雄性不稔ネギ属植物及びそれに由来する細胞ならびにその作製方法
【課題】ネギ属植物において育種上利用可能な雄性不稔植物、及びその作製方法を提供する。
【解決手段】ネギ属植物において、アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質と、タマネギ及び／またはシャロットである非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムとを有し、雄性不稔の形質を示すネギ属植物およびその細胞。
【解決手段】ネギ属植物において、アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質と、タマネギ及び／またはシャロットである非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムとを有し、雄性不稔の形質を示すネギ属植物およびその細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネギ属植物において品種改良などに有用な雄性不稔植物及びその作製方法に関し、より詳しくは、ロイレイ種の細胞質と非ロイレイ種ネギ属植物（ロイレイ種ではないネギ属植物、以下同じ）由来の核ゲノムとを有し、雄性不稔の形質を有するネギ属植物及びその細胞、ならびにその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種子植物において、雄性器官に異常を生じ、稔性のある正常な花粉の形成が阻害される現象は雄性不稔（Ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）と呼ばれ、例えば花の構造上おしべの除去（除雄）が困難な野菜等であっても、雄性不稔の形質を持っていればその必要がなくなるため、雑種の形成やその制御が容易になるという利点を持っている（非特許文献１）。雄性不稔は通常、自然突然変異として単離される形質であり、その原因としては、核遺伝子に存在する因子の支配を受ける場合（Ｇｅｎｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）、細胞質及び核の両方の因子の支配を受ける場合（Ｇｅｎｅ−ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）の２つの型があり、育種対象の植物種などにより使い分けられている。
【０００３】
有用植物の雄性不稔のうち、ネギ属植物においては、雄性不稔の形質が細胞質（Ｓ＝雄性不稔細胞質、Ｎ＝正常細胞質）及び核（優性稔性回復遺伝子ＭＳ、劣性対立遺伝子ｍｓ）の両方の因子の支配を受ける型であることが知られている（非特許文献２）。雄性不稔形質を有用品種に付与することは、育種上、また種苗生産上きわめて有用であるが、ネギ属植物を用いて雄性不稔系統を作出するためには、タマネギを用いた例では、（Ａ）自然突然変異として単離された雄性不稔系統Ｓ１（Ｓ−ｍｓｍｓ）と改良対象となる品種Ｎ１（Ｎ−ＭＳＭＳ）とを交配して稔性Ｆ１（Ｓ−ＭＳｍｓ）を得、（Ｂ）次いでＦ１（Ｓ−ＭＳｍｓ）を花粉親としてＮ１（Ｎ−ＭＳＭＳ）との間で交配・採種して核因子がヘテロの子孫を得、（Ｃ）更に（Ｂ）で得られた子孫同士（Ｎ−ＭＳＭＳ及びＮ−ＭＳｍｓ：両者は区別できない）を多数交配してＮ−ｍｓｍｓの形質を持った子孫（雄性不稔維持系統）を作出し、（Ｄ）最終的にＳ１（Ｓ−ｍｓｍｓ）とＮ−ｍｓｍｓ形質を持つ子孫とを交配することによって、品種としてはＮ１の形質を持ち、かつ雄性不稔形質を有する雄性不稔子孫（Ｓ−ｍｓｍｓ）という工程を経るのが従来の方法であった。
この様な従来の方法においては、採種と定植の過程を含むことから作出には最低でも７年間が必要であり、また特に工程（Ｂ）及び（Ｃ）では外見では区別がつかない子孫株どうしを多数かけ合わせる必要があるなど、非常な労力を要するのが現状であった。
【０００４】
また、他種植物においては、イタリアンライグラスとペレニアルライグラスとを交配して雄性不稔ライグラスを作製する方法（特許文献１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａの細胞とＢ．ｎａｐｕｓ等の細胞とを融合させ、雄性不稔アブラナ科植物を作製する方法（特許文献２，４）、自然界から単離された雄性不稔系統を用いる雄性不稔のスギ（特許文献３）、大豆（特許文献５）、コムギ（特許文献６）の作製方法、その他シンノリン化合物を用いてユリ綱植物の花粉を抑制する方法（特許文献７）や遺伝子組み換えを用いて雄性不稔形質を付与する方法等が提案されているが、化合物を用いたり遺伝子組み換えを用いる方法は、特に食に関するものでは社会的な抵抗感があり、また他種植物における雄性不稔形質の事例ではその植物に固有の因子を利用するものであるため、ネギ属植物には適用できないという問題があった。このため、ネギ属植物においても、育種上利用可能で遺伝子組み換えや化合物処理などによらない雄性不稔植物の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開２００４−２２２６４６号公報 雄性不稔ライグラス類及びその作出方法
【特許文献２】特開平１０−０５２１８５号公報 細胞原形質雄性不稔Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（キャベツ）及びそのような植物の生産法
【特許文献３】特開平１０−２４８４１８号公報 スギ雄性不稔個体の作出方法
【特許文献４】特開平７−０３１３０７号公報 雄性不稔植物の育種方法及び増殖方法
【特許文献５】特表２０００−５１０３４６号公報 細胞質遺伝雄性不稔大豆及び雑種大豆を生産する方法
【特許文献６】特表２０００−５１４６６４号公報 ハイブリッドコムギの生産方法
【特許文献７】特開平５−３０１８０７号公報 ユリ綱植物において雄性不稔を誘発する方法
【非特許文献１】鈴木芳夫ほか著 １９９３「新 蔬菜園芸学」朝倉書店
【非特許文献２】山口彦之監修 ２００３「細胞質雄性不稔と育種技術（普及版）」シーエムシー出版
【非特許文献３】田丸典彦、木下俊郎、高橋萬右衛門 １９８０ 北海道大学農学部邦文紀要１２（２）：１２４−１２８
【非特許文献４】Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ．＆Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ．１９９９．Ｊ．Ｊａｐａｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．６８（２）：２５６−２６３．
【非特許文献５】Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｊａｐａｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．６８（４）：７８８−７９７．
【非特許文献６】Ｋｅｕｓｇｅｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５０：２８８４−２８９０．
【非特許文献７】Ｍａｓｕｚａｋｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２００６．Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．８１（４）：２５５−２６３．
【非特許文献８】Ｕｍｅｈａｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００６．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １４８（３）：２９５−３０１．
【非特許文献９】執行正義 ２００２ 「染色体工学的手法を用いたネギ属栽培種の改良」 園学研 １（１）：７５−８０．
【非特許文献１０】Ｗｅｎｄｅｌ Ｊ．Ｆ．１９８３．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ Ｕｎｉｖ．Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ．
【非特許文献１１】ｖａｎ Ｈｅｕｓｄｅｎ Ａ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．２０００．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１００：４８０−４８６．
【非特許文献１２】Ｃｈｕｎｇ Ｓ−Ｍ．＆Ｓｔａｕｂ Ｊ．Ｅ．２００３．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：７５７−７６７．
【非特許文献１３】荒木直幸、執行正義 ２００５ 「葉緑体ＳＳＲ（ＣｐＳＳＲ）配列からみたネギ属植物の種間多様性について」 園学雑７４別１：１９９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の様な現状に鑑み、本発明は、ネギ属植物において育種上利用可能な雄性不稔植物及びその細胞ならびにその作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題の解決のため、本発明者らは、核置換による細胞質雄性不稔系統の作出技術に着目した。核置換とは、異種間または異品種間で交配を行い、その子孫株に花粉親を連続して戻し交配して、核ゲノムを限りなく花粉親に近づける（染色体組換えを考慮しない理論値は１−１／２ｎ、ｎは戻し交配の回数）という技術であり、ある組合せにおいては細胞質と形成された核との間で何らかの不和合性が生じて、花粉が正常に形成されないなど雄性不稔の形質が表れるという現象を利用するものである。イネにおいてインディカ品種（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）とジャポニカ品種（Ｏ．ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）との交配に由来する核置換系統で雄性不稔系統が作出されているほか（非特許文献３）、ネギ属植物でもガランサム種（Ａｌｌｉｕｍ ｇａｌａｎｔｈｕｍ）とネギ（Ａ．ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）またはシャロット（Ａ．ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）との交配に由来しガランサム種の核がそれぞれの核で置換された系統に雄性不稔系統が見いだされている（非特許文献４，５）。しかしながらこれまでのところ、ネギ属植物では核置換による細胞質雄性不稔系統の利用は進んでおらず、また北米におけるトウモロコシでのごま葉枯病の大流行の例、すなわちＦ１種子として広く用いられていた単一の雄性不稔系統が新型病原菌に感受性であったため、この細胞質を持つ多くの品種が感染し被害が拡大した例、での教訓から、雄性不稔系統は複数の、由来を異にする系統が並立するのが望ましいと考えられた。この観点から本発明者らは核置換による細胞質雄性不稔系統の作出を可能とするネギ属植物を広く探索し、その中で野生種のネギの一種ロイレイ種（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）の細胞質を持ち、核が非ロイレイ種のネギ属植物の核で置換された植物に強い雄性不稔形質が表れるという事実を見いだし、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の態様は、アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質と、非ロイレイ種ネギ属植物（ロイレイ種ではないネギ属植物、以下同じ）由来の核ゲノムとを有することを特徴とする、雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、核ゲノムが、少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、第１の態様に記載の雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、核ゲノムが、単一種の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、第２の態様に記載の雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様は、非ロイレイ種ネギ属植物が、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）及び／またはシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）であることを特徴とする、第３の態様に記載の雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【００１１】
本発明の第５の態様は、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の雄性不稔ネギ属植物に由来する、植物細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第６の態様は、以下の各工程からなることを特徴とする、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の雄性不稔ネギ属植物の作製方法を提供する。
（１）アリウム・ロイレイ種と非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、雑種植物を得る工程
（２）工程（１）で得られた植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体植物を得る工程
（３）工程（２）で得られた４倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、異質３倍体植物を得る工程
（４）工程（３）で得られた異質３倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、得られた子孫植物の染色体を調査して、ロイレイ種の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）
【発明の効果】
【００１３】
以上の様に本発明によれば、本発明を利用することにより、育種上極めて有用な「細胞質雄性不稔」の形質を、食用、観賞用と広く利用されているネギ属植物に付与することが可能となる。また、本発明の提供する雄性不稔ネギ属植物の作製方法は、過去に報告のあるガランサム種を用いた方法と異なり、その工程に染色体の倍加と異質３倍体の作出を含むことによって、ロイレイ種染色体の排除を容易かつ確実にしており、これによってロイレイ種ゲノム中に含まれる花粉稔性回復遺伝子を排除し、完全な細胞質雄性不稔ネギ属植物を作出可能である。このことはまた、新品種作出までの時間を大幅に短縮するものである。更に、ロイレイ種の細胞質にはべと病や葉枯れ病などネギ属栽培種が罹患しやすい病気への抵抗性がある可能性があり、雄性不稔形質と同時に耐病性も付与することも期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を実施するための最良の形態を示す。本発明は、ネギ属植物において、アリウム・ロイレイ（Ａ．ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムで置換され、雄性不稔の形質を示すことを特徴とする、ネギ属植物を提供する。ロイレイ種は灰色かび病やべと病への抵抗性が知られ、一般的なネギ属栽培種植物と交配親和性を持つ野生種のタマネギの一種であるが、ロイレイ種の細胞質が持つ雄性不稔形質については全く注目されていなかった。本発明を用いて雄性不稔形質を付与可能な非ロイレイ種ネギ属植物は、ロイレイ種と交配可能なアリウム属の植物であればよく、その種別が本発明を限定するものではないが、有用品種として食用のネギ属植物、好ましくはネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）などから選択される食用作物や、花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）などから選択される園芸品種に適用可能である。また、今後の品種改良の有望な遺伝子資源としての野生種など含んだネギ属植物、すなわち下記表１から表２１に掲げるネギ属植物に適用可能である。ネギ属植物は、非特許文献６に示されている通り、種間交配が容易に行えるグループとして知られており、特にここではタマネギ（Ａ．ｃｅｐａ）とＡ．ａｌｔｙｎｃｏｌｉｃｕｍ、Ａ．ｃｈｅｖｓｕｒｉｃｕｍ、Ａ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ａ．ｏｂｌｉｑｕｕｍ、Ａ．ｓａｘａｔｉｌｅ、Ａ．ｓｅｎｅｓｃｅｎｓとの交配による子孫が報告されていることから、たとえロイレイ種との交配が難しい種であっても、下記実施例で示すとおりロイレイ種の核ゲノムをタマネギの核ゲノムで置換した後、この子孫とこれらの種とをかけ合わせるといった手法も適用可能である。
以下、表１から表２１に本願発明が適用可能なネギ属植物のリストを示す。これらの表は現在報告されているネギ属植物をアルファベット順に列記したものであり、表中において、Ａ．とあるのは属名のＡｌｌｉｕｍを省略したものである。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】
【表４】
【００１９】
【表５】
【００２０】
【表６】
【００２１】
【表７】
【００２２】
【表８】
【００２３】
【表９】
【００２４】
【表１０】
【００２５】
【表１１】
【００２６】
【表１２】
【００２７】
【表１３】
【００２８】
【表１４】
【００２９】
【表１５】
【００３０】
【表１６】
【００３１】
【表１７】
【００３２】
【表１８】
【００３３】
【表１９】
【００３４】
【表２０】
【００３５】
【表２１】
【００３６】
本発明の雄性不稔ネギ属植物は、ロイレイ種の細胞質と非ロイレイ種の核とからなる植物であればよく、その組み合わせなどが本発明を限定するものではないが、好適には少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムからなる核を有しているのが良い。ネギ属植物は異種間交配が容易な植物群であり、これまでにもネギとシャロットとの雑種（非特許文献７）、ネギとチャイブとの雑種（非特許文献８）などが報告されており、ロイレイ種と非ロイレイ種との交配によりロイレイ種の染色体を排除した後、別の非ロイレイ種ネギ属植物と交配して品種改良等を行っても良い。複数種の非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムを持つ場合における、非ロイレイ種ネギ属植物の組み合わせ、数、ゲノム内の各種の比率などは必要に応じて適宜変更すれば良い。また、ゲノムの倍数性についても、半数体、２倍体、３倍体以上の高次倍数体等、育種目的に沿ったものであればその内容は適宜選択可能である。更に、非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムを１セット（ｎ）全部ではなく染色体レベルで付与する場合についても、ネギ属植物ではその技術を利用可能であり、本発明の範囲内に含まれるものである。これらの中でも育種上、特に形質の安定性の観点から、単一種の非ロイレイ種ネギ属植物の核を持つものが本発明の実施の態様としては好適である。下記の実施例で示すとおり、非ロイレイ種ネギ属植物の中でも特にシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）及び／またはタマネギ（Ａ．ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）については日常食される野菜として需要も高く、実施の態様として好適である。ロイレイ種の核ゲノムを非ロイレイ種の核ゲノムで置換する方法としては、通常の交配技術を用いるのが好適であるが、細胞工学的な手法、すなわち顕微手術によって直接核を入れ替える手法も原理的には適用可能である。なお、これらの雄性不稔ネギ属植物に由来する細胞も、組織培養などで植物体を再生したり、プロトプラストを形成させ細胞融合に用いたりと、細胞工学的手法により新たな植物体を形成させるための原材料として利用可能であり、本発明の範囲内に含まれるものである。
【００３７】
本発明はまた、以下の各工程、すなわち（１）ロイレイ種と非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、雑種植物を得る工程、（２）前記工程（１）で得られた植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体植物を得る工程、（３）前記工程（２）で得られた４倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、異質３倍体植物を得る工程、（４）前記工程（３）で得られた異質３倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、得られた子孫植物の染色体を調査して、ロイレイ種の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）、からなることを特徴とする、雄性不稔ネギ属植物の作製方法も提供する。
本態様においては、工程（１）で示す通り、ロイレイ種を種子親とし、自然交配や人工交配で種間雑種を形成可能な非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親に用いればよく、その種類や交配の手法は本発明を限定するものではない。工程（１）に続く工程（２）においても、形成された雑種植物の染色体を倍加するという目的のため、植物育種で通常用いられる手法を適宜選択すればよく、その例としては成長点を植物体から単離し、コルヒチン処理によって倍加する手法があげられる。工程（２）に続く工程（３）、（４）では、工程（２）で得られた４倍体植物（複２倍体植物）と工程（１）で用いた花粉親植物とを交配する工程であり、これは広い意味での戻し交配工程であって、核ゲノムからロイレイ種のゲノムすなわち染色体を排除する目的で行われるものである。戻し交配の回数は、多ければ多いほど核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物の核ゲノムに限りなく近づくと考えられ、有効であると考えられるが、実質的に得られた子孫が雄性不稔になればよく、その回数などが本発明を限定するものではない。従来方法では交配の回数によって核置換の確度を上げていたが、下記実施例に示すとおり、得られた子孫植物の組織から分裂中の細胞を採取して染色体を形態的に観察するか、または染色体特異的マーカー遺伝子やくり返し配列などの特定モチーフの多型、あるいはアイソザイムマーカーなどを用いて分子生物学的に染色体を同定するかして、核ゲノム中に含まれる染色体を調査し、ロイレイ種の染色体を持たない子孫植物を選択すれば戻し交配の回数が少なくてすむ。ロイレイ種細胞質の雄性不稔形質が強いため、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）及び／またはタマネギ（Ａ．ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）の核ゲノムで置換された子孫植物を作製するためには、工程（４）の戻し交配工程は理論上１回で可能である。こうして得られた雄性不稔ネギ属植物を種子親として、種々のネギ属植物との間で交配を行い、更なる品種改良に供することも可能である。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
（材料、及び雄性不稔系統の作出工程）まず、材料及び雄性不稔系統の作出工程について説明する。図１は、本実施例に係る雄性不稔ネギ属植物の作製方法を模式的に示すフローチャート図である。本実施例においては、図１に示す様に、ロイレイ種ネギ属植物（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物の核ゲノムで置換された雄性不稔ネギ属植物を得るために、工程（１）として、ロイレイ種とシャロット（Ａ．ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）との交配を行った。ロイレイ種のＣＰＲＯ９７１７５株を種子親（ｒＲＲ：２ｎ＝１６；ｒはロイレイ種細胞質を、Ｒはロイレイ種ゲノムをそれぞれ表す。以下同じ）とし、シャロットの８６２０８株（ａＡＡ：２ｎ＝１６；ａはシャロット細胞質を、Ａはシャロットゲノムをそれぞれ表す。以下同じ）を花粉親として交配を行った。交配の際にはロイレイ株で自家受粉が起こらないように除雄を行い、少量のシャロット花粉を手作業にてロイレイ株に受粉させてＦ１を得た。これらの交配で得られた果実から、成熟した種子を採取した。採取された種子の一部を、湿らせた濾紙を敷いたシャーレ上に置き、２５℃、暗黒条件下で発芽させた。発芽後は２５℃、照明下で緑化させ、ある程度まで成長させた後、順化させて培養土に移植し、温室内で栽培した。以後の交配についても、同様の方法を用いた。
【００３９】
また、図１に示すように、工程（２）として、ロイレイ種とシャロットのＦ１（ｒＡＲ）の染色体の倍加を行った。先の工程（１）で得られたＦ１から茎頂部組織を切り出し、コルヒチン０．１％を含むＬｉｎｓｍｅｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）固形培地上に組織を置床して、暗黒条件下で４日間培養した。その後、組織をＬＳフリー培地上に移し、２ヶ月間培養した後、得られた再生植物体について根端細胞の染色体を酢酸カーミンで染色し、顕微鏡下で染色体調査を行った。予めロイレイ種とシャロットの染色体の形や大きさを顕微鏡下で調べておき、これと再生植物体の染色体像を形態的に比較することで、どの染色体をどれだけもっているかを決定した。染色体の観察は以下の方法で行った。まず、５−１０ｍｍに伸長した二次根を採取し、酢酸−エタノール混合液（１：３）内にて冷蔵庫内で一晩固定した。次に、固定後の根を６０℃の１規定塩酸で６分間処理し、解離・加水分解させた後、塩基性フクシンを用いてフォイルゲン染色を行った。続いて、スライドガラス上に４５％酢酸を１滴落とし、その中に染色した根端を入れ、カバーガラスを載せて先の尖った棒でカバーガラス上から試料を叩き、カバーガラスを圧した。この操作により細胞や染色体を分散させ、染色体を一平面上に配列させた後、光学顕微鏡下で染色体を観察した。この観察により、再生植物体の中から、ロイレイ種染色体とシャロットの染色体をそれぞれ２組ずつ持つもの、すなわち複２倍体（ｒＡＡＲＲ：２ｎ＝３２）を選抜して次代の交配に用いた。
【００４０】
更に図１に示すように、工程（３）として、先の工程（２）で得られた複２倍体を種子親とし、シャロット１８−５株、及びタマネギ晩抽苔株を花粉親として戻し交配を行って第一代の異質３倍体（ＢＣ１）を作出した。下記表２２に、交配の結果を示す。なお、下記表２２において種子形成胚珠率は、種子形成胚珠率＝［種子数／（交配小花数×６）］で示す計算式により求めたものである。
【００４１】
【表２２】
【００４２】
上記表２２からも明らかな様に、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）×シャロット（ａＡＡ）の組み合わせでは、５６８個の小花に交配を行い、うち１２４個の小花が結実し、種子数は２３２個であった。この値を基に種子形成胚珠率［種子数／（交配小花数×６）］を計算すると、６．８％という値を示した。このうち７９個の種を前述の方法にて発芽させたところ、２９個が発芽し、発芽率は３６．７％であった。この２９個体を培養したところ、２３個体が正常に成長し、その生存率は８６．２％であった。
一方、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）とタマネギ晩抽苔株（ｃＣＣ）との組み合わせでは、７９個の小花に交配を行い、うち３３個の小花が結実し、種子数は７５個であった。種子形成胚珠率はシャロットよりも高く１５．８％の値を示した。種子のうち５２個を発芽させたところ、１０個が発芽し、発芽率は１９．２％であった。この１０個体を培養したところ、６個体が正常に成長し、その生存率は６０％であった。タマネギとシャロットは形態的に違いはあるが、種レベルでは同種とされ、そのゲノムＡとＣとは等価であると指摘されているが、この結果はそれを裏付けるものである。
【００４３】
図１に示すように、工程（３）で得られた子孫株のうち、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）とシャロット（ａＡＡ）の交配に由来し、染色体数が２４である異質３倍体（ｒＡＡＲ）ＣＭ２３系統を材料とし、ここにタマネギ北見交３９号（ｃＣＣ）をかけ合わせ、工程（４）の戻し交配を行って第二代（ＢＣ２）を作出した。交配の結果を、下記表２３に示す。
【００４４】
【表２３】
【００４５】
上記表２３で示すように、交配で得られた種子１７８個のうち、１３０個が発芽し、発芽率は７３．０％であった。発芽した個体のうち正常に成長したものは１２７個体あり、生存率は９７．７％と高い値を示した。
正常に成長したＢＣ２世代１０８個体につき、その染色体数を上記の方法で形態学的に調査した。結果を下記表２４に示す。
【００４６】
【表２４】
【００４７】
上記表２４に示すように、染色体数が１６、すなわちロイレイ種由来の染色体が排除され、核ゲノムがシャロット及びタマネギの核ゲノムで置換されたと考えられるものが６８個体あり、全体の６３％を占めた。次いで、染色体数が１７、すなわちロイレイ種由来の単一染色体を有するものが３８個体で、割合は３５％であった。染色体数が１８−２２のものは見られず、染色体数が２３すなわちロイレイ種由来の染色体が１本欠失した個体が１個体、染色体数が２４すなわちロイレイ種由来の染色体を全て持つ異質３倍体が１個体で、割合はそれぞれ０．９％と非常に少なかった。４倍体（２ｎ＝３２）は観察されなかった。
これらの結果は、本発明の提供する、ロイレイ種由来の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種由来の核ゲノムからなるネギ属植物の作製方法（工程１−４）を用いれば、ＢＣ２世代でロイレイ種の染色体を持たないものが７割近くと効率よく目的の系統を作製することが可能であることを示している。
【実施例２】
【００４８】
（アイソザイム分析による核ゲノムの同定）本実施例においては、アイソザイム分析による核ゲノムの同定について詳細に説明する。染色体数が２ｎ＝１６を示したＢＣ２系統、及び２ｎ＝１７を示し染色体の形態からロイレイ種の第１染色体を有すると推定されたＢＣ２系統の各１個体を、ネギ属植物第１染色体特異的アイソザイムマーカーＬａｐ−ｌ（非特許文献９参照）を用いて分析し、アイソザイムの出現パターンをロイレイ種、シャロット、ロイレイ種とシャロットのＦ１、ＢＣ１のそれぞれと比較した。Ｌａｐ−１（ロイシンアミノペプチダーゼ−１）は細胞内では単畳体（モノマー）として存在し、種によってその分子量にばらつきがあることから、アイソザイム分析のマーカーとして広く利用されているタンパク質である。またネギ属植物では、Ｌａｐ−１をコードする遺伝子が第１染色体上に存在することが知られており、Ｌａｐ−１は第１染色体のマーカーとして利用可能である。各植物試料から、それぞれ葉身部を０．２ｇ程度切り取って乳鉢に入れ、Ｗｅｎｄｅｌの抽出液（０．６％ リン酸水素２Ｎａ，７％ ショ糖，５％ ＰＶＰ−４０，０．０５％ ＥＤＴＡ，０．０５％ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，０．１％ Ｌ−アスコルビン酸Ｎａ，０．１％ Ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ，０．０５％ ピロ亜硫酸Ｎａ，０．１％ ｖ／ｖ メルカプトエタノール；非特許文献１０参照）を１ｍｌと石英砂を加え、氷上にて乳棒を用いて磨砕した。磨砕した試料を、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清２０μｌを電気泳動用の試料とした。電気泳動は５％ポリアクリルアミドゲルを用い、１５Ａ（ゲル１枚あたり）の定電流で３時間半、冷蔵庫内にて泳動した。電気泳動の終了後、ゲルを染色液［０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中に０．０２％ Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅβ−Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ，０．０５％ Ｆａｓｔ Ｇａｒｎｅｔ ＧＢＣ ｓａｌｔ，１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］に移し、３７℃、暗黒条件下で３０分間、振とうさせながら染色した。ゲル上にバンドが出現した後、１．５％酢酸で染色反応を止め、ゲルを水道水で５−６回洗浄して酢酸を除去した。ガラス板上にＧｅｌｂｏｎｄ（登録商標） ＰＡＧ ｆｉｌｍ（タカラバイオ社）を乗せ、その上にゲルを乗せ、１０％グリセロールをゲルの上に重層し、更にその上からセロファンを乗せてシールした。この状態で２５℃の暗所に置き、全体を乾燥させた。
【００４９】
アイソザイム分析の結果を模式化したものを、図２に示す。図中レーン１−６は電気泳動で得られたバンドパターンを模式化したものであり、レーン１はロイレイ種、レーン２はシャロット、レーン３はロイレイ種とシャロットのＦ１、レーン４はＢＣ１の異質３倍体、レーン５は２ｎ＝１６を示したＢＣ２、レーン６は２ｎ＝１７を示したＢＣ２の結果をそれぞれ表している。ロイレイ種第１染色体にコードされたＬａｐ−１の産物をαで、シャロット及びタマネギの第１染色体にコードされたＬａｐ−１の産物をβでそれぞれ示しており、これらの結果から、２ｎ＝１７のＢＣ２個体はロイレイの第１染色体とシャロット及び／またはタマネギの第１染色体の両方を持っており、反対に２ｎ＝１６のＢＣ２個体はロイレイ種の染色体を持たず、シャロット及び／またはタマネギの染色体を持っていることが明らかとなった。この結果はまた、本発明の方法を用いることでロイレイ種の染色体がＢＣ２世代で排除可能であることも示している。
【実施例３】
【００５０】
（ＳＳＲ多型解析による細胞質の同定）本実施例では、ＳＳＲ多型解析による細胞質の同定について説明する。上記の様なＢＣ２系統において染色体数が２ｎ＝１６を示した個体７個体（５，６，１４，２２，２４，３０，４１株）について、葉緑体ＤＮＡ由来のＳＳＲ配列（Ｓｈｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ：ｃｃＳＳＲ１１）に着目してＤＮＡ多型解析を行い、それぞれの細胞質の同定を行った。葉緑体は母系遺伝することが知られており、その葉緑体中に含まれるＤＮＡの多型は細胞質の由来を知るためのマーカーとなる。
試料からの全ＤＮＡの抽出は、ｖａｎ Ｈｅｕｓｄｅｎらの方法（非特許文献１１参照）に従った。具体的には、植物試料から葉身部０．０５ｇを切り取り、これに抽出液（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ３１２．５μｌ，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３１２．５μｌ，Ｓａｒｋｏｓｙｌ １２５μｌ，亜硫酸ナトリウム２．８５ｍｇを混合したもの）７５０μｌを加えて磨砕した後、６５℃で１時間インキュベートした。次に、磨砕試料をチューブに移し、１４０００ｒｐｍ、４℃で９０秒遠心し、上清にクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）を７５０μｌ加えて振とうし、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。続いて、上清（水相）４００μｌを別チューブに移し、等量の冷やしたイソプロパノールを加えて混合し、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心してペレットを得た。そして、上清を捨て、ペレットに７０％エタノールを５００μｌ加えて１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨ててペレットを室温で乾かし、１００μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ）を加えて懸濁し葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）試料とした。分光高度計を用い試料液中のＤＮＡ濃度を測定し、終濃度が２０ｎｇ／μｌとなるように調整した。この試料液をＰＣＲ用に供した。
ＰＣＲは、Ｃｈｕｎｇ＆Ｓｔａｕｂにより開発されたプライマーセット（非特許文献１２）のうちｃｃＳＳＲ−１１プライマーを用いて，以下の条件により行った。反応液組成は、全量２５μｌ；５０ｍＭ ＫＣｌ，４ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，０．４ｍＭ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ，０．４ｍＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ，０．１２５ ｕｎｉｔ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ，１００ｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ，１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に調整した。ＰＣＲ反応は，予備反応９５℃ １１分；変性９４℃ ３０秒，アニーリング５６℃ ３０秒，伸長反応７２℃ ３０秒を４０サイクル；後処理７２℃ １０分で行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行い、そのバンドパターンをロイレイ種、シャロット、タマネギ、２ｎ＝１６であるＢＣ２で比較した。
【００５１】
ＰＣＲの結果を、図３に示す。図３はｃｐＤＮＡのｃｃＳＳＲ−１１のＰＣＲ増幅パターンを示す図である。図中レーンｍは分子量マーカー（ｂｐ）を表し、レーンＲはロイレイ種を、レーンＡはシャロットを、レーンＣはタマネギを表し、以降の５−４１はＢＣ２各株のサンプルの結果である。本解析で用いたｃｃＳＳＲ−１１プライマー（非特許文献１２）でＰＣＲを行うと、葉緑体ＤＮＡの多型が増幅されるバンドの分子量の違いとして表れ、今回用いた試料ではロイレイ種が最も大きく、次いでタマネギ（ロイレイ種よりも１塩基小さい）、最も小さいシャロットとなり、ＢＣ２細胞の葉緑体ＤＮＡが示す多型と比較可能である。レーン５−４１が示す通り、全てのＢＣ２個体でロイレイ種と同じ位置に単一のバンドが出現し、このことから、これらのＢＣ２個体はロイレイ種に由来する細胞質を有していることが明らかとなった。
【実施例４】
【００５２】
（ＢＣ２世代の花粉稔性の調査）本実施例では、ＢＣ２世代の花粉稔性の調査結果について説明する。ＢＣ２世代において、栽培により開花が見られた個体の花粉稔性を、酢酸カーミンの染色性と１０％（ｗ／ｖ）ショ糖寒天培地上における発芽率の２つの指標により測定した。酢酸カーミンの染色性は、最初の小花が開花した直後とその約１週間後に、１個体につき３小花、合計１５００粒以上の花粉を採取し、酢酸カーミンで染色して形態学的に観察して、生殖核と栄養核の両方を持つ花粉を可稔の正常な花粉、生殖核を持たない花粉を不稔の花粉とし、それぞれの個体について全花粉中の可稔の花粉の割合（％）を求めた。またショ糖寒天培地上における発芽率は、酢酸カーミン染色による２回目の調査後に行い、１個体から３小花、合計３００粒以上の花粉を採取してショ糖寒天培地上に蒔き、２５℃、湿度５０％の条件下で２時間培養して、顕微鏡下で花粉管が伸長していたものを可稔の花粉、伸長がみられなかったものを不稔の花粉とし、それぞれの個体について全花粉中の可稔の花粉の割合（％）を算出した。
花粉稔性の調査の結果を下記表２５に示す。
【００５３】
【表２５】
【００５４】
上記表２５に示すように、カーミン染色による２回の調査から、全個体のうち８割−９割近くの個体が、生殖核と栄養核の両方を持ち正常（可稔）と考えられる花粉を１０％も持たず、花粉稔性が極めて低いことが示された。更に、ショ糖寒天培地上における花粉の発芽率は、カーミン染色による結果よりも更に低く、ほとんどの個体が正常花粉を花粉全体の１２％未満しかもたないことが明らかとなった。カーミン染色と花粉培養の両調査結果から、２ｎ＝１６であるＢＣ２世代の各個体に、強い雄性不稔形質が表れていることが示された。
これらの結果から、本発明の提供する、ロイレイ種の細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲノムを有するネギ属植物が、雄性不稔形質を有していることが示された。
【実施例５】
【００５５】
実施例４の花粉稔性調査結果について、より本質的な雄性不稔形質、すなわち花粉稔性が０または１％未満という個体の頻度に着目して改めて集計した。結果を下記表２６に示す。表２６は表２５と基本的に同じ調査結果を元にしており、個体あたりの可稔花粉の割合（％）を表２５よりも細かく分け、可稔花粉が０のもの、及び１％未満のものを示している。
カーミン染色１回目の調査では、可稔花粉が０のものが全体の２０％にあたる１２個体観察され、また１％未満のものも１６個体（２６．７％）観察された。２回目の調査でも可稔花粉が０、１％未満の個体がそれぞれ全体の１８．５％、１４．８％を占めていた。更に、花粉の発芽率に着目した調査では、全体の実に７５％が可稔花粉をまったく持たない不稔の個体であり、本発明の提供するロイレイ種の細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲノムを有する２倍体のネギ属植物に、強い雄性不稔の形質が付与されていることが改めて示された。
【００５６】
【表２６】
【実施例６】
【００５７】
（葉緑体ＳＳＲの塩基配列を用いた他種ネギ属植物との比較）実施例３で解析した葉緑体ＤＮＡ上のくり返し配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ：ｃｃＳＳＲ）について、より詳細な多型解析を行い、本発明において作出した核置換系統が確かにロイレイ種の細胞質を有しているかどうかを検証した。
多型解析用のプライマーとしては、先行研究（非特許文献１３）において本発明者らが明らかにした結果より、Ｃｈｕｎｇ＆Ｓｔａｕｂにより開発されたｃｃＳＳＲのプライマー（非特許文献１２）のうち、ｃｃＳＳＲ−１１プライマー及びｃｃＳＳＲ−１７プライマーの２組のプライマーを用いた。試料としては栽培種、野生種を含む複数種のネギ属植物−Ａ．ｃｅｐａ種に属する４つの栽培種、すなわちネギ’九条細’系統、タマネギ’北見交３９号’系統、シャロット’８６２０８’系統、ワケギ’寒知らず（晩成）’系統、及び４種の野生種であるＡ．ｇａｌａｎｔｈｕｍ’９７２０５−２２’系統、Ａ．ｒｏｙｌｅｉ’９５００１−１’系統、Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ’９７２０３−８’系統、Ａ．ａｌｔａｉｃｕｍ’９７０１０−２５’系統の４系統、ニラＡ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ’広幅にら’系統とラッキョウＡ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ（系統不詳）の１０種類に加え、本発明の核置換系統であるＣＭ２３−ＲＢ６、ＣＭ２３−ＲＢ１５、ＣＭ２３−ＲＢ２５、ＣＭ２３−ＲＢ３０、ＣＭ２３−ＲＢ３６、ＣＭ２３−ＲＢ３９、ＣＭ２３−ＲＢ４１の７系統の合計１７系統を試料として供した。
【００５８】
各試料から微量サンプル抽出法（実施例３の方法に従う）により全ＤＮＡを抽出した。この全ＤＮＡを鋳型とし、上記２組のプライマーについて、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーの５’末端を６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤのうち１種類で蛍光標識し、これらの蛍光プライマーを１反応につき１組用いてＰＣＲを行い、各試料のＤＮＡからｃｃＳＳＲ領域を増幅させた。ＰＣＲ産物はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によりキャピラリー電気泳動を行い、ＧｅｎｅＳｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりフラグメントサイズを決定した。
【００５９】
下記表２７に、フラグメント解析の結果を示す。表中の種名・品種名はそれぞれ上記野生種、栽培種、核置換の各系統を示し、産物の分子量は葉緑体ＤＮＡからｃｃＳＳＲ−１１プライマー、ｃｃＳＳＲ−１７プライマーで増幅した産物の分子量（ｂｐ）の測定結果を示す。
ｃｃＳＳＲ−１１プライマーにより、１０２−１２０ｂｐのＰＣＲ産物が増幅され、本発明の核置換系統では１１１．６−１１１．７ｂｐの産物が増幅された。これを他種と比較すると、野生種ではＡ．ｒｏｙｌｅｉの１１１．６ｂｐと一致し、一方で従来技術において核置換による雄性不稔が報告されているＡ．ｇａｌａｎｔｈｕｍの１０２．７ｂｐとは異なっており、本発明の核置換により作出された雄性不稔系統が従来知られた系統とは異なる系統であることが示された。更に交配に用いたシャロット（１０６．１ｂｐ）及びタマネギ（１１０．７ｂｐ）とも異なっており、本発明の雄性不稔系統がＡ．ｒｏｙｌｅｉの細胞質を有していることが示された。
一方ｃｃＳＳＲ−１７プライマーにより、１９４−２０２ｂｐのＰＣＲ産物が増幅され、本発明の核置換系統では１９４．４−１９４．８ｂｐの産物が増幅された。これはＡ．ｒｏｙｌｅｉの１９４．７ｂｐと一致し、一方ｃｃＳＳＲ−１１プライマーではＰＣＲ産物の分子量が比較的近かったタマネギにおける１９９．６ｂｐとは大きく異なっていた。ここで、北見交３９号系統が細胞質−核遺伝子支配による雄性不稔系統（自然突然変異から従来技術により作製された雄性不稔系統）を母方とするＦ１品種であり、雄性不稔の細胞質（ｓ細胞質）を有することから、本発明で作製された雄性不稔系統が、従来用いられてきたタマネギの雄性不稔系統とは異なる雄性不稔系統であることが改めて示された。
なお本実施例におけるＰＣＲ産物の分子量は、解析ソフトを用いた計算値であるため、小数点以下の数字を含む値で示されている。
【００６０】
【表２７】
【００６１】
以上の結果を、図４及び図５に可視化して表す。図４はｃｃＳＳＲ−１１プライマーを用いたＰＣＲの結果を、その産物の分子量からグラフ上に模式化したものであり、レーン１−４は野生種（１：Ａ．ｒｏｙｌｅｉ，２：Ａ．ｇａｌａｎｔｈｕｍ，３．Ａ．ａｌｔａｉｃｕｍ，４：Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）を、レーン５−１０は栽培種（５：シャロット、６：タマネギ、７：ラッキョウ、８：ニラ、９：ネギ、１０：ワケギ）を、レーン１１−１７は本発明の核置換系統（ＣＭ２３−ＲＢ系統、番号は株番号）をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分子量（ｂｐ）を表している。図中矢印で示した様に、核置換系統のＰＣＲ産物はＡ．ｒｏｙｌｅｉのものとほぼ一致し、他の野生種や栽培種とは異なっていた。
図５はｃｃＳＳＲ−１７プライマーを用いたＰＣＲの結果を、その産物の分子量からグラフ上に模式化したものであり、レーン１−４は野生種（１：Ａ．ｒｏｙｌｅｉ，２：Ａ．ｇａｌａｎｔｈｕｍ，３．Ａ．ａｌｔａｉｃｕｍ，４：Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）を、レーン５−１０は栽培種（５：シャロット、６：タマネギ、７：ラッキョウ、８：ニラ、９：ネギ、１０：ワケギ）を、レーン１１−１７は本発明の核置換系統（ＣＭ２３−ＲＢ系統、番号は株番号）をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分子量（ｂｐ）を表している。図中矢印で示した様に、核置換系統のＰＣＲ産物はＡ．ｒｏｙｌｅｉのものとほぼ一致し、加えて図中囲みで示したタマネギ（雄性不稔のｓ細胞質を持つ）とは異なるサイズであった。
これらの結果は、本発明で作製した核置換による雄性不稔系統が、Ａ．ｒｏｙｌｅｉの細胞質を有している事を示している。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、ロイレイ種ネギ属植物と非ロイレイ種ネギ属植物との交配によって作出される雄性不稔ネギ属植物であり、新品種作出までの大幅な時間短縮を可能にするなど、農業の育種分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の実施の形態において提供する雄性不稔ネギ属植物の作製方法を模式的に示す。
【図２】本発明の実施の形態の交配各世代におけるＬａｐ−１アイソザイム分析の結果を模式的に示す。
【図３】本発明の実施の形態で用いたロイレイ種、シャロット、タマネギ及びＢＣ２世代の葉緑体ＤＮＡの多型の解析結果を示す。
【図４】本発明の実施例における葉緑体ＤＮＡの多型（ｃｃＳＳＲ−１１プライマー使用）の解析結果の模式図を示す。
【図５】本発明の実施例における葉緑体ＤＮＡの多型（ｃｃＳＳＲ−１７プライマー使用）の解析結果の模式図を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネギ属植物において品種改良などに有用な雄性不稔植物及びその作製方法に関し、より詳しくは、ロイレイ種の細胞質と非ロイレイ種ネギ属植物（ロイレイ種ではないネギ属植物、以下同じ）由来の核ゲノムとを有し、雄性不稔の形質を有するネギ属植物及びその細胞、ならびにその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種子植物において、雄性器官に異常を生じ、稔性のある正常な花粉の形成が阻害される現象は雄性不稔（Ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）と呼ばれ、例えば花の構造上おしべの除去（除雄）が困難な野菜等であっても、雄性不稔の形質を持っていればその必要がなくなるため、雑種の形成やその制御が容易になるという利点を持っている（非特許文献１）。雄性不稔は通常、自然突然変異として単離される形質であり、その原因としては、核遺伝子に存在する因子の支配を受ける場合（Ｇｅｎｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）、細胞質及び核の両方の因子の支配を受ける場合（Ｇｅｎｅ−ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）の２つの型があり、育種対象の植物種などにより使い分けられている。
【０００３】
有用植物の雄性不稔のうち、ネギ属植物においては、雄性不稔の形質が細胞質（Ｓ＝雄性不稔細胞質、Ｎ＝正常細胞質）及び核（優性稔性回復遺伝子ＭＳ、劣性対立遺伝子ｍｓ）の両方の因子の支配を受ける型であることが知られている（非特許文献２）。雄性不稔形質を有用品種に付与することは、育種上、また種苗生産上きわめて有用であるが、ネギ属植物を用いて雄性不稔系統を作出するためには、タマネギを用いた例では、（Ａ）自然突然変異として単離された雄性不稔系統Ｓ１（Ｓ−ｍｓｍｓ）と改良対象となる品種Ｎ１（Ｎ−ＭＳＭＳ）とを交配して稔性Ｆ１（Ｓ−ＭＳｍｓ）を得、（Ｂ）次いでＦ１（Ｓ−ＭＳｍｓ）を花粉親としてＮ１（Ｎ−ＭＳＭＳ）との間で交配・採種して核因子がヘテロの子孫を得、（Ｃ）更に（Ｂ）で得られた子孫同士（Ｎ−ＭＳＭＳ及びＮ−ＭＳｍｓ：両者は区別できない）を多数交配してＮ−ｍｓｍｓの形質を持った子孫（雄性不稔維持系統）を作出し、（Ｄ）最終的にＳ１（Ｓ−ｍｓｍｓ）とＮ−ｍｓｍｓ形質を持つ子孫とを交配することによって、品種としてはＮ１の形質を持ち、かつ雄性不稔形質を有する雄性不稔子孫（Ｓ−ｍｓｍｓ）という工程を経るのが従来の方法であった。
この様な従来の方法においては、採種と定植の過程を含むことから作出には最低でも７年間が必要であり、また特に工程（Ｂ）及び（Ｃ）では外見では区別がつかない子孫株どうしを多数かけ合わせる必要があるなど、非常な労力を要するのが現状であった。
【０００４】
また、他種植物においては、イタリアンライグラスとペレニアルライグラスとを交配して雄性不稔ライグラスを作製する方法（特許文献１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａの細胞とＢ．ｎａｐｕｓ等の細胞とを融合させ、雄性不稔アブラナ科植物を作製する方法（特許文献２，４）、自然界から単離された雄性不稔系統を用いる雄性不稔のスギ（特許文献３）、大豆（特許文献５）、コムギ（特許文献６）の作製方法、その他シンノリン化合物を用いてユリ綱植物の花粉を抑制する方法（特許文献７）や遺伝子組み換えを用いて雄性不稔形質を付与する方法等が提案されているが、化合物を用いたり遺伝子組み換えを用いる方法は、特に食に関するものでは社会的な抵抗感があり、また他種植物における雄性不稔形質の事例ではその植物に固有の因子を利用するものであるため、ネギ属植物には適用できないという問題があった。このため、ネギ属植物においても、育種上利用可能で遺伝子組み換えや化合物処理などによらない雄性不稔植物の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開２００４−２２２６４６号公報 雄性不稔ライグラス類及びその作出方法
【特許文献２】特開平１０−０５２１８５号公報 細胞原形質雄性不稔Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（キャベツ）及びそのような植物の生産法
【特許文献３】特開平１０−２４８４１８号公報 スギ雄性不稔個体の作出方法
【特許文献４】特開平７−０３１３０７号公報 雄性不稔植物の育種方法及び増殖方法
【特許文献５】特表２０００−５１０３４６号公報 細胞質遺伝雄性不稔大豆及び雑種大豆を生産する方法
【特許文献６】特表２０００−５１４６６４号公報 ハイブリッドコムギの生産方法
【特許文献７】特開平５−３０１８０７号公報 ユリ綱植物において雄性不稔を誘発する方法
【非特許文献１】鈴木芳夫ほか著 １９９３「新 蔬菜園芸学」朝倉書店
【非特許文献２】山口彦之監修 ２００３「細胞質雄性不稔と育種技術（普及版）」シーエムシー出版
【非特許文献３】田丸典彦、木下俊郎、高橋萬右衛門 １９８０ 北海道大学農学部邦文紀要１２（２）：１２４−１２８
【非特許文献４】Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ．＆Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ．１９９９．Ｊ．Ｊａｐａｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．６８（２）：２５６−２６３．
【非特許文献５】Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｊａｐａｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．６８（４）：７８８−７９７．
【非特許文献６】Ｋｅｕｓｇｅｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５０：２８８４−２８９０．
【非特許文献７】Ｍａｓｕｚａｋｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２００６．Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．８１（４）：２５５−２６３．
【非特許文献８】Ｕｍｅｈａｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００６．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １４８（３）：２９５−３０１．
【非特許文献９】執行正義 ２００２ 「染色体工学的手法を用いたネギ属栽培種の改良」 園学研 １（１）：７５−８０．
【非特許文献１０】Ｗｅｎｄｅｌ Ｊ．Ｆ．１９８３．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ Ｕｎｉｖ．Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ．
【非特許文献１１】ｖａｎ Ｈｅｕｓｄｅｎ Ａ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．２０００．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１００：４８０−４８６．
【非特許文献１２】Ｃｈｕｎｇ Ｓ−Ｍ．＆Ｓｔａｕｂ Ｊ．Ｅ．２００３．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：７５７−７６７．
【非特許文献１３】荒木直幸、執行正義 ２００５ 「葉緑体ＳＳＲ（ＣｐＳＳＲ）配列からみたネギ属植物の種間多様性について」 園学雑７４別１：１９９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の様な現状に鑑み、本発明は、ネギ属植物において育種上利用可能な雄性不稔植物及びその細胞ならびにその作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題の解決のため、本発明者らは、核置換による細胞質雄性不稔系統の作出技術に着目した。核置換とは、異種間または異品種間で交配を行い、その子孫株に花粉親を連続して戻し交配して、核ゲノムを限りなく花粉親に近づける（染色体組換えを考慮しない理論値は１−１／２ｎ、ｎは戻し交配の回数）という技術であり、ある組合せにおいては細胞質と形成された核との間で何らかの不和合性が生じて、花粉が正常に形成されないなど雄性不稔の形質が表れるという現象を利用するものである。イネにおいてインディカ品種（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）とジャポニカ品種（Ｏ．ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）との交配に由来する核置換系統で雄性不稔系統が作出されているほか（非特許文献３）、ネギ属植物でもガランサム種（Ａｌｌｉｕｍ ｇａｌａｎｔｈｕｍ）とネギ（Ａ．ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）またはシャロット（Ａ．ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）との交配に由来しガランサム種の核がそれぞれの核で置換された系統に雄性不稔系統が見いだされている（非特許文献４，５）。しかしながらこれまでのところ、ネギ属植物では核置換による細胞質雄性不稔系統の利用は進んでおらず、また北米におけるトウモロコシでのごま葉枯病の大流行の例、すなわちＦ１種子として広く用いられていた単一の雄性不稔系統が新型病原菌に感受性であったため、この細胞質を持つ多くの品種が感染し被害が拡大した例、での教訓から、雄性不稔系統は複数の、由来を異にする系統が並立するのが望ましいと考えられた。この観点から本発明者らは核置換による細胞質雄性不稔系統の作出を可能とするネギ属植物を広く探索し、その中で野生種のネギの一種ロイレイ種（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）の細胞質を持ち、核が非ロイレイ種のネギ属植物の核で置換された植物に強い雄性不稔形質が表れるという事実を見いだし、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の態様は、アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質と、非ロイレイ種ネギ属植物（ロイレイ種ではないネギ属植物、以下同じ）由来の核ゲノムとを有することを特徴とする、雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、核ゲノムが、少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、第１の態様に記載の雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、核ゲノムが、単一種の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、第２の態様に記載の雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様は、非ロイレイ種ネギ属植物が、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）及び／またはシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）であることを特徴とする、第３の態様に記載の雄性不稔ネギ属植物を提供する。
【００１１】
本発明の第５の態様は、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の雄性不稔ネギ属植物に由来する、植物細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第６の態様は、以下の各工程からなることを特徴とする、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の雄性不稔ネギ属植物の作製方法を提供する。
（１）アリウム・ロイレイ種と非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、雑種植物を得る工程
（２）工程（１）で得られた植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体植物を得る工程
（３）工程（２）で得られた４倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、異質３倍体植物を得る工程
（４）工程（３）で得られた異質３倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、得られた子孫植物の染色体を調査して、ロイレイ種の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）
【発明の効果】
【００１３】
以上の様に本発明によれば、本発明を利用することにより、育種上極めて有用な「細胞質雄性不稔」の形質を、食用、観賞用と広く利用されているネギ属植物に付与することが可能となる。また、本発明の提供する雄性不稔ネギ属植物の作製方法は、過去に報告のあるガランサム種を用いた方法と異なり、その工程に染色体の倍加と異質３倍体の作出を含むことによって、ロイレイ種染色体の排除を容易かつ確実にしており、これによってロイレイ種ゲノム中に含まれる花粉稔性回復遺伝子を排除し、完全な細胞質雄性不稔ネギ属植物を作出可能である。このことはまた、新品種作出までの時間を大幅に短縮するものである。更に、ロイレイ種の細胞質にはべと病や葉枯れ病などネギ属栽培種が罹患しやすい病気への抵抗性がある可能性があり、雄性不稔形質と同時に耐病性も付与することも期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を実施するための最良の形態を示す。本発明は、ネギ属植物において、アリウム・ロイレイ（Ａ．ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムで置換され、雄性不稔の形質を示すことを特徴とする、ネギ属植物を提供する。ロイレイ種は灰色かび病やべと病への抵抗性が知られ、一般的なネギ属栽培種植物と交配親和性を持つ野生種のタマネギの一種であるが、ロイレイ種の細胞質が持つ雄性不稔形質については全く注目されていなかった。本発明を用いて雄性不稔形質を付与可能な非ロイレイ種ネギ属植物は、ロイレイ種と交配可能なアリウム属の植物であればよく、その種別が本発明を限定するものではないが、有用品種として食用のネギ属植物、好ましくはネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｃｔｏｒａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）などから選択される食用作物や、花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）などから選択される園芸品種に適用可能である。また、今後の品種改良の有望な遺伝子資源としての野生種など含んだネギ属植物、すなわち下記表１から表２１に掲げるネギ属植物に適用可能である。ネギ属植物は、非特許文献６に示されている通り、種間交配が容易に行えるグループとして知られており、特にここではタマネギ（Ａ．ｃｅｐａ）とＡ．ａｌｔｙｎｃｏｌｉｃｕｍ、Ａ．ｃｈｅｖｓｕｒｉｃｕｍ、Ａ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ａ．ｏｂｌｉｑｕｕｍ、Ａ．ｓａｘａｔｉｌｅ、Ａ．ｓｅｎｅｓｃｅｎｓとの交配による子孫が報告されていることから、たとえロイレイ種との交配が難しい種であっても、下記実施例で示すとおりロイレイ種の核ゲノムをタマネギの核ゲノムで置換した後、この子孫とこれらの種とをかけ合わせるといった手法も適用可能である。
以下、表１から表２１に本願発明が適用可能なネギ属植物のリストを示す。これらの表は現在報告されているネギ属植物をアルファベット順に列記したものであり、表中において、Ａ．とあるのは属名のＡｌｌｉｕｍを省略したものである。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】
【表４】
【００１９】
【表５】
【００２０】
【表６】
【００２１】
【表７】
【００２２】
【表８】
【００２３】
【表９】
【００２４】
【表１０】
【００２５】
【表１１】
【００２６】
【表１２】
【００２７】
【表１３】
【００２８】
【表１４】
【００２９】
【表１５】
【００３０】
【表１６】
【００３１】
【表１７】
【００３２】
【表１８】
【００３３】
【表１９】
【００３４】
【表２０】
【００３５】
【表２１】
【００３６】
本発明の雄性不稔ネギ属植物は、ロイレイ種の細胞質と非ロイレイ種の核とからなる植物であればよく、その組み合わせなどが本発明を限定するものではないが、好適には少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムからなる核を有しているのが良い。ネギ属植物は異種間交配が容易な植物群であり、これまでにもネギとシャロットとの雑種（非特許文献７）、ネギとチャイブとの雑種（非特許文献８）などが報告されており、ロイレイ種と非ロイレイ種との交配によりロイレイ種の染色体を排除した後、別の非ロイレイ種ネギ属植物と交配して品種改良等を行っても良い。複数種の非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムを持つ場合における、非ロイレイ種ネギ属植物の組み合わせ、数、ゲノム内の各種の比率などは必要に応じて適宜変更すれば良い。また、ゲノムの倍数性についても、半数体、２倍体、３倍体以上の高次倍数体等、育種目的に沿ったものであればその内容は適宜選択可能である。更に、非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムを１セット（ｎ）全部ではなく染色体レベルで付与する場合についても、ネギ属植物ではその技術を利用可能であり、本発明の範囲内に含まれるものである。これらの中でも育種上、特に形質の安定性の観点から、単一種の非ロイレイ種ネギ属植物の核を持つものが本発明の実施の態様としては好適である。下記の実施例で示すとおり、非ロイレイ種ネギ属植物の中でも特にシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）及び／またはタマネギ（Ａ．ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）については日常食される野菜として需要も高く、実施の態様として好適である。ロイレイ種の核ゲノムを非ロイレイ種の核ゲノムで置換する方法としては、通常の交配技術を用いるのが好適であるが、細胞工学的な手法、すなわち顕微手術によって直接核を入れ替える手法も原理的には適用可能である。なお、これらの雄性不稔ネギ属植物に由来する細胞も、組織培養などで植物体を再生したり、プロトプラストを形成させ細胞融合に用いたりと、細胞工学的手法により新たな植物体を形成させるための原材料として利用可能であり、本発明の範囲内に含まれるものである。
【００３７】
本発明はまた、以下の各工程、すなわち（１）ロイレイ種と非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、雑種植物を得る工程、（２）前記工程（１）で得られた植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体植物を得る工程、（３）前記工程（２）で得られた４倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、異質３倍体植物を得る工程、（４）前記工程（３）で得られた異質３倍体植物と、工程（１）で用いたのと同じ非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、得られた子孫植物の染色体を調査して、ロイレイ種の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）、からなることを特徴とする、雄性不稔ネギ属植物の作製方法も提供する。
本態様においては、工程（１）で示す通り、ロイレイ種を種子親とし、自然交配や人工交配で種間雑種を形成可能な非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親に用いればよく、その種類や交配の手法は本発明を限定するものではない。工程（１）に続く工程（２）においても、形成された雑種植物の染色体を倍加するという目的のため、植物育種で通常用いられる手法を適宜選択すればよく、その例としては成長点を植物体から単離し、コルヒチン処理によって倍加する手法があげられる。工程（２）に続く工程（３）、（４）では、工程（２）で得られた４倍体植物（複２倍体植物）と工程（１）で用いた花粉親植物とを交配する工程であり、これは広い意味での戻し交配工程であって、核ゲノムからロイレイ種のゲノムすなわち染色体を排除する目的で行われるものである。戻し交配の回数は、多ければ多いほど核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物の核ゲノムに限りなく近づくと考えられ、有効であると考えられるが、実質的に得られた子孫が雄性不稔になればよく、その回数などが本発明を限定するものではない。従来方法では交配の回数によって核置換の確度を上げていたが、下記実施例に示すとおり、得られた子孫植物の組織から分裂中の細胞を採取して染色体を形態的に観察するか、または染色体特異的マーカー遺伝子やくり返し配列などの特定モチーフの多型、あるいはアイソザイムマーカーなどを用いて分子生物学的に染色体を同定するかして、核ゲノム中に含まれる染色体を調査し、ロイレイ種の染色体を持たない子孫植物を選択すれば戻し交配の回数が少なくてすむ。ロイレイ種細胞質の雄性不稔形質が強いため、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）及び／またはタマネギ（Ａ．ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）の核ゲノムで置換された子孫植物を作製するためには、工程（４）の戻し交配工程は理論上１回で可能である。こうして得られた雄性不稔ネギ属植物を種子親として、種々のネギ属植物との間で交配を行い、更なる品種改良に供することも可能である。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
（材料、及び雄性不稔系統の作出工程）まず、材料及び雄性不稔系統の作出工程について説明する。図１は、本実施例に係る雄性不稔ネギ属植物の作製方法を模式的に示すフローチャート図である。本実施例においては、図１に示す様に、ロイレイ種ネギ属植物（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物の核ゲノムで置換された雄性不稔ネギ属植物を得るために、工程（１）として、ロイレイ種とシャロット（Ａ．ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）との交配を行った。ロイレイ種のＣＰＲＯ９７１７５株を種子親（ｒＲＲ：２ｎ＝１６；ｒはロイレイ種細胞質を、Ｒはロイレイ種ゲノムをそれぞれ表す。以下同じ）とし、シャロットの８６２０８株（ａＡＡ：２ｎ＝１６；ａはシャロット細胞質を、Ａはシャロットゲノムをそれぞれ表す。以下同じ）を花粉親として交配を行った。交配の際にはロイレイ株で自家受粉が起こらないように除雄を行い、少量のシャロット花粉を手作業にてロイレイ株に受粉させてＦ１を得た。これらの交配で得られた果実から、成熟した種子を採取した。採取された種子の一部を、湿らせた濾紙を敷いたシャーレ上に置き、２５℃、暗黒条件下で発芽させた。発芽後は２５℃、照明下で緑化させ、ある程度まで成長させた後、順化させて培養土に移植し、温室内で栽培した。以後の交配についても、同様の方法を用いた。
【００３９】
また、図１に示すように、工程（２）として、ロイレイ種とシャロットのＦ１（ｒＡＲ）の染色体の倍加を行った。先の工程（１）で得られたＦ１から茎頂部組織を切り出し、コルヒチン０．１％を含むＬｉｎｓｍｅｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）固形培地上に組織を置床して、暗黒条件下で４日間培養した。その後、組織をＬＳフリー培地上に移し、２ヶ月間培養した後、得られた再生植物体について根端細胞の染色体を酢酸カーミンで染色し、顕微鏡下で染色体調査を行った。予めロイレイ種とシャロットの染色体の形や大きさを顕微鏡下で調べておき、これと再生植物体の染色体像を形態的に比較することで、どの染色体をどれだけもっているかを決定した。染色体の観察は以下の方法で行った。まず、５−１０ｍｍに伸長した二次根を採取し、酢酸−エタノール混合液（１：３）内にて冷蔵庫内で一晩固定した。次に、固定後の根を６０℃の１規定塩酸で６分間処理し、解離・加水分解させた後、塩基性フクシンを用いてフォイルゲン染色を行った。続いて、スライドガラス上に４５％酢酸を１滴落とし、その中に染色した根端を入れ、カバーガラスを載せて先の尖った棒でカバーガラス上から試料を叩き、カバーガラスを圧した。この操作により細胞や染色体を分散させ、染色体を一平面上に配列させた後、光学顕微鏡下で染色体を観察した。この観察により、再生植物体の中から、ロイレイ種染色体とシャロットの染色体をそれぞれ２組ずつ持つもの、すなわち複２倍体（ｒＡＡＲＲ：２ｎ＝３２）を選抜して次代の交配に用いた。
【００４０】
更に図１に示すように、工程（３）として、先の工程（２）で得られた複２倍体を種子親とし、シャロット１８−５株、及びタマネギ晩抽苔株を花粉親として戻し交配を行って第一代の異質３倍体（ＢＣ１）を作出した。下記表２２に、交配の結果を示す。なお、下記表２２において種子形成胚珠率は、種子形成胚珠率＝［種子数／（交配小花数×６）］で示す計算式により求めたものである。
【００４１】
【表２２】
【００４２】
上記表２２からも明らかな様に、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）×シャロット（ａＡＡ）の組み合わせでは、５６８個の小花に交配を行い、うち１２４個の小花が結実し、種子数は２３２個であった。この値を基に種子形成胚珠率［種子数／（交配小花数×６）］を計算すると、６．８％という値を示した。このうち７９個の種を前述の方法にて発芽させたところ、２９個が発芽し、発芽率は３６．７％であった。この２９個体を培養したところ、２３個体が正常に成長し、その生存率は８６．２％であった。
一方、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）とタマネギ晩抽苔株（ｃＣＣ）との組み合わせでは、７９個の小花に交配を行い、うち３３個の小花が結実し、種子数は７５個であった。種子形成胚珠率はシャロットよりも高く１５．８％の値を示した。種子のうち５２個を発芽させたところ、１０個が発芽し、発芽率は１９．２％であった。この１０個体を培養したところ、６個体が正常に成長し、その生存率は６０％であった。タマネギとシャロットは形態的に違いはあるが、種レベルでは同種とされ、そのゲノムＡとＣとは等価であると指摘されているが、この結果はそれを裏付けるものである。
【００４３】
図１に示すように、工程（３）で得られた子孫株のうち、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）とシャロット（ａＡＡ）の交配に由来し、染色体数が２４である異質３倍体（ｒＡＡＲ）ＣＭ２３系統を材料とし、ここにタマネギ北見交３９号（ｃＣＣ）をかけ合わせ、工程（４）の戻し交配を行って第二代（ＢＣ２）を作出した。交配の結果を、下記表２３に示す。
【００４４】
【表２３】
【００４５】
上記表２３で示すように、交配で得られた種子１７８個のうち、１３０個が発芽し、発芽率は７３．０％であった。発芽した個体のうち正常に成長したものは１２７個体あり、生存率は９７．７％と高い値を示した。
正常に成長したＢＣ２世代１０８個体につき、その染色体数を上記の方法で形態学的に調査した。結果を下記表２４に示す。
【００４６】
【表２４】
【００４７】
上記表２４に示すように、染色体数が１６、すなわちロイレイ種由来の染色体が排除され、核ゲノムがシャロット及びタマネギの核ゲノムで置換されたと考えられるものが６８個体あり、全体の６３％を占めた。次いで、染色体数が１７、すなわちロイレイ種由来の単一染色体を有するものが３８個体で、割合は３５％であった。染色体数が１８−２２のものは見られず、染色体数が２３すなわちロイレイ種由来の染色体が１本欠失した個体が１個体、染色体数が２４すなわちロイレイ種由来の染色体を全て持つ異質３倍体が１個体で、割合はそれぞれ０．９％と非常に少なかった。４倍体（２ｎ＝３２）は観察されなかった。
これらの結果は、本発明の提供する、ロイレイ種由来の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種由来の核ゲノムからなるネギ属植物の作製方法（工程１−４）を用いれば、ＢＣ２世代でロイレイ種の染色体を持たないものが７割近くと効率よく目的の系統を作製することが可能であることを示している。
【実施例２】
【００４８】
（アイソザイム分析による核ゲノムの同定）本実施例においては、アイソザイム分析による核ゲノムの同定について詳細に説明する。染色体数が２ｎ＝１６を示したＢＣ２系統、及び２ｎ＝１７を示し染色体の形態からロイレイ種の第１染色体を有すると推定されたＢＣ２系統の各１個体を、ネギ属植物第１染色体特異的アイソザイムマーカーＬａｐ−ｌ（非特許文献９参照）を用いて分析し、アイソザイムの出現パターンをロイレイ種、シャロット、ロイレイ種とシャロットのＦ１、ＢＣ１のそれぞれと比較した。Ｌａｐ−１（ロイシンアミノペプチダーゼ−１）は細胞内では単畳体（モノマー）として存在し、種によってその分子量にばらつきがあることから、アイソザイム分析のマーカーとして広く利用されているタンパク質である。またネギ属植物では、Ｌａｐ−１をコードする遺伝子が第１染色体上に存在することが知られており、Ｌａｐ−１は第１染色体のマーカーとして利用可能である。各植物試料から、それぞれ葉身部を０．２ｇ程度切り取って乳鉢に入れ、Ｗｅｎｄｅｌの抽出液（０．６％ リン酸水素２Ｎａ，７％ ショ糖，５％ ＰＶＰ−４０，０．０５％ ＥＤＴＡ，０．０５％ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，０．１％ Ｌ−アスコルビン酸Ｎａ，０．１％ Ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ，０．０５％ ピロ亜硫酸Ｎａ，０．１％ ｖ／ｖ メルカプトエタノール；非特許文献１０参照）を１ｍｌと石英砂を加え、氷上にて乳棒を用いて磨砕した。磨砕した試料を、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清２０μｌを電気泳動用の試料とした。電気泳動は５％ポリアクリルアミドゲルを用い、１５Ａ（ゲル１枚あたり）の定電流で３時間半、冷蔵庫内にて泳動した。電気泳動の終了後、ゲルを染色液［０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中に０．０２％ Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅβ−Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ，０．０５％ Ｆａｓｔ Ｇａｒｎｅｔ ＧＢＣ ｓａｌｔ，１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］に移し、３７℃、暗黒条件下で３０分間、振とうさせながら染色した。ゲル上にバンドが出現した後、１．５％酢酸で染色反応を止め、ゲルを水道水で５−６回洗浄して酢酸を除去した。ガラス板上にＧｅｌｂｏｎｄ（登録商標） ＰＡＧ ｆｉｌｍ（タカラバイオ社）を乗せ、その上にゲルを乗せ、１０％グリセロールをゲルの上に重層し、更にその上からセロファンを乗せてシールした。この状態で２５℃の暗所に置き、全体を乾燥させた。
【００４９】
アイソザイム分析の結果を模式化したものを、図２に示す。図中レーン１−６は電気泳動で得られたバンドパターンを模式化したものであり、レーン１はロイレイ種、レーン２はシャロット、レーン３はロイレイ種とシャロットのＦ１、レーン４はＢＣ１の異質３倍体、レーン５は２ｎ＝１６を示したＢＣ２、レーン６は２ｎ＝１７を示したＢＣ２の結果をそれぞれ表している。ロイレイ種第１染色体にコードされたＬａｐ−１の産物をαで、シャロット及びタマネギの第１染色体にコードされたＬａｐ−１の産物をβでそれぞれ示しており、これらの結果から、２ｎ＝１７のＢＣ２個体はロイレイの第１染色体とシャロット及び／またはタマネギの第１染色体の両方を持っており、反対に２ｎ＝１６のＢＣ２個体はロイレイ種の染色体を持たず、シャロット及び／またはタマネギの染色体を持っていることが明らかとなった。この結果はまた、本発明の方法を用いることでロイレイ種の染色体がＢＣ２世代で排除可能であることも示している。
【実施例３】
【００５０】
（ＳＳＲ多型解析による細胞質の同定）本実施例では、ＳＳＲ多型解析による細胞質の同定について説明する。上記の様なＢＣ２系統において染色体数が２ｎ＝１６を示した個体７個体（５，６，１４，２２，２４，３０，４１株）について、葉緑体ＤＮＡ由来のＳＳＲ配列（Ｓｈｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ：ｃｃＳＳＲ１１）に着目してＤＮＡ多型解析を行い、それぞれの細胞質の同定を行った。葉緑体は母系遺伝することが知られており、その葉緑体中に含まれるＤＮＡの多型は細胞質の由来を知るためのマーカーとなる。
試料からの全ＤＮＡの抽出は、ｖａｎ Ｈｅｕｓｄｅｎらの方法（非特許文献１１参照）に従った。具体的には、植物試料から葉身部０．０５ｇを切り取り、これに抽出液（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ３１２．５μｌ，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３１２．５μｌ，Ｓａｒｋｏｓｙｌ １２５μｌ，亜硫酸ナトリウム２．８５ｍｇを混合したもの）７５０μｌを加えて磨砕した後、６５℃で１時間インキュベートした。次に、磨砕試料をチューブに移し、１４０００ｒｐｍ、４℃で９０秒遠心し、上清にクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）を７５０μｌ加えて振とうし、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。続いて、上清（水相）４００μｌを別チューブに移し、等量の冷やしたイソプロパノールを加えて混合し、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心してペレットを得た。そして、上清を捨て、ペレットに７０％エタノールを５００μｌ加えて１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨ててペレットを室温で乾かし、１００μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ）を加えて懸濁し葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）試料とした。分光高度計を用い試料液中のＤＮＡ濃度を測定し、終濃度が２０ｎｇ／μｌとなるように調整した。この試料液をＰＣＲ用に供した。
ＰＣＲは、Ｃｈｕｎｇ＆Ｓｔａｕｂにより開発されたプライマーセット（非特許文献１２）のうちｃｃＳＳＲ−１１プライマーを用いて，以下の条件により行った。反応液組成は、全量２５μｌ；５０ｍＭ ＫＣｌ，４ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，０．４ｍＭ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ，０．４ｍＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ，０．１２５ ｕｎｉｔ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ，１００ｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ，１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に調整した。ＰＣＲ反応は，予備反応９５℃ １１分；変性９４℃ ３０秒，アニーリング５６℃ ３０秒，伸長反応７２℃ ３０秒を４０サイクル；後処理７２℃ １０分で行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行い、そのバンドパターンをロイレイ種、シャロット、タマネギ、２ｎ＝１６であるＢＣ２で比較した。
【００５１】
ＰＣＲの結果を、図３に示す。図３はｃｐＤＮＡのｃｃＳＳＲ−１１のＰＣＲ増幅パターンを示す図である。図中レーンｍは分子量マーカー（ｂｐ）を表し、レーンＲはロイレイ種を、レーンＡはシャロットを、レーンＣはタマネギを表し、以降の５−４１はＢＣ２各株のサンプルの結果である。本解析で用いたｃｃＳＳＲ−１１プライマー（非特許文献１２）でＰＣＲを行うと、葉緑体ＤＮＡの多型が増幅されるバンドの分子量の違いとして表れ、今回用いた試料ではロイレイ種が最も大きく、次いでタマネギ（ロイレイ種よりも１塩基小さい）、最も小さいシャロットとなり、ＢＣ２細胞の葉緑体ＤＮＡが示す多型と比較可能である。レーン５−４１が示す通り、全てのＢＣ２個体でロイレイ種と同じ位置に単一のバンドが出現し、このことから、これらのＢＣ２個体はロイレイ種に由来する細胞質を有していることが明らかとなった。
【実施例４】
【００５２】
（ＢＣ２世代の花粉稔性の調査）本実施例では、ＢＣ２世代の花粉稔性の調査結果について説明する。ＢＣ２世代において、栽培により開花が見られた個体の花粉稔性を、酢酸カーミンの染色性と１０％（ｗ／ｖ）ショ糖寒天培地上における発芽率の２つの指標により測定した。酢酸カーミンの染色性は、最初の小花が開花した直後とその約１週間後に、１個体につき３小花、合計１５００粒以上の花粉を採取し、酢酸カーミンで染色して形態学的に観察して、生殖核と栄養核の両方を持つ花粉を可稔の正常な花粉、生殖核を持たない花粉を不稔の花粉とし、それぞれの個体について全花粉中の可稔の花粉の割合（％）を求めた。またショ糖寒天培地上における発芽率は、酢酸カーミン染色による２回目の調査後に行い、１個体から３小花、合計３００粒以上の花粉を採取してショ糖寒天培地上に蒔き、２５℃、湿度５０％の条件下で２時間培養して、顕微鏡下で花粉管が伸長していたものを可稔の花粉、伸長がみられなかったものを不稔の花粉とし、それぞれの個体について全花粉中の可稔の花粉の割合（％）を算出した。
花粉稔性の調査の結果を下記表２５に示す。
【００５３】
【表２５】
【００５４】
上記表２５に示すように、カーミン染色による２回の調査から、全個体のうち８割−９割近くの個体が、生殖核と栄養核の両方を持ち正常（可稔）と考えられる花粉を１０％も持たず、花粉稔性が極めて低いことが示された。更に、ショ糖寒天培地上における花粉の発芽率は、カーミン染色による結果よりも更に低く、ほとんどの個体が正常花粉を花粉全体の１２％未満しかもたないことが明らかとなった。カーミン染色と花粉培養の両調査結果から、２ｎ＝１６であるＢＣ２世代の各個体に、強い雄性不稔形質が表れていることが示された。
これらの結果から、本発明の提供する、ロイレイ種の細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲノムを有するネギ属植物が、雄性不稔形質を有していることが示された。
【実施例５】
【００５５】
実施例４の花粉稔性調査結果について、より本質的な雄性不稔形質、すなわち花粉稔性が０または１％未満という個体の頻度に着目して改めて集計した。結果を下記表２６に示す。表２６は表２５と基本的に同じ調査結果を元にしており、個体あたりの可稔花粉の割合（％）を表２５よりも細かく分け、可稔花粉が０のもの、及び１％未満のものを示している。
カーミン染色１回目の調査では、可稔花粉が０のものが全体の２０％にあたる１２個体観察され、また１％未満のものも１６個体（２６．７％）観察された。２回目の調査でも可稔花粉が０、１％未満の個体がそれぞれ全体の１８．５％、１４．８％を占めていた。更に、花粉の発芽率に着目した調査では、全体の実に７５％が可稔花粉をまったく持たない不稔の個体であり、本発明の提供するロイレイ種の細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲノムを有する２倍体のネギ属植物に、強い雄性不稔の形質が付与されていることが改めて示された。
【００５６】
【表２６】
【実施例６】
【００５７】
（葉緑体ＳＳＲの塩基配列を用いた他種ネギ属植物との比較）実施例３で解析した葉緑体ＤＮＡ上のくり返し配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ：ｃｃＳＳＲ）について、より詳細な多型解析を行い、本発明において作出した核置換系統が確かにロイレイ種の細胞質を有しているかどうかを検証した。
多型解析用のプライマーとしては、先行研究（非特許文献１３）において本発明者らが明らかにした結果より、Ｃｈｕｎｇ＆Ｓｔａｕｂにより開発されたｃｃＳＳＲのプライマー（非特許文献１２）のうち、ｃｃＳＳＲ−１１プライマー及びｃｃＳＳＲ−１７プライマーの２組のプライマーを用いた。試料としては栽培種、野生種を含む複数種のネギ属植物−Ａ．ｃｅｐａ種に属する４つの栽培種、すなわちネギ’九条細’系統、タマネギ’北見交３９号’系統、シャロット’８６２０８’系統、ワケギ’寒知らず（晩成）’系統、及び４種の野生種であるＡ．ｇａｌａｎｔｈｕｍ’９７２０５−２２’系統、Ａ．ｒｏｙｌｅｉ’９５００１−１’系統、Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ’９７２０３−８’系統、Ａ．ａｌｔａｉｃｕｍ’９７０１０−２５’系統の４系統、ニラＡ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ’広幅にら’系統とラッキョウＡ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ（系統不詳）の１０種類に加え、本発明の核置換系統であるＣＭ２３−ＲＢ６、ＣＭ２３−ＲＢ１５、ＣＭ２３−ＲＢ２５、ＣＭ２３−ＲＢ３０、ＣＭ２３−ＲＢ３６、ＣＭ２３−ＲＢ３９、ＣＭ２３−ＲＢ４１の７系統の合計１７系統を試料として供した。
【００５８】
各試料から微量サンプル抽出法（実施例３の方法に従う）により全ＤＮＡを抽出した。この全ＤＮＡを鋳型とし、上記２組のプライマーについて、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーの５’末端を６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤのうち１種類で蛍光標識し、これらの蛍光プライマーを１反応につき１組用いてＰＣＲを行い、各試料のＤＮＡからｃｃＳＳＲ領域を増幅させた。ＰＣＲ産物はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によりキャピラリー電気泳動を行い、ＧｅｎｅＳｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりフラグメントサイズを決定した。
【００５９】
下記表２７に、フラグメント解析の結果を示す。表中の種名・品種名はそれぞれ上記野生種、栽培種、核置換の各系統を示し、産物の分子量は葉緑体ＤＮＡからｃｃＳＳＲ−１１プライマー、ｃｃＳＳＲ−１７プライマーで増幅した産物の分子量（ｂｐ）の測定結果を示す。
ｃｃＳＳＲ−１１プライマーにより、１０２−１２０ｂｐのＰＣＲ産物が増幅され、本発明の核置換系統では１１１．６−１１１．７ｂｐの産物が増幅された。これを他種と比較すると、野生種ではＡ．ｒｏｙｌｅｉの１１１．６ｂｐと一致し、一方で従来技術において核置換による雄性不稔が報告されているＡ．ｇａｌａｎｔｈｕｍの１０２．７ｂｐとは異なっており、本発明の核置換により作出された雄性不稔系統が従来知られた系統とは異なる系統であることが示された。更に交配に用いたシャロット（１０６．１ｂｐ）及びタマネギ（１１０．７ｂｐ）とも異なっており、本発明の雄性不稔系統がＡ．ｒｏｙｌｅｉの細胞質を有していることが示された。
一方ｃｃＳＳＲ−１７プライマーにより、１９４−２０２ｂｐのＰＣＲ産物が増幅され、本発明の核置換系統では１９４．４−１９４．８ｂｐの産物が増幅された。これはＡ．ｒｏｙｌｅｉの１９４．７ｂｐと一致し、一方ｃｃＳＳＲ−１１プライマーではＰＣＲ産物の分子量が比較的近かったタマネギにおける１９９．６ｂｐとは大きく異なっていた。ここで、北見交３９号系統が細胞質−核遺伝子支配による雄性不稔系統（自然突然変異から従来技術により作製された雄性不稔系統）を母方とするＦ１品種であり、雄性不稔の細胞質（ｓ細胞質）を有することから、本発明で作製された雄性不稔系統が、従来用いられてきたタマネギの雄性不稔系統とは異なる雄性不稔系統であることが改めて示された。
なお本実施例におけるＰＣＲ産物の分子量は、解析ソフトを用いた計算値であるため、小数点以下の数字を含む値で示されている。
【００６０】
【表２７】
【００６１】
以上の結果を、図４及び図５に可視化して表す。図４はｃｃＳＳＲ−１１プライマーを用いたＰＣＲの結果を、その産物の分子量からグラフ上に模式化したものであり、レーン１−４は野生種（１：Ａ．ｒｏｙｌｅｉ，２：Ａ．ｇａｌａｎｔｈｕｍ，３．Ａ．ａｌｔａｉｃｕｍ，４：Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）を、レーン５−１０は栽培種（５：シャロット、６：タマネギ、７：ラッキョウ、８：ニラ、９：ネギ、１０：ワケギ）を、レーン１１−１７は本発明の核置換系統（ＣＭ２３−ＲＢ系統、番号は株番号）をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分子量（ｂｐ）を表している。図中矢印で示した様に、核置換系統のＰＣＲ産物はＡ．ｒｏｙｌｅｉのものとほぼ一致し、他の野生種や栽培種とは異なっていた。
図５はｃｃＳＳＲ−１７プライマーを用いたＰＣＲの結果を、その産物の分子量からグラフ上に模式化したものであり、レーン１−４は野生種（１：Ａ．ｒｏｙｌｅｉ，２：Ａ．ｇａｌａｎｔｈｕｍ，３．Ａ．ａｌｔａｉｃｕｍ，４：Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）を、レーン５−１０は栽培種（５：シャロット、６：タマネギ、７：ラッキョウ、８：ニラ、９：ネギ、１０：ワケギ）を、レーン１１−１７は本発明の核置換系統（ＣＭ２３−ＲＢ系統、番号は株番号）をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分子量（ｂｐ）を表している。図中矢印で示した様に、核置換系統のＰＣＲ産物はＡ．ｒｏｙｌｅｉのものとほぼ一致し、加えて図中囲みで示したタマネギ（雄性不稔のｓ細胞質を持つ）とは異なるサイズであった。
これらの結果は、本発明で作製した核置換による雄性不稔系統が、Ａ．ｒｏｙｌｅｉの細胞質を有している事を示している。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、ロイレイ種ネギ属植物と非ロイレイ種ネギ属植物との交配によって作出される雄性不稔ネギ属植物であり、新品種作出までの大幅な時間短縮を可能にするなど、農業の育種分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の実施の形態において提供する雄性不稔ネギ属植物の作製方法を模式的に示す。
【図２】本発明の実施の形態の交配各世代におけるＬａｐ−１アイソザイム分析の結果を模式的に示す。
【図３】本発明の実施の形態で用いたロイレイ種、シャロット、タマネギ及びＢＣ２世代の葉緑体ＤＮＡの多型の解析結果を示す。
【図４】本発明の実施例における葉緑体ＤＮＡの多型（ｃｃＳＳＲ−１１プライマー使用）の解析結果の模式図を示す。
【図５】本発明の実施例における葉緑体ＤＮＡの多型（ｃｃＳＳＲ−１７プライマー使用）の解析結果の模式図を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質と、非ロイレイ種ネギ属植物（ロイレイ種ではないネギ属植物、以下同じ）由来の核ゲノムとを有することを特徴とする、雄性不稔ネギ属植物。
【請求項２】
核ゲノムが、少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、請求項１に記載の雄性不稔ネギ属植物。
【請求項３】
核ゲノムが、単一種の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、請求項２に記載の雄性不稔ネギ属植物。
【請求項４】
非ロイレイ種ネギ属植物が、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）及び／またはシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）であることを特徴とする、請求項３に記載の雄性不稔ネギ属植物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の雄性不稔ネギ属植物に由来することを特徴とする、植物細胞。
【請求項６】
以下の各工程からなることを特徴とする、請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の雄性不稔ネギ属植物の作製方法。
（１）アリウム・ロイレイ種と非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、雑種植物を得る工程
（２）工程（１）で得られた植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体植物を得る工程
（３）工程（２）で得られた４倍体植物と、前記非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、異質３倍体植物を得る工程
（４）工程（３）で得られた異質３倍体植物と、前記非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、得られた子孫植物の染色体を調査して、前記ロイレイ種の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）
【請求項１】
アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質と、非ロイレイ種ネギ属植物（ロイレイ種ではないネギ属植物、以下同じ）由来の核ゲノムとを有することを特徴とする、雄性不稔ネギ属植物。
【請求項２】
核ゲノムが、少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、請求項１に記載の雄性不稔ネギ属植物。
【請求項３】
核ゲノムが、単一種の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムであることを特徴とする、請求項２に記載の雄性不稔ネギ属植物。
【請求項４】
非ロイレイ種ネギ属植物が、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｃｏｍｍｏｎ ｏｎｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）及び／またはシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ｇｒｏｕｐ）であることを特徴とする、請求項３に記載の雄性不稔ネギ属植物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の雄性不稔ネギ属植物に由来することを特徴とする、植物細胞。
【請求項６】
以下の各工程からなることを特徴とする、請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の雄性不稔ネギ属植物の作製方法。
（１）アリウム・ロイレイ種と非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、雑種植物を得る工程
（２）工程（１）で得られた植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体植物を得る工程
（３）工程（２）で得られた４倍体植物と、前記非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、異質３倍体植物を得る工程
（４）工程（３）で得られた異質３倍体植物と、前記非ロイレイ種ネギ属植物とをかけ合わせ、得られた子孫植物の染色体を調査して、前記ロイレイ種の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２０７４８１（Ｐ２００９−２０７４８１Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５１５７３（Ｐ２００８−１５１５７３）
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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