非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリンの発現強化
本発明は、ヒト（化）免疫グロブリンローカスならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβ配列をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物について記載する。特に関心対象であるのは、Ｉｇならびに／または内因性Ｉｇαおよび／もしくはＩｇβ配列の内因生産性が抑制されている、多様化されたヒト（化）抗体レパートリーを産生することのできるトランスジェニック重鎖および軽鎖免疫グロブリンローカスを有する動物である。ヒト（化）免疫グロブリンならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβの同時発現は、正常なＢ細胞発生、親和性成熟およびヒト（化）抗体の効率的な発現を招く。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、正常Ｂ細胞の発生を促進することにより、およびヒト（化）免疫グロブリンローカスを持つ非ヒト動物におけるヒト（化）抗体の発現を維持することにより非ヒトトランスジェニック動物におけるヒト（化）免疫グロブリンの発現を改善する方法に関する。特に、本発明は、Ｂ細胞レセプターの構成要素であるヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする導入遺伝子ならびに一つまたは複数のヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子の同時発現に関する。この方法は、例えばトランスジェニック非ヒト動物の血液、乳汁または卵にヒト（化）抗体を優位に発現させる。
【０００２】
関連技術の説明
抗体は、ガン、アレルギー疾患、移植拒絶の予防および宿主対移植片病などの様々なヒト疾患および状態の処置にうまく使用されてきた重要な種類の医薬品である。
【０００３】
非ヒト動物から得られた抗体調製物の主な問題は、ヒト患者における非ヒト免疫グロブリンの内因性免疫原性である。非ヒト抗体の免疫原性を減らすために、動物可変（Ｖ）領域エキソンをヒト定常（Ｃ）領域エキソンと融合させることにより、キメラ抗体遺伝子が得られることが示された。このようなキメラまたはヒト化抗体は、ヒトに最小限の免疫原性を有し、ヒト対象の治療上の処置に使用するために適する。
【０００４】
ヒト化モノクローナル抗体が開発され、臨床応用されている、しかし、キメラ、ヒト化またはヒトのいずれにせよ、一般にガンまたは毒性病原体感染などの壊滅的な疾患を処置するためのモノクローナル抗体の使用は、これらの疾患の複雑性、多因性の原因および適応性により限定される。単独に確定されたターゲットに対するモノクローナル抗体は、これらのターゲットが変化、進化および突然変異すると通常は作用しなくなる。例えば、悪性腫瘍は、標準的なモノクローナル抗体療法に対する耐性を獲得するおそれがある。この問題の解決は、複数の進化中のターゲットをターゲティングする能力を有するポリクローナル抗体を使用することである。ポリクローナル抗体は、細菌毒素またはウイルス毒素を中和することができ、病原体を殺滅および除去する免疫反応を命じる。
【０００５】
したがって、高力価高親和性ヒト化ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の大規模生産に適した方法の大きな臨床的必要性がある。さらに、ウサギ、ニワトリ、ヒツジおよびウシなどの比較的大型のトランスジェニック動物での抗体の生産は、抗体の収率の観点から好都合であり、導入遺伝子がコードする産物を多量に発現する比較的大型の創始動物の創出もまた大いに望ましい。
【０００６】
ヒト化モノクローナル抗体は、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあることはいくつかのＦＲ残基が、非ヒト動物の、例えばげっ歯類の抗体における類似部位由来の残基により置換されている、典型的にはヒト抗体である。ヒト化は、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988)）に従って、ヒトモノクローナル抗体の対応する配列から非ヒト動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列（例えばげっ歯動物のもの）に置換することにより本質的に行うことができる。
【０００７】
動物においてヒト化抗体を製造する間に遭遇する一問題は、トランスジェニック抗体を超える宿主抗体の内因性産生であり、これは抑制する必要がある。キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおけるその抗体の重鎖Ｊ領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くと記載されている。このような生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原誘発時にヒト抗体の産生を招くものである。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)；２００６年６月２０日に発行された米国特許第７，０６４，２４４号を参照されたい。これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００８】
マウスゲノムへのヒト免疫グロブリン遺伝子の導入は、これらの遺伝子操作されたマウスにおける多様化されたヒト抗体レパートリーの発現を招く。ヒト−マウスキメラ抗体を発現するマウスの作製は、Pluschke et al., Journal of Immunological Methods 215: 27-37 (1998)に記載されている。ヒト免疫グロブリンポリペプチドを発現するマウスの作製は、Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989)；Lonberg et al., Int. Rev. Immunol. 13(l):65-93 (1995)；およびBruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8(4): 455-8 (1997)；米国特許第５，５４５，８０６号（１９９６年８月発行）；米国特許第５，５４５，８０７号（１９９６年８月発行）ならびに米国特許第５，５６９，８２５号（１９９６年１０月発行）に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ヒト抗体を発現するウシの作製は、Kuroiwa et al., Nature Biotech 20(9): 889-894 (2002)に記載されている。ヒト（化）免疫グロブリントランスローカスを発現する非ヒトトランスジェニック動物の産生およびこのようなトランスジェニック動物からの抗体の産生は、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ０２／１２４３７、ならびに米国特許第５，８１４，３１８号および第５，５７０，４２９号にもまた詳細に記載されており、これらの開示は、本明細書によりその全体が参照により明白に組み入れられる。得られたヒト化抗体は、ヒトに最小限の免疫原性を有し、ヒト対象の治療上の処置に使用するために適する。
【０００９】
上に引用した遺伝子操作アプローチは、遺伝子操作マウスにヒト免疫グロブリンポリペプチドの発現を招くが、ヒト免疫グロブリンの発現レベルは通常よりも低い。これは、免疫グロブリンの効率的な発現に必要な、免疫グロブリンローカス中の種特異的レギュレーションエレメント（regulatory element）が原因のおそれがある。トランスフェクションされた細胞系で実証されたように、ヒト免疫グロブリン遺伝子に存在するレギュレーションエレメントは、非ヒト動物では適正に機能できないおそれがある。免疫グロブリン遺伝子中のいくつかのレギュレーションエレメントが記載されている。特に重要なのは、重鎖定常領域下流（３’）のエンハンサーおよび軽鎖遺伝子中のイントロンエンハンサーである。加えて、まだ確認されていない他のコントロールエレメントが免疫グロブリン遺伝子に存在するおそれがある。マウスにおける研究は、膜型免疫グロブリン分子の膜部および細胞質尾部がヒトＣγ１遺伝子ホモ接合性マウスの血清中のヒト−マウスキメラ抗体の発現レベルに重要な役割を果たすことを示した。したがって、動物に異種免疫グロブリン遺伝子を発現させるために、エンハンサーエレメントと、膜貫通部および細胞質尾部をコードするエキソン（それぞれＭ１エキソンおよびＭ２エキソン）とを含有する配列を、その動物において類似の位置に通常みられる配列に交換することが望ましい。
【００１０】
これらの遺伝子操作された動物でのヒト免疫グロブリンの発現は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンローカスを保持する非ヒトＢ細胞のＢ細胞発生によってもまた影響されうる。Ｂ細胞発生に及ぼすＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の影響は、マウスで広く研究されてきた。しかし、トランスジェニック動物においてヒトまたは部分的ヒト抗体がどのように組み合わせられて機能的ＢＣＲを形成するか、およびこのようなＢＣＲがヒト（化）Ｉｇを発現している非ヒトＢ細胞の発生および生存に効率的に影響するかどうか（これは、次には抗体の収率にもまた影響する）は不明であった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヒトＩｇαポリペプチド配列（配列番号１）と他の非ヒトＩｇα配列（配列番号２〜６）とのアミノ酸アライメントを示す図である。
【図２】図２は、ヒトＩｇβポリペプチド配列（配列番号７）と他の非ヒトＩｇβ配列（配列番号８〜１２）とのアミノ酸アライメントを示す図である。
【００１２】
発明の概要
一局面では、本発明は、ＢＣＲのキメラＩｇαサブユニットをコードする導入遺伝子構築物を提供し、ここで、キメラＩｇαサブユニットは、非ヒトＩｇαポリペプチド配列の細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列、ならびにさらに配列番号１のヒトＩｇαの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１３】
第２の局面では、本発明は、ＢＣＲのキメラＩｇβサブユニットをコードする導入遺伝子構築物を提供し、ここで、キメラＩｇβサブユニットは、非ヒトＩｇβポリペプチド配列の細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列、ならびにさらに配列番号７のヒトＩｇβの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明のある態様では、非ヒトＩｇαポリペプチド配列の種類には、ウシ（配列番号２）、マウス（配列番号３）、イヌ（配列番号４）、霊長類（配列番号５）、ウサギ（配列番号６）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。本発明の別の態様では、非ヒトＩｇβポリペプチド配列の種類には、イヌ（配列番号８）、ラット（配列番号９）、ウシ（配列番号１０）、マウス（配列番号１１）、ニワトリ（配列番号１２）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００１５】
第３の局面では、非ヒトトランスジェニック動物は、（ａ）配列番号１の完全長ヒトＩｇαサブユニットもしくは上に定義したキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／または（ｂ）配列番号７の完全長ヒトＩｇβサブユニットもしくは上に定義したキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、ならびに（ｃ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を含み、ここで、結果として生じる導入遺伝子産物は、組み合わされてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成する。
【００１６】
この局面の一態様では、非ヒトトランスジェニック動物の任意の内因性Ｉｇ産生の発現ならびに／または内因性Ｉｇαおよび／もしくは内因性Ｉｇβサブユニットの発現は実質的に減少する。
【００１７】
別の態様では、非ヒトトランスジェニック動物は、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、ウマ、ロバおよびウシからなる群より選択される。好ましい態様では、非ヒトトランスジェニック動物はウサギである。
【００１８】
第４の局面では、本発明は、上に定義された非ヒトトランスジェニック動物から単離されたヒト（化）免疫グロブリンもまた提供し、これは、抗体または抗体フラグメントのいずれかである。この局面のある態様では、単離されたヒト（化）免疫グロブリンは、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または抗体フラグメントのいずれかである。抗体フラグメントは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれか由来でありうる。さらに、抗体または抗体フラグメントはラベルすることができるし、毒素と融合させて免疫毒素を形成させることができるし、治療剤と結合させることができるし、当技術分野において明確であり、使用されている任意の異種アミノ酸配列に融合させることができる。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2フラグメントである。
【００１９】
第５の局面では、本発明は、上に定義された非ヒトトランスジェニック動物から単離されたＢ細胞を提供し、ここでこのＢ細胞は、ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかおよび／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかを発現し、さらに、ヒト（化）免疫グロブリンローカスもまた発現する。ある態様では、このＢ細胞は不死化されており、好ましい態様では、ウサギ由来である。
【００２０】
第６の局面では、本発明は、上記のような抗体または抗体フラグメントを含む抗体調製物を提供する。
【００２１】
第７の局面では、本発明は、薬学的に許容される成分との混合物中に、上記のような抗体または抗体フラグメントを含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、モノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、または一つもしくは複数のポリクローナル抗体もしくはそのフラグメントのいずれかを含むことがある。
【００２２】
第８の局面では、本発明は、非ヒト動物においてヒト（化）抗体を産生させるための方法を提供し、その方法は、（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物に導入および発現させること、（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物に導入および発現させること、（ｃ）その動物を抗原刺激に供すること、ならびに（ｄ）その動物からヒト（化）抗体を単離することを含む。この局面のある態様では、抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のフラグメントのいずれかである。さらに、抗体または抗体フラグメントは、ラベルすること、または毒素と融合させて免疫毒素を形成させること、または治療剤と結合させること、または任意の異種アミノ酸配列に融合させることのいずれかができる。
【００２３】
第９の局面では、本発明は、ヒト（化）抗体を発現している非ヒト動物を産生させるための方法を提供し、この方法は、（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物のＢ細胞に導入および発現させること；ならびに（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物に導入および発現させることを含み、ここで、結果として生じる導入遺伝子産物を組み合わせてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成させる。一態様では、ヒト（化）抗体を発現している非ヒト動物は、遺伝子変換および／または体細胞超突然変異により抗体多様性を創出する動物である。好ましい態様では、この動物はウサギである。
【００２４】
発明の詳細な説明
定義
別に定義しない限り、本明細書に使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者に通例了解されるものと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, NY 1992)は、本出願に使用される用語の多くについて全般的な指針を当業者に与える。
【００２５】
当業者は、本明細書に記載されるものと類似または等価の多数の方法および材料を認識しているものであり、それらを本発明の実施に使用することができよう。実際に、本発明は、記載された方法および材料に決して限定されない。本発明のために、以下の用語を下に定義する。
【００２６】
本明細書に定義する「導入遺伝子構築物または発現構築物」は、関心対象の少なくとも一つの導入遺伝子についてのコード配列を、非ヒトトランスジェニック動物のターゲット細胞内の関心対象の導入遺伝子の、時間的、細胞特異的、および／または強化された発現に必要な適切なレギュレーション配列と一緒に有するＤＮＡ分子を表す。
【００２７】
「Ｂ細胞」は、免疫グロブリン遺伝子セグメントの再構成を受けることができ、その生活環のある段階で免疫グロブリン遺伝子を発現することができるＢ系列細胞と定義される。これらの細胞には、早期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、形質細胞などが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００２８】
本明細書に定義される「Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）複合体」は、Ｂ細胞上に発現される多サブユニット免疫認識レセプターを表し、これには、以下のサブユニット、すなわち抗原（Ａｇ）レセプター、膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）、ＩｇαサブユニットおよびＩｇβサブユニットが挙げられる。Ｂ細胞レセプター、その構成要素、および五つの免疫グロブリンクラスとのその関連が、Wienands et al., EMBO J. 9(2): 449-455 (1990)、Venkitaraman et al., Nature 352: 777-781 (1991)、Herren et al., Immunologic Res. 26(1-3): 35-43 (2002)に記載されている。加えて、クローニングおよびシーケンシングされたがその機能は未知のままであり、ＢＣＲの構成要素としてのその役割が疑われているいくつかのＢＣＲ関連タンパク質（ＢＡＰ）がある。ＢＣＲ関連タンパク質は、Adachi et al., EMBO J 15(7): 1534-1541 (1996)およびSchamel et al., PNAS 100(17): 9861-9866 (2003)に記載されている。
【００２９】
「ネイティブなＩｇαまたはＩｇβサブユニット」は、天然ＩｇαまたはＩｇβポリペプチド配列を表し、これには、所与の種類の動物または近縁種に見出される、ＩｇαまたはＩｇβサブユニットの天然アレルが含まれる。これらは、「完全長ＩｇαまたはＩｇβ配列」とも呼ばれる。ヒトＩｇαポリペプチド配列は、Flaswinkelら（Immunogenetics 36 (4): 266-69 (1992)；アクセッション番号Ｍ７４７２１）（図１、配列番号１）によりクローニングされた。ヒトＩｇβポリペプチド配列は、Muellerら（Eur. J. Biochem. 22, 1621-25 (1992)；アクセッション番号Ｍ８０４６１）（図２、配列番号７）によりクローニングされた。
【００３０】
「ヒト（化）」という用語は、完全なヒト配列または一つもしくは複数のヒト配列を有する配列を表す。したがって、本明細書に使用する用語には、ヒト配列およびヒト化配列が含まれる。
【００３１】
「キメラＩｇα」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えば、ラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇαポリペプチド配列を表し、この配列で、Ｉｇαポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇαポリペプチド由来の一つまたは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇαバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇα配列由来の、または所与のＩｇα配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇα配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。「キメラＩｇα」および「ヒト（化）Ｉｇα」という用語は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。いくつかの非ヒト動物由来のＩｇαポリペプチド配列（配列番号２〜６）もまた図１に定義する。
【００３２】
「キメラＩｇβ」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えば、ラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇβポリペプチド配列を表し、この配列で、Ｉｇβポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇβポリペプチド由来の一つまたは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇβバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇβ配列由来の、または所与のＩｇβ配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇβ配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。「キメラＩｇβ」および「ヒト（化）Ｉｇβ」という用語は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。いくつかの非ヒト動物からのＩｇβポリペプチド配列（配列番号８〜１２）は図２に定義される。
【００３３】
「細胞内ポリペプチドもしくはドメイン」または「細胞質尾部」は、細胞の範囲内に存在する所与の膜結合型タンパク質またはサブユニットのポリペプチド配列のその部分を表す。通常は、タンパク質の細胞内ドメインはシグナル伝達を担う。
【００３４】
ＩｇαまたはＩｇβサブユニットの「細胞内ドメイン配列」により、細胞の範囲内に通常存在するＩｇαもしくはＩｇβポリペプチド、またはそのフラグメントのポリペプチド配列を意味する。
【００３５】
ＩｇαまたはＩｇβサブユニットの「膜貫通ドメイン配列」は、原形質膜、オルガネラ膜、または脂質二重層などの生体膜を貫通するＩｇαもしくはＩｇβポリペプチド、またはそのフラグメントのポリペプチド配列を意味する。本明細書に定義する「膜貫通ドメイン配列」には、天然膜貫通ポリペプチドが含まれるし、膜貫通ドメイン配列は、非天然コンセンサス配列またはそのフラグメントのこともある。
【００３６】
「細胞外ポリペプチドまたはドメイン」は、通常は細胞の範囲外に存在する所与の膜結合型タンパク質またはサブユニットのポリペプチド配列のその部分を表す。「ＩｇαまたはＩｇβの細胞外ドメイン」により、細胞の範囲外に存在するＩｇαもしくはＩｇβポリペプチド、またはそのフラグメントのポリペプチド配列を意味する。
【００３７】
本明細書に使用する「ヒト（化）免疫グロブリンローカス」という用語には、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子ローカスまたはそのセグメントの天然配列と、ヒトＩｇ遺伝子ローカスまたはそのセグメントの天然配列の縮重型と、ヒトＩｇ遺伝子ローカスまたはそのセグメントの天然配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド配列をコードする合成配列との三者が含まれる。特定の態様では、ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、免疫グロブリン分子をヒトに非免疫原性にする。本明細書で、「ヒト（化）またはヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖および／または軽鎖ローカス」または「ヒトまたはヒト（化）免疫グロブリン（Ｉｇ）ローカス」という用語は相互交換可能に使用される。
【００３８】
本明細書に使用する「ヒト（化）Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）複合体」という用語は、ＩｇαサブユニットがネイティブなヒトＩｇαサブユニットまたは上記のヒトもしくはヒト化Ｉｇα配列を有するキメラＩｇαサブユニットのいずれかであり、かつ／あるいはさらにＩｇβサブユニットがネイティブなヒトＩｇβサブユニットまたは上記のヒトもしくはヒト化Ｉｇβ配列を有するキメラＩｇβサブユニットのいずれかであり、かつさらに、膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）が上記のヒト（化）免疫グロブリンのものである多サブユニットＢＣＲ複合体を表す。用語「ヒト抗体」および「ヒト免疫グロブリン」は、本明細書において抗体および完全ヒト配列を含む免疫グロブリン分子を表すために使用される。
【００３９】
本明細書に使用する用語「ヒト化抗体」および「ヒト化免疫グロブリン」は、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列（またはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列）の少なくとも一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のヒト化免疫グロブリン分子は、ヒト化免疫グロブリン分子を産生するように操作されたトランスジェニック非ヒト動物から単離することができる。このようなヒト化免疫グロブリン分子は、動物から調製された、または動物由来の細胞から調製された非ヒト化免疫グロブリン分子よりも霊長類に、特にヒトに免疫原性が低い。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体には、遺伝子変換動物における遺伝子変換および体細胞超突然変異によりさらに多様化された免疫グロブリン（Ｉｇ）および抗体が挙げられる。このようなヒト化Ｉｇまたは抗体は、ヒトにより自然に製造されないことから、それらは「ヒト」ではないが（ヒトは遺伝子変換により自己の抗体レパートリーを多様化しないため）、それでもなお、ヒト化Ｉｇまたは抗体は、その構造にヒトＩｇ配列を有することから、それらはヒトに免疫原性ではない。
【００４０】
「実質的に減少した」内因性Ｉｇ産生ならびに／またはＩｇαおよび／もしくはＩｇβサブユニットの発現という用語は、トランスジェニック動物における内因性Ｉｇ単独の産生、または追加的に内因性Ｉｇαおよび／もしくはＩｇβの発現のいずれかの程度が、好ましくは少なくとも約３０％〜４９％、またはより好ましくは少なくとも約５０％〜７９％、またはなおいっそう好ましくは少なくとも約８０〜８９％、または最も好ましくは約９０〜１００％だけ減少していることを意味する。
【００４１】
「モノクローナル抗体」という用語は、単クローンのＢ細胞により合成される抗体分子を表すために使用される。
【００４２】
「ポリクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞集団により合成される抗体分子集団を表すために使用される。
【００４３】
遺伝子再編成および遺伝子変換を受ける能力を有する「免疫グロブリン（Ｉｇ）ローカス」は、本明細書において「機能的」Ｉｇローカスとも呼ばれ、機能的Ｉｇローカスにより作製される多様性を有する抗体は、本明細書において「機能的」抗体または抗体の「機能的」レパートリーとも呼ばれる。
【００４４】
本明細書に使用する用語「非ヒト（トランスジェニック）動物」には、哺乳類、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類（例えばマウスおよびラット）、非げっ歯類哺乳類、例えばウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバ、ならびに鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。本明細書に使用される「非霊長動物」という用語には、上に具体的に挙げた哺乳類を非限定的に含む、霊長類以外の哺乳類が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００４５】
詳細な説明
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリン（免疫グロブリン鎖を含む）の産生が、その動物のＢ細胞におけるヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβを同時発現することにより顕著に増加することができるという認識に少なくとも部分的に基づく。トランスジェニック動物のＢ細胞にヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβが含まれることは、Ｂ細胞レセプタータンパク質間の相互作用を再構成および改善することにより、そのような導入遺伝子を保持するＢ細胞の抗原認識、Ｂ細胞発生および生存を高めると考えられる。ヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子をすでに保持するトランスジェニック動物におけるヒト化免疫グロブリンの同時発現は、ヒト化免疫グロブリン産生を大いに改善するであろう。好ましくは内因性Ｉｇと内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβの両方のノックアウトバックグラウンドに対してヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子と、ヒト化免疫グロブリン導入遺伝子との両方を発現させることが追加的に望ましいであろう。
【００４６】
Ｂ細胞レセプターおよびその関連タンパク質
Ｂ細胞レセプターは、膜結合型免疫グロブリンと、ＩｇαおよびＩｇβと呼ばれる二つのジスルフィド結合糖タンパク質からなるシグナル伝達性ヘテロ二量体とからなる。加えて、ＢＣＲ関連タンパク質（ＢＡＰ）が記載されている。
【００４７】
ＢＣＲの発現は、Ｂ細胞の発生、選択および生存に重要である。これらの過程は、Ｉｇα／Ｉｇβヘテロ二量体によるＢＣＲシグナル伝達に依存する。これらの分子の細胞質ドメインは、数個のチロシン残基がいわゆるＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）に集合したものを有する配列モチーフを保持し、このＩＴＡＭは、ＢＣＲがトリガーされるとリン酸化される。
【００４８】
遺伝子ターゲティング実験から、Ｉｇα／Ｉｇβヘテロ二量体の細胞質ドメインがＢ細胞の発生に重大であることが示された。Ｉｇα／Ｉｇβヘテロ二量体により伝達されるシグナルは、発生途中のＢ細胞の正の選択および負の選択との両方に関与する。
【００４９】
膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）分子は、ホモ二量体を形成している２本の重鎖および２本の軽鎖からなり、各軽鎖は重鎖の１本に共有結合している。Ｎ末端で重鎖はＶＨドメインを保持し、アイソタイプに応じて、このＶＨドメインに４個（ＩｇＭ、ＩｇＥ）、３個（ＩｇＧ、ＩｇＡ）または２個（ＩｇＤ）のＣドメインが続く。抗原結合部位は、ＶＨ：ＶＬ対の超可変領域により形成される。したがって、各ｍＩｇ分子は二つの抗原結合部位を有する。
【００５０】
ｍＩｇＭ分子は、分泌型ＩｇＭが１０個の潜在的抗原結合部位を有する五量体を形成する点で分泌型ＩｇＭと異なる。五量体化は、分泌されたμｓ鎖のＣ末端部分の配列により制御される。この部分はアミノ酸２２個からなり、膜結合型μｍ鎖に存在せず、その代わりに、Ｍ１およびＭ２エキソンによりコードされるＣ末端アミノ酸４８個を保持する。
【００５１】
この配列のμｍ特異的部分は、ＩｇＭ分子全体のうち最も進化的に保存されている部分である。この部分は、マウス、ウサギおよびヒトｍＩｇＭの間でほぼ同一であり、この保存は、マウスをサメｍＩｇＭと比べてもなお明白である。ｍＩｇＭのＣ末端配列をマウスの他のｍＩｇアイソタイプのＣ末端配列と比べた場合にもまた、アミノ酸の保存が明らかである。この発見は、保存された膜貫通アミノ酸がＨ鎖ホモ二量体において相互に相互作用するか、またはＩｇαおよびＩｇβサブユニットと相互作用するかのいずれかであるという証拠を提供する。
【００５２】
ＩｇαおよびＩｇβの両方は、アミノ酸２２個の膜貫通セグメントに続き、チロシン残基数個を有するアミノ酸約４０〜７０個のＣ末端細胞質尾部を有する。Ｎ末端では、両タンパク質はリーダーペプチドに続いて細胞外ドメインを保持し、細胞外ドメインは、システイン残基、トリプトファン１個、およびＩｇスーパーファミリーのタンパク質にみられる他の保存されたアミノ酸数個を有する。これは、ＩｇαおよびＩｇβサブユニット両方の細胞外部分がＩｇ様ドメインを形成することを示唆している。ドメイン内ジスルフィド結合を形成するシステイン以外に、ＩｇαおよびＩｇβ配列は追加のシステインを有し、このシステインは、ＩｇαとＩｇβサブユニットの間で鎖間ジスルフィド結合をおそらく形成する。
【００５３】
マウスおよびヒトＩｇα配列の間の比較から、Ｉｇドメインおよび鎖間結合の情報に重要な全ての残基が、二つの種のＩｇαの間で保存されていることが示される。しかし、この比較は、細胞外部分の配列保存がわずか約５６％に達するが、膜貫通部および細胞質尾部はそれぞれ１００％および８７％の保存を示す。後者は、分子のＣ末端部分内の残基の重要性を反映している。
【００５４】
ｍＩｇＭ分子とＩｇα／Ｉｇβヘテロ二量体との集合は、ｍＩｇＭの表面発現に必要である。この必要性は、μｍ鎖の膜貫通部分の突然変異により無効にすることができる。例えば、μｍ鎖の膜貫通部位からＨ−２ＫK分子の膜貫通部分への交換は、Ｉｇα／Ｉｇβに依存せずにｍＩｇＭの表面発現を招く。これらのデータは、μｍの膜貫通領域がμｍ鎖とＩｇα／Ｉｇβヘテロ二量体との間の特異的相互作用に必要なことを実証している。加えて、Ｂ細胞は、ＥＲからの、膜貫通タンパク質複合体の単一構成要素または不完全に集合した構成要素の輸送を阻害する制御メカニズムを有する。
【００５５】
ＢＣＲの膜貫通部分は、ＢＣＲ複合体の形成に必要となる、おそらく最も重要な構造であり、ＩｇαおよびＩｇβの細胞外Ｉｇドメインもまた、ｍＩｇＭ分子の結合に役割を果たすことが示唆されている。例えば、マウスＩｇαを発現しないマウス細胞系Ｊ５５８Ｌμｍでは、Ｉｇα導入遺伝子を用いたトランスフェクションにより、ｍＩｇＭの表面発現が回復する。関心対象には、マウスＩｇα遺伝子を用いたトランスフェクションは、ヒトＩｇα遺伝子を用いたトランスフェクションに比べて１０倍高い発現を招いた。このデータは、Ｉｇαの細胞外ドメインが追加的にｍＩｇＭの細胞外部分と相互作用しうることを示唆している。他方で、ヒト免疫グロブリンローカスを有するトランスジェニックマウスは、実際にヒト免疫グロブリンを発現する。トランスジェニック非ヒト動物におけるＢ細胞の発生、Ｂ細胞の生存またはヒト（化）ｍＩｇＭの発現がヒト（化）ｍＩｇＭ遺伝子を保持するＢ細胞でのヒトＩｇαおよび／またはヒトＩｇβの同時発現により影響されるかどうかは不明なままである。
【００５６】
加えて、クローニングおよびシーケンシングされたが、機能が未知のままであるいくつかのＢＣＲ関連タンパク質（ＢＡＰ）がある。これらのタンパク質はＢＣＲと関連するにもかかわらず、ＢＣＲの構成要素としてのその役割は疑われている。そのうえ、ＢＡＰの遍在性発現および強い進化上の保存は、可能性があることには一般的な細胞過程にこれらが重要な役割を果たすに違いないことを示唆しており、いくつかの推定上の機能が提案されている。例えば、これらのタンパク質は、ＢＣＲから細胞骨格への結合または小胞輸送の制御に関与しうる。最後に、これらはシャペロンとして機能して膜貫通タンパク質のフォールディングおよび集合を助けると提案されている。
【００５７】
関連文献
Ｂ細胞レセプター、その構成要素、および五つの免疫グロブリンクラスとのその関連は、Wienands et al., EMBO J. 9(2): 449-455 (1990)、Venkitaraman et al., Nature 352: 777-781 (1991)、Herren et al., Immunologic Res. 26(1-3): 35-43 (2002)に記載されている。ＢＣＲ関連タンパク質は、Adachi et al., EMBO J 15(7): 1534-1541 (1996)およびSchamel et al., PNAS 100(17): 9861-9866 (2003)に記載されている。Ｂ細胞の発生および生存にＢ細胞レセプターが及ぼす影響は、Reth, Annual Reviews of Immunology 10: 97-121 (1992)、Kraus et al., Cell 117(6): 787-800 (2004)、Sayegh et al., Immunological Reviews 175: 187-200 (2000)、Reichlin et al., Journal of Experimental Medicine 193(1): 13-23 (2001)、Pike et al., Journal of Immunology 172: 2210-2218 (2004)、Pelanda et al., Journal of Immunology 169: 865-872 (2002)により記載されている。ＢＣＲシグナル伝達のレギュレーションならびにＢ細胞の発生およびアポトーシスにおけるその影響は、Cronin et al., J. Immunology 161 : 252-259 (1998)、Muller et al., PNAS 97 (15): 8451-8454 (2000)、Cragg et al., Blood 100: 3068-3076 (2002)、Wang et al., J. Immunology 171 : 6381-6388 (2003)、Fuentes-Panana et al., J. Immunology 174: 1245-1252 (2005)に記載されている。上に引用した参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５８】
したがって、本発明は、特にトランスジェニック動物の、Ｂ細胞にヒト（化）Ｉｇαおよび／またはヒト（化）Ｉｇβを同時発現させるための方法を対象とし、この方法は、このようなトランスジェニック動物に多様化したヒト（化）抗体レパートリーを産生させ、Ｂ細胞の生存を改善することができる。動物の種類には、ウサギ、トリ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバなどの比較的大型の非ヒト動物が挙げられる。これらの動物がＩｇトランスローカスを発現する場合には、動物の大きさが比較的大きいことから、その抗体収率もまた比較的大きいはずである。したがって、本発明は、Ｂ細胞の発生および生存の増強により比較的多量のヒト（化）免疫グロブリンを産生する比較的大型の創始動物を創出することを目的とする。
【００５９】
したがって、本発明は、下にさらに定義するような完全長ヒトＩｇαおよびＩｇβポリペプチドをコードする導入遺伝子構築物、またはキメラもしくはヒト化Ｉｇαポリペプチドおよびキメラもしくはヒト化Ｉｇβポリペプチドをコードするキメラ導入遺伝子構築物を対象とする。
【００６０】
「ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβポリペプチドをコードする導入遺伝子または導入遺伝子構築物」により、それぞれネイティブな完全長ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ ＤＮＡ配列、ならびにＩｇαまたはＩｇβの機能的に等価のポリペプチドをコードするが、コドン縮重に基づき異なるＤＮＡ配列を有する任意の変異型のコドン最適化ＤＮＡ配列を意味する。この概念をさらに下に詳細に論じる。ネイティブな完全長ヒトＩｇαポリペプチド配列は、配列番号１（図１）に定義されている。ネイティブな完全長ヒトＩｇβポリペプチド配列は配列番号７（図１）に定義されている。
【００６１】
「キメラまたはヒト（化）Ｉｇαをコードする核酸分子または導入遺伝子または導入遺伝子構築物」もまた本明細書に参照される。「キメラＩｇα」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えばラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇαポリペプチド配列を表し、ここで、Ｉｇαポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇαポリペプチドからの一つもしくは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇαバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇα配列由来の、または所与のＩｇα配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇα配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。「キメラＩｇα」および「ヒト（化）Ｉｇα」という用語は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。細胞内および／または膜貫通ドメイン配列を得ることができる非ヒトＩｇαポリペプチド配列には、例えばウシ（配列番号２）；マウス（配列番号３）；イヌ（配列番号４）；霊長類（配列番号５）；ウサギ（配列番号６）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００６２】
「キメラまたはヒト（化）Ｉｇβをコードする核酸分子または導入遺伝子または導入遺伝子構築物」もまた本明細書に参照される。「キメラＩｇβ」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えばラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇβポリペプチド配列を表し、ここで、Ｉｇβポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇβポリペプチド由来の一つもしくは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇβバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇβ配列由来の、または所与のＩｇβ配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇβ配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。用語「キメラＩｇβ」および「ヒト（化）Ｉｇβ」は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。細胞内および／または膜貫通ドメイン配列を得ることができる非ヒトＩｇβポリペプチド配列には、例えばイヌ（配列番号８）；ラット（配列番号９）；ウシ（配列番号１０）；マウス（配列番号１１）；ニワトリ（配列番号１２）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００６３】
したがって、簡潔にはキメラＩｇαまたはＩｇβ導入遺伝子は、１）ヒトＩｇαまたはＩｇβの細胞外ドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列、ならびに２）宿主トランスジェニック動物由来のＩｇαまたはＩｇβの膜貫通および細胞内ドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる。
【００６４】
さらなる態様では、本発明は、２００３年１月２３に公開された米国特許公報第２００３−００１７５３４号および２００６年２月２日に公開された米国特許公報第２００６−００２６６９６号として現在入手することのできる、以前に提出された米国出願（これらの開示は、本明細書によりその全体が参照により組み入れられる）に記載されているような、ヒト（化）免疫グロブリンまたはローカスをコードするトランスジェニック構築物もまた対象にする。それから作製されるトランスジェニック動物、Ｂ細胞または細胞系、およびそこに開示される関連方法論もまた、本発明の局面を形成する。
【００６５】
上に言及した局面の代替アプローチでは、本発明は、１９９６年８月に発行された米国特許第５，５４５，８０６号；１９９６年８月に発行された米国特許第５，５４５，８０７号および１９９６年１０月に発行された米国特許第５，５６９，８２５号、２００６年６月２０日に発行された米国特許第７，０６４，２４４号；またはＰＣＴ公報ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ０２／１２４３７、ならびに米国特許第５，８１４，３１８号および第５，５７０，４２９号に記載されているような、ヒト（化）免疫グロブリンまたはＩｇ鎖もしくはローカスをコードするトランスジェニック構築物もまた対象にするが、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)；Pluschke et al., Journal of Immunological Methods 215: 27-37 (1998)；Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989)；Lonberg et al., Int. Rev. Immunol. 13(l):65-93 (1995)；およびBruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8(4): 455-8 (1997)；およびKuroiwa et al., Nature Biotech 20(9): 889-894 (2002)もまた参照されたく、これらの開示は、その全体が本明細書により参照により組み入れられる。それから作製されるトランスジェニック動物、Ｂ細胞または細胞系、およびそこに開示される関連方法論もまた、本発明の局面を形成する。
【００６６】
導入遺伝子または導入遺伝子構築物は、多様な技法により動物のゲノムに導入することができ、その技法には、前核のマイクロインジェクション、トランスフェクション、核移植クローニング、精子介在性遺伝子導入、精巣介在性遺伝子導入などが挙げられる。
【００６７】
一態様では、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子は、免疫特異的プロモーター、好ましくはＢ細胞特異的プロモーターによりトランスジェニック動物のＢ細胞に好ましくは発現される。このヒトＩｇαまたはＩｇβ遺伝子発現は、好ましくはＢ細胞のみの中で起こり、Ｂ細胞発生の増強および非ヒトトランスジェニック動物の生存をもたらす。「Ｂ細胞特異的プロモーター」により、Ｂ細胞に発現する遺伝子の発現を通常制御する、任意のＢ細胞特異的遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列および／またはその変異体もしくは操作された部分を意味し、その例には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ（Ｂ２９またはＩｇβとしても知られている）、ｍｂ−１（Ｉｇαとしても知られている）、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリンκ軽鎖、免疫グロブリンλ軽鎖、免疫グロブリンＪ鎖などのプロモーター／エンハンサーが挙げられるが、それに限定されるわけではない。好ましい態様では、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはκ軽鎖のプロモーター／エンハンサーは、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子のＢ細胞特異的発現を推進する。
【００６８】
なお別の態様では、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子をコードする核酸分子を含む導入遺伝子構築物は、外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖導入遺伝子ローカスを含む導入遺伝子構築物と共に同時発現される。この態様では、Ｉｇ導入遺伝子ローカスとヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子との両方が、同一のトランスジェニック発現ベクター上に存在することもあり、二つの異なるトランスジェニック発現ベクター上に存在することもある。後者の場合、二つのトランスジェニック発現ベクターを、同時または連続的のいずれかで非ヒトトランスジェニック動物に導入してもよい。
【００６９】
本発明によると、ＩｇαまたはＩｇβのヒト完全長または細胞外ドメイン単独の変異体が本明細書に包含される。これにより、遺伝コードの縮重を見込んだ核酸配列、機能的に等価な残基のアミノ酸置換を含むポリペプチド配列をコードする核酸配列および／または細胞外ドメインの機能性を高める突然変異が意味される。「細胞外ドメインの機能性」には、シグナル伝達可能なＢＣＲの形成が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００７０】
遺伝コードの縮重を見込むことにより、本発明はヒトＩｇαおよびヒトＩｇβの細胞外ポリペプチド配列と少なくとも約７０％、さらに通常には約８０〜８５％。好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約９５％の配列同一性を有する配列を包含する。
【００７１】
生物学的に機能的に等価という用語は、当技術分野において十分に了解されており、さらに本明細書に詳細に定義される。したがって、アミノ酸レベルで約７０％〜約８０％、またはさらに好ましくは約８１％〜約９０％、またはなおいっそう好ましくは約９１％〜約９９％の同一性を有する配列は、そのタンパク質の生物学的活性が維持されるならば、ヒトＩｇαおよびＩｇβに機能的に等価であるとみなされる。
【００７２】
機能的に等価なコドンという用語は、本明細書においてアルギニンまたはセリンについての六つのコドンなどの、同一のアミノ酸をコードするコドンを表すために使用され、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンもまた表す。
【００７３】
以下は、等価の第二世代分子または改良までもされている第二世代分子を創出するための、タンパク質のアミノ酸変更に基づく考察である。例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの、構造に伴う相互作用性結合能をあまり損失せずに、例えばタンパク質構造中のある種のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することができる。タンパク質の生物学的機能的活性を規定するのがタンパク質の相互作用能および性質であることから、ある種のアミノ酸置換をタンパク質配列および基礎となるＤＮＡコード配列に加え、それでもなお類似の特性を有するタンパク質を産生させることができる。したがって、下に論じるように遺伝子の生物学的有用性も活性もあまり損失せずに、その遺伝子のＤＮＡ配列に様々な変更を加えられることが、本発明者らにより考えられている。
【００７４】
このような変更を加えるときに、アミノ酸のハイドロパシー指標もまた考慮することができる。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する上でのハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に了解されている（Kyte & Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー性は、結果として生じるタンパク質の二次構造の一因となり、それが、次にはタンパク質と、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原などの他の分子との相互作用もまた規定すると受け入れられている。
【００７５】
類似のアミノ酸の置換は親水性に基づき効果的に行うことができることもまた、当技術分野において了解されている。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接アミノ酸の親水性により支配される、タンパク質の最大局所平均親水性が、そのタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、アミノ酸残基に以下の親水性値が割り付けられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±０．１）、グルタミン酸（＋３．０±０．１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±０．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。
【００７６】
アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のものに置換してもなお、生物学的に等価で、かつ免疫学的に等価のタンパク質を産生できることが了解されている。このような変更では、親水性値が±０．２以内のアミノ酸置換が好ましく、±０．１以内のものが特に好ましく、±０．０５以内のものがなおいっそう特に好ましい。
【００７７】
本明細書に概略するように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮する置換の例は当業者に周知であり、それらには、アルギニンおよびリシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【００７８】
本発明によりポリペプチドを調製するための別の態様は、ペプチド模倣体の使用である。模倣体は、タンパク質二次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である（Johnson 1993）。ペプチド模倣体の使用の基礎となる原理は、タンパク質のペプチド主鎖が、抗体および抗原の分子相互作用のような分子相互作用を促進する方法で、主にアミノ酸側鎖を配向させるために存在することである。ペプチド模倣体は、自然分子に類似した分子相互作用を許すと考えられる。これらの原理を上に概要した原理と共に使用して、変化および改良された特徴と共に、ヒトＩｇαまたはＩｇβの自然特性の多くを有する第二世代分子を操作することができる。
【００７９】
したがって、ヒトＩｇαまたはＩｇβ、およびヒトＩｇαまたはＩｇβの機能的に等価なポリペプチドをコードする変異型核酸配列は、本発明に有用である。
【００８０】
関心対象の遺伝子を有するトランスジェニックベクターは、一つもしくは複数のレシピエント細胞に導入し、次にランダム組み込みまたはターゲティングした組み込みにより一つまたは複数のレシピエント細胞のゲノムに組み込むことができる。
【００８１】
ランダム組み込みのために、標準的なトランスジェニック技法によりヒトＩｇαまたはＩｇβを有するトランスジェニックベクターを動物レシピエントに導入することができる。例えば、トランスジェニックベクターは、受精した卵母細胞の前核に直接注射することができる。トランスジェニックベクターは、卵母細胞の受精前に精子をトランスジェニックベクターと共インキュベーションすることによってもまた導入することができる。トランスジェニック動物は、受精した卵母細胞から発育させることができる。トランスジェニックベクターを導入する別の方法は、胚性幹細胞にトランスフェクションし、続いて発生途中の胚に遺伝子改変胚性幹細胞を注射することによる。または、トランスジェニックベクター（ネイキッドで、または促進試薬と共に）を発生途中の胚に直接注射することができる。最後に、ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子がトランスジェニック動物の少なくとも一部の体細胞のゲノムに組み込まれたものを有する胚からキメラトランスジェニック動物を産生させる。
【００８２】
特定の態様では、ヒトＩｇαまたはＩｇβを有する導入遺伝子を、内因性ＩｇαまたはＩｇβの発現障害を有する動物系統由来のレシピエント細胞（例えば、受精した卵母細胞または発生途中の胚）のゲノムにランダムに組み込む。このような動物系統の使用は、ヒト（化）トランスジェニックＩｇローカスからの免疫グロブリン分子の優先的発現を許す。または、ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβの発現障害を有する動物系統と交配させることができる。障害Ｉｇαおよび／またはＩｇβならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβについてホモ接合性の子孫を得ることができる。または、アンチセンス技法、細胞内抗Ｉｇαおよび／またはＩｇβの発現などを使用して、内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβの発現を阻害または低下させることができる。一態様では、宿主動物のＩｇαおよび／またはＩｇβの内因性産生をノックダウンするためのえり抜きの方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）法であり、この方法は、細胞内ホスト動物Ｉｇαおよび／またはＩｇβ核酸配列を有するＢ細胞に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＮＡ）またはさらに好ましくは短鎖または小分子干渉性ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）のいずれかを導入する。これは、Invitrogen CorpからのBlock iT（商標）またはStealth（商標）ＲＮＡキットを非限定的に含む市販のキットを使用して実現することができる。
【００８３】
ターゲティングした組み込みのために、トランスジェニックベクターは、胚性幹細胞またはすでに分化した体細胞などの適切な動物レシピエント細胞に導入することができる。その後、導入遺伝子が動物ゲノムに組み込まれ、相同組換えにより対応する内因性遺伝子を交換された細胞を、標準的な方法により選択することができる（例えば、Kuroiwa et al., Nature Genetics 2004, June 6を参照されたい）。次に、選択された細胞を、除核された核移植ユニット細胞、例えば卵母細胞または胚性幹細胞と融合させることができ、このユニット細胞は全能性であり、機能的新生仔を形成することができる。十分に確立された通例技法により融合を行う。卵母細胞の除核および核移植は、注入ピペットを使用した顕微手術によってもまた行うことができる（例えば、Wakayama et al., Nature (1998) 394:369を参照されたい）。次に、結果として生じた卵子を適切な培地中で培養し、トランスジェニック動物を作製するために同期化したレシピエントに移植する。または、発生途中の胚に選択された遺伝子改変細胞を注射して、この胚を続いてキメラ動物に発育させることができる。
【００８４】
さらに、本発明により、本明細書上記の一つまたは複数の組換えベクター（その一つは、内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントのフランキング配列に相同な５’および３’フランキング配列に連結したヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントを保持する）を一つまたは複数のレシピエント細胞に導入し、次に相同組換えにより内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントをヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントに交換された細胞を選択し、選択された一つまたは複数の遺伝子改変レシピエント細胞から動物を得ることによってもまた、ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβを産生することのできるトランスジェニック動物を製造することができる。
【００８５】
トランスジェニックベクターのターゲット挿入に類似して、この手順でレシピエント細胞として使用するために適した細胞には、胚性幹細胞またはすでに分化した体細胞が挙げられる。ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントを保持する組換えベクターは、任意の実行可能な手段、例えばトランスフェクションによりこのようなレシピエント細胞に導入することができる。その後、相同組換えにより、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントが、対応する内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントの代わりに置き換わった細胞を標準的な方法により選択することができる。これらの遺伝子改変細胞は、トランスジェニック動物をクローニングするための核移植手順において核ドナー細胞として役立つことができる。または、選択された遺伝子改変胚性幹細胞を発生途中の胚に注射することができ、続いてその胚をキメラ動物に発育させることができる。
【００８６】
具体的な態様では、本発明の導入遺伝子構築物は、胚に導入遺伝子を直接注射することにより、または妊娠した母親もしくは産卵期のメンドリに導入遺伝子を注射することにより間接的に、胚期のトランスジェニック動物に導入することができる。前記方法のうち任意のものにより産生されるトランスジェニック動物は、本発明の別の態様を形成する。トランスジェニック動物は、ゲノムに少なくとも一つ、すなわち一つまたは複数のヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子を有し、この動物から機能的ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβタンパク質を産生させることができる。
【００８７】
さらに、本発明の導入遺伝子構築物、すなわちヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子ならびにヒト化免疫グロブリン導入遺伝子は、内因性Ｉｇならびに内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβノックアウトのうち一つまたはさらに好ましくはその両方のいずれかのノックアウトバックグラウンドに対して好ましくは発現される。したがって、本発明のトランスジェニック動物は、ヒト（化）Ｉｇローカスを再編成することができ、実質的に減少した内因性Ｉｇ発現ならびにさらに好ましくは実質的に減少した内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβを同様に有するバックグラウンドに対してヒト（化）抗体の機能的レパートリーを効率的に発現することができる。この文脈では、「実質的に」により、内因性Ｉｇの発現単独または追加的に内因性Ｉｇαおよび／もしくはＩｇβの発現のいずれかの内因性産生の程度が、好ましくは少なくとも約３０％〜４９％、またはさらに好ましくは少なくとも約５０％〜７９％、またはなおさらに好ましくは少なくとも約８０〜８９％、または最も好ましくは約９０〜１００％だけ減少していることを意味する。
【００８８】
本発明は、ヒト（化）Ｉｇローカスを再編成および遺伝子変換することができ、ヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することができる一つまたは複数のヒト（化）Ｉｇローカスならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβを発現するトランスジェニックウサギを提供する。好ましくは追加的に、これらのウサギは、実質的な量の機能的内因性ウサギ免疫グロブリンも、機能的内因性ウサギＩｇαおよび／またはＩｇβも産生しない。
【００８９】
本発明は、一つまたは複数のヒト（化）Ｉｇローカスならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβを発現する鳥類、げっ歯類およびウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウマなどの農用動物を非限定的に含む比較的大型のトランスジェニック動物もまた提供する。また好ましくは、これらの動物は、追加的に実質的な量の機能的内因性免疫グロブリンも機能的内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβも産生しない。したがって、これらのトランスジェニック動物は、ヒト（化）Ｉｇローカスを再編成することができ、ヒト（化）抗体の機能的レパートリーを増大した収率で効率的に発現することができる。
【００９０】
本発明は、ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子ならびにヒト（化）免疫グロブリンローカスを発現する、上記の異なる種類のトランスジェニック動物から単離されたＢ細胞もまた対象とする。さらに、このようなＢ細胞は、ウイルストランスフォーメーションなどの使用を非限定的に含む公知の通常法を使用して不死化させることができ、当業者はこれを使用することができる。
【００９１】
抗原を用いた免疫処置は、前記トランスジェニック動物に同一抗原に対するヒト（化）抗体の産生をもたらす。
【００９２】
本発明の好ましい態様は、ヒト（化）Ｉｇローカスを有するトランスジェニック動物を対象とするものの、霊長類化Ｉｇローカスおよび霊長類化ポリクローナル抗血清を有するトランスジェニック動物もまた本発明の精神内に属することを了解されたい。ヒト（化）ポリクローナル抗血清組成物と同様に、霊長類化ポリクローナル抗血清組成物は、ヒト個体において減少した免疫原性を有する見込みがある。
【００９３】
多様化したヒト（化）免疫グロブリン分子を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が（下記にさらに示すように）ひとたび製造されれば、抗原に対するヒト（化）免疫グロブリンおよびヒト（化）抗体調製物は、その動物に抗原を免疫処置することにより容易に得ることができる。多様な抗原を使用して、トランスジェニック宿主動物を免疫処置することができる。このような抗原には、生存、弱毒化もしくは死滅した微生物、例えばウイルスおよび単細胞生物（細菌および真菌など）、微生物のフラグメント、またはその微生物から単離された抗原分子が挙げられる。
【００９４】
動物を免疫処置するときに使用するために好ましい細菌抗原には、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来精製抗原、例えば莢膜多糖５および８型、α−毒素などのリコンビナントバージョンの病原性因子、アドヘシン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、ならびにフィブロネクチン結合タンパク質が挙げられる。好ましい細菌抗原には、弱毒化バージョンのS. aureus、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロコッカス、エンテロバクター、およびクラブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）、またはこれらの細菌細胞からの培養上清もまた挙げられる。免疫処置に使用することのできる他の細菌抗原には、Pseudomonas aeruginosa、エンテロコッカス、エンテロバクター、およびKlebsiella pneumoniae由来の精製リポ多糖（ＬＰＳ）、莢膜抗原、莢膜多糖および／またはリコンビナントバージョンの外膜タンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質、エンドトキシン、およびエキソトキシンが挙げられる。
【００９５】
真菌に対する抗体を作製するための好ましい抗原には、弱毒化バージョンの真菌またはその外膜タンパク質が挙げられ、この真菌には、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・パラサイロシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００９６】
ウイルスに対する抗体を作製するための免疫処置に使用するための好ましい抗原には、ウイルスのエンベロープタンパク質および弱毒化バージョンが挙げられ、そのウイルスには、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（特にＦ−タンパク質）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、およびＨＳＶが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００９７】
トランスジェニック動物に単離された腫瘍細胞、腫瘍細胞系、または腫瘍関連抗原を免疫処置することにより、ガンの処置のための治療用抗体を作製することができ、腫瘍関連抗原には、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（これに対する抗体は、乳ガンの治療に有用である）；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ５３抗原（これに対する抗体は、Ｂ細胞リンパ腫の治療に有用である）、（３）前立腺特異膜抗原（ＰＭＳＡ）（これに対する抗体は、前立腺ガンの処置に有用である）、および１７ー１Ａ分子（これに対する抗体は、大腸ガンの処置に有用である）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００９８】
抗原は、アジュバントの存在下または不在下で任意の好都合な方法でトランスジェニック宿主動物に投与することができ、予定されたスケジュールに従って投与することができる。
【００９９】
免疫処置後に、免疫処置されたトランスジェニック動物の血清または乳汁を分画して、抗原に特異的な医薬品等級のポリクローナル抗体の精製に供することができる。トランスジェニックトリの場合、抗体は、卵黄の分画によってもまた製造することができる。濃縮、精製された免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（アフィニティー、イオン交換、ゲルろ過など）、硫酸アンモニウムなどの塩を用いた選択的沈殿、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーにより得ることができる。
【０１００】
分画されたヒト（化）抗体は、ヒトに静脈内投与するために適した無毒性、無発熱性媒質、例えば滅菌緩衝食塩水に溶解または希釈してもよい。
【０１０１】
投与に使用される抗体調製物は、０．１〜１００mg/ml、さらに通常には１〜１０mg/mlの免疫グロブリン濃度を有することにより全般的に特徴付けられる。抗体調製物は、様々なアイソタイプの免疫グロブリンを含有してもよい。または、抗体調製物は、一つのアイソタイプだけの抗体またはいくつかの選択されたアイソタイプを含有してもよい。
【０１０２】
ヒト（化）モノクローナル抗体を製造するために、動物の内因性免疫グロブリンを発現しているＢ細胞が枯渇した、免疫処置されたトランスジェニック動物から脾臓細胞を単離する。単離された脾臓細胞が、ハイブリドーマを産生するためのトランスフォーメーションされた細胞系との細胞融合に使用されるか、または抗体をコードするｃＤＮＡが標準的な分子生物学的技法によりクローニングされ、トランスフェクションされた細胞に発現されるかのいずれかである。モノクローナル抗体を製造するための手順は、当技術分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願０５８３９８０Ａ１（"Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"）、米国特許第４，９７７，０８１号（"Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof"）、ＷＯ９７／１６５３７（"Stable Chicken B-Cell Line And Method of Use Thereof")、およびＥＰ０４９１０５７Ｂ１（"Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G"）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。クローニングされたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生は、Andris-Widhopf et al., "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Immunol Methods 242:159 (2000)およびBurton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995)に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
たいていの場合には、抗体調製物は、未改変免疫グロブリン、すなわち動物から調製された、例えば化学物質または酵素による追加の改変を有さないヒト（化）抗体からなる。または、免疫グロブリン画分は、酵素分解（例えばペプシン、パパイン、プラスミン、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼなどを用いた分解）、加熱などの処理に供し、かつ／またはさらに分画して「抗体フラグメント」を作製することができる。
【０１０４】
本発明には、上に定義した方法により得られる抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物または抗体調製物もまた含まれる。本明細書に使用する「薬学的に許容されうる成分」または「製剤」という用語は、特定の量の請求された活性成分、すなわちヒト（化）抗体または抗体フラグメントを含む産物、および特定の量の特定の活性成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の産物を包含することが意図される。このような用語は、活性成分および担体を構成する不活性成分を含む産物と、任意の二つ以上の成分の組み合わせ、複合体形成もしくは凝集から、または一つもしくは複数の成分の解離から、または一つもしくは複数の成分の他種の反応もしくは相互作用から、直接または間接的に生じる任意の産物とを包含することが意図される。したがって、本発明の「薬学的組成物」は、本発明の任意の活性化合物および薬学的に許容されうる担体を混合することにより製造される任意の組成物を包含する。
【０１０５】
化合物の「投与」または化合物を「投与すること」という用語は、処置を必要とする個体に、任意の製剤中の本発明の任意の活性化合物を提供することを意味することを了解すべきである。
本発明の化合物を投与するための薬学的組成物は、投薬ユニット形態で好都合に提示してもよく、薬剤学の分野で周知の方法により調製してもよい。使用に適した方法および担体は、当技術分野で十分に説明されたもの、例えばRemington, The Science and Practice of Pharmacy, ed. Gennaro et al., 20th Ed. (2000)に説明されたものであるものの、免疫学分野の専門家は、他の方法が公知であり、本発明の組成物の調製に適することを容易に認識している。全ての方法は、活性成分を、一つまたは複数の補助成分を構成する担体と関連させるステップを含む。全般に、薬学的組成物は、活性成分を、液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方と均一および密接に関連させ、次に必要に応じてその産物を所望の製剤に形作ることにより調製される。薬学的組成物において、活性成分は、疾患の過程または状態に所望の効果を生じるために十分な、上に論じた有効量で含められる。さらに、抗体分子の持続性長時間放出のための製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、この方法は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
したがって、上記方法を使用して作製されるトランスジェニック構築物、導入遺伝子構築物を含むベクターおよびトランスジェニック動物は、全て本発明の態様である。
【０１０７】
以下の実施例により本発明をさらに例証するが、本発明はこの実施例により決して限定されることはない。
【０１０８】
実施例１
ヒトＩｇαおよびＩｇβを用いたウサギＢ細胞系のトランスフェクション
ウサギＢ細胞におけるヒトｍＩｇＭの発現にヒトＩｇαおよびＩｇβが及ぼす効果を実証するために、ヒトＩｇαもしくはＩｇβまたはヒトｍＩｇＭをコードする発現ベクターをこの細胞にトランスフェクションする。
【０１０９】
ヒトＩｇαおよびヒトＩｇβおよびヒトＩｇＭをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングする。
【０１１０】
不死化ウサギＢ細胞系に発現ベクターをトランスフェクションし、ネオマイシン存在下の培地中で培養し、安定トランスフェクタントの選択に供する。ヒトＩｇＭならびにヒトＩｇαおよび／またはＩｇβに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーにより耐性細胞を分析する。ヒトＩｇＭをコードする発現ベクターを用いたウサギＢ細胞のトランスフェクションは、ヒトＩｇＭの低い細胞表面発現を招く。ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβを用いた同時トランスフェクションは、ヒトｍＩｇＭの高い細胞表面発現を招く。これは、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβがヒト（化）またはキメラｍＩｇＭの高い細胞表面発現に必要かつ十分であるであることを実証している。
【０１１１】
実施例２
ヒトＩｇαおよびＩｇβを用いた任意の動物由来Ｂ細胞系のトランスフェクション
動物由来Ｂ細胞におけるヒトｍＩｇＭの発現にヒトＩｇαおよびＩｇβが及ぼす効果を実証するために、ニワトリ（ＤＴ４０）、ウシおよびブタ由来Ｂ細胞に、ヒトＩｇαもしくはＩｇβまたはヒトｍＩｇＭをコードする発現ベクターをトランスフェクションする。
【０１１２】
不死化Ｂ細胞系に発現ベクターをトランスフェクションし、ネオマイシン存在下の培地中で培養し、安定トランスフェクタントの選択に供する。ヒトＩｇＭならびにヒトＩｇαおよび／またはＩｇβに特異的な抗体を使用したフローサイトメトリーにより耐性細胞を分析する。ヒトＩｇＭをコードする発現ベクターを用いたウサギＢ細胞のトランスフェクションは、ヒトＩｇＭの低い細胞表面発現を招く。ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβを用いた同時トランスフェクションは、ヒトｍＩｇＭの高い細胞表面発現を招く。これは、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβがヒト（化）またはキメラｍＩｇＭの高い細胞表面発現に必要かつ十分であるであることを実証している。
【０１１３】
実施例３
ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβの存在下または不在下でヒト化免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖導入遺伝子を発現するトランスジェニックウサギ
Fanら（Pathol. Int. 49: 583-594, 1999）により記載されるようにトランスジェニックウサギを作製した。簡潔には、標準法を使用して雌ウサギから過剰排卵させ、雄ウサギと交配させた。前核段階の接合子を輸卵管から集め、２０％ウシ胎仔血清を補充したDulbeccoリン酸緩衝食塩水などの適切な培地に入れた。一対のマニピュレーターの助けを借りて、外因性ＤＮＡ（例えばヒト（化）免疫グロブリンローカスまたはヒトＩｇαもしくはヒトＩｇβを有する発現ベクター）を前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している接合子を偽妊娠ウサギの輸卵管に移植した。偽妊娠は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の注射により誘導した。注射された接合子の約０．１〜１％が生きたトランスジェニックウサギに発育した。ゲノムへの導入遺伝子の組み込みは、ＰＣＲおよびＦＩＳＨにより確認した。
【０１１４】
トランスジェニック創始ウサギの血清中にヒトＩｇＧおよび／またはヒトκ軽鎖抗原決定基を有する抗体が存在することは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判定した。Ｂ細胞表面での抗体発現は、フローサイトメトリーにより分析した。ヒト（化）免疫グロブリン重鎖ローカスをコードする導入遺伝子を有するウサギは、１〜１０ug/mlのヒトＩｇＭを発現した。若い動物（６〜９週齢）は１００〜４０００ug/mlのヒトＩｇＧを発現した。しかし、ヒトＩｇＧの発現は、１０〜１００ｕｇ／ｍｌのレベルに急速に低下した。末梢血中のＢ細胞のフローサイトメトリー分析は、少数のヒトｍＩｇＭ＋細胞（１〜２％）が存在することを明らかにした。若いウサギの虫垂は、最大１０％のヒトｍＩｇＭ＋細胞を含有したが、これは齢と共に急速に消滅した。
【０１１５】
ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβをコードする導入遺伝子の導入は、血清中に１００〜２０００ug/mlのヒト（化）ＩｇＭの発現および２０００〜１２０００ug/mlのヒト（化）ＩｇＧの安定発現を招く。虫垂では、３０〜７０％のリンパ球がヒト（化）ｍＩｇＭ＋である。末梢血では、等しい数のＢ細胞がウサギおよびヒト（化）ｍＩｇＭまたはｍＩｇＧを発現する。
【０１１６】
本開示にわたり引用された全ての参考文献は、そこに引用された参考文献と共に、本明細書より参照により明白に組み入れられる。
【０１１７】
本発明を特定の態様を参照することにより例示するが、本発明はそれに限定されない。当業者は、様々な改変を容易に利用することができ、本発明が役立つ方法に実質的な変更を加えずに実施できることを了解しているものである。このような全ての改変は、本明細書に請求される本発明の範囲内に属することが具体的に意図される。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、正常Ｂ細胞の発生を促進することにより、およびヒト（化）免疫グロブリンローカスを持つ非ヒト動物におけるヒト（化）抗体の発現を維持することにより非ヒトトランスジェニック動物におけるヒト（化）免疫グロブリンの発現を改善する方法に関する。特に、本発明は、Ｂ細胞レセプターの構成要素であるヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする導入遺伝子ならびに一つまたは複数のヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子の同時発現に関する。この方法は、例えばトランスジェニック非ヒト動物の血液、乳汁または卵にヒト（化）抗体を優位に発現させる。
【０００２】
関連技術の説明
抗体は、ガン、アレルギー疾患、移植拒絶の予防および宿主対移植片病などの様々なヒト疾患および状態の処置にうまく使用されてきた重要な種類の医薬品である。
【０００３】
非ヒト動物から得られた抗体調製物の主な問題は、ヒト患者における非ヒト免疫グロブリンの内因性免疫原性である。非ヒト抗体の免疫原性を減らすために、動物可変（Ｖ）領域エキソンをヒト定常（Ｃ）領域エキソンと融合させることにより、キメラ抗体遺伝子が得られることが示された。このようなキメラまたはヒト化抗体は、ヒトに最小限の免疫原性を有し、ヒト対象の治療上の処置に使用するために適する。
【０００４】
ヒト化モノクローナル抗体が開発され、臨床応用されている、しかし、キメラ、ヒト化またはヒトのいずれにせよ、一般にガンまたは毒性病原体感染などの壊滅的な疾患を処置するためのモノクローナル抗体の使用は、これらの疾患の複雑性、多因性の原因および適応性により限定される。単独に確定されたターゲットに対するモノクローナル抗体は、これらのターゲットが変化、進化および突然変異すると通常は作用しなくなる。例えば、悪性腫瘍は、標準的なモノクローナル抗体療法に対する耐性を獲得するおそれがある。この問題の解決は、複数の進化中のターゲットをターゲティングする能力を有するポリクローナル抗体を使用することである。ポリクローナル抗体は、細菌毒素またはウイルス毒素を中和することができ、病原体を殺滅および除去する免疫反応を命じる。
【０００５】
したがって、高力価高親和性ヒト化ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の大規模生産に適した方法の大きな臨床的必要性がある。さらに、ウサギ、ニワトリ、ヒツジおよびウシなどの比較的大型のトランスジェニック動物での抗体の生産は、抗体の収率の観点から好都合であり、導入遺伝子がコードする産物を多量に発現する比較的大型の創始動物の創出もまた大いに望ましい。
【０００６】
ヒト化モノクローナル抗体は、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあることはいくつかのＦＲ残基が、非ヒト動物の、例えばげっ歯類の抗体における類似部位由来の残基により置換されている、典型的にはヒト抗体である。ヒト化は、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988)）に従って、ヒトモノクローナル抗体の対応する配列から非ヒト動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列（例えばげっ歯動物のもの）に置換することにより本質的に行うことができる。
【０００７】
動物においてヒト化抗体を製造する間に遭遇する一問題は、トランスジェニック抗体を超える宿主抗体の内因性産生であり、これは抑制する必要がある。キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおけるその抗体の重鎖Ｊ領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くと記載されている。このような生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原誘発時にヒト抗体の産生を招くものである。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)；２００６年６月２０日に発行された米国特許第７，０６４，２４４号を参照されたい。これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００８】
マウスゲノムへのヒト免疫グロブリン遺伝子の導入は、これらの遺伝子操作されたマウスにおける多様化されたヒト抗体レパートリーの発現を招く。ヒト−マウスキメラ抗体を発現するマウスの作製は、Pluschke et al., Journal of Immunological Methods 215: 27-37 (1998)に記載されている。ヒト免疫グロブリンポリペプチドを発現するマウスの作製は、Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989)；Lonberg et al., Int. Rev. Immunol. 13(l):65-93 (1995)；およびBruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8(4): 455-8 (1997)；米国特許第５，５４５，８０６号（１９９６年８月発行）；米国特許第５，５４５，８０７号（１９９６年８月発行）ならびに米国特許第５，５６９，８２５号（１９９６年１０月発行）に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ヒト抗体を発現するウシの作製は、Kuroiwa et al., Nature Biotech 20(9): 889-894 (2002)に記載されている。ヒト（化）免疫グロブリントランスローカスを発現する非ヒトトランスジェニック動物の産生およびこのようなトランスジェニック動物からの抗体の産生は、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ０２／１２４３７、ならびに米国特許第５，８１４，３１８号および第５，５７０，４２９号にもまた詳細に記載されており、これらの開示は、本明細書によりその全体が参照により明白に組み入れられる。得られたヒト化抗体は、ヒトに最小限の免疫原性を有し、ヒト対象の治療上の処置に使用するために適する。
【０００９】
上に引用した遺伝子操作アプローチは、遺伝子操作マウスにヒト免疫グロブリンポリペプチドの発現を招くが、ヒト免疫グロブリンの発現レベルは通常よりも低い。これは、免疫グロブリンの効率的な発現に必要な、免疫グロブリンローカス中の種特異的レギュレーションエレメント（regulatory element）が原因のおそれがある。トランスフェクションされた細胞系で実証されたように、ヒト免疫グロブリン遺伝子に存在するレギュレーションエレメントは、非ヒト動物では適正に機能できないおそれがある。免疫グロブリン遺伝子中のいくつかのレギュレーションエレメントが記載されている。特に重要なのは、重鎖定常領域下流（３’）のエンハンサーおよび軽鎖遺伝子中のイントロンエンハンサーである。加えて、まだ確認されていない他のコントロールエレメントが免疫グロブリン遺伝子に存在するおそれがある。マウスにおける研究は、膜型免疫グロブリン分子の膜部および細胞質尾部がヒトＣγ１遺伝子ホモ接合性マウスの血清中のヒト−マウスキメラ抗体の発現レベルに重要な役割を果たすことを示した。したがって、動物に異種免疫グロブリン遺伝子を発現させるために、エンハンサーエレメントと、膜貫通部および細胞質尾部をコードするエキソン（それぞれＭ１エキソンおよびＭ２エキソン）とを含有する配列を、その動物において類似の位置に通常みられる配列に交換することが望ましい。
【００１０】
これらの遺伝子操作された動物でのヒト免疫グロブリンの発現は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンローカスを保持する非ヒトＢ細胞のＢ細胞発生によってもまた影響されうる。Ｂ細胞発生に及ぼすＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の影響は、マウスで広く研究されてきた。しかし、トランスジェニック動物においてヒトまたは部分的ヒト抗体がどのように組み合わせられて機能的ＢＣＲを形成するか、およびこのようなＢＣＲがヒト（化）Ｉｇを発現している非ヒトＢ細胞の発生および生存に効率的に影響するかどうか（これは、次には抗体の収率にもまた影響する）は不明であった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヒトＩｇαポリペプチド配列（配列番号１）と他の非ヒトＩｇα配列（配列番号２〜６）とのアミノ酸アライメントを示す図である。
【図２】図２は、ヒトＩｇβポリペプチド配列（配列番号７）と他の非ヒトＩｇβ配列（配列番号８〜１２）とのアミノ酸アライメントを示す図である。
【００１２】
発明の概要
一局面では、本発明は、ＢＣＲのキメラＩｇαサブユニットをコードする導入遺伝子構築物を提供し、ここで、キメラＩｇαサブユニットは、非ヒトＩｇαポリペプチド配列の細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列、ならびにさらに配列番号１のヒトＩｇαの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１３】
第２の局面では、本発明は、ＢＣＲのキメラＩｇβサブユニットをコードする導入遺伝子構築物を提供し、ここで、キメラＩｇβサブユニットは、非ヒトＩｇβポリペプチド配列の細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列、ならびにさらに配列番号７のヒトＩｇβの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明のある態様では、非ヒトＩｇαポリペプチド配列の種類には、ウシ（配列番号２）、マウス（配列番号３）、イヌ（配列番号４）、霊長類（配列番号５）、ウサギ（配列番号６）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。本発明の別の態様では、非ヒトＩｇβポリペプチド配列の種類には、イヌ（配列番号８）、ラット（配列番号９）、ウシ（配列番号１０）、マウス（配列番号１１）、ニワトリ（配列番号１２）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００１５】
第３の局面では、非ヒトトランスジェニック動物は、（ａ）配列番号１の完全長ヒトＩｇαサブユニットもしくは上に定義したキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／または（ｂ）配列番号７の完全長ヒトＩｇβサブユニットもしくは上に定義したキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、ならびに（ｃ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を含み、ここで、結果として生じる導入遺伝子産物は、組み合わされてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成する。
【００１６】
この局面の一態様では、非ヒトトランスジェニック動物の任意の内因性Ｉｇ産生の発現ならびに／または内因性Ｉｇαおよび／もしくは内因性Ｉｇβサブユニットの発現は実質的に減少する。
【００１７】
別の態様では、非ヒトトランスジェニック動物は、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、ウマ、ロバおよびウシからなる群より選択される。好ましい態様では、非ヒトトランスジェニック動物はウサギである。
【００１８】
第４の局面では、本発明は、上に定義された非ヒトトランスジェニック動物から単離されたヒト（化）免疫グロブリンもまた提供し、これは、抗体または抗体フラグメントのいずれかである。この局面のある態様では、単離されたヒト（化）免疫グロブリンは、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または抗体フラグメントのいずれかである。抗体フラグメントは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれか由来でありうる。さらに、抗体または抗体フラグメントはラベルすることができるし、毒素と融合させて免疫毒素を形成させることができるし、治療剤と結合させることができるし、当技術分野において明確であり、使用されている任意の異種アミノ酸配列に融合させることができる。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2フラグメントである。
【００１９】
第５の局面では、本発明は、上に定義された非ヒトトランスジェニック動物から単離されたＢ細胞を提供し、ここでこのＢ細胞は、ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかおよび／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかを発現し、さらに、ヒト（化）免疫グロブリンローカスもまた発現する。ある態様では、このＢ細胞は不死化されており、好ましい態様では、ウサギ由来である。
【００２０】
第６の局面では、本発明は、上記のような抗体または抗体フラグメントを含む抗体調製物を提供する。
【００２１】
第７の局面では、本発明は、薬学的に許容される成分との混合物中に、上記のような抗体または抗体フラグメントを含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、モノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、または一つもしくは複数のポリクローナル抗体もしくはそのフラグメントのいずれかを含むことがある。
【００２２】
第８の局面では、本発明は、非ヒト動物においてヒト（化）抗体を産生させるための方法を提供し、その方法は、（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物に導入および発現させること、（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物に導入および発現させること、（ｃ）その動物を抗原刺激に供すること、ならびに（ｄ）その動物からヒト（化）抗体を単離することを含む。この局面のある態様では、抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のフラグメントのいずれかである。さらに、抗体または抗体フラグメントは、ラベルすること、または毒素と融合させて免疫毒素を形成させること、または治療剤と結合させること、または任意の異種アミノ酸配列に融合させることのいずれかができる。
【００２３】
第９の局面では、本発明は、ヒト（化）抗体を発現している非ヒト動物を産生させるための方法を提供し、この方法は、（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物のＢ細胞に導入および発現させること；ならびに（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を非ヒト動物に導入および発現させることを含み、ここで、結果として生じる導入遺伝子産物を組み合わせてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成させる。一態様では、ヒト（化）抗体を発現している非ヒト動物は、遺伝子変換および／または体細胞超突然変異により抗体多様性を創出する動物である。好ましい態様では、この動物はウサギである。
【００２４】
発明の詳細な説明
定義
別に定義しない限り、本明細書に使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者に通例了解されるものと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, NY 1992)は、本出願に使用される用語の多くについて全般的な指針を当業者に与える。
【００２５】
当業者は、本明細書に記載されるものと類似または等価の多数の方法および材料を認識しているものであり、それらを本発明の実施に使用することができよう。実際に、本発明は、記載された方法および材料に決して限定されない。本発明のために、以下の用語を下に定義する。
【００２６】
本明細書に定義する「導入遺伝子構築物または発現構築物」は、関心対象の少なくとも一つの導入遺伝子についてのコード配列を、非ヒトトランスジェニック動物のターゲット細胞内の関心対象の導入遺伝子の、時間的、細胞特異的、および／または強化された発現に必要な適切なレギュレーション配列と一緒に有するＤＮＡ分子を表す。
【００２７】
「Ｂ細胞」は、免疫グロブリン遺伝子セグメントの再構成を受けることができ、その生活環のある段階で免疫グロブリン遺伝子を発現することができるＢ系列細胞と定義される。これらの細胞には、早期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、形質細胞などが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００２８】
本明細書に定義される「Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）複合体」は、Ｂ細胞上に発現される多サブユニット免疫認識レセプターを表し、これには、以下のサブユニット、すなわち抗原（Ａｇ）レセプター、膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）、ＩｇαサブユニットおよびＩｇβサブユニットが挙げられる。Ｂ細胞レセプター、その構成要素、および五つの免疫グロブリンクラスとのその関連が、Wienands et al., EMBO J. 9(2): 449-455 (1990)、Venkitaraman et al., Nature 352: 777-781 (1991)、Herren et al., Immunologic Res. 26(1-3): 35-43 (2002)に記載されている。加えて、クローニングおよびシーケンシングされたがその機能は未知のままであり、ＢＣＲの構成要素としてのその役割が疑われているいくつかのＢＣＲ関連タンパク質（ＢＡＰ）がある。ＢＣＲ関連タンパク質は、Adachi et al., EMBO J 15(7): 1534-1541 (1996)およびSchamel et al., PNAS 100(17): 9861-9866 (2003)に記載されている。
【００２９】
「ネイティブなＩｇαまたはＩｇβサブユニット」は、天然ＩｇαまたはＩｇβポリペプチド配列を表し、これには、所与の種類の動物または近縁種に見出される、ＩｇαまたはＩｇβサブユニットの天然アレルが含まれる。これらは、「完全長ＩｇαまたはＩｇβ配列」とも呼ばれる。ヒトＩｇαポリペプチド配列は、Flaswinkelら（Immunogenetics 36 (4): 266-69 (1992)；アクセッション番号Ｍ７４７２１）（図１、配列番号１）によりクローニングされた。ヒトＩｇβポリペプチド配列は、Muellerら（Eur. J. Biochem. 22, 1621-25 (1992)；アクセッション番号Ｍ８０４６１）（図２、配列番号７）によりクローニングされた。
【００３０】
「ヒト（化）」という用語は、完全なヒト配列または一つもしくは複数のヒト配列を有する配列を表す。したがって、本明細書に使用する用語には、ヒト配列およびヒト化配列が含まれる。
【００３１】
「キメラＩｇα」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えば、ラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇαポリペプチド配列を表し、この配列で、Ｉｇαポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇαポリペプチド由来の一つまたは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇαバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇα配列由来の、または所与のＩｇα配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇα配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。「キメラＩｇα」および「ヒト（化）Ｉｇα」という用語は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。いくつかの非ヒト動物由来のＩｇαポリペプチド配列（配列番号２〜６）もまた図１に定義する。
【００３２】
「キメラＩｇβ」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えば、ラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇβポリペプチド配列を表し、この配列で、Ｉｇβポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇβポリペプチド由来の一つまたは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇβバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇβ配列由来の、または所与のＩｇβ配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇβ配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。「キメラＩｇβ」および「ヒト（化）Ｉｇβ」という用語は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。いくつかの非ヒト動物からのＩｇβポリペプチド配列（配列番号８〜１２）は図２に定義される。
【００３３】
「細胞内ポリペプチドもしくはドメイン」または「細胞質尾部」は、細胞の範囲内に存在する所与の膜結合型タンパク質またはサブユニットのポリペプチド配列のその部分を表す。通常は、タンパク質の細胞内ドメインはシグナル伝達を担う。
【００３４】
ＩｇαまたはＩｇβサブユニットの「細胞内ドメイン配列」により、細胞の範囲内に通常存在するＩｇαもしくはＩｇβポリペプチド、またはそのフラグメントのポリペプチド配列を意味する。
【００３５】
ＩｇαまたはＩｇβサブユニットの「膜貫通ドメイン配列」は、原形質膜、オルガネラ膜、または脂質二重層などの生体膜を貫通するＩｇαもしくはＩｇβポリペプチド、またはそのフラグメントのポリペプチド配列を意味する。本明細書に定義する「膜貫通ドメイン配列」には、天然膜貫通ポリペプチドが含まれるし、膜貫通ドメイン配列は、非天然コンセンサス配列またはそのフラグメントのこともある。
【００３６】
「細胞外ポリペプチドまたはドメイン」は、通常は細胞の範囲外に存在する所与の膜結合型タンパク質またはサブユニットのポリペプチド配列のその部分を表す。「ＩｇαまたはＩｇβの細胞外ドメイン」により、細胞の範囲外に存在するＩｇαもしくはＩｇβポリペプチド、またはそのフラグメントのポリペプチド配列を意味する。
【００３７】
本明細書に使用する「ヒト（化）免疫グロブリンローカス」という用語には、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子ローカスまたはそのセグメントの天然配列と、ヒトＩｇ遺伝子ローカスまたはそのセグメントの天然配列の縮重型と、ヒトＩｇ遺伝子ローカスまたはそのセグメントの天然配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド配列をコードする合成配列との三者が含まれる。特定の態様では、ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、免疫グロブリン分子をヒトに非免疫原性にする。本明細書で、「ヒト（化）またはヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖および／または軽鎖ローカス」または「ヒトまたはヒト（化）免疫グロブリン（Ｉｇ）ローカス」という用語は相互交換可能に使用される。
【００３８】
本明細書に使用する「ヒト（化）Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）複合体」という用語は、ＩｇαサブユニットがネイティブなヒトＩｇαサブユニットまたは上記のヒトもしくはヒト化Ｉｇα配列を有するキメラＩｇαサブユニットのいずれかであり、かつ／あるいはさらにＩｇβサブユニットがネイティブなヒトＩｇβサブユニットまたは上記のヒトもしくはヒト化Ｉｇβ配列を有するキメラＩｇβサブユニットのいずれかであり、かつさらに、膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）が上記のヒト（化）免疫グロブリンのものである多サブユニットＢＣＲ複合体を表す。用語「ヒト抗体」および「ヒト免疫グロブリン」は、本明細書において抗体および完全ヒト配列を含む免疫グロブリン分子を表すために使用される。
【００３９】
本明細書に使用する用語「ヒト化抗体」および「ヒト化免疫グロブリン」は、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列（またはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列）の少なくとも一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のヒト化免疫グロブリン分子は、ヒト化免疫グロブリン分子を産生するように操作されたトランスジェニック非ヒト動物から単離することができる。このようなヒト化免疫グロブリン分子は、動物から調製された、または動物由来の細胞から調製された非ヒト化免疫グロブリン分子よりも霊長類に、特にヒトに免疫原性が低い。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体には、遺伝子変換動物における遺伝子変換および体細胞超突然変異によりさらに多様化された免疫グロブリン（Ｉｇ）および抗体が挙げられる。このようなヒト化Ｉｇまたは抗体は、ヒトにより自然に製造されないことから、それらは「ヒト」ではないが（ヒトは遺伝子変換により自己の抗体レパートリーを多様化しないため）、それでもなお、ヒト化Ｉｇまたは抗体は、その構造にヒトＩｇ配列を有することから、それらはヒトに免疫原性ではない。
【００４０】
「実質的に減少した」内因性Ｉｇ産生ならびに／またはＩｇαおよび／もしくはＩｇβサブユニットの発現という用語は、トランスジェニック動物における内因性Ｉｇ単独の産生、または追加的に内因性Ｉｇαおよび／もしくはＩｇβの発現のいずれかの程度が、好ましくは少なくとも約３０％〜４９％、またはより好ましくは少なくとも約５０％〜７９％、またはなおいっそう好ましくは少なくとも約８０〜８９％、または最も好ましくは約９０〜１００％だけ減少していることを意味する。
【００４１】
「モノクローナル抗体」という用語は、単クローンのＢ細胞により合成される抗体分子を表すために使用される。
【００４２】
「ポリクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞集団により合成される抗体分子集団を表すために使用される。
【００４３】
遺伝子再編成および遺伝子変換を受ける能力を有する「免疫グロブリン（Ｉｇ）ローカス」は、本明細書において「機能的」Ｉｇローカスとも呼ばれ、機能的Ｉｇローカスにより作製される多様性を有する抗体は、本明細書において「機能的」抗体または抗体の「機能的」レパートリーとも呼ばれる。
【００４４】
本明細書に使用する用語「非ヒト（トランスジェニック）動物」には、哺乳類、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類（例えばマウスおよびラット）、非げっ歯類哺乳類、例えばウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバ、ならびに鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。本明細書に使用される「非霊長動物」という用語には、上に具体的に挙げた哺乳類を非限定的に含む、霊長類以外の哺乳類が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００４５】
詳細な説明
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリン（免疫グロブリン鎖を含む）の産生が、その動物のＢ細胞におけるヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβを同時発現することにより顕著に増加することができるという認識に少なくとも部分的に基づく。トランスジェニック動物のＢ細胞にヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβが含まれることは、Ｂ細胞レセプタータンパク質間の相互作用を再構成および改善することにより、そのような導入遺伝子を保持するＢ細胞の抗原認識、Ｂ細胞発生および生存を高めると考えられる。ヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子をすでに保持するトランスジェニック動物におけるヒト化免疫グロブリンの同時発現は、ヒト化免疫グロブリン産生を大いに改善するであろう。好ましくは内因性Ｉｇと内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβの両方のノックアウトバックグラウンドに対してヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子と、ヒト化免疫グロブリン導入遺伝子との両方を発現させることが追加的に望ましいであろう。
【００４６】
Ｂ細胞レセプターおよびその関連タンパク質
Ｂ細胞レセプターは、膜結合型免疫グロブリンと、ＩｇαおよびＩｇβと呼ばれる二つのジスルフィド結合糖タンパク質からなるシグナル伝達性ヘテロ二量体とからなる。加えて、ＢＣＲ関連タンパク質（ＢＡＰ）が記載されている。
【００４７】
ＢＣＲの発現は、Ｂ細胞の発生、選択および生存に重要である。これらの過程は、Ｉｇα／Ｉｇβヘテロ二量体によるＢＣＲシグナル伝達に依存する。これらの分子の細胞質ドメインは、数個のチロシン残基がいわゆるＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）に集合したものを有する配列モチーフを保持し、このＩＴＡＭは、ＢＣＲがトリガーされるとリン酸化される。
【００４８】
遺伝子ターゲティング実験から、Ｉｇα／Ｉｇβヘテロ二量体の細胞質ドメインがＢ細胞の発生に重大であることが示された。Ｉｇα／Ｉｇβヘテロ二量体により伝達されるシグナルは、発生途中のＢ細胞の正の選択および負の選択との両方に関与する。
【００４９】
膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）分子は、ホモ二量体を形成している２本の重鎖および２本の軽鎖からなり、各軽鎖は重鎖の１本に共有結合している。Ｎ末端で重鎖はＶＨドメインを保持し、アイソタイプに応じて、このＶＨドメインに４個（ＩｇＭ、ＩｇＥ）、３個（ＩｇＧ、ＩｇＡ）または２個（ＩｇＤ）のＣドメインが続く。抗原結合部位は、ＶＨ：ＶＬ対の超可変領域により形成される。したがって、各ｍＩｇ分子は二つの抗原結合部位を有する。
【００５０】
ｍＩｇＭ分子は、分泌型ＩｇＭが１０個の潜在的抗原結合部位を有する五量体を形成する点で分泌型ＩｇＭと異なる。五量体化は、分泌されたμｓ鎖のＣ末端部分の配列により制御される。この部分はアミノ酸２２個からなり、膜結合型μｍ鎖に存在せず、その代わりに、Ｍ１およびＭ２エキソンによりコードされるＣ末端アミノ酸４８個を保持する。
【００５１】
この配列のμｍ特異的部分は、ＩｇＭ分子全体のうち最も進化的に保存されている部分である。この部分は、マウス、ウサギおよびヒトｍＩｇＭの間でほぼ同一であり、この保存は、マウスをサメｍＩｇＭと比べてもなお明白である。ｍＩｇＭのＣ末端配列をマウスの他のｍＩｇアイソタイプのＣ末端配列と比べた場合にもまた、アミノ酸の保存が明らかである。この発見は、保存された膜貫通アミノ酸がＨ鎖ホモ二量体において相互に相互作用するか、またはＩｇαおよびＩｇβサブユニットと相互作用するかのいずれかであるという証拠を提供する。
【００５２】
ＩｇαおよびＩｇβの両方は、アミノ酸２２個の膜貫通セグメントに続き、チロシン残基数個を有するアミノ酸約４０〜７０個のＣ末端細胞質尾部を有する。Ｎ末端では、両タンパク質はリーダーペプチドに続いて細胞外ドメインを保持し、細胞外ドメインは、システイン残基、トリプトファン１個、およびＩｇスーパーファミリーのタンパク質にみられる他の保存されたアミノ酸数個を有する。これは、ＩｇαおよびＩｇβサブユニット両方の細胞外部分がＩｇ様ドメインを形成することを示唆している。ドメイン内ジスルフィド結合を形成するシステイン以外に、ＩｇαおよびＩｇβ配列は追加のシステインを有し、このシステインは、ＩｇαとＩｇβサブユニットの間で鎖間ジスルフィド結合をおそらく形成する。
【００５３】
マウスおよびヒトＩｇα配列の間の比較から、Ｉｇドメインおよび鎖間結合の情報に重要な全ての残基が、二つの種のＩｇαの間で保存されていることが示される。しかし、この比較は、細胞外部分の配列保存がわずか約５６％に達するが、膜貫通部および細胞質尾部はそれぞれ１００％および８７％の保存を示す。後者は、分子のＣ末端部分内の残基の重要性を反映している。
【００５４】
ｍＩｇＭ分子とＩｇα／Ｉｇβヘテロ二量体との集合は、ｍＩｇＭの表面発現に必要である。この必要性は、μｍ鎖の膜貫通部分の突然変異により無効にすることができる。例えば、μｍ鎖の膜貫通部位からＨ−２ＫK分子の膜貫通部分への交換は、Ｉｇα／Ｉｇβに依存せずにｍＩｇＭの表面発現を招く。これらのデータは、μｍの膜貫通領域がμｍ鎖とＩｇα／Ｉｇβヘテロ二量体との間の特異的相互作用に必要なことを実証している。加えて、Ｂ細胞は、ＥＲからの、膜貫通タンパク質複合体の単一構成要素または不完全に集合した構成要素の輸送を阻害する制御メカニズムを有する。
【００５５】
ＢＣＲの膜貫通部分は、ＢＣＲ複合体の形成に必要となる、おそらく最も重要な構造であり、ＩｇαおよびＩｇβの細胞外Ｉｇドメインもまた、ｍＩｇＭ分子の結合に役割を果たすことが示唆されている。例えば、マウスＩｇαを発現しないマウス細胞系Ｊ５５８Ｌμｍでは、Ｉｇα導入遺伝子を用いたトランスフェクションにより、ｍＩｇＭの表面発現が回復する。関心対象には、マウスＩｇα遺伝子を用いたトランスフェクションは、ヒトＩｇα遺伝子を用いたトランスフェクションに比べて１０倍高い発現を招いた。このデータは、Ｉｇαの細胞外ドメインが追加的にｍＩｇＭの細胞外部分と相互作用しうることを示唆している。他方で、ヒト免疫グロブリンローカスを有するトランスジェニックマウスは、実際にヒト免疫グロブリンを発現する。トランスジェニック非ヒト動物におけるＢ細胞の発生、Ｂ細胞の生存またはヒト（化）ｍＩｇＭの発現がヒト（化）ｍＩｇＭ遺伝子を保持するＢ細胞でのヒトＩｇαおよび／またはヒトＩｇβの同時発現により影響されるかどうかは不明なままである。
【００５６】
加えて、クローニングおよびシーケンシングされたが、機能が未知のままであるいくつかのＢＣＲ関連タンパク質（ＢＡＰ）がある。これらのタンパク質はＢＣＲと関連するにもかかわらず、ＢＣＲの構成要素としてのその役割は疑われている。そのうえ、ＢＡＰの遍在性発現および強い進化上の保存は、可能性があることには一般的な細胞過程にこれらが重要な役割を果たすに違いないことを示唆しており、いくつかの推定上の機能が提案されている。例えば、これらのタンパク質は、ＢＣＲから細胞骨格への結合または小胞輸送の制御に関与しうる。最後に、これらはシャペロンとして機能して膜貫通タンパク質のフォールディングおよび集合を助けると提案されている。
【００５７】
関連文献
Ｂ細胞レセプター、その構成要素、および五つの免疫グロブリンクラスとのその関連は、Wienands et al., EMBO J. 9(2): 449-455 (1990)、Venkitaraman et al., Nature 352: 777-781 (1991)、Herren et al., Immunologic Res. 26(1-3): 35-43 (2002)に記載されている。ＢＣＲ関連タンパク質は、Adachi et al., EMBO J 15(7): 1534-1541 (1996)およびSchamel et al., PNAS 100(17): 9861-9866 (2003)に記載されている。Ｂ細胞の発生および生存にＢ細胞レセプターが及ぼす影響は、Reth, Annual Reviews of Immunology 10: 97-121 (1992)、Kraus et al., Cell 117(6): 787-800 (2004)、Sayegh et al., Immunological Reviews 175: 187-200 (2000)、Reichlin et al., Journal of Experimental Medicine 193(1): 13-23 (2001)、Pike et al., Journal of Immunology 172: 2210-2218 (2004)、Pelanda et al., Journal of Immunology 169: 865-872 (2002)により記載されている。ＢＣＲシグナル伝達のレギュレーションならびにＢ細胞の発生およびアポトーシスにおけるその影響は、Cronin et al., J. Immunology 161 : 252-259 (1998)、Muller et al., PNAS 97 (15): 8451-8454 (2000)、Cragg et al., Blood 100: 3068-3076 (2002)、Wang et al., J. Immunology 171 : 6381-6388 (2003)、Fuentes-Panana et al., J. Immunology 174: 1245-1252 (2005)に記載されている。上に引用した参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５８】
したがって、本発明は、特にトランスジェニック動物の、Ｂ細胞にヒト（化）Ｉｇαおよび／またはヒト（化）Ｉｇβを同時発現させるための方法を対象とし、この方法は、このようなトランスジェニック動物に多様化したヒト（化）抗体レパートリーを産生させ、Ｂ細胞の生存を改善することができる。動物の種類には、ウサギ、トリ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバなどの比較的大型の非ヒト動物が挙げられる。これらの動物がＩｇトランスローカスを発現する場合には、動物の大きさが比較的大きいことから、その抗体収率もまた比較的大きいはずである。したがって、本発明は、Ｂ細胞の発生および生存の増強により比較的多量のヒト（化）免疫グロブリンを産生する比較的大型の創始動物を創出することを目的とする。
【００５９】
したがって、本発明は、下にさらに定義するような完全長ヒトＩｇαおよびＩｇβポリペプチドをコードする導入遺伝子構築物、またはキメラもしくはヒト化Ｉｇαポリペプチドおよびキメラもしくはヒト化Ｉｇβポリペプチドをコードするキメラ導入遺伝子構築物を対象とする。
【００６０】
「ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβポリペプチドをコードする導入遺伝子または導入遺伝子構築物」により、それぞれネイティブな完全長ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ ＤＮＡ配列、ならびにＩｇαまたはＩｇβの機能的に等価のポリペプチドをコードするが、コドン縮重に基づき異なるＤＮＡ配列を有する任意の変異型のコドン最適化ＤＮＡ配列を意味する。この概念をさらに下に詳細に論じる。ネイティブな完全長ヒトＩｇαポリペプチド配列は、配列番号１（図１）に定義されている。ネイティブな完全長ヒトＩｇβポリペプチド配列は配列番号７（図１）に定義されている。
【００６１】
「キメラまたはヒト（化）Ｉｇαをコードする核酸分子または導入遺伝子または導入遺伝子構築物」もまた本明細書に参照される。「キメラＩｇα」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えばラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇαポリペプチド配列を表し、ここで、Ｉｇαポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇαポリペプチドからの一つもしくは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇαバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇα配列由来の、または所与のＩｇα配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇα配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。「キメラＩｇα」および「ヒト（化）Ｉｇα」という用語は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。細胞内および／または膜貫通ドメイン配列を得ることができる非ヒトＩｇαポリペプチド配列には、例えばウシ（配列番号２）；マウス（配列番号３）；イヌ（配列番号４）；霊長類（配列番号５）；ウサギ（配列番号６）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００６２】
「キメラまたはヒト（化）Ｉｇβをコードする核酸分子または導入遺伝子または導入遺伝子構築物」もまた本明細書に参照される。「キメラＩｇβ」サブユニットまたはタンパク質またはポリペプチドは、動物（例えばラット、マウス、ヒト、ウサギ、ニワトリなど）由来のＩｇβポリペプチド配列を表し、ここで、Ｉｇβポリペプチドの一つまたは複数のドメインは、別の動物または種の、異なるＩｇβポリペプチド由来の一つもしくは複数の対応するドメインに、あるいは異なるアレルＩｇβバージョン由来の、または一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する変異型Ｉｇβ配列由来の、または所与のＩｇβ配列の対応するドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異型Ｉｇβ配列由来の一つまたは複数の対応するドメインに交換されている。用語「キメラＩｇβ」および「ヒト（化）Ｉｇβ」は、本明細書にわたり相互交換可能に使用される。細胞内および／または膜貫通ドメイン配列を得ることができる非ヒトＩｇβポリペプチド配列には、例えばイヌ（配列番号８）；ラット（配列番号９）；ウシ（配列番号１０）；マウス（配列番号１１）；ニワトリ（配列番号１２）または他の非ヒト配列が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００６３】
したがって、簡潔にはキメラＩｇαまたはＩｇβ導入遺伝子は、１）ヒトＩｇαまたはＩｇβの細胞外ドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列、ならびに２）宿主トランスジェニック動物由来のＩｇαまたはＩｇβの膜貫通および細胞内ドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる。
【００６４】
さらなる態様では、本発明は、２００３年１月２３に公開された米国特許公報第２００３−００１７５３４号および２００６年２月２日に公開された米国特許公報第２００６−００２６６９６号として現在入手することのできる、以前に提出された米国出願（これらの開示は、本明細書によりその全体が参照により組み入れられる）に記載されているような、ヒト（化）免疫グロブリンまたはローカスをコードするトランスジェニック構築物もまた対象にする。それから作製されるトランスジェニック動物、Ｂ細胞または細胞系、およびそこに開示される関連方法論もまた、本発明の局面を形成する。
【００６５】
上に言及した局面の代替アプローチでは、本発明は、１９９６年８月に発行された米国特許第５，５４５，８０６号；１９９６年８月に発行された米国特許第５，５４５，８０７号および１９９６年１０月に発行された米国特許第５，５６９，８２５号、２００６年６月２０日に発行された米国特許第７，０６４，２４４号；またはＰＣＴ公報ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ０２／１２４３７、ならびに米国特許第５，８１４，３１８号および第５，５７０，４２９号に記載されているような、ヒト（化）免疫グロブリンまたはＩｇ鎖もしくはローカスをコードするトランスジェニック構築物もまた対象にするが、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)；Pluschke et al., Journal of Immunological Methods 215: 27-37 (1998)；Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989)；Lonberg et al., Int. Rev. Immunol. 13(l):65-93 (1995)；およびBruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8(4): 455-8 (1997)；およびKuroiwa et al., Nature Biotech 20(9): 889-894 (2002)もまた参照されたく、これらの開示は、その全体が本明細書により参照により組み入れられる。それから作製されるトランスジェニック動物、Ｂ細胞または細胞系、およびそこに開示される関連方法論もまた、本発明の局面を形成する。
【００６６】
導入遺伝子または導入遺伝子構築物は、多様な技法により動物のゲノムに導入することができ、その技法には、前核のマイクロインジェクション、トランスフェクション、核移植クローニング、精子介在性遺伝子導入、精巣介在性遺伝子導入などが挙げられる。
【００６７】
一態様では、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子は、免疫特異的プロモーター、好ましくはＢ細胞特異的プロモーターによりトランスジェニック動物のＢ細胞に好ましくは発現される。このヒトＩｇαまたはＩｇβ遺伝子発現は、好ましくはＢ細胞のみの中で起こり、Ｂ細胞発生の増強および非ヒトトランスジェニック動物の生存をもたらす。「Ｂ細胞特異的プロモーター」により、Ｂ細胞に発現する遺伝子の発現を通常制御する、任意のＢ細胞特異的遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列および／またはその変異体もしくは操作された部分を意味し、その例には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ（Ｂ２９またはＩｇβとしても知られている）、ｍｂ−１（Ｉｇαとしても知られている）、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリンκ軽鎖、免疫グロブリンλ軽鎖、免疫グロブリンＪ鎖などのプロモーター／エンハンサーが挙げられるが、それに限定されるわけではない。好ましい態様では、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはκ軽鎖のプロモーター／エンハンサーは、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子のＢ細胞特異的発現を推進する。
【００６８】
なお別の態様では、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子をコードする核酸分子を含む導入遺伝子構築物は、外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖導入遺伝子ローカスを含む導入遺伝子構築物と共に同時発現される。この態様では、Ｉｇ導入遺伝子ローカスとヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子との両方が、同一のトランスジェニック発現ベクター上に存在することもあり、二つの異なるトランスジェニック発現ベクター上に存在することもある。後者の場合、二つのトランスジェニック発現ベクターを、同時または連続的のいずれかで非ヒトトランスジェニック動物に導入してもよい。
【００６９】
本発明によると、ＩｇαまたはＩｇβのヒト完全長または細胞外ドメイン単独の変異体が本明細書に包含される。これにより、遺伝コードの縮重を見込んだ核酸配列、機能的に等価な残基のアミノ酸置換を含むポリペプチド配列をコードする核酸配列および／または細胞外ドメインの機能性を高める突然変異が意味される。「細胞外ドメインの機能性」には、シグナル伝達可能なＢＣＲの形成が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００７０】
遺伝コードの縮重を見込むことにより、本発明はヒトＩｇαおよびヒトＩｇβの細胞外ポリペプチド配列と少なくとも約７０％、さらに通常には約８０〜８５％。好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約９５％の配列同一性を有する配列を包含する。
【００７１】
生物学的に機能的に等価という用語は、当技術分野において十分に了解されており、さらに本明細書に詳細に定義される。したがって、アミノ酸レベルで約７０％〜約８０％、またはさらに好ましくは約８１％〜約９０％、またはなおいっそう好ましくは約９１％〜約９９％の同一性を有する配列は、そのタンパク質の生物学的活性が維持されるならば、ヒトＩｇαおよびＩｇβに機能的に等価であるとみなされる。
【００７２】
機能的に等価なコドンという用語は、本明細書においてアルギニンまたはセリンについての六つのコドンなどの、同一のアミノ酸をコードするコドンを表すために使用され、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンもまた表す。
【００７３】
以下は、等価の第二世代分子または改良までもされている第二世代分子を創出するための、タンパク質のアミノ酸変更に基づく考察である。例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの、構造に伴う相互作用性結合能をあまり損失せずに、例えばタンパク質構造中のある種のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することができる。タンパク質の生物学的機能的活性を規定するのがタンパク質の相互作用能および性質であることから、ある種のアミノ酸置換をタンパク質配列および基礎となるＤＮＡコード配列に加え、それでもなお類似の特性を有するタンパク質を産生させることができる。したがって、下に論じるように遺伝子の生物学的有用性も活性もあまり損失せずに、その遺伝子のＤＮＡ配列に様々な変更を加えられることが、本発明者らにより考えられている。
【００７４】
このような変更を加えるときに、アミノ酸のハイドロパシー指標もまた考慮することができる。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する上でのハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に了解されている（Kyte & Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー性は、結果として生じるタンパク質の二次構造の一因となり、それが、次にはタンパク質と、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原などの他の分子との相互作用もまた規定すると受け入れられている。
【００７５】
類似のアミノ酸の置換は親水性に基づき効果的に行うことができることもまた、当技術分野において了解されている。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接アミノ酸の親水性により支配される、タンパク質の最大局所平均親水性が、そのタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、アミノ酸残基に以下の親水性値が割り付けられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±０．１）、グルタミン酸（＋３．０±０．１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±０．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。
【００７６】
アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のものに置換してもなお、生物学的に等価で、かつ免疫学的に等価のタンパク質を産生できることが了解されている。このような変更では、親水性値が±０．２以内のアミノ酸置換が好ましく、±０．１以内のものが特に好ましく、±０．０５以内のものがなおいっそう特に好ましい。
【００７７】
本明細書に概略するように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮する置換の例は当業者に周知であり、それらには、アルギニンおよびリシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【００７８】
本発明によりポリペプチドを調製するための別の態様は、ペプチド模倣体の使用である。模倣体は、タンパク質二次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である（Johnson 1993）。ペプチド模倣体の使用の基礎となる原理は、タンパク質のペプチド主鎖が、抗体および抗原の分子相互作用のような分子相互作用を促進する方法で、主にアミノ酸側鎖を配向させるために存在することである。ペプチド模倣体は、自然分子に類似した分子相互作用を許すと考えられる。これらの原理を上に概要した原理と共に使用して、変化および改良された特徴と共に、ヒトＩｇαまたはＩｇβの自然特性の多くを有する第二世代分子を操作することができる。
【００７９】
したがって、ヒトＩｇαまたはＩｇβ、およびヒトＩｇαまたはＩｇβの機能的に等価なポリペプチドをコードする変異型核酸配列は、本発明に有用である。
【００８０】
関心対象の遺伝子を有するトランスジェニックベクターは、一つもしくは複数のレシピエント細胞に導入し、次にランダム組み込みまたはターゲティングした組み込みにより一つまたは複数のレシピエント細胞のゲノムに組み込むことができる。
【００８１】
ランダム組み込みのために、標準的なトランスジェニック技法によりヒトＩｇαまたはＩｇβを有するトランスジェニックベクターを動物レシピエントに導入することができる。例えば、トランスジェニックベクターは、受精した卵母細胞の前核に直接注射することができる。トランスジェニックベクターは、卵母細胞の受精前に精子をトランスジェニックベクターと共インキュベーションすることによってもまた導入することができる。トランスジェニック動物は、受精した卵母細胞から発育させることができる。トランスジェニックベクターを導入する別の方法は、胚性幹細胞にトランスフェクションし、続いて発生途中の胚に遺伝子改変胚性幹細胞を注射することによる。または、トランスジェニックベクター（ネイキッドで、または促進試薬と共に）を発生途中の胚に直接注射することができる。最後に、ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子がトランスジェニック動物の少なくとも一部の体細胞のゲノムに組み込まれたものを有する胚からキメラトランスジェニック動物を産生させる。
【００８２】
特定の態様では、ヒトＩｇαまたはＩｇβを有する導入遺伝子を、内因性ＩｇαまたはＩｇβの発現障害を有する動物系統由来のレシピエント細胞（例えば、受精した卵母細胞または発生途中の胚）のゲノムにランダムに組み込む。このような動物系統の使用は、ヒト（化）トランスジェニックＩｇローカスからの免疫グロブリン分子の優先的発現を許す。または、ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβの発現障害を有する動物系統と交配させることができる。障害Ｉｇαおよび／またはＩｇβならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβについてホモ接合性の子孫を得ることができる。または、アンチセンス技法、細胞内抗Ｉｇαおよび／またはＩｇβの発現などを使用して、内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβの発現を阻害または低下させることができる。一態様では、宿主動物のＩｇαおよび／またはＩｇβの内因性産生をノックダウンするためのえり抜きの方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）法であり、この方法は、細胞内ホスト動物Ｉｇαおよび／またはＩｇβ核酸配列を有するＢ細胞に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＮＡ）またはさらに好ましくは短鎖または小分子干渉性ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）のいずれかを導入する。これは、Invitrogen CorpからのBlock iT（商標）またはStealth（商標）ＲＮＡキットを非限定的に含む市販のキットを使用して実現することができる。
【００８３】
ターゲティングした組み込みのために、トランスジェニックベクターは、胚性幹細胞またはすでに分化した体細胞などの適切な動物レシピエント細胞に導入することができる。その後、導入遺伝子が動物ゲノムに組み込まれ、相同組換えにより対応する内因性遺伝子を交換された細胞を、標準的な方法により選択することができる（例えば、Kuroiwa et al., Nature Genetics 2004, June 6を参照されたい）。次に、選択された細胞を、除核された核移植ユニット細胞、例えば卵母細胞または胚性幹細胞と融合させることができ、このユニット細胞は全能性であり、機能的新生仔を形成することができる。十分に確立された通例技法により融合を行う。卵母細胞の除核および核移植は、注入ピペットを使用した顕微手術によってもまた行うことができる（例えば、Wakayama et al., Nature (1998) 394:369を参照されたい）。次に、結果として生じた卵子を適切な培地中で培養し、トランスジェニック動物を作製するために同期化したレシピエントに移植する。または、発生途中の胚に選択された遺伝子改変細胞を注射して、この胚を続いてキメラ動物に発育させることができる。
【００８４】
さらに、本発明により、本明細書上記の一つまたは複数の組換えベクター（その一つは、内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントのフランキング配列に相同な５’および３’フランキング配列に連結したヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントを保持する）を一つまたは複数のレシピエント細胞に導入し、次に相同組換えにより内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントをヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントに交換された細胞を選択し、選択された一つまたは複数の遺伝子改変レシピエント細胞から動物を得ることによってもまた、ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβを産生することのできるトランスジェニック動物を製造することができる。
【００８５】
トランスジェニックベクターのターゲット挿入に類似して、この手順でレシピエント細胞として使用するために適した細胞には、胚性幹細胞またはすでに分化した体細胞が挙げられる。ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントを保持する組換えベクターは、任意の実行可能な手段、例えばトランスフェクションによりこのようなレシピエント細胞に導入することができる。その後、相同組換えにより、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントが、対応する内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子セグメントの代わりに置き換わった細胞を標準的な方法により選択することができる。これらの遺伝子改変細胞は、トランスジェニック動物をクローニングするための核移植手順において核ドナー細胞として役立つことができる。または、選択された遺伝子改変胚性幹細胞を発生途中の胚に注射することができ、続いてその胚をキメラ動物に発育させることができる。
【００８６】
具体的な態様では、本発明の導入遺伝子構築物は、胚に導入遺伝子を直接注射することにより、または妊娠した母親もしくは産卵期のメンドリに導入遺伝子を注射することにより間接的に、胚期のトランスジェニック動物に導入することができる。前記方法のうち任意のものにより産生されるトランスジェニック動物は、本発明の別の態様を形成する。トランスジェニック動物は、ゲノムに少なくとも一つ、すなわち一つまたは複数のヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子を有し、この動物から機能的ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβタンパク質を産生させることができる。
【００８７】
さらに、本発明の導入遺伝子構築物、すなわちヒトまたはヒト化Ｉｇαおよび／またはＩｇβ導入遺伝子ならびにヒト化免疫グロブリン導入遺伝子は、内因性Ｉｇならびに内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβノックアウトのうち一つまたはさらに好ましくはその両方のいずれかのノックアウトバックグラウンドに対して好ましくは発現される。したがって、本発明のトランスジェニック動物は、ヒト（化）Ｉｇローカスを再編成することができ、実質的に減少した内因性Ｉｇ発現ならびにさらに好ましくは実質的に減少した内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβを同様に有するバックグラウンドに対してヒト（化）抗体の機能的レパートリーを効率的に発現することができる。この文脈では、「実質的に」により、内因性Ｉｇの発現単独または追加的に内因性Ｉｇαおよび／もしくはＩｇβの発現のいずれかの内因性産生の程度が、好ましくは少なくとも約３０％〜４９％、またはさらに好ましくは少なくとも約５０％〜７９％、またはなおさらに好ましくは少なくとも約８０〜８９％、または最も好ましくは約９０〜１００％だけ減少していることを意味する。
【００８８】
本発明は、ヒト（化）Ｉｇローカスを再編成および遺伝子変換することができ、ヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することができる一つまたは複数のヒト（化）Ｉｇローカスならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβを発現するトランスジェニックウサギを提供する。好ましくは追加的に、これらのウサギは、実質的な量の機能的内因性ウサギ免疫グロブリンも、機能的内因性ウサギＩｇαおよび／またはＩｇβも産生しない。
【００８９】
本発明は、一つまたは複数のヒト（化）Ｉｇローカスならびにヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβを発現する鳥類、げっ歯類およびウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウマなどの農用動物を非限定的に含む比較的大型のトランスジェニック動物もまた提供する。また好ましくは、これらの動物は、追加的に実質的な量の機能的内因性免疫グロブリンも機能的内因性Ｉｇαおよび／またはＩｇβも産生しない。したがって、これらのトランスジェニック動物は、ヒト（化）Ｉｇローカスを再編成することができ、ヒト（化）抗体の機能的レパートリーを増大した収率で効率的に発現することができる。
【００９０】
本発明は、ヒト（化）Ｉｇαおよび／またはＩｇβ遺伝子ならびにヒト（化）免疫グロブリンローカスを発現する、上記の異なる種類のトランスジェニック動物から単離されたＢ細胞もまた対象とする。さらに、このようなＢ細胞は、ウイルストランスフォーメーションなどの使用を非限定的に含む公知の通常法を使用して不死化させることができ、当業者はこれを使用することができる。
【００９１】
抗原を用いた免疫処置は、前記トランスジェニック動物に同一抗原に対するヒト（化）抗体の産生をもたらす。
【００９２】
本発明の好ましい態様は、ヒト（化）Ｉｇローカスを有するトランスジェニック動物を対象とするものの、霊長類化Ｉｇローカスおよび霊長類化ポリクローナル抗血清を有するトランスジェニック動物もまた本発明の精神内に属することを了解されたい。ヒト（化）ポリクローナル抗血清組成物と同様に、霊長類化ポリクローナル抗血清組成物は、ヒト個体において減少した免疫原性を有する見込みがある。
【００９３】
多様化したヒト（化）免疫グロブリン分子を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が（下記にさらに示すように）ひとたび製造されれば、抗原に対するヒト（化）免疫グロブリンおよびヒト（化）抗体調製物は、その動物に抗原を免疫処置することにより容易に得ることができる。多様な抗原を使用して、トランスジェニック宿主動物を免疫処置することができる。このような抗原には、生存、弱毒化もしくは死滅した微生物、例えばウイルスおよび単細胞生物（細菌および真菌など）、微生物のフラグメント、またはその微生物から単離された抗原分子が挙げられる。
【００９４】
動物を免疫処置するときに使用するために好ましい細菌抗原には、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来精製抗原、例えば莢膜多糖５および８型、α−毒素などのリコンビナントバージョンの病原性因子、アドヘシン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、ならびにフィブロネクチン結合タンパク質が挙げられる。好ましい細菌抗原には、弱毒化バージョンのS. aureus、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロコッカス、エンテロバクター、およびクラブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）、またはこれらの細菌細胞からの培養上清もまた挙げられる。免疫処置に使用することのできる他の細菌抗原には、Pseudomonas aeruginosa、エンテロコッカス、エンテロバクター、およびKlebsiella pneumoniae由来の精製リポ多糖（ＬＰＳ）、莢膜抗原、莢膜多糖および／またはリコンビナントバージョンの外膜タンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質、エンドトキシン、およびエキソトキシンが挙げられる。
【００９５】
真菌に対する抗体を作製するための好ましい抗原には、弱毒化バージョンの真菌またはその外膜タンパク質が挙げられ、この真菌には、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・パラサイロシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００９６】
ウイルスに対する抗体を作製するための免疫処置に使用するための好ましい抗原には、ウイルスのエンベロープタンパク質および弱毒化バージョンが挙げられ、そのウイルスには、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（特にＦ−タンパク質）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、およびＨＳＶが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００９７】
トランスジェニック動物に単離された腫瘍細胞、腫瘍細胞系、または腫瘍関連抗原を免疫処置することにより、ガンの処置のための治療用抗体を作製することができ、腫瘍関連抗原には、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（これに対する抗体は、乳ガンの治療に有用である）；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ５３抗原（これに対する抗体は、Ｂ細胞リンパ腫の治療に有用である）、（３）前立腺特異膜抗原（ＰＭＳＡ）（これに対する抗体は、前立腺ガンの処置に有用である）、および１７ー１Ａ分子（これに対する抗体は、大腸ガンの処置に有用である）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００９８】
抗原は、アジュバントの存在下または不在下で任意の好都合な方法でトランスジェニック宿主動物に投与することができ、予定されたスケジュールに従って投与することができる。
【００９９】
免疫処置後に、免疫処置されたトランスジェニック動物の血清または乳汁を分画して、抗原に特異的な医薬品等級のポリクローナル抗体の精製に供することができる。トランスジェニックトリの場合、抗体は、卵黄の分画によってもまた製造することができる。濃縮、精製された免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（アフィニティー、イオン交換、ゲルろ過など）、硫酸アンモニウムなどの塩を用いた選択的沈殿、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーにより得ることができる。
【０１００】
分画されたヒト（化）抗体は、ヒトに静脈内投与するために適した無毒性、無発熱性媒質、例えば滅菌緩衝食塩水に溶解または希釈してもよい。
【０１０１】
投与に使用される抗体調製物は、０．１〜１００mg/ml、さらに通常には１〜１０mg/mlの免疫グロブリン濃度を有することにより全般的に特徴付けられる。抗体調製物は、様々なアイソタイプの免疫グロブリンを含有してもよい。または、抗体調製物は、一つのアイソタイプだけの抗体またはいくつかの選択されたアイソタイプを含有してもよい。
【０１０２】
ヒト（化）モノクローナル抗体を製造するために、動物の内因性免疫グロブリンを発現しているＢ細胞が枯渇した、免疫処置されたトランスジェニック動物から脾臓細胞を単離する。単離された脾臓細胞が、ハイブリドーマを産生するためのトランスフォーメーションされた細胞系との細胞融合に使用されるか、または抗体をコードするｃＤＮＡが標準的な分子生物学的技法によりクローニングされ、トランスフェクションされた細胞に発現されるかのいずれかである。モノクローナル抗体を製造するための手順は、当技術分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願０５８３９８０Ａ１（"Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"）、米国特許第４，９７７，０８１号（"Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof"）、ＷＯ９７／１６５３７（"Stable Chicken B-Cell Line And Method of Use Thereof")、およびＥＰ０４９１０５７Ｂ１（"Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G"）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。クローニングされたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生は、Andris-Widhopf et al., "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Immunol Methods 242:159 (2000)およびBurton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995)に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
たいていの場合には、抗体調製物は、未改変免疫グロブリン、すなわち動物から調製された、例えば化学物質または酵素による追加の改変を有さないヒト（化）抗体からなる。または、免疫グロブリン画分は、酵素分解（例えばペプシン、パパイン、プラスミン、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼなどを用いた分解）、加熱などの処理に供し、かつ／またはさらに分画して「抗体フラグメント」を作製することができる。
【０１０４】
本発明には、上に定義した方法により得られる抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物または抗体調製物もまた含まれる。本明細書に使用する「薬学的に許容されうる成分」または「製剤」という用語は、特定の量の請求された活性成分、すなわちヒト（化）抗体または抗体フラグメントを含む産物、および特定の量の特定の活性成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の産物を包含することが意図される。このような用語は、活性成分および担体を構成する不活性成分を含む産物と、任意の二つ以上の成分の組み合わせ、複合体形成もしくは凝集から、または一つもしくは複数の成分の解離から、または一つもしくは複数の成分の他種の反応もしくは相互作用から、直接または間接的に生じる任意の産物とを包含することが意図される。したがって、本発明の「薬学的組成物」は、本発明の任意の活性化合物および薬学的に許容されうる担体を混合することにより製造される任意の組成物を包含する。
【０１０５】
化合物の「投与」または化合物を「投与すること」という用語は、処置を必要とする個体に、任意の製剤中の本発明の任意の活性化合物を提供することを意味することを了解すべきである。
本発明の化合物を投与するための薬学的組成物は、投薬ユニット形態で好都合に提示してもよく、薬剤学の分野で周知の方法により調製してもよい。使用に適した方法および担体は、当技術分野で十分に説明されたもの、例えばRemington, The Science and Practice of Pharmacy, ed. Gennaro et al., 20th Ed. (2000)に説明されたものであるものの、免疫学分野の専門家は、他の方法が公知であり、本発明の組成物の調製に適することを容易に認識している。全ての方法は、活性成分を、一つまたは複数の補助成分を構成する担体と関連させるステップを含む。全般に、薬学的組成物は、活性成分を、液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方と均一および密接に関連させ、次に必要に応じてその産物を所望の製剤に形作ることにより調製される。薬学的組成物において、活性成分は、疾患の過程または状態に所望の効果を生じるために十分な、上に論じた有効量で含められる。さらに、抗体分子の持続性長時間放出のための製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、この方法は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
したがって、上記方法を使用して作製されるトランスジェニック構築物、導入遺伝子構築物を含むベクターおよびトランスジェニック動物は、全て本発明の態様である。
【０１０７】
以下の実施例により本発明をさらに例証するが、本発明はこの実施例により決して限定されることはない。
【０１０８】
実施例１
ヒトＩｇαおよびＩｇβを用いたウサギＢ細胞系のトランスフェクション
ウサギＢ細胞におけるヒトｍＩｇＭの発現にヒトＩｇαおよびＩｇβが及ぼす効果を実証するために、ヒトＩｇαもしくはＩｇβまたはヒトｍＩｇＭをコードする発現ベクターをこの細胞にトランスフェクションする。
【０１０９】
ヒトＩｇαおよびヒトＩｇβおよびヒトＩｇＭをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングする。
【０１１０】
不死化ウサギＢ細胞系に発現ベクターをトランスフェクションし、ネオマイシン存在下の培地中で培養し、安定トランスフェクタントの選択に供する。ヒトＩｇＭならびにヒトＩｇαおよび／またはＩｇβに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーにより耐性細胞を分析する。ヒトＩｇＭをコードする発現ベクターを用いたウサギＢ細胞のトランスフェクションは、ヒトＩｇＭの低い細胞表面発現を招く。ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβを用いた同時トランスフェクションは、ヒトｍＩｇＭの高い細胞表面発現を招く。これは、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβがヒト（化）またはキメラｍＩｇＭの高い細胞表面発現に必要かつ十分であるであることを実証している。
【０１１１】
実施例２
ヒトＩｇαおよびＩｇβを用いた任意の動物由来Ｂ細胞系のトランスフェクション
動物由来Ｂ細胞におけるヒトｍＩｇＭの発現にヒトＩｇαおよびＩｇβが及ぼす効果を実証するために、ニワトリ（ＤＴ４０）、ウシおよびブタ由来Ｂ細胞に、ヒトＩｇαもしくはＩｇβまたはヒトｍＩｇＭをコードする発現ベクターをトランスフェクションする。
【０１１２】
不死化Ｂ細胞系に発現ベクターをトランスフェクションし、ネオマイシン存在下の培地中で培養し、安定トランスフェクタントの選択に供する。ヒトＩｇＭならびにヒトＩｇαおよび／またはＩｇβに特異的な抗体を使用したフローサイトメトリーにより耐性細胞を分析する。ヒトＩｇＭをコードする発現ベクターを用いたウサギＢ細胞のトランスフェクションは、ヒトＩｇＭの低い細胞表面発現を招く。ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβを用いた同時トランスフェクションは、ヒトｍＩｇＭの高い細胞表面発現を招く。これは、ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβがヒト（化）またはキメラｍＩｇＭの高い細胞表面発現に必要かつ十分であるであることを実証している。
【０１１３】
実施例３
ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβの存在下または不在下でヒト化免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖導入遺伝子を発現するトランスジェニックウサギ
Fanら（Pathol. Int. 49: 583-594, 1999）により記載されるようにトランスジェニックウサギを作製した。簡潔には、標準法を使用して雌ウサギから過剰排卵させ、雄ウサギと交配させた。前核段階の接合子を輸卵管から集め、２０％ウシ胎仔血清を補充したDulbeccoリン酸緩衝食塩水などの適切な培地に入れた。一対のマニピュレーターの助けを借りて、外因性ＤＮＡ（例えばヒト（化）免疫グロブリンローカスまたはヒトＩｇαもしくはヒトＩｇβを有する発現ベクター）を前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している接合子を偽妊娠ウサギの輸卵管に移植した。偽妊娠は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の注射により誘導した。注射された接合子の約０．１〜１％が生きたトランスジェニックウサギに発育した。ゲノムへの導入遺伝子の組み込みは、ＰＣＲおよびＦＩＳＨにより確認した。
【０１１４】
トランスジェニック創始ウサギの血清中にヒトＩｇＧおよび／またはヒトκ軽鎖抗原決定基を有する抗体が存在することは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判定した。Ｂ細胞表面での抗体発現は、フローサイトメトリーにより分析した。ヒト（化）免疫グロブリン重鎖ローカスをコードする導入遺伝子を有するウサギは、１〜１０ug/mlのヒトＩｇＭを発現した。若い動物（６〜９週齢）は１００〜４０００ug/mlのヒトＩｇＧを発現した。しかし、ヒトＩｇＧの発現は、１０〜１００ｕｇ／ｍｌのレベルに急速に低下した。末梢血中のＢ細胞のフローサイトメトリー分析は、少数のヒトｍＩｇＭ＋細胞（１〜２％）が存在することを明らかにした。若いウサギの虫垂は、最大１０％のヒトｍＩｇＭ＋細胞を含有したが、これは齢と共に急速に消滅した。
【０１１５】
ヒトＩｇαおよび／またはＩｇβをコードする導入遺伝子の導入は、血清中に１００〜２０００ug/mlのヒト（化）ＩｇＭの発現および２０００〜１２０００ug/mlのヒト（化）ＩｇＧの安定発現を招く。虫垂では、３０〜７０％のリンパ球がヒト（化）ｍＩｇＭ＋である。末梢血では、等しい数のＢ細胞がウサギおよびヒト（化）ｍＩｇＭまたはｍＩｇＧを発現する。
【０１１６】
本開示にわたり引用された全ての参考文献は、そこに引用された参考文献と共に、本明細書より参照により明白に組み入れられる。
【０１１７】
本発明を特定の態様を参照することにより例示するが、本発明はそれに限定されない。当業者は、様々な改変を容易に利用することができ、本発明が役立つ方法に実質的な変更を加えずに実施できることを了解しているものである。このような全ての改変は、本明細書に請求される本発明の範囲内に属することが具体的に意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＲのキメラＩｇαサブユニットをコードする導入遺伝子構築物であって、該キメラＩｇαサブユニットが、
（ａ）非ヒトＩｇαポリペプチド配列の細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列；ならびに
（ｂ）配列番号１のヒトＩｇαの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド
を含む導入遺伝子構築物。
【請求項２】
ＢＣＲのキメラＩｇβサブユニットをコードする導入遺伝子構築物であって、該キメラＩｇβサブユニットが、
（ａ）非ヒトＩｇβサブユニットの細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列；ならびに
（ｂ）配列番号７のヒトＩｇβの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド
を含む導入遺伝子構築物。
【請求項３】
非ヒトＩｇαポリペプチド配列に、ウシ（配列番号２）、マウス（配列番号３）、イヌ（配列番号４）、霊長類（配列番号５）、ウサギ（配列番号６）または他の非ヒト配列が含まれる、請求項１記載の導入遺伝子構築物。
【請求項４】
非ヒトＩｇβポリペプチド配列に、イヌ（配列番号８）、ラット（配列番号９）、ウシ（配列番号１０）、マウス（配列番号１１）、ニワトリ（配列番号１２）または他の非ヒト配列が含まれる、請求項２記載の導入遺伝子構築物。
【請求項５】
（ａ）配列番号１の完全長ヒトＩｇαサブユニットもしくは請求項１記載のキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／または
（ｂ）配列番号７の完全長ヒトＩｇβサブユニットもしくは請求項２記載のキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、ならびに
（ｃ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物
を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、結果として生じる導入遺伝子産物が組み合わされてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
任意の内因性Ｉｇ産生ならびに／またはＩｇαおよび／もしくはＩｇβサブユニットの発現が、実質的に減少している、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、ウマ、ロバおよびウシからなる群より選択される、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
ウサギである、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
抗体または抗体フラグメントのいずれかである、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１０】
抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１１】
抗体フラグメントがポリクローナルまたはモノクローナル抗体のフラグメントである、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１２】
抗体または抗体フラグメントがラベルされている、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１３】
抗体または抗体フラグメントが、毒素と融合されて免疫毒素を形成するか、または治療剤と結合される、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１４】
抗体または抗体フラグメントが、異種アミノ酸配列と融合される、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１５】
抗体フラグメントが、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2フラグメントである、請求項１１記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１６】
ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかおよび／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれか、ならびにヒト（化）免疫グロブリンローカスを発現する、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の単離されたＢ細胞。
【請求項１７】
不死化されている、請求項１６記載の単離されたＢ細胞。
【請求項１８】
Ｂ細胞がウサギ由来である、請求項１６または１７記載の単離されたＢ細胞。
【請求項１９】
請求項９記載の抗体または抗体フラグメントを含む抗体調製物。
【請求項２０】
薬学的に許容されうる成分との混合物中の、請求項１９記載の抗体調製物を含む薬学的組成物。
【請求項２１】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
一つまたは複数のポリクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
非ヒト動物においてヒト（化）抗体を産生させるための方法であって、以下：
（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物に導入し、そして発現させること；
（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物に導入し、そして発現させること；
（ｃ）該動物を抗原刺激に供すること；ならびに
（ｄ）該動物からヒト（化）抗体を単離すること
を含む方法。
【請求項２４】
抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２５】
抗体フラグメントがポリクローナルまたはモノクローナル抗体のフラグメントである、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２６】
抗体または抗体フラグメントがラベルされている、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２７】
抗体または抗体フラグメントが毒素と融合されて免疫毒素を形成するか、または治療剤と結合される、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２８】
抗体または抗体フラグメントが、異種アミノ酸配列と融合される、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２９】
ヒト（化）抗体を発現する非ヒト動物を産生させるための方法であって、
（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物のＢ細胞に導入し、そして発現させること；ならびに
（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物に導入し、そして発現させること
を含み、ここで結果として生じる導入遺伝子産物が組み合わされてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成する、方法。
【請求項３０】
請求項２７記載のヒト（化）抗体を発現する非ヒト動物を産生させるための方法であって、該動物が、遺伝子変換および／または体細胞超突然変異により抗体多様性を創出する方法。
【請求項３１】
動物がウサギである、請求項２７記載のヒト（化）抗体を発現する非ヒト動物を産生させるための方法。
【請求項１】
ＢＣＲのキメラＩｇαサブユニットをコードする導入遺伝子構築物であって、該キメラＩｇαサブユニットが、
（ａ）非ヒトＩｇαポリペプチド配列の細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列；ならびに
（ｂ）配列番号１のヒトＩｇαの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド
を含む導入遺伝子構築物。
【請求項２】
ＢＣＲのキメラＩｇβサブユニットをコードする導入遺伝子構築物であって、該キメラＩｇβサブユニットが、
（ａ）非ヒトＩｇβサブユニットの細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列；ならびに
（ｂ）配列番号７のヒトＩｇβの細胞外ドメインと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド
を含む導入遺伝子構築物。
【請求項３】
非ヒトＩｇαポリペプチド配列に、ウシ（配列番号２）、マウス（配列番号３）、イヌ（配列番号４）、霊長類（配列番号５）、ウサギ（配列番号６）または他の非ヒト配列が含まれる、請求項１記載の導入遺伝子構築物。
【請求項４】
非ヒトＩｇβポリペプチド配列に、イヌ（配列番号８）、ラット（配列番号９）、ウシ（配列番号１０）、マウス（配列番号１１）、ニワトリ（配列番号１２）または他の非ヒト配列が含まれる、請求項２記載の導入遺伝子構築物。
【請求項５】
（ａ）配列番号１の完全長ヒトＩｇαサブユニットもしくは請求項１記載のキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／または
（ｂ）配列番号７の完全長ヒトＩｇβサブユニットもしくは請求項２記載のキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、ならびに
（ｃ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物
を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、結果として生じる導入遺伝子産物が組み合わされてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
任意の内因性Ｉｇ産生ならびに／またはＩｇαおよび／もしくはＩｇβサブユニットの発現が、実質的に減少している、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、ウマ、ロバおよびウシからなる群より選択される、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
ウサギである、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
抗体または抗体フラグメントのいずれかである、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１０】
抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１１】
抗体フラグメントがポリクローナルまたはモノクローナル抗体のフラグメントである、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１２】
抗体または抗体フラグメントがラベルされている、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１３】
抗体または抗体フラグメントが、毒素と融合されて免疫毒素を形成するか、または治療剤と結合される、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１４】
抗体または抗体フラグメントが、異種アミノ酸配列と融合される、請求項９記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１５】
抗体フラグメントが、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2フラグメントである、請求項１１記載の単離されたヒト（化）免疫グロブリン。
【請求項１６】
ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかおよび／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれか、ならびにヒト（化）免疫グロブリンローカスを発現する、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の単離されたＢ細胞。
【請求項１７】
不死化されている、請求項１６記載の単離されたＢ細胞。
【請求項１８】
Ｂ細胞がウサギ由来である、請求項１６または１７記載の単離されたＢ細胞。
【請求項１９】
請求項９記載の抗体または抗体フラグメントを含む抗体調製物。
【請求項２０】
薬学的に許容されうる成分との混合物中の、請求項１９記載の抗体調製物を含む薬学的組成物。
【請求項２１】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
一つまたは複数のポリクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
非ヒト動物においてヒト（化）抗体を産生させるための方法であって、以下：
（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物に導入し、そして発現させること；
（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物に導入し、そして発現させること；
（ｃ）該動物を抗原刺激に供すること；ならびに
（ｄ）該動物からヒト（化）抗体を単離すること
を含む方法。
【請求項２４】
抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２５】
抗体フラグメントがポリクローナルまたはモノクローナル抗体のフラグメントである、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２６】
抗体または抗体フラグメントがラベルされている、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２７】
抗体または抗体フラグメントが毒素と融合されて免疫毒素を形成するか、または治療剤と結合される、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２８】
抗体または抗体フラグメントが、異種アミノ酸配列と融合される、請求項２３記載のヒト（化）抗体を産生させるための方法。
【請求項２９】
ヒト（化）抗体を発現する非ヒト動物を産生させるための方法であって、
（ａ）ネイティブなヒトＩｇαサブユニットもしくはキメラＩｇαサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物、および／またはネイティブなヒトＩｇβサブユニットもしくはキメラＩｇβサブユニットのいずれかをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物のＢ細胞に導入し、そして発現させること；ならびに
（ｂ）ヒト（化）免疫グロブリンローカスをコードする導入遺伝子構築物を該非ヒト動物に導入し、そして発現させること
を含み、ここで結果として生じる導入遺伝子産物が組み合わされてヒト（化）Ｂ細胞レセプター複合体を形成する、方法。
【請求項３０】
請求項２７記載のヒト（化）抗体を発現する非ヒト動物を産生させるための方法であって、該動物が、遺伝子変換および／または体細胞超突然変異により抗体多様性を創出する方法。
【請求項３１】
動物がウサギである、請求項２７記載のヒト（化）抗体を発現する非ヒト動物を産生させるための方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５０２１８８（Ｐ２０１０−５０２１８８Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２６８９３（Ｐ２００９−５２６８９３）
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７１４３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２７９８６
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（５０９０５８０２５）セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＨＵＭＡＮ ＰＯＬＹＣＬＯＮＡＬＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７１４３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２７９８６
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（５０９０５８０２５）セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＨＵＭＡＮ ＰＯＬＹＣＬＯＮＡＬＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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