非コードＲＮＡ発現アッセイを用いた方法
生体系への介入を実施する工程と、介入に起因する生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定する工程と、測定された発現プロフィールから誘導される発現データセットを保存する工程とをそれぞれ含む、複数の異なる介入と複数の異なる生体系との片方または双方に関する複数の発現アッセイを実施するステップと、得られた発現データセットを分析して、異なる介入または異なる生体系の片方または双方に関する２つ以上の発現アッセイ群におけるそれぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するステップを含む方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非コードＲＮＡ発現アッセイを用いる方法に関する。本発明の実施態様は、２つ以上の介入が生体系に影響を及ぼす機序の類似性を判定すること、試験薬の治療的用途の候補を同定すること、そして１つ以上の適応症について以前臨床試験の対象であった治療薬の新たな用途を同定することをはじめとするが、これに限定されるものではない問題に対処する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現アッセイの利用に言及して本発明に関わる論点をここで検討するが、本発明では、その他の非コードＲＮＡ分子に関する発現アッセイを用いてもよい。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、２１〜２３ヌクレオチド前後の長さを有する一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは最初１９９３年にＶｉｃｔｏｒ Ａｍｂｒｏｓによって記載され、それ以来ｍｉＲＮＡの論題で２，０００を超える論文が公開されている。ヒトでは約１，０００のｍｉＲＮＡが予測されており、今までにその中のほぼ６００が記載され実験的に検証されているが、その数を数万と推定する者もいる。しかし様々なヒトおよび齧歯類の組織および細胞系中のｍｉＲＮＡの発現アトラスの作成を模索する最近の報告は、検出される全ｍｉＲＮＡの９７％をおよそ３００のｍｉＲＮＡが占めると報告した。
【０００４】
ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されないが、その代わりに１つ以上のその他の遺伝子の発現を調節する。既知の生物学は、現在、ｍｉｃｒｏＲＮＡが特定の個々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡ群を標的にして、それによってそれらの翻訳を妨げ、またはそれほど頻繁ではないがＲＮＡの分解を加速することを示す。成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質と複合体を形成し、その標的遺伝子のタンパク質コーディングｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）内の部分的相補的配列に結合する。さらなるタンパク質が動員されてサイレンシング複合体が形成され、標的遺伝子産物の発現はｍＲＮＡの翻訳をブロックする機序によって阻止される。
【０００５】
ｍｉＲＮＡの生物学、およびサイレンシング複合体の組成および機序に関して未だ発見されていないことは多いが、ｍｉＲＮＡが多数の遺伝子の制御に関与することは明白である。ｍｉＲＮＡは、翻訳レベルで全遺伝子の３０％を調節すると考えられている（Ｘｉｅら、２００５）。ｍｉＲＮＡは複数の遺伝子を調節し得て、各遺伝子は複数のｍｉＲＮＡによって調節され得る。ｍｉＲＮＡの組織特異的発現は、組織を分化させ、および／または組織同一性を能動的に保つことへの細胞の傾倒を先導すると考えられる。この幅広い影響および異なるｍｉＲＮＡ間の相互作用は、単一ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの小さなサブセットの調節解除された発現が、複雑な疾患形質をもたらすかもしれないことを示唆する（Ｌｉｍら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ）。既知のヒトｍｉＲＮＡの５０％以上が、癌細胞への変化をこうむりがちなゲノム領域に存在する（Ｃａｌｉｎら、２００４ ＰＮＡＳ，１０１，２９９−３００４）。当然のことながらｍｉＲＮＡの発現パターンは、癌およびその他の疾患状態において変化する。この情報は、癌幹細胞中の特定のｍｉＲＮＡ発現パターンを定義できるようにすることで、癌を類別して病期分類し、予後および応答の生物マーカーを明らかにして、治療的介入を導くための主要な決定因子を提供し、化学的感受性を説明して化学療法抵抗性機序を提供するのに使用され始めている。
【０００６】
可能な新しい治療法の研究開発に対するｍｉＲＮＡの応用は、典型的に、それによってｍｉＲＮＡの発現およびプロセッシングが制御される機序、およびそれによって特定のｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ翻訳を調節する機序の詳細かつ時間がかかる分析からもたらされている。特定の薬剤標的が同定されており、これらの薬剤標的と関連した研究が継続している。しかし徹底的ではあるけれども、この研究パラダイムは時間がかかり高価である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明は、介入の作用機序の詳細な理解も特定の薬剤標的の同定も要さない、治療薬投与などの介入の実用的応用を発見する代案の方法を提供することを目標としている。本発明のいくつかの実施態様は、既知の治療物質の新しい適応症を判定し、または試験薬の毒物学的プロフィールの側面などの薬理学的特性を予測する問題に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明に従って、
（１）生体系への介入を実施する工程と、介入に起因する生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定する工程と、測定された発現プロフィールから誘導される発現データセットを保存する工程をそれぞれ含む、複数の異なる介入と複数の異なる生体系との片方または双方に関する複数の発現アッセイを実施するステップと、
（２）得られた発現データセットを分析して、異なる介入または異なる生体系の片方または双方に関する２つ以上の発現アッセイ群におけるそれぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するステップ
を含む方法が提供される。
【０００９】
発現データセットを分析して、実施された介入と、それに対して介入が実施された生体系との片方または双方に関して異なる、２つ以上の発現アッセイ群における非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する介入の効果間の類似性を判定することで、それによって１つ以上の介入が１つ以上の生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールに影響を及ぼす機序を判定する必要なしに、相関を判定してもよい。
【００１０】
したがって既知の治療的妥当性がある第１の介入の効果と関連付けられている非コードＲＮＡ発現プロフィールに対して、第２の介入が効果を有することが分かった場合、第２の介入は同一のまたは同様の治療的応用の候補として扱い得る。第１および第２の介入が、同一の、同様の、または関連した作用機序を有する可能性は、少なくともいくらかある。この方法論は、治療的介入を発見するために、特定の標的（タンパク質、核酸または液体分子など）が同定されて分析され、標的の生物学が深く研究され、標的の１つ以上の活性を調節するのに適した治療的介入が合理なおよび／または組み合わせによる方法によって開発される、既知の戦略とは、全く対照的である。
【００１１】
１つ以上の（そして場合により全ての）前記介入は、１つ以上の試験薬の生体系への、同時または逐次のどちらかの適用を含んでもよい。１つ以上の試験薬は、例えば２，０００ダルトン未満、１，０００ダルトン未満、または５００ダルトン未満の分子量を有する分子などの化学物質であってもよい。化学物質は非ポリマー性であってもよい。１つ以上の試験物質は、例えば脂質、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質（例えば酵素、抗体、または抗体断片、ヒト化抗体または抗体断片、ファージまたはリボソームディスプレイタンパク質断片、またはプリオン）などの生体高分子のような生物学的物質であってもよい。生物学的物質はウィルスまたは細菌であってもよい。したがって発現アッセイのいくつかまたはそれぞれは、生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する試験薬の効果を測定してもよい。
【００１２】
１つ以上の前記試験薬は治療薬であってもよい。１つ以上の前記試験薬は、既知の病状の治療または予防に対する既知の用途を有する治療薬であってもよい。１つ以上の前記試験薬は、１つ以上の適応症に関して（成功裏であるかどうかに関わらず）臨床試験の対象とされている治療薬であってもよい。しかし１つ以上の（そして場合により全ての）前記介入は、電離放射、連続またはパルス電磁放射（例えば可視光、紫外線、赤外線）、（空気または液状媒体を通じて送達される）音響エネルギー、機械的介入（例えば加圧）、電気、温度変化、容積モル浸透圧濃度変化、増殖培地の張性またはｐＨ、磁界、流体力学の変化、および機械化学的な情報伝達を含む群の１つ以上の生体系に対する適用を含んでもよい。したがって少なくともいくつかの介入は、生体系に有害であることが知られている介入であってもよい。このような有害な介入に起因する発現プロフィールは、有害効果を覆しまたは予防する薬剤を同定するのに有用かもしれない。
【００１３】
１つ以上の前記生体系は、例えばヒト、ウサギ、または齧歯類（例えばマウスまたはラット）細胞のような哺乳類細胞、または培養昆虫、両生類または魚細胞系などの細胞を含んでもよい。１つ以上の前記生体系は、細胞型の混合物を含んでもよい。介入は、典型的に培養哺乳類細胞に対して実施される。哺乳類細胞は、幹細胞または前駆細胞であってもよい。幹細胞とは、自己再生して少なくとも１つの別の特殊な細胞型に分化できる細胞を指す。しかし１つ以上の前記生体系は、生物全体、生体外組織、合成系または形質転換細胞であってもよい。１つ以上の前記生体系は、遺伝子導入されていてもよい。培養細胞は、同期または非同期の細胞周期を有してもよい。１つ以上の前記介入は、幹細胞または前駆細胞の分化または脱分化状態を変化させ、または幹細胞または前駆細胞の特殊化を引き起こし、または特定の細胞系統または分化状態の特徴を保ちながら複製を引き起こす介入であってもよい。
【００１４】
発現アッセイを繰り返してもよく、分析される発現データセットは、同等な生体系に対する同等な介入を使用して、いくつかのまたは全ての反復実験から集計してもよい。
【００１５】
相関は典型的に、どの発現データが発現データセットに保存されるかとの関連で、非コードＲＮＡのサブセットの発現の間にある。非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関は典型的に、２つ以上の発現アッセイ間の１つまたは少数の（例えば２、３、５または５未満の、または１０または１０未満の）非コードＲＮＡ発現の変化における、正または負であってもよい相関である。正相関は、２つの各発現アッセイにおける１つ以上の非コードＲＮＡ発現の増大を含んでもよい。正相関は、２つの各発現アッセイにおける１つ以上の非コードＲＮＡ発現の減少を含んでもよい。負相関は、第１の発現アッセイにおける１つ以上の非コードＲＮＡ発現の増大と、第２の発現アッセイにおける同一の１つ以上の非コードＲＮＡ発現の減少とを含んでもよい。
【００１６】
それぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するために、方法は、例えばそれぞれの介入が実施されない対照アッセイ、またはそれぞれの介入を実施する前に生体系における非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定するステップを含む対照アッセイなどの適切な対照アッセイにおいて、非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定するステップをさらに含んでもよい。発現アッセイおよび対応する対照アッセイにおける非コードＲＮＡ発現プロフィール間の違いを判定してもよい。保存された発現データセットは、測定された発現プロフィールおよび対応する対照アッセイの発現プロフィールに由来してもよい。得られた発現データを分析するステップは、対照アッセイからの発現プロフィールを考慮に入れてもよい。しかしいくつかの用途では、対照アッセイを実施しなくてもよい。例えば同等な生体系に対して複数の介入を実施する場合、それぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するためには、各発現アッセイに起因する発現プロフィールだけに由来するデータセットを分析することのみが必要であるかもしれない。
【００１７】
例えば２つ以上の発現アッセイ群におけるそれぞれの介入の非コードＲＮＡ発現に対する効果間の類似性など、少なくとも前記相関のいくつかは正相関であってもよい。相関を判定するために、得られた発現データセットを分析するステップは、発現アッセイに起因する発現データセット間の類似性に基づいて発現アッセイを分類するステップ（例えばクラスター形成または組分け）を含んでもよい。有利には、これは、共通する機序の性質を理解することを要せずして、２つ以上の異なる介入が（典型的に同一または同等な生体系の）非コードＲＮＡ発現プロフィールに対して直接にまたは間接的に効果を有する機序の類似性を同定し得るようにするかもしれない。
【００１８】
したがって方法は、２つ以上の介入が、１つ以上の非コードＲＮＡ発現に対して同様の効果を有することを判定する方法であってもよい。第１の介入は、少なくとも１つの既知の第１の治療的用途を有する第１の治療物質の適用であってもよく、方法は、第２の治療物質の適用を含む第２の介入の非コードＲＮＡ発現に対する効果間に正相関があるかどうかを判定する方法であってもよい。したがって方法は、既知の治療物質（第２の治療物質）について、可能な新しい治療的用途（第１の治療的用途）を判定する方法であってもよい。方法は、第２の介入が、前記既知の第１の治療的用途の応用に適用できるかどうかを試験するステップをさらに含んでもよい。
【００１９】
第１の介入は、既知の第１の治療的用途はないが、治療法としての展開に適した薬理学的および毒物学的プロフィールを有することが知られている物質の適用であってもよい。したがって方法は、毒物学試験に合格したが、臨床試験において有効である、または対照治療物質よりも有効であることが分からなかった治療物質の可能な新しい治療的用途を判定する方法であってもよい。
【００２０】
前記相関の少なくともいくつかは負相関であってもよく、例えば２つ以上の介入が１つ以上の非コードＲＮＡ発現に対して逆の効果を有すると判定されてもよい。有利には、第１の介入および第２の介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の負相関は、第２の介入が治療法において第１の介入の１つ以上の効果を逆転させるのに恐らく有用たり得ることを示唆するかもしれない。したがって第１の介入は、生体系に対して悪影響を有することが知られている介入であってもよく、例えば第１の介入は毒素の適用であってもよい。この場合、方法は、第１の介入によって引き起こされることが知られている病状を治療または予防する候補として、第２の介入を同定するステップを含んでもよい。
【００２１】
したがって複数の介入は、毒素の投与または生体系に有害な処置を含んでもよい。したがって方法は、１つ以上のその他の介入によって引き起こされることが知られている病状を治療、または予防するかもしれない介入候補（例えば治療物質候補）を判定する方法の一部であってもよい。方法は、既知の治療的介入（例えば治療物質または放射線療法の適用）の副作用を治療または予防する候補を判定する方法の一部であってもよい。
【００２２】
方法は、例えば、第１の介入に起因する非コードＲＮＡ発現プロフィールが、生体系に対して悪影響を有することが知られている介入の発現プロフィールと正に相関し、またはその毒物学の１つ以上の側面が知られている薬剤の投与を含む介入の発現プロフィールと正に相関することを検出することで、試験薬の毒性の１つ以上の側面を予測する方法であってもよい。
【００２３】
方法は、非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する、第１の試験薬および第２の試験薬の効果、または標的分子の既知の作動薬または拮抗薬である試験薬の効果間のそれぞれの相関を判定することによって、第１の試験薬が第２の試験薬または特定の標的高分子の作動薬候補または拮抗薬候補であることを判定する方法であってもよい。
【００２４】
方法は、非コードＲＮＡ発現に対して同様の効果を有する介入を組分けするステップを含んでもよい。得られた発現プロフィールは、さらなる治療物質を同定するさらなる研究の有用な出発点になるかもしれない。方法は、例えば一群の治療物質である、一群の介入と関連付けられている非コードＲＮＡ中の発現プロフィールの変化を判定する方法であってもよい。したがって方法は、化学または生物学的物質が生体系に対して作用機序を有し、それが生体系に対する別の化学または生物学的物質の作用機序に関連することを判定する方法であってもよい。グループは、分類体系によって順序付けられてもよい。
【００２５】
介入が生体系に対する第２の試験薬の適用であって、非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する第２の試験薬の適用の効果が、第１の病状の治療または予防に有用であることが知られている別の第１の試験薬の生体系に対する効果と（正または負）相関性があることが分かった場合、第２の試験薬、または第２の試験薬を変性することによって得られる試験薬を第１の病状または第１の病状に関連する病状の治療または予防における有効性について試験してもよい。第１の病状または第１の病状に関連する病状の治療または予防に有効であることが分かった試験薬は、妥当な病状の治療または予防から展開してもよい。
【００２６】
いくつかの実施態様では、複数の異なる生体系に対して同一の介入または介入群が実施される発現アッセイが実施される。したがって方法は、複数の異なる生体系のいくつかのみに存在する介入効果間の相関を発見できるようにしてもよい。いくつかの実施態様では、複数の異なる生体系は、例えば異なる発達段階などの、異なる分化または脱分化状態にある幹細胞である。したがって方法は、特定の分化または脱分化状態にある幹細胞に対する介入効果間の相関を発見できるようにしてもよい。この情報は、発達機序、および幹細胞または前駆細胞の分化および脱分化を研究するのに有用である。複数の異なる生体系は、異なる疾患状態にある哺乳類細胞を含んでもよい。介入は、幹細胞または前駆細胞の分化または脱分化を引き起こし、または特定の分化状態の獲得を推進し、または特定の分化状態にある幹細胞または前駆細胞の安定性を保つ介入であってもよい。
【００２７】
発現プロフィールは、少なくとも１つの、そして典型的に複数の非コードＲＮＡ、好ましくは少なくとも１０、またはより好ましくは少なくとも１００の非コードＲＮＡ発現に関連している。発現プロフィールは、マーカーとして機能する１つ以上の遺伝子導入非コードＲＮＡ発現に関連していてもよい。発現プロフィールは、１つ以上の非コードＲＮＡの発現レベルの定量的または定性的測定を含んでもよい。１つ以上の前記非コードＲＮＡ発現レベルは、例えば、特定の生体系中で生体系ゲノムに組み込まれ、またはエピソームに保持される、遺伝子導入レポーターコンストラクトなどのレポーターコンストラクト活性化の量またはレベルの測定を通じて間接的に判定されてもよい。発現プロフィールは、典型的に、例えば１つ以上の非コードＲＮＡの定常状態またはピーク量など、生体系中の少なくともいくつかの状況で発現される１つ以上の非コードＲＮＡの量に関連する。しかし発現プロフィールは、例えば１つ以上の非コードＲＮＡ発現の変化率に関連するかもしれない。いくつかの実施態様では、発現プロフィールはマイクロアレイを使用して得られる。
【００２８】
非コードＲＮＡは、典型的にｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、ｍｉＲＮＡ前駆体および成熟ｍｉＲＮＡの片方または双方を含んでもよい。非コードＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の１つ以上を含んでもよい。非コードＲＮＡは遺伝子導入されていてもよい。ＲＮＡのいくつかまたは全ては、例えば非コードＲＮＡ発現のレポーターとして機能する遺伝子導入ＲＮＡであってもよい。非コードＲＮＡはエピソームＲＮＡであってもよく、方法は、例えばウィルスを用いた生体系の感染によってエピソームＤＮＡを生体系に導入するステップを含んでもよく、エピソームＤＮＡが転写されて、解析された非コードＲＮＡの全部または一部を構成する非コードＲＮＡを生成し得る。
【００２９】
発現プロフィールは一群の非コードＲＮＡ中で各非コードＲＮＡについて測定してもよく、方法は、複数の介入がそれに対して相関効果を有する発現プロフィールを有する、個々の非コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡ群の下位集団を同定するステップを含んでもよい。
【００３０】
相関効果を有する複数の介入は本発明の方法によって同定されてもよく、したがって複数の介入によって影響される発現レベルを有する、一群の非コードＲＮＡ、および群中の個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団の発現プロフィールに対して相関効果を有する双方の介入が、同定できるようになる。
【００３１】
相関効果を有する複数の介入は、関連作用機序を有することが以前に知られている介入であってもよく、例えば、複数の介入は、例えば薬物群のような、同一のまたは同様の作用機序を有することが知られているか、または有すると考えられている薬剤の投与を含んでもよい。したがって本発明は、複数の介入によって影響される発現レベルを有する、個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団を同定する方法を提供する。
【００３２】
次に低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールが測定されるさらなる発現アッセイで使用するために、得られた同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定された非コードＲＮＡ下位集団を選択してもよく、低減された非コードＲＮＡ群は、少なくとも同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定された非コードＲＮＡ下位集団を含み、または場合によりそれからなる、非コードＲＮＡ群のいくつかのみを含む。その結果、低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールに対するさらなる介入の効果、および低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールに対するさらなる介入の効果と、低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールに対する前記複数の介入の効果との間の相関を判定し得る。したがって引き続くアッセイおよび試験ではより少ない非コードＲＮＡを用いてもよく、経費が低減されて処理能力が増大する。例えば治療薬群がそれに対して相関効果を有する発現レベルを有する低減された非コードＲＮＡ群を使用して、新しい治療的に有用な薬剤を発見するために、または既知の治療薬について新しい適応症を同定するために、薬剤候補をスクリーニングしてもよい。
【００３３】
生物学的介入効果を識別するための、非コードＲＮＡ群または下位集団の発現レベルの妥当性を判定してもよい。方法は、生物学的介入効果の間の識別に対するそれらの妥当性にしたがって、群または下位集団中で非コードＲＮＡを格付けするステップを含んでもよい。方法は、非コードＲＮＡ発現に対して相関効果を有する、生物学的介入または一群の生物学的介入の非コードＲＮＡ発現に対する効果を非コードＲＮＡ群または下位集団中で格付けするステップを含んでもよい。得られた格付けを使用して、生物学的介入効果間の相関を同定してもよい。
【００３４】
相関は、例えば主成分分析などの統計学的数学的方法によって同定してもよい。複数の各特定の非コードＲＮＡ発現に対する生物学的介入効果に、それぞれの非コードＲＮＡ発現に対する生物学的介入効果の特性を示す一群のコードの１つを割り当ててもよい。得られたコードを分析して、相関を同定してもよい。
【００３５】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる、前記低減された非コードＲＮＡ群からなる非コードＲＮＡを有するアッセイ装置（例えば試験キット、またはそれに固定化された非コードＲＮＡを有する固相担体）にも及ぶ。
【００３６】
ここで以下の図に言及して、本発明の実施形態の例を例証する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の方法に従った流れ図である。
【図２ａ】１つの生物学的介入についての主成分分析からの結果のプロットである。
【図２ｂ】１つの変数についての主成分分析からの結果のプロットである。
【図３】ｐ値およびｑ値による１１個のｍｉＲＮＡの統計学的格付けを示す表である。
【図４ａ】標識された識別ｍｉＲＮＡの下位集団を示す主成分分析からのデータプロットである。
【図４ｂ】異なる介入タイプからの発現データがどのようにクラスター形成するかを示す、４つの介入タイプからのデータを示す主成分分析からのデータプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施形態例の詳細な説明
本発明の実例応用において、ｍｉＲＮＡ発現データセットのデータベース（非コードＲＮＡ発現プロフィールに由来する発現データセットの一例）を作成する。図１に言及すると、既知の方法によって適切なヒト細胞を培養し（２）、試験薬を培養細胞に投与する（４）。次に介入実施後の１つ以上の期間中に、処理細胞のサンプルを使用してｍｉＲＮＡ発現プロフィールを測定し（６）、処理細胞中のいくつかの各ｍｉＲＮＡの発現レベルを判定する。
【００３９】
ｍｉＲＮＡ発現プロフィールを測定する２つの代案の方法であるマイクロアレイ分析法、および定性的リアルタイムＰＣＲ分析法について下で述べる。
【００４０】
（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびデータ分析法
Ｖｅｄｂａｅｋ，ＤｅｎｍａｒｋのＥｘｉｑｏｎ Ａ／Ｓからのカラムベースのキットを使用して、薬剤処理（ｎ ＝ ３）および対照処理細胞（ｎ ＝ ３）からの全ＲＮＡを単離する。ｍｉＲＮＡマイクロアレイによって、各サンプルからの全ＲＮＡの２μｇを分析する。標識、ハイブリダイゼーション、スキャニング、正規化、およびデータ分析を含むｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析は、例えばＥｘｉｑｏｎ Ａ／Ｓなどのようないくつかの供給元から市販される。簡単に述べると、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００ マイクロ流体プラットフォーム（ＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの商標である）を使用して、ＲＮＡ品質管理を実施する。ＡｇｉｌｅｎｔからのＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｈｙｂ Ｋｉｔを使用し、提供される説明書に従ってサンプルを標識する。
【００４１】
（２）定量的リアルタイムＰＣＲ法
上のオプション（１）同様、Ｅｘｉｑｏｎからのカラムベースキットを使用し、製造業者の使用説明書に従って全ての細胞性ＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによるｍｉＲＮＡの定量化は、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））によって記載されるように実施する（ＴａｑＭａｎはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の商標である）。簡単に述べると、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットおよびｍｉＲＮＡ特異的ステムループプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１０ｎｇのＲＮＡを逆転写（ＲＴ）のテンプレートとして使用する。２０μｌのＰＣＲ反応にＲＴ生成物のアリコート（１．５μｌ）を装入し、それをＡＢＩ７９００ＨＴサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上の９６ウェルプレート内において、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルでインキュベートする。Ｕ４８ ＲＮＡ（小型非コードＲＮＡ）（またはＵ４８が薬物療法によって変動することが分かればＧＡＰＤＨ）発現の値に基づいて、異なるサンプル間で標的遺伝子発現を正規化する。
【００４２】
いずれの場合にも、得られるｍｉＲＮＡ発現レベルを発現データセットとして保存する（８）。多数の発現アッセイを好ましくは実施する。このようにして、典型的に多数（例えば数百または数千）の試験薬を細胞培養物に装入し、分析してｍｉＲＮＡ発現データのデータベースを作り出す。
【００４３】
ｍｉＲＮＡ発現データセットの適切に大きなデータベースが利用できるようになったら、発現データセットを分析し（１０）、ｍｉＲＮＡ発現に対する各試験薬の効果間の相関を判定して、ｍｉＲＮＡ発現プロフィールに対して同様の効果を有する試験薬の階層的なクラスターを作り出す。
【００４４】
核酸発現データセット間の相関を判定する方法は、当業者に良く知られている。例えば一方法は、ＧＰＲ形式でＥｘｉｑｏｎ Ａ／Ｓから得られるマイクロアレイデータをスプレッドシートにインポートすることである（ＧＰＲは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から入手できるＧｅｎｅｐｉｘ６ソフトウェアによって使用されるデータ形式であり、ＧｅｎｅｐｉｘはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓの商標である）。各ｍｉＲＮＡのスポット強度を品質対照に対して分析し、較正スポットをｍｉＲＮＡ配列上に提供する（Ｇｅｎｅｐｉｘ６ソフトウェアによって負のフラグとして示される）。シグナル強度５０未満の値は０とする。各ｍｉＲＮＡ捕捉プローブ種の４つの各複製スポットについてバックグラウンド補正スポット強度の中央値を計算し、階層的クラスター形成および／または当業者に良く知られているその他の統計学的分析を実施する、ＴＭｅＶマイクロアレイ分析ソフトウェアにインポートする（ＴＭｅＶは、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅによってＵＲＬ ｗｗｗ．ｔｍ４．ｏｒｇで提供される）。
【００４５】
代案としては、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できるＧＲＰ形式の発現データをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸソフトウェアにインポートしてもよく（Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの商標である）、７５パーセンタイル数に正規化し、次に階層的クラスター形成およびＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸに組み込まれているその他の統計学的ツールを使用して処理する。
【００４６】
１つ以上のｍｉＲＮＡの発現に対して、２つ以上の試験薬の効果間に正相関が見つかった場合、これは試験薬が同一のまたは関連した作用機序を共有する徴候であるかもしれない。したがって病状の治療法として知られている薬剤と同様の効果をｍｉＲＮＡ発現プロフィールに対して有することが分かった試験薬は、同一のまたは関連した病状を治療する候補として同定し得る（１２）。これは既に１つの治療的応用に潜在的に有用であると同定された薬剤の再配置を促進するのに、有用であるかもしれない。候補試験薬を試験して、それらが同一のまたは関連した病状の治療に有用かどうか、またはさらなる研究の出発点として使用できるかどうかを判定し得る。例えばそれらを合理的なまたは組み合わせによる設計法を使用して修飾し、模倣剤化合物を調製して試験等ができるかもしれない。候補試験薬を試験して（１４）、それらが治療物質として使用するのに適するか判定し、もしそうであれば治療物質として採用し得る（１６）。
【００４７】
ｍｉＲＮＡ発現に対する効果による分類は、直接または間接的であるかどうかにかかわらず、ｍｉＲＮＡ発現レベルに対する同様のまたは関連した作用機序に反映されるかもしれないので、１つ以上のｍｉＲＮＡ発現に対して同様の効果を有する試験薬を組分けすることは特に有用である。
【００４８】
負相関が同定された場合、１つの試験薬が、さらなる試験薬またはその他の介入の１つ以上の望ましくない影響を予防、軽減、または除去する候補として同定されるかもしれない。したがって望ましくない効果を有する別の試験薬に対する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現に対して反対の効果を有することが知られている試験薬は、望ましくない効果を治療または予防する物質候補として考慮し得る。
【００４９】
有利にはｍｉＲＮＡ発現アッセイを実施して、化学または生物学的物質投与以外の介入をはじめとする一連の介入の効果を評価する。例えば紫外線、電離放射、音波、および細胞に有害なその他の介入を用いて細胞を処理してもよい。このような介入の効果と負に相関する、１つ以上のｍｉＲＮＡの発現に対する効果を有する試験薬を同定し得る場合、その試験薬は対応する生体内介入に起因する望ましくない効果の治療候補または予防候補であってもよい。これは紫外線によって、または放射線療法の副作用として、引き起こされる損傷を予防する薬剤を同定するのに有用かもしれない。
【００５０】
方法は、多数の試験薬の高処理能力スクリーニングに応用し得る（例えば小型の化学物質、ペプチド、ペプチド模倣薬またはポリ核酸の組み合わせライブラリー）。新しい発現アッセイが実施されると、得られた発現データセットをあらかじめ保存された発現データセットと比較して、スクリーンされた試験薬の効果と、あらかじめアッセイされた薬剤の効果間の相関を探し得る。
【００５１】
方法は、典型的に、ｍｉＲＮＡ発現データセットの大きなデータベースを使用して用いるのが最適である。しかしいくつかの特定用途では、新しいアッセイに起因するｍｉＲＮＡ発現データセットとの比較のために利用できる、少数のｍｉＲＮＡ発現データセット、または１つのｍｉＲＮＡ発現データセットを有することのみを要するかもしれない。これは、例えばｍｉＲＮＡ発現に対して顕著な効果を有することが知られており、またはそれが疑われる薬剤の効果などの特定の同定された効果と正または負相関を有するｍｉＲＮＡ発現に対する効果を有する薬剤を見いだす高処理能力スクリーニングにおいて、妥当かもしれない。
【００５２】
したがって本発明は、試験薬がｍｉＲＮＡ発現プロフィールに影響を及ぼす機序の理解を要せずして、試験薬（化学物質および生物製剤）の作用機序における類似性、ひいては実用的用途が、ｍｉＲＮＡ（そして潜在的にその他の非コードＲＮＡ）の発現に対するそれらの効果の比較分析を通じて発見されるかもしれないという原理に基づく。これは、その中で作用機序が深く研究されて、薬剤標的と所望の相互作用を有する薬剤を発見するためのスクリーニングアッセイで使用される薬剤標的が同定される、従来の創薬および薬剤再配置戦略とは全く対照的である。
【００５３】
実験的発見およびそれらの意味合い
記載される方法を使用して、我々はｍｉＲＮＡ発現データの組分けに基づいて、介入の潜在的な治療的用途の様式を判定することが可能であると判断した。さらに方法を使用して、スクリーニングされる介入の特定の治療的用途の指標となる発現レベルを有する、特定のｍｉＲＮＡを同定し得る。このような指標となるｍｉＲＮＡは将来、ｍｉＲＮＡライブラリー全体でなく、ｍｉＲＮＡ発現レベルの比較的小さな群を分析して、スクリーニングされる介入の潜在的治療用途を同定するためのさらなる介入スクリーニングができるようにする。
【００５４】
選択されたｍｉＲＮＡの小さな群を使用して、介入の潜在的治療用途を判定する一例を下に示す。
【００５５】
本明細書で記載される実験では、対照として、一群の細胞をジメチルスルホキシドまたはＤＭＳＯ、およびリン酸緩衝食塩水を含む薬剤溶剤ミックスで処理した。薬剤溶剤ミックスは、ｍｉＲＮＡ発現に対する効果を有さないと仮定され、もし効果があれば、それは試験される薬剤に関連付けられているパターンのいずれにも一致しないと仮定された。しかし薬剤溶剤ミックスは、ＨＤＡＣ阻害剤に一致するｍｉＲＮＡ発現パターンを有することが分かった。後に文献レビューから、ＤＭＳＯはＨＤＡＣ阻害剤であるとされていることが分かり、薬剤の未知の潜在的治療特性が、本発明の方法を使用して判定され得ることが確認された。
【００５６】
材料と方法
ＨｅＬａ細胞は標準法を使用して培養した。細胞はＤＭＥＭ培地中で分割させた。
【００５７】
培地を吸引して、細胞単層を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、８００ｍｌの蒸留水に溶解された８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、および０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。ＰＢＳを吸引した。
【００５８】
試験対象の試験薬を細胞に投与して、４８時間にわたりインキュベートした。
ＲＮＡ抽出
Ｅｘｉｑｏｎからのカラムベースのキットを使用して、以下の手順でこれらの細胞からＲＮＡを単離精製した。
【００５９】
細胞が成長した培地を吸引して、細胞単層を適量のＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳをさらに吸引した。
【００６０】
３５０μＬの溶菌液を培養プレートに直接添加した。培養皿を穏やかに叩いて緩衝液をプレート表面で５分間旋回させ、細胞を溶解した。次に溶解産物を微小遠心管に移した。
【００６１】
２００μＬの９５〜１００％エタノールを溶解産物に添加し、１０秒間ボルテックスして混合した。
【００６２】
キット中で提供される管の１本を使用して、カラムを組み立てた。６００μＬの溶解産物／エタノールをカラムに装入し、１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。通過物を廃棄し、その収集管を用いてスピンカラムを再び組み立てた。
【００６３】
提供される洗浄溶液の４００μＬをカラムに装入して、１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。通過物を廃棄し、その収集管を用いてスピンカラムを再び組み立てた。
【００６４】
別の４００μＬの洗浄溶液を添加して１４，０００×ｇで１分間遠心分離し、カラムをさらに２回洗浄した。通過物を廃棄し、その収集管を用いてスピンカラムを再び組み立てた。
【００６５】
カラムを１４，０００×ｇで２分間遠心分離して樹脂を完全に乾燥させ、収集管を廃棄した。
【００６６】
キットで提供される１．７ｍＬ溶出管にカラムをアセンブルし、５０μＬの溶出緩衝液をカラムに添加して、２００×ｇで２分間、続いて１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。
【００６７】
得られた精製ＲＮＡサンプルは、−２０℃で数日間保存し得た。サンプルの長期保存のためには、−７０℃で保存した。
【００６８】
（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびデータ分析法
標識
Ａｇｉｌｅｎｔからの標識キットを使用して、精製ＲＮＡサンプルを標識した。
【００６９】
全ＲＮＡサンプルを１×ＴＥ ｐＨ７．５中で５０ｎｇ／μＬに希釈した。２μＬの希釈全ＲＮＡを１．５ｍＬ微小遠心管に入れ、氷上にのせた。使用直前に、０．４μＬの１０×仔ウシ腸管ホスファターゼ緩衝液、１．１μＬのヌクレアーゼ非含有水、および０．５μＬの仔ウシ腸管ホスファターゼを穏やかに混合して、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼマスターミックスを調製した。
【００７０】
２μＬの仔ウシ腸管アルカリホスファターゼマスターミックスを各サンプル管に入れて総反応体積を４μＬにし、ピペット操作により穏やかに混合した。反応体積を循環する水浴内において３７℃で３０分間インキュベートした。
【００７１】
２．８μＬの１００％ＤＭＳＯを各サンプルに添加した。サンプルを循環水浴内において１００℃で５〜１０分間インキュベートし、次に即座に氷浴に移した。
【００７２】
１０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液を３７℃に暖め、全ての沈殿物が溶解するまで回転させた。使用直前に、１μＬの１０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液、３μＬのシアニン３−ｐＣｐ、および０．５μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼを穏やかに混合してライゲーションマスターミックスを作成し、氷上に置いた。
【００７３】
４．５μＬのライゲーションマスターミックスを各サンプル管に添加して、総反応体積を１１．３μＬにした。サンプルをピペット操作により穏やかに混合し、遠心分離した。次に循環する水浴内において、サンプルを１６℃で２時間インキュベートした。次に真空濃縮器を使用して４５〜５５℃でサンプルを乾燥させ、管を弾いてペレットが動いたり分散したりしなければ、サンプルは乾燥していると判定された。
【００７４】
ハイブリダイゼーション
Ａｇｉｌｅｎｔキットで提供される凍結乾燥１０×ＧＥブロック剤を含有するバイアルに、１２５μＬのヌクレアーゼ非含有水を添加して混合した。
【００７５】
乾燥サンプルを１８μＬのヌクレアーゼ非含有水に再懸濁した。４．５μＬの１０×ＧＥブロック剤を各サンプルに添加した。２２．５μＬの２×Ｈｉ−ＲＰＭハイブリダイゼーション緩衝液を各サンプルに添加して、よく混合した。得られたサンプルを１００℃で５分間インキュベートし、次に即座に氷浴に移してさらに５分間インキュベートした。
【００７６】
清潔なガスケットスライドをＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＨｙｂチャンバーベースに装入し、ガスケットスライドがチャンバーベースと確実にぴったり重なるようにした。確実に気泡がないようにして、ハイブリダイゼーションサンプルをガスケットウェルに分注した。
【００７７】
アレイを活性面を下向きにしてＳｕｒｅＨｙｂガスケットスライドにのせ、ＳｕｒｅＨｙｂチャンバーカバーを用いてアセンブルしてアセンブルチャンバーを形成した。アセンブルチャンバーを５５℃に設定したハイブリダイゼーションオーブンに入れ、その温度で２０時間、２０ｒｐｍで回転させた。
【００７８】
引き続いて、提供されたＧＥ洗浄緩衝液を使用してスキャン前に配列を洗浄した。
（２）定量的なリアルタイムＰＣＲ
ＲＴ反応マスターミックスの調製
構成要素を氷上で解凍した。０．１５μＬのｄＮＴＰ（１００ｍＭ）、１μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅはＡｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商標である）（５０Ｕ／μＬ）、１．５μＬの１０×逆転写緩衝液、０．１９μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μＬ）、４．１６μＬのヌクレアーゼ非含有水を混合して、ＲＴ反応マスターミックスを調製し、次に氷上で保存した。上述の体積は１５μＬのＲＴ反応あたりのもので、実施したＲＴ反応の数に応じて増大させたことに留意されたい。
【００７９】
ＲＴ反応の調製
各１５μＬのＲＴ反応毎に、７μＬのＲＴマスターミックスを５μＬの全ＲＮＡと合わせた。ＲＴプライマーを氷上で解凍し、３μＬのＲＴプライマーを９６ウェルプレートのウェル中の１２μＬのＲＴマスターミックス／全ＲＮＡに添加した。充填するまでプレートを氷上に保ち、次にサーマルサイクラーに入れた。
サーマルサイクラーステップ：
１６℃で３０分間
４２℃で３０分間
８５℃で５分間
４℃で都合がつく限り長時間
ＰＣＲ増幅
各ウェル毎に、１０μＬのＴａｑｍａｎ ２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスを７．６７μＬヌクレアーゼ−非含有水、１μＬの２０×Ｔａｑｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイミックス、および先行ステップからの１．３３μＬのＲＴ生成物に混合した。全てのウェルが充填されたら、オプティカル接着カバーを用いてプレートを密封し、遠心分離してあらゆる気泡を除去した。
【００８０】
次にプレートをリアルタイム対応サーマルサイクラー／ＰＣＲ機に装入し、以下のプログラムに従った。
９５℃で１０分間（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ酵素の活性化）
４０×（９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間）
データ分析
これらの技術の双方からのデータは、各プレートの急上昇ｍｉＲＮＡスポットに対して正規化し、別個の配列からのデータを比較できるようにした。
【００８１】
当業者に良く理解されている標準技術である主成分分析を使用して正規化データを分析し、ｍｉＲＮＡ発現プロフィール間の相関と、元の細胞に適用された特定試験薬の個々のｍｉＲＮＡ発現に対する作用の帰結であると判定された、観察されたあらゆるデータの組分けとを同定した。
【００８２】
図１は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現プロフィールを得る方法の流れ図である。
図２は、主成分分析後の発現プロフィールの一例を示す。パート（ａ）は、ｍｉＲＮＡ発現の総多次元発現データセットの３つの主成分の三次元投影を示し、１つの処置タイプについてのｍｉＲＮＡ発現データのクラスター形成を図示する。パート（ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ発現実験のデータ拡散を示す。
【００８３】
図３は、ｈａｓ−ｍｉＲ−１からｈａｓ−ｍｉＲ−１１と標識された１１の識別ｍｉＲＮＡの統計学的格付けを示す。ｐ値は結果が統計的に有意であるか、または偶然の結果（一般に０．０５以下のｐ値として示される）であるかどうかの標準統計学的試験値であり、ｑ値は複数試験について補正されたｐ値であり、偽発見率の測定を提供する。示されるｐ値は全て、０．０５よりもはるかに小さい。
【００８４】
図４（ａ）は、複数ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現の多次元データセットの３つの主成分の投射と、潜在的治療的用途の指示ｍｉＲＮＡのクラスター形成とを示す。（ｂ）は複数ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現の多次元データセットの３つの主成分の投射を示し、個々のｍｉＲＮＡは網掛け表示されて、それらの発現に適用される生物学的介入が使用される、治療的用途が示唆される。
【００８５】
以上のように結果は明白に組分けされ、この組分けは、その中でｍｉＲＮＡが発現された細胞に適用された生物学的介入の治療用途に準じている。換言すれば、組分けされた生物学的介入は、それらが適用された細胞に対して同様の作用機序を有し、そしてその共通の機序がｍｉＲＮＡ発現レベルに同様の効果をもたらしたかもしれないと判定することが可能である。
【００８６】
同様の作用機序がある生物学的介入はまた、同様の治療的特性も有してもよく、したがってそれらは同様の治療的用途を有してもよい。図３および４に提示されるデータは、試験された生物学的介入では、同様の治療的用途の生物学的介入（例えば抗代謝産物）のｍｉＲＮＡ発現の多次元データセットの３つの主成分の投影が実際にグループにまとまり、異なる治療用途がある生物学的介入の組分け（例えば後成的変更因子）は別のグループにまとまることを実証する。
【００８７】
ｍｉＲＮＡ発現パターンのデータベースは、多数の生物学的介入を実施して、ｍｉＲＮＡ発現プロフィール中で得られた変化を分析することで構築し得る。このようなデータベースは、未試験の生物学的介入とデータベース中の生物学的介入との間でｍｉＲＮＡ発現プロフィールを比較し、前記発現プロフィールが治療的用途の組分けの１つに入るかどうかを判定することで、前記未試験の生物学的介入の治療用途、または潜在的な将来の治療用途を同定できるようにする。このような相関が生じた場合、未試験の生物学的介入を特定の治療的用途について考慮してもよい。
【００８８】
さらにｍｉＲＮＡ発現データのデータベースを構築することは、特定の治療的用途の特徴を示す特定のｍｉＲＮＡサブセットを明らかにするかもしれない。ひとたび指示ｍｉＲＮＡの前記サブセットが同定されたならば、その細胞によって生成されるｍｉＲＮＡの全範囲でなく、指示ｍｉＲＮＡ発現プロフィールのサブセットの発現プロフィールを見ることで、潜在的な治療的用途を見つけるための新しい生物学的介入の将来の試験、または新しい治療的用途のための既知の生物学的介入の試験を実施し得る。
【００８９】
ｍｉＲＮＡ発現データのデータベースはまた、その発現レベルが同様の作用様式を有することが知られているか、または仮定される、生物学的介入、または生物学的介入群を識別するのに最も有用な特定のｍｉＲＮＡのサブセットを判定するのに用いてもよい。ｍｉＲＮＡは、同様の作用様式を有することが知られているか、または仮定される、生物学的介入、または生物学的介入群を識別するそれらの発現レベルの妥当性の順に格付けされてもよい。ｍｉＲＮＡには、同様の作用様式を有することが知られているか、または仮定される、生物学的介入、または生物学的介入群を識別するそれらの発現レベルの妥当性を示す数値を割り当ててもよい。例えば数値は、主成分の分散に対するｍｉＲＮＡの発現レベルの貢献に関連してもよい。
【００９０】
主成分分析などの統計学的方法を使用したｍｉＲＮＡ発現プロフィール比較の代替えとして、またはそれに加えて、限定的な（例えば１０〜５０の）各ｍｉＲＮＡ群の発現に対する生物学的介入の効果を同定し使用して、それぞれのｍｉＲＮＡ発現に対する生物学的介入効果に対して一群のコードから選択されるコードを割り当ててもよい。得られたコードを比較して、実質的な類似性を同定してもよい。
【００９１】
例えば次に基づいて、各生物学的介入について（例えばスクリーニングされた各化合物について）、格付けされた各ｍｉＲＮＡに対するコードとして３桁の２進数を割り当ててもよい。
１．生物学的介入に応えてｍｉＲＮＡの発現に変化がなければ（実験変動の正常限界内）、第１の桁は０に設定される。発現が顕著に変化すれば、第１の桁は１に設定される。
２．発現レベルの変化が同定されて変化が増大するならば、第２の桁は１に設定される。生物学的介入に起因する変化が減少すれば、第２の桁は０に設定される。
３．発現レベルが４倍を超えれば第３の桁は１に設定され、さもなければそれは０に設定される。
【００９２】
したがってｍｉＲＮＡの発現に対する生物学的介入レベルの効果に、５つの可能な値の１つを有するコードが割り当てられる。
１．発現の変化なし−０００
２．発現の大きな増大−１１１
３．発現の小さな増大−１１０
４．発現の大きな減少−１０１
５．発現の小さな減少−１００
一群のｍｉＲＮＡの発現レベルに対する生物学的介入（例えば特定化合物の投与）の効果は関連コードによって特徴付けられてもよく、主成分分析からはすぐに分からない発現レベルの変化が同定できるようになり、生物学的介入の類似性を採点する代案の方法を可能にして、得られた発現データが外観検査によって理解できるようになる。
【００９３】
生物学的介入効果を特徴付けて、異なる生物学的介入のｍｉＲＮＡ発現に対する効果間の相関を判定する別のやり方は、発現アッセイを実施して各ｍｉＲＮＡ群（典型的に１０〜５０）の発現に対する生物学的介入効果を判定し、例えば発現が最も増大した群中のｍｉＲＮＡから発現が最も減少した群中のｍｉＲＮＡの順で、またはその逆で、その群中のｍｉＲＮＡを効果順に格付けすることである。得られた格付けは、特定の生物学的介入効果の特徴を示す。したがってｍｉＲＮＡ群に対するその他の生物学的介入の効果を測定して、郡中のｍｉＲＮＡを効果の順に格付けしてもよい。得られた格付けを比較して、同定される生物学的介入効果間の相関を可能にしてもよい。
【００９４】
指示ｍｉＲＮＡサブセットを試験するのに使用できるプレートを含むキットを提供して、潜在的な新しい治療的用途について生物学的介入をスクリーニングし得る効率および速度を顕著に増大させてもよい。
【００９５】
本明細書に開示される本発明の範囲内で、さらなる変更および修正を加えてもよい。
参考文献
１．Ｘｉｅ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ３’−ＵＴＲｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｍａｍｍａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．４３４（７０３１）：ｐ．３３８−４５
２．Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｓｏｍｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．４３３（７０７２）：ｐ．７６９−７３
３．Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ａｃｉ ＵＳＡ，２００４．１０１（３２）：ｐ． １１７５５−６０
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非コードＲＮＡ発現アッセイを用いる方法に関する。本発明の実施態様は、２つ以上の介入が生体系に影響を及ぼす機序の類似性を判定すること、試験薬の治療的用途の候補を同定すること、そして１つ以上の適応症について以前臨床試験の対象であった治療薬の新たな用途を同定することをはじめとするが、これに限定されるものではない問題に対処する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現アッセイの利用に言及して本発明に関わる論点をここで検討するが、本発明では、その他の非コードＲＮＡ分子に関する発現アッセイを用いてもよい。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、２１〜２３ヌクレオチド前後の長さを有する一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは最初１９９３年にＶｉｃｔｏｒ Ａｍｂｒｏｓによって記載され、それ以来ｍｉＲＮＡの論題で２，０００を超える論文が公開されている。ヒトでは約１，０００のｍｉＲＮＡが予測されており、今までにその中のほぼ６００が記載され実験的に検証されているが、その数を数万と推定する者もいる。しかし様々なヒトおよび齧歯類の組織および細胞系中のｍｉＲＮＡの発現アトラスの作成を模索する最近の報告は、検出される全ｍｉＲＮＡの９７％をおよそ３００のｍｉＲＮＡが占めると報告した。
【０００４】
ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されないが、その代わりに１つ以上のその他の遺伝子の発現を調節する。既知の生物学は、現在、ｍｉｃｒｏＲＮＡが特定の個々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡ群を標的にして、それによってそれらの翻訳を妨げ、またはそれほど頻繁ではないがＲＮＡの分解を加速することを示す。成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質と複合体を形成し、その標的遺伝子のタンパク質コーディングｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）内の部分的相補的配列に結合する。さらなるタンパク質が動員されてサイレンシング複合体が形成され、標的遺伝子産物の発現はｍＲＮＡの翻訳をブロックする機序によって阻止される。
【０００５】
ｍｉＲＮＡの生物学、およびサイレンシング複合体の組成および機序に関して未だ発見されていないことは多いが、ｍｉＲＮＡが多数の遺伝子の制御に関与することは明白である。ｍｉＲＮＡは、翻訳レベルで全遺伝子の３０％を調節すると考えられている（Ｘｉｅら、２００５）。ｍｉＲＮＡは複数の遺伝子を調節し得て、各遺伝子は複数のｍｉＲＮＡによって調節され得る。ｍｉＲＮＡの組織特異的発現は、組織を分化させ、および／または組織同一性を能動的に保つことへの細胞の傾倒を先導すると考えられる。この幅広い影響および異なるｍｉＲＮＡ間の相互作用は、単一ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの小さなサブセットの調節解除された発現が、複雑な疾患形質をもたらすかもしれないことを示唆する（Ｌｉｍら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ）。既知のヒトｍｉＲＮＡの５０％以上が、癌細胞への変化をこうむりがちなゲノム領域に存在する（Ｃａｌｉｎら、２００４ ＰＮＡＳ，１０１，２９９−３００４）。当然のことながらｍｉＲＮＡの発現パターンは、癌およびその他の疾患状態において変化する。この情報は、癌幹細胞中の特定のｍｉＲＮＡ発現パターンを定義できるようにすることで、癌を類別して病期分類し、予後および応答の生物マーカーを明らかにして、治療的介入を導くための主要な決定因子を提供し、化学的感受性を説明して化学療法抵抗性機序を提供するのに使用され始めている。
【０００６】
可能な新しい治療法の研究開発に対するｍｉＲＮＡの応用は、典型的に、それによってｍｉＲＮＡの発現およびプロセッシングが制御される機序、およびそれによって特定のｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ翻訳を調節する機序の詳細かつ時間がかかる分析からもたらされている。特定の薬剤標的が同定されており、これらの薬剤標的と関連した研究が継続している。しかし徹底的ではあるけれども、この研究パラダイムは時間がかかり高価である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明は、介入の作用機序の詳細な理解も特定の薬剤標的の同定も要さない、治療薬投与などの介入の実用的応用を発見する代案の方法を提供することを目標としている。本発明のいくつかの実施態様は、既知の治療物質の新しい適応症を判定し、または試験薬の毒物学的プロフィールの側面などの薬理学的特性を予測する問題に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明に従って、
（１）生体系への介入を実施する工程と、介入に起因する生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定する工程と、測定された発現プロフィールから誘導される発現データセットを保存する工程をそれぞれ含む、複数の異なる介入と複数の異なる生体系との片方または双方に関する複数の発現アッセイを実施するステップと、
（２）得られた発現データセットを分析して、異なる介入または異なる生体系の片方または双方に関する２つ以上の発現アッセイ群におけるそれぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するステップ
を含む方法が提供される。
【０００９】
発現データセットを分析して、実施された介入と、それに対して介入が実施された生体系との片方または双方に関して異なる、２つ以上の発現アッセイ群における非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する介入の効果間の類似性を判定することで、それによって１つ以上の介入が１つ以上の生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールに影響を及ぼす機序を判定する必要なしに、相関を判定してもよい。
【００１０】
したがって既知の治療的妥当性がある第１の介入の効果と関連付けられている非コードＲＮＡ発現プロフィールに対して、第２の介入が効果を有することが分かった場合、第２の介入は同一のまたは同様の治療的応用の候補として扱い得る。第１および第２の介入が、同一の、同様の、または関連した作用機序を有する可能性は、少なくともいくらかある。この方法論は、治療的介入を発見するために、特定の標的（タンパク質、核酸または液体分子など）が同定されて分析され、標的の生物学が深く研究され、標的の１つ以上の活性を調節するのに適した治療的介入が合理なおよび／または組み合わせによる方法によって開発される、既知の戦略とは、全く対照的である。
【００１１】
１つ以上の（そして場合により全ての）前記介入は、１つ以上の試験薬の生体系への、同時または逐次のどちらかの適用を含んでもよい。１つ以上の試験薬は、例えば２，０００ダルトン未満、１，０００ダルトン未満、または５００ダルトン未満の分子量を有する分子などの化学物質であってもよい。化学物質は非ポリマー性であってもよい。１つ以上の試験物質は、例えば脂質、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質（例えば酵素、抗体、または抗体断片、ヒト化抗体または抗体断片、ファージまたはリボソームディスプレイタンパク質断片、またはプリオン）などの生体高分子のような生物学的物質であってもよい。生物学的物質はウィルスまたは細菌であってもよい。したがって発現アッセイのいくつかまたはそれぞれは、生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する試験薬の効果を測定してもよい。
【００１２】
１つ以上の前記試験薬は治療薬であってもよい。１つ以上の前記試験薬は、既知の病状の治療または予防に対する既知の用途を有する治療薬であってもよい。１つ以上の前記試験薬は、１つ以上の適応症に関して（成功裏であるかどうかに関わらず）臨床試験の対象とされている治療薬であってもよい。しかし１つ以上の（そして場合により全ての）前記介入は、電離放射、連続またはパルス電磁放射（例えば可視光、紫外線、赤外線）、（空気または液状媒体を通じて送達される）音響エネルギー、機械的介入（例えば加圧）、電気、温度変化、容積モル浸透圧濃度変化、増殖培地の張性またはｐＨ、磁界、流体力学の変化、および機械化学的な情報伝達を含む群の１つ以上の生体系に対する適用を含んでもよい。したがって少なくともいくつかの介入は、生体系に有害であることが知られている介入であってもよい。このような有害な介入に起因する発現プロフィールは、有害効果を覆しまたは予防する薬剤を同定するのに有用かもしれない。
【００１３】
１つ以上の前記生体系は、例えばヒト、ウサギ、または齧歯類（例えばマウスまたはラット）細胞のような哺乳類細胞、または培養昆虫、両生類または魚細胞系などの細胞を含んでもよい。１つ以上の前記生体系は、細胞型の混合物を含んでもよい。介入は、典型的に培養哺乳類細胞に対して実施される。哺乳類細胞は、幹細胞または前駆細胞であってもよい。幹細胞とは、自己再生して少なくとも１つの別の特殊な細胞型に分化できる細胞を指す。しかし１つ以上の前記生体系は、生物全体、生体外組織、合成系または形質転換細胞であってもよい。１つ以上の前記生体系は、遺伝子導入されていてもよい。培養細胞は、同期または非同期の細胞周期を有してもよい。１つ以上の前記介入は、幹細胞または前駆細胞の分化または脱分化状態を変化させ、または幹細胞または前駆細胞の特殊化を引き起こし、または特定の細胞系統または分化状態の特徴を保ちながら複製を引き起こす介入であってもよい。
【００１４】
発現アッセイを繰り返してもよく、分析される発現データセットは、同等な生体系に対する同等な介入を使用して、いくつかのまたは全ての反復実験から集計してもよい。
【００１５】
相関は典型的に、どの発現データが発現データセットに保存されるかとの関連で、非コードＲＮＡのサブセットの発現の間にある。非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関は典型的に、２つ以上の発現アッセイ間の１つまたは少数の（例えば２、３、５または５未満の、または１０または１０未満の）非コードＲＮＡ発現の変化における、正または負であってもよい相関である。正相関は、２つの各発現アッセイにおける１つ以上の非コードＲＮＡ発現の増大を含んでもよい。正相関は、２つの各発現アッセイにおける１つ以上の非コードＲＮＡ発現の減少を含んでもよい。負相関は、第１の発現アッセイにおける１つ以上の非コードＲＮＡ発現の増大と、第２の発現アッセイにおける同一の１つ以上の非コードＲＮＡ発現の減少とを含んでもよい。
【００１６】
それぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するために、方法は、例えばそれぞれの介入が実施されない対照アッセイ、またはそれぞれの介入を実施する前に生体系における非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定するステップを含む対照アッセイなどの適切な対照アッセイにおいて、非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定するステップをさらに含んでもよい。発現アッセイおよび対応する対照アッセイにおける非コードＲＮＡ発現プロフィール間の違いを判定してもよい。保存された発現データセットは、測定された発現プロフィールおよび対応する対照アッセイの発現プロフィールに由来してもよい。得られた発現データを分析するステップは、対照アッセイからの発現プロフィールを考慮に入れてもよい。しかしいくつかの用途では、対照アッセイを実施しなくてもよい。例えば同等な生体系に対して複数の介入を実施する場合、それぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するためには、各発現アッセイに起因する発現プロフィールだけに由来するデータセットを分析することのみが必要であるかもしれない。
【００１７】
例えば２つ以上の発現アッセイ群におけるそれぞれの介入の非コードＲＮＡ発現に対する効果間の類似性など、少なくとも前記相関のいくつかは正相関であってもよい。相関を判定するために、得られた発現データセットを分析するステップは、発現アッセイに起因する発現データセット間の類似性に基づいて発現アッセイを分類するステップ（例えばクラスター形成または組分け）を含んでもよい。有利には、これは、共通する機序の性質を理解することを要せずして、２つ以上の異なる介入が（典型的に同一または同等な生体系の）非コードＲＮＡ発現プロフィールに対して直接にまたは間接的に効果を有する機序の類似性を同定し得るようにするかもしれない。
【００１８】
したがって方法は、２つ以上の介入が、１つ以上の非コードＲＮＡ発現に対して同様の効果を有することを判定する方法であってもよい。第１の介入は、少なくとも１つの既知の第１の治療的用途を有する第１の治療物質の適用であってもよく、方法は、第２の治療物質の適用を含む第２の介入の非コードＲＮＡ発現に対する効果間に正相関があるかどうかを判定する方法であってもよい。したがって方法は、既知の治療物質（第２の治療物質）について、可能な新しい治療的用途（第１の治療的用途）を判定する方法であってもよい。方法は、第２の介入が、前記既知の第１の治療的用途の応用に適用できるかどうかを試験するステップをさらに含んでもよい。
【００１９】
第１の介入は、既知の第１の治療的用途はないが、治療法としての展開に適した薬理学的および毒物学的プロフィールを有することが知られている物質の適用であってもよい。したがって方法は、毒物学試験に合格したが、臨床試験において有効である、または対照治療物質よりも有効であることが分からなかった治療物質の可能な新しい治療的用途を判定する方法であってもよい。
【００２０】
前記相関の少なくともいくつかは負相関であってもよく、例えば２つ以上の介入が１つ以上の非コードＲＮＡ発現に対して逆の効果を有すると判定されてもよい。有利には、第１の介入および第２の介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の負相関は、第２の介入が治療法において第１の介入の１つ以上の効果を逆転させるのに恐らく有用たり得ることを示唆するかもしれない。したがって第１の介入は、生体系に対して悪影響を有することが知られている介入であってもよく、例えば第１の介入は毒素の適用であってもよい。この場合、方法は、第１の介入によって引き起こされることが知られている病状を治療または予防する候補として、第２の介入を同定するステップを含んでもよい。
【００２１】
したがって複数の介入は、毒素の投与または生体系に有害な処置を含んでもよい。したがって方法は、１つ以上のその他の介入によって引き起こされることが知られている病状を治療、または予防するかもしれない介入候補（例えば治療物質候補）を判定する方法の一部であってもよい。方法は、既知の治療的介入（例えば治療物質または放射線療法の適用）の副作用を治療または予防する候補を判定する方法の一部であってもよい。
【００２２】
方法は、例えば、第１の介入に起因する非コードＲＮＡ発現プロフィールが、生体系に対して悪影響を有することが知られている介入の発現プロフィールと正に相関し、またはその毒物学の１つ以上の側面が知られている薬剤の投与を含む介入の発現プロフィールと正に相関することを検出することで、試験薬の毒性の１つ以上の側面を予測する方法であってもよい。
【００２３】
方法は、非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する、第１の試験薬および第２の試験薬の効果、または標的分子の既知の作動薬または拮抗薬である試験薬の効果間のそれぞれの相関を判定することによって、第１の試験薬が第２の試験薬または特定の標的高分子の作動薬候補または拮抗薬候補であることを判定する方法であってもよい。
【００２４】
方法は、非コードＲＮＡ発現に対して同様の効果を有する介入を組分けするステップを含んでもよい。得られた発現プロフィールは、さらなる治療物質を同定するさらなる研究の有用な出発点になるかもしれない。方法は、例えば一群の治療物質である、一群の介入と関連付けられている非コードＲＮＡ中の発現プロフィールの変化を判定する方法であってもよい。したがって方法は、化学または生物学的物質が生体系に対して作用機序を有し、それが生体系に対する別の化学または生物学的物質の作用機序に関連することを判定する方法であってもよい。グループは、分類体系によって順序付けられてもよい。
【００２５】
介入が生体系に対する第２の試験薬の適用であって、非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する第２の試験薬の適用の効果が、第１の病状の治療または予防に有用であることが知られている別の第１の試験薬の生体系に対する効果と（正または負）相関性があることが分かった場合、第２の試験薬、または第２の試験薬を変性することによって得られる試験薬を第１の病状または第１の病状に関連する病状の治療または予防における有効性について試験してもよい。第１の病状または第１の病状に関連する病状の治療または予防に有効であることが分かった試験薬は、妥当な病状の治療または予防から展開してもよい。
【００２６】
いくつかの実施態様では、複数の異なる生体系に対して同一の介入または介入群が実施される発現アッセイが実施される。したがって方法は、複数の異なる生体系のいくつかのみに存在する介入効果間の相関を発見できるようにしてもよい。いくつかの実施態様では、複数の異なる生体系は、例えば異なる発達段階などの、異なる分化または脱分化状態にある幹細胞である。したがって方法は、特定の分化または脱分化状態にある幹細胞に対する介入効果間の相関を発見できるようにしてもよい。この情報は、発達機序、および幹細胞または前駆細胞の分化および脱分化を研究するのに有用である。複数の異なる生体系は、異なる疾患状態にある哺乳類細胞を含んでもよい。介入は、幹細胞または前駆細胞の分化または脱分化を引き起こし、または特定の分化状態の獲得を推進し、または特定の分化状態にある幹細胞または前駆細胞の安定性を保つ介入であってもよい。
【００２７】
発現プロフィールは、少なくとも１つの、そして典型的に複数の非コードＲＮＡ、好ましくは少なくとも１０、またはより好ましくは少なくとも１００の非コードＲＮＡ発現に関連している。発現プロフィールは、マーカーとして機能する１つ以上の遺伝子導入非コードＲＮＡ発現に関連していてもよい。発現プロフィールは、１つ以上の非コードＲＮＡの発現レベルの定量的または定性的測定を含んでもよい。１つ以上の前記非コードＲＮＡ発現レベルは、例えば、特定の生体系中で生体系ゲノムに組み込まれ、またはエピソームに保持される、遺伝子導入レポーターコンストラクトなどのレポーターコンストラクト活性化の量またはレベルの測定を通じて間接的に判定されてもよい。発現プロフィールは、典型的に、例えば１つ以上の非コードＲＮＡの定常状態またはピーク量など、生体系中の少なくともいくつかの状況で発現される１つ以上の非コードＲＮＡの量に関連する。しかし発現プロフィールは、例えば１つ以上の非コードＲＮＡ発現の変化率に関連するかもしれない。いくつかの実施態様では、発現プロフィールはマイクロアレイを使用して得られる。
【００２８】
非コードＲＮＡは、典型的にｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、ｍｉＲＮＡ前駆体および成熟ｍｉＲＮＡの片方または双方を含んでもよい。非コードＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の１つ以上を含んでもよい。非コードＲＮＡは遺伝子導入されていてもよい。ＲＮＡのいくつかまたは全ては、例えば非コードＲＮＡ発現のレポーターとして機能する遺伝子導入ＲＮＡであってもよい。非コードＲＮＡはエピソームＲＮＡであってもよく、方法は、例えばウィルスを用いた生体系の感染によってエピソームＤＮＡを生体系に導入するステップを含んでもよく、エピソームＤＮＡが転写されて、解析された非コードＲＮＡの全部または一部を構成する非コードＲＮＡを生成し得る。
【００２９】
発現プロフィールは一群の非コードＲＮＡ中で各非コードＲＮＡについて測定してもよく、方法は、複数の介入がそれに対して相関効果を有する発現プロフィールを有する、個々の非コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡ群の下位集団を同定するステップを含んでもよい。
【００３０】
相関効果を有する複数の介入は本発明の方法によって同定されてもよく、したがって複数の介入によって影響される発現レベルを有する、一群の非コードＲＮＡ、および群中の個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団の発現プロフィールに対して相関効果を有する双方の介入が、同定できるようになる。
【００３１】
相関効果を有する複数の介入は、関連作用機序を有することが以前に知られている介入であってもよく、例えば、複数の介入は、例えば薬物群のような、同一のまたは同様の作用機序を有することが知られているか、または有すると考えられている薬剤の投与を含んでもよい。したがって本発明は、複数の介入によって影響される発現レベルを有する、個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団を同定する方法を提供する。
【００３２】
次に低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールが測定されるさらなる発現アッセイで使用するために、得られた同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定された非コードＲＮＡ下位集団を選択してもよく、低減された非コードＲＮＡ群は、少なくとも同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定された非コードＲＮＡ下位集団を含み、または場合によりそれからなる、非コードＲＮＡ群のいくつかのみを含む。その結果、低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールに対するさらなる介入の効果、および低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールに対するさらなる介入の効果と、低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールに対する前記複数の介入の効果との間の相関を判定し得る。したがって引き続くアッセイおよび試験ではより少ない非コードＲＮＡを用いてもよく、経費が低減されて処理能力が増大する。例えば治療薬群がそれに対して相関効果を有する発現レベルを有する低減された非コードＲＮＡ群を使用して、新しい治療的に有用な薬剤を発見するために、または既知の治療薬について新しい適応症を同定するために、薬剤候補をスクリーニングしてもよい。
【００３３】
生物学的介入効果を識別するための、非コードＲＮＡ群または下位集団の発現レベルの妥当性を判定してもよい。方法は、生物学的介入効果の間の識別に対するそれらの妥当性にしたがって、群または下位集団中で非コードＲＮＡを格付けするステップを含んでもよい。方法は、非コードＲＮＡ発現に対して相関効果を有する、生物学的介入または一群の生物学的介入の非コードＲＮＡ発現に対する効果を非コードＲＮＡ群または下位集団中で格付けするステップを含んでもよい。得られた格付けを使用して、生物学的介入効果間の相関を同定してもよい。
【００３４】
相関は、例えば主成分分析などの統計学的数学的方法によって同定してもよい。複数の各特定の非コードＲＮＡ発現に対する生物学的介入効果に、それぞれの非コードＲＮＡ発現に対する生物学的介入効果の特性を示す一群のコードの１つを割り当ててもよい。得られたコードを分析して、相関を同定してもよい。
【００３５】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる、前記低減された非コードＲＮＡ群からなる非コードＲＮＡを有するアッセイ装置（例えば試験キット、またはそれに固定化された非コードＲＮＡを有する固相担体）にも及ぶ。
【００３６】
ここで以下の図に言及して、本発明の実施形態の例を例証する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の方法に従った流れ図である。
【図２ａ】１つの生物学的介入についての主成分分析からの結果のプロットである。
【図２ｂ】１つの変数についての主成分分析からの結果のプロットである。
【図３】ｐ値およびｑ値による１１個のｍｉＲＮＡの統計学的格付けを示す表である。
【図４ａ】標識された識別ｍｉＲＮＡの下位集団を示す主成分分析からのデータプロットである。
【図４ｂ】異なる介入タイプからの発現データがどのようにクラスター形成するかを示す、４つの介入タイプからのデータを示す主成分分析からのデータプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施形態例の詳細な説明
本発明の実例応用において、ｍｉＲＮＡ発現データセットのデータベース（非コードＲＮＡ発現プロフィールに由来する発現データセットの一例）を作成する。図１に言及すると、既知の方法によって適切なヒト細胞を培養し（２）、試験薬を培養細胞に投与する（４）。次に介入実施後の１つ以上の期間中に、処理細胞のサンプルを使用してｍｉＲＮＡ発現プロフィールを測定し（６）、処理細胞中のいくつかの各ｍｉＲＮＡの発現レベルを判定する。
【００３９】
ｍｉＲＮＡ発現プロフィールを測定する２つの代案の方法であるマイクロアレイ分析法、および定性的リアルタイムＰＣＲ分析法について下で述べる。
【００４０】
（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびデータ分析法
Ｖｅｄｂａｅｋ，ＤｅｎｍａｒｋのＥｘｉｑｏｎ Ａ／Ｓからのカラムベースのキットを使用して、薬剤処理（ｎ ＝ ３）および対照処理細胞（ｎ ＝ ３）からの全ＲＮＡを単離する。ｍｉＲＮＡマイクロアレイによって、各サンプルからの全ＲＮＡの２μｇを分析する。標識、ハイブリダイゼーション、スキャニング、正規化、およびデータ分析を含むｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析は、例えばＥｘｉｑｏｎ Ａ／Ｓなどのようないくつかの供給元から市販される。簡単に述べると、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００ マイクロ流体プラットフォーム（ＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの商標である）を使用して、ＲＮＡ品質管理を実施する。ＡｇｉｌｅｎｔからのＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｈｙｂ Ｋｉｔを使用し、提供される説明書に従ってサンプルを標識する。
【００４１】
（２）定量的リアルタイムＰＣＲ法
上のオプション（１）同様、Ｅｘｉｑｏｎからのカラムベースキットを使用し、製造業者の使用説明書に従って全ての細胞性ＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによるｍｉＲＮＡの定量化は、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））によって記載されるように実施する（ＴａｑＭａｎはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の商標である）。簡単に述べると、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットおよびｍｉＲＮＡ特異的ステムループプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１０ｎｇのＲＮＡを逆転写（ＲＴ）のテンプレートとして使用する。２０μｌのＰＣＲ反応にＲＴ生成物のアリコート（１．５μｌ）を装入し、それをＡＢＩ７９００ＨＴサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上の９６ウェルプレート内において、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルでインキュベートする。Ｕ４８ ＲＮＡ（小型非コードＲＮＡ）（またはＵ４８が薬物療法によって変動することが分かればＧＡＰＤＨ）発現の値に基づいて、異なるサンプル間で標的遺伝子発現を正規化する。
【００４２】
いずれの場合にも、得られるｍｉＲＮＡ発現レベルを発現データセットとして保存する（８）。多数の発現アッセイを好ましくは実施する。このようにして、典型的に多数（例えば数百または数千）の試験薬を細胞培養物に装入し、分析してｍｉＲＮＡ発現データのデータベースを作り出す。
【００４３】
ｍｉＲＮＡ発現データセットの適切に大きなデータベースが利用できるようになったら、発現データセットを分析し（１０）、ｍｉＲＮＡ発現に対する各試験薬の効果間の相関を判定して、ｍｉＲＮＡ発現プロフィールに対して同様の効果を有する試験薬の階層的なクラスターを作り出す。
【００４４】
核酸発現データセット間の相関を判定する方法は、当業者に良く知られている。例えば一方法は、ＧＰＲ形式でＥｘｉｑｏｎ Ａ／Ｓから得られるマイクロアレイデータをスプレッドシートにインポートすることである（ＧＰＲは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から入手できるＧｅｎｅｐｉｘ６ソフトウェアによって使用されるデータ形式であり、ＧｅｎｅｐｉｘはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓの商標である）。各ｍｉＲＮＡのスポット強度を品質対照に対して分析し、較正スポットをｍｉＲＮＡ配列上に提供する（Ｇｅｎｅｐｉｘ６ソフトウェアによって負のフラグとして示される）。シグナル強度５０未満の値は０とする。各ｍｉＲＮＡ捕捉プローブ種の４つの各複製スポットについてバックグラウンド補正スポット強度の中央値を計算し、階層的クラスター形成および／または当業者に良く知られているその他の統計学的分析を実施する、ＴＭｅＶマイクロアレイ分析ソフトウェアにインポートする（ＴＭｅＶは、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅによってＵＲＬ ｗｗｗ．ｔｍ４．ｏｒｇで提供される）。
【００４５】
代案としては、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できるＧＲＰ形式の発現データをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸソフトウェアにインポートしてもよく（Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの商標である）、７５パーセンタイル数に正規化し、次に階層的クラスター形成およびＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸに組み込まれているその他の統計学的ツールを使用して処理する。
【００４６】
１つ以上のｍｉＲＮＡの発現に対して、２つ以上の試験薬の効果間に正相関が見つかった場合、これは試験薬が同一のまたは関連した作用機序を共有する徴候であるかもしれない。したがって病状の治療法として知られている薬剤と同様の効果をｍｉＲＮＡ発現プロフィールに対して有することが分かった試験薬は、同一のまたは関連した病状を治療する候補として同定し得る（１２）。これは既に１つの治療的応用に潜在的に有用であると同定された薬剤の再配置を促進するのに、有用であるかもしれない。候補試験薬を試験して、それらが同一のまたは関連した病状の治療に有用かどうか、またはさらなる研究の出発点として使用できるかどうかを判定し得る。例えばそれらを合理的なまたは組み合わせによる設計法を使用して修飾し、模倣剤化合物を調製して試験等ができるかもしれない。候補試験薬を試験して（１４）、それらが治療物質として使用するのに適するか判定し、もしそうであれば治療物質として採用し得る（１６）。
【００４７】
ｍｉＲＮＡ発現に対する効果による分類は、直接または間接的であるかどうかにかかわらず、ｍｉＲＮＡ発現レベルに対する同様のまたは関連した作用機序に反映されるかもしれないので、１つ以上のｍｉＲＮＡ発現に対して同様の効果を有する試験薬を組分けすることは特に有用である。
【００４８】
負相関が同定された場合、１つの試験薬が、さらなる試験薬またはその他の介入の１つ以上の望ましくない影響を予防、軽減、または除去する候補として同定されるかもしれない。したがって望ましくない効果を有する別の試験薬に対する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現に対して反対の効果を有することが知られている試験薬は、望ましくない効果を治療または予防する物質候補として考慮し得る。
【００４９】
有利にはｍｉＲＮＡ発現アッセイを実施して、化学または生物学的物質投与以外の介入をはじめとする一連の介入の効果を評価する。例えば紫外線、電離放射、音波、および細胞に有害なその他の介入を用いて細胞を処理してもよい。このような介入の効果と負に相関する、１つ以上のｍｉＲＮＡの発現に対する効果を有する試験薬を同定し得る場合、その試験薬は対応する生体内介入に起因する望ましくない効果の治療候補または予防候補であってもよい。これは紫外線によって、または放射線療法の副作用として、引き起こされる損傷を予防する薬剤を同定するのに有用かもしれない。
【００５０】
方法は、多数の試験薬の高処理能力スクリーニングに応用し得る（例えば小型の化学物質、ペプチド、ペプチド模倣薬またはポリ核酸の組み合わせライブラリー）。新しい発現アッセイが実施されると、得られた発現データセットをあらかじめ保存された発現データセットと比較して、スクリーンされた試験薬の効果と、あらかじめアッセイされた薬剤の効果間の相関を探し得る。
【００５１】
方法は、典型的に、ｍｉＲＮＡ発現データセットの大きなデータベースを使用して用いるのが最適である。しかしいくつかの特定用途では、新しいアッセイに起因するｍｉＲＮＡ発現データセットとの比較のために利用できる、少数のｍｉＲＮＡ発現データセット、または１つのｍｉＲＮＡ発現データセットを有することのみを要するかもしれない。これは、例えばｍｉＲＮＡ発現に対して顕著な効果を有することが知られており、またはそれが疑われる薬剤の効果などの特定の同定された効果と正または負相関を有するｍｉＲＮＡ発現に対する効果を有する薬剤を見いだす高処理能力スクリーニングにおいて、妥当かもしれない。
【００５２】
したがって本発明は、試験薬がｍｉＲＮＡ発現プロフィールに影響を及ぼす機序の理解を要せずして、試験薬（化学物質および生物製剤）の作用機序における類似性、ひいては実用的用途が、ｍｉＲＮＡ（そして潜在的にその他の非コードＲＮＡ）の発現に対するそれらの効果の比較分析を通じて発見されるかもしれないという原理に基づく。これは、その中で作用機序が深く研究されて、薬剤標的と所望の相互作用を有する薬剤を発見するためのスクリーニングアッセイで使用される薬剤標的が同定される、従来の創薬および薬剤再配置戦略とは全く対照的である。
【００５３】
実験的発見およびそれらの意味合い
記載される方法を使用して、我々はｍｉＲＮＡ発現データの組分けに基づいて、介入の潜在的な治療的用途の様式を判定することが可能であると判断した。さらに方法を使用して、スクリーニングされる介入の特定の治療的用途の指標となる発現レベルを有する、特定のｍｉＲＮＡを同定し得る。このような指標となるｍｉＲＮＡは将来、ｍｉＲＮＡライブラリー全体でなく、ｍｉＲＮＡ発現レベルの比較的小さな群を分析して、スクリーニングされる介入の潜在的治療用途を同定するためのさらなる介入スクリーニングができるようにする。
【００５４】
選択されたｍｉＲＮＡの小さな群を使用して、介入の潜在的治療用途を判定する一例を下に示す。
【００５５】
本明細書で記載される実験では、対照として、一群の細胞をジメチルスルホキシドまたはＤＭＳＯ、およびリン酸緩衝食塩水を含む薬剤溶剤ミックスで処理した。薬剤溶剤ミックスは、ｍｉＲＮＡ発現に対する効果を有さないと仮定され、もし効果があれば、それは試験される薬剤に関連付けられているパターンのいずれにも一致しないと仮定された。しかし薬剤溶剤ミックスは、ＨＤＡＣ阻害剤に一致するｍｉＲＮＡ発現パターンを有することが分かった。後に文献レビューから、ＤＭＳＯはＨＤＡＣ阻害剤であるとされていることが分かり、薬剤の未知の潜在的治療特性が、本発明の方法を使用して判定され得ることが確認された。
【００５６】
材料と方法
ＨｅＬａ細胞は標準法を使用して培養した。細胞はＤＭＥＭ培地中で分割させた。
【００５７】
培地を吸引して、細胞単層を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、８００ｍｌの蒸留水に溶解された８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、および０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。ＰＢＳを吸引した。
【００５８】
試験対象の試験薬を細胞に投与して、４８時間にわたりインキュベートした。
ＲＮＡ抽出
Ｅｘｉｑｏｎからのカラムベースのキットを使用して、以下の手順でこれらの細胞からＲＮＡを単離精製した。
【００５９】
細胞が成長した培地を吸引して、細胞単層を適量のＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳをさらに吸引した。
【００６０】
３５０μＬの溶菌液を培養プレートに直接添加した。培養皿を穏やかに叩いて緩衝液をプレート表面で５分間旋回させ、細胞を溶解した。次に溶解産物を微小遠心管に移した。
【００６１】
２００μＬの９５〜１００％エタノールを溶解産物に添加し、１０秒間ボルテックスして混合した。
【００６２】
キット中で提供される管の１本を使用して、カラムを組み立てた。６００μＬの溶解産物／エタノールをカラムに装入し、１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。通過物を廃棄し、その収集管を用いてスピンカラムを再び組み立てた。
【００６３】
提供される洗浄溶液の４００μＬをカラムに装入して、１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。通過物を廃棄し、その収集管を用いてスピンカラムを再び組み立てた。
【００６４】
別の４００μＬの洗浄溶液を添加して１４，０００×ｇで１分間遠心分離し、カラムをさらに２回洗浄した。通過物を廃棄し、その収集管を用いてスピンカラムを再び組み立てた。
【００６５】
カラムを１４，０００×ｇで２分間遠心分離して樹脂を完全に乾燥させ、収集管を廃棄した。
【００６６】
キットで提供される１．７ｍＬ溶出管にカラムをアセンブルし、５０μＬの溶出緩衝液をカラムに添加して、２００×ｇで２分間、続いて１４，０００×ｇで１分間遠心分離した。
【００６７】
得られた精製ＲＮＡサンプルは、−２０℃で数日間保存し得た。サンプルの長期保存のためには、−７０℃で保存した。
【００６８】
（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびデータ分析法
標識
Ａｇｉｌｅｎｔからの標識キットを使用して、精製ＲＮＡサンプルを標識した。
【００６９】
全ＲＮＡサンプルを１×ＴＥ ｐＨ７．５中で５０ｎｇ／μＬに希釈した。２μＬの希釈全ＲＮＡを１．５ｍＬ微小遠心管に入れ、氷上にのせた。使用直前に、０．４μＬの１０×仔ウシ腸管ホスファターゼ緩衝液、１．１μＬのヌクレアーゼ非含有水、および０．５μＬの仔ウシ腸管ホスファターゼを穏やかに混合して、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼマスターミックスを調製した。
【００７０】
２μＬの仔ウシ腸管アルカリホスファターゼマスターミックスを各サンプル管に入れて総反応体積を４μＬにし、ピペット操作により穏やかに混合した。反応体積を循環する水浴内において３７℃で３０分間インキュベートした。
【００７１】
２．８μＬの１００％ＤＭＳＯを各サンプルに添加した。サンプルを循環水浴内において１００℃で５〜１０分間インキュベートし、次に即座に氷浴に移した。
【００７２】
１０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液を３７℃に暖め、全ての沈殿物が溶解するまで回転させた。使用直前に、１μＬの１０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液、３μＬのシアニン３−ｐＣｐ、および０．５μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼを穏やかに混合してライゲーションマスターミックスを作成し、氷上に置いた。
【００７３】
４．５μＬのライゲーションマスターミックスを各サンプル管に添加して、総反応体積を１１．３μＬにした。サンプルをピペット操作により穏やかに混合し、遠心分離した。次に循環する水浴内において、サンプルを１６℃で２時間インキュベートした。次に真空濃縮器を使用して４５〜５５℃でサンプルを乾燥させ、管を弾いてペレットが動いたり分散したりしなければ、サンプルは乾燥していると判定された。
【００７４】
ハイブリダイゼーション
Ａｇｉｌｅｎｔキットで提供される凍結乾燥１０×ＧＥブロック剤を含有するバイアルに、１２５μＬのヌクレアーゼ非含有水を添加して混合した。
【００７５】
乾燥サンプルを１８μＬのヌクレアーゼ非含有水に再懸濁した。４．５μＬの１０×ＧＥブロック剤を各サンプルに添加した。２２．５μＬの２×Ｈｉ−ＲＰＭハイブリダイゼーション緩衝液を各サンプルに添加して、よく混合した。得られたサンプルを１００℃で５分間インキュベートし、次に即座に氷浴に移してさらに５分間インキュベートした。
【００７６】
清潔なガスケットスライドをＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＨｙｂチャンバーベースに装入し、ガスケットスライドがチャンバーベースと確実にぴったり重なるようにした。確実に気泡がないようにして、ハイブリダイゼーションサンプルをガスケットウェルに分注した。
【００７７】
アレイを活性面を下向きにしてＳｕｒｅＨｙｂガスケットスライドにのせ、ＳｕｒｅＨｙｂチャンバーカバーを用いてアセンブルしてアセンブルチャンバーを形成した。アセンブルチャンバーを５５℃に設定したハイブリダイゼーションオーブンに入れ、その温度で２０時間、２０ｒｐｍで回転させた。
【００７８】
引き続いて、提供されたＧＥ洗浄緩衝液を使用してスキャン前に配列を洗浄した。
（２）定量的なリアルタイムＰＣＲ
ＲＴ反応マスターミックスの調製
構成要素を氷上で解凍した。０．１５μＬのｄＮＴＰ（１００ｍＭ）、１μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅはＡｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商標である）（５０Ｕ／μＬ）、１．５μＬの１０×逆転写緩衝液、０．１９μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μＬ）、４．１６μＬのヌクレアーゼ非含有水を混合して、ＲＴ反応マスターミックスを調製し、次に氷上で保存した。上述の体積は１５μＬのＲＴ反応あたりのもので、実施したＲＴ反応の数に応じて増大させたことに留意されたい。
【００７９】
ＲＴ反応の調製
各１５μＬのＲＴ反応毎に、７μＬのＲＴマスターミックスを５μＬの全ＲＮＡと合わせた。ＲＴプライマーを氷上で解凍し、３μＬのＲＴプライマーを９６ウェルプレートのウェル中の１２μＬのＲＴマスターミックス／全ＲＮＡに添加した。充填するまでプレートを氷上に保ち、次にサーマルサイクラーに入れた。
サーマルサイクラーステップ：
１６℃で３０分間
４２℃で３０分間
８５℃で５分間
４℃で都合がつく限り長時間
ＰＣＲ増幅
各ウェル毎に、１０μＬのＴａｑｍａｎ ２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスを７．６７μＬヌクレアーゼ−非含有水、１μＬの２０×Ｔａｑｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイミックス、および先行ステップからの１．３３μＬのＲＴ生成物に混合した。全てのウェルが充填されたら、オプティカル接着カバーを用いてプレートを密封し、遠心分離してあらゆる気泡を除去した。
【００８０】
次にプレートをリアルタイム対応サーマルサイクラー／ＰＣＲ機に装入し、以下のプログラムに従った。
９５℃で１０分間（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ酵素の活性化）
４０×（９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間）
データ分析
これらの技術の双方からのデータは、各プレートの急上昇ｍｉＲＮＡスポットに対して正規化し、別個の配列からのデータを比較できるようにした。
【００８１】
当業者に良く理解されている標準技術である主成分分析を使用して正規化データを分析し、ｍｉＲＮＡ発現プロフィール間の相関と、元の細胞に適用された特定試験薬の個々のｍｉＲＮＡ発現に対する作用の帰結であると判定された、観察されたあらゆるデータの組分けとを同定した。
【００８２】
図１は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現プロフィールを得る方法の流れ図である。
図２は、主成分分析後の発現プロフィールの一例を示す。パート（ａ）は、ｍｉＲＮＡ発現の総多次元発現データセットの３つの主成分の三次元投影を示し、１つの処置タイプについてのｍｉＲＮＡ発現データのクラスター形成を図示する。パート（ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ発現実験のデータ拡散を示す。
【００８３】
図３は、ｈａｓ−ｍｉＲ−１からｈａｓ−ｍｉＲ−１１と標識された１１の識別ｍｉＲＮＡの統計学的格付けを示す。ｐ値は結果が統計的に有意であるか、または偶然の結果（一般に０．０５以下のｐ値として示される）であるかどうかの標準統計学的試験値であり、ｑ値は複数試験について補正されたｐ値であり、偽発見率の測定を提供する。示されるｐ値は全て、０．０５よりもはるかに小さい。
【００８４】
図４（ａ）は、複数ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現の多次元データセットの３つの主成分の投射と、潜在的治療的用途の指示ｍｉＲＮＡのクラスター形成とを示す。（ｂ）は複数ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現の多次元データセットの３つの主成分の投射を示し、個々のｍｉＲＮＡは網掛け表示されて、それらの発現に適用される生物学的介入が使用される、治療的用途が示唆される。
【００８５】
以上のように結果は明白に組分けされ、この組分けは、その中でｍｉＲＮＡが発現された細胞に適用された生物学的介入の治療用途に準じている。換言すれば、組分けされた生物学的介入は、それらが適用された細胞に対して同様の作用機序を有し、そしてその共通の機序がｍｉＲＮＡ発現レベルに同様の効果をもたらしたかもしれないと判定することが可能である。
【００８６】
同様の作用機序がある生物学的介入はまた、同様の治療的特性も有してもよく、したがってそれらは同様の治療的用途を有してもよい。図３および４に提示されるデータは、試験された生物学的介入では、同様の治療的用途の生物学的介入（例えば抗代謝産物）のｍｉＲＮＡ発現の多次元データセットの３つの主成分の投影が実際にグループにまとまり、異なる治療用途がある生物学的介入の組分け（例えば後成的変更因子）は別のグループにまとまることを実証する。
【００８７】
ｍｉＲＮＡ発現パターンのデータベースは、多数の生物学的介入を実施して、ｍｉＲＮＡ発現プロフィール中で得られた変化を分析することで構築し得る。このようなデータベースは、未試験の生物学的介入とデータベース中の生物学的介入との間でｍｉＲＮＡ発現プロフィールを比較し、前記発現プロフィールが治療的用途の組分けの１つに入るかどうかを判定することで、前記未試験の生物学的介入の治療用途、または潜在的な将来の治療用途を同定できるようにする。このような相関が生じた場合、未試験の生物学的介入を特定の治療的用途について考慮してもよい。
【００８８】
さらにｍｉＲＮＡ発現データのデータベースを構築することは、特定の治療的用途の特徴を示す特定のｍｉＲＮＡサブセットを明らかにするかもしれない。ひとたび指示ｍｉＲＮＡの前記サブセットが同定されたならば、その細胞によって生成されるｍｉＲＮＡの全範囲でなく、指示ｍｉＲＮＡ発現プロフィールのサブセットの発現プロフィールを見ることで、潜在的な治療的用途を見つけるための新しい生物学的介入の将来の試験、または新しい治療的用途のための既知の生物学的介入の試験を実施し得る。
【００８９】
ｍｉＲＮＡ発現データのデータベースはまた、その発現レベルが同様の作用様式を有することが知られているか、または仮定される、生物学的介入、または生物学的介入群を識別するのに最も有用な特定のｍｉＲＮＡのサブセットを判定するのに用いてもよい。ｍｉＲＮＡは、同様の作用様式を有することが知られているか、または仮定される、生物学的介入、または生物学的介入群を識別するそれらの発現レベルの妥当性の順に格付けされてもよい。ｍｉＲＮＡには、同様の作用様式を有することが知られているか、または仮定される、生物学的介入、または生物学的介入群を識別するそれらの発現レベルの妥当性を示す数値を割り当ててもよい。例えば数値は、主成分の分散に対するｍｉＲＮＡの発現レベルの貢献に関連してもよい。
【００９０】
主成分分析などの統計学的方法を使用したｍｉＲＮＡ発現プロフィール比較の代替えとして、またはそれに加えて、限定的な（例えば１０〜５０の）各ｍｉＲＮＡ群の発現に対する生物学的介入の効果を同定し使用して、それぞれのｍｉＲＮＡ発現に対する生物学的介入効果に対して一群のコードから選択されるコードを割り当ててもよい。得られたコードを比較して、実質的な類似性を同定してもよい。
【００９１】
例えば次に基づいて、各生物学的介入について（例えばスクリーニングされた各化合物について）、格付けされた各ｍｉＲＮＡに対するコードとして３桁の２進数を割り当ててもよい。
１．生物学的介入に応えてｍｉＲＮＡの発現に変化がなければ（実験変動の正常限界内）、第１の桁は０に設定される。発現が顕著に変化すれば、第１の桁は１に設定される。
２．発現レベルの変化が同定されて変化が増大するならば、第２の桁は１に設定される。生物学的介入に起因する変化が減少すれば、第２の桁は０に設定される。
３．発現レベルが４倍を超えれば第３の桁は１に設定され、さもなければそれは０に設定される。
【００９２】
したがってｍｉＲＮＡの発現に対する生物学的介入レベルの効果に、５つの可能な値の１つを有するコードが割り当てられる。
１．発現の変化なし−０００
２．発現の大きな増大−１１１
３．発現の小さな増大−１１０
４．発現の大きな減少−１０１
５．発現の小さな減少−１００
一群のｍｉＲＮＡの発現レベルに対する生物学的介入（例えば特定化合物の投与）の効果は関連コードによって特徴付けられてもよく、主成分分析からはすぐに分からない発現レベルの変化が同定できるようになり、生物学的介入の類似性を採点する代案の方法を可能にして、得られた発現データが外観検査によって理解できるようになる。
【００９３】
生物学的介入効果を特徴付けて、異なる生物学的介入のｍｉＲＮＡ発現に対する効果間の相関を判定する別のやり方は、発現アッセイを実施して各ｍｉＲＮＡ群（典型的に１０〜５０）の発現に対する生物学的介入効果を判定し、例えば発現が最も増大した群中のｍｉＲＮＡから発現が最も減少した群中のｍｉＲＮＡの順で、またはその逆で、その群中のｍｉＲＮＡを効果順に格付けすることである。得られた格付けは、特定の生物学的介入効果の特徴を示す。したがってｍｉＲＮＡ群に対するその他の生物学的介入の効果を測定して、郡中のｍｉＲＮＡを効果の順に格付けしてもよい。得られた格付けを比較して、同定される生物学的介入効果間の相関を可能にしてもよい。
【００９４】
指示ｍｉＲＮＡサブセットを試験するのに使用できるプレートを含むキットを提供して、潜在的な新しい治療的用途について生物学的介入をスクリーニングし得る効率および速度を顕著に増大させてもよい。
【００９５】
本明細書に開示される本発明の範囲内で、さらなる変更および修正を加えてもよい。
参考文献
１．Ｘｉｅ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ３’−ＵＴＲｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｍａｍｍａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．４３４（７０３１）：ｐ．３３８−４５
２．Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｓｏｍｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．４３３（７０７２）：ｐ．７６９−７３
３．Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ａｃｉ ＵＳＡ，２００４．１０１（３２）：ｐ． １１７５５−６０
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）生体系への介入を実施する工程と、前記介入に起因する生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定する工程と、前記測定された発現プロフィールから誘導される発現データセットを保存する工程をそれぞれ含み、複数の異なる介入と複数の異なる生体系との片方または双方に関する複数の発現アッセイを実施するステップと、
（２）前記得られた発現データセットを分析して、異なる介入または異なる生体系の片方または双方に関する２つ以上の発現アッセイ群におけるそれぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
１つ以上の前記介入が生体系に対する試験薬の適用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
介入が生体系に対する複数の試験薬の前記適用を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の前記生体系が培養細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくともいくつかの前記相関が正相関である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発現アッセイから得られる前記発現データセットの間の類似性に基づいて、発現アッセイを分類する前記ステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２つ以上の異なる介入が、同様の機序によって前記非コードＲＮＡ発現プロフィールに対して直接または間接的効果を有することを判定する前記ステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１の介入が少なくとも１つの既知の第１の治療的用途を有する第１の治療物質の生体系に対する前記適用であって、前記方法が、第２の治療物質の前記適用を含む第２の介入の非コードＲＮＡ発現に対する前記効果間に正相関があることを判定する前記ステップを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の治療物質が前記第１の治療的用途に応用可能かどうかを試験するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくともいくつかの前記相関が負相関である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の介入が前記生体系に悪影響を及ぼす介入であって、前記第１の介入の効果と負相関を有する、前記非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果を有すると判定された第２の介入が、前記第１の介入によって引き起こされることが知られている病状の前記治療候補または予防候補として同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的介入の効果間の識別に対する、非コードＲＮＡ群の前記発現レベルの妥当性を判定するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
複数の各生物学的介入について、前記各非コードＲＮＡの前記発現に対する前記各生物学的介入の前記効果によって、非コードＲＮＡ群中で前記非コードＲＮＡを格付けするステップと、前記得られた格付けを比較して、前記非コードＲＮＡ発現に対する生物学的介入の前記効果間の相関を同定するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を含む、既知の治療的介入の副作用の前記治療または予防のための治療物質候補を判定する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を含む、試験薬の毒物学の１つ以上の側面を予測する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を含む、第１の試験薬が、第２の試験薬または特定の標的高分子の作動薬候補または拮抗薬候補であることを判定する方法。
【請求項１７】
同一の介入または介入群が複数の異なる生体系に対して実施される、複数の発現アッセイが実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記異なる生体系が、異なる分化段階または脱分化段階にある哺乳類の幹細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現プロフィールが複数の前記非コードＲＮＡ発現に関連する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記非コードＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現プロフィールが非コードＲＮＡ群中の各非コードＲＮＡについて測定され、方法が、複数の介入がそれに対して相関効果を有する発現プロフィールを有する前記非コードＲＮＡ群の個々の非コードＲＮＡ、または下位集団を同定するステップを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の介入によって影響される発現レベルを有する、非コードＲＮＡ群、前記群中の前記個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団の前記発現プロフィールに対して相関効果を有する、双方の介入が同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
相関効果を有する前記複数の介入が、関連作用機序を有することが以前に知られている介入であり、前記方法が、前記複数の介入によって影響される発現レベルを有する個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団を同定する方法である、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記得られた同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定されたＲＮＡ下位集団が、低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールを測定するさらなる発現アッセイで使用するために選択され、前記低減された非コードＲＮＡ群が、少なくとも前記同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定された非コードＲＮＡ下位集団を含む、前記非コードＲＮＡ群のいくつかのみを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
新しい治療的に有用な物質を発見するため、または既知の治療物質の新しい適応症を同定するために、選択された低減された非コードＲＮＡ群を用いて物質候補をスクリーニングする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法によって得られた前記低減された非コードＲＮＡ群からなる非コードＲＮＡを有するアッセイ装置。
【請求項１】
（１）生体系への介入を実施する工程と、前記介入に起因する生体系中の非コードＲＮＡ発現プロフィールを測定する工程と、前記測定された発現プロフィールから誘導される発現データセットを保存する工程をそれぞれ含み、複数の異なる介入と複数の異なる生体系との片方または双方に関する複数の発現アッセイを実施するステップと、
（２）前記得られた発現データセットを分析して、異なる介入または異なる生体系の片方または双方に関する２つ以上の発現アッセイ群におけるそれぞれの介入の非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果間の相関を判定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
１つ以上の前記介入が生体系に対する試験薬の適用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
介入が生体系に対する複数の試験薬の前記適用を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の前記生体系が培養細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくともいくつかの前記相関が正相関である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発現アッセイから得られる前記発現データセットの間の類似性に基づいて、発現アッセイを分類する前記ステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２つ以上の異なる介入が、同様の機序によって前記非コードＲＮＡ発現プロフィールに対して直接または間接的効果を有することを判定する前記ステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１の介入が少なくとも１つの既知の第１の治療的用途を有する第１の治療物質の生体系に対する前記適用であって、前記方法が、第２の治療物質の前記適用を含む第２の介入の非コードＲＮＡ発現に対する前記効果間に正相関があることを判定する前記ステップを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の治療物質が前記第１の治療的用途に応用可能かどうかを試験するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくともいくつかの前記相関が負相関である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の介入が前記生体系に悪影響を及ぼす介入であって、前記第１の介入の効果と負相関を有する、前記非コードＲＮＡ発現プロフィールに対する効果を有すると判定された第２の介入が、前記第１の介入によって引き起こされることが知られている病状の前記治療候補または予防候補として同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的介入の効果間の識別に対する、非コードＲＮＡ群の前記発現レベルの妥当性を判定するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
複数の各生物学的介入について、前記各非コードＲＮＡの前記発現に対する前記各生物学的介入の前記効果によって、非コードＲＮＡ群中で前記非コードＲＮＡを格付けするステップと、前記得られた格付けを比較して、前記非コードＲＮＡ発現に対する生物学的介入の前記効果間の相関を同定するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を含む、既知の治療的介入の副作用の前記治療または予防のための治療物質候補を判定する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を含む、試験薬の毒物学の１つ以上の側面を予測する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を含む、第１の試験薬が、第２の試験薬または特定の標的高分子の作動薬候補または拮抗薬候補であることを判定する方法。
【請求項１７】
同一の介入または介入群が複数の異なる生体系に対して実施される、複数の発現アッセイが実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記異なる生体系が、異なる分化段階または脱分化段階にある哺乳類の幹細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現プロフィールが複数の前記非コードＲＮＡ発現に関連する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記非コードＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現プロフィールが非コードＲＮＡ群中の各非コードＲＮＡについて測定され、方法が、複数の介入がそれに対して相関効果を有する発現プロフィールを有する前記非コードＲＮＡ群の個々の非コードＲＮＡ、または下位集団を同定するステップを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の介入によって影響される発現レベルを有する、非コードＲＮＡ群、前記群中の前記個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団の前記発現プロフィールに対して相関効果を有する、双方の介入が同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
相関効果を有する前記複数の介入が、関連作用機序を有することが以前に知られている介入であり、前記方法が、前記複数の介入によって影響される発現レベルを有する個々の非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ下位集団を同定する方法である、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記得られた同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定されたＲＮＡ下位集団が、低減された非コードＲＮＡ群の発現プロフィールを測定するさらなる発現アッセイで使用するために選択され、前記低減された非コードＲＮＡ群が、少なくとも前記同定された個々の非コードＲＮＡまたは同定された非コードＲＮＡ下位集団を含む、前記非コードＲＮＡ群のいくつかのみを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
新しい治療的に有用な物質を発見するため、または既知の治療物質の新しい適応症を同定するために、選択された低減された非コードＲＮＡ群を用いて物質候補をスクリーニングする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法によって得られた前記低減された非コードＲＮＡ群からなる非コードＲＮＡを有するアッセイ装置。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５１４９９４（Ｐ２０１２−５１４９９４Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４５７９４（Ｐ２０１１−５４５７９４）
【出願日】平成２２年１月１９日（２０１０．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００００７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８２０３９
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１１１７４７１９）システミック・スコットランド・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＳＴＥＭＩＣ ＳＣＯＴＬＡＮＤ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１９日（２０１０．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００００７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８２０３９
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１１１７４７１９）システミック・スコットランド・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＳＴＥＭＩＣ ＳＣＯＴＬＡＮＤ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]