７年、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ．４７巻：９９９〜１００５頁；Ｗｏｏｄら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ ３１４巻：４４６〜４４９頁；ならびにＳｈａｗら、１９８８年、Ｊ． Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０巻：１５５３〜１５５９頁を参照されたい）。
【０１６５】
抗体または免疫グロブリン鎖は、当技術分野において公知の方法によりヒト化できる。マウス抗体が一旦得られると、可変領域の配列決定ができる。ＣＤＲおよびフレームワーク残基の位置を決定できる（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ 第９１ ３２４２号およびＣｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら（１９８７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁（これらは本明細書に参照により組み込まれる）を参照されたい）。軽鎖および重鎖の可変領域は、所望により、対応する定常領域にライゲーションできる。
【０１６６】
本発明を、限定するとみなされるべきでない上記の実験および以下の実施例により本明細書において説明する。本明細書をとおして引用する全ての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。当業者は、本発明を多くの異なる形態で具体化してよく、本明細書に示す実施形態に限定されるとみなされるべきでないことを理解している。むしろ、これらの実施形態は、本開示が本発明を当業者に十分に伝えるように提供される。上記の記載に示される教示の恩恵を受けた本発明が属する技術分野の当業者は、本発明の多くの改変およびその他の実施形態に想到する。具体的な用語を用いているが、これらは、そうでないと記載しない限り、当技術分野におけるものと同様に用いられる。
【実施例】
【０１６７】
（実施例１）
材料および方法
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）誘導。マウス胚線維芽細胞を、Ｅ１３ ＣＦ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から誘導した。動物に、２５０ｍｇ／ｋｇのＡｖｅｒｔｉｎ（登録商標）（２，２，２−トリブロモエタノール）を腹腔内注射により投与し、頸椎脱臼により安楽死させた。各動物からの子宮角を腹膜から取り出し、１０ｃｍのペトリ皿に入れ、ＰＢＳですすいだ。胚嚢を切断し、胚を取り出し、ＰＢＳですすいで計数した。内臓組織を分離して廃棄し、胚をＰＢＳで再びすすいだ。残りの組織を解剖鋏で細かく刻み、２ｍＬのトリプシンを加え、大きい片が残らなくなるまで組織をさらに細かく刻んだ。さらに５ｍＬのトリプシンを加え、皿を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに２０〜３０分間入れた。ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＭＥＦ培地培地（付録Ｃを参照されたい）を加え、細胞をＴ７５フラスコで培養した（フラスコあたりおよそ３つの胚）。次の日に、合計６匹のマウスからの細胞を、２つの群ＭＥＦ１およびＭＥＦ２にプールし、１０％ＤＭＳＯを補ったＭＥＦ培地中で凍結させ、液体窒素中で貯蔵した。各群からの試料を、マイコプラズマ混入について試験した（試験Ｍ−２５０、Ｂｉｏｎｉｑｕｅ（登録商標）Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．）。試験した両方の試料は、ＤＮＡ蛍光色素染色および生存培養法の両方によりマイコプラズマ混入について陰性であった。
【０１６８】
線維芽細胞培養。正常胎児肺組織からの初代ヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）をＡＴＣＣから得て、それらの推奨に従って培養した。
【０１６９】
変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動。転写物は、ポリ（Ａ）テイル付加の前および後の両方で、変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動により分析して、これらが予測されたサイズであることを確実にし、ポリ（Ａ）テイルの長さを測定した。３倍容量のホルムアルデヒドロード色素を各試料に加え、試料を７０℃にて１５分間変性させ、次いで、１．５％ホルムアルデヒド−アガロースゲル（ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ（登録商標）キット、Ａｍｂｉｏｎ）のウェルにロードした。ＲＮＡラダー（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｍａｒｋｅｒｓ（商標）Ａｍｂｉｏｎ）をサイズ比較のために用いた。
【０１７０】
脂質媒介トランスフェクション。ｉｖＴ−ＲＮＡをＭＲＣ−５線維芽細胞に、製造者の使用説明に従って脂質媒介トランスフェクション（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）、Ｍｉｒｕｓ）により送達した。
【０１７１】
エレクトロポレーション。細胞をトリプシン処理し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄し、２ｍｍギャップを有する標準的なエレクトロポレーションキュベット中で５０μＬの合計容量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）に再懸濁した。１１０Ｖと１４５Ｖの間に充電した１５０μＦコンデンサからキュベットに放電して、細胞にエレクトロポレーションした。温かい培地を加え、細胞を１０ｃｍ皿またはマルチウェルプレートに播種した。
【０１７２】
定量ＲＴ−ＰＣＲ。プライマーおよび分子ビーコンプローブを設計して、ＨＵＳＫ転写物Ａ〜Ｆを検出した。停止コドンをまたぐアンプリコンを設計して、内因性転写物の同時増幅を防いだ。標準曲線を作成して、各反応の効率を評価した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、表Ａ．１）を用いて、内因性ｍＲＮＡのレベルを測定した。ＲＮＡを細胞から抽出し、精製した（ＲＮｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）後に、ＲＴ−ＰＣＲ（ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を行った。ＲＴ−ＰＣＲプロトコールは、５０℃、１０分間の逆転写ステップと、その後に、９５℃で５分間の最初の変性ステップと９５℃で１５秒間および５５℃で３０秒間の４５サイクルとを含んだ。
【０１７３】
ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン。細胞に、ｓｉＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、表Ａ．１）を種々の濃度で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）中でエレクトロポレーションした（上記のプロトコールを参照されたい）。表Ａ．１は、商業的な業者から購入したいくつかのｓｉＲＮＡ分子を列挙する。自然免疫応答タンパク質を抑制するこれらのｓｉＲＮＡの混合物は、本発明の範囲内である。
【０１７４】
免疫細胞化学。細胞をＰＢＳですすぎ、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。細胞を、次いで、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で透過にし、２％脱脂乳中で３０分間ブロッキングした。ブロッキングの後に、細胞を１次抗体と４℃にて１晩インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で３回洗浄し、ＦＩＴＣ−およびＣＹ３−コンジュゲート２次抗体と室温にて１時間インキュベートした。細胞を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２と１分間インキュベートし、すすぎ、ＰＢＳ中の５０％グリセロールに載せ、蛍光顕微鏡により画像化した。
【０１７５】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロット。全細胞可溶化液（Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ哺乳動物タンパク質調製キット、Ｑｉａｇｅｎ）を、１２％ポリアクリルアミドゲル（ＰｒｏＳｉｅｖｅ（登録商標）５０、Ｌｏｎｚａ）上で、還元変性条件下で分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）−ＦＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１１中で移した。メンブレンをＴＢＳＴ中の３％ＢＳＡ中でブロッキングし、適切な抗体でプローブ付加した。量子ドットコンジュゲート２次抗体Ｑｄｏｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、多重プローブ付加のために用いた。β−アクチン（Ａｂｃａｍ８２２６）をローディング対照として用いた。
【０１７６】
（実施例２）
Ａ．ｉｖＴ−鋳型アセンブリおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
組換えＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼは、最小Ｔ７プロモーター配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（最後の３塩基（ＧＧＧ）は、転写物の最初の３ヌクレオチド（これもまたＧＧＧ）をコードする）を含有するＤＮＡ鋳型からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために広く用いられている。この酵素を、高収率の全長転写物を生成するように設計された緩衝液および添加物とともに用いるいくつかの商業的ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットが入手可能である。直鎖状にしたプラスミド、ＰＣＲ生成物および１本鎖オリゴヌクレオチドをＴ７ＲＮＡ−ポリメラーゼ鋳型として用いることができるが、Ｔ７プロモーターは２本鎖でなければならない。この研究について、配列の誤りを最小限にしながら鋳型合成手順を単純化するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型を、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼにより逆転写ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡから生成される平滑末端ＰＣＲ生成物として設計した。ＰＣＲ生成物を選択することにより、細菌のクローニングを必要とせずに多量の鋳型の生成が容易になり、プラスミド鋳型を用いる場合に直鎖状にするステップの必要がなくなる。逆転写ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを増幅することにより、ｉｖＴ−鋳型成分の配列が、成熟内因性転写物のものと確実に整合するようにする。
【０１７７】
Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応のためのｄｓＤＮＡ鋳型を生成するために、付着末端ライゲーションを、組み合わせ消化を可能にするように同じ緩衝液中で活性な２つの制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ（認識部位：Ｇ／ＣＴＡＧ＼Ｃ）およびＡｇｅＩ（認識部位：Ａ／ＣＣＧＧ＼Ｔ）を用いてＨＢＢ ＵＴＲを任意のＣＤＳと組み合わせるために設計した。Ｔ７プロモーター、強いコンセンサスを有するコザック配列および制限酵素認識部位を含有するプライマーを設計して、これらのエレメントがｉｖＴ−鋳型成分にＰＣＲ中に取り込まれることを容易にした。５つのアデノシン残基を、ＨＢＢ ５’−ＵＴＲリバースプライマーおよびＨＢＢ ３’−ＵＴＲフォワードプライマーの５’端に含めて、消化を容易にした。ＨＢＢ ＵＴＲプライマー配列を以下に示し、Ｔ７プロモーターおよび制限酵素認識部位に下線を付す。
【０１７８】
本発明で用いるための制限酵素のリストは、以下を含む：
【０１７９】
【化２】

基本的な組み立てられたＨＢＢ−ＵＴＲ安定化コザック＋（ＨＵＳＫ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の図を、以下に示す。
ＨＢＢ ５’−ＵＴＲフォワードプライマー：配列番号１５
【０１８０】
【化３】

ＨＢＢ ５’−ＵＴＲリバースプライマー：配列番号１６
【０１８１】
【化４】

生成物の長さ：７５ｂｐ
ＨＢＢ ３’−ＵＴＲフォワードプライマー：配列番号１７
【０１８２】
【化５】

ＨＢＢ ３’−ＵＴＲリバースプライマー：配列番号１８
【０１８３】
【化６】

生成物の長さ：１４３ｂｐ
【０１８４】
【化７】

Ｂ．ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ鋳型についてのコード配列および非翻訳領域
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞培養。Ｈ９ヒト胚性幹細胞を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから第２４代で得て、記載される^１（方法を参照されたい）ようにしてＥ１３ ＣＦ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から誘導した照射マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した。ｈＥＳ細胞は、細胞質をほとんど有さない緊密細胞の大きいコロニーとして成長した。ＭＥＦ上で成長した細胞を、多能性マーカーであるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇに対する抗体を用いて染色した。ｈＥＳ細胞コロニーは、多くの明るく染色された細胞を含んだが、ＭＥＦは染色されなかった。数世代の継代後に、いくらかの細胞を、ＢＭＥ基底膜マトリクス（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で被覆した皿上に播種し、照射ＭＥＦ上で４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）^５０を補って２４時間馴化した培地で培養した。Ｙ−２７６３２を含む馴化培地で成長した細胞は、ＭＥＦ上またはＹ−２７６３２を含まない馴化培地で成長した細胞で観察される自発的分化のレベルが非常に低かった。
【０１８５】
トータルＲＮＡを、ＢＭＥ被覆プレート上で馴化培地において培養したＨ９ ｈＥＳ細胞から、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）をカラム上でのＤＮアーゼＩ消化とともに用いて抽出した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、ポリ（ｄＴ）ラテックスビーズ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｑｉａｇｅｎ）を用いて濃縮し、定量し（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４℃にて５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で貯蔵した。対象のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ転写物およびβ−グロビンを、別々の反応において、ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（ＭｏｎｓｔｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））と、ＨＢＢ ３’−ＵＴＲおよびこの研究のために選択した７つの遺伝子のＣＤＳの３’端にアニールするように設計したプライマーとを用いて逆転写した（表Ｂ．１）。鋳型成分を、高忠実度ポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート、ＮＥＢ）を用いて増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）でライゲーションした。ライゲーション生成物を増幅し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための調製においてゲル精製した（ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）。
【０１８６】
ＨＢＢ ３’−ＵＴＲおよび７つのＣＤＳを、次いで、高忠実度ポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート、ＮＥＢ）を用いて増幅して、配列の誤りを最小限にした（表Ｂ．２〜Ｂ．４）。ＨＢＢ ５’−ＵＴＲプライマーは、ＰＣＲ生成物全体をまたぐものであり、ＨＢＢ ５’−ＵＴＲ増幅反応におけるｃＤＮＡ鋳型の必要性を排除した。プライマーを、Ｔ７プロモーター配列をＨＢＢ ５’−ＵＴＲの５’端に、そして制限酵素認識配列をＨＢＢ ５’−ＵＴＲの３’端、ＨＢＢ ３’−ＵＴＲの５’端およびＣＤＳの両端に接着させるように設計した。反応生成物を１．５％（ＣＤＳ）または３％（ＨＢＢ ＵＴＲ）アガロースゲル上で分離し、適当なバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した（ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）。
【０１８７】
ＰＣＲ生成物を、ＮｈｅＩおよびＡｇｅＩの制限酵素を用いて消化し（表Ｂ．５）、精製し（ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、ライゲーションして、完全ｉｖＴ鋳型を形成した（表Ｂ．６）。ライゲーション反応物を１．５％アガロースゲル上で分離し、適当なバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した。抽出ＤＮＡを、ＨＢＢ ５’−ＵＴＲフォワードプライマーおよびＨＢＢ ３’−ＵＴＲリバースプライマーを用いて増幅して、マイクログラム量の組み立てられたｉｖＴ鋳型を得た（表Ｂ．７）。
【０１８８】
大規模増幅を、次いで行って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために必要な量の各鋳型を生成した（表Ｂ．８）。完了した増幅反応物を、２回の逐次的ゲル精製に供して、非特異的生成物を除去した。
【０１８９】
Ｃ．ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ転写物合成
高忠実度ポリメラーゼをｄｓＤＮＡ鋳型合成の全ての段階において用いて、配列の誤りを最小限にした。変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動を行って、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡ鋳型から転写された転写物がポリアデニル化前に予測されたサイズを有し、これらが分解されず、ポリアデニル化反応により効率的な翻訳を促進するために十分な長さのポリ（Ａ）テイルが付加されたことを確認した。全長転写物は各鋳型から生成されたが、完了した反応物は、早期終結転写物および分解転写物の組合せとして同定される多量の低分子量生成物も含有した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の温度を低減することにより、生成される全長転写物の画分が劇的に増加した。
【０１９０】
いくつかの論文は、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を加える^５１かまたは反応温度を低減する^５２ことによってｉｖＴ反応を改変することにより、早期終結を低減でき、生成される全長転写物の画分を増加できることを示している。Ｔ７ ＲＮＡ−ポリメラーゼの処理能力は、３７℃未満の温度で著しく低減する。しかし、反応の特異性は増加し、３７℃で得られるものと等しい収率を、反応持続期間を１時間から２０時間に増加させることにより１０℃で得ることができる。
【０１９１】
各ＨＵＳＫ ｉｖＴ鋳型を、Ｔ７ ｉｖＴ反応に加え（ｍＳｃｒｉｐｔ（商標）ｍＲＮＡ生成システム、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、表Ｂ．９）、得られたＲＮＡを精製し（ＲＮｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）、定量し、キャップ付加し、ポリアデニル化した（ｍＳｃｒｉｐｔ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、表Ｂ．１０およびＢ．１１）。キャップ付加ポリ（Ａ）＋ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを、ｍＳｃｒｉｐｔ ｍＲＮＡ生成システム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））を用いて合成した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の温度および持続期間を、特異性および収率について、所定の細胞およびタンパク質についての日常的な実験に基づいて最適化した。キャップ付加ポリ（Ａ）＋ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡを精製し、定量し、４℃にてＲＮアーゼ阻害剤（ＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ）を含むＲＮアーゼフリー水中で貯蔵した。ポリ（Ａ）テイル付加の前および後の両方での１μｇの各転写物を変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動（方法を参照されたい）により分析して、各転写物がポリ（Ａ）テイル付加の前に予測されたサイズを有することを確認し、分解のレベルを評価し、ポリ（Ａ）テイルの長さを測定した。ポリアデニル化反応の持続期間は、およそ１５０ヌクレオチドのポリ（Ａ）テイルを生じるように調節し、この長さは、実験条件およびコードされるタンパク質に基づいて必要により変動できる。
【０１９２】
７つのＨＵＳＫ転写物に加えて、全長の内因性未改変転写物Ａを、内因性ｍＲＮＡの完全配列を含有する鋳型（内因性ＵＴＲおよび未改変コザック配列）を用いて合成した。全ての反応において、低分子量生成物は、ポリアデニル化の後に出現した（濃いバンドの下の薄暗い形）。ポリアデニル化反応は、ＲＮアーゼ阻害剤を含有し、ポリアデノシンポリメラーゼ自体が低レベルのＲＮアーゼ活性を有し得ることを示す。
【０１９３】
（実施例３）
ＩＦＮＢ１発現のｓｉＲＮＡノックダウン
ＩＦＮＢ１を標的にするｓｉＲＮＡを用いて、自然免疫応答を抑制するためにその発現をノックダウンした。ｓｉＲＮＡをＭＲＣ−５線維芽細胞に、エレクトロポレーションにより、ｉｖＴ−ＲＮＡとともにまたはそれなしで送達した。ｓｉＲＮＡを受けなかった模擬トランスフェクトした細胞は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に１０，０００倍のＩＦＮＢ１の過剰発現を示した。対照的に、抗ＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとの両方を受けた細胞は、５０〜１００倍のＩＦＮＢ１過剰発現しか示さず、これは、９９〜９９．５％のノックダウン効率に相当した（図７Ｂ）。ＲＮＡｉ機構に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションの前にｓｉＲＮＡの位置を定めてそれを結合させるより長い時間を与えるために、細胞にｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションし、４８時間成長させ、次いで、ｓｉＲＮＡとＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとの両方をエレクトロポレーションした。この実験において、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞は、模擬トランスフェクトした細胞と比べて７５００倍のＩＦＮＢ１の過剰発現を示したが、ｓｉＲＮＡを受けた細胞は、模擬トランスフェクトした細胞と比べて１５倍のＩＦＮＢ１の過剰発現を示し、これは９９．８％のノックダウン効率に相当した（図７Ａ）。これらの２つの実験において測定された、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡだけを受けた細胞におけるＩＦＮＢ１過剰発現の差と、本文中の他の場所に記載するものの差は、ＭＲＣ−５細胞により内因的に発現されるＩＦＮＢ１の非常に低いレベルにおける小さい変動による可能性があった。この理由から、過剰発現のレベルは、実験間ではなく実験内でのみ比較した。なぜなら、各実験は、独立した模擬トランスフェクション対照を有し、これに対してその実験における全ての発現データが標準化されるからである。
【０１９４】
その他の遺伝子を標的にする、同じ業者からのｓｉＲＮＡを用いるＭＲＣ−５線維芽細胞におけるエレクトロポレーションで観察されたノックダウン効率が、典型的に８０％と９０％の間であるので（図９および図１０）、これらの実験において観察されたＩＦＮＢ１ノックダウンの高い効率は、十分なＩＦＮＢ１ ｍＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構により破壊されて、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答のインターフェロン−β媒介増幅が妨害されたことを示した。この仮説は、自然免疫応答に関与するいくつかのその他の遺伝子が、模擬トランスフェクトした細胞と比べてまだ過剰発現されているが、ＩＦＮＢ１を標的にするｓｉＲＮＡを受けた細胞において、ｓｉＲＮＡを受けなかった細胞のものよりも著しく少なく過剰発現されたという観察結果により支持される（図７Ａ）。特に、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡだけを受けた細胞において５０〜６０倍過剰発現されるＰＲＲであるＴＬＲ３およびＲＡＲＲＥＳ３は、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとをともに受けた細胞において２０〜３０倍過剰発現される。さらに、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２およびＥＩＦ２ＡＫ２は全て、細胞にＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとを同時トランスフェクトした場合に、模擬トランスフェクトした細胞と比べて同様の過剰発現レベルの低減を示した。
【０１９５】
ｓｉＲＮＡにより媒介されるＩＦＮＢ１ノックダウンは、ＭＲＣ−５細胞においてＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡトランスフェクションにより惹起される自然免疫応答に関与するいくつかの遺伝子の過剰発現を低減させたが、ＰＲＲであるＴＬＲ３およびＲＡＲＲＥＳ３の＞２０倍の過剰発現、ならびにＩＦＮＢ１、ＳＴＡＴ１およびＥＩＦ２ＡＫ２の＞５倍の過剰発現の残存により示されるように、これらの細胞において自然免疫は完全に阻害されなかった。実際に、ＩＦＮＢ１ノックダウンは、ｉｖＴ−ＲＮＡをトランスフェクトした細胞において観察される増殖の阻害にほとんどまたは全く影響しないことが観察され（図８）、このことは、ＨＵＳＫ ｉｖＴ−ＲＮＡとＩＦＮＢ１ ｓｉＲＮＡとの両方をトランスフェクトした細胞において、ＩＦＮＢ１発現の低い残存レベルが細胞の増殖を妨げるために十分であるか、またはインターフェロン−βシグナル伝達とは独立した仕組みにより、細胞が増殖することが妨げられているかのいずれかであることを示す。
【０１９６】
【表５】

ＴａｑＭａｎアッセイおよびＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
【０１９７】
【表６−１】

【０１９８】
【表６−２】

【０１９９】
【表６−３】

【０２００】
【表６−４】

【０２０１】
【表６−５】

【０２０２】
【表６−６】

【０２０３】
【表６−７】

【０２０４】
【表６−８】

【０２０５】
【表６−９】

【０２０６】
【表６−１０】

【０２０７】
【表６−１１】

【０２０８】
【表６−１２】

【０２０９】
【表６−１３】

【０２１０】
【表６−１４】

【０２１１】
【表６−１５】

【０２１２】
【化８】

【０２１３】
【化９】

【０２１４】
【化１０】

【０２１５】
【化１１】

【０２１６】
【化１２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５またはそれらの生物学的に活性な断片、類似体もしくは改変体からなる群より選択される自然免疫応答経路中の１つまたは複数のタンパク質の発現を低減する作用物質の有効量を細胞に導入することにより、核酸のトランスフェクションに対する前記細胞の自然免疫応答を抑制するための方法。
【請求項２】
前記作用物質が、ｓｉＲＮＡ、１つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が動物細胞であり、前記ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５をコードするｍＲＮＡまたはこれらのタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ分子と特異的にハイブリダイズ可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を、自然免疫応答経路中のタンパク質またはその生物学的に活性な断片、改変体もしくは類似体と選択的に結合する抗体と接触させ、それによりその生物学的な活性を低減することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞を、自然免疫応答経路中のタンパク質もしくはその生物学的に活性な断片の生物学的な活性を低減するタンパク質または小分子と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することが、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、衝撃トランスフェクション、マグネトフェクション、ペプチド媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションまたはそれらの組合せにより達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
細胞に核酸分子をトランスフェクトするための方法であって、
ａ．前記細胞の自然免疫応答を抑制するステップと、
ｂ．前記核酸を前記細胞に導入するステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記核酸分子が、タンパク質もしくはその生物学的断片またはＲＮＡ分子をコードし、前記核酸を導入するステップが、トランスフェクションによる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が、１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、または１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む群から選択されるメンバーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１本鎖ＲＮＡ分子が、対象のタンパク質をコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａおよびｂが、同時である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａが、２回以上反復される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂが、２回以上反復される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ステップａが、ステップｂの約２４〜７２時間前まで行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ステップａが、ＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５またはそれらの生物学的に活性な断片、改変体もしくは類似体からなる群より選択される自然免疫応答経路中の１つまたは複数のタンパク質の発現を低減する作用物質の有効量を前記細胞に導入することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記作用物質が、トランスフェクションにより導入されるｓｉＲＮＡ、１つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が動物細胞であり、前記ｓｉＲＮＡまたは１つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３およびＩＦＩＴ５またはそれらの生物学的に活性な断片、改変体もしくは類似体をコードするｍＲＮＡ、あるいはこれらのタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ分子と特異的にハイブリダイズ可能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞を、自然免疫応答経路中のタンパク質またはその生物学的に活性な断片、改変体もしくは類似体と選択的に結合する抗体と接触させ、それによりその生物学的な活性を低減することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞を、自然免疫応答経路中のタンパク質もしくはその生物学的に活性な断片の生物学的な活性を低減するタンパク質または小分子と接触させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が動物細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップａおよびｂが、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、衝撃トランスフェクション、マグネトフェクション、ペプチド媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションまたはそれらの組合せにより達成される、請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸が、そのｍＲＮＡが配列番号１を含むＯＣＴ４；そのｍＲＮＡが配列番号２を含むＳＯＸ２；そのｍＲＮＡが配列番号３を含むＫＬＦ４；そのｍＲＮＡが配列番号４を含むＭＹＣ；そのｍＲＮＡが配列番号５を含むＮＡＮＯＧ；そのｍＲＮＡが配列番号６を含むＬＩＮ２８；そのｍＲＮＡが配列番号７を含むＭＹＯＤ１；そのｍＲＮＡが配列番号８を含むＡｓｃｌ１；そのｍＲＮＡが配列番号９を含むＰＵ．１；そのｍＲＮＡが配列番号１０を含むＣ／ＥＢＰα；そのｍＲＮＡが配列番号１１を含むＣ／ＥＢＰβ；そのｍＲＮＡが配列番号１２を含むＮｇｎ３；そのｍＲＮＡが配列番号１３を含むＰｄｘ１；そのｍＲＮＡが配列番号１４を含むＭａｆａ；およびそのｍＲＮＡが配列番号１５を含むＥｓｒｒｂ、またはそれらの生物学的に活性な断片、類似体もしくは改変体からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
前記コードされるタンパク質またはＲＮＡ分子の発現が、前記細胞における所望の表現型変化を引き起こす、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が動物細胞であり、前記所望の表現型変化が細胞の分化、分化転換または脱分化である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記動物が哺乳動物であり、前記細胞が成体海馬幹細胞であり、前記コードされるタンパク質がＡｓｃｌ１であり、前記表現型変化がオリゴデンドロサイトへの前記細胞の分化である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記動物が哺乳動物であり、前記細胞が神経幹細胞であり、前記細胞に、それぞれＯｃｔ４、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードする複数の異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡがトランスフェクトされ、前記表現型変化が多能性幹細胞への前記神経幹細胞の脱分化である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記動物が哺乳動物であり、前記細胞が非インスリン生成膵臓外分泌細胞であり、前記細胞に、それぞれＮｇｎ３、Ｐｄｘ１またはＭａｆａタンパク質をコードする複数の異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡがトランスフェクトされ、前記表現型変化が、インスリン生成ベータ島細胞への前記非インスリン生成膵臓外分泌細胞の分化転換である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記動物が哺乳動物であり、前記細胞が線維芽細胞であり、前記細胞に、それぞれＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードする複数の異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡがトランスフェクトされ、前記表現型変化が多能性幹細胞への前記線維芽細胞の脱分化である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物が哺乳動物であり、前記細胞が、線維芽細胞、軟骨芽細胞、平滑筋細胞および網膜色素上皮細胞を含む群から選択されるメンバーであり、前記コードされるタンパク質がＭｙｏＤであり、前記所望の表現型変化が筋芽細胞への前記細胞の分化転換である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記動物が哺乳動物であり、前記細胞が線維芽細胞であり、前記細胞に、それぞれＰＵ．１またはＣ／ＥＢＰα／βをコードする複数の異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡがトランスフェクトされ、前記所望の表現型変化がマクロファージへの前記線維芽細胞の分化転換である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＰ５３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＲＡＲＲＥＳ３、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＢ１、ＩＬ６、ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＭＡＶＳ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＡＳＥＬ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＲＢ１、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴ５またはそれらの生物学的に活性な断片、改変体もしくは類似体を含む群から選択される自然免疫応答経路中の２つ以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子、あるいは列挙したタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ分子と特異的にハイブリダイズし、それにより前記２つ以上のタンパク質の発現を低減する、複数の異なるｓｉＲＮＡ、１つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組合せを含む組成物。
【請求項３３】
ＴＰ５３、ＳＴＡＴ２およびＥＩＦ２ＡＫ２をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズするｓｉＲＮＡの混合物、またはＴＰ５３、ＳＴＡＴ２、ＥＩＦ２ＡＫ２およびＩＦＮＢ１をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズするｓｉＲＮＡの混合物を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法により生成される細胞。
【請求項３５】
請求項７に記載の方法により生成される細胞。
【請求項３６】
（ｉ）安定５’ＵＴＲと、
（ｉｉ）タンパク質コード配列（ＣＤＳ）に連結した強力なコザックコンセンサス配列と
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成する構築物に作動可能に連結した転写プロモーターを含むＤＮＡ鋳型。
【請求項３７】
前記構築物が、前記安定５’ＵＴＲを前記強力なコザックコンセンサス配列につなぐ第１制限部位を有する、請求項３６に記載の鋳型。
【請求項３８】
前記第１制限部位がＮｈｅＩ部位である、請求項３７に記載の鋳型。
【請求項３９】
（ｉｉｉ）安定３’ＵＴＲをさらに含む、請求項３６に記載の鋳型。
【請求項４０】
前記安定３’ＵＴＲおよび前記安定５’ＵＴＲが、ベータグロビンＵＴＲまたはアルファグロビンＵＴＲである、請求項３９に記載の鋳型。
【請求項４１】
前記構築物が、前記ＣＤＳを前記安定３’ＵＴＲにつなぐ第２制限部位を有する、請求項３９に記載の鋳型。
【請求項４２】
前記第２制限部位がＡｇｅＩ部位である、請求項４１に記載の鋳型。
【請求項４３】
配列内リボソーム進入部位をさらに含む、請求項３６に記載の鋳型。
【請求項４４】
前記プロモーターが、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６を含む群から選択されるメンバーである、請求項３６に記載の鋳型。
【請求項４５】
対象のタンパク質をコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ転写物であって、作動可能な組合せで、
（ｉ）安定５’ＵＴＲと、
（ｉｉ）タンパク質コード配列（ＣＤＳ）に連結した強力なコザック配列と
を含む転写物。
【請求項４６】
（ｉｉｉ）安定３’ＵＴＲをさらに含む、請求項４５に記載の転写物。
【請求項４７】
前記安定３’ＵＴＲおよび前記安定５’ＵＴＲが、ベータグロビンＵＴＲもしくはアルファグロビンＵＴＲまたはこれらの任意の組合せである、請求項４６に記載の転写物。
【請求項４８】
以下のエレメント：前記転写物の３’端のポリ（Ａ）テイル、前記転写物の５’端の７−メチルグアノシンキャップおよび配列内リボソーム進入部位のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項４５に記載の転写物。
【請求項４９】
前記対象のタンパク質が、そのｍＲＮＡが配列番号１を含むＯＣＴ４、そのｍＲＮＡが配列番号２を含むＳＯＸ２、そのｍＲＮＡが配列番号３を含むＫＬＦ４、そのｍＲＮＡが配列番号４を含むＭＹＣ、そのｍＲＮＡが配列番号５を含むＮＡＮＯＧ、そのｍＲＮＡが配列番号６を含むＬＩＮ２８、そのｍＲＮＡが配列番号７を含むＭＹＯＤ１、そのｍＲＮＡが配列番号８を含むＡｓｃｌ１、そのｍＲＮＡが配列番号９を含むＰＵ．１、そのｍＲＮＡが配列番号１０を含むＣ／ＥＢＰα、そのｍＲＮＡが配列番号１１を含むＣ／ＥＢＰβ、そのｍＲＮＡが配列番号１２を含むＮｇｎ３、そのｍＲＮＡが配列番号１３を含むＰｄｘ１、そのｍＲＮＡが配列番号１４を含むＭａｆａ、およびそのｍＲＮＡが配列番号１５を含むＥｓｒｒｂ、またはそれらの生物学的に活性な断片、類似体もしくは改変体からなる群より選択される、請求項４５に記載の転写物。
【請求項５０】
（ｉ）安定５’ＵＴＲと、
（ｉｉ）前記５’ＵＴＲをコザックコンセンサス配列につなぐことができる第１制限部位と
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成する構築物に作動可能に連結した強力な転写プロモーターを有するＤＮＡ鋳型を含むキット。
【請求項５１】
前記プロモーターを認識して結合するポリメラーゼ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行うために適切な緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の混合物、前記第１制限部位および第２制限部位を認識する制限酵素、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応が完了したら用いた前記鋳型を分解するためのＤＮアーゼ酵素溶液、５’ ｍ７Ｇキャップを生成するためのキャップ付加酵素、２番目のヌクレオチドにメチル基を付加するための２−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素、ＧＴＰの溶液、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の溶液、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ酵素（例えばＥ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＡＴＰの溶液、およびポリ（Ａ）テイル付加反応のための緩衝液のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項５０に記載のキットであって、前記キットは、陽性対照として用いられるＤＮＡ鋳型をさらに含んでよい、キット。

【図１】

【図５】

【図１３−２】

【図２】

【図３】

【図４】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１２】

【図１３−１】

【図１３−３】

【公表番号】特表２０１２−５２４７７７（Ｐ２０１２−５２４７７７Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０７１８７（Ｐ２０１２−５０７１８７）
【出願日】平成２１年４月２２日（２００９．４．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４１４５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２３５０１
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ　インスティテュート　オブ　テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】