非分離アッセイ方法
公知の方法に比べて簡略化される特異的な結合反応を含むアッセイ方法が開示される。試料から分析物を捕捉するための特異的結合対のメンバーとして、化学発光を生成することが可能な化合物が、固体支持体に固定される。化学発光化合物を活性化し、特異的結合対のメンバーに結合される活性化剤化合物が過剰に、試料とともに固体支持体に添加される。トリガー溶液の添加によって、活性化剤結合体が特異的に結合している部位で化学発光反応が生じる。検出工程に先立って、過剰の検出標識（活性化剤結合体）の除去も分離も必要としないので、これらのアッセイ方法は非分離アッセイと呼ばれる。該方法は、免疫アッセイ、受容体−リガンドのアッセイ及び核酸のハイブリッド形成アッセイを含む種々の種類のアッセイに適用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００６年５月９日に出願された、本出願人の同時係属中の仮出願番号６０／７９８，８３９に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、既知の方法に比べて簡略化されている特異的な結合反応を含む新規のアッセイ方法に関する。アッセイ方法は、検出工程に先立って過剰の検出標識の除去又は分離を必要としないので、非分離アッセイと呼ばれる。該方法は、免疫アッセイ、受容体／リガンドのアッセイ及び核酸のハイブリッド形成アッセイを含む種々のアッセイに適用可能である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
感受性、動的範囲、堅牢性、幅広い適用性及び自動化への好適性における本質的な利益を保持しながら、アッセイの開発、特に、アッセイの設計を簡略化する免疫アッセイの開発の領域において多大な尽力が費やされている。アプローチの１つは、検出可能に標識されて添加された特異的結合のパートナーの分離を使用しない、いわゆる均質アッセイ法を考案することであった。この種の方法は、結合反応の結果として、作動する又は停止する検出原理を考案することに頼っている。対照的に、均質アッセイ法は、定量する前に、結合した検出可能に標識された特異的結合パートナーと遊離の検出可能に標識された特異的結合パートナーを物理的に分離することに頼っている。
【０００４】
多数の米国特許が、均質酵素免疫アッセイの分野で公表されている。多くは、標識された酵素を活性化する又は阻害するための抗原抗体結合反応を活用する：米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５２，１５７号；同第３，８７５，０１１号；同第３，９６６，５５６号；同第３，９０５，８７１号；同第４，０６５，３５４号；同第４，０４３，８７２号；同第４，０４０，９０７号；同第４，０３９，３８５号；同第４，０４６，６３６号；同第４，０６７，７７４号；同第４，１９１，６１３号；及び同第４，１７１，２４４号、同第４，７８５，０８０号。そのほかの均質免疫アッセイには、抗体又はそのほかの蛍光消光剤を介して蛍光を消す様々な方法が関与する：米国特許第３，９９８，９４３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，１７４，３８４号；同第４，１６１，５１５号；同第４，２０８，４７９号及び同第４，１６０，０１６号。免疫アッセイの類別型のこの分野におけるさらにそのほかの米国特許には、米国特許第３，９３５，０７４号；同第４，１３０，４６２号；及び同第４，１９３，９８３号が挙げられる。米国特許第４，１６０，６４５号は、標識として電子伝達触媒を用いるアッセイ方法を開示している。抗体に結合させることによって触媒（標識）を不活化する。
【０００５】
Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， （Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２１６， １８５−１９４ （１９８３））は、競合アッセイの構成で抗原に結合させた化学発光供与体（Ａｇ−Ｌ）と抗体に結合させた蛍光受容体（Ａｂ−Ｆ）との間でのエネルギー転移を用いる検出方法を開示している。複合体の抗原は最終的には蛍光発光物質の波長で放射するが、遊離の抗原は、化学発光標識の特徴的な波長で放射する。その後、２つの波長で光の強度を測定し、２つのシグナルの比を試料中の分析物の量に関係付ける。
【０００６】
種々のそのほかの均質免疫アッセイが知られている： Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎらの米国特許第３，８１７，８３７号（均質酵素免疫アッセイ）、Ｕｌｌｍａｎらの米国特許第３，９９６，３４５号（蛍光消光均質免疫アッセイ）、Ｍａｇｇｉｏらの米国特許第４，２３３，４０２号（酵素チャネリング均質酵素免疫アッセイ）、及びＢｏｇｕｓｌａｓｋｉらのカナダ特許第１，０８２，５７７号（ハプテン−補因子均質酵素免疫アッセイ）。
【０００７】
Ｕｌｌｍａｎへの米国特許第６，４０６，９１３号は、分析物が光増感剤と化学発光化合物を近傍に近づけるような条件下で、分析物を含有していることが疑われる媒体を処理することを含むアッセイ方法を開示している。光増感剤は一重項酸素を発生させ、それは、溶液を介して化学発光化合物に拡散し、近傍に近づいたとき、化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光化合物は続いて光を生成する。生成される光の量は、媒体における分析物の量に関係する。実施態様の１つでは、光増感剤と化学発光化合物の少なくとも一方が浮遊可能な粒子に会合し、特異的結合対のメンバーがそれに結合する。
【０００８】
ＭｃＣａｐｒａへの米国特許第５，５１６，６３６号は、標識として増感剤を利用する特異的結合アッセイを含むアッセイ方法を開示している。増感剤は、放射線、電子伝達、電解質、電気発光又はエネルギー転移によって刺激されると励起状態を達成し、それは（ａ）分子酸素と相互作用する際、一重項酸素を生成し、又は（ｂ）ロイコ染料と相互作用する際、酸素によって還元されて過酸化水素を生じる。そのほかの試薬の添加を伴った、励起された増感剤との相互作用は、検出可能なシグナルを生成する。
【０００９】
均質アッセイ又は非分離アッセイの構成を考案する相当な尽力にもかかわらず、それらは、広範囲に及ぶ商業的採用を依然として経験していない。均質アッセイは、たとえ操作上さらに複雑であっても開発し、大量生産するのにさらに単純であるとみなされる。特に、大量の臨床免疫診断の分野及び臨床的な核酸診断のさらに小さな分野は、均質アッセイの構成が優位を占める。この領域の範囲内で、試験の構成は、プロトコールを簡略化する、複雑さを減らす、不必要な工程を除去することによって自動化との相性を改善する分野で有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
側面の１つでは、本発明は、既知の方法に比べて簡略化された特異的結合反応、特に免疫アッセイを含む新規のアッセイ方法を提供する。検出工程の前の分離及び洗浄の工程を排除することによってアッセイが簡略化されるので、非分離アッセイとみなされる。該方法は、固定された化学発光化合物及び化学発光反応を誘導するための特異的結合パートナーに結合された活性化剤化合物を特徴とする。分析物が介在する、化学発光標識化合物と活性化剤結合体の同時局在は、結合した分析物分子の部位でのみ生じる確実な化学発光反応を引き起こす。結合していない、過剰の活性化剤結合体の存在は、化学発光反応に寄与することもなければ、それに干渉することもない。その結果、放射される化学発光の強度は分析物の量に比例する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
アルキル−Ｈ以外の１以上の置換基で置換することができる１個〜２０個の炭素を含有する分枝鎖、直鎖又は環状の炭化水素基。本明細書で使用されるとき、低級アルキルは８までの炭素を含有するアルキル基を言う。
【００１２】
分析物−アッセイで検出されるべき試料中の物質。分析物に特異的な結合親和性を有する１以上の物質を用いて分析物を検出する。分析物は、タンパク質、抗体、それに結合する抗体が作製されてもよいハプテンであってもよい。分析物は、相補的な核酸によって結合される核酸であってもよい。分析物は、特異的結合対のメンバーを形成する任意のそのほかの物質であってもよい。
【００１３】
アラルキル−アリール基で置換されたアルキル基。
【００１４】
アリール−Ｈ以外の１以上の置換基で置換することができる１個〜５個の炭素環式の芳香族環を含有する芳香族環含有の基。
【００１５】
生体材料−全血、抗凝固剤処理した全血、血漿、血清、組織、細胞、細胞の内容物及びウイルスを含む。
【００１６】
化学発光化合物−電子的に励起された状態で形成される別の化合物に変換されることを結果的に生じる反応を受ける化合物。励起された状態は一重項又は三重項の励起状態でもよい。励起された状態は、弛緩の際、基底状態に直接、光を放射し、又は励起エネルギーを放射エネルギー受容体に転移し、それによって基底状態に戻ってもよい。エネルギー受容体は過程中に励起状態に上げられ、光を放射する。
【００１７】
試料−核酸を含有する又は核酸を含有することが疑われる液体。本発明の方法で使用することができる典型的な試料には、採血分析物で普通に見い出されるような、抗凝固処理した血液であってもよい血液、血漿、血清、尿、精液、唾液のような体液、細胞培養物、組織抽出物などが挙げられる。そのほかの種類の試料には、溶媒、海水、産業水試料、食物試料、及び土壌又は水のような環境試料、植物材料、真核生物、細菌、プラスミド及びウイルス、真菌、原核生物に由来する細胞が挙げられる。
【００１８】
固相材料−アッセイ成分がその上に固定される表面を有する材料。材料は、粒子、微粒子、ナノ粒子、繊維、ビーズ、膜、フィルター、並びに試験管及びマイクロウェルのようなそのほかの担体の形態であってもよい。
【００１９】
特異的結合対、特異的結合パートナー−ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡのキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンを含む、別の物質に対して特異的な結合親和性を有する生体分子を含む分子。特異的結合のパートナーは、活性化剤又は化学発光化合物のいずれかの１以上の分子に結合される。
【００２０】
置換される−非水素基による少なくとも１つの水素基の置き換えを言う。置換された基に関して、明らかに指示されない限り、置換の複数点が存在することが意図されることに言及すべきである。
【００２１】
本発明は、特異的結合対の反応によって物質を検出するための迅速で且つ単純なアッセイ方法に関する。該方法は、固定された化学発光化合物と、化学発光反応を誘導するための特異的結合パートナーに結合された活性化剤化合物とトリガー溶液の使用を必要とする。該方法には、分析物を検出するための１以上の特異的結合対の反応が関与する。標識された特異的結合パートナーが分析物に結合した結果、活性化剤が固定された化学発光化合物の近傍に近づけられるので、トリガー溶液を添加する際、化学発光を発生する反応を活性化するのに有効である。活性化剤−標識された特異的結合パートナーは、分析物すべてを結合するのに必要とされる量に対して過剰で系に提供される。過剰な結合していない活性化剤結合体は、反応に参画することができないので、トリガー溶液の添加及び検出に先立って除かれることはない。
【００２２】
従って、本方法は、分析物と特異的に会合される量に対して大過剰で存在する未結合の活性化剤結合体の除去を必要としない点で従来の試験方法とは異なる。洗浄又は分離を行うことなく、分析物を含有する試料、活性化剤結合体及びトリガー溶液を試験容器に順に加え、発光を読み取ることができる。或いは、試料及び活性化剤結合体を事前に混合し、トリガー溶液を導入する前に、分析物を捕捉するための特異的結合パートナーを含有し、固定された化学発光標識を含有する試験容器に加えてもよい。過剰な未結合の活性化剤結合体の洗浄又は分離は必要とされない。当該技術で既知の従来の化学発光アッセイとの差異の別の点は、光生成に参画する化学発光化合物も、活性化剤（たとえば、ペルオキシダーゼ）も溶液中で遊離して拡散することはないという事実にある。両者は空間的には拘束されている。部分的には、この結果、シグナル発生は、持続時間が短い傾向がある。
【００２３】
化学発光基質及び酵素標識した結合体を用いる従来のアッセイは、標識酵素の量に対して大過剰で基質を提供する。基質／酵素のモル比は、１０の９乗を超える、すなわち、１０億倍過剰であってもよいことが多い。連続する酵素の代謝回転に対して基質を適当に確実に供給するためにそのような大過剰の化学発光化合物を供給することが必要であり、この過程がアッセイ方法における適当な検出感度を保証すると考えられている。出願者は、この比を数桁の程度軽減する感度の高いアッセイ方法を考案することが可能であることを見い出した。この点で、これらの方法は既知の方法とは根本的に異なる。
【００２４】
上述したように、又、以下に記載される例示となるアッセイで実証されるように洗浄及び分離の工程を排除することは、アッセイプロトコールの設計を簡略化する機会を与える。操作工程の数が減ると、アッセイ時間、不完全な洗浄に由来するアッセイ間の変動及びコストが減る。同時に、それは、自動化及び小型化に付随する固有の利点すべてと共にアッセイ性能を自動化し、小型化する能力を高める。
【００２５】
本方法に従って行なわれるアッセイには、４つの工程が関与する。第１の工程では、当該分析物を特異的に捕捉するための試験装置に固相が提供される。固相には、検出されるべき分析物のための、固定された特異的結合パートナーが提供される。固相にはさらに、それに固定された化学発光標識する化合物が提供される。化学発光標識は、以下でさらに詳しく記載されるように多数の異なった方法で提供されてもよい。各変形例では、化学発光標識は、それを不動にするような方法で物質又は材料に不可逆的に結合される。第２の工程では、分析物のための、固相に固定され、特異的結合複合体を形成できる特異的結合パートナーを有する試験装置に、分析物を含有する試料及び活性化剤結合体を導入する。試料及び活性化剤結合体は別々に順に加えてもよく、又は同時に加えてもよく、又は事前に混合し、組み合わせとして加えてもよい。結合反応を起こす任意の遅延時間をこの点で挿入することができる。第３の工程では、トリガー溶液を加えて分析物を検出するための化学発光を生成する。最後に化学発光を検出する。好ましくは、ピークの光強度レベル又は合計積算光強度のいずれかを測定する。一般に知られた方法に従って較正曲線を作図することによって光の量を分析物の量に関係付けることができる。トリガー溶液の添加後、光の放射が迅速に起きる場合、好適な注入器による添加に対して測定の開始を機械的に調節するか、又はすでに検出器に暴露された試験装置によって添加を行うかのいずれかが望ましい。
【００２６】
（アッセイの構成及び固体支持体）
本発明の方法では、化学発光標識化合物が試験系の成分に固定される。幾つかの方法のいずれかによってこれを達成することができる。実施態様の１つでは、化学発光標識は、分析物のための、固定された特異的結合パートナーに共有結合される。例は、マイクロプレートのウェルに固定された捕捉抗体である。特異的結合のパートナーの固定は共有結合又は吸収法によればよい。図１に示されるこの構成では、「サンドイッチ」の構成で双方とも分析物に結合する２つの特異的結合パートナーによって化学発光標識は活性化剤と会合する。図２に示される別の実施態様では、無作為の様式で固体支持体に固定される補助物質に化学発光標識は共有結合される。補助物質の固定は共有結合又は吸収法によればよい。それによって標識は多かれ少なかれ均一に、固体支持体の表面に分配される。たとえば、分析物に対する未結合の特異的結合パートナーによって、表面に分析物を引き寄せるために手段が提供される。担体の表面に不活性に塗布された補助物質に結合された化学発光標識の近傍に活性化剤を近づける特異的結合反応によって化学発光標識は活性化剤に関わるようになる。別の実施態様では、化学発光標識は固体支持体の表面に共有結合される。図３に示すように、それによって標識は多かれ少なかれ均一に、固体支持体の表面に分配される。たとえば、分析物に対する未結合の特異的結合パートナーによって、表面に分析物を引き寄せるために手段が提供される。担体の表面に直接結合された化学発光標識の近傍に活性化剤を近づける特異的結合反応によって化学発光標識は活性化剤に関わるようになる。次いで、洗浄又は分離を行うことなく、トリガー溶液が添加され、化学発光が測定される。
【００２７】
別の実施態様は、活性化剤−分析物の結合体を含む分析物の類縁体を使用する変形物を含む。分析物類縁体と分析物は、分析物に対する特異的結合パートナーに競合して結合する。この種のアッセイ方法では、試料中の分析物の量と化学発光の強度との間に負の相関が生じることが明らかであろう（図７）。
【００２８】
免疫アッセイを介して抗原又はそのほかのタンパク質又はそのほかの抗体を結合するための抗体を介した化学発光標識の結合に加えて、本方法は、相補的な核酸の結合を介して核酸を検出するために化学発光標識された核酸を使用することができる。この点での使用には、核酸のサイズに関して特に限定されないが、唯一の基準は、相補的なパートナーが安定なハイブリッド形成ができるように十分な長さであることである。本明細書で使用されるとき、核酸には、遺伝子の長さの核酸、核酸のさらに短い断片、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられるが、それらはいずれも一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。特異的結合パートナーとして核酸を用いる本発明の実践では、核酸は、固体支持体の表面に共有結合して、又は物理的に固定されて分析物核酸を捕捉する。化学発光標識は、図６に模式的に示すように、捕捉核酸に結合してもよく、又は上で説明したように、標識は固相に直接結合してもよい。捕捉核酸は、分析物核酸の配列領域に相補的な完全な又は実質的に完全な配列を有する。実質的に相補的である場合、捕捉核酸は、分析物とのハイブリッド形成を干渉しない又は妨害しないという条件で、分析物とは相補的ではない末端オーバーハング部、末端ループ部又は内部ループ部を保有してもよい。分析物核酸の中にオーバーハング又はループがある場合、逆の状況が生じてもよい。捕捉核酸、分析物核酸及び活性化剤結合体及び第３の核酸をハイブリッドに形成することができる。第３の核酸は、捕捉核酸に相補的な領域と異なる分析物核酸の配列領域に対して実質的に相補的である。捕捉核酸及び活性化剤結合体核酸と分析物とのハイブリッド形成は、順に又は同時に行うことができる。この過程の結果、担体の表面に直接結合された化学発光標識に活性化剤を近づける特異的なハイブリッド形成反応によって化学発光標識は活性化剤に関わるようになる。上述のように、トリガー溶液が提供され、化学発光が検出される。
【００２９】
別の実施態様は、活性化剤との分析物の結合体を使用する変形物を含む。分析物核酸−活性化剤結合体と分析物核酸は、分析物核酸に対する特異的結合パートナーに競合して結合する。この種のアッセイ方法では、試料中の分析物の量と化学発光の強度との間に負の相関が生じることが明らかであろう。
【００３０】
抗体に基づく系及び核酸に基づく系に加えて、結合アッセイの当業者に一般に知られるようなそのほかの特異的結合パートナーは、本発明に係る試験方法の基礎として役立ってもよい。フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン及びニトロフェニル／抗ニトロフェニルの対は例示である。さらなる例として、周知の（ストレプト）アビジン／ビオチンを利用することができる。この結合対を使用すればよい方法の１つを説明すると、ストレプトアビジン−化学発光標識結合体を固体支持体に共有結合する、又は吸着させることができる。次いで、ビオチン標識された分析物と活性化剤の結合体を加えるが、その際、結合体は抗ビオチン抗体又は抗分析物抗体に結合させる。複合体を形成した後、トリガー溶液を加え、上記のように検出を行う。当業者に思い浮かぶこれら及びそのほかの例は、本発明方法の範囲内であるとみなされる。
【００３１】
本発明の実践に有用な固体支持体は、種々の材質、形状及び大きさのものであってもよい。９６穴、３８４穴又はさらに数の多い変形体のマイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロース、紙又はプラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子、磁性粒子、特に０．１〜１０μｍの平均径を有するもの、種々の材質のナノ粒子を含む結合アッセイにすでに使用されている材料はすべて、化学発光標識を結合するための及び特異的結合パートナーを固定するための有用な固体支持体を提供することができる。本開示は、本アッセイ方法で使用するためにそのような材料を官能化する方法を教示する。特に、化学発光標識する化合物と、たとえば抗体のような特異的結合パートナーの双方を同一表面、特に微粒子に結合する方法が開示される。
【００３２】
（化学発光標識化合物）
本発明の実践で化学発光標識として使用される化合物は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧを有し、式中、ＣＬは化学発光部分を示し、Ｌは化学発光部分と反応基を連結する連結部分を示し、ＲＧは別の物質にカップリングする反応基を示す。化学発光部分ＣＬは含む。ＣＬ基と活性化剤とトリガー溶液の化学発光反応が迅速であり、望ましくは極めて短い時間範囲で起きることが望ましいが、必要ではない。
【００３３】
好ましい化学発光化合物は、酸化され、活性化剤とトリガー溶液の存在下で化学発光を生成することが可能である。リンカー及び反応基の取り込みによって化学発光標識として役立つ例示となる部類の化合物には、ルミノール、及びイソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）、アミノヘキシルエチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、環置換のアミノフタルヒドラジド類、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド類、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド類、ピレンジカルボン酸ヒドラジド類、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジドを含む構造的に関連した環状ヒドラジド類、並びにＭａｓｕｙａらへの米国特許第５，４２０，２７５号及びＹａｍａｇｕｃｈｉらへの米国特許第 ５，３２４，８３５号に開示されたそのほかのフタラジンジオン類縁体が挙げられる。
【００３４】
化学発光部分の別の部類には、米国特許第５，４９１，０７２号、同第５，５２３，２１２号、同第５，５９３号、８４５号及び同第６．０３０，８０３号で開示されたアクリダンエステル類、チオエステル類及びスルホアミド類が挙げられる。
【００３５】
別の部類の化学発光部分には、米国特許第５，９２２，５５８号；同第６，６９６，５６９号；及び同第６，８９１，０５７号で開示された複素環化合物が挙げられる。これらの化合物は好ましくは、窒素、酸素若しくはイオウを含有する５若しくは６員環を好ましくは含む複素環を含み、又は環外の二重結合を結合し、酸素原子及びイオウ原子から選択される２つの原子で末端炭素が置換される複数の環基を含む。
【００３６】
過酸化水素とペルオキシダーゼの作用によって化学発光を生成することが知られている化合物は、本発明で使用される化学発光標識化合物の化学発光部分として機能することが考慮される。キサンテン染料、芳香族アミン類及び複素環式アミン類を含む様々な構造的部類の多数のそのような化合物が、当該技術ではこれらの条件下で化学発光を生成することが知られている。
【００３７】
本発明の方法で有用な化学発光標識化合物の好ましい基は、式Ｉを有するアクリダン化合物を含み、
【００３８】
【化６】
（式中、基Ｒ１〜Ｒ１１の少なくとも１つは、式−Ｌ−ＲＧの標識置換基であり、その際、Ｌは結合であってもよい連結基又は別の二価又は多価の基であり、ＲＧは化学発光標識する化合物が別の化合物に結合するのを可能にする反応基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素若しくは非干渉の置換基である。標識置換基−Ｌ−ＲＧは、置換基としてＲ３又はＲ４〜Ｒ１１の１つに存在することもできるが、好ましくはＲ１又はＲ２の１つに存在する。
【００３９】
式Ｉの化合物における基、Ｒ１及びＲ２は、光生成を可能にするＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンの原子から選択される１〜約５０の非水素原子を含有する有機基であってもよい。後者によって、式Ｉの化合物が本発明の反応を受ける場合、励起状態の生成物化合物が生成され、１以上の化学発光中間体の生成が関与してもよいことを意味する。励起状態の生成物は直接、光を放射することができ、又は蛍光受容体から放射されるべき光を生じるエネルギー転移を介して蛍光受容体に励起エネルギーを転移することができる。Ｒ１及びＲ２は好ましくは、１個〜２０個の炭素原子の置換又は非置換のアルキル基、置換又は非置換のアルケニル基、置換又は非置換のアルキニル基、置換又は非置換のアリール基、置換又は非置換のアラルキル基から選択される。Ｒ１又はＲ２が置換された基である場合、それは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３〜２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、四級アンモニウム基、四級ホスホニウム基から選択される１個〜３個の原子又は基によって置換される。好ましい実施態様では、Ｒ１又はＲ２は好ましくは、式−Ｌ−ＲＧの標識置換基で置換され、その際、Ｌは連結基であり、ＲＧは反応基である。
【００４０】
Ｒ３基は、基における原子の価数を満たすのに必要とされるＨ原子の必要な数に加えて、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンの原子から選択される１個〜５０個の非水素原子を含有する有機基である。さらに好ましくは、Ｒ３は１個〜２０個の非水素原子を含有する。有機基は好ましくは、１個〜２０個の炭素原子のアルキル基、置換アルキル基、置換又は非置換のアルケニル基、置換又は非置換のアルキニル基、置換又は非置換のアリール基、置換又は非置換のアラルキル基から成る群から選択される。Ｒ３についてさらに好ましい基には、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ４のアルキル基、フェニル、置換又は非置換のベンジル基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基及びアルキルスルホン酸基が挙げられる。Ｒ３基はＲ７又はＲ８と結合して５又は６員環の環を完成させてもよい。実施態様の１つでは、Ｒ３は式−Ｌ−ＲＧの標識置換基で置換される。
【００４１】
式Ｉの化合物では、基Ｒ４〜Ｒ１１はそれぞれ独立してＨ、又は生成されるべき励起状態の生成物を可能にし、一般にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンの原子から選択される１個〜５０個の原子を含有する置換基である。存在してもよい代表的な置換基には、限定しないで、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン基、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキサミド基、シアノ基及びスルホネート基が挙げられる。隣接する基の対、たとえば、Ｒ４−Ｒ５又はＲ５−Ｒ６は一緒に結合して、２つの基が結合する環に縮合する少なくとも５又は６員環の環を含む炭素環状又は複素環状の系を形成してもよい。そのような縮合した複素環は、Ｎ、Ｏ又はＳの原子を含有してもよく、上述のような、Ｈ以外の環置換基を含有してもよい。１以上の基Ｒ４〜Ｒ１１が式−Ｌ−ＲＧの標識置換基であってもよい。Ｒ４〜Ｒ１１は、水素、ハロゲン、及びメトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどのようなアルコキシ基から選択されることが好ましい。化合物の好ましい基はハロゲンとしてのＲ５、Ｒ６、Ｒ９又はＲ１０の１つを有し、Ｒ４〜Ｒ１１のそのほかは水素原子である。
【００４２】
化合物の特性を改変するために、又は合成の利便性を提供するために、種々の量で、アクリダン環の選択された環又は鎖にて置換基を組み入れることができる。そのような特性には、たとえば、化学発光の量子収量、酵素との反応の速度、光の最大強度、光放射の持続時間、光放射の波長及び反応媒体における溶解性が挙げられる。具体的な置換基及びその効果は以下の具体的な実施例で説明するが、それらは、決して本発明の範囲を限定するとみなされるものではない。合成の都合上、式Ｉの化合物は望ましくは、水素原子としてのＲ４〜Ｒ１１のそれぞれを有する。
【００４３】
連結基（Ｌ） 連結基は、結合、原子、二価の基及び多価の基、又は一部が環構造の一部であってもよい原子の直鎖若しくは分枝鎖であってもよい。置換基は普通、１〜約５０の非水素原子、さらに普通には、１〜約３０の非水素原子を含有する。鎖を構成する原子は、 Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、Ｂ、及びＳｅの原子から選択され、好ましくはＣ、Ｏ、Ｎ、Ｐ及びＳの原子から選択される。ハロゲン原子は置換基として鎖又は環に存在してもよい。連結置換基を構成する典型的な官能基には、アルキレン、アリーレン、アルケニレン、エーテル、ペルオキシド、ケトンとしてのカルボニル、エステル、カーボネートエステル、チオエステル、又はアミノ基、アミン、アミジン、カルバメート、尿素、イミン、イミド、イミデート、カルボジイミド、ヒドラジン、ジアゾ、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネートエステル、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホネートエステル、サルフェートエステル及びチオ尿素の基が挙げられる。
【００４４】
反応基 反応基は、その存在が共有結合又は物理的な力によって別の分子への結合を円滑にする原子又は基である。一部の実施態様では、反応基が、たとえば、ハロゲン原子又はトシレート基のような脱離基であり、化学発光標識化合物が求核置換反応によって別の化合物に共有結合する場合、本発明の化学発光標識化合物の別の化合物への結合には、反応基からの１以上の原子の喪失が関与する。他の実施態様では、たとえば、ミカエル付加のような付加反応にて生じるとき、又は反応基がイソシアネート基若しくはイソチオシアネート基である場合、共有結合形成による化学発光標識化合物の別の化合物への結合には、反応基内での結合の認識が関与する。さらに他の実施態様では、結合には共有結合形成は関与しないが、物理的力が関与し、その場合、反応基は未変化のままである。物理的力によって、たとえば、水素結合、静電気の引力又はイオンの引力、塩基スタッキングのような疎水性の引力のような引力、並びにたとえば、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原／抗体及びヌクレオチド／ヌクレオチドの相互作用のような特異的な親和性の相互作用を意味する。
【００４５】
表１．有機分子及び生体分子への標識の化学的結合のための反応基
【００４６】
【化７】
【００４７】
【化８】
好ましい反応基には、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエーテル及びマレイミドの基が挙げられる。
【００４８】
二官能性のカップリング試薬を用いて、緩やかな反応基によって標識を有機分子及び生体分子にカップリングすることができる（Ｌ． Ｊ． Ｋｒｉｃｋａ， Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｅｒ Ａｓｓａｙｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８５， ｐｐ． １８−２０， Ｔａｂｌｅ ２．２ ａｎｄ Ｔ． Ｈ Ｊｉ， ”Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ， ９１， ５８０−６０９ （１９８３）を参照のこと）。２種類の二官能性試薬がある：最終的な構造に組み入れられるもの及び組み入れられず、２つの反応物質のカップリングのみに役立つもの。
【００４９】
化合物の好ましい基は式ＩＩを有し、式中、Ｒ４〜Ｒ１１は水素原子である。基Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記と同義である。
【００５０】
【化９】
式Ｉを有する好ましい標識化合物は、基Ｒ１又はＲ２上の置換基として基−Ｌ−ＲＧを有する。好ましい標識化合物は式ＩＩＩを有する。
【００５１】
【化１０】
代表的な好ましい標識化合物及び他の分子への結合におけるそれらの使用及び固体表面については、以下の具体的な実施例で記載する。
【００５２】
（活性化剤結合体）
活性化剤化合物は、活性化剤−特異的結合パートナーの結合体の一部を形成する。結合体は２重の機能：１）アッセイにおいて特異的結合パートナーの部分を介して直接、又は中間の特異的結合パートナーを介して分析物に特異的に結合すること、及び２）活性化剤部分を介して化学発光化合物を活性化すること、の役目を果たす。結合体の活性化剤部分は、化学発光化合物の活性化を達成する化合物なので、トリガー溶液の存在下で化学発光が生成される。活性化剤として役立つことが可能である化合物には、遷移金属の塩及び錯体及び酵素、特に遷移金属を含有する酵素、最も特には、ペルオキシダーゼ酵素が挙げられる。活性化剤化合物で有用な遷移金属には、周期律表の３〜１２族、特に、鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムが挙げられる。シグナル発生に関与する活性化剤分子は物理的に限定された範囲内で作動すればよく、限定された供給の化学発光化合物と接触するのみでよいことが言及されるべきである。このことは、活性化剤がその可能性を持っている場合、大きな触媒的代謝回転を排除すると思われる。
【００５３】
化学発光反応を受けてもよいペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、たとえば、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、真菌のペルオキシダーゼ、たとえば、リグニンペルオキシダーゼ及びＡｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ由来のペルオキシダーゼ及び白腐れ病真菌で産生されるＭｎ依存性のペルオキシダーゼ及び大豆ペルオキシダーゼが挙げられる。たとえば、ヘム及びＭｎ−ＴＰＰＳ４（Ｙ．−Ｘ． Ｃｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ５２， ２５７−６２ （１９９５））のような鉄錯体を含む、酵素ではないが、ペルオキシダーゼ様の活性を持つそのほかのペルオキシダーゼ模倣体化合物が知られ、それらは基質の化学発光酸化を触媒し、本明細書で使用されるとき、ペルオキシダーゼの意味の範囲内であると明白にみなされる。
【００５４】
ペルオキシダーゼと生体分子との結合体又は複合体は、結合体がペルオキシダーゼ活性を示すという条件で化学発光を生成する方法で使用することができる。ペルオキシダーゼの１以上の分子に結合されてもよい生体分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡのキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンが挙げられる。生体分子への結合のために官能化されるリポソーム、ミセル、小胞及びポリマーのようなペルオキシダーゼを含む又は組み入れる複合体も本発明の方法で使用することができる。
【００５５】
（トリガー溶液）
トリガー溶液は、化学発光に必要な励起状態の化合物を発生するのに必要な反応物質を提供する。反応物質は、化学発光標識と直接反応することによって化学発光反応を行うのに必要なものであってもよい。それは、この機能の代わりに、又はそれに加えて、活性化剤化合物の作用を促進する。これは、たとえば、活性化剤がペルオキシダーゼ酵素である場合である。好ましい実施態様では、トリガー溶液は過酸化物化合物を含む。過酸化物化合物は、ペルオキシダーゼと反応することが可能である任意の過酸化物又はアルキルヒドロペルオキシドである。好ましい過酸化物には、過酸化水素、過酸化尿素及び過ホウ酸塩が挙げられる。代表的な実施態様は、活性化剤としてのペルオキシダーゼ結合体、分析物のアクリダン標識物を使用し、その際、アクリダン標識は、特異的結合パートナーを上記式ＩＩＩの化合物と反応させることによって提供され、トリガー溶液は過酸化水素を含む。過酸化物はペルオキシダーゼと反応して、多分、酵素の活性部位におけるイオンの酸化状態を異なった酸化状態に変える。酵素のこの変化した状態は、酵素の近傍に保持されるアクリダン標識と反応する。化学発光反応はさらに、化学発光化合物から形成される中間体と過酸化物との反応を含み、最終的には反応生成物と光を生成する。
【００５６】
特定の増進剤化合物をトリガー溶液に組み入れることによって、酵素の反応性を促進する。増進剤の中に含まれるのは、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，１７１，６６８号及び同第５，２０６，１４９号に記載されるようにそのほかのペルオキシダーゼ反応を増進することが知られているフェノール性化合物及び芳香族アミンである。参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，５１２，４５１号で開示されたような置換及び非置換のアリールホウ酸及びそのエステル及び無水物誘導体も本発明で有用な増進剤の範囲内であるとみなされる。好ましい増進剤には、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−インドフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール及び６−ブロモ−２−ナフトールが挙げられるが、これらに限定されない。上述のこれらの部類からの１より多い増進剤の混合物も採用されてもよい。
【００５７】
本発明の化合物からの化学発光の生成を高めるのに有効であることが見い出された追加の増進剤は、フェノキサジンの誘導体及び以下の式を有するフェノチアジンである。
【００５８】
【化１１】
フェノキサジン及びフェノチアジンの増進剤の窒素原子上で置換されたＲ基には、１個〜８個の炭素原子のアルキル及びスルホン酸塩基又はカルボン酸塩基で置換された１個〜８個の炭素原子のアルキルが挙げられる。好ましい増進剤には、３（Ｎ−フェノチアジニル）−プロパンスルホン酸塩、３−（Ｎ−フェノキサジニル）プロパンスルホン酸塩、４−（Ｎ−フェノキサジニル）ブタンスルホン酸塩、５−（Ｎ−フェノキサジニル）ペンタン酸塩及びＮ−メチルフェノキサジン及び関連する同族体が挙げられる。
【００５９】
本発明の検出反応は、通常、水性緩衝液中であるトリガー溶液とともに行われる。好適な緩衝液には、化学発光を進めることができる環境を維持することが可能である一般に使用される任意の緩衝液が挙げられる。通常、トリガー溶液は、約５〜約１０．５の範囲内でのｐＨを有する。例示となる緩衝液には、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、［トリス］、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミンＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。
【００６０】
トリガー溶液は、１以上の界面活性剤又はポリマー界面活性剤を含有して、光生成反応の発光効率を高める又はアッセイのシグナル／ノイズ比を改善することができる。本発明の実践で有用な非イオン性の界面活性剤には、例示として、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール類、ポリオキシエチレン化アルコール類、ポリオキシエチレン化エーテル類及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステル類が挙げられる。たとえば、ＣＴＡＢのような四級アンモニウム塩化合物及び四級ホスホニウム塩化合物を含むモノマーのカチオン性の界面活性剤を使用することができる。四級アンモニウム及びホスホニウム塩基を含むものを含むポリマーのカチオン性の界面活性剤もこの目的で使用することができる。
【００６１】
本方法で放射された光は、好適な既知の手段、たとえば、照度計、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンタ、化学光量計によって、又は視覚的に検出することができる。各検出手段は、異なったスペクトルの感度を有する。ヒトの眼は緑色光に最適に感受性であり、ＣＣＤカメラは赤色光に最大の感度を示し、ＵＶ〜青色光又は緑色光のいずれかに最大の応答を持つＸ線フィルムも利用可能である。検出装置の選択は、コスト、利便性の適用及び考慮によって、及び創製又は永続的な記録を必要とするかどうかによって支配される。光放射の時間経過が迅速であるそれらの実施態様では、検出装置の存在下で誘発反応を行って発光を生成することが有利である。一例として、検出反応は、照度計に格納された試験管若しくはマイクロウェルプレート内で、又は試験管若しくはマイクロウェルプレートに適合した筺体におけるＣＣＤカメラの前に設置された試験管若しくはマイクロウェルプレート内で行ってもよい。
【００６２】
（使用）
本アッセイ方法は、多数の種類の特異的結合対のアッセイで適用性が見い出される。これらの中で最も重要なのは、ＥＬＩＳＡのような化学発光酵素連結免疫アッセイである。免疫化学の工程を実施するための種々のアッセイの構成及びプロトコールは当該技術で周知であり、競合アッセイ及びサンドイッチアッセイが含まれる。本発明に係る免疫アッセイによってアッセイすることができる物質の種類には、タンパク質、抗体、ハプテン、薬剤、ステロイド及び免疫アッセイの技術で一般に知られているそのほかの物質が挙げられる。
【００６３】
本発明の方法はまた、酵素標識した核酸プローブの使用によって核酸を検出するのにも有用である。例示となる方法には、溶液ハイブリッド形成アッセイ、サザンブロットにおけるＤＮＡの検出、ノーザンブロットによるＲＮＡ、ＤＮＡの配列決定、ＤＮＡのフィンガープリント、コロニーハイブリッド形成及びプラークリフト、当業者に周知である処理が挙げられる。
【００６４】
前述の抗原／抗体の対、ハプテン／抗体の対又は抗体／抗体の対に加えて、特異的結合の対には、相補的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、ホルモン／受容体、レクチン／糖質、ＩｇＧ／プロテインＡ、核酸／核酸結合タンパク質、及び核酸／抗核酸抗体が挙げられる。薬剤候補のスクリーニングに使用される受容体アッセイは、本方法への使用の別の領域である。上述の３つの成分のサンドイッチ手法又は２つの成分の競合手法によってこれらの結合対のいずれかを本方法における使用に適合させてもよい。
【００６５】
本発明は、本発明の方法に従ってアッセイを行うためのキットを提供することも企図する。キットは、包装された組み合わせにおいて、遊離の標識化合物としての化学発光標識、化学発光標識された特異的結合のパートナー、化学発光で誘導体化された固体支持体、たとえば、粒子若しくは微粒子、又はブロッキングタンパク質のような化学発光で標識された補助物質を、トリガー溶液及び使用の指示書とともに含む。化学発光標識がユーザーによって行われるのであれば、キットは任意で、活性化剤結合体、分析物較正器、稀釈剤及び反応緩衝液を含有してもよい。
【実施例】
【００６６】
（実施例１．化合物１の合成）
【００６７】
【化１２】
カップリング剤としてＤＣＣを用いてヨードカルボン酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによりヨードカルボキシレートＮＨＳエステルを合成した。
【００６８】
アルゴンのもとで、無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のジチオエステルＢ（１．８０８ｇ、５．００ミリモル）の溶液にＮａＨ（鉱物油中６０％、０．２００ｇ、５．００ミリモル）を加えた。室温にて４時間後、ＮＨＳ３−ヨードプロピオネートＡ（１．４８５ｇ、５．００ミリモル）を加え、得られた混合物を一晩撹拌した。減圧でＤＭＦを除いた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ（４０：１）によるカラムクロマトグラフィによって黄色固形物（収率６７％）として１．７７０ｇの１を得た。
【００６９】
【化１３】
（実施例２．化合物２の合成）
【００７０】
【化１４】
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のジチオエステルＣ（０．６９２ｇ、１．５０ミリモル）とＮａＨ（鉱物油中６０％、０．０６０ｇ、１．５０ミリモル）の混合物をアルゴンのもと、室温にて４時間撹拌し、やや濁った溶液を得た。次いでＮＨＳ６−ヨードヘキサノエートＡ（０．６６１ｇ、１．９５ミリモル）をＤＭＦ（５ｍＬ）に加えた。１６時間後、減圧でＤＭＦを除いた。残留物に１０ｍＬのアセトンを加え、次いで２０ｍＬのエーテルを加えた。上清を静かに捨てた。同じ手順に続いて沈殿物を３回洗浄した。減圧下で乾燥した後、黄色固形物として１．２００ｇの２を得た。
【００７１】
【化１５】
（実施例３．化合物３及び４の合成）
【００７２】
【化１６】
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のジチオエステルＣ（１．００ｇ、２．１０ミリモル）とＮａＨ（鉱物油中６０％、０．０８７ｇ、２．１６ミリモル）の混合物をアルゴンのもと、室温にて４時間撹拌し、やや濁った溶液を得た。Ｎ−６ヨードヘキソオキシスクシンイミドＤ（０．８２ｇ、２．５２ミリモル）をＤＭＦ（５ｍＬ）に加えた。混合物を一晩撹拌し、その後、減圧でＤＭＦを除いた。３０ｍＬのエーテルで残留物を４回洗浄して１．３５ｇの３を得た。
【００７３】
化合物３（０．２５ｇ）を５ｍＬのメタノールに溶解し、それにＮＨ２ＯＨの５０％水溶液５．０ｍＬを加えた。溶液を２日間撹拌した後、減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物を６ｘ２０ｍＬのエーテルで洗浄して０．２１ｇの４を得た。
【００７４】
【化１７】
（実施例４．化合物５及び６の合成）
【００７５】
【化１８】
無水ＤＭＦ３０ｍＬ中のジチオエステルＣ（１．３２ｇ、２．７８ミリモル）とＮａＨ（鉱物油中６０％、０．１１４ｇ、２．８６ミリモル）の混合物をアルゴンのもと、室温にて４時間撹拌した。次いで化合物Ｅ（１．０１４ｇ、３．６１ミリモル）をＤＭＦ１０ｍＬに加えた。混合物を一晩撹拌し、その後、減圧でＤＭＦを除いた。残留物を２０ｍＬのエーテルで３回洗浄して２．１０ｇのＦを得た。
【００７６】
７ＮのＮＨ３のメタノール溶液１５ｍＬと２８％のアンモニア水溶液１０ｍＬの混合物に化合物Ｆ（２．２５ｇ）を溶解した。３日間の撹拌の後、減圧下で溶媒を除いた。残留物をエーテル（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｈ２Ｏ／２−プロパノールで再結晶化して１．２０ｇの５を得た。
【００７７】
９．０ｍＬの無水ＤＭＦ中の５（０．３００ｇ、０．５６３ミリモル）の懸濁液に、１．２０ｍＬのトリエチルアミンを加えた。混合物を５分間撹拌し、やや濁った溶液を得た。６−マレイミドヘキサン酸ＮＨＳエステル（Ｇ、０．２６０ｇ、０．８４３ミリモル）をこれに加えた。５分で透明な溶液が得られた。１６時間後、減圧下でＤＭＦを除いた。残留物をエーテル（４ｘ３０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、エーテル（５０ｍＬ）で沈殿させた。黄色の泡様の固形物として０．４００ｇ収量の６が得られた。
【００７８】
【化１９】
（実施例５．追加の標識化合物７〜１２）
以下に列記されるそのほかの例示となる標識化合物の調製は、米国特許第６，８５８，７３３号で開示された。
【００７９】
【化２０】
（実施例６．アクリダン標識された抗体の調製）
実施例３のアクリダン標識する化合物３を用いて、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を標識した。５００μＬ容量にて、ｐＨ８．２５の０．１Ｍホウ酸緩衝液中の０．２４ｍｇの抗体と化合物３のＤＭＦ溶液（３：抗体、１０：１のモル比）を室温にて１５分間、次いで、４℃にて一晩反応させた。脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）に溶液を通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出して未結合の標識を除いた。５００μＬの分画を回収することによって未反応の抗体と共に標識された抗体を得た。
【００８０】
化学発光アッセイによって標識された抗体の量について分画を調べた。Ｔｕｒｎｅｒ ＤｅｓｉｇｎｓのＴＤ−２０ｅ照度計の中での試験管中にて、１μＬ又は１０μＬの一定分量を０．４ＭのＨＣｌ＋３．６％尿素過酸化物５０μＬと混合し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ５０μＬを注入した。発光の突発からの合計積算強度を注入時から測定した。化学発光を示す分画が得られた。分画８は最大量の生成物を含有した。
【００８１】
（実施例７．アクリダン標識されたＢＳＡの調製）
実施例３のアクリダン標識する化合物３を用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標識した。ｐＨ８．２５の０．１Ｍホウ酸緩衝液５００μＬ中の０．１ｇのＢＳＡと２３．４ｍｇの化合物３／１００μＬのＤＭＦの溶液４２μＬ（３：ＢＳＡ、１０：１のモル比）を室温にて１５分間、次いで、４℃にて一晩反応させた。脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）に溶液を通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出して未結合の標識を除いた。５００μＬの分画を回収することによって未反応のＢＳＡと共に標識されたＢＳＡを得た。
【００８２】
実施例６の化学発光アッセイによって標識されたＢＳＡの量について分画を調べた。化学発光を示す分画が得られた。分画７は最大量の生成物を含有した。
【００８３】
（実施例８．アクリダンで官能化されたマイクロウェルの調製）
カップリング剤としてＥＤＣを用いて、カルボン酸基（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で官能化された白色のポリスチレン製９６穴マイクロプレートを化合物５にカップリングさせた。ＤＭＦとｐＨ４の０．１ＭのＭＥＳ緩衝液の７０：３０（ｖ／ｖ）溶液にて化合物５のストック溶液を調製する。あらかじめＭＥＳ緩衝液で洗浄したプレートの各ウェルに０．２ｍＬの一定分量を加えた。ＭＥＳ緩衝液中のＥＤＣを加え、混合物を一晩反応させる。上清を除き、水で２回、及びメタノールで６回、ウェルを順に洗浄する。
【００８４】
（実施例９．アクリダン標識されたポリ（メタクリレート）マイクロプレートの調製）
アンバーライト樹脂（ＩＲＰ−６４、１００〜４００メッシュ、２．５０ｇ）を還流にてＳＯＣｌ２と４時間反応させた。反応物を冷却し、揮発物を減圧下で除いた。次いで、５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２にビーズを浮遊し、それに１７．０ｍＬのトリエチルアミンを加え、次いで１５．０ｍＬのエチレンジアミンを加えた。アルゴンのもとで混合物を一晩撹拌した。１００ｍＬのＭｅＯＨを加えることにより粒子を分散し、次いでろ過した。ろ過した粒子をＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、風乾した。２．８６ミリモル／ｇの算出されたＮＨ２含量に対して得られた粒子は２．８０ｇの重さがあった。
【００８５】
室温にて１０ｍＬのＤＭＦ中のエチレンジアミンで修飾した粒子（１００ｍｇ）をアルゴンのもとで１０ｍｇの化合物２と共に一晩撹拌した。混合物をろ過し、ＭｅＯＨで粒子を洗浄した。風乾した後、回収した官能化粒子の重さは１０２ｍｇだった。
【００８６】
代替の方法では、上記のようなＳＯＣｌ２との反応によって２．５０ｇのアンバーライト樹脂を酸塩化物に変換し、次いで５０ｍＬのＴＨＦ中の４．３２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと６．８ｍＬのトリエチルアミンと反応させて、ＮＨＳ−エステルで官能化された粒子を調製した。遊離の末端ＮＨ２基を含有する化合物５とこれらを反応させてカップリングを達成した。
【００８７】
（実施例１０．アクリダンで標識した微粒子の抗体との結合）
未反応の末端ＮＨ２基を含有する、アクリダンで標識した２０ｍｇ量のアンバーライト粒子を室温にて、無水ＤＭＦ１００ｍＬ中の１０２ｍｇのジスクシンイミジルオクタンジオエート（約５当量）とさらに反応させた。遠心によって粒子を分離し、１０ｘ１ｍＬのＤＭＦで洗浄した。得られた遊離のＮＨＳエステルを４℃にて一晩、ｐＨ８．５の０．１Ｍのホウ酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ中のヒツジ抗マウスＩｇＧ（１．８ｍｇ／ｍＬのストック溶液０．５ｍＬ）にカップリングさせた。反応混合物を１３ｋ ｒｐｍで遠心し、上清を除いた。スピンカラムにてＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０によって粒子を数回洗浄した。
【００８８】
１．０ｍＬのブロッキング緩衝液（１ｘＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１％スクロース）で３７℃にて１時間インキュベートすることによって、得られた抗体標識の粒子をＢＳＡでブロックした。ツイーン−ＰＢＳ洗浄緩衝液で粒子を洗浄し、１．０ｍＬの１ｘＰＢＳに保存した。
【００８９】
（実施例１１．アクリダン標識された磁性マイクロプレートの調製）
０．７ｍＬのＤＭＦとｐＨ４の０．１ＭのＭＥＳ緩衝液の溶液０．３ｍＬ中の４ｍｇの化合物５のストック溶液を調製した。ＭＥＳ緩衝液で洗浄した５０ｍｇのカルボキシル化ポリスチレン粒子（Ｄｙｎａｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０カルボン酸）に０．１ｍＬの一定分量を加えた。０．６７ｍＬのＭＥＳ緩衝液及び０．２３ｍＬのＤＭＦで混合物を稀釈した。ＥＤＣ（２３ｍｇ）を加え、混合物を一晩振盪した。上清を除き、２ｘ１ｍＬの水及び６ｘ１ｍＬのＭｅＯＨで順に粒子を洗浄し、１ｍＬのＭｅＯＨに再浮遊した。
【００９０】
標識の取り込みについて粒子を調べた。０．５ｍＬの水に１０μＬの一定分量（約０．５を含有する）を加え、１ｍｇ／ｍＬのストックを調製した。１００μＬの一定分量を過剰なＨＲＰと５分間反応させた。粒子を４ｘ１ｍＬの水で洗浄し、次いで１ｍＬの水に浮遊させた。２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、８ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のツイーン２０及び０．１Ｍの尿素過酸化物を含有するトリガー溶液（１０μＬ）を注入し、照度計で、化学発光の閃光を記録した。ブランクの１８ＲＬＵに比べて、６０４０ＲＬＵのシグナルが観察された。
【００９１】
２ｘ２００μＬの０．１ＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４にて粒子の５ｍｇ部分を洗浄し、１１７μＬのＭＥＳ緩衝液に再浮遊した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ（１．８ｍｇ／ｍＬのストック溶液から０．１５ｍｇ）を粒子に加え、３０分間混合物を振盪した。５ｍｇのＥＤＣを加え、混合物を４時間振盪した。上清を除き、３ｘ５００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のツイーン２０）で洗浄した。５００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ＋１％のスクロース）及び５ｍｇのＥＤＣに粒子を再浮遊し、室温にて１５分間撹拌し、４℃にて一晩撹拌した。上清を除き、２ｘ５００μＬの洗浄緩衝液で粒子を洗浄し、１ｍＬのＰＢＳに再浮遊した。
【００９２】
（実施例１２．標識された捕捉抗体を用いたマイクロプレートでの免疫アッセイ）
実施例６における標識された抗体の調製物に由来する分画を含有する生成物をＰＢＳ緩衝液で１：１００に稀釈した。５０μＬの一定分量を白色のポリスチレン９６穴プレートの２６ウェルのそれぞれに加えた。オービタルシェーカーにて室温でプレートを５分間激しく振盪した。溶液を除き、１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０でウェルを３回洗浄し、各工程の後、洗浄緩衝液はすべて除いた。
【００９３】
２．５％のＢＳＡと１％のスクロースを１ｘＰＢＳ中に含む結合体緩衝液にてヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：１．２ｘ１０６に稀釈した。或いは、結合体は、たとえばＦＢＳのようなほかのマトリクスで稀釈されればよい。稀釈した結合体の一定分量を２６ウェルに分配した。抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液における０ｎｇ／ｍＬ溶液と同様に、１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬを含有するＩｇＧ標準液を２倍稀釈で調製した。標準液及びゼロ溶液をウェルに分配し、最終容量５０μＬ／ウェルを達成した。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【００９４】
２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、８ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ツイーン２０及び０．１Ｍの尿素過酸化物を含有するトリガー溶液を調製した。
【００９５】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去することなく、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットを図１に示す。ゼロ溶液のシグナル＋ゼロ溶液のシグナルの標準偏差の２倍を超える、最低の較正器によって調べられる全体の範囲にわたってアッセイにより定量することができた。
【００９６】
（実施例１３．マイクロプレート免疫アッセイ、未標識の捕捉抗体及び標識されたＢＳＡ）
１ｘＰＢＳ中の４０μｇ／ｍＬの標識されていないヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の一定分量５０μＬを加えて、白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルのそれぞれを被覆した。オービタルシェーカー上にて室温でプレートを５分間撹拌した。溶液を取り除き、１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０でウェルを３回洗浄し、各工程後、洗浄緩衝液はすべて取り除いた。
【００９７】
実施例７で標識されたＢＳＡの調製に由来する生成物を含有する分画をＰＢＳ緩衝液＋１％スクロースで５０μＬ／ｍＬに稀釈した。１００μＬの一定分量を白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルのそれぞれに加えた。プレートを３７℃で１時間保持した。溶液を取り除き、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０でウェルを３回洗浄し、各工程後、洗浄緩衝液はすべて取り除いた。
【００９８】
１％ＢＳＡ及び１％スクロースを１ｘＰＢＳ中に含む結合体緩衝液で、ヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体を１：１．２ｘ１０６に稀釈した。稀釈した結合体の一定分量を２６ウェルに分配した。抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液における０ｎｇ／ｍＬ溶液と同様に、１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬを含有するＩｇＧ標準液を２倍稀釈で調製した。標準液及びゼロ溶液をウェルに分配し、最終容量５０μＬ／ウェルを達成した。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【００９９】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去しないで、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットを図２に示す。ゼロ溶液のシグナル＋ゼロ溶液のシグナルの標準偏差の２倍を超える、最低の較正器によって調べられる全体の範囲にわたってアッセイにより定量することができた。
【０１００】
（実施例１４．標識された磁性微粒子を用いた微粒子免疫アッセイ）
アクリダンと抗体を同時標識した、実施例１１の磁性微粒子の反応物５０μｇを利用する。１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で粒子を３回洗浄し、１％ＢＳＡ及び１％スクロースを含有する１ｘＰＢＳで１：１．２ｘ１０６に稀釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体に再浮遊した。粒子浮遊液を白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルに分配した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液におけるＩｇＧ標準液を連続２倍稀釈で調製し、ウェルにおける最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬ又は０ｎｇ／ｍＬを生じた。各標準液及びゼロ溶液をウェルに分配して最終反応容量５０μＬ／ウェルとした。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【０１０１】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去することなく、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットによってＩｇＧを定量することができた。
【０１０２】
（実施例１５．標識されたアンバーライト微粒子を用いた微粒子免疫アッセイ）
アクリダンと抗体を同時標識した、実施例１０のアンバーライト微粒子の反応物１００μｇを利用する。１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で粒子を３回洗浄し、１％ＢＳＡ及び１％スクロースを含有する１ｘＰＢＳで１：１．２ｘ１０６に稀釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体に再浮遊した。粒子浮遊液を白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルに分配した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液におけるＩｇＧ標準液を連続２倍稀釈で調製し、ウェルにおける最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬ又は０ｎｇ／ｍＬを生じた。各標準液及びゼロ溶液をウェルに分配して最終反応容量５０μＬ／ウェルとした。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【０１０３】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去しないで、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットによってＩｇＧを定量することができた。
【０１０４】
（実施例１６．アクリダン標識されカルボキシル修飾された微粒子の調製）
実施例１１に記載された手順に従ってＥＤＣカップリングによって、０．０２８２ｍｅｑ／ｇのカルボキシル負荷を有するカルボン酸で修飾されたポリスチレン製の１μｍの微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）を化合物５に結合させた。粒子の５２．５ｍｇ部分（１．４８マイクロモルＣＯＯＨ）を０．３９ｍｇの５で処理して確実に未反応のＣＯＯＨ基を残した。ｐＨ４のＭＥＳ緩衝液中でのＥＤＣカップリングによって遊離のＣＯＯＨ基をヒツジ抗マウスＩｇＧ（１．４８マイクロモル）にカップリングさせた。スピンカラムを用いてツイーン／ＰＢＳ緩衝液によって洗浄することにより未反応の抗体を取り除いた。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は標識された捕捉抗体を用いて本発明に従って実施される免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【図２】図２は標識されたブロッキングタンパク質と非標識の捕捉抗体を用いて本発明に従って実施される別の免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【図３】図３は標識された固体面と非標識の捕捉抗体を用いて本発明に従って実施される別の免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【図４】図４はマイクロプレートのウェルに固定された標識捕捉抗体及び検出用の過剰な抗ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた非分離免疫アッセイにおけるＩｇＧ抗原の検出を示すグラフである。
【図５】図５は標識されたブロッキングタンパク質とマイクロプレートのウェルに固定された非標識の捕捉抗体と過剰な抗ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた非分離免疫アッセイにおけるＩｇＧ抗原の検出を示すグラフである。
【図６】図６は標識された捕捉核酸を用いて本発明に従って実施される核酸ハイブリッド形成の検出工程の模式図である。
【図７】図７は標識された固相と固定された捕捉抗体と標識された分析物類縁体を用いて本発明に従って実施される競合免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００６年５月９日に出願された、本出願人の同時係属中の仮出願番号６０／７９８，８３９に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、既知の方法に比べて簡略化されている特異的な結合反応を含む新規のアッセイ方法に関する。アッセイ方法は、検出工程に先立って過剰の検出標識の除去又は分離を必要としないので、非分離アッセイと呼ばれる。該方法は、免疫アッセイ、受容体／リガンドのアッセイ及び核酸のハイブリッド形成アッセイを含む種々のアッセイに適用可能である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
感受性、動的範囲、堅牢性、幅広い適用性及び自動化への好適性における本質的な利益を保持しながら、アッセイの開発、特に、アッセイの設計を簡略化する免疫アッセイの開発の領域において多大な尽力が費やされている。アプローチの１つは、検出可能に標識されて添加された特異的結合のパートナーの分離を使用しない、いわゆる均質アッセイ法を考案することであった。この種の方法は、結合反応の結果として、作動する又は停止する検出原理を考案することに頼っている。対照的に、均質アッセイ法は、定量する前に、結合した検出可能に標識された特異的結合パートナーと遊離の検出可能に標識された特異的結合パートナーを物理的に分離することに頼っている。
【０００４】
多数の米国特許が、均質酵素免疫アッセイの分野で公表されている。多くは、標識された酵素を活性化する又は阻害するための抗原抗体結合反応を活用する：米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５２，１５７号；同第３，８７５，０１１号；同第３，９６６，５５６号；同第３，９０５，８７１号；同第４，０６５，３５４号；同第４，０４３，８７２号；同第４，０４０，９０７号；同第４，０３９，３８５号；同第４，０４６，６３６号；同第４，０６７，７７４号；同第４，１９１，６１３号；及び同第４，１７１，２４４号、同第４，７８５，０８０号。そのほかの均質免疫アッセイには、抗体又はそのほかの蛍光消光剤を介して蛍光を消す様々な方法が関与する：米国特許第３，９９８，９４３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，１７４，３８４号；同第４，１６１，５１５号；同第４，２０８，４７９号及び同第４，１６０，０１６号。免疫アッセイの類別型のこの分野におけるさらにそのほかの米国特許には、米国特許第３，９３５，０７４号；同第４，１３０，４６２号；及び同第４，１９３，９８３号が挙げられる。米国特許第４，１６０，６４５号は、標識として電子伝達触媒を用いるアッセイ方法を開示している。抗体に結合させることによって触媒（標識）を不活化する。
【０００５】
Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， （Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２１６， １８５−１９４ （１９８３））は、競合アッセイの構成で抗原に結合させた化学発光供与体（Ａｇ−Ｌ）と抗体に結合させた蛍光受容体（Ａｂ−Ｆ）との間でのエネルギー転移を用いる検出方法を開示している。複合体の抗原は最終的には蛍光発光物質の波長で放射するが、遊離の抗原は、化学発光標識の特徴的な波長で放射する。その後、２つの波長で光の強度を測定し、２つのシグナルの比を試料中の分析物の量に関係付ける。
【０００６】
種々のそのほかの均質免疫アッセイが知られている： Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎらの米国特許第３，８１７，８３７号（均質酵素免疫アッセイ）、Ｕｌｌｍａｎらの米国特許第３，９９６，３４５号（蛍光消光均質免疫アッセイ）、Ｍａｇｇｉｏらの米国特許第４，２３３，４０２号（酵素チャネリング均質酵素免疫アッセイ）、及びＢｏｇｕｓｌａｓｋｉらのカナダ特許第１，０８２，５７７号（ハプテン−補因子均質酵素免疫アッセイ）。
【０００７】
Ｕｌｌｍａｎへの米国特許第６，４０６，９１３号は、分析物が光増感剤と化学発光化合物を近傍に近づけるような条件下で、分析物を含有していることが疑われる媒体を処理することを含むアッセイ方法を開示している。光増感剤は一重項酸素を発生させ、それは、溶液を介して化学発光化合物に拡散し、近傍に近づいたとき、化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光化合物は続いて光を生成する。生成される光の量は、媒体における分析物の量に関係する。実施態様の１つでは、光増感剤と化学発光化合物の少なくとも一方が浮遊可能な粒子に会合し、特異的結合対のメンバーがそれに結合する。
【０００８】
ＭｃＣａｐｒａへの米国特許第５，５１６，６３６号は、標識として増感剤を利用する特異的結合アッセイを含むアッセイ方法を開示している。増感剤は、放射線、電子伝達、電解質、電気発光又はエネルギー転移によって刺激されると励起状態を達成し、それは（ａ）分子酸素と相互作用する際、一重項酸素を生成し、又は（ｂ）ロイコ染料と相互作用する際、酸素によって還元されて過酸化水素を生じる。そのほかの試薬の添加を伴った、励起された増感剤との相互作用は、検出可能なシグナルを生成する。
【０００９】
均質アッセイ又は非分離アッセイの構成を考案する相当な尽力にもかかわらず、それらは、広範囲に及ぶ商業的採用を依然として経験していない。均質アッセイは、たとえ操作上さらに複雑であっても開発し、大量生産するのにさらに単純であるとみなされる。特に、大量の臨床免疫診断の分野及び臨床的な核酸診断のさらに小さな分野は、均質アッセイの構成が優位を占める。この領域の範囲内で、試験の構成は、プロトコールを簡略化する、複雑さを減らす、不必要な工程を除去することによって自動化との相性を改善する分野で有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
側面の１つでは、本発明は、既知の方法に比べて簡略化された特異的結合反応、特に免疫アッセイを含む新規のアッセイ方法を提供する。検出工程の前の分離及び洗浄の工程を排除することによってアッセイが簡略化されるので、非分離アッセイとみなされる。該方法は、固定された化学発光化合物及び化学発光反応を誘導するための特異的結合パートナーに結合された活性化剤化合物を特徴とする。分析物が介在する、化学発光標識化合物と活性化剤結合体の同時局在は、結合した分析物分子の部位でのみ生じる確実な化学発光反応を引き起こす。結合していない、過剰の活性化剤結合体の存在は、化学発光反応に寄与することもなければ、それに干渉することもない。その結果、放射される化学発光の強度は分析物の量に比例する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
アルキル−Ｈ以外の１以上の置換基で置換することができる１個〜２０個の炭素を含有する分枝鎖、直鎖又は環状の炭化水素基。本明細書で使用されるとき、低級アルキルは８までの炭素を含有するアルキル基を言う。
【００１２】
分析物−アッセイで検出されるべき試料中の物質。分析物に特異的な結合親和性を有する１以上の物質を用いて分析物を検出する。分析物は、タンパク質、抗体、それに結合する抗体が作製されてもよいハプテンであってもよい。分析物は、相補的な核酸によって結合される核酸であってもよい。分析物は、特異的結合対のメンバーを形成する任意のそのほかの物質であってもよい。
【００１３】
アラルキル−アリール基で置換されたアルキル基。
【００１４】
アリール−Ｈ以外の１以上の置換基で置換することができる１個〜５個の炭素環式の芳香族環を含有する芳香族環含有の基。
【００１５】
生体材料−全血、抗凝固剤処理した全血、血漿、血清、組織、細胞、細胞の内容物及びウイルスを含む。
【００１６】
化学発光化合物−電子的に励起された状態で形成される別の化合物に変換されることを結果的に生じる反応を受ける化合物。励起された状態は一重項又は三重項の励起状態でもよい。励起された状態は、弛緩の際、基底状態に直接、光を放射し、又は励起エネルギーを放射エネルギー受容体に転移し、それによって基底状態に戻ってもよい。エネルギー受容体は過程中に励起状態に上げられ、光を放射する。
【００１７】
試料−核酸を含有する又は核酸を含有することが疑われる液体。本発明の方法で使用することができる典型的な試料には、採血分析物で普通に見い出されるような、抗凝固処理した血液であってもよい血液、血漿、血清、尿、精液、唾液のような体液、細胞培養物、組織抽出物などが挙げられる。そのほかの種類の試料には、溶媒、海水、産業水試料、食物試料、及び土壌又は水のような環境試料、植物材料、真核生物、細菌、プラスミド及びウイルス、真菌、原核生物に由来する細胞が挙げられる。
【００１８】
固相材料−アッセイ成分がその上に固定される表面を有する材料。材料は、粒子、微粒子、ナノ粒子、繊維、ビーズ、膜、フィルター、並びに試験管及びマイクロウェルのようなそのほかの担体の形態であってもよい。
【００１９】
特異的結合対、特異的結合パートナー−ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡのキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンを含む、別の物質に対して特異的な結合親和性を有する生体分子を含む分子。特異的結合のパートナーは、活性化剤又は化学発光化合物のいずれかの１以上の分子に結合される。
【００２０】
置換される−非水素基による少なくとも１つの水素基の置き換えを言う。置換された基に関して、明らかに指示されない限り、置換の複数点が存在することが意図されることに言及すべきである。
【００２１】
本発明は、特異的結合対の反応によって物質を検出するための迅速で且つ単純なアッセイ方法に関する。該方法は、固定された化学発光化合物と、化学発光反応を誘導するための特異的結合パートナーに結合された活性化剤化合物とトリガー溶液の使用を必要とする。該方法には、分析物を検出するための１以上の特異的結合対の反応が関与する。標識された特異的結合パートナーが分析物に結合した結果、活性化剤が固定された化学発光化合物の近傍に近づけられるので、トリガー溶液を添加する際、化学発光を発生する反応を活性化するのに有効である。活性化剤−標識された特異的結合パートナーは、分析物すべてを結合するのに必要とされる量に対して過剰で系に提供される。過剰な結合していない活性化剤結合体は、反応に参画することができないので、トリガー溶液の添加及び検出に先立って除かれることはない。
【００２２】
従って、本方法は、分析物と特異的に会合される量に対して大過剰で存在する未結合の活性化剤結合体の除去を必要としない点で従来の試験方法とは異なる。洗浄又は分離を行うことなく、分析物を含有する試料、活性化剤結合体及びトリガー溶液を試験容器に順に加え、発光を読み取ることができる。或いは、試料及び活性化剤結合体を事前に混合し、トリガー溶液を導入する前に、分析物を捕捉するための特異的結合パートナーを含有し、固定された化学発光標識を含有する試験容器に加えてもよい。過剰な未結合の活性化剤結合体の洗浄又は分離は必要とされない。当該技術で既知の従来の化学発光アッセイとの差異の別の点は、光生成に参画する化学発光化合物も、活性化剤（たとえば、ペルオキシダーゼ）も溶液中で遊離して拡散することはないという事実にある。両者は空間的には拘束されている。部分的には、この結果、シグナル発生は、持続時間が短い傾向がある。
【００２３】
化学発光基質及び酵素標識した結合体を用いる従来のアッセイは、標識酵素の量に対して大過剰で基質を提供する。基質／酵素のモル比は、１０の９乗を超える、すなわち、１０億倍過剰であってもよいことが多い。連続する酵素の代謝回転に対して基質を適当に確実に供給するためにそのような大過剰の化学発光化合物を供給することが必要であり、この過程がアッセイ方法における適当な検出感度を保証すると考えられている。出願者は、この比を数桁の程度軽減する感度の高いアッセイ方法を考案することが可能であることを見い出した。この点で、これらの方法は既知の方法とは根本的に異なる。
【００２４】
上述したように、又、以下に記載される例示となるアッセイで実証されるように洗浄及び分離の工程を排除することは、アッセイプロトコールの設計を簡略化する機会を与える。操作工程の数が減ると、アッセイ時間、不完全な洗浄に由来するアッセイ間の変動及びコストが減る。同時に、それは、自動化及び小型化に付随する固有の利点すべてと共にアッセイ性能を自動化し、小型化する能力を高める。
【００２５】
本方法に従って行なわれるアッセイには、４つの工程が関与する。第１の工程では、当該分析物を特異的に捕捉するための試験装置に固相が提供される。固相には、検出されるべき分析物のための、固定された特異的結合パートナーが提供される。固相にはさらに、それに固定された化学発光標識する化合物が提供される。化学発光標識は、以下でさらに詳しく記載されるように多数の異なった方法で提供されてもよい。各変形例では、化学発光標識は、それを不動にするような方法で物質又は材料に不可逆的に結合される。第２の工程では、分析物のための、固相に固定され、特異的結合複合体を形成できる特異的結合パートナーを有する試験装置に、分析物を含有する試料及び活性化剤結合体を導入する。試料及び活性化剤結合体は別々に順に加えてもよく、又は同時に加えてもよく、又は事前に混合し、組み合わせとして加えてもよい。結合反応を起こす任意の遅延時間をこの点で挿入することができる。第３の工程では、トリガー溶液を加えて分析物を検出するための化学発光を生成する。最後に化学発光を検出する。好ましくは、ピークの光強度レベル又は合計積算光強度のいずれかを測定する。一般に知られた方法に従って較正曲線を作図することによって光の量を分析物の量に関係付けることができる。トリガー溶液の添加後、光の放射が迅速に起きる場合、好適な注入器による添加に対して測定の開始を機械的に調節するか、又はすでに検出器に暴露された試験装置によって添加を行うかのいずれかが望ましい。
【００２６】
（アッセイの構成及び固体支持体）
本発明の方法では、化学発光標識化合物が試験系の成分に固定される。幾つかの方法のいずれかによってこれを達成することができる。実施態様の１つでは、化学発光標識は、分析物のための、固定された特異的結合パートナーに共有結合される。例は、マイクロプレートのウェルに固定された捕捉抗体である。特異的結合のパートナーの固定は共有結合又は吸収法によればよい。図１に示されるこの構成では、「サンドイッチ」の構成で双方とも分析物に結合する２つの特異的結合パートナーによって化学発光標識は活性化剤と会合する。図２に示される別の実施態様では、無作為の様式で固体支持体に固定される補助物質に化学発光標識は共有結合される。補助物質の固定は共有結合又は吸収法によればよい。それによって標識は多かれ少なかれ均一に、固体支持体の表面に分配される。たとえば、分析物に対する未結合の特異的結合パートナーによって、表面に分析物を引き寄せるために手段が提供される。担体の表面に不活性に塗布された補助物質に結合された化学発光標識の近傍に活性化剤を近づける特異的結合反応によって化学発光標識は活性化剤に関わるようになる。別の実施態様では、化学発光標識は固体支持体の表面に共有結合される。図３に示すように、それによって標識は多かれ少なかれ均一に、固体支持体の表面に分配される。たとえば、分析物に対する未結合の特異的結合パートナーによって、表面に分析物を引き寄せるために手段が提供される。担体の表面に直接結合された化学発光標識の近傍に活性化剤を近づける特異的結合反応によって化学発光標識は活性化剤に関わるようになる。次いで、洗浄又は分離を行うことなく、トリガー溶液が添加され、化学発光が測定される。
【００２７】
別の実施態様は、活性化剤−分析物の結合体を含む分析物の類縁体を使用する変形物を含む。分析物類縁体と分析物は、分析物に対する特異的結合パートナーに競合して結合する。この種のアッセイ方法では、試料中の分析物の量と化学発光の強度との間に負の相関が生じることが明らかであろう（図７）。
【００２８】
免疫アッセイを介して抗原又はそのほかのタンパク質又はそのほかの抗体を結合するための抗体を介した化学発光標識の結合に加えて、本方法は、相補的な核酸の結合を介して核酸を検出するために化学発光標識された核酸を使用することができる。この点での使用には、核酸のサイズに関して特に限定されないが、唯一の基準は、相補的なパートナーが安定なハイブリッド形成ができるように十分な長さであることである。本明細書で使用されるとき、核酸には、遺伝子の長さの核酸、核酸のさらに短い断片、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられるが、それらはいずれも一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。特異的結合パートナーとして核酸を用いる本発明の実践では、核酸は、固体支持体の表面に共有結合して、又は物理的に固定されて分析物核酸を捕捉する。化学発光標識は、図６に模式的に示すように、捕捉核酸に結合してもよく、又は上で説明したように、標識は固相に直接結合してもよい。捕捉核酸は、分析物核酸の配列領域に相補的な完全な又は実質的に完全な配列を有する。実質的に相補的である場合、捕捉核酸は、分析物とのハイブリッド形成を干渉しない又は妨害しないという条件で、分析物とは相補的ではない末端オーバーハング部、末端ループ部又は内部ループ部を保有してもよい。分析物核酸の中にオーバーハング又はループがある場合、逆の状況が生じてもよい。捕捉核酸、分析物核酸及び活性化剤結合体及び第３の核酸をハイブリッドに形成することができる。第３の核酸は、捕捉核酸に相補的な領域と異なる分析物核酸の配列領域に対して実質的に相補的である。捕捉核酸及び活性化剤結合体核酸と分析物とのハイブリッド形成は、順に又は同時に行うことができる。この過程の結果、担体の表面に直接結合された化学発光標識に活性化剤を近づける特異的なハイブリッド形成反応によって化学発光標識は活性化剤に関わるようになる。上述のように、トリガー溶液が提供され、化学発光が検出される。
【００２９】
別の実施態様は、活性化剤との分析物の結合体を使用する変形物を含む。分析物核酸−活性化剤結合体と分析物核酸は、分析物核酸に対する特異的結合パートナーに競合して結合する。この種のアッセイ方法では、試料中の分析物の量と化学発光の強度との間に負の相関が生じることが明らかであろう。
【００３０】
抗体に基づく系及び核酸に基づく系に加えて、結合アッセイの当業者に一般に知られるようなそのほかの特異的結合パートナーは、本発明に係る試験方法の基礎として役立ってもよい。フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン及びニトロフェニル／抗ニトロフェニルの対は例示である。さらなる例として、周知の（ストレプト）アビジン／ビオチンを利用することができる。この結合対を使用すればよい方法の１つを説明すると、ストレプトアビジン−化学発光標識結合体を固体支持体に共有結合する、又は吸着させることができる。次いで、ビオチン標識された分析物と活性化剤の結合体を加えるが、その際、結合体は抗ビオチン抗体又は抗分析物抗体に結合させる。複合体を形成した後、トリガー溶液を加え、上記のように検出を行う。当業者に思い浮かぶこれら及びそのほかの例は、本発明方法の範囲内であるとみなされる。
【００３１】
本発明の実践に有用な固体支持体は、種々の材質、形状及び大きさのものであってもよい。９６穴、３８４穴又はさらに数の多い変形体のマイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロース、紙又はプラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子、磁性粒子、特に０．１〜１０μｍの平均径を有するもの、種々の材質のナノ粒子を含む結合アッセイにすでに使用されている材料はすべて、化学発光標識を結合するための及び特異的結合パートナーを固定するための有用な固体支持体を提供することができる。本開示は、本アッセイ方法で使用するためにそのような材料を官能化する方法を教示する。特に、化学発光標識する化合物と、たとえば抗体のような特異的結合パートナーの双方を同一表面、特に微粒子に結合する方法が開示される。
【００３２】
（化学発光標識化合物）
本発明の実践で化学発光標識として使用される化合物は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧを有し、式中、ＣＬは化学発光部分を示し、Ｌは化学発光部分と反応基を連結する連結部分を示し、ＲＧは別の物質にカップリングする反応基を示す。化学発光部分ＣＬは含む。ＣＬ基と活性化剤とトリガー溶液の化学発光反応が迅速であり、望ましくは極めて短い時間範囲で起きることが望ましいが、必要ではない。
【００３３】
好ましい化学発光化合物は、酸化され、活性化剤とトリガー溶液の存在下で化学発光を生成することが可能である。リンカー及び反応基の取り込みによって化学発光標識として役立つ例示となる部類の化合物には、ルミノール、及びイソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）、アミノヘキシルエチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、環置換のアミノフタルヒドラジド類、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド類、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド類、ピレンジカルボン酸ヒドラジド類、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジドを含む構造的に関連した環状ヒドラジド類、並びにＭａｓｕｙａらへの米国特許第５，４２０，２７５号及びＹａｍａｇｕｃｈｉらへの米国特許第 ５，３２４，８３５号に開示されたそのほかのフタラジンジオン類縁体が挙げられる。
【００３４】
化学発光部分の別の部類には、米国特許第５，４９１，０７２号、同第５，５２３，２１２号、同第５，５９３号、８４５号及び同第６．０３０，８０３号で開示されたアクリダンエステル類、チオエステル類及びスルホアミド類が挙げられる。
【００３５】
別の部類の化学発光部分には、米国特許第５，９２２，５５８号；同第６，６９６，５６９号；及び同第６，８９１，０５７号で開示された複素環化合物が挙げられる。これらの化合物は好ましくは、窒素、酸素若しくはイオウを含有する５若しくは６員環を好ましくは含む複素環を含み、又は環外の二重結合を結合し、酸素原子及びイオウ原子から選択される２つの原子で末端炭素が置換される複数の環基を含む。
【００３６】
過酸化水素とペルオキシダーゼの作用によって化学発光を生成することが知られている化合物は、本発明で使用される化学発光標識化合物の化学発光部分として機能することが考慮される。キサンテン染料、芳香族アミン類及び複素環式アミン類を含む様々な構造的部類の多数のそのような化合物が、当該技術ではこれらの条件下で化学発光を生成することが知られている。
【００３７】
本発明の方法で有用な化学発光標識化合物の好ましい基は、式Ｉを有するアクリダン化合物を含み、
【００３８】
【化６】
（式中、基Ｒ１〜Ｒ１１の少なくとも１つは、式−Ｌ−ＲＧの標識置換基であり、その際、Ｌは結合であってもよい連結基又は別の二価又は多価の基であり、ＲＧは化学発光標識する化合物が別の化合物に結合するのを可能にする反応基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素若しくは非干渉の置換基である。標識置換基−Ｌ−ＲＧは、置換基としてＲ３又はＲ４〜Ｒ１１の１つに存在することもできるが、好ましくはＲ１又はＲ２の１つに存在する。
【００３９】
式Ｉの化合物における基、Ｒ１及びＲ２は、光生成を可能にするＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンの原子から選択される１〜約５０の非水素原子を含有する有機基であってもよい。後者によって、式Ｉの化合物が本発明の反応を受ける場合、励起状態の生成物化合物が生成され、１以上の化学発光中間体の生成が関与してもよいことを意味する。励起状態の生成物は直接、光を放射することができ、又は蛍光受容体から放射されるべき光を生じるエネルギー転移を介して蛍光受容体に励起エネルギーを転移することができる。Ｒ１及びＲ２は好ましくは、１個〜２０個の炭素原子の置換又は非置換のアルキル基、置換又は非置換のアルケニル基、置換又は非置換のアルキニル基、置換又は非置換のアリール基、置換又は非置換のアラルキル基から選択される。Ｒ１又はＲ２が置換された基である場合、それは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３〜２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、四級アンモニウム基、四級ホスホニウム基から選択される１個〜３個の原子又は基によって置換される。好ましい実施態様では、Ｒ１又はＲ２は好ましくは、式−Ｌ−ＲＧの標識置換基で置換され、その際、Ｌは連結基であり、ＲＧは反応基である。
【００４０】
Ｒ３基は、基における原子の価数を満たすのに必要とされるＨ原子の必要な数に加えて、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンの原子から選択される１個〜５０個の非水素原子を含有する有機基である。さらに好ましくは、Ｒ３は１個〜２０個の非水素原子を含有する。有機基は好ましくは、１個〜２０個の炭素原子のアルキル基、置換アルキル基、置換又は非置換のアルケニル基、置換又は非置換のアルキニル基、置換又は非置換のアリール基、置換又は非置換のアラルキル基から成る群から選択される。Ｒ３についてさらに好ましい基には、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ４のアルキル基、フェニル、置換又は非置換のベンジル基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基及びアルキルスルホン酸基が挙げられる。Ｒ３基はＲ７又はＲ８と結合して５又は６員環の環を完成させてもよい。実施態様の１つでは、Ｒ３は式−Ｌ−ＲＧの標識置換基で置換される。
【００４１】
式Ｉの化合物では、基Ｒ４〜Ｒ１１はそれぞれ独立してＨ、又は生成されるべき励起状態の生成物を可能にし、一般にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンの原子から選択される１個〜５０個の原子を含有する置換基である。存在してもよい代表的な置換基には、限定しないで、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン基、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキサミド基、シアノ基及びスルホネート基が挙げられる。隣接する基の対、たとえば、Ｒ４−Ｒ５又はＲ５−Ｒ６は一緒に結合して、２つの基が結合する環に縮合する少なくとも５又は６員環の環を含む炭素環状又は複素環状の系を形成してもよい。そのような縮合した複素環は、Ｎ、Ｏ又はＳの原子を含有してもよく、上述のような、Ｈ以外の環置換基を含有してもよい。１以上の基Ｒ４〜Ｒ１１が式−Ｌ−ＲＧの標識置換基であってもよい。Ｒ４〜Ｒ１１は、水素、ハロゲン、及びメトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどのようなアルコキシ基から選択されることが好ましい。化合物の好ましい基はハロゲンとしてのＲ５、Ｒ６、Ｒ９又はＲ１０の１つを有し、Ｒ４〜Ｒ１１のそのほかは水素原子である。
【００４２】
化合物の特性を改変するために、又は合成の利便性を提供するために、種々の量で、アクリダン環の選択された環又は鎖にて置換基を組み入れることができる。そのような特性には、たとえば、化学発光の量子収量、酵素との反応の速度、光の最大強度、光放射の持続時間、光放射の波長及び反応媒体における溶解性が挙げられる。具体的な置換基及びその効果は以下の具体的な実施例で説明するが、それらは、決して本発明の範囲を限定するとみなされるものではない。合成の都合上、式Ｉの化合物は望ましくは、水素原子としてのＲ４〜Ｒ１１のそれぞれを有する。
【００４３】
連結基（Ｌ） 連結基は、結合、原子、二価の基及び多価の基、又は一部が環構造の一部であってもよい原子の直鎖若しくは分枝鎖であってもよい。置換基は普通、１〜約５０の非水素原子、さらに普通には、１〜約３０の非水素原子を含有する。鎖を構成する原子は、 Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、Ｂ、及びＳｅの原子から選択され、好ましくはＣ、Ｏ、Ｎ、Ｐ及びＳの原子から選択される。ハロゲン原子は置換基として鎖又は環に存在してもよい。連結置換基を構成する典型的な官能基には、アルキレン、アリーレン、アルケニレン、エーテル、ペルオキシド、ケトンとしてのカルボニル、エステル、カーボネートエステル、チオエステル、又はアミノ基、アミン、アミジン、カルバメート、尿素、イミン、イミド、イミデート、カルボジイミド、ヒドラジン、ジアゾ、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネートエステル、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホネートエステル、サルフェートエステル及びチオ尿素の基が挙げられる。
【００４４】
反応基 反応基は、その存在が共有結合又は物理的な力によって別の分子への結合を円滑にする原子又は基である。一部の実施態様では、反応基が、たとえば、ハロゲン原子又はトシレート基のような脱離基であり、化学発光標識化合物が求核置換反応によって別の化合物に共有結合する場合、本発明の化学発光標識化合物の別の化合物への結合には、反応基からの１以上の原子の喪失が関与する。他の実施態様では、たとえば、ミカエル付加のような付加反応にて生じるとき、又は反応基がイソシアネート基若しくはイソチオシアネート基である場合、共有結合形成による化学発光標識化合物の別の化合物への結合には、反応基内での結合の認識が関与する。さらに他の実施態様では、結合には共有結合形成は関与しないが、物理的力が関与し、その場合、反応基は未変化のままである。物理的力によって、たとえば、水素結合、静電気の引力又はイオンの引力、塩基スタッキングのような疎水性の引力のような引力、並びにたとえば、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原／抗体及びヌクレオチド／ヌクレオチドの相互作用のような特異的な親和性の相互作用を意味する。
【００４５】
表１．有機分子及び生体分子への標識の化学的結合のための反応基
【００４６】
【化７】
【００４７】
【化８】
好ましい反応基には、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエーテル及びマレイミドの基が挙げられる。
【００４８】
二官能性のカップリング試薬を用いて、緩やかな反応基によって標識を有機分子及び生体分子にカップリングすることができる（Ｌ． Ｊ． Ｋｒｉｃｋａ， Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｅｒ Ａｓｓａｙｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８５， ｐｐ． １８−２０， Ｔａｂｌｅ ２．２ ａｎｄ Ｔ． Ｈ Ｊｉ， ”Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ， ９１， ５８０−６０９ （１９８３）を参照のこと）。２種類の二官能性試薬がある：最終的な構造に組み入れられるもの及び組み入れられず、２つの反応物質のカップリングのみに役立つもの。
【００４９】
化合物の好ましい基は式ＩＩを有し、式中、Ｒ４〜Ｒ１１は水素原子である。基Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記と同義である。
【００５０】
【化９】
式Ｉを有する好ましい標識化合物は、基Ｒ１又はＲ２上の置換基として基−Ｌ−ＲＧを有する。好ましい標識化合物は式ＩＩＩを有する。
【００５１】
【化１０】
代表的な好ましい標識化合物及び他の分子への結合におけるそれらの使用及び固体表面については、以下の具体的な実施例で記載する。
【００５２】
（活性化剤結合体）
活性化剤化合物は、活性化剤−特異的結合パートナーの結合体の一部を形成する。結合体は２重の機能：１）アッセイにおいて特異的結合パートナーの部分を介して直接、又は中間の特異的結合パートナーを介して分析物に特異的に結合すること、及び２）活性化剤部分を介して化学発光化合物を活性化すること、の役目を果たす。結合体の活性化剤部分は、化学発光化合物の活性化を達成する化合物なので、トリガー溶液の存在下で化学発光が生成される。活性化剤として役立つことが可能である化合物には、遷移金属の塩及び錯体及び酵素、特に遷移金属を含有する酵素、最も特には、ペルオキシダーゼ酵素が挙げられる。活性化剤化合物で有用な遷移金属には、周期律表の３〜１２族、特に、鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムが挙げられる。シグナル発生に関与する活性化剤分子は物理的に限定された範囲内で作動すればよく、限定された供給の化学発光化合物と接触するのみでよいことが言及されるべきである。このことは、活性化剤がその可能性を持っている場合、大きな触媒的代謝回転を排除すると思われる。
【００５３】
化学発光反応を受けてもよいペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、たとえば、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、真菌のペルオキシダーゼ、たとえば、リグニンペルオキシダーゼ及びＡｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ由来のペルオキシダーゼ及び白腐れ病真菌で産生されるＭｎ依存性のペルオキシダーゼ及び大豆ペルオキシダーゼが挙げられる。たとえば、ヘム及びＭｎ−ＴＰＰＳ４（Ｙ．−Ｘ． Ｃｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ５２， ２５７−６２ （１９９５））のような鉄錯体を含む、酵素ではないが、ペルオキシダーゼ様の活性を持つそのほかのペルオキシダーゼ模倣体化合物が知られ、それらは基質の化学発光酸化を触媒し、本明細書で使用されるとき、ペルオキシダーゼの意味の範囲内であると明白にみなされる。
【００５４】
ペルオキシダーゼと生体分子との結合体又は複合体は、結合体がペルオキシダーゼ活性を示すという条件で化学発光を生成する方法で使用することができる。ペルオキシダーゼの１以上の分子に結合されてもよい生体分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡのキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンが挙げられる。生体分子への結合のために官能化されるリポソーム、ミセル、小胞及びポリマーのようなペルオキシダーゼを含む又は組み入れる複合体も本発明の方法で使用することができる。
【００５５】
（トリガー溶液）
トリガー溶液は、化学発光に必要な励起状態の化合物を発生するのに必要な反応物質を提供する。反応物質は、化学発光標識と直接反応することによって化学発光反応を行うのに必要なものであってもよい。それは、この機能の代わりに、又はそれに加えて、活性化剤化合物の作用を促進する。これは、たとえば、活性化剤がペルオキシダーゼ酵素である場合である。好ましい実施態様では、トリガー溶液は過酸化物化合物を含む。過酸化物化合物は、ペルオキシダーゼと反応することが可能である任意の過酸化物又はアルキルヒドロペルオキシドである。好ましい過酸化物には、過酸化水素、過酸化尿素及び過ホウ酸塩が挙げられる。代表的な実施態様は、活性化剤としてのペルオキシダーゼ結合体、分析物のアクリダン標識物を使用し、その際、アクリダン標識は、特異的結合パートナーを上記式ＩＩＩの化合物と反応させることによって提供され、トリガー溶液は過酸化水素を含む。過酸化物はペルオキシダーゼと反応して、多分、酵素の活性部位におけるイオンの酸化状態を異なった酸化状態に変える。酵素のこの変化した状態は、酵素の近傍に保持されるアクリダン標識と反応する。化学発光反応はさらに、化学発光化合物から形成される中間体と過酸化物との反応を含み、最終的には反応生成物と光を生成する。
【００５６】
特定の増進剤化合物をトリガー溶液に組み入れることによって、酵素の反応性を促進する。増進剤の中に含まれるのは、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，１７１，６６８号及び同第５，２０６，１４９号に記載されるようにそのほかのペルオキシダーゼ反応を増進することが知られているフェノール性化合物及び芳香族アミンである。参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，５１２，４５１号で開示されたような置換及び非置換のアリールホウ酸及びそのエステル及び無水物誘導体も本発明で有用な増進剤の範囲内であるとみなされる。好ましい増進剤には、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−インドフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール及び６−ブロモ−２−ナフトールが挙げられるが、これらに限定されない。上述のこれらの部類からの１より多い増進剤の混合物も採用されてもよい。
【００５７】
本発明の化合物からの化学発光の生成を高めるのに有効であることが見い出された追加の増進剤は、フェノキサジンの誘導体及び以下の式を有するフェノチアジンである。
【００５８】
【化１１】
フェノキサジン及びフェノチアジンの増進剤の窒素原子上で置換されたＲ基には、１個〜８個の炭素原子のアルキル及びスルホン酸塩基又はカルボン酸塩基で置換された１個〜８個の炭素原子のアルキルが挙げられる。好ましい増進剤には、３（Ｎ−フェノチアジニル）−プロパンスルホン酸塩、３−（Ｎ−フェノキサジニル）プロパンスルホン酸塩、４−（Ｎ−フェノキサジニル）ブタンスルホン酸塩、５−（Ｎ−フェノキサジニル）ペンタン酸塩及びＮ−メチルフェノキサジン及び関連する同族体が挙げられる。
【００５９】
本発明の検出反応は、通常、水性緩衝液中であるトリガー溶液とともに行われる。好適な緩衝液には、化学発光を進めることができる環境を維持することが可能である一般に使用される任意の緩衝液が挙げられる。通常、トリガー溶液は、約５〜約１０．５の範囲内でのｐＨを有する。例示となる緩衝液には、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、［トリス］、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミンＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。
【００６０】
トリガー溶液は、１以上の界面活性剤又はポリマー界面活性剤を含有して、光生成反応の発光効率を高める又はアッセイのシグナル／ノイズ比を改善することができる。本発明の実践で有用な非イオン性の界面活性剤には、例示として、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール類、ポリオキシエチレン化アルコール類、ポリオキシエチレン化エーテル類及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステル類が挙げられる。たとえば、ＣＴＡＢのような四級アンモニウム塩化合物及び四級ホスホニウム塩化合物を含むモノマーのカチオン性の界面活性剤を使用することができる。四級アンモニウム及びホスホニウム塩基を含むものを含むポリマーのカチオン性の界面活性剤もこの目的で使用することができる。
【００６１】
本方法で放射された光は、好適な既知の手段、たとえば、照度計、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンタ、化学光量計によって、又は視覚的に検出することができる。各検出手段は、異なったスペクトルの感度を有する。ヒトの眼は緑色光に最適に感受性であり、ＣＣＤカメラは赤色光に最大の感度を示し、ＵＶ〜青色光又は緑色光のいずれかに最大の応答を持つＸ線フィルムも利用可能である。検出装置の選択は、コスト、利便性の適用及び考慮によって、及び創製又は永続的な記録を必要とするかどうかによって支配される。光放射の時間経過が迅速であるそれらの実施態様では、検出装置の存在下で誘発反応を行って発光を生成することが有利である。一例として、検出反応は、照度計に格納された試験管若しくはマイクロウェルプレート内で、又は試験管若しくはマイクロウェルプレートに適合した筺体におけるＣＣＤカメラの前に設置された試験管若しくはマイクロウェルプレート内で行ってもよい。
【００６２】
（使用）
本アッセイ方法は、多数の種類の特異的結合対のアッセイで適用性が見い出される。これらの中で最も重要なのは、ＥＬＩＳＡのような化学発光酵素連結免疫アッセイである。免疫化学の工程を実施するための種々のアッセイの構成及びプロトコールは当該技術で周知であり、競合アッセイ及びサンドイッチアッセイが含まれる。本発明に係る免疫アッセイによってアッセイすることができる物質の種類には、タンパク質、抗体、ハプテン、薬剤、ステロイド及び免疫アッセイの技術で一般に知られているそのほかの物質が挙げられる。
【００６３】
本発明の方法はまた、酵素標識した核酸プローブの使用によって核酸を検出するのにも有用である。例示となる方法には、溶液ハイブリッド形成アッセイ、サザンブロットにおけるＤＮＡの検出、ノーザンブロットによるＲＮＡ、ＤＮＡの配列決定、ＤＮＡのフィンガープリント、コロニーハイブリッド形成及びプラークリフト、当業者に周知である処理が挙げられる。
【００６４】
前述の抗原／抗体の対、ハプテン／抗体の対又は抗体／抗体の対に加えて、特異的結合の対には、相補的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、ホルモン／受容体、レクチン／糖質、ＩｇＧ／プロテインＡ、核酸／核酸結合タンパク質、及び核酸／抗核酸抗体が挙げられる。薬剤候補のスクリーニングに使用される受容体アッセイは、本方法への使用の別の領域である。上述の３つの成分のサンドイッチ手法又は２つの成分の競合手法によってこれらの結合対のいずれかを本方法における使用に適合させてもよい。
【００６５】
本発明は、本発明の方法に従ってアッセイを行うためのキットを提供することも企図する。キットは、包装された組み合わせにおいて、遊離の標識化合物としての化学発光標識、化学発光標識された特異的結合のパートナー、化学発光で誘導体化された固体支持体、たとえば、粒子若しくは微粒子、又はブロッキングタンパク質のような化学発光で標識された補助物質を、トリガー溶液及び使用の指示書とともに含む。化学発光標識がユーザーによって行われるのであれば、キットは任意で、活性化剤結合体、分析物較正器、稀釈剤及び反応緩衝液を含有してもよい。
【実施例】
【００６６】
（実施例１．化合物１の合成）
【００６７】
【化１２】
カップリング剤としてＤＣＣを用いてヨードカルボン酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによりヨードカルボキシレートＮＨＳエステルを合成した。
【００６８】
アルゴンのもとで、無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のジチオエステルＢ（１．８０８ｇ、５．００ミリモル）の溶液にＮａＨ（鉱物油中６０％、０．２００ｇ、５．００ミリモル）を加えた。室温にて４時間後、ＮＨＳ３−ヨードプロピオネートＡ（１．４８５ｇ、５．００ミリモル）を加え、得られた混合物を一晩撹拌した。減圧でＤＭＦを除いた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ（４０：１）によるカラムクロマトグラフィによって黄色固形物（収率６７％）として１．７７０ｇの１を得た。
【００６９】
【化１３】
（実施例２．化合物２の合成）
【００７０】
【化１４】
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のジチオエステルＣ（０．６９２ｇ、１．５０ミリモル）とＮａＨ（鉱物油中６０％、０．０６０ｇ、１．５０ミリモル）の混合物をアルゴンのもと、室温にて４時間撹拌し、やや濁った溶液を得た。次いでＮＨＳ６−ヨードヘキサノエートＡ（０．６６１ｇ、１．９５ミリモル）をＤＭＦ（５ｍＬ）に加えた。１６時間後、減圧でＤＭＦを除いた。残留物に１０ｍＬのアセトンを加え、次いで２０ｍＬのエーテルを加えた。上清を静かに捨てた。同じ手順に続いて沈殿物を３回洗浄した。減圧下で乾燥した後、黄色固形物として１．２００ｇの２を得た。
【００７１】
【化１５】
（実施例３．化合物３及び４の合成）
【００７２】
【化１６】
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のジチオエステルＣ（１．００ｇ、２．１０ミリモル）とＮａＨ（鉱物油中６０％、０．０８７ｇ、２．１６ミリモル）の混合物をアルゴンのもと、室温にて４時間撹拌し、やや濁った溶液を得た。Ｎ−６ヨードヘキソオキシスクシンイミドＤ（０．８２ｇ、２．５２ミリモル）をＤＭＦ（５ｍＬ）に加えた。混合物を一晩撹拌し、その後、減圧でＤＭＦを除いた。３０ｍＬのエーテルで残留物を４回洗浄して１．３５ｇの３を得た。
【００７３】
化合物３（０．２５ｇ）を５ｍＬのメタノールに溶解し、それにＮＨ２ＯＨの５０％水溶液５．０ｍＬを加えた。溶液を２日間撹拌した後、減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物を６ｘ２０ｍＬのエーテルで洗浄して０．２１ｇの４を得た。
【００７４】
【化１７】
（実施例４．化合物５及び６の合成）
【００７５】
【化１８】
無水ＤＭＦ３０ｍＬ中のジチオエステルＣ（１．３２ｇ、２．７８ミリモル）とＮａＨ（鉱物油中６０％、０．１１４ｇ、２．８６ミリモル）の混合物をアルゴンのもと、室温にて４時間撹拌した。次いで化合物Ｅ（１．０１４ｇ、３．６１ミリモル）をＤＭＦ１０ｍＬに加えた。混合物を一晩撹拌し、その後、減圧でＤＭＦを除いた。残留物を２０ｍＬのエーテルで３回洗浄して２．１０ｇのＦを得た。
【００７６】
７ＮのＮＨ３のメタノール溶液１５ｍＬと２８％のアンモニア水溶液１０ｍＬの混合物に化合物Ｆ（２．２５ｇ）を溶解した。３日間の撹拌の後、減圧下で溶媒を除いた。残留物をエーテル（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｈ２Ｏ／２−プロパノールで再結晶化して１．２０ｇの５を得た。
【００７７】
９．０ｍＬの無水ＤＭＦ中の５（０．３００ｇ、０．５６３ミリモル）の懸濁液に、１．２０ｍＬのトリエチルアミンを加えた。混合物を５分間撹拌し、やや濁った溶液を得た。６−マレイミドヘキサン酸ＮＨＳエステル（Ｇ、０．２６０ｇ、０．８４３ミリモル）をこれに加えた。５分で透明な溶液が得られた。１６時間後、減圧下でＤＭＦを除いた。残留物をエーテル（４ｘ３０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、エーテル（５０ｍＬ）で沈殿させた。黄色の泡様の固形物として０．４００ｇ収量の６が得られた。
【００７８】
【化１９】
（実施例５．追加の標識化合物７〜１２）
以下に列記されるそのほかの例示となる標識化合物の調製は、米国特許第６，８５８，７３３号で開示された。
【００７９】
【化２０】
（実施例６．アクリダン標識された抗体の調製）
実施例３のアクリダン標識する化合物３を用いて、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を標識した。５００μＬ容量にて、ｐＨ８．２５の０．１Ｍホウ酸緩衝液中の０．２４ｍｇの抗体と化合物３のＤＭＦ溶液（３：抗体、１０：１のモル比）を室温にて１５分間、次いで、４℃にて一晩反応させた。脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）に溶液を通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出して未結合の標識を除いた。５００μＬの分画を回収することによって未反応の抗体と共に標識された抗体を得た。
【００８０】
化学発光アッセイによって標識された抗体の量について分画を調べた。Ｔｕｒｎｅｒ ＤｅｓｉｇｎｓのＴＤ−２０ｅ照度計の中での試験管中にて、１μＬ又は１０μＬの一定分量を０．４ＭのＨＣｌ＋３．６％尿素過酸化物５０μＬと混合し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ５０μＬを注入した。発光の突発からの合計積算強度を注入時から測定した。化学発光を示す分画が得られた。分画８は最大量の生成物を含有した。
【００８１】
（実施例７．アクリダン標識されたＢＳＡの調製）
実施例３のアクリダン標識する化合物３を用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標識した。ｐＨ８．２５の０．１Ｍホウ酸緩衝液５００μＬ中の０．１ｇのＢＳＡと２３．４ｍｇの化合物３／１００μＬのＤＭＦの溶液４２μＬ（３：ＢＳＡ、１０：１のモル比）を室温にて１５分間、次いで、４℃にて一晩反応させた。脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）に溶液を通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出して未結合の標識を除いた。５００μＬの分画を回収することによって未反応のＢＳＡと共に標識されたＢＳＡを得た。
【００８２】
実施例６の化学発光アッセイによって標識されたＢＳＡの量について分画を調べた。化学発光を示す分画が得られた。分画７は最大量の生成物を含有した。
【００８３】
（実施例８．アクリダンで官能化されたマイクロウェルの調製）
カップリング剤としてＥＤＣを用いて、カルボン酸基（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で官能化された白色のポリスチレン製９６穴マイクロプレートを化合物５にカップリングさせた。ＤＭＦとｐＨ４の０．１ＭのＭＥＳ緩衝液の７０：３０（ｖ／ｖ）溶液にて化合物５のストック溶液を調製する。あらかじめＭＥＳ緩衝液で洗浄したプレートの各ウェルに０．２ｍＬの一定分量を加えた。ＭＥＳ緩衝液中のＥＤＣを加え、混合物を一晩反応させる。上清を除き、水で２回、及びメタノールで６回、ウェルを順に洗浄する。
【００８４】
（実施例９．アクリダン標識されたポリ（メタクリレート）マイクロプレートの調製）
アンバーライト樹脂（ＩＲＰ−６４、１００〜４００メッシュ、２．５０ｇ）を還流にてＳＯＣｌ２と４時間反応させた。反応物を冷却し、揮発物を減圧下で除いた。次いで、５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２にビーズを浮遊し、それに１７．０ｍＬのトリエチルアミンを加え、次いで１５．０ｍＬのエチレンジアミンを加えた。アルゴンのもとで混合物を一晩撹拌した。１００ｍＬのＭｅＯＨを加えることにより粒子を分散し、次いでろ過した。ろ過した粒子をＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、風乾した。２．８６ミリモル／ｇの算出されたＮＨ２含量に対して得られた粒子は２．８０ｇの重さがあった。
【００８５】
室温にて１０ｍＬのＤＭＦ中のエチレンジアミンで修飾した粒子（１００ｍｇ）をアルゴンのもとで１０ｍｇの化合物２と共に一晩撹拌した。混合物をろ過し、ＭｅＯＨで粒子を洗浄した。風乾した後、回収した官能化粒子の重さは１０２ｍｇだった。
【００８６】
代替の方法では、上記のようなＳＯＣｌ２との反応によって２．５０ｇのアンバーライト樹脂を酸塩化物に変換し、次いで５０ｍＬのＴＨＦ中の４．３２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと６．８ｍＬのトリエチルアミンと反応させて、ＮＨＳ−エステルで官能化された粒子を調製した。遊離の末端ＮＨ２基を含有する化合物５とこれらを反応させてカップリングを達成した。
【００８７】
（実施例１０．アクリダンで標識した微粒子の抗体との結合）
未反応の末端ＮＨ２基を含有する、アクリダンで標識した２０ｍｇ量のアンバーライト粒子を室温にて、無水ＤＭＦ１００ｍＬ中の１０２ｍｇのジスクシンイミジルオクタンジオエート（約５当量）とさらに反応させた。遠心によって粒子を分離し、１０ｘ１ｍＬのＤＭＦで洗浄した。得られた遊離のＮＨＳエステルを４℃にて一晩、ｐＨ８．５の０．１Ｍのホウ酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ中のヒツジ抗マウスＩｇＧ（１．８ｍｇ／ｍＬのストック溶液０．５ｍＬ）にカップリングさせた。反応混合物を１３ｋ ｒｐｍで遠心し、上清を除いた。スピンカラムにてＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０によって粒子を数回洗浄した。
【００８８】
１．０ｍＬのブロッキング緩衝液（１ｘＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１％スクロース）で３７℃にて１時間インキュベートすることによって、得られた抗体標識の粒子をＢＳＡでブロックした。ツイーン−ＰＢＳ洗浄緩衝液で粒子を洗浄し、１．０ｍＬの１ｘＰＢＳに保存した。
【００８９】
（実施例１１．アクリダン標識された磁性マイクロプレートの調製）
０．７ｍＬのＤＭＦとｐＨ４の０．１ＭのＭＥＳ緩衝液の溶液０．３ｍＬ中の４ｍｇの化合物５のストック溶液を調製した。ＭＥＳ緩衝液で洗浄した５０ｍｇのカルボキシル化ポリスチレン粒子（Ｄｙｎａｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０カルボン酸）に０．１ｍＬの一定分量を加えた。０．６７ｍＬのＭＥＳ緩衝液及び０．２３ｍＬのＤＭＦで混合物を稀釈した。ＥＤＣ（２３ｍｇ）を加え、混合物を一晩振盪した。上清を除き、２ｘ１ｍＬの水及び６ｘ１ｍＬのＭｅＯＨで順に粒子を洗浄し、１ｍＬのＭｅＯＨに再浮遊した。
【００９０】
標識の取り込みについて粒子を調べた。０．５ｍＬの水に１０μＬの一定分量（約０．５を含有する）を加え、１ｍｇ／ｍＬのストックを調製した。１００μＬの一定分量を過剰なＨＲＰと５分間反応させた。粒子を４ｘ１ｍＬの水で洗浄し、次いで１ｍＬの水に浮遊させた。２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、８ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のツイーン２０及び０．１Ｍの尿素過酸化物を含有するトリガー溶液（１０μＬ）を注入し、照度計で、化学発光の閃光を記録した。ブランクの１８ＲＬＵに比べて、６０４０ＲＬＵのシグナルが観察された。
【００９１】
２ｘ２００μＬの０．１ＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４にて粒子の５ｍｇ部分を洗浄し、１１７μＬのＭＥＳ緩衝液に再浮遊した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ（１．８ｍｇ／ｍＬのストック溶液から０．１５ｍｇ）を粒子に加え、３０分間混合物を振盪した。５ｍｇのＥＤＣを加え、混合物を４時間振盪した。上清を除き、３ｘ５００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のツイーン２０）で洗浄した。５００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ＋１％のスクロース）及び５ｍｇのＥＤＣに粒子を再浮遊し、室温にて１５分間撹拌し、４℃にて一晩撹拌した。上清を除き、２ｘ５００μＬの洗浄緩衝液で粒子を洗浄し、１ｍＬのＰＢＳに再浮遊した。
【００９２】
（実施例１２．標識された捕捉抗体を用いたマイクロプレートでの免疫アッセイ）
実施例６における標識された抗体の調製物に由来する分画を含有する生成物をＰＢＳ緩衝液で１：１００に稀釈した。５０μＬの一定分量を白色のポリスチレン９６穴プレートの２６ウェルのそれぞれに加えた。オービタルシェーカーにて室温でプレートを５分間激しく振盪した。溶液を除き、１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０でウェルを３回洗浄し、各工程の後、洗浄緩衝液はすべて除いた。
【００９３】
２．５％のＢＳＡと１％のスクロースを１ｘＰＢＳ中に含む結合体緩衝液にてヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：１．２ｘ１０６に稀釈した。或いは、結合体は、たとえばＦＢＳのようなほかのマトリクスで稀釈されればよい。稀釈した結合体の一定分量を２６ウェルに分配した。抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液における０ｎｇ／ｍＬ溶液と同様に、１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬを含有するＩｇＧ標準液を２倍稀釈で調製した。標準液及びゼロ溶液をウェルに分配し、最終容量５０μＬ／ウェルを達成した。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【００９４】
２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、８ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ツイーン２０及び０．１Ｍの尿素過酸化物を含有するトリガー溶液を調製した。
【００９５】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去することなく、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットを図１に示す。ゼロ溶液のシグナル＋ゼロ溶液のシグナルの標準偏差の２倍を超える、最低の較正器によって調べられる全体の範囲にわたってアッセイにより定量することができた。
【００９６】
（実施例１３．マイクロプレート免疫アッセイ、未標識の捕捉抗体及び標識されたＢＳＡ）
１ｘＰＢＳ中の４０μｇ／ｍＬの標識されていないヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の一定分量５０μＬを加えて、白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルのそれぞれを被覆した。オービタルシェーカー上にて室温でプレートを５分間撹拌した。溶液を取り除き、１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０でウェルを３回洗浄し、各工程後、洗浄緩衝液はすべて取り除いた。
【００９７】
実施例７で標識されたＢＳＡの調製に由来する生成物を含有する分画をＰＢＳ緩衝液＋１％スクロースで５０μＬ／ｍＬに稀釈した。１００μＬの一定分量を白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルのそれぞれに加えた。プレートを３７℃で１時間保持した。溶液を取り除き、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０でウェルを３回洗浄し、各工程後、洗浄緩衝液はすべて取り除いた。
【００９８】
１％ＢＳＡ及び１％スクロースを１ｘＰＢＳ中に含む結合体緩衝液で、ヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体を１：１．２ｘ１０６に稀釈した。稀釈した結合体の一定分量を２６ウェルに分配した。抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液における０ｎｇ／ｍＬ溶液と同様に、１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬを含有するＩｇＧ標準液を２倍稀釈で調製した。標準液及びゼロ溶液をウェルに分配し、最終容量５０μＬ／ウェルを達成した。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【００９９】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去しないで、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットを図２に示す。ゼロ溶液のシグナル＋ゼロ溶液のシグナルの標準偏差の２倍を超える、最低の較正器によって調べられる全体の範囲にわたってアッセイにより定量することができた。
【０１００】
（実施例１４．標識された磁性微粒子を用いた微粒子免疫アッセイ）
アクリダンと抗体を同時標識した、実施例１１の磁性微粒子の反応物５０μｇを利用する。１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で粒子を３回洗浄し、１％ＢＳＡ及び１％スクロースを含有する１ｘＰＢＳで１：１．２ｘ１０６に稀釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体に再浮遊した。粒子浮遊液を白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルに分配した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液におけるＩｇＧ標準液を連続２倍稀釈で調製し、ウェルにおける最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬ又は０ｎｇ／ｍＬを生じた。各標準液及びゼロ溶液をウェルに分配して最終反応容量５０μＬ／ウェルとした。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【０１０１】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去することなく、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットによってＩｇＧを定量することができた。
【０１０２】
（実施例１５．標識されたアンバーライト微粒子を用いた微粒子免疫アッセイ）
アクリダンと抗体を同時標識した、実施例１０のアンバーライト微粒子の反応物１００μｇを利用する。１ｘＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で粒子を３回洗浄し、１％ＢＳＡ及び１％スクロースを含有する１ｘＰＢＳで１：１．２ｘ１０６に稀釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体に再浮遊した。粒子浮遊液を白色ポリスチレンの９６穴プレートの２６ウェルに分配した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ結合体溶液におけるＩｇＧ標準液を連続２倍稀釈で調製し、ウェルにおける最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０４８ｎｇ／ｍＬ又は０ｎｇ／ｍＬを生じた。各標準液及びゼロ溶液をウェルに分配して最終反応容量５０μＬ／ウェルとした。プレート振盪器上で室温にてプレートを１時間インキュベートした。
【０１０３】
プレートをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎプレート照度計に移した。結合体溶液を除去しないで、１００μＬのトリガー溶液を順に注入することによって発光を発生させ、各ウェルの積算強度を５秒間読み取った。得られたアッセイのプロットによってＩｇＧを定量することができた。
【０１０４】
（実施例１６．アクリダン標識されカルボキシル修飾された微粒子の調製）
実施例１１に記載された手順に従ってＥＤＣカップリングによって、０．０２８２ｍｅｑ／ｇのカルボキシル負荷を有するカルボン酸で修飾されたポリスチレン製の１μｍの微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）を化合物５に結合させた。粒子の５２．５ｍｇ部分（１．４８マイクロモルＣＯＯＨ）を０．３９ｍｇの５で処理して確実に未反応のＣＯＯＨ基を残した。ｐＨ４のＭＥＳ緩衝液中でのＥＤＣカップリングによって遊離のＣＯＯＨ基をヒツジ抗マウスＩｇＧ（１．４８マイクロモル）にカップリングさせた。スピンカラムを用いてツイーン／ＰＢＳ緩衝液によって洗浄することにより未反応の抗体を取り除いた。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は標識された捕捉抗体を用いて本発明に従って実施される免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【図２】図２は標識されたブロッキングタンパク質と非標識の捕捉抗体を用いて本発明に従って実施される別の免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【図３】図３は標識された固体面と非標識の捕捉抗体を用いて本発明に従って実施される別の免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【図４】図４はマイクロプレートのウェルに固定された標識捕捉抗体及び検出用の過剰な抗ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた非分離免疫アッセイにおけるＩｇＧ抗原の検出を示すグラフである。
【図５】図５は標識されたブロッキングタンパク質とマイクロプレートのウェルに固定された非標識の捕捉抗体と過剰な抗ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を用いた非分離免疫アッセイにおけるＩｇＧ抗原の検出を示すグラフである。
【図６】図６は標識された捕捉核酸を用いて本発明に従って実施される核酸ハイブリッド形成の検出工程の模式図である。
【図７】図７は標識された固相と固定された捕捉抗体と標識された分析物類縁体を用いて本発明に従って実施される競合免疫アッセイの検出工程の模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイ手順において試料中の分析物を検出する方法であって
ａ）分析物を含有する又は含有することが疑われる試料並びに固体支持体を提供する工程であって、固体支持体には、
１）化学発光化合物及び
２）分析物に対する特異的結合の第１のパートナー
が固定されている、工程；
ｂ）試料と固体支持体を接触させて分析物に対する固定された特異的結合のパートナーに分析物が結合できるようにする工程；
ｃ）分析物に対する特異的結合の第２のパートナー又は分析物のいずれかに結合された活性化剤化合物を含む、過剰の活性化剤化合物結合体を提供する工程；
ｄ）活性化剤化合物結合体が特異的結合対の反応を受けるようにし、それによって活性化剤化合物結合体の第１の部分を固定された化学発光化合物の近傍に近づける工程であって、活性化剤化合物結合体の第２の部分は特異的結合対の反応を受けず、固定された化学発光化合物の近傍に近づかず、固定された化学発光化合物の近傍における活性化剤化合物結合体の該部分が固定された化学発光化合物の一部を活性化する、工程；
ｅ）トリガー溶液を提供して、化学発光化合物の活性化された部分から化学発光を生成する工程；
ｆ）生成された化学発光を検出する工程；並びに
ｇ）生成された化学発光を試料における分析物の存在、位置又は量と関係付ける工程
を含む方法。
【請求項２】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
活性化剤化合物が、遷移金属の塩及び錯体、ペルオキシダーゼ酵素、並びに遷移金属を含有する酵素の少なくとも１つから選択され、遷移金属が鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムの少なくとも１つから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トリガー溶液が、過酸化物化合物を含む水溶液である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
固体支持体が、マイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロースの試験片、紙の試験片、プラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子及び磁性粒子から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化学発光化合物が、活性化剤とトリガー溶液の存在下で酸化されて化学発光を生成することができ、化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含み、化学発光部分が、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド及び式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）の基から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学発光化合物が固体支持体に共有結合される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される補助物質に共有結合される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される特異的結合対のメンバーに共有結合される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイが免疫アッセイである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
免疫アッセイがサンドイッチ免疫アッセイである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アッセイが核酸のハイブリッド形成アッセイであり、分析物が標的核酸であり、第１の特異的結合のパートナーが標的の第１の領域に相補的な核酸であり、活性化剤化合物結合体が標的の第２の領域に相補的である核酸に結合される活性化剤化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アッセイ手順において試料中の分析物を検出する方法であって
ａ）分析物を含有する又は含有することが疑われる試料並びに固体支持体を提供する工程であって、固体支持体には、
１）化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含む化学発光化合物であって、化学発光部分は式Ｉのもの：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）である、化学発光化合物、及び
２）分析物に対する特異的結合の第１のパートナー
が固定されている、工程；
ｂ）試料と固体支持体を接触させて分析物に対する固定された特異的結合のパートナーに分析物が結合できるようにする工程；
ｃ）分析物に対する特異的結合の第２のパートナー又は分析物のいずれかに結合された活性化剤化合物を含む、過剰の活性化剤化合物結合体を提供する工程であって、活性化剤化合物はペルオキシダーゼ酵素である、工程；
ｄ）活性化剤化合物結合体が特異的結合対の反応を受けるようにし、それによって活性化剤化合物結合体の第１の部分を固定された化学発光化合物の近傍に近づける工程であって、活性化剤化合物結合体の第２の部分は特異的結合対の反応を受けず、固定された化学発光化合物の近傍に近づかず、固定された化学発光化合物の近傍における活性化剤化合物結合体の該部分が固定された化学発光化合物の一部を活性化する、工程；
ｅ）活性化剤化合物結合体の第２の部分を取り除かずに、トリガー溶液を提供して、化学発光化合物の活性化された部分から化学発光を生成する工程であって、トリガー溶液は過酸化物化合物を含む水溶液である、工程；
ｆ）生成された化学発光を検出する工程；並びに
ｇ）生成された化学発光を試料における分析物の存在、位置又は量と関係付ける工程
を含む方法。
【請求項１５】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれない請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれる請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
活性化剤化合物が、遷移金属の塩及び錯体、ペルオキシダーゼ酵素、並びに遷移金属を含有する酵素の少なくとも１つから選択され、遷移金属が鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムの少なくとも１つから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
トリガー溶液が、過酸化物化合物を含む水溶液である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
固体支持体が、マイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロースの試験片、紙の試験片、プラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子及び磁性粒子から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
化学発光化合物が、活性化剤とトリガー溶液の存在下で酸化されて化学発光を生成することができ、化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含み、化学発光部分が、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド及び式Ｉ：
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）の基から選択される請求項１４の方法。
【請求項２１】
化学発光化合物が固体支持体に共有結合される請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される補助物質に共有結合される請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される特異的結合対のメンバーに共有結合される請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイが免疫アッセイである請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
免疫アッセイがサンドイッチ免疫アッセイである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アッセイが核酸のハイブリッド形成アッセイであり、分析物が標的核酸であり、第１の特異的結合のパートナーが標的の第１の領域に相補的な核酸であり、活性化剤化合物結合体が標的の第２の領域に相補的である核酸に結合される活性化剤化合物である請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
アッセイ手順において試料中の分析物を検出する方法であって
ａ）分析物を含有する又は含有することが疑われる試料並びに化学発光標識された固体支持体を提供する工程であって、固体支持体には、
１）化学発光化合物；及び
２）分析物に対する特異的結合の第１のパートナー
が固定されており、化学発光標識された固体支持体は、固体支持体を式ＩＩ：
【化４】
（式中、Ｍはアルカリ金属イオンである）の化合物と反応させることによって調製される、工程；
ｂ）試料と化学発光標識された固体支持体を接触させて分析物に対する固定された特異的結合のパートナーに分析物が結合できるようにする工程；
ｃ）分析物に対する特異的結合の第２のパートナー又は分析物のいずれかに結合されたペルオキシダーゼを含む、過剰の活性化剤化合物結合体を提供する工程；
ｄ）活性化剤化合物結合体が特異的結合対の反応を受けるようにし、それによって活性化剤化合物結合体の第１の部分を固定された化学発光化合物の近傍に近づける工程であって、活性化剤化合物結合体の第２の部分は特異的結合対の反応を受けず、固定された化学発光化合物の近傍に近づかず、固定された化学発光化合物の近傍における活性化剤化合物結合体の該部分が固定された化学発光化合物の一部を活性化する、工程；
ｅ）活性化剤化合物結合体の第２の部分を取り除かずに、トリガー溶液を提供して、化学発光化合物の活性化された部分から化学発光を生成する工程であって、トリガー溶液は過酸化物化合物を含む水溶液である、工程；
ｆ）生成された化学発光を検出する工程；並びに
ｇ）生成された化学発光を試料における分析物の存在、位置又は量と関係付ける工程
を含む方法。
【請求項２８】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれない請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれる請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
活性化剤化合物が、遷移金属の塩及び錯体、ペルオキシダーゼ酵素、並びに遷移金属を含有する酵素の少なくとも１つから選択され、遷移金属が鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムの少なくとも１つから選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
トリガー溶液が、過酸化物化合物を含む水溶液である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
固体支持体が、マイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロースの試験片、紙の試験片、プラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子及び磁性粒子から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
化学発光化合物が、活性化剤とトリガー溶液の存在下で酸化されて化学発光を生成することができ、化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含み、化学発光部分が、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド及び式Ｉ：
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）の基から選択される請求項２７の方法。
【請求項３４】
化学発光化合物が固体支持体に共有結合される請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される補助物質に共有結合される請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される特異的結合対のメンバーに共有結合される請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
アッセイが免疫アッセイである請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
免疫アッセイがサンドイッチ免疫アッセイである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
アッセイが核酸のハイブリッド形成アッセイであり、分析物が標的核酸であり、第１の特異的結合のパートナーが標的の第１の領域に相補的な核酸であり、活性化剤化合物結合体が標的の第２の領域に相補的である核酸に結合される活性化剤化合物である請求項２７に記載の方法。
【請求項１】
アッセイ手順において試料中の分析物を検出する方法であって
ａ）分析物を含有する又は含有することが疑われる試料並びに固体支持体を提供する工程であって、固体支持体には、
１）化学発光化合物及び
２）分析物に対する特異的結合の第１のパートナー
が固定されている、工程；
ｂ）試料と固体支持体を接触させて分析物に対する固定された特異的結合のパートナーに分析物が結合できるようにする工程；
ｃ）分析物に対する特異的結合の第２のパートナー又は分析物のいずれかに結合された活性化剤化合物を含む、過剰の活性化剤化合物結合体を提供する工程；
ｄ）活性化剤化合物結合体が特異的結合対の反応を受けるようにし、それによって活性化剤化合物結合体の第１の部分を固定された化学発光化合物の近傍に近づける工程であって、活性化剤化合物結合体の第２の部分は特異的結合対の反応を受けず、固定された化学発光化合物の近傍に近づかず、固定された化学発光化合物の近傍における活性化剤化合物結合体の該部分が固定された化学発光化合物の一部を活性化する、工程；
ｅ）トリガー溶液を提供して、化学発光化合物の活性化された部分から化学発光を生成する工程；
ｆ）生成された化学発光を検出する工程；並びに
ｇ）生成された化学発光を試料における分析物の存在、位置又は量と関係付ける工程
を含む方法。
【請求項２】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
活性化剤化合物が、遷移金属の塩及び錯体、ペルオキシダーゼ酵素、並びに遷移金属を含有する酵素の少なくとも１つから選択され、遷移金属が鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムの少なくとも１つから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トリガー溶液が、過酸化物化合物を含む水溶液である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
固体支持体が、マイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロースの試験片、紙の試験片、プラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子及び磁性粒子から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化学発光化合物が、活性化剤とトリガー溶液の存在下で酸化されて化学発光を生成することができ、化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含み、化学発光部分が、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド及び式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）の基から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学発光化合物が固体支持体に共有結合される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される補助物質に共有結合される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される特異的結合対のメンバーに共有結合される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイが免疫アッセイである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
免疫アッセイがサンドイッチ免疫アッセイである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アッセイが核酸のハイブリッド形成アッセイであり、分析物が標的核酸であり、第１の特異的結合のパートナーが標的の第１の領域に相補的な核酸であり、活性化剤化合物結合体が標的の第２の領域に相補的である核酸に結合される活性化剤化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アッセイ手順において試料中の分析物を検出する方法であって
ａ）分析物を含有する又は含有することが疑われる試料並びに固体支持体を提供する工程であって、固体支持体には、
１）化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含む化学発光化合物であって、化学発光部分は式Ｉのもの：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）である、化学発光化合物、及び
２）分析物に対する特異的結合の第１のパートナー
が固定されている、工程；
ｂ）試料と固体支持体を接触させて分析物に対する固定された特異的結合のパートナーに分析物が結合できるようにする工程；
ｃ）分析物に対する特異的結合の第２のパートナー又は分析物のいずれかに結合された活性化剤化合物を含む、過剰の活性化剤化合物結合体を提供する工程であって、活性化剤化合物はペルオキシダーゼ酵素である、工程；
ｄ）活性化剤化合物結合体が特異的結合対の反応を受けるようにし、それによって活性化剤化合物結合体の第１の部分を固定された化学発光化合物の近傍に近づける工程であって、活性化剤化合物結合体の第２の部分は特異的結合対の反応を受けず、固定された化学発光化合物の近傍に近づかず、固定された化学発光化合物の近傍における活性化剤化合物結合体の該部分が固定された化学発光化合物の一部を活性化する、工程；
ｅ）活性化剤化合物結合体の第２の部分を取り除かずに、トリガー溶液を提供して、化学発光化合物の活性化された部分から化学発光を生成する工程であって、トリガー溶液は過酸化物化合物を含む水溶液である、工程；
ｆ）生成された化学発光を検出する工程；並びに
ｇ）生成された化学発光を試料における分析物の存在、位置又は量と関係付ける工程
を含む方法。
【請求項１５】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれない請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれる請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
活性化剤化合物が、遷移金属の塩及び錯体、ペルオキシダーゼ酵素、並びに遷移金属を含有する酵素の少なくとも１つから選択され、遷移金属が鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムの少なくとも１つから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
トリガー溶液が、過酸化物化合物を含む水溶液である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
固体支持体が、マイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロースの試験片、紙の試験片、プラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子及び磁性粒子から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
化学発光化合物が、活性化剤とトリガー溶液の存在下で酸化されて化学発光を生成することができ、化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含み、化学発光部分が、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド及び式Ｉ：
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）の基から選択される請求項１４の方法。
【請求項２１】
化学発光化合物が固体支持体に共有結合される請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される補助物質に共有結合される請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される特異的結合対のメンバーに共有結合される請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイが免疫アッセイである請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
免疫アッセイがサンドイッチ免疫アッセイである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アッセイが核酸のハイブリッド形成アッセイであり、分析物が標的核酸であり、第１の特異的結合のパートナーが標的の第１の領域に相補的な核酸であり、活性化剤化合物結合体が標的の第２の領域に相補的である核酸に結合される活性化剤化合物である請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
アッセイ手順において試料中の分析物を検出する方法であって
ａ）分析物を含有する又は含有することが疑われる試料並びに化学発光標識された固体支持体を提供する工程であって、固体支持体には、
１）化学発光化合物；及び
２）分析物に対する特異的結合の第１のパートナー
が固定されており、化学発光標識された固体支持体は、固体支持体を式ＩＩ：
【化４】
（式中、Ｍはアルカリ金属イオンである）の化合物と反応させることによって調製される、工程；
ｂ）試料と化学発光標識された固体支持体を接触させて分析物に対する固定された特異的結合のパートナーに分析物が結合できるようにする工程；
ｃ）分析物に対する特異的結合の第２のパートナー又は分析物のいずれかに結合されたペルオキシダーゼを含む、過剰の活性化剤化合物結合体を提供する工程；
ｄ）活性化剤化合物結合体が特異的結合対の反応を受けるようにし、それによって活性化剤化合物結合体の第１の部分を固定された化学発光化合物の近傍に近づける工程であって、活性化剤化合物結合体の第２の部分は特異的結合対の反応を受けず、固定された化学発光化合物の近傍に近づかず、固定された化学発光化合物の近傍における活性化剤化合物結合体の該部分が固定された化学発光化合物の一部を活性化する、工程；
ｅ）活性化剤化合物結合体の第２の部分を取り除かずに、トリガー溶液を提供して、化学発光化合物の活性化された部分から化学発光を生成する工程であって、トリガー溶液は過酸化物化合物を含む水溶液である、工程；
ｆ）生成された化学発光を検出する工程；並びに
ｇ）生成された化学発光を試料における分析物の存在、位置又は量と関係付ける工程
を含む方法。
【請求項２８】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれない請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固定された化学発光化合物の近傍に近づかない活性化剤化合物結合体の第２の部分が、トリガー溶液を加えて化学発光を生成する前に除かれる請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
活性化剤化合物が、遷移金属の塩及び錯体、ペルオキシダーゼ酵素、並びに遷移金属を含有する酵素の少なくとも１つから選択され、遷移金属が鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン及びクロムの少なくとも１つから選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
トリガー溶液が、過酸化物化合物を含む水溶液である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
固体支持体が、マイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球体、セルロースの試験片、紙の試験片、プラスチックの試験片、ラテックス粒子、ポリマー粒子、シリカ粒子及び磁性粒子から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
化学発光化合物が、活性化剤とトリガー溶液の存在下で酸化されて化学発光を生成することができ、化学発光部分と化学発光部分を固体支持体に連結する連結部分を含み、化学発光部分が、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナトレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド及び式Ｉ：
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１個〜５０個の非水素の原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素又は非干渉の置換基であり、Ｒ１〜Ｒ１１の基の少なくとも１つは連結部分を含む）の基から選択される請求項２７の方法。
【請求項３４】
化学発光化合物が固体支持体に共有結合される請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される補助物質に共有結合される請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
化学発光化合物が、固体支持体に固定される特異的結合対のメンバーに共有結合される請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
アッセイが免疫アッセイである請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
免疫アッセイがサンドイッチ免疫アッセイである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
アッセイが核酸のハイブリッド形成アッセイであり、分析物が標的核酸であり、第１の特異的結合のパートナーが標的の第１の領域に相補的な核酸であり、活性化剤化合物結合体が標的の第２の領域に相補的である核酸に結合される活性化剤化合物である請求項２７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５３６７４５（Ｐ２００９−５３６７４５Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１０１１６（Ｐ２００９−５１０１１６）
【出願日】平成１９年５月７日（２００７．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３３９８８
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５９１０２８２５６）ベックマン コールター インコーポレイテッド (24)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月７日（２００７．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３３９８８
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５９１０２８２５６）ベックマン コールター インコーポレイテッド (24)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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