顕微鏡及び合焦点方法
【課題】照明視野絞りのピント調整を自動的に実行可能な顕微鏡及び合焦点方法の提供。
【解決手段】本発明に係る顕微鏡は、照明視野絞りと光学素子とを有し、ステージに設けられたサンプルに対して照明光を投影する照明光学系と、サンプルを透過した透過光を撮像する第１の撮像素子と、第１の撮像素子に透過光を結像させる光学素子とを有する第１の結像光学系と、第１の結像光学系から透過光の一部を分岐する光線分岐部と、分岐された透過光の位相差像を撮像する第２の撮像素子と、第２の撮像素子に分岐された透過光の位相差像を結像させる光学素子とを有する第２の結像光学系と、照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整部と、第２の撮像素子からの出力信号により照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する特徴量算出部とを備え、照明視野絞りピント調整部は、算出された特徴量に応じて、照明視野絞りの結像位置を調整する。
【解決手段】本発明に係る顕微鏡は、照明視野絞りと光学素子とを有し、ステージに設けられたサンプルに対して照明光を投影する照明光学系と、サンプルを透過した透過光を撮像する第１の撮像素子と、第１の撮像素子に透過光を結像させる光学素子とを有する第１の結像光学系と、第１の結像光学系から透過光の一部を分岐する光線分岐部と、分岐された透過光の位相差像を撮像する第２の撮像素子と、第２の撮像素子に分岐された透過光の位相差像を結像させる光学素子とを有する第２の結像光学系と、照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整部と、第２の撮像素子からの出力信号により照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する特徴量算出部とを備え、照明視野絞りピント調整部は、算出された特徴量に応じて、照明視野絞りの結像位置を調整する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡及び合焦点方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、対物レンズの切り換えに応じて、コンデンサレンズ、視野絞り、開口絞り、標本ステージの対物レンズ光軸方向駆動機構、フィルタ、光源に対する調光電源等の調整が自動的に行われる電動式顕微鏡が知られている（例えば、以下の特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１３３３１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、顕微鏡において複数の試料を観察する際、これら複数の試料は、厚さ方向にばらつきのあるカバーガラス及びスライドガラスを利用して作製される。そのため、照明光にてこれら試料を照射する場合に任意の位置に照明が配置されていると、スライドガラスの厚みが変化することで照明から対物レンズまでの光学距離が変化してしまう。その結果、照明光学系内に設けられた照明視野絞りが試料面の観察位置から光軸方向にずれた位置にて結像することとなり、画像のコントラストの低下等の問題が発生する。
【０００５】
上記特許文献１に記載の顕微鏡を含む従来の顕微鏡では、視野絞り補正環を絞り、照明光学系のコンデンサレンズの光軸方向位置を調整し、補正環のエッジの結像具合を目視もしくは撮像素子にて観察して調整することで、照明視野絞りのピント調整を行うことが一般的である。
【０００６】
しかしながら、複数の試料を自動で観察可能なシステムを構築する場合には、自動かつ迅速に照明視野絞りのピント調整を自動的に行うことが求められる。
【０００７】
そこで、本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的とするところは、照明視野絞りのピント調整を自動的に行うことが可能な、顕微鏡及び合焦点方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のある観点によれば、照明視野絞りと、１又は複数の光学素子とを有し、ステージに設けられたサンプルに対して照明光を投影する照明光学系と、前記サンプルを透過した透過光を撮像する第１の撮像素子と、当該第１の撮像素子に前記透過光を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第１の結像光学系と、前記第１の結像光学系から前記透過光の一部を分岐する光線分岐部と、分岐された前記透過光の位相差像を撮像する第２の撮像素子と、当該第２の撮像素子に前記分岐された透過光の位相差像を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第２の結像光学系と、前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整部と、前記第２の撮像素子から出力される出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する特徴量算出部と、を備え、前記照明視野絞りピント調整部は、前記特徴量算出部により算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する顕微鏡が提供される。
【０００９】
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、前記特徴量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記特徴量を算出してもよい。
【００１０】
前記特徴量算出部による特徴量の算出は、前記サンプルの透過光が前記第１の撮像素子上に合焦していない状態で行われることが好ましい。
【００１１】
前記照明光の強度は、前記第２の撮像素子上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整されることが好ましい。
【００１２】
前記顕微鏡は、前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、を更に備え、前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、前記厚み変化量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させてもよい。
【００１３】
前記顕微鏡は、前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、を更に備え、前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、前記厚み変化量算出部は、少なくとも合焦時における前記第１の像又は前記第２の像のエッジ位置と得られた第１の像又は前記第２の像のエッジ位置との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させてもよい。
【００１４】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像又は前記第２の像において、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出してもよい。
【００１５】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出してもよい。
【００１６】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状の両側のエッジ位置の和に基づいて、前記厚み変化量を算出してもよい。
【００１７】
前記特徴量算出部は、前記出力信号のエッジ位置を利用して、前記特徴量を算出してもよい。
【００１８】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、前記明度補正部は、前記照明視野絞りピント調整部により前記照明視野絞りの像が合焦するように前記照明視野絞りが調整された後に撮像された像に対して、予め準備された、明度補正に利用される明度補正パターンを利用して、明度の補正を実施してもよい。
【００１９】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、前記明度補正部は、算出された前記スライドガラスの厚みに基づいて、予め設定された複数の明度補正パターンの中から明度補正に利用する明度補正パターンを選択し、前記明度の補正を実施してもよい。
【００２０】
また、上記課題を解決するために、本発明の別の観点によれば、照明視野絞りを有する照明光学系により投影された照明光のうちステージに設けられたサンプルを透過した透過光の一部を分岐して、分岐された前記透過光の位相差像を撮像素子により撮像するステップと、前記撮像素子から出力された出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出するステップと、算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整機構を駆動するステップと、を含む合焦点方法が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように本発明によれば、照明視野絞りのピント調整を自動的に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡の構成を示した説明図である。
【図２】同実施形態に係る統括制御部の構成を示したブロック図である。
【図３】同実施形態に係る顕微鏡の光学系を概略的に示した説明図である。
【図４】同実施形態に係る顕微鏡の光学系を概略的に示した説明図である。
【図５Ａ】スライドガラスの厚みと照明視野絞りの結像位置との関係を示した説明図である。
【図５Ｂ】スライドガラスの厚みと照明視野絞りの結像位置との関係を示した説明図である。
【図６】照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【図７】照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【図８】位相差像における照明位置の検出方法を示した説明図である。
【図９】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１０】本発明の第２の実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１１】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１２】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１３】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１４】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００２４】
なお、説明は、以下の順序で行うものとする。
（１）第１の実施形態
（１−１）顕微鏡の構成について
（１−２）照明視野絞りのピント調整処理について
（１−３）ステージ位置の調整処理について
（１−４）明度ムラの補正処理について
（１−５）変形例
【００２５】
（第１の実施形態）
＜顕微鏡の構成について＞
まず、図１を参照しながら、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡１の構成について説明する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡１の構成を示した説明図である。
【００２６】
［全体構成］
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に例示したように、生体サンプルＳＰＬが配設されるプレパラートＰＲＴ全体の像（以下、この像をサムネイル像とも称する。）を撮像するサムネイル像撮像部１０と、生体サンプルＳＰＬが所定倍率で拡大された像（以下、この像を拡大像とも称する。）を撮像する拡大像撮像部２０と、を有する。また、拡大像撮像部２０には、拡大像撮像部２０中に存在する照明視野絞りのデフォーカス（ｄｅｆｏｃｕｓ）量を検出するためのデフォーカス量検出部３０が設けられている。
【００２７】
プレパラートＰＲＴは、血液等の結合組織、上皮組織又はそれらの双方の組織などの組織切片又は塗抹細胞からなる生体サンプルＳＰＬを、所定の固定手法によりスライドガラスに固定したものである。これらの組織切片又は塗抹細胞には、必要に応じて各種の染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色のみならず、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ−Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）や酵素抗体法等の蛍光染色が含まれる。
【００２８】
また、プレパラートＰＲＴには、対応する生体サンプルＳＰＬを特定するための付帯情報（例えば、サンプルを採取した人の氏名、採取日時、染色の種類等）が記載されたラベルが貼付されていてもよい。
【００２９】
本実施形態に係る顕微鏡１には、上述のようなプレパラートＰＲＴが載置されるステージ４０が設けられており、更に、ステージ４０を様々な方向に移動させるためのステージ駆動機構４１が設けられている。このステージ駆動機構４１により、ステージ４０を、ステージ面に対して平行となる方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）と、直交する方向（Ｚ軸方向）に自由に移動させることができる。
【００３０】
また、拡大像撮像部２０には、照明視野絞りピント調整部の一例であるコンデンサレンズ駆動機構４２が設けられている。
【００３１】
［サムネイル像撮像部］
サムネイル像撮像部１０は、図１に示したように、光源１１と、対物レンズ１２と、撮像素子１３と、を主に備える。
【００３２】
光源１１は、ステージ４０のプレパラート配置面とは逆の面側に設けられる。光源１１は、一般染色が施された生体サンプルＳＰＬを照明する光（以下、明視野照明光、又は、単に照明光とも称する。）と、特殊染色が施された生体サンプルＳＰＬを照明する光（以下、暗視野照明光とも称する。）とを切り換えて照射可能である。また、光源１１は、明視野照明光又は暗視野照明光のいずれか一方だけを照射可能なものであってもよい。この場合、光源１１として、明視野照明光を照射する光源と、暗視野照明光を照射する光源の２種類の光源が設けられることとなる。
【００３３】
更に、サムネイル像撮像部１０には、プレパラートＰＲＴに貼付されたラベルに記載されている付帯情報を撮像するための光を照射するラベル光源（図示せず。）が別途設けられていてもよい。
【００３４】
所定倍率の対物レンズ１２は、プレパラート配置面におけるサムネイル像撮像部１０の基準位置の法線を光軸ＳＲＡとして、ステージ４０のプレパラート配置面側に配設される。ステージ４０上に配設されたプレパラートＰＲＴを透過した透過光は、この対物レンズ１２によって集光されて、対物レンズ１２の後方（すなわち、照明光の進行方向）に設けられた撮像素子１３に結像する。
【００３５】
撮像素子１３には、ステージ４０のプレパラート配置面に載置されたプレパラートＰＲＴ全体を包括する撮像範囲の光（換言すれば、プレパラートＰＲＴ全体を透過した透過光）が結像する。この撮像素子１３上に結像した像が、プレパラートＰＲＴ全体を撮像した顕微鏡画像であるサムネイル像となる。
【００３６】
［拡大像撮像部］
拡大像撮像部２０は、図１に示したように、光源２１と、コンデンサレンズ２２と、対物レンズ２３と、撮像素子２４と、を主に備える。また、拡大像撮像部２０には、更に、照明視野絞り（図示せず。）が設けられている。
【００３７】
光源２１は、明視野照明光を照射するものであり、ステージ４０のプレパラート配置面とは逆の面側に設けられる。また、光源２１とは異なる位置（例えばプレパラート配置面側）には、暗視野照明光を照射する光源（図示せず。）が設けられる。
【００３８】
コンデンサレンズ２２は、光源２１から照射された明視野照明光や、暗視野照明用の光源から照射された暗視野照明光を集光して、ステージ４０上のプレパラートＰＲＴに導くレンズである。このコンデンサレンズ２２は、プレパラート配置面における拡大像撮像部２０の基準位置の法線を光軸ＥＲＡとして、光源２１とステージ４０との間に配設される。また、コンデンサレンズ駆動機構４２は、このコンデンサレンズ２２を光軸ＥＲＡ方向に沿って駆動することが可能である。コンデンサレンズ２２は、コンデンサレンズ駆動機構４２によって、光軸ＥＲＡ上の位置を変えることができる。
【００３９】
所定倍率の対物レンズ２３は、プレパラート配置面における拡大像撮像部２０の基準位置の法線を光軸ＥＲＡとして、ステージ４０のプレパラート配置面側に配設される。拡大像撮像部２０では、この対物レンズ２３を適宜交換することで、生体サンプルＳＰＬを様々な倍率に拡大して撮像することが可能となる。ステージ４０上に配設されたプレパラートＰＲＴを透過した透過光は、この対物レンズ２３によって集光されて、対物レンズ２３の後方（すなわち、照明光の進行方向）に設けられた撮像素子２４に結像する。
【００４０】
なお、対物レンズ２３と撮像素子２４との間の光軸ＥＲＡ上には、ビームスプリッター３１が設けられており、対物レンズ２３を透過した透過光の一部が、後述するデフォーカス量検出部３０へと導かれる。
【００４１】
撮像素子２４には、撮像素子２４の画素サイズ及び対物レンズ２３の倍率に応じて、ステージ４０のプレパラート配置面上における所定の横幅及び縦幅からなる撮像範囲の像が結像される。なお、対物レンズ２３により生体サンプルＳＰＬの一部が拡大されるため、上述の撮像範囲は、撮像素子１３の撮像範囲に比べて十分に狭い範囲となる。
【００４２】
ここで、サムネイル像撮像部１０及び拡大像撮像部２０は、図１に示したように、それぞれの基準位置の法線である光軸ＳＲＡと光軸ＥＲＡとがＹ軸方向に距離Ｄだけ離れるように配置される。この距離Ｄは、撮像素子１３の撮像範囲に拡大像撮像部２０の対物レンズ２３を保持する鏡筒（図示せず）が写りこむことなく、かつ小型化のために近い距離に設定される。
【００４３】
［デフォーカス量検出部］
デフォーカス量検出部３０は、図１に示したように、ビームスプリッター３１と、コンデンサレンズ３２と、２眼レンズ３３と、撮像素子３４と、を主に備える。
【００４４】
ビームスプリッター３１は、先に説明したように、拡大像撮像部２０の対物レンズ２３と撮像素子２４との間の光軸ＥＲＡ上に設けられており、対物レンズ２３を透過した透過光の一部を反射させる。換言すれば、ビームスプリッター３１によって、対物レンズ２３を透過した透過光は、撮像素子２４へと向かう透過光と、後述するデフォーカス量検出部３０内のコンデンサレンズ３２へと向かう反射光とに分岐される。
【００４５】
ビームスプリッター３１によって分岐された反射光の進行方向側には、コンデンサレンズ３２が設けられる。このコンデンサレンズ３２は、ビームスプリッター３１によって分岐された反射光を集光して、コンデンサレンズ３２の後方（反射光の進行方向側）に設けられた２眼レンズ３３へと導く。
【００４６】
２眼レンズ３３は、コンデンサレンズ３２から導光された光束を２つの光束へと分割する。分割された光束は、２眼レンズ３３の後方（反射光の進行方向側）に設けられた撮像素子３４の結像面に対して、１組の被写体像を形成する。
【００４７】
撮像素子３４には、２眼レンズ３３を透過した光がそれぞれ結像する。その結果、撮像素子３４の撮像面には、１組の被写体像が形成されることとなる。２眼レンズ３３には、コンデンサレンズ３２を射出した様々な方向の光束が入射するため、形成される１組の被写体像間には、位相差が存在する。以下では、この１組の被写体像を、位相差像と称することとする。本実施形態に係るデフォーカス量検出部３０は、この位相差を利用することで、拡大像撮像部２０中に存在する照明視野絞りのデフォーカス量を検出する。
【００４８】
以上の説明では、対物レンズ２３と撮像素子２４との間にビームスプリッター３１が設けられる場合について説明したが、光線を分岐するための光線分岐手段はビームスプリッターに限定されるわけではなく、可動式ミラー等を利用することも可能である。
【００４９】
また、サムネイル像撮像部１０、拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０それぞれに設けられる撮像素子は、１次元撮像素子であってもよく、２次元撮像素子であってもよい。
【００５０】
なお、拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０については、以下で改めて詳細に説明する。
【００５１】
［制御部］
本実施形態に係る顕微鏡１には、図１に示したように、顕微鏡の様々な部位を制御するための制御部が接続されている。具体的には、本実施形態に係る顕微鏡１には、光源１１及び光源２１を含む、顕微鏡１が備える各種の光源を制御するための照明制御部５１が接続されており、ステージ駆動機構４１には、ステージ駆動機構４１を制御するステージ駆動制御部５２が接続されている。また、コンデンサレンズ２２には、コンデンサレンズ２２の位置制御を行うコンデンサレンズ駆動制御部５３が接続されている。更に、位相差像を撮像するための撮像素子３４には、位相差像撮像制御部５４が接続されており、サムネイル像を撮像するための撮像素子１３には、サムネイル像撮像制御部５５が接続されている。また、生体サンプルＳＰＬの拡大像を撮像するための撮像素子２４には、拡大像撮像制御部５６が接続されている。これらの制御部は、各種のデータ通信路を介して制御を行う部位に対して接続されている。
【００５２】
また、本実施形態に係る顕微鏡１には、顕微鏡全体の制御を行う制御部（以下、統括制御部５０と称する。）が別途設けられており、上述の各種の制御部に、各種のデータ通信路を介して接続されている。
【００５３】
これらの制御部は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ストレージ装置、通信装置及び演算回路等により実現されるものである。
【００５４】
以下では、上記制御部について、その機能を簡単に説明するものとする。
【００５５】
○照明制御部
照明制御部５１は、本実施形態に係る顕微鏡１が備える各種の光源を制御する処理部である。照明制御部５１は、統括制御部５０から生体サンプルＳＰＬの照明方法を示す情報が出力されると、取得した照明方法を示す情報に基づいて、対応する光源の照射制御を行う。
【００５６】
例えば、照明制御部５１が、サムネイル像撮像部１０に設けられた光源１１の制御を行う場合について着目する。かかる場合、照明制御部５１は、照明方法を示す情報を参照して、明視野像を取得すべきモード（以下、明視野モードとも称する。）又は暗視野像を取得すべきモード（以下、暗視野モードとも称する。）のどちらを実行するかを判断する。その後、照明制御部５１は、各モードに応じたパラメータを光源１１に対して設定し、光源１１から、各モードに適した照明光を照射させる。これにより、光源１１から照射された照明光が、ステージ４０の開口部を介して、生体サンプルＳＰＬ全体に照射されることとなる。なお、照明制御部５１が設定するパラメータとしては、例えば、照明光の強度や光源種類の選択等を挙げることができる。
【００５７】
また、照明制御部５１が、拡大像撮像部２０に設けられた光源２１の制御を行う場合について着目する。かかる場合、照明制御部５１は、照明方法を示す情報を参照して、明視野モード又は暗視野モードのどちらを実行するかを判断する。その後、照明制御部５１は、各モードに応じたパラメータを光源２１に対して設定し、光源２１から、各モードに適した照明光を照射させる。これにより、光源２１から照射された照明光が、ステージ４０の開口部を介して、生体サンプルＳＰＬ全体に照射されることとなる。なお、照明制御部５１が設定するパラメータとしては、例えば、照明光の強度や光源種類の選択等を挙げることができる。
【００５８】
なお、明視野モードにおける照射光は、可視光とすることが好ましい。また、暗視野モードにおける照射光は、特殊染色で用いられる蛍光マーカを励起可能な波長を含む光とすることが好ましい。また、暗視野モードでは、蛍光マーカに対する背景部分はカットアウトされることとなる。
【００５９】
○ステージ駆動制御部
ステージ駆動制御部５２は、本実施形態に係る顕微鏡１に設けられたステージを駆動するためのステージ駆動機構４１を制御する処理部である。ステージ駆動制御部５２は、統括制御部５０から生体サンプルＳＰＬの撮像方法を示す情報が出力されると、取得した撮像方法を示す情報に基づいて、ステージ駆動機構４１の制御を行う。
【００６０】
例えば、本実施形態に係る顕微鏡１により、サムネイル像を撮像する場合に着目する。ステージ駆動制御部５２は、統括制御部５０から、生体サンプルＳＰＬのサムネイル像を撮像する旨の情報が出力されると、プレパラートＰＲＴ全体が撮像素子１３の撮像範囲に入るように、ステージ面方向（Ｘ―Ｙ軸方向）にステージ４０を移動させる。また、ステージ駆動制御部５２は、プレパラートＰＲＴ全体に対物レンズ１２の焦点が合うように、ステージ４０をＺ軸方向に移動させる。
【００６１】
また、本実施形態に係る顕微鏡１により、拡大像を撮像する場合について着目する。ステージ駆動制御部５２は、統括制御部５０から、生体サンプルＳＰＬの拡大像を撮像する旨の情報が出力されると、ステージ駆動制御部５２は、ステージ駆動機構４１を駆動制御し、光源１１と対物レンズ１２との間からコンデンサレンズ２２と対物レンズ２３との間に生体サンプルＳＰＬが位置するよう、ステージ面方向にステージ４０を移動させる。
【００６２】
また、ステージ駆動制御部５２は、撮像素子２４に撮像される撮像範囲に生体サンプルの所定の部位が位置するように、ステージ面方向（Ｘ−Ｙ軸方向）にステージ４０を移動させる。
【００６３】
更に、ステージ駆動制御部５２は、ステージ駆動機構４１を駆動制御して、所定の撮影範囲内に位置する生体サンプルＳＰＬの部位が対物レンズ２３の焦点に合うように、ステージ面に直交する方向（Ｚ軸方向、組織切片の奥行方向）にステージ４０を移動させる。
【００６４】
○コンデンサレンズ駆動制御部
コンデンサレンズ駆動制御部５３は、本実施形態に係る顕微鏡１の拡大像撮像部２０に設けられたコンデンサレンズ２２を駆動するためのコンデンサレンズ駆動機構４２を制御する処理部である。コンデンサレンズ駆動制御部５３は、統括制御部５０から、照明視野絞りのデフォーカス量に関する情報が出力されると、取得したデフォーカス量に関する情報に基づいて、コンデンサレンズ駆動機構４２の制御を行う。
【００６５】
後述するように、拡大像撮像部２０内に設けられた照明視野絞りが適切に合焦していない場合には、生成される拡大像のコントラストが低下してしまう。かかるコントラストの低下を防止するために、本実施形態に係る顕微鏡１では、後述する統括制御部５０において、デフォーカス量検出部３０により生成される位相差像に基づく照明視野絞りのデフォーカス量の特定処理が行われる。統括制御部５０は、特定した照明視野絞りのデフォーカス量を表す情報をコンデンサレンズ駆動制御部５３に出力して、照明視野絞りが合焦するようにコンデンサレンズ２２の位置を変更させる。
【００６６】
コンデンサレンズ駆動制御部５３は、コンデンサレンズ駆動機構４２の駆動制御を行って、照明視野絞りが合焦するように、コンデンサレンズ２２の位置（光軸ＥＲＡ上の位置）を修正する。
【００６７】
○位相差像撮像制御部
位相差像撮像制御部５４は、デフォーカス量検出部３０に設けられた撮像素子３４の制御を行う処理部である。位相差像撮像制御部５４は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを、撮像素子３４に設定する。また、位相差像撮像制御部５４は、撮像素子３４から出力される、撮像素子３４の結像面に結像した像に対応する出力信号を取得すると、取得した出力信号を、位相差像に対応する出力信号とする。位相差像撮像制御部５４は、位相差像に対応する出力信号を取得すると、取得した信号に対応するデータを統括制御部５０に出力する。なお、位相差像撮像制御部５４が設定するパラメータとして、例えば、露光の開始タイミング及び終了タイミング（換言すれば、露光時間）等を挙げることができる。
【００６８】
○サムネイル像撮像制御部
サムネイル像撮像制御部５５は、サムネイル像撮像部１０に設けられた撮像素子１３の制御を行う処理部である。サムネイル像撮像制御部５５は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを、撮像素子１３に設定する。また、サムネイル像撮像制御部５５は、撮像素子１３から出力される、撮像素子１３の結像面に結像した像に対応する出力信号を取得すると、取得した出力信号を、サムネイル像に対応する出力信号とする。サムネイル像撮像制御部５５は、サムネイル像に対応する出力信号を取得すると、取得した信号に対応するデータを統括制御部５０に出力する。なお、サムネイル像撮像制御部５５が設定するパラメータとして、例えば、露光の開始タイミング及び終了タイミング等を挙げることができる。
【００６９】
○拡大像撮像制御部
拡大像撮像制御部５６は、拡大像撮像部２０に設けられた撮像素子２４の制御を行う処理部である。拡大像撮像制御部５６は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを、撮像素子２４に設定する。また、拡大像撮像制御部５６は、撮像素子２４から出力される、撮像素子２４の結像面に結像した像に対応する出力信号を取得すると、取得した出力信号を、拡大像に対応する出力信号とする。拡大像撮像制御部５６は、拡大像に対応する出力信号を取得すると、取得した信号に対応するデータを統括制御部５０に出力する。なお、拡大像撮像制御部５６が設定するパラメータとして、例えば、露光の開始タイミング及び終了タイミング等を挙げることができる。
【００７０】
○統括制御部
統括制御部５０は、上述の各種制御部を含む顕微鏡全体の制御を行う処理部である。以下では、図２を参照しながら、本実施形態に係る統括制御部５０の構成について、詳細に説明する。図２は、本実施形態に係る統括制御部５０の構成を示したブロック図である。
【００７１】
統括制御部５０は、図２に示したように、サムネイル像取得部５０１、位相差像取得部５０３、拡大像取得部５０５、特徴量算出部５０７、エッジ位置検出部５０９、厚み変化量算出部５１１、明度補正部５１３、通信部５１５及び記憶部５１７を主に備える。
【００７２】
サムネイル像取得部５０１は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。顕微鏡１に対して所定のユーザ操作がなされた場合や、ステージ４０にプレパラートＰＲＴが載置された場合等に、サムネイル像取得部５０１は、サムネイル像撮像制御部５５に対して、各種設定条件とともにサムネイル像を撮像するように要請する。
【００７３】
また、サムネイル像取得部５０１は、サムネイル像撮像制御部５５から出力される、サムネイル像に対応するデータ（以下、サムネイル像データとも称する。）を取得する。サムネイル像取得部５０１は、取得したサムネイル像データを、後述する記憶部５１７に格納してもよい。また、サムネイル像取得部５０１は、取得したサムネイル像データを、後述する通信部５１５を介して、外部に設けられた画像データ格納サーバ等に出力してもよい。
【００７４】
位相差像取得部５０３は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。位相差像取得部５０３は、所定のタイミングにおいて、位相差像撮像制御部５４に対して、各種設定条件とともに位相差像を撮像するように要請する。ここで、位相差像の撮像を要請するタイミングとしては、例えば、照明視野絞りのピント調整を実施するようユーザ操作等により要請された場合、前回照明視野絞りのピント調整を実施してから所定の期間が経過した場合、拡大像の撮像を開始する場合、その他予め決定されたタイミングが到達した場合等がある。
【００７５】
また、位相差像取得部５０３は、位相差像撮像制御部５４から出力される、位相差像に対応するデータ（以下、位相差像データとも称する。）を取得する。位相差像取得部５０３は、取得した位相差像データを、後述する特徴量算出部５０７に出力する。また、位相差像取得部５０３は、取得した位相差像データを、後述する記憶部５１７に格納してもよい。
【００７６】
拡大像取得部５０５は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。顕微鏡１に対して所定のユーザ操作がなされた場合や、あるプレパラートＰＲＴのサムネイル像の撮像が終了した場合等に、拡大像取得部５０５は、拡大像撮像制御部５６に対して、各種設定条件とともに拡大像を撮像するように要請する。
【００７７】
また、拡大像取得部５０５は、拡大像撮像制御部５６から出力される、拡大像に対応するデータ（以下、拡大像データとも称する。）を取得する。拡大像取得部５０５は、取得した拡大像データを、後述する記憶部５１７に格納してもよい。また、拡大像取得部５０５は、取得した拡大像データを、後述する通信部５１５を介して、外部に設けられた画像データ格納サーバ等に出力してもよい。
【００７８】
特徴量算出部５０７は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。特徴量算出部５０７は、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データに基づいて、拡大像撮像部２０内に設けられた照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する。特徴量算出部５０７が算出する特徴量及び特徴量の算出方法については、以下で改めて詳細に説明する。特徴量算出部５０７は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出すると、算出した特徴量を、コンデンサレンズ駆動制御部５３に出力する。コンデンサレンズ駆動制御部５３は、出力された特徴量に応じてコンデンサレンズ駆動機構４２を駆動することで、照明視野絞りのピンボケを解消する。
【００７９】
なお、特徴量算出部５０７は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する際に、照明制御部５１に対して照明光の光量に関する要請をしたり、ステージ駆動制御部５２に対してサンプルの合焦度合いに関する要請をしたりすることが可能である。
【００８０】
また、以下で説明するように、特徴量の算出方法には各種の方法があるが、特徴量算出部５０７は、後述するエッジ位置検出部５０９と連携しながら、特徴量を算出することも可能である。
【００８１】
なお、特徴量算出部５０７が算出する特徴量や、特徴量の算出の途中経過で得られる各種数値は、厚み変化量算出部５１１や明度補正部５１３が、それぞれの処理部で実施する処理に利用される。
【００８２】
エッジ位置検出部５０９は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。エッジ位置検出部５０９は、特徴量算出部５０７や、後述する厚み変化量算出部５１１等から、位相差像取得部５０３が取得した位相差像のエッジ検出を要請された場合に、位相差像のエッジ位置を検出する。エッジ位置検出部５０９がエッジ位置の検出に利用する方法は、特に限定されるわけではなく、公知の方法を利用することが可能である。また、本実施形態に係るエッジ位置検出部５０９が行うエッジ位置検出処理の一例については、以下で改めて詳細に説明する。
【００８３】
本実施形態に係る位相差像は、後述するように、拡大像撮像部２０内に設けられた照明視野絞りの形状に関する像となっている。エッジ位置検出部５０９は、例えば以下で説明するようなエッジ位置検出処理を行うことで、照明視野絞りの形状（換言すれば、照明視野絞りによって遮られた視野の形状）におけるエッジ位置を検出する。ここで、エッジ位置検出部５０９によって検出されるエッジ位置は、例えば、撮像素子３４における画素の座標として表される。
【００８４】
エッジ位置検出部５０９は、検出したエッジ位置に関する情報を、エッジ位置検出処理の要請のあった処理部（例えば、特徴量算出部５０７や厚み変化量算出部５１１）に出力する。
【００８５】
なお、エッジ位置検出部５０９は、平面画像（すなわち、２次元画像）から１次元のみを抽出してエッジ位置の検出を行ってもよく、２次元画像そのものに対してエッジ位置検出を行ってもよい。
【００８６】
厚み変化量算出部５１１は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。前述のように、プレパラートＰＲＴは、厚み方向にばらつきを持ったカバーガラス及びスライドガラスを用いて作製される。カバーガラス及びスライドガラスの厚みのばらつき度合いを考慮すると、カバーガラスの厚みの変化よりも、スライドガラスの厚みの変化の方が、得られる拡大像のコントラスト変化に大きな影響を与える要因となる。そこで、厚み変化量算出部５１１は、生体サンプルＳＰＬが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データを利用して算出する。
【００８７】
なお、スライドガラスの厚み変化量を算出する際に利用するデータや、算出に利用される数値は、特徴量算出部５０７が特徴量を算出する際に利用したり途中経過として算出されたりするものと重複しているものがある。そこで、厚み変化量算出部５１１は、特徴量算出部５０７と連携しながら、効率よく厚み変化量の算出を行うようにしてもよい。
【００８８】
厚み変化量算出部５１１が実施する厚み変化量の算出方法の詳細については、以下で改めて詳細に説明する。
【００８９】
明度補正部５１３は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。明度補正部５１３は、拡大像撮像部２０に設けられた撮像素子２４から出力された拡大像の明度を補正する。明度補正部５１３は、明度補正を行うに当たって、後述する記憶部５１７等に格納されている、厚み変化量と明度補正パターンとが互いに関連付けられたデータベースを参照する。明度補正部５１３は、厚み変化量算出部５１１が算出した厚み変化量に基づいて、かかるデータベースの検索を行い、算出された厚み変化量に適した明度補正パターンを選択する。その後、明度補正部５１３は、選択した明度補正パターンを利用して、拡大像の明度補正処理を実施する。
【００９０】
また、明度補正部５１３は、上記明度補正パターンを利用する方法以外にも、照明視野絞りが合焦するように、光源２１の後段に位置する光学素子（例えば、コンデンサレンズ２２）の位置を制御してもよい。かかる場合には、明度補正部５１３は、照明視野絞りが合焦するようにコンデンサレンズ２２を駆動するよう、コンデンサレンズ駆動制御部５３にコンデンサレンズの駆動制御処理を要請する。
【００９１】
通信部５１５は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。通信部５１５は、本実施形態に係る顕微鏡１（より詳細には、統括制御部５０）と、顕微鏡１の外部に設けられた各種の情報処理装置との間で実施される通信を制御する。かかる通信部５１５により、本実施形態に係る顕微鏡１は、インターネット等の公共のネットワークやローカルエリアネットワーク等のプライベートネットワークに接続されている各種の情報処理装置（例えば、生体サンプルの顕微鏡画像が格納される画像データ格納サーバ等）と相互に通信を行うことが可能となる。
【００９２】
記憶部５１７は、本実施形態に係る統括制御部５０が備えるストレージ装置の一例である。この記憶部５１７には、本実施形態に係る顕微鏡１の各種の設計パラメータや、明度補正パターンに関するデータベース等が格納されている。また、記憶部５１７には、各種の撮像データや履歴情報等が記録されていてもよい。さらに、記憶部５１７には、本実施形態に係る統括制御部５０が何らかの処理を行う際に保存する必要が生じた様々なパラメータや処理の途中経過等、または、各種のデータベースやプログラム等が、適宜記録される。
【００９３】
この記憶部５１７は、統括制御部５０が備える各処理部が自由に読み書きを行うことが可能である。
【００９４】
以上、本実施形態に係る統括制御部５０の機能の一例を示した。上記の各構成要素は、汎用的な部材や回路を用いて構成されていてもよいし、各構成要素の機能に特化したハードウェアにより構成されていてもよい。また、各構成要素の機能を、ＣＰＵ等が全て行ってもよい。従って、本実施形態を実施する時々の技術レベルに応じて、適宜、利用する構成を変更することが可能である。
【００９５】
なお、上述のような本実施形態に係る統括制御部やその他の制御部の各機能を実現するためのコンピュータプログラムを作製し、パーソナルコンピュータ等に実装することが可能である。また、このようなコンピュータプログラムが格納された、コンピュータで読み取り可能な記録媒体も提供することができる。記録媒体は、例えば、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリなどである。また、上記のコンピュータプログラムは、記録媒体を用いずに、例えばネットワークを介して配信してもよい。
【００９６】
以上、図１及び図２を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡１の全体的な構成について、詳細に説明した。
【００９７】
なお、前述の説明では、デフォーカス量検出部３０内の位相差ＡＦ光学系としてコンデンサレンズ、２眼レンズ及び撮像素子を有する構成を示した。しかしながら、かかる例に限定されるわけではなく、例えば２眼レンズを１枚のレンズとして、エッジ検出を行いスライドガラスの厚み変化量を検出する等、同等の機能を実現可能なものであれば、他の光学系であってもよい。
【００９８】
また、本実施形態に係る顕微鏡１で用いられる透過照明光学系は、ケーラー照明であってもよく、他の照明光学系であってもよい。
【００９９】
更に、前述の例では、ビームスプリッター３１にて反射した光が進行する方向にデフォーカス量検出部３０が設置される場合について示したが、ビームスプリッター３１を透過した光が進行する方向にデフォーカス量検出部３０を設置してもよい。
【０１００】
＜照明視野絞りのピント調整処理について＞
続いて、図３〜図９を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡１で実施される照明視野絞りのピント調整処理について、詳細に説明する。
【０１０１】
[拡大像撮像部及び位相差ＡＦ光学部の構成の一例について]
まず、図３を参照しながら、本実施形態に係る拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０の構成の一例について説明する。図３は、本実施形態に係る顕微鏡（より詳細には、拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０）の光学系を概略的に示した説明図である。
【０１０２】
本実施形態に係る拡大像撮像部２０は、図３に示したように、ステージ４０（より詳細には、プレパラートＰＲＴ）の前段に位置し、プレパラートＰＲＴに照明光を投影する照明光学系と、プレパラートＰＲＴの後段に位置する結像光学系２１１と、からなる。また、照明光学系は、照明視野絞り２０５の前段（光源２１側）に位置する透過照明前段光学系２０１と、照明視野絞り２０５の後段に位置する透過照明後段光学系２０３と、からなる。また、結像光学系２１１の内部には、ビームスプリッター３１が設けられており、ビームスプリッター３１により分岐された光束は、デフォーカス量検出部３０へと導かれる。このデフォーカス量検出部３０は、位相差オートフォーカス（ＡＦ）光学系３０１からなる。
【０１０３】
なお、以下の説明では、第１の結像光学系の一例である結像光学系２１１の倍率をＭＩと表すこととし、第２の結像光学系の一例である位相差ＡＦ光学系３０１の倍率をＭＡと表すこととする。
【０１０４】
光源２１から照射された光線（照明光）は、図示されていない固定機構にて機械的に固定された透過照明前段光学系２０１を透過する。その後、透過照明前段光学系２０１を透過した光線は、透過正面後段光学系２０３内の照明視野絞り２０５へと入射する。ここで照明視野絞り２０５のエッジ（照明視野絞りの絞り形状のエッジ）の結像を考えるため、照明視野絞り２０５のエッジからの回折光束Ａを考える。
【０１０５】
光束Ａは、透過照明後段光学系２０３内のコンデンサレンズ２０７，２０９を透過し、ステージ４０上に保持された屈折率ｎのスライドガラスＡ表面上の試料面へと結像される。結像面にて結像された光束Ａは、結像光学系２１１に入射した光束Ａは、コンデンサレンズ（対物レンズ）２１３及びコンデンサレンズ２１５を透過し、拡大像撮像部２０の撮像素子２４の撮像面２１７に結像する。これにより、ユーザは、照明視野絞り２０５及び試料面が撮像素子２４で共に結像した状態で、これらの像Ａを観察することができる。
【０１０６】
また、光束Ａの一部は、結像光学系２１１内に位置するビームスプリッター（以下、ＢＳと略記する。）によって反射され、分岐された光束Ａの一部（以下、光束Ｂとも称する。）は、位相差ＡＦ光学系３０１に入射する。光束Ｂは、相差ＡＦ光学系３０１内に設けられたコンデンサレンズ３２を透過した後、２眼レンズ３３へと導かれる。これら２眼レンズ３３により導かれた光束Ｂは、デフォーカス量検出部３０内の撮像素子３４の撮像面３０５で結像し、２つの視野絞り像Ｂ，Ｃ（すなわち、位相差像）が生成されることとなる。これにより、ユーザは、１組の位相差像である視野絞り像Ｂ，Ｃを観察することができる。
【０１０７】
[厚みが異なるスライドガラスが載置された場合について]
次に、図４〜図６を参照しながら、スライドガラスＡと厚みがΔｔ異なる屈折率ｎのスライドガラスＢを、図３に示した光学系に設置した場合について考える。図４は、本実施形態に係る顕微鏡の光学系を概略的に示した説明図である。図５Ａ及び図５Ｂは、スライドガラスの厚みと照明視野絞りの結像位置との関係を示した説明図である。図６は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【０１０８】
照明視野絞り２０５からの光束Ａ’は、透過照明後段光学系２０３内のコンデンサレンズ２０７，２０９を透過して、スライドガラスＢへと入射する。ここで、ステージ４０が図３と同様の位置に設置された場合を考えると、スライドガラスの厚みがΔｔ増加したことで、照明視野絞り２０５はスライドガラスＢ内に結像された状態となる。
【０１０９】
図５Ａに示したように、図３に示した状態における結像光学系２１１から試料面までの距離をｄ１とし、スライドガラス厚をｔとし、透過照明後段光学系２０３からスライドガラスまでの距離をｄ２とする。かかる場合において、スライドガラスの厚みがｔから（ｔ＋Δｔ）に変化すると、結像光学系２１１から試料面までの距離と、透過照明後段光学系２０３からスライドガラスまでの距離は、それぞれｄ１−Δｔ、ｄ２となる。
【０１１０】
また、図３及び図５Ａに示した光学系において、結像光学系２１１から試料面までの間の空間は空気で満たされており、結像光学系２１１からスライドガラスまでの光学距離は、（空気の屈折率＝１）×（結像光学系２１１から試料面までの距離）＝ｄ１となる。
【０１１１】
他方、図４及び図５Ｂに示した光学系では、屈折率ｎの空間（すなわち、スライドガラス内の空間）をΔｔだけ進むこととなるため、結像光学系２１１からスライドガラスまでの光学距離は、１×（ｄ１−Δｔ）＋ｎ×Δｔ＝ｄ１＋（ｎ−１）Δｔとなる。
【０１１２】
ここで、図６から明らかなように、スネル（Ｓｎｅｌｌ）の法則より、以下の式１０１がｓｉｎ（θ）＝ｎ×ｓｉｎ（θ’）が成立する。また、集光点シフト量をＤとすると、図６に示した幾何学的関係から、以下の式１０２が成立することがわかる。Δｔ×ｓｉｎ（θ’）＝（Δｔ−Ｄ）×ｓｉｎ（θ）となる。
【０１１３】
ｓｉｎ（θ）＝ｎ×ｓｉｎ（θ’） ・・・（式１０１）
Δｔ×ｓｉｎ（θ’）＝（Δｔ−Ｄ）×ｓｉｎ（θ） ・・・（式１０２）
【０１１４】
従って、式１０１及び式１０２から、集光点シフト量Ｄは、以下の式１０３のように表されることとなる。
【０１１５】
【数１】
【０１１６】
従って、図５Ｂに示した状態では、集光点シフト量Ｄだけ結像光学系２１１から集光点がずれることとなり、撮像素子２４の撮像面２１７上でのデフォーカス量は、結像光学系２１１の倍率がＭＩであることから、Ｄ×（ＭＩ）２となる。その結果、撮像面２１７上では、照明視野絞り２０５のピントずれが発生した状態となる。
【０１１７】
本実施形態に係る顕微鏡１では、このピントズレ量Ｄ×（ＭＩ）２を検出するために、位相差ＡＦ光学系３０１から得られる情報を利用する。
【０１１８】
［ピントズレ量の検出原理］
ビームスプリッター３１により光束Ａ’から分岐された光束Ｂ’は、光束Ｂと比較してＤ×（ＭＩ）２だけデフォーカスした状態で、位相差ＡＦ光学系３０１へ入射することとなる。位相差ＡＦ光学系３０１は、図３に示したように、コンデンサレンズ３２及び２眼レンズ３３を有しており、以下で詳細に説明するように、デフォーカス量を撮像面３０５の平面方向での移動量Δｘとして検出可能である。
【０１１９】
以下では、図７を参照しながら、ピントズレ量の検出原理について説明する。図７は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【０１２０】
図７に示したような、結像面（すなわち、撮像面３０５）近傍に配置されたコンデンサレンズ３２により、複数の像高（ｉｍａｇｅ ｈｅｉｇｈｔ）の光束が２眼レンズ３３へ入射し、２眼レンズ３３により撮像面３０５へ２つの画像が結像する光学系を考える。ここで、図７に示したように、中心軸から各２眼レンズ３３までの平面方向シフト量をａとし、コンデンサレンズ３２から２眼レンズ３３までの距離をｓ１とし、２眼レンズ３３から撮像面３０５までの距離をｓ２とする。
【０１２１】
ここで、撮像面３０５の平面方向の移動量Δｘは、図７における幾何学的関係から、以下の式１０４のように表すことができる。ここで、スライドガラスの厚みの変化量のオーダーと、コンデンサレンズ３２から２眼レンズ３３までの距離のオーダーとを考慮した場合、ｓ１＞＞Ｄ・（ＭＩ）２が成立すると考えられる。すると、以下の式１０４は、倍率ＭＡに関するＭＡ＝（ｓ２／ｓ１）という関係式を用いて、以下の式１０５の左側の等式のように表すことができる。ここで、上記式１０３より集光点シフト量Ｄとスライドガラスの厚みの変化量Δｔとは比例関係にあるため、結局、撮像面３０５の平面方向の移動量Δｘは、スライドガラスの厚みの変化量Δｔと比例関係にあることがわかる。
【０１２２】
【数２】
【０１２３】
よって、照明視野絞りのピンボケ量を表す特徴量である集光点シフト量Ｄは、撮像素子３４での像Ｂ又は像Ｃの平面移動量Δｘで検出することが可能となる。
【０１２４】
［照明視野絞りのピント位置について］
特徴量算出部５０７による集光点シフト量Ｄの算出処理について説明するに先立ち、まず、図８を参照しながら、照明視野絞りの適切な位置について説明する。
【０１２５】
本実施形態に係る位相差ＡＦ光学系３０１では、位相差像として２つの被写体像が撮像素子３４上に結像される。ここで、照明視野絞り２０５とコンデンサレンズとが適切な位置関係にあって、照明が適切にスライドガラスに照射されている場合には、位相差像において、視野領域を表す窓は、２眼レンズ３３の左目に対応する画像と右目に対応する画像とで同じ位置となる。しかし、コンデンサレンズが適切な位置に存在せず、照明位置が適正位置よりも下側（光源２１側）になると、視野領域を表す窓は、撮像素子３４の中央寄り（図７に示したｘ軸方向に沿って撮像素子３４の中央寄り）に移動する。逆に、照明位置が適正位置よりも上側になると、視野領域を表す窓は、撮像素子３４のｘ軸方向に沿った端部方向へと移動する。従って、撮像素子３４に結像する窓の位置関係に着目することで、照明位置を特定することができる。
【０１２６】
ここで、予め照明位置（例えば、照明視野絞りとコンデンサレンズとの間の距離）を様々に変化させながら、位相差像における左右の窓位置の間隔を測定しておき、窓位置の間隔と照明位置との相関関係を把握しておく。この相関関係において、照明位置を適正位置からの差として表すことで、窓位置の間隔から、適正照明位置からの差を算出することが可能となる。
【０１２７】
この際、位相差像における左右の窓位置の間隔は、図８に示したようにして特定することができる。すなわち、撮像素子３４の中央を通過する、撮像素子３４の幅方向に対応する軸をｘ軸とした場合に、ｘ軸上の撮像素子３４の出力信号値（すなわち、輝度値）の分布に着目する。撮像素子３４には、左目に対応する画像と右目に対応する画像の２つの像が結像しているため、図８（ａ）に示したように、左目の画像に対応する輝度値の分布と、右目に対応する輝度値の分布とが検出される。
【０１２８】
まず、左目及び右目に対応する画像の輝度値を移動平均で平滑化し、左右それぞれの輝度の最大値（Ｌｍａｘ及びＲｍａｘ）と最小値（Ｌｍｉｎ及びＲｍｉｎ）とを検出する。その後、左右それぞれの輝度値を、左右独立に正規化する。その結果、図８（ｂ）に示したような輝度分布を得ることができる。この正規化輝度分布において、所定の閾値を超える輝度値となる画素位置を、左目に対応する画像は輝度分布の左側端部から、右目に対応する画像は輝度分布の右側端部から、それぞれ探索していく。ここで、図８（ｂ）に示したように、左目に対応する画像は、座標Ｌｐｏｓにて所定の輝度値となり、右目に対応する画像は、座標Ｒｐｏｓにて所定の輝度値となったとする。この場合、座標ＬｐｏｓとＲｐｏｓとの差を、位相差像における左右の窓位置の間隔とする。
【０１２９】
このようにして窓位置の間隔と照明位置との相関関係を特定しておくことで、実際に計測される窓位置の間隔と、この相関関係とに基づいて、照明位置を特定することが可能となる。また、照明位置とスライドガラスの厚みとの相関関係を予め測定しておくことで、特定した照明位置に基づいて、スライドガラスの厚みｔを算出することも可能である。
【０１３０】
以上のような方法で算出した適正照明位置との差を用いて、適切な照明位置を実現するための照明視野絞りのピント調節を行うことが可能であるが、本実施形態に係る特徴量算出部５０７は、以下のような方法を用いて照明視野絞りのピント調節を実施する。
【０１３１】
［特徴量算出部における特徴量算出処理］
次に、統括制御部５０の特徴量算出部５０７が実施する特徴量の算出処理（すなわち、集光点シフト量Ｄの算出処理）について、具体的に説明する。以下で説明する本実施形態に係る特徴量算出部５０７による特徴量算出処理は、位相差像データに記載されている光強度信号に対して行われる信号処理である。この光強度信号は、撮像素子３４を構成する各画素が検知した光束の強度（すなわち、受光した光の強度）を表すものであり、撮像素子３４を構成する各画素が検知した光の輝度値を表すものであるともいえる。
【０１３２】
上記式１０５に示したように、集光点シフト量Ｄと比例関係にある平面移動量Δｘを検出することで、スライドガラスの厚みの変化量Δｔを検知することが可能である。ここで、厚みｔのスライドガラスに対して照明視野絞り２０５とコンデンサレンズとが適切な位置関係にあり、照明視野絞りの位相差像が合焦点状態にある場合には、左右の位相差像は、左右（ｘ軸方向）に均等に分布していると考えられる。そこで、特徴量算出部５０７は、以下のような信号処理を行うことで、照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量である集光点シフト量Ｄを算出する。
【０１３３】
特徴量算出部５０７は、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データを参照して、位相差像（すなわち、図９における像Ｂ及び像Ｃ）の撮像面３０５での光強度信号を特定する。その後、特徴量算出部５０７は、図９に示したようにデフォーカス時の撮像面での位相差像の移動方向が逆であることを利用して、以下のような値を算出する。
【０１３４】
すなわち、特徴量算出部５０７は、撮像素子３４の各画素ｘｉから得られる像Ｂの信号強度ｆ（ｘｉ）と、像Ｃの信号強度ｇ（ｘｉ）を利用して、以下の式１０６で表される２つの信号強度の差Ａｉを算出する。また、特徴量算出部５０７は、算出した信号強度の差Ａｉを利用して、以下の式１０７で表される値Ａを算出する。
【０１３５】
【数３】
【０１３６】
ここで、照明視野絞り２０５が合焦点状態にある場合には、ｆ（ｘｉ）＝ｇ（ｘｉ）となるため、算出されるＡ＝０となる。しかしながら、スライドガラスの厚みの変化により、合焦点状態からΔｔずれた状態にある場合には、撮像素子３４の画素数をｋ（すなわち、ｉ＝１，・・・，ｋ）とすると、値Ａは、以下の式１０８のように表される。
【０１３７】
【数４】
【０１３８】
ここで、上記式１０８におけるｋ，ａ，ｓ１，ＭＡ及びＭＩは、本実施形態に係る顕微鏡１に固有の値（設計値）であるため、特徴量算出部５０７は、算出した値Ａに基づいて、集光点シフト量Ｄを算出することができる。
【０１３９】
なお、以上のような特徴量算出部５０７による特徴量の算出処理は、ステージ４０上に載置された生体サンプルにピントが合っている状態にて行っても良いが、生体サンプルにピントが合っていない状態にて行うことが好ましい。換言すれば、特徴量算出部５０７による特徴量の算出処理は、生体サンプルの透過光が、結像光学系２１１内に設けられた撮像素子２４上に合焦していない状態で行われることが好ましい。生体サンプルにピントが合っている状態では、像Ｂ及び像Ｃに対応する出力信号に、生体サンプルに対応する信号が含まれることとなり、算出される特徴量の誤差要因となる可能性があるからである。
【０１４０】
算出される特徴量に含まれる誤差を低減するために、統括制御部５０は、照明光の強度を、撮像素子３４上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整してもよい。また、照明視野絞りの枠が撮像素子３４に結像した際に、かかる照明視野絞りの枠が撮像素子３４の枠内に収まるようになっていることが好ましい。換言すれば、照明視野絞りの枠（照明視野絞りの形状）での光束が、光学系内に存在する各種の絞りによりケラれることなく、撮像素子３４に結像することが好ましい。これにより、特徴量算出部５０７は、より正確に特徴量を算出することが可能となる。
【０１４１】
本実施形態に係る統括制御部５０は、特徴量算出部５０７が算出した特徴量（すなわち、集光点シフト量Ｄ）に基づいて、照明視野絞りのピント調整を実施する。
透過照明後段光学系２０３内に位置するコンデンサレンズ２０９の倍率が０である場合、コンデンサレンズシフト量ΔＺ＝コンデンサレンズＡの集光点シフト量となる。そのため、特徴量算出部５０７は、算出した集光点シフト量Ｄを表す情報を、コンデンサレンズ駆動制御部５３に出力する。コンデンサレンズ駆動制御部５３は、取得した集光点シフト量Ｄに応じてコンデンサレンズ駆動機構４２の駆動制御を行い、コンデンサレンズ２０９をレンズの光軸方向に駆動する。これにより、照明視野絞り２０５を撮像素子の撮像面上へ結像させることが可能となる。
【０１４２】
なお、透過照明後段光学系２０３内に位置するコンデンサレンズ２０９の倍率は、任意の値とすることができる。なお、コンデンサレンズ２０９の倍率が０以外である場合には、集光点シフト量Ｄとレンズシフト量ΔＺとの関係がレンズ固有の関係で決定される。そのため、集光点シフト量Ｄとレンズシフト量ΔＺとの相関関数を予め統括制御部５０（例えば、記憶部５１７等）に格納しておき、特徴量算出部５０７は、格納されている相関関数を用いて、集光点シフト量Ｄに基づいてレンズシフト量ΔＺを決定する。特徴量算出部５０７は、算出したレンズシフト量ΔＺをコンデンサレンズ駆動制御部５３に出力することで、照明視野絞りのピント調整を実施することができる。
【０１４３】
かかる処理を行うことで、透過照明後段光学系２０３内の任意のレンズにとりつけられたコンデンサレンズ駆動機構４２により、スライドガラスの厚みズレΔｔに起因する照明視野絞りのピントズレを、自動的に補正することが可能となる。かかる処理をスライドガラスを交換するたびに行うことで、本実施形態に係る顕微鏡１は、観察スライドガラスの厚みによらず照明視野絞りのピントを合わせることが可能となる。
【０１４４】
このように、本実施形態に係る特徴量算出部５０７では、位相差ＡＦ光学系３０１により得られた位相差像の出力信号と、顕微鏡１に固有の値（設計パラメータ等）とを用いて演算を行うことで、照明視野絞りのピントズレ量を算出する。照明視野絞りピント調整部の一例であるコンデンサレンズ駆動制御部５３は、特徴量算出部５０７から出力されたピントズレ量に応じてコンデンサレンズ駆動機構４２を制御し、照明視野絞りのピントを調整する。
【０１４５】
かかる照明視野絞りのピント調整処理により、本実施形態に係る顕微鏡１では、照明視野絞りのピント調整を自動化することができ、従来目視にて調整されていた内容を、定量的に実施することが可能となる。また、位相差ＡＦ光学系にて照明視野絞りのピント調整が可能となるため、同一の顕微鏡を用いて、従来の位相差ＡＦを試料面にて実施することが可能となる。
【０１４６】
＜ステージ位置の調整処理について＞
顕微鏡において複数の試料を観察する際、その試料は厚さ方向にばらつきをもったカバーガラスおよびスライドガラスにて作製される。薄い試料を観察する際、スライドガラスの厚みは１．１ｍｍ程度と、カバーガラス厚や試料厚と比較して１桁以上厚く、また厚みも数百μｍ程度ばらつくことがある。そのため、従来の顕微鏡のようにスライドガラス駆動ステージの上面にスライドガラスを保持し、スライドガラス上方に配置された顕微鏡光学系にて試料を観察した場合、スライドガラスの厚み変化量に応じて試料面から顕微鏡光学系までの距離が変化する。その結果、試料面を観察した画像が、デフォーカスによりボケてしまうという問題があった。
【０１４７】
そこで、本実施形態に係る統括制御部５０の厚み変化量算出部５１１は、生体サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データに基づいて算出し、算出結果に応じてステージ位置の調整を行う。
【０１４８】
上記式１０３を式１０５に代入することで、以下の式１２１を得ることができる。従って、撮像素子３４での位相差像Ｂ又はＣの平行移動量Δｘに基づいて、スライドガラスの厚み変化量Δｔを算出することができる。
【０１４９】
【数５】
【０１５０】
[厚み変化量Δｔの算出方法−その１]
厚み変化量算出部５１１は、例えば以下のようにして、スライドガラスの厚み変化量Δｔを算出することが可能である。
厚み変化量算出部５１１は、上記式１０６及び式１０７に基づいて、位相差像における光強度信号の差の合計Ａを算出する。なお、この値Ａは、特徴量算出部５０７が算出する値Ａと同一のものであるため、厚み変化量算出部５１１は、独自にこの値を算出してもよく、特徴量算出部５０７が算出した値Ａを取得して、厚み変化量の算出処理に利用してもよい。
【０１５１】
ここで、スライドガラスの厚みの変化により、合焦点状態からΔｔずれた状態にある場合には、撮像素子３４の画素数をｋ（すなわち、ｉ＝１，・・・，ｋ）とすると、値Ａは、以下の式１２２のように表される。
【０１５２】
【数６】
【０１５３】
ここで、上記式１２２におけるｋ，ａ，ｓ１，ＭＡ及びＭＩは、本実施形態に係る顕微鏡１に固有の値（設計値）であるため、厚み変化量算出部５１１は、スライドガラスの屈折率ｎと、算出した値Ａとに基づいて、厚み変化量Δｔを算出することができる。
【０１５４】
[厚み変化量Δｔの算出方法−その２]
また、厚み変化量算出部５１１は、例えば以下のようにして、スライドガラスの厚み変化量Δｔを算出してもよい。なお、以下で説明する処理では、合焦点状態における位相差像Ｂ及び位相差像Ｃの少なくともいずれか一方のエッジ位置を表す情報（例えば、エッジ位置の座標等）が、記憶部５１７等に格納されているものとする。
【０１５５】
厚み変化量算出部５１１は、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データについて、エッジ位置検出部５０９に対して、エッジ位置の検出処理を要請する。エッジ位置検出部５０９は、像Ｂ及び像Ｃの少なくともいずれか一方について、そのエッジ位置を検出する処理を実施し、対応する画像のエッジ位置を表すＸ座標ｘｉを検出する。このエッジ位置は、着目した像のＸ軸方向に沿った一方の端部を表す位置である。エッジ位置検出部５０９は、検出されたエッジ位置に関する情報を、厚み変化量算出部５１１に出力する。
【０１５６】
厚み変化量算出部５１１は、エッジ位置検出部５０９から出力されたエッジ位置座標ｘｉと、合焦時のエッジのＸ座標（以下、Ｘと表記する。）とを利用して、エッジ位置の相対Ｘ座標であるｘｉ−Ｘを算出する。
【０１５７】
ここで、算出されるエッジ位置の相対Ｘ座標ｘｉ−Ｘは、以下の式１２３のように表すことができる。
【０１５８】
【数７】
【０１５９】
ここで、上記式１２３におけるａ，ｓ１，ＭＩは、本実施形態に係る顕微鏡１に固有の値（設計値）であるため、厚み変化量算出部５１１は、スライドガラスの屈折率ｎと、算出したエッジ位置の相対Ｘ座標とに基づいて、厚み変化量Δｔを算出することができる。なお、本方法は、照明視野絞りのエッジ位置に基づいて、スライドガラスの厚み変化量を算出する方法であるため、照明視野絞り２０５のエッジが撮像素子３４にて検出されるように、位相差ＡＦ光学系３０１の倍率ＭＩを設定することが望ましい。以上説明したような本方式では、照明光のシェーディングの影響を避けることが可能となる。
【０１６０】
なお、以上のような厚み変化量算出部５１１による厚み変化量の算出処理は、ステージ４０上に載置された生体サンプルにピントが合っている状態にて行ってもよいし、生体サンプルにピントが合っていない状態にて行ってもよい。
【０１６１】
本実施形態に係る統括制御部５０は、厚み変化量算出部５１１が算出した厚み変化量Δｔに基づいて、ステージ位置の調整を実施する。
図３等に示したように、スライドガラスの取り付け面がステージ４０の結像光学系２１１側である場合、試料面のデフォーカス量は、スライドガラスの厚み変化量Δｔと同一である。従って、厚み変化量算出部５１１は、算出した厚み変化量Δｔを表す情報を、ステージ駆動制御部５２に出力する。ステージ駆動制御部５２は、取得した厚み変化量Δｔに応じてステージ駆動機構４１の駆動制御を行い、ステージ４０をΔｔだけ結像光学系２１１側へと移動させる。これにより、本実施形態に係る顕微鏡１では、スライドガラスの厚み変化に起因して生じた試料面のピントズレを補正することが可能となる。
【０１６２】
そのため、厚み変化量算出部５１１は、合焦点状態（例えば、図３に示した状態）での撮像面３０５のエッジ位置座標及びステージの位置を表す位置座標を保持しておき、厚み変化量を算出する際の基準値とする。その上で、図４に示したように、厚みの異なるスライドガラスを用いた試料がステージ４０上に設置されると、格納されている基準値と、観察された撮像面３０５でのエッジ位置座標に基づいて、エッジ位置座標の変化量を算出する。統括制御部５０は、算出した厚み変化量Δｔに応じてステージを駆動することで、試料面を撮像素子２４に結像した状態で観察することが可能となる。
【０１６３】
なお、前述の説明では、厚み変化量算出部５１１は、像Ｂ又は像Ｃにおいて、照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、厚み変化量を算出する場合について説明したが、かかる場合に限定されるわけではない。厚み変化量算出部５１１は、像Ｂ及び像Ｃそれぞれにおいて、照明視野絞りのある一方の側のエッジ位置座標に基づいて、厚み変化量Δｔを算出してもよい。また、厚み変化量算出部５１１は、像Ｂ及び像Ｃそれぞれにおいて、照明視野絞りの形状の両側のエッジ位置の和に基づいて、厚み変化量Δｔを算出してもよい。このようにすることで、厚み変化量算出部５１１は、結像面ずれによる誤差の発生や、ディストーション（歪曲収差）による誤差の発生を、除去することが可能となる。
【０１６４】
このように、本実施形態に係る厚み変化量算出部５１１では、位相差ＡＦ光学系３０１により得られた位相差像の出力信号と、顕微鏡１に固有の値（設計パラメータ等）とを用いて演算を行うことで、スライドガラス厚やスライドガラスの厚み変化量を算出できる。また、本実施形態に係る統括制御部５０は、算出したスライドガラスの厚み変化量に応じてステージ位置を駆動させることで、厚み方向の変化量が最も大きなスライドガラス厚の変化分をキャンセルし、試料を正確に観察することが可能となる。
【０１６５】
また、かかる厚み変化量を算出することで、試料面の位置（生体サンプルの光軸方向に沿った位置）によらず、スライドガラスの厚み変化量をもとに、試料面のピント調整が可能となる。そのため、スライドガラスの厚み変化に起因して大きなデフォーカスが発生し、試料面がほぼなんら信号を有さない状態となったとしても、試料面のピント調整を行うことが可能となる。このように、本方式によれば、試料面からの情報を用いずに、試料面のピント調整を行うことができる。
【０１６６】
また、従来の試料面ピント調整に利用可能な光学系を利用することで、照明視野絞り及び試料面双方のピント調整を、一台の装置にて実施することが可能となる。また、スライドガラスの厚み変化検出をもとにステージを駆動した後、試料面を位相差ＡＦ光学系にて観察して従来の位相差ＡＦを行うことで、同一光学系にてピント微調整を実施することも可能となる。
【０１６７】
＜明度ムラの補正処理について＞
前述のように、スライドガラスの厚みは、その変動幅が大きく、かかる厚みの変化に起因して、ある厚みのスライドガラスでは合焦点状態にあった光学系が、ある厚みのスライドガラスでは合焦点状態ではなくなる、といった事態が生じうる。その結果、スライドガラスの厚みの変化に応じて、撮像素子２４により撮像される被写体像（拡大像）の明度にもムラが生じる可能性がある。
【０１６８】
そこで、本実施形態に係る顕微鏡１では、前述のように、スライドガラスの厚みが変化して、照明視野絞りが合焦点状態ではなくなった場合、照明視野絞りが合焦点状態となるように、照明光学系の位置を調整する。
【０１６９】
照明光学系の位置が調整され、照明視野絞りが合焦点状態にある場合には、撮像された画像における明度のムラは、一定とみなすことが可能である。そこで、本実施形態に係る統括制御部５０では、光学系が合焦点状態にある場合における明度ムラ補正用の明度ムラ補正パターンを予め準備しておき、記憶部５１７等に格納しておく。その後、本実施形態に係る明度補正部５１３は、照明視野絞りが合焦点状態となるように調整された後に撮像された被写体像に対して、予め格納されている共通の明度ムラ補正パターンを利用して、被写体像に含まれる明度ムラを補正する。
【０１７０】
また、照明視野絞りの合焦調整を行わない場合であっても、明度補正部５１３は、以下のような方法を用いることで、撮像された被写体像に存在しうる明度ムラを補正することが可能である。すなわち、スライドガラスの厚みごとに、予め複数種類の明度補正パターンを準備しておき、記憶部５１７等に格納しておく。その後、明度補正部５１３は、算出されたスライドガラスの厚みに応じて、複数の明度補正パターンの中から、明度補正処理に利用する明度補正パターンを選択する。明度補正部５１３は、選択した明度補正パターンを利用して明度ムラ補正を行うことが可能である。
【０１７１】
明度補正部５１３が、このような明度補正処理を実施することで、適切な被写体像を得ることが可能となる。
【０１７２】
以上、本実施形態に係る顕微鏡１で実施される各種処理について、詳細に説明した。
なお、前述の説明では、コンデンサレンズ駆動機構４２により透過照明後段光学系２０３のコンデンサレンズを駆動する場合について説明したが、照明視野絞り２０５のピント位置を調整可能であるならば、他のレンズや照明光学系全体を駆動しても良い。
【０１７３】
また、前述の説明では、照明視野絞り２０５のピントズレがスライドガラスの厚み変化に起因するものとして説明したが、本実施形態に係る合焦方法によれば、他の原因による照明視野絞り２０５のピントズレを検出して調整することも可能である。
【０１７４】
更に、前述の説明では、位相差ＡＦ光学系３０１にて照明視野絞り２０５のピントズレを検出しているが、位相差ＡＦ光学系３０１にて試料面のピントズレを検出し、試料面のピント調整を実施してもよい。
【０１７５】
＜変形例＞
前述の説明では、特徴量算出部５０７が、位相差像データに記載されている信号強度を利用して特徴量（集光点シフト量Ｄ）を算出する場合について説明したが、特徴量算出部５０７は、以下で説明するような方法を用いて、特徴量を算出してもよい。
【０１７６】
前述のように、集光点シフト量Ｄは、式１０５を利用して、平面移動量Δｘから算出することができる。ここで、平面移動量Δｘを位相差像から決定するために、例えば図１０に示したような撮像素子３４に結像した位相差像（像Ｂ及び像Ｃ）のエッジ検出を利用する。ここで、図１０に示したｘ軸は、撮像素子３４の撮像面３０５の中心を通り、撮像素子の幅方向に対応する軸であり、図１０に示したｙ軸は、撮像素子３４の撮像面３０５の中心を通り、撮像素子の高さ方向に対応する軸である。
【０１７７】
図１０のｙ＝０におけるｘ座標方向での強度分布を示したものが、図１１である。図１１に示したように、撮像素子３４にて観察される照明視野絞り像が一様な強度分布をしている場合、像のエッジ部分でのみ急激に信号量が変化する。そのため、例えば像Ｂ信号及び像Ｃ信号を微分すると、図１２のように微分信号のピーク値をエッジとして検出することが可能となる。なお、一様な強度分布をしている照明視野絞り像を得るために、統括制御部５０は、照明光の強度を、撮像素子３４上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整することが好ましい。本実施形態では、位相差像として生成される画像が２種類存在し、かつ、各画像についてｘ軸方向のエッジが左右２つ存在するため、位相差像に対してエッジ位置検出部５０９がエッジ位置の検出処理を行うことで、計４つのエッジ位置座標が求まることとなる。
【０１７８】
ここで、図１１に示したように、エッジ位置座標をεと表すこととし、各々のエッジ位置座標を、εｃ１，εｃ２，εｂ１，εｂ２と表すこととする。これらのエッジ位置座標は、照明視野絞り２０５がデフォーカスすることで、像Ｃについては、−Δｘだけ移動し、像Ｂについては、＋Δｘだけ移動することとなる。
【０１７９】
エッジ位置検出部５０９は、このようにして検出された４種類のエッジ位置座標のうち、少なくとも１つに関する検出結果を、特徴量算出部５０７に出力する。特徴量算出部５０７は、得られたエッジ位置座標の検出結果のうち、少なくとも１つのエッジ位置（例えば、εｂ１で表されるエッジ位置）のみに注目することで、平面移動量Δｘを検出することが可能となる。この場合には、位相差ＡＦ光学系３０１は、２眼レンズを用いた光学系ではなく、単眼レンズを用いた光学系であってもよい。
【０１８０】
また、単一エッジ位置座標にて平面移動量Δｘを検出する場合、結像面ずれΔｘ０が存在すると、検出される平面移動量ΔｘがΔｘ＋Δｘ０となり、結像面ずれの影響を受けることとなる。そのため、特徴量算出部５０７は、Δｘ＝（εｂ１−εｃ２）／２、又は、Δｘ＝（εｂ２−εｃ１）／２として、結像面ずれΔｘ０の影響を除去するようにしてもよい。
【０１８１】
また２眼レンズを用いた位相差ＡＦ光学系３０１が設けられており、かつ、図１３に示したようなディストーション（歪曲収差）が存在する場合、図１３に示したように、ディストーションにより同一像内の左右のエッジ結像位置にズレが生ずることとなる。
【０１８２】
図７に示したように中心軸を中心として２眼レンズが対称位置に存在する場合、図１４に示した像Ｃのエッジ左側と像Ｂのエッジ右側のシフト量は、｜Δｄｘ１｜と同一となる。同様に、図１４に示した像Ｂのエッジ左側と像Ｃのエッジ右側のシフト量についても、｜Δｄｘ２｜と同一となる。そのため、特徴量算出部５０７は、Δｘ＝｛（εｃ１＋εｃ２）−（εｂ１＋εｂ２）｝／４とすることで、ディストーションの影響を除去することが可能となる。
【０１８３】
特徴量算出部５０７は、以上のようにして算出した平面移動量Δｘを利用して、式１０５により集光点シフト量Ｄを算出することが可能である。
【０１８４】
以上説明したように、本変形例に係る特徴量算出部５０７は、位相差ＡＦ光学系３０１にて得られた位相差像から結像画像内での照明視野絞りエッジ位置を検出し、検出したエッジ位置座標に基づいて照明視野絞りのピントズレ量を算出する。照明視野絞りピント調整部の一例であるコンデンサレンズ駆動制御部５３は、特徴量算出部５０７から出力されたピントズレ量に応じてコンデンサレンズ駆動機構４２を制御し、照明視野絞りのピントを調整する。
【０１８５】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【符号の説明】
【０１８６】
１ 顕微鏡
１０ サムネイル像撮像部
１１，２１ 光源
１２，２３ 対物レンズ
１３，２４，３４ 撮像素子
２０ 拡大像撮像部
２２，３２ コンデンサレンズ
３０ デフォーカス量検出部
３１ ビームスプリッター
３３ ２眼レンズ
４０ ステージ
４１ ステージ移動機構
４２ コンデンサレンズ駆動機構
５０ 統括制御部
５１ 照明制御部
５２ ステージ駆動制御部
５３ コンデンサレンズ駆動制御部
５４ 位相差像撮像制御部
５５ サムネイル像撮像制御部
５６ 拡大像撮像制御部
２０１ 透過照明前段光学系
２０３ 透過照明後段光学系
２０５ 照明視野絞り
２０７，２０９，２１５ コンデンサレンズ
２１１ 結像光学系
２１３ コンデンサレンズ（対物レンズ）
２１７，３０５ 撮像面
３０１ 位相差オートフォーカス光学系
５０１ サムネイル像取得部
５０３ 位相差像取得部
５０５ 拡大像取得部
５０７ 特徴量算出部
５０９ エッジ位置検出部
５１１ 厚み変化量算出部
５１３ 明度補正部
５１５ 通信部
５１７ 記憶部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡及び合焦点方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、対物レンズの切り換えに応じて、コンデンサレンズ、視野絞り、開口絞り、標本ステージの対物レンズ光軸方向駆動機構、フィルタ、光源に対する調光電源等の調整が自動的に行われる電動式顕微鏡が知られている（例えば、以下の特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１３３３１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、顕微鏡において複数の試料を観察する際、これら複数の試料は、厚さ方向にばらつきのあるカバーガラス及びスライドガラスを利用して作製される。そのため、照明光にてこれら試料を照射する場合に任意の位置に照明が配置されていると、スライドガラスの厚みが変化することで照明から対物レンズまでの光学距離が変化してしまう。その結果、照明光学系内に設けられた照明視野絞りが試料面の観察位置から光軸方向にずれた位置にて結像することとなり、画像のコントラストの低下等の問題が発生する。
【０００５】
上記特許文献１に記載の顕微鏡を含む従来の顕微鏡では、視野絞り補正環を絞り、照明光学系のコンデンサレンズの光軸方向位置を調整し、補正環のエッジの結像具合を目視もしくは撮像素子にて観察して調整することで、照明視野絞りのピント調整を行うことが一般的である。
【０００６】
しかしながら、複数の試料を自動で観察可能なシステムを構築する場合には、自動かつ迅速に照明視野絞りのピント調整を自動的に行うことが求められる。
【０００７】
そこで、本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的とするところは、照明視野絞りのピント調整を自動的に行うことが可能な、顕微鏡及び合焦点方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のある観点によれば、照明視野絞りと、１又は複数の光学素子とを有し、ステージに設けられたサンプルに対して照明光を投影する照明光学系と、前記サンプルを透過した透過光を撮像する第１の撮像素子と、当該第１の撮像素子に前記透過光を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第１の結像光学系と、前記第１の結像光学系から前記透過光の一部を分岐する光線分岐部と、分岐された前記透過光の位相差像を撮像する第２の撮像素子と、当該第２の撮像素子に前記分岐された透過光の位相差像を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第２の結像光学系と、前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整部と、前記第２の撮像素子から出力される出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する特徴量算出部と、を備え、前記照明視野絞りピント調整部は、前記特徴量算出部により算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する顕微鏡が提供される。
【０００９】
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、前記特徴量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記特徴量を算出してもよい。
【００１０】
前記特徴量算出部による特徴量の算出は、前記サンプルの透過光が前記第１の撮像素子上に合焦していない状態で行われることが好ましい。
【００１１】
前記照明光の強度は、前記第２の撮像素子上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整されることが好ましい。
【００１２】
前記顕微鏡は、前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、を更に備え、前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、前記厚み変化量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させてもよい。
【００１３】
前記顕微鏡は、前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、を更に備え、前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、前記厚み変化量算出部は、少なくとも合焦時における前記第１の像又は前記第２の像のエッジ位置と得られた第１の像又は前記第２の像のエッジ位置との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させてもよい。
【００１４】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像又は前記第２の像において、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出してもよい。
【００１５】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出してもよい。
【００１６】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状の両側のエッジ位置の和に基づいて、前記厚み変化量を算出してもよい。
【００１７】
前記特徴量算出部は、前記出力信号のエッジ位置を利用して、前記特徴量を算出してもよい。
【００１８】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、前記明度補正部は、前記照明視野絞りピント調整部により前記照明視野絞りの像が合焦するように前記照明視野絞りが調整された後に撮像された像に対して、予め準備された、明度補正に利用される明度補正パターンを利用して、明度の補正を実施してもよい。
【００１９】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、前記明度補正部は、算出された前記スライドガラスの厚みに基づいて、予め設定された複数の明度補正パターンの中から明度補正に利用する明度補正パターンを選択し、前記明度の補正を実施してもよい。
【００２０】
また、上記課題を解決するために、本発明の別の観点によれば、照明視野絞りを有する照明光学系により投影された照明光のうちステージに設けられたサンプルを透過した透過光の一部を分岐して、分岐された前記透過光の位相差像を撮像素子により撮像するステップと、前記撮像素子から出力された出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出するステップと、算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整機構を駆動するステップと、を含む合焦点方法が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように本発明によれば、照明視野絞りのピント調整を自動的に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡の構成を示した説明図である。
【図２】同実施形態に係る統括制御部の構成を示したブロック図である。
【図３】同実施形態に係る顕微鏡の光学系を概略的に示した説明図である。
【図４】同実施形態に係る顕微鏡の光学系を概略的に示した説明図である。
【図５Ａ】スライドガラスの厚みと照明視野絞りの結像位置との関係を示した説明図である。
【図５Ｂ】スライドガラスの厚みと照明視野絞りの結像位置との関係を示した説明図である。
【図６】照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【図７】照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【図８】位相差像における照明位置の検出方法を示した説明図である。
【図９】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１０】本発明の第２の実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１１】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１２】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１３】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【図１４】同実施形態に係る合焦方法について説明するための説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００２４】
なお、説明は、以下の順序で行うものとする。
（１）第１の実施形態
（１−１）顕微鏡の構成について
（１−２）照明視野絞りのピント調整処理について
（１−３）ステージ位置の調整処理について
（１−４）明度ムラの補正処理について
（１−５）変形例
【００２５】
（第１の実施形態）
＜顕微鏡の構成について＞
まず、図１を参照しながら、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡１の構成について説明する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡１の構成を示した説明図である。
【００２６】
［全体構成］
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に例示したように、生体サンプルＳＰＬが配設されるプレパラートＰＲＴ全体の像（以下、この像をサムネイル像とも称する。）を撮像するサムネイル像撮像部１０と、生体サンプルＳＰＬが所定倍率で拡大された像（以下、この像を拡大像とも称する。）を撮像する拡大像撮像部２０と、を有する。また、拡大像撮像部２０には、拡大像撮像部２０中に存在する照明視野絞りのデフォーカス（ｄｅｆｏｃｕｓ）量を検出するためのデフォーカス量検出部３０が設けられている。
【００２７】
プレパラートＰＲＴは、血液等の結合組織、上皮組織又はそれらの双方の組織などの組織切片又は塗抹細胞からなる生体サンプルＳＰＬを、所定の固定手法によりスライドガラスに固定したものである。これらの組織切片又は塗抹細胞には、必要に応じて各種の染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色のみならず、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ−Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）や酵素抗体法等の蛍光染色が含まれる。
【００２８】
また、プレパラートＰＲＴには、対応する生体サンプルＳＰＬを特定するための付帯情報（例えば、サンプルを採取した人の氏名、採取日時、染色の種類等）が記載されたラベルが貼付されていてもよい。
【００２９】
本実施形態に係る顕微鏡１には、上述のようなプレパラートＰＲＴが載置されるステージ４０が設けられており、更に、ステージ４０を様々な方向に移動させるためのステージ駆動機構４１が設けられている。このステージ駆動機構４１により、ステージ４０を、ステージ面に対して平行となる方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）と、直交する方向（Ｚ軸方向）に自由に移動させることができる。
【００３０】
また、拡大像撮像部２０には、照明視野絞りピント調整部の一例であるコンデンサレンズ駆動機構４２が設けられている。
【００３１】
［サムネイル像撮像部］
サムネイル像撮像部１０は、図１に示したように、光源１１と、対物レンズ１２と、撮像素子１３と、を主に備える。
【００３２】
光源１１は、ステージ４０のプレパラート配置面とは逆の面側に設けられる。光源１１は、一般染色が施された生体サンプルＳＰＬを照明する光（以下、明視野照明光、又は、単に照明光とも称する。）と、特殊染色が施された生体サンプルＳＰＬを照明する光（以下、暗視野照明光とも称する。）とを切り換えて照射可能である。また、光源１１は、明視野照明光又は暗視野照明光のいずれか一方だけを照射可能なものであってもよい。この場合、光源１１として、明視野照明光を照射する光源と、暗視野照明光を照射する光源の２種類の光源が設けられることとなる。
【００３３】
更に、サムネイル像撮像部１０には、プレパラートＰＲＴに貼付されたラベルに記載されている付帯情報を撮像するための光を照射するラベル光源（図示せず。）が別途設けられていてもよい。
【００３４】
所定倍率の対物レンズ１２は、プレパラート配置面におけるサムネイル像撮像部１０の基準位置の法線を光軸ＳＲＡとして、ステージ４０のプレパラート配置面側に配設される。ステージ４０上に配設されたプレパラートＰＲＴを透過した透過光は、この対物レンズ１２によって集光されて、対物レンズ１２の後方（すなわち、照明光の進行方向）に設けられた撮像素子１３に結像する。
【００３５】
撮像素子１３には、ステージ４０のプレパラート配置面に載置されたプレパラートＰＲＴ全体を包括する撮像範囲の光（換言すれば、プレパラートＰＲＴ全体を透過した透過光）が結像する。この撮像素子１３上に結像した像が、プレパラートＰＲＴ全体を撮像した顕微鏡画像であるサムネイル像となる。
【００３６】
［拡大像撮像部］
拡大像撮像部２０は、図１に示したように、光源２１と、コンデンサレンズ２２と、対物レンズ２３と、撮像素子２４と、を主に備える。また、拡大像撮像部２０には、更に、照明視野絞り（図示せず。）が設けられている。
【００３７】
光源２１は、明視野照明光を照射するものであり、ステージ４０のプレパラート配置面とは逆の面側に設けられる。また、光源２１とは異なる位置（例えばプレパラート配置面側）には、暗視野照明光を照射する光源（図示せず。）が設けられる。
【００３８】
コンデンサレンズ２２は、光源２１から照射された明視野照明光や、暗視野照明用の光源から照射された暗視野照明光を集光して、ステージ４０上のプレパラートＰＲＴに導くレンズである。このコンデンサレンズ２２は、プレパラート配置面における拡大像撮像部２０の基準位置の法線を光軸ＥＲＡとして、光源２１とステージ４０との間に配設される。また、コンデンサレンズ駆動機構４２は、このコンデンサレンズ２２を光軸ＥＲＡ方向に沿って駆動することが可能である。コンデンサレンズ２２は、コンデンサレンズ駆動機構４２によって、光軸ＥＲＡ上の位置を変えることができる。
【００３９】
所定倍率の対物レンズ２３は、プレパラート配置面における拡大像撮像部２０の基準位置の法線を光軸ＥＲＡとして、ステージ４０のプレパラート配置面側に配設される。拡大像撮像部２０では、この対物レンズ２３を適宜交換することで、生体サンプルＳＰＬを様々な倍率に拡大して撮像することが可能となる。ステージ４０上に配設されたプレパラートＰＲＴを透過した透過光は、この対物レンズ２３によって集光されて、対物レンズ２３の後方（すなわち、照明光の進行方向）に設けられた撮像素子２４に結像する。
【００４０】
なお、対物レンズ２３と撮像素子２４との間の光軸ＥＲＡ上には、ビームスプリッター３１が設けられており、対物レンズ２３を透過した透過光の一部が、後述するデフォーカス量検出部３０へと導かれる。
【００４１】
撮像素子２４には、撮像素子２４の画素サイズ及び対物レンズ２３の倍率に応じて、ステージ４０のプレパラート配置面上における所定の横幅及び縦幅からなる撮像範囲の像が結像される。なお、対物レンズ２３により生体サンプルＳＰＬの一部が拡大されるため、上述の撮像範囲は、撮像素子１３の撮像範囲に比べて十分に狭い範囲となる。
【００４２】
ここで、サムネイル像撮像部１０及び拡大像撮像部２０は、図１に示したように、それぞれの基準位置の法線である光軸ＳＲＡと光軸ＥＲＡとがＹ軸方向に距離Ｄだけ離れるように配置される。この距離Ｄは、撮像素子１３の撮像範囲に拡大像撮像部２０の対物レンズ２３を保持する鏡筒（図示せず）が写りこむことなく、かつ小型化のために近い距離に設定される。
【００４３】
［デフォーカス量検出部］
デフォーカス量検出部３０は、図１に示したように、ビームスプリッター３１と、コンデンサレンズ３２と、２眼レンズ３３と、撮像素子３４と、を主に備える。
【００４４】
ビームスプリッター３１は、先に説明したように、拡大像撮像部２０の対物レンズ２３と撮像素子２４との間の光軸ＥＲＡ上に設けられており、対物レンズ２３を透過した透過光の一部を反射させる。換言すれば、ビームスプリッター３１によって、対物レンズ２３を透過した透過光は、撮像素子２４へと向かう透過光と、後述するデフォーカス量検出部３０内のコンデンサレンズ３２へと向かう反射光とに分岐される。
【００４５】
ビームスプリッター３１によって分岐された反射光の進行方向側には、コンデンサレンズ３２が設けられる。このコンデンサレンズ３２は、ビームスプリッター３１によって分岐された反射光を集光して、コンデンサレンズ３２の後方（反射光の進行方向側）に設けられた２眼レンズ３３へと導く。
【００４６】
２眼レンズ３３は、コンデンサレンズ３２から導光された光束を２つの光束へと分割する。分割された光束は、２眼レンズ３３の後方（反射光の進行方向側）に設けられた撮像素子３４の結像面に対して、１組の被写体像を形成する。
【００４７】
撮像素子３４には、２眼レンズ３３を透過した光がそれぞれ結像する。その結果、撮像素子３４の撮像面には、１組の被写体像が形成されることとなる。２眼レンズ３３には、コンデンサレンズ３２を射出した様々な方向の光束が入射するため、形成される１組の被写体像間には、位相差が存在する。以下では、この１組の被写体像を、位相差像と称することとする。本実施形態に係るデフォーカス量検出部３０は、この位相差を利用することで、拡大像撮像部２０中に存在する照明視野絞りのデフォーカス量を検出する。
【００４８】
以上の説明では、対物レンズ２３と撮像素子２４との間にビームスプリッター３１が設けられる場合について説明したが、光線を分岐するための光線分岐手段はビームスプリッターに限定されるわけではなく、可動式ミラー等を利用することも可能である。
【００４９】
また、サムネイル像撮像部１０、拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０それぞれに設けられる撮像素子は、１次元撮像素子であってもよく、２次元撮像素子であってもよい。
【００５０】
なお、拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０については、以下で改めて詳細に説明する。
【００５１】
［制御部］
本実施形態に係る顕微鏡１には、図１に示したように、顕微鏡の様々な部位を制御するための制御部が接続されている。具体的には、本実施形態に係る顕微鏡１には、光源１１及び光源２１を含む、顕微鏡１が備える各種の光源を制御するための照明制御部５１が接続されており、ステージ駆動機構４１には、ステージ駆動機構４１を制御するステージ駆動制御部５２が接続されている。また、コンデンサレンズ２２には、コンデンサレンズ２２の位置制御を行うコンデンサレンズ駆動制御部５３が接続されている。更に、位相差像を撮像するための撮像素子３４には、位相差像撮像制御部５４が接続されており、サムネイル像を撮像するための撮像素子１３には、サムネイル像撮像制御部５５が接続されている。また、生体サンプルＳＰＬの拡大像を撮像するための撮像素子２４には、拡大像撮像制御部５６が接続されている。これらの制御部は、各種のデータ通信路を介して制御を行う部位に対して接続されている。
【００５２】
また、本実施形態に係る顕微鏡１には、顕微鏡全体の制御を行う制御部（以下、統括制御部５０と称する。）が別途設けられており、上述の各種の制御部に、各種のデータ通信路を介して接続されている。
【００５３】
これらの制御部は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ストレージ装置、通信装置及び演算回路等により実現されるものである。
【００５４】
以下では、上記制御部について、その機能を簡単に説明するものとする。
【００５５】
○照明制御部
照明制御部５１は、本実施形態に係る顕微鏡１が備える各種の光源を制御する処理部である。照明制御部５１は、統括制御部５０から生体サンプルＳＰＬの照明方法を示す情報が出力されると、取得した照明方法を示す情報に基づいて、対応する光源の照射制御を行う。
【００５６】
例えば、照明制御部５１が、サムネイル像撮像部１０に設けられた光源１１の制御を行う場合について着目する。かかる場合、照明制御部５１は、照明方法を示す情報を参照して、明視野像を取得すべきモード（以下、明視野モードとも称する。）又は暗視野像を取得すべきモード（以下、暗視野モードとも称する。）のどちらを実行するかを判断する。その後、照明制御部５１は、各モードに応じたパラメータを光源１１に対して設定し、光源１１から、各モードに適した照明光を照射させる。これにより、光源１１から照射された照明光が、ステージ４０の開口部を介して、生体サンプルＳＰＬ全体に照射されることとなる。なお、照明制御部５１が設定するパラメータとしては、例えば、照明光の強度や光源種類の選択等を挙げることができる。
【００５７】
また、照明制御部５１が、拡大像撮像部２０に設けられた光源２１の制御を行う場合について着目する。かかる場合、照明制御部５１は、照明方法を示す情報を参照して、明視野モード又は暗視野モードのどちらを実行するかを判断する。その後、照明制御部５１は、各モードに応じたパラメータを光源２１に対して設定し、光源２１から、各モードに適した照明光を照射させる。これにより、光源２１から照射された照明光が、ステージ４０の開口部を介して、生体サンプルＳＰＬ全体に照射されることとなる。なお、照明制御部５１が設定するパラメータとしては、例えば、照明光の強度や光源種類の選択等を挙げることができる。
【００５８】
なお、明視野モードにおける照射光は、可視光とすることが好ましい。また、暗視野モードにおける照射光は、特殊染色で用いられる蛍光マーカを励起可能な波長を含む光とすることが好ましい。また、暗視野モードでは、蛍光マーカに対する背景部分はカットアウトされることとなる。
【００５９】
○ステージ駆動制御部
ステージ駆動制御部５２は、本実施形態に係る顕微鏡１に設けられたステージを駆動するためのステージ駆動機構４１を制御する処理部である。ステージ駆動制御部５２は、統括制御部５０から生体サンプルＳＰＬの撮像方法を示す情報が出力されると、取得した撮像方法を示す情報に基づいて、ステージ駆動機構４１の制御を行う。
【００６０】
例えば、本実施形態に係る顕微鏡１により、サムネイル像を撮像する場合に着目する。ステージ駆動制御部５２は、統括制御部５０から、生体サンプルＳＰＬのサムネイル像を撮像する旨の情報が出力されると、プレパラートＰＲＴ全体が撮像素子１３の撮像範囲に入るように、ステージ面方向（Ｘ―Ｙ軸方向）にステージ４０を移動させる。また、ステージ駆動制御部５２は、プレパラートＰＲＴ全体に対物レンズ１２の焦点が合うように、ステージ４０をＺ軸方向に移動させる。
【００６１】
また、本実施形態に係る顕微鏡１により、拡大像を撮像する場合について着目する。ステージ駆動制御部５２は、統括制御部５０から、生体サンプルＳＰＬの拡大像を撮像する旨の情報が出力されると、ステージ駆動制御部５２は、ステージ駆動機構４１を駆動制御し、光源１１と対物レンズ１２との間からコンデンサレンズ２２と対物レンズ２３との間に生体サンプルＳＰＬが位置するよう、ステージ面方向にステージ４０を移動させる。
【００６２】
また、ステージ駆動制御部５２は、撮像素子２４に撮像される撮像範囲に生体サンプルの所定の部位が位置するように、ステージ面方向（Ｘ−Ｙ軸方向）にステージ４０を移動させる。
【００６３】
更に、ステージ駆動制御部５２は、ステージ駆動機構４１を駆動制御して、所定の撮影範囲内に位置する生体サンプルＳＰＬの部位が対物レンズ２３の焦点に合うように、ステージ面に直交する方向（Ｚ軸方向、組織切片の奥行方向）にステージ４０を移動させる。
【００６４】
○コンデンサレンズ駆動制御部
コンデンサレンズ駆動制御部５３は、本実施形態に係る顕微鏡１の拡大像撮像部２０に設けられたコンデンサレンズ２２を駆動するためのコンデンサレンズ駆動機構４２を制御する処理部である。コンデンサレンズ駆動制御部５３は、統括制御部５０から、照明視野絞りのデフォーカス量に関する情報が出力されると、取得したデフォーカス量に関する情報に基づいて、コンデンサレンズ駆動機構４２の制御を行う。
【００６５】
後述するように、拡大像撮像部２０内に設けられた照明視野絞りが適切に合焦していない場合には、生成される拡大像のコントラストが低下してしまう。かかるコントラストの低下を防止するために、本実施形態に係る顕微鏡１では、後述する統括制御部５０において、デフォーカス量検出部３０により生成される位相差像に基づく照明視野絞りのデフォーカス量の特定処理が行われる。統括制御部５０は、特定した照明視野絞りのデフォーカス量を表す情報をコンデンサレンズ駆動制御部５３に出力して、照明視野絞りが合焦するようにコンデンサレンズ２２の位置を変更させる。
【００６６】
コンデンサレンズ駆動制御部５３は、コンデンサレンズ駆動機構４２の駆動制御を行って、照明視野絞りが合焦するように、コンデンサレンズ２２の位置（光軸ＥＲＡ上の位置）を修正する。
【００６７】
○位相差像撮像制御部
位相差像撮像制御部５４は、デフォーカス量検出部３０に設けられた撮像素子３４の制御を行う処理部である。位相差像撮像制御部５４は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを、撮像素子３４に設定する。また、位相差像撮像制御部５４は、撮像素子３４から出力される、撮像素子３４の結像面に結像した像に対応する出力信号を取得すると、取得した出力信号を、位相差像に対応する出力信号とする。位相差像撮像制御部５４は、位相差像に対応する出力信号を取得すると、取得した信号に対応するデータを統括制御部５０に出力する。なお、位相差像撮像制御部５４が設定するパラメータとして、例えば、露光の開始タイミング及び終了タイミング（換言すれば、露光時間）等を挙げることができる。
【００６８】
○サムネイル像撮像制御部
サムネイル像撮像制御部５５は、サムネイル像撮像部１０に設けられた撮像素子１３の制御を行う処理部である。サムネイル像撮像制御部５５は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを、撮像素子１３に設定する。また、サムネイル像撮像制御部５５は、撮像素子１３から出力される、撮像素子１３の結像面に結像した像に対応する出力信号を取得すると、取得した出力信号を、サムネイル像に対応する出力信号とする。サムネイル像撮像制御部５５は、サムネイル像に対応する出力信号を取得すると、取得した信号に対応するデータを統括制御部５０に出力する。なお、サムネイル像撮像制御部５５が設定するパラメータとして、例えば、露光の開始タイミング及び終了タイミング等を挙げることができる。
【００６９】
○拡大像撮像制御部
拡大像撮像制御部５６は、拡大像撮像部２０に設けられた撮像素子２４の制御を行う処理部である。拡大像撮像制御部５６は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを、撮像素子２４に設定する。また、拡大像撮像制御部５６は、撮像素子２４から出力される、撮像素子２４の結像面に結像した像に対応する出力信号を取得すると、取得した出力信号を、拡大像に対応する出力信号とする。拡大像撮像制御部５６は、拡大像に対応する出力信号を取得すると、取得した信号に対応するデータを統括制御部５０に出力する。なお、拡大像撮像制御部５６が設定するパラメータとして、例えば、露光の開始タイミング及び終了タイミング等を挙げることができる。
【００７０】
○統括制御部
統括制御部５０は、上述の各種制御部を含む顕微鏡全体の制御を行う処理部である。以下では、図２を参照しながら、本実施形態に係る統括制御部５０の構成について、詳細に説明する。図２は、本実施形態に係る統括制御部５０の構成を示したブロック図である。
【００７１】
統括制御部５０は、図２に示したように、サムネイル像取得部５０１、位相差像取得部５０３、拡大像取得部５０５、特徴量算出部５０７、エッジ位置検出部５０９、厚み変化量算出部５１１、明度補正部５１３、通信部５１５及び記憶部５１７を主に備える。
【００７２】
サムネイル像取得部５０１は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。顕微鏡１に対して所定のユーザ操作がなされた場合や、ステージ４０にプレパラートＰＲＴが載置された場合等に、サムネイル像取得部５０１は、サムネイル像撮像制御部５５に対して、各種設定条件とともにサムネイル像を撮像するように要請する。
【００７３】
また、サムネイル像取得部５０１は、サムネイル像撮像制御部５５から出力される、サムネイル像に対応するデータ（以下、サムネイル像データとも称する。）を取得する。サムネイル像取得部５０１は、取得したサムネイル像データを、後述する記憶部５１７に格納してもよい。また、サムネイル像取得部５０１は、取得したサムネイル像データを、後述する通信部５１５を介して、外部に設けられた画像データ格納サーバ等に出力してもよい。
【００７４】
位相差像取得部５０３は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。位相差像取得部５０３は、所定のタイミングにおいて、位相差像撮像制御部５４に対して、各種設定条件とともに位相差像を撮像するように要請する。ここで、位相差像の撮像を要請するタイミングとしては、例えば、照明視野絞りのピント調整を実施するようユーザ操作等により要請された場合、前回照明視野絞りのピント調整を実施してから所定の期間が経過した場合、拡大像の撮像を開始する場合、その他予め決定されたタイミングが到達した場合等がある。
【００７５】
また、位相差像取得部５０３は、位相差像撮像制御部５４から出力される、位相差像に対応するデータ（以下、位相差像データとも称する。）を取得する。位相差像取得部５０３は、取得した位相差像データを、後述する特徴量算出部５０７に出力する。また、位相差像取得部５０３は、取得した位相差像データを、後述する記憶部５１７に格納してもよい。
【００７６】
拡大像取得部５０５は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。顕微鏡１に対して所定のユーザ操作がなされた場合や、あるプレパラートＰＲＴのサムネイル像の撮像が終了した場合等に、拡大像取得部５０５は、拡大像撮像制御部５６に対して、各種設定条件とともに拡大像を撮像するように要請する。
【００７７】
また、拡大像取得部５０５は、拡大像撮像制御部５６から出力される、拡大像に対応するデータ（以下、拡大像データとも称する。）を取得する。拡大像取得部５０５は、取得した拡大像データを、後述する記憶部５１７に格納してもよい。また、拡大像取得部５０５は、取得した拡大像データを、後述する通信部５１５を介して、外部に設けられた画像データ格納サーバ等に出力してもよい。
【００７８】
特徴量算出部５０７は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。特徴量算出部５０７は、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データに基づいて、拡大像撮像部２０内に設けられた照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する。特徴量算出部５０７が算出する特徴量及び特徴量の算出方法については、以下で改めて詳細に説明する。特徴量算出部５０７は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出すると、算出した特徴量を、コンデンサレンズ駆動制御部５３に出力する。コンデンサレンズ駆動制御部５３は、出力された特徴量に応じてコンデンサレンズ駆動機構４２を駆動することで、照明視野絞りのピンボケを解消する。
【００７９】
なお、特徴量算出部５０７は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する際に、照明制御部５１に対して照明光の光量に関する要請をしたり、ステージ駆動制御部５２に対してサンプルの合焦度合いに関する要請をしたりすることが可能である。
【００８０】
また、以下で説明するように、特徴量の算出方法には各種の方法があるが、特徴量算出部５０７は、後述するエッジ位置検出部５０９と連携しながら、特徴量を算出することも可能である。
【００８１】
なお、特徴量算出部５０７が算出する特徴量や、特徴量の算出の途中経過で得られる各種数値は、厚み変化量算出部５１１や明度補正部５１３が、それぞれの処理部で実施する処理に利用される。
【００８２】
エッジ位置検出部５０９は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。エッジ位置検出部５０９は、特徴量算出部５０７や、後述する厚み変化量算出部５１１等から、位相差像取得部５０３が取得した位相差像のエッジ検出を要請された場合に、位相差像のエッジ位置を検出する。エッジ位置検出部５０９がエッジ位置の検出に利用する方法は、特に限定されるわけではなく、公知の方法を利用することが可能である。また、本実施形態に係るエッジ位置検出部５０９が行うエッジ位置検出処理の一例については、以下で改めて詳細に説明する。
【００８３】
本実施形態に係る位相差像は、後述するように、拡大像撮像部２０内に設けられた照明視野絞りの形状に関する像となっている。エッジ位置検出部５０９は、例えば以下で説明するようなエッジ位置検出処理を行うことで、照明視野絞りの形状（換言すれば、照明視野絞りによって遮られた視野の形状）におけるエッジ位置を検出する。ここで、エッジ位置検出部５０９によって検出されるエッジ位置は、例えば、撮像素子３４における画素の座標として表される。
【００８４】
エッジ位置検出部５０９は、検出したエッジ位置に関する情報を、エッジ位置検出処理の要請のあった処理部（例えば、特徴量算出部５０７や厚み変化量算出部５１１）に出力する。
【００８５】
なお、エッジ位置検出部５０９は、平面画像（すなわち、２次元画像）から１次元のみを抽出してエッジ位置の検出を行ってもよく、２次元画像そのものに対してエッジ位置検出を行ってもよい。
【００８６】
厚み変化量算出部５１１は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。前述のように、プレパラートＰＲＴは、厚み方向にばらつきを持ったカバーガラス及びスライドガラスを用いて作製される。カバーガラス及びスライドガラスの厚みのばらつき度合いを考慮すると、カバーガラスの厚みの変化よりも、スライドガラスの厚みの変化の方が、得られる拡大像のコントラスト変化に大きな影響を与える要因となる。そこで、厚み変化量算出部５１１は、生体サンプルＳＰＬが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データを利用して算出する。
【００８７】
なお、スライドガラスの厚み変化量を算出する際に利用するデータや、算出に利用される数値は、特徴量算出部５０７が特徴量を算出する際に利用したり途中経過として算出されたりするものと重複しているものがある。そこで、厚み変化量算出部５１１は、特徴量算出部５０７と連携しながら、効率よく厚み変化量の算出を行うようにしてもよい。
【００８８】
厚み変化量算出部５１１が実施する厚み変化量の算出方法の詳細については、以下で改めて詳細に説明する。
【００８９】
明度補正部５１３は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等により実現される。明度補正部５１３は、拡大像撮像部２０に設けられた撮像素子２４から出力された拡大像の明度を補正する。明度補正部５１３は、明度補正を行うに当たって、後述する記憶部５１７等に格納されている、厚み変化量と明度補正パターンとが互いに関連付けられたデータベースを参照する。明度補正部５１３は、厚み変化量算出部５１１が算出した厚み変化量に基づいて、かかるデータベースの検索を行い、算出された厚み変化量に適した明度補正パターンを選択する。その後、明度補正部５１３は、選択した明度補正パターンを利用して、拡大像の明度補正処理を実施する。
【００９０】
また、明度補正部５１３は、上記明度補正パターンを利用する方法以外にも、照明視野絞りが合焦するように、光源２１の後段に位置する光学素子（例えば、コンデンサレンズ２２）の位置を制御してもよい。かかる場合には、明度補正部５１３は、照明視野絞りが合焦するようにコンデンサレンズ２２を駆動するよう、コンデンサレンズ駆動制御部５３にコンデンサレンズの駆動制御処理を要請する。
【００９１】
通信部５１５は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、通信装置等により実現される。通信部５１５は、本実施形態に係る顕微鏡１（より詳細には、統括制御部５０）と、顕微鏡１の外部に設けられた各種の情報処理装置との間で実施される通信を制御する。かかる通信部５１５により、本実施形態に係る顕微鏡１は、インターネット等の公共のネットワークやローカルエリアネットワーク等のプライベートネットワークに接続されている各種の情報処理装置（例えば、生体サンプルの顕微鏡画像が格納される画像データ格納サーバ等）と相互に通信を行うことが可能となる。
【００９２】
記憶部５１７は、本実施形態に係る統括制御部５０が備えるストレージ装置の一例である。この記憶部５１７には、本実施形態に係る顕微鏡１の各種の設計パラメータや、明度補正パターンに関するデータベース等が格納されている。また、記憶部５１７には、各種の撮像データや履歴情報等が記録されていてもよい。さらに、記憶部５１７には、本実施形態に係る統括制御部５０が何らかの処理を行う際に保存する必要が生じた様々なパラメータや処理の途中経過等、または、各種のデータベースやプログラム等が、適宜記録される。
【００９３】
この記憶部５１７は、統括制御部５０が備える各処理部が自由に読み書きを行うことが可能である。
【００９４】
以上、本実施形態に係る統括制御部５０の機能の一例を示した。上記の各構成要素は、汎用的な部材や回路を用いて構成されていてもよいし、各構成要素の機能に特化したハードウェアにより構成されていてもよい。また、各構成要素の機能を、ＣＰＵ等が全て行ってもよい。従って、本実施形態を実施する時々の技術レベルに応じて、適宜、利用する構成を変更することが可能である。
【００９５】
なお、上述のような本実施形態に係る統括制御部やその他の制御部の各機能を実現するためのコンピュータプログラムを作製し、パーソナルコンピュータ等に実装することが可能である。また、このようなコンピュータプログラムが格納された、コンピュータで読み取り可能な記録媒体も提供することができる。記録媒体は、例えば、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリなどである。また、上記のコンピュータプログラムは、記録媒体を用いずに、例えばネットワークを介して配信してもよい。
【００９６】
以上、図１及び図２を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡１の全体的な構成について、詳細に説明した。
【００９７】
なお、前述の説明では、デフォーカス量検出部３０内の位相差ＡＦ光学系としてコンデンサレンズ、２眼レンズ及び撮像素子を有する構成を示した。しかしながら、かかる例に限定されるわけではなく、例えば２眼レンズを１枚のレンズとして、エッジ検出を行いスライドガラスの厚み変化量を検出する等、同等の機能を実現可能なものであれば、他の光学系であってもよい。
【００９８】
また、本実施形態に係る顕微鏡１で用いられる透過照明光学系は、ケーラー照明であってもよく、他の照明光学系であってもよい。
【００９９】
更に、前述の例では、ビームスプリッター３１にて反射した光が進行する方向にデフォーカス量検出部３０が設置される場合について示したが、ビームスプリッター３１を透過した光が進行する方向にデフォーカス量検出部３０を設置してもよい。
【０１００】
＜照明視野絞りのピント調整処理について＞
続いて、図３〜図９を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡１で実施される照明視野絞りのピント調整処理について、詳細に説明する。
【０１０１】
[拡大像撮像部及び位相差ＡＦ光学部の構成の一例について]
まず、図３を参照しながら、本実施形態に係る拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０の構成の一例について説明する。図３は、本実施形態に係る顕微鏡（より詳細には、拡大像撮像部２０及びデフォーカス量検出部３０）の光学系を概略的に示した説明図である。
【０１０２】
本実施形態に係る拡大像撮像部２０は、図３に示したように、ステージ４０（より詳細には、プレパラートＰＲＴ）の前段に位置し、プレパラートＰＲＴに照明光を投影する照明光学系と、プレパラートＰＲＴの後段に位置する結像光学系２１１と、からなる。また、照明光学系は、照明視野絞り２０５の前段（光源２１側）に位置する透過照明前段光学系２０１と、照明視野絞り２０５の後段に位置する透過照明後段光学系２０３と、からなる。また、結像光学系２１１の内部には、ビームスプリッター３１が設けられており、ビームスプリッター３１により分岐された光束は、デフォーカス量検出部３０へと導かれる。このデフォーカス量検出部３０は、位相差オートフォーカス（ＡＦ）光学系３０１からなる。
【０１０３】
なお、以下の説明では、第１の結像光学系の一例である結像光学系２１１の倍率をＭＩと表すこととし、第２の結像光学系の一例である位相差ＡＦ光学系３０１の倍率をＭＡと表すこととする。
【０１０４】
光源２１から照射された光線（照明光）は、図示されていない固定機構にて機械的に固定された透過照明前段光学系２０１を透過する。その後、透過照明前段光学系２０１を透過した光線は、透過正面後段光学系２０３内の照明視野絞り２０５へと入射する。ここで照明視野絞り２０５のエッジ（照明視野絞りの絞り形状のエッジ）の結像を考えるため、照明視野絞り２０５のエッジからの回折光束Ａを考える。
【０１０５】
光束Ａは、透過照明後段光学系２０３内のコンデンサレンズ２０７，２０９を透過し、ステージ４０上に保持された屈折率ｎのスライドガラスＡ表面上の試料面へと結像される。結像面にて結像された光束Ａは、結像光学系２１１に入射した光束Ａは、コンデンサレンズ（対物レンズ）２１３及びコンデンサレンズ２１５を透過し、拡大像撮像部２０の撮像素子２４の撮像面２１７に結像する。これにより、ユーザは、照明視野絞り２０５及び試料面が撮像素子２４で共に結像した状態で、これらの像Ａを観察することができる。
【０１０６】
また、光束Ａの一部は、結像光学系２１１内に位置するビームスプリッター（以下、ＢＳと略記する。）によって反射され、分岐された光束Ａの一部（以下、光束Ｂとも称する。）は、位相差ＡＦ光学系３０１に入射する。光束Ｂは、相差ＡＦ光学系３０１内に設けられたコンデンサレンズ３２を透過した後、２眼レンズ３３へと導かれる。これら２眼レンズ３３により導かれた光束Ｂは、デフォーカス量検出部３０内の撮像素子３４の撮像面３０５で結像し、２つの視野絞り像Ｂ，Ｃ（すなわち、位相差像）が生成されることとなる。これにより、ユーザは、１組の位相差像である視野絞り像Ｂ，Ｃを観察することができる。
【０１０７】
[厚みが異なるスライドガラスが載置された場合について]
次に、図４〜図６を参照しながら、スライドガラスＡと厚みがΔｔ異なる屈折率ｎのスライドガラスＢを、図３に示した光学系に設置した場合について考える。図４は、本実施形態に係る顕微鏡の光学系を概略的に示した説明図である。図５Ａ及び図５Ｂは、スライドガラスの厚みと照明視野絞りの結像位置との関係を示した説明図である。図６は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【０１０８】
照明視野絞り２０５からの光束Ａ’は、透過照明後段光学系２０３内のコンデンサレンズ２０７，２０９を透過して、スライドガラスＢへと入射する。ここで、ステージ４０が図３と同様の位置に設置された場合を考えると、スライドガラスの厚みがΔｔ増加したことで、照明視野絞り２０５はスライドガラスＢ内に結像された状態となる。
【０１０９】
図５Ａに示したように、図３に示した状態における結像光学系２１１から試料面までの距離をｄ１とし、スライドガラス厚をｔとし、透過照明後段光学系２０３からスライドガラスまでの距離をｄ２とする。かかる場合において、スライドガラスの厚みがｔから（ｔ＋Δｔ）に変化すると、結像光学系２１１から試料面までの距離と、透過照明後段光学系２０３からスライドガラスまでの距離は、それぞれｄ１−Δｔ、ｄ２となる。
【０１１０】
また、図３及び図５Ａに示した光学系において、結像光学系２１１から試料面までの間の空間は空気で満たされており、結像光学系２１１からスライドガラスまでの光学距離は、（空気の屈折率＝１）×（結像光学系２１１から試料面までの距離）＝ｄ１となる。
【０１１１】
他方、図４及び図５Ｂに示した光学系では、屈折率ｎの空間（すなわち、スライドガラス内の空間）をΔｔだけ進むこととなるため、結像光学系２１１からスライドガラスまでの光学距離は、１×（ｄ１−Δｔ）＋ｎ×Δｔ＝ｄ１＋（ｎ−１）Δｔとなる。
【０１１２】
ここで、図６から明らかなように、スネル（Ｓｎｅｌｌ）の法則より、以下の式１０１がｓｉｎ（θ）＝ｎ×ｓｉｎ（θ’）が成立する。また、集光点シフト量をＤとすると、図６に示した幾何学的関係から、以下の式１０２が成立することがわかる。Δｔ×ｓｉｎ（θ’）＝（Δｔ−Ｄ）×ｓｉｎ（θ）となる。
【０１１３】
ｓｉｎ（θ）＝ｎ×ｓｉｎ（θ’） ・・・（式１０１）
Δｔ×ｓｉｎ（θ’）＝（Δｔ−Ｄ）×ｓｉｎ（θ） ・・・（式１０２）
【０１１４】
従って、式１０１及び式１０２から、集光点シフト量Ｄは、以下の式１０３のように表されることとなる。
【０１１５】
【数１】
【０１１６】
従って、図５Ｂに示した状態では、集光点シフト量Ｄだけ結像光学系２１１から集光点がずれることとなり、撮像素子２４の撮像面２１７上でのデフォーカス量は、結像光学系２１１の倍率がＭＩであることから、Ｄ×（ＭＩ）２となる。その結果、撮像面２１７上では、照明視野絞り２０５のピントずれが発生した状態となる。
【０１１７】
本実施形態に係る顕微鏡１では、このピントズレ量Ｄ×（ＭＩ）２を検出するために、位相差ＡＦ光学系３０１から得られる情報を利用する。
【０１１８】
［ピントズレ量の検出原理］
ビームスプリッター３１により光束Ａ’から分岐された光束Ｂ’は、光束Ｂと比較してＤ×（ＭＩ）２だけデフォーカスした状態で、位相差ＡＦ光学系３０１へ入射することとなる。位相差ＡＦ光学系３０１は、図３に示したように、コンデンサレンズ３２及び２眼レンズ３３を有しており、以下で詳細に説明するように、デフォーカス量を撮像面３０５の平面方向での移動量Δｘとして検出可能である。
【０１１９】
以下では、図７を参照しながら、ピントズレ量の検出原理について説明する。図７は、照明視野絞りのピントのズレ度合いを示す特徴量を定式化する際のパラメータについて説明するための説明図である。
【０１２０】
図７に示したような、結像面（すなわち、撮像面３０５）近傍に配置されたコンデンサレンズ３２により、複数の像高（ｉｍａｇｅ ｈｅｉｇｈｔ）の光束が２眼レンズ３３へ入射し、２眼レンズ３３により撮像面３０５へ２つの画像が結像する光学系を考える。ここで、図７に示したように、中心軸から各２眼レンズ３３までの平面方向シフト量をａとし、コンデンサレンズ３２から２眼レンズ３３までの距離をｓ１とし、２眼レンズ３３から撮像面３０５までの距離をｓ２とする。
【０１２１】
ここで、撮像面３０５の平面方向の移動量Δｘは、図７における幾何学的関係から、以下の式１０４のように表すことができる。ここで、スライドガラスの厚みの変化量のオーダーと、コンデンサレンズ３２から２眼レンズ３３までの距離のオーダーとを考慮した場合、ｓ１＞＞Ｄ・（ＭＩ）２が成立すると考えられる。すると、以下の式１０４は、倍率ＭＡに関するＭＡ＝（ｓ２／ｓ１）という関係式を用いて、以下の式１０５の左側の等式のように表すことができる。ここで、上記式１０３より集光点シフト量Ｄとスライドガラスの厚みの変化量Δｔとは比例関係にあるため、結局、撮像面３０５の平面方向の移動量Δｘは、スライドガラスの厚みの変化量Δｔと比例関係にあることがわかる。
【０１２２】
【数２】
【０１２３】
よって、照明視野絞りのピンボケ量を表す特徴量である集光点シフト量Ｄは、撮像素子３４での像Ｂ又は像Ｃの平面移動量Δｘで検出することが可能となる。
【０１２４】
［照明視野絞りのピント位置について］
特徴量算出部５０７による集光点シフト量Ｄの算出処理について説明するに先立ち、まず、図８を参照しながら、照明視野絞りの適切な位置について説明する。
【０１２５】
本実施形態に係る位相差ＡＦ光学系３０１では、位相差像として２つの被写体像が撮像素子３４上に結像される。ここで、照明視野絞り２０５とコンデンサレンズとが適切な位置関係にあって、照明が適切にスライドガラスに照射されている場合には、位相差像において、視野領域を表す窓は、２眼レンズ３３の左目に対応する画像と右目に対応する画像とで同じ位置となる。しかし、コンデンサレンズが適切な位置に存在せず、照明位置が適正位置よりも下側（光源２１側）になると、視野領域を表す窓は、撮像素子３４の中央寄り（図７に示したｘ軸方向に沿って撮像素子３４の中央寄り）に移動する。逆に、照明位置が適正位置よりも上側になると、視野領域を表す窓は、撮像素子３４のｘ軸方向に沿った端部方向へと移動する。従って、撮像素子３４に結像する窓の位置関係に着目することで、照明位置を特定することができる。
【０１２６】
ここで、予め照明位置（例えば、照明視野絞りとコンデンサレンズとの間の距離）を様々に変化させながら、位相差像における左右の窓位置の間隔を測定しておき、窓位置の間隔と照明位置との相関関係を把握しておく。この相関関係において、照明位置を適正位置からの差として表すことで、窓位置の間隔から、適正照明位置からの差を算出することが可能となる。
【０１２７】
この際、位相差像における左右の窓位置の間隔は、図８に示したようにして特定することができる。すなわち、撮像素子３４の中央を通過する、撮像素子３４の幅方向に対応する軸をｘ軸とした場合に、ｘ軸上の撮像素子３４の出力信号値（すなわち、輝度値）の分布に着目する。撮像素子３４には、左目に対応する画像と右目に対応する画像の２つの像が結像しているため、図８（ａ）に示したように、左目の画像に対応する輝度値の分布と、右目に対応する輝度値の分布とが検出される。
【０１２８】
まず、左目及び右目に対応する画像の輝度値を移動平均で平滑化し、左右それぞれの輝度の最大値（Ｌｍａｘ及びＲｍａｘ）と最小値（Ｌｍｉｎ及びＲｍｉｎ）とを検出する。その後、左右それぞれの輝度値を、左右独立に正規化する。その結果、図８（ｂ）に示したような輝度分布を得ることができる。この正規化輝度分布において、所定の閾値を超える輝度値となる画素位置を、左目に対応する画像は輝度分布の左側端部から、右目に対応する画像は輝度分布の右側端部から、それぞれ探索していく。ここで、図８（ｂ）に示したように、左目に対応する画像は、座標Ｌｐｏｓにて所定の輝度値となり、右目に対応する画像は、座標Ｒｐｏｓにて所定の輝度値となったとする。この場合、座標ＬｐｏｓとＲｐｏｓとの差を、位相差像における左右の窓位置の間隔とする。
【０１２９】
このようにして窓位置の間隔と照明位置との相関関係を特定しておくことで、実際に計測される窓位置の間隔と、この相関関係とに基づいて、照明位置を特定することが可能となる。また、照明位置とスライドガラスの厚みとの相関関係を予め測定しておくことで、特定した照明位置に基づいて、スライドガラスの厚みｔを算出することも可能である。
【０１３０】
以上のような方法で算出した適正照明位置との差を用いて、適切な照明位置を実現するための照明視野絞りのピント調節を行うことが可能であるが、本実施形態に係る特徴量算出部５０７は、以下のような方法を用いて照明視野絞りのピント調節を実施する。
【０１３１】
［特徴量算出部における特徴量算出処理］
次に、統括制御部５０の特徴量算出部５０７が実施する特徴量の算出処理（すなわち、集光点シフト量Ｄの算出処理）について、具体的に説明する。以下で説明する本実施形態に係る特徴量算出部５０７による特徴量算出処理は、位相差像データに記載されている光強度信号に対して行われる信号処理である。この光強度信号は、撮像素子３４を構成する各画素が検知した光束の強度（すなわち、受光した光の強度）を表すものであり、撮像素子３４を構成する各画素が検知した光の輝度値を表すものであるともいえる。
【０１３２】
上記式１０５に示したように、集光点シフト量Ｄと比例関係にある平面移動量Δｘを検出することで、スライドガラスの厚みの変化量Δｔを検知することが可能である。ここで、厚みｔのスライドガラスに対して照明視野絞り２０５とコンデンサレンズとが適切な位置関係にあり、照明視野絞りの位相差像が合焦点状態にある場合には、左右の位相差像は、左右（ｘ軸方向）に均等に分布していると考えられる。そこで、特徴量算出部５０７は、以下のような信号処理を行うことで、照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量である集光点シフト量Ｄを算出する。
【０１３３】
特徴量算出部５０７は、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データを参照して、位相差像（すなわち、図９における像Ｂ及び像Ｃ）の撮像面３０５での光強度信号を特定する。その後、特徴量算出部５０７は、図９に示したようにデフォーカス時の撮像面での位相差像の移動方向が逆であることを利用して、以下のような値を算出する。
【０１３４】
すなわち、特徴量算出部５０７は、撮像素子３４の各画素ｘｉから得られる像Ｂの信号強度ｆ（ｘｉ）と、像Ｃの信号強度ｇ（ｘｉ）を利用して、以下の式１０６で表される２つの信号強度の差Ａｉを算出する。また、特徴量算出部５０７は、算出した信号強度の差Ａｉを利用して、以下の式１０７で表される値Ａを算出する。
【０１３５】
【数３】
【０１３６】
ここで、照明視野絞り２０５が合焦点状態にある場合には、ｆ（ｘｉ）＝ｇ（ｘｉ）となるため、算出されるＡ＝０となる。しかしながら、スライドガラスの厚みの変化により、合焦点状態からΔｔずれた状態にある場合には、撮像素子３４の画素数をｋ（すなわち、ｉ＝１，・・・，ｋ）とすると、値Ａは、以下の式１０８のように表される。
【０１３７】
【数４】
【０１３８】
ここで、上記式１０８におけるｋ，ａ，ｓ１，ＭＡ及びＭＩは、本実施形態に係る顕微鏡１に固有の値（設計値）であるため、特徴量算出部５０７は、算出した値Ａに基づいて、集光点シフト量Ｄを算出することができる。
【０１３９】
なお、以上のような特徴量算出部５０７による特徴量の算出処理は、ステージ４０上に載置された生体サンプルにピントが合っている状態にて行っても良いが、生体サンプルにピントが合っていない状態にて行うことが好ましい。換言すれば、特徴量算出部５０７による特徴量の算出処理は、生体サンプルの透過光が、結像光学系２１１内に設けられた撮像素子２４上に合焦していない状態で行われることが好ましい。生体サンプルにピントが合っている状態では、像Ｂ及び像Ｃに対応する出力信号に、生体サンプルに対応する信号が含まれることとなり、算出される特徴量の誤差要因となる可能性があるからである。
【０１４０】
算出される特徴量に含まれる誤差を低減するために、統括制御部５０は、照明光の強度を、撮像素子３４上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整してもよい。また、照明視野絞りの枠が撮像素子３４に結像した際に、かかる照明視野絞りの枠が撮像素子３４の枠内に収まるようになっていることが好ましい。換言すれば、照明視野絞りの枠（照明視野絞りの形状）での光束が、光学系内に存在する各種の絞りによりケラれることなく、撮像素子３４に結像することが好ましい。これにより、特徴量算出部５０７は、より正確に特徴量を算出することが可能となる。
【０１４１】
本実施形態に係る統括制御部５０は、特徴量算出部５０７が算出した特徴量（すなわち、集光点シフト量Ｄ）に基づいて、照明視野絞りのピント調整を実施する。
透過照明後段光学系２０３内に位置するコンデンサレンズ２０９の倍率が０である場合、コンデンサレンズシフト量ΔＺ＝コンデンサレンズＡの集光点シフト量となる。そのため、特徴量算出部５０７は、算出した集光点シフト量Ｄを表す情報を、コンデンサレンズ駆動制御部５３に出力する。コンデンサレンズ駆動制御部５３は、取得した集光点シフト量Ｄに応じてコンデンサレンズ駆動機構４２の駆動制御を行い、コンデンサレンズ２０９をレンズの光軸方向に駆動する。これにより、照明視野絞り２０５を撮像素子の撮像面上へ結像させることが可能となる。
【０１４２】
なお、透過照明後段光学系２０３内に位置するコンデンサレンズ２０９の倍率は、任意の値とすることができる。なお、コンデンサレンズ２０９の倍率が０以外である場合には、集光点シフト量Ｄとレンズシフト量ΔＺとの関係がレンズ固有の関係で決定される。そのため、集光点シフト量Ｄとレンズシフト量ΔＺとの相関関数を予め統括制御部５０（例えば、記憶部５１７等）に格納しておき、特徴量算出部５０７は、格納されている相関関数を用いて、集光点シフト量Ｄに基づいてレンズシフト量ΔＺを決定する。特徴量算出部５０７は、算出したレンズシフト量ΔＺをコンデンサレンズ駆動制御部５３に出力することで、照明視野絞りのピント調整を実施することができる。
【０１４３】
かかる処理を行うことで、透過照明後段光学系２０３内の任意のレンズにとりつけられたコンデンサレンズ駆動機構４２により、スライドガラスの厚みズレΔｔに起因する照明視野絞りのピントズレを、自動的に補正することが可能となる。かかる処理をスライドガラスを交換するたびに行うことで、本実施形態に係る顕微鏡１は、観察スライドガラスの厚みによらず照明視野絞りのピントを合わせることが可能となる。
【０１４４】
このように、本実施形態に係る特徴量算出部５０７では、位相差ＡＦ光学系３０１により得られた位相差像の出力信号と、顕微鏡１に固有の値（設計パラメータ等）とを用いて演算を行うことで、照明視野絞りのピントズレ量を算出する。照明視野絞りピント調整部の一例であるコンデンサレンズ駆動制御部５３は、特徴量算出部５０７から出力されたピントズレ量に応じてコンデンサレンズ駆動機構４２を制御し、照明視野絞りのピントを調整する。
【０１４５】
かかる照明視野絞りのピント調整処理により、本実施形態に係る顕微鏡１では、照明視野絞りのピント調整を自動化することができ、従来目視にて調整されていた内容を、定量的に実施することが可能となる。また、位相差ＡＦ光学系にて照明視野絞りのピント調整が可能となるため、同一の顕微鏡を用いて、従来の位相差ＡＦを試料面にて実施することが可能となる。
【０１４６】
＜ステージ位置の調整処理について＞
顕微鏡において複数の試料を観察する際、その試料は厚さ方向にばらつきをもったカバーガラスおよびスライドガラスにて作製される。薄い試料を観察する際、スライドガラスの厚みは１．１ｍｍ程度と、カバーガラス厚や試料厚と比較して１桁以上厚く、また厚みも数百μｍ程度ばらつくことがある。そのため、従来の顕微鏡のようにスライドガラス駆動ステージの上面にスライドガラスを保持し、スライドガラス上方に配置された顕微鏡光学系にて試料を観察した場合、スライドガラスの厚み変化量に応じて試料面から顕微鏡光学系までの距離が変化する。その結果、試料面を観察した画像が、デフォーカスによりボケてしまうという問題があった。
【０１４７】
そこで、本実施形態に係る統括制御部５０の厚み変化量算出部５１１は、生体サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データに基づいて算出し、算出結果に応じてステージ位置の調整を行う。
【０１４８】
上記式１０３を式１０５に代入することで、以下の式１２１を得ることができる。従って、撮像素子３４での位相差像Ｂ又はＣの平行移動量Δｘに基づいて、スライドガラスの厚み変化量Δｔを算出することができる。
【０１４９】
【数５】
【０１５０】
[厚み変化量Δｔの算出方法−その１]
厚み変化量算出部５１１は、例えば以下のようにして、スライドガラスの厚み変化量Δｔを算出することが可能である。
厚み変化量算出部５１１は、上記式１０６及び式１０７に基づいて、位相差像における光強度信号の差の合計Ａを算出する。なお、この値Ａは、特徴量算出部５０７が算出する値Ａと同一のものであるため、厚み変化量算出部５１１は、独自にこの値を算出してもよく、特徴量算出部５０７が算出した値Ａを取得して、厚み変化量の算出処理に利用してもよい。
【０１５１】
ここで、スライドガラスの厚みの変化により、合焦点状態からΔｔずれた状態にある場合には、撮像素子３４の画素数をｋ（すなわち、ｉ＝１，・・・，ｋ）とすると、値Ａは、以下の式１２２のように表される。
【０１５２】
【数６】
【０１５３】
ここで、上記式１２２におけるｋ，ａ，ｓ１，ＭＡ及びＭＩは、本実施形態に係る顕微鏡１に固有の値（設計値）であるため、厚み変化量算出部５１１は、スライドガラスの屈折率ｎと、算出した値Ａとに基づいて、厚み変化量Δｔを算出することができる。
【０１５４】
[厚み変化量Δｔの算出方法−その２]
また、厚み変化量算出部５１１は、例えば以下のようにして、スライドガラスの厚み変化量Δｔを算出してもよい。なお、以下で説明する処理では、合焦点状態における位相差像Ｂ及び位相差像Ｃの少なくともいずれか一方のエッジ位置を表す情報（例えば、エッジ位置の座標等）が、記憶部５１７等に格納されているものとする。
【０１５５】
厚み変化量算出部５１１は、位相差像取得部５０３が取得した位相差像データについて、エッジ位置検出部５０９に対して、エッジ位置の検出処理を要請する。エッジ位置検出部５０９は、像Ｂ及び像Ｃの少なくともいずれか一方について、そのエッジ位置を検出する処理を実施し、対応する画像のエッジ位置を表すＸ座標ｘｉを検出する。このエッジ位置は、着目した像のＸ軸方向に沿った一方の端部を表す位置である。エッジ位置検出部５０９は、検出されたエッジ位置に関する情報を、厚み変化量算出部５１１に出力する。
【０１５６】
厚み変化量算出部５１１は、エッジ位置検出部５０９から出力されたエッジ位置座標ｘｉと、合焦時のエッジのＸ座標（以下、Ｘと表記する。）とを利用して、エッジ位置の相対Ｘ座標であるｘｉ−Ｘを算出する。
【０１５７】
ここで、算出されるエッジ位置の相対Ｘ座標ｘｉ−Ｘは、以下の式１２３のように表すことができる。
【０１５８】
【数７】
【０１５９】
ここで、上記式１２３におけるａ，ｓ１，ＭＩは、本実施形態に係る顕微鏡１に固有の値（設計値）であるため、厚み変化量算出部５１１は、スライドガラスの屈折率ｎと、算出したエッジ位置の相対Ｘ座標とに基づいて、厚み変化量Δｔを算出することができる。なお、本方法は、照明視野絞りのエッジ位置に基づいて、スライドガラスの厚み変化量を算出する方法であるため、照明視野絞り２０５のエッジが撮像素子３４にて検出されるように、位相差ＡＦ光学系３０１の倍率ＭＩを設定することが望ましい。以上説明したような本方式では、照明光のシェーディングの影響を避けることが可能となる。
【０１６０】
なお、以上のような厚み変化量算出部５１１による厚み変化量の算出処理は、ステージ４０上に載置された生体サンプルにピントが合っている状態にて行ってもよいし、生体サンプルにピントが合っていない状態にて行ってもよい。
【０１６１】
本実施形態に係る統括制御部５０は、厚み変化量算出部５１１が算出した厚み変化量Δｔに基づいて、ステージ位置の調整を実施する。
図３等に示したように、スライドガラスの取り付け面がステージ４０の結像光学系２１１側である場合、試料面のデフォーカス量は、スライドガラスの厚み変化量Δｔと同一である。従って、厚み変化量算出部５１１は、算出した厚み変化量Δｔを表す情報を、ステージ駆動制御部５２に出力する。ステージ駆動制御部５２は、取得した厚み変化量Δｔに応じてステージ駆動機構４１の駆動制御を行い、ステージ４０をΔｔだけ結像光学系２１１側へと移動させる。これにより、本実施形態に係る顕微鏡１では、スライドガラスの厚み変化に起因して生じた試料面のピントズレを補正することが可能となる。
【０１６２】
そのため、厚み変化量算出部５１１は、合焦点状態（例えば、図３に示した状態）での撮像面３０５のエッジ位置座標及びステージの位置を表す位置座標を保持しておき、厚み変化量を算出する際の基準値とする。その上で、図４に示したように、厚みの異なるスライドガラスを用いた試料がステージ４０上に設置されると、格納されている基準値と、観察された撮像面３０５でのエッジ位置座標に基づいて、エッジ位置座標の変化量を算出する。統括制御部５０は、算出した厚み変化量Δｔに応じてステージを駆動することで、試料面を撮像素子２４に結像した状態で観察することが可能となる。
【０１６３】
なお、前述の説明では、厚み変化量算出部５１１は、像Ｂ又は像Ｃにおいて、照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、厚み変化量を算出する場合について説明したが、かかる場合に限定されるわけではない。厚み変化量算出部５１１は、像Ｂ及び像Ｃそれぞれにおいて、照明視野絞りのある一方の側のエッジ位置座標に基づいて、厚み変化量Δｔを算出してもよい。また、厚み変化量算出部５１１は、像Ｂ及び像Ｃそれぞれにおいて、照明視野絞りの形状の両側のエッジ位置の和に基づいて、厚み変化量Δｔを算出してもよい。このようにすることで、厚み変化量算出部５１１は、結像面ずれによる誤差の発生や、ディストーション（歪曲収差）による誤差の発生を、除去することが可能となる。
【０１６４】
このように、本実施形態に係る厚み変化量算出部５１１では、位相差ＡＦ光学系３０１により得られた位相差像の出力信号と、顕微鏡１に固有の値（設計パラメータ等）とを用いて演算を行うことで、スライドガラス厚やスライドガラスの厚み変化量を算出できる。また、本実施形態に係る統括制御部５０は、算出したスライドガラスの厚み変化量に応じてステージ位置を駆動させることで、厚み方向の変化量が最も大きなスライドガラス厚の変化分をキャンセルし、試料を正確に観察することが可能となる。
【０１６５】
また、かかる厚み変化量を算出することで、試料面の位置（生体サンプルの光軸方向に沿った位置）によらず、スライドガラスの厚み変化量をもとに、試料面のピント調整が可能となる。そのため、スライドガラスの厚み変化に起因して大きなデフォーカスが発生し、試料面がほぼなんら信号を有さない状態となったとしても、試料面のピント調整を行うことが可能となる。このように、本方式によれば、試料面からの情報を用いずに、試料面のピント調整を行うことができる。
【０１６６】
また、従来の試料面ピント調整に利用可能な光学系を利用することで、照明視野絞り及び試料面双方のピント調整を、一台の装置にて実施することが可能となる。また、スライドガラスの厚み変化検出をもとにステージを駆動した後、試料面を位相差ＡＦ光学系にて観察して従来の位相差ＡＦを行うことで、同一光学系にてピント微調整を実施することも可能となる。
【０１６７】
＜明度ムラの補正処理について＞
前述のように、スライドガラスの厚みは、その変動幅が大きく、かかる厚みの変化に起因して、ある厚みのスライドガラスでは合焦点状態にあった光学系が、ある厚みのスライドガラスでは合焦点状態ではなくなる、といった事態が生じうる。その結果、スライドガラスの厚みの変化に応じて、撮像素子２４により撮像される被写体像（拡大像）の明度にもムラが生じる可能性がある。
【０１６８】
そこで、本実施形態に係る顕微鏡１では、前述のように、スライドガラスの厚みが変化して、照明視野絞りが合焦点状態ではなくなった場合、照明視野絞りが合焦点状態となるように、照明光学系の位置を調整する。
【０１６９】
照明光学系の位置が調整され、照明視野絞りが合焦点状態にある場合には、撮像された画像における明度のムラは、一定とみなすことが可能である。そこで、本実施形態に係る統括制御部５０では、光学系が合焦点状態にある場合における明度ムラ補正用の明度ムラ補正パターンを予め準備しておき、記憶部５１７等に格納しておく。その後、本実施形態に係る明度補正部５１３は、照明視野絞りが合焦点状態となるように調整された後に撮像された被写体像に対して、予め格納されている共通の明度ムラ補正パターンを利用して、被写体像に含まれる明度ムラを補正する。
【０１７０】
また、照明視野絞りの合焦調整を行わない場合であっても、明度補正部５１３は、以下のような方法を用いることで、撮像された被写体像に存在しうる明度ムラを補正することが可能である。すなわち、スライドガラスの厚みごとに、予め複数種類の明度補正パターンを準備しておき、記憶部５１７等に格納しておく。その後、明度補正部５１３は、算出されたスライドガラスの厚みに応じて、複数の明度補正パターンの中から、明度補正処理に利用する明度補正パターンを選択する。明度補正部５１３は、選択した明度補正パターンを利用して明度ムラ補正を行うことが可能である。
【０１７１】
明度補正部５１３が、このような明度補正処理を実施することで、適切な被写体像を得ることが可能となる。
【０１７２】
以上、本実施形態に係る顕微鏡１で実施される各種処理について、詳細に説明した。
なお、前述の説明では、コンデンサレンズ駆動機構４２により透過照明後段光学系２０３のコンデンサレンズを駆動する場合について説明したが、照明視野絞り２０５のピント位置を調整可能であるならば、他のレンズや照明光学系全体を駆動しても良い。
【０１７３】
また、前述の説明では、照明視野絞り２０５のピントズレがスライドガラスの厚み変化に起因するものとして説明したが、本実施形態に係る合焦方法によれば、他の原因による照明視野絞り２０５のピントズレを検出して調整することも可能である。
【０１７４】
更に、前述の説明では、位相差ＡＦ光学系３０１にて照明視野絞り２０５のピントズレを検出しているが、位相差ＡＦ光学系３０１にて試料面のピントズレを検出し、試料面のピント調整を実施してもよい。
【０１７５】
＜変形例＞
前述の説明では、特徴量算出部５０７が、位相差像データに記載されている信号強度を利用して特徴量（集光点シフト量Ｄ）を算出する場合について説明したが、特徴量算出部５０７は、以下で説明するような方法を用いて、特徴量を算出してもよい。
【０１７６】
前述のように、集光点シフト量Ｄは、式１０５を利用して、平面移動量Δｘから算出することができる。ここで、平面移動量Δｘを位相差像から決定するために、例えば図１０に示したような撮像素子３４に結像した位相差像（像Ｂ及び像Ｃ）のエッジ検出を利用する。ここで、図１０に示したｘ軸は、撮像素子３４の撮像面３０５の中心を通り、撮像素子の幅方向に対応する軸であり、図１０に示したｙ軸は、撮像素子３４の撮像面３０５の中心を通り、撮像素子の高さ方向に対応する軸である。
【０１７７】
図１０のｙ＝０におけるｘ座標方向での強度分布を示したものが、図１１である。図１１に示したように、撮像素子３４にて観察される照明視野絞り像が一様な強度分布をしている場合、像のエッジ部分でのみ急激に信号量が変化する。そのため、例えば像Ｂ信号及び像Ｃ信号を微分すると、図１２のように微分信号のピーク値をエッジとして検出することが可能となる。なお、一様な強度分布をしている照明視野絞り像を得るために、統括制御部５０は、照明光の強度を、撮像素子３４上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整することが好ましい。本実施形態では、位相差像として生成される画像が２種類存在し、かつ、各画像についてｘ軸方向のエッジが左右２つ存在するため、位相差像に対してエッジ位置検出部５０９がエッジ位置の検出処理を行うことで、計４つのエッジ位置座標が求まることとなる。
【０１７８】
ここで、図１１に示したように、エッジ位置座標をεと表すこととし、各々のエッジ位置座標を、εｃ１，εｃ２，εｂ１，εｂ２と表すこととする。これらのエッジ位置座標は、照明視野絞り２０５がデフォーカスすることで、像Ｃについては、−Δｘだけ移動し、像Ｂについては、＋Δｘだけ移動することとなる。
【０１７９】
エッジ位置検出部５０９は、このようにして検出された４種類のエッジ位置座標のうち、少なくとも１つに関する検出結果を、特徴量算出部５０７に出力する。特徴量算出部５０７は、得られたエッジ位置座標の検出結果のうち、少なくとも１つのエッジ位置（例えば、εｂ１で表されるエッジ位置）のみに注目することで、平面移動量Δｘを検出することが可能となる。この場合には、位相差ＡＦ光学系３０１は、２眼レンズを用いた光学系ではなく、単眼レンズを用いた光学系であってもよい。
【０１８０】
また、単一エッジ位置座標にて平面移動量Δｘを検出する場合、結像面ずれΔｘ０が存在すると、検出される平面移動量ΔｘがΔｘ＋Δｘ０となり、結像面ずれの影響を受けることとなる。そのため、特徴量算出部５０７は、Δｘ＝（εｂ１−εｃ２）／２、又は、Δｘ＝（εｂ２−εｃ１）／２として、結像面ずれΔｘ０の影響を除去するようにしてもよい。
【０１８１】
また２眼レンズを用いた位相差ＡＦ光学系３０１が設けられており、かつ、図１３に示したようなディストーション（歪曲収差）が存在する場合、図１３に示したように、ディストーションにより同一像内の左右のエッジ結像位置にズレが生ずることとなる。
【０１８２】
図７に示したように中心軸を中心として２眼レンズが対称位置に存在する場合、図１４に示した像Ｃのエッジ左側と像Ｂのエッジ右側のシフト量は、｜Δｄｘ１｜と同一となる。同様に、図１４に示した像Ｂのエッジ左側と像Ｃのエッジ右側のシフト量についても、｜Δｄｘ２｜と同一となる。そのため、特徴量算出部５０７は、Δｘ＝｛（εｃ１＋εｃ２）−（εｂ１＋εｂ２）｝／４とすることで、ディストーションの影響を除去することが可能となる。
【０１８３】
特徴量算出部５０７は、以上のようにして算出した平面移動量Δｘを利用して、式１０５により集光点シフト量Ｄを算出することが可能である。
【０１８４】
以上説明したように、本変形例に係る特徴量算出部５０７は、位相差ＡＦ光学系３０１にて得られた位相差像から結像画像内での照明視野絞りエッジ位置を検出し、検出したエッジ位置座標に基づいて照明視野絞りのピントズレ量を算出する。照明視野絞りピント調整部の一例であるコンデンサレンズ駆動制御部５３は、特徴量算出部５０７から出力されたピントズレ量に応じてコンデンサレンズ駆動機構４２を制御し、照明視野絞りのピントを調整する。
【０１８５】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【符号の説明】
【０１８６】
１ 顕微鏡
１０ サムネイル像撮像部
１１，２１ 光源
１２，２３ 対物レンズ
１３，２４，３４ 撮像素子
２０ 拡大像撮像部
２２，３２ コンデンサレンズ
３０ デフォーカス量検出部
３１ ビームスプリッター
３３ ２眼レンズ
４０ ステージ
４１ ステージ移動機構
４２ コンデンサレンズ駆動機構
５０ 統括制御部
５１ 照明制御部
５２ ステージ駆動制御部
５３ コンデンサレンズ駆動制御部
５４ 位相差像撮像制御部
５５ サムネイル像撮像制御部
５６ 拡大像撮像制御部
２０１ 透過照明前段光学系
２０３ 透過照明後段光学系
２０５ 照明視野絞り
２０７，２０９，２１５ コンデンサレンズ
２１１ 結像光学系
２１３ コンデンサレンズ（対物レンズ）
２１７，３０５ 撮像面
３０１ 位相差オートフォーカス光学系
５０１ サムネイル像取得部
５０３ 位相差像取得部
５０５ 拡大像取得部
５０７ 特徴量算出部
５０９ エッジ位置検出部
５１１ 厚み変化量算出部
５１３ 明度補正部
５１５ 通信部
５１７ 記憶部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明視野絞りと、１又は複数の光学素子とを有し、ステージに設けられたサンプルに対して照明光を投影する照明光学系と、
前記サンプルを透過した透過光を撮像する第１の撮像素子と、当該第１の撮像素子に前記透過光を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第１の結像光学系と、
前記第１の結像光学系から前記透過光の一部を分岐する光線分岐部と、分岐された前記透過光の位相差像を撮像する第２の撮像素子と、当該第２の撮像素子に前記分岐された透過光の位相差像を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第２の結像光学系と、
前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整部と、
前記第２の撮像素子から出力される出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する特徴量算出部と、
を備え、
前記照明視野絞りピント調整部は、前記特徴量算出部により算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する、顕微鏡。
【請求項２】
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、
前記特徴量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記特徴量を算出する、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記特徴量算出部による特徴量の算出は、前記サンプルの透過光が前記第１の撮像素子上に合焦していない状態で行われる、請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記照明光の強度は、前記第２の撮像素子上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整される、請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記顕微鏡は、
前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、
前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、
を更に備え、
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、
前記厚み変化量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、
前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させる、請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記顕微鏡は、
前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、
前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、
を更に備え、
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、
前記厚み変化量算出部は、少なくとも合焦時における前記第１の像又は前記第２の像のエッジ位置と得られた第１の像又は前記第２の像のエッジ位置との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、
前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させる、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像又は前記第２の像において、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出する、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出する、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状の両側のエッジ位置の和に基づいて、前記厚み変化量を算出する、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記特徴量算出部は、前記出力信号のエッジ位置を利用して、前記特徴量を算出する、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、
前記明度補正部は、前記照明視野絞りピント調整部により前記照明視野絞りの像が合焦するように前記照明視野絞りが調整された後に撮像された像に対して、予め準備された、明度補正に利用される明度補正パターンを利用して、明度の補正を実施する、請求項５又は６に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、
前記明度補正部は、算出された前記スライドガラスの厚みに基づいて、予め設定された複数の明度補正パターンの中から明度補正に利用する明度補正パターンを選択し、前記明度の補正を実施する、請求項５又は６に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
照明視野絞りを有する照明光学系により投影された照明光のうちステージに設けられたサンプルを透過した透過光の一部を分岐して、分岐された前記透過光の位相差像を撮像素子により撮像するステップと、
前記撮像素子から出力された出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出するステップと、
算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整機構を駆動するステップと、
を含む、合焦点方法。
【請求項１】
照明視野絞りと、１又は複数の光学素子とを有し、ステージに設けられたサンプルに対して照明光を投影する照明光学系と、
前記サンプルを透過した透過光を撮像する第１の撮像素子と、当該第１の撮像素子に前記透過光を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第１の結像光学系と、
前記第１の結像光学系から前記透過光の一部を分岐する光線分岐部と、分岐された前記透過光の位相差像を撮像する第２の撮像素子と、当該第２の撮像素子に前記分岐された透過光の位相差像を結像させる１又は複数の光学素子と、を有する第２の結像光学系と、
前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整部と、
前記第２の撮像素子から出力される出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出する特徴量算出部と、
を備え、
前記照明視野絞りピント調整部は、前記特徴量算出部により算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する、顕微鏡。
【請求項２】
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、
前記特徴量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記特徴量を算出する、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記特徴量算出部による特徴量の算出は、前記サンプルの透過光が前記第１の撮像素子上に合焦していない状態で行われる、請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記照明光の強度は、前記第２の撮像素子上に結像した位相差像の出力信号強度が飽和するように調整される、請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記顕微鏡は、
前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、
前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、
を更に備え、
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、
前記厚み変化量算出部は、前記第２の撮像素子の各画素における第１の像の出力信号強度と第２の像の出力信号強度との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、
前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させる、請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記顕微鏡は、
前記ステージの位置の制御を行う位置制御部と、
前記サンプルが載置されているスライドガラスの厚みの変化量を算出する厚み変化量算出部と、
を更に備え、
前記位相差像は、前記照明視野絞りの形状に対応する前記第２の撮像素子上に結像した第１の像及び第２の像からなり、
前記厚み変化量算出部は、少なくとも合焦時における前記第１の像又は前記第２の像のエッジ位置と得られた第１の像又は前記第２の像のエッジ位置との差を利用して、前記厚み変化量を算出し、
前記位置制御部は、前記厚み変化量算出部が算出した前記厚み変化量に基づいて、前記ステージの位置を、前記照明光学系側へ移動させる、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像又は前記第２の像において、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出する、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状のある一方の側のエッジ位置に基づいて、前記厚み変化量を算出する、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記厚み変化量算出部は、前記第１の像及び前記第２の像それぞれにおいて、前記照明視野絞りの形状の両側のエッジ位置の和に基づいて、前記厚み変化量を算出する、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記特徴量算出部は、前記出力信号のエッジ位置を利用して、前記特徴量を算出する、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、
前記明度補正部は、前記照明視野絞りピント調整部により前記照明視野絞りの像が合焦するように前記照明視野絞りが調整された後に撮像された像に対して、予め準備された、明度補正に利用される明度補正パターンを利用して、明度の補正を実施する、請求項５又は６に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記顕微鏡は、前記第１の撮像素子に結像した像の明度を補正する明度補正部を更に備え、
前記明度補正部は、算出された前記スライドガラスの厚みに基づいて、予め設定された複数の明度補正パターンの中から明度補正に利用する明度補正パターンを選択し、前記明度の補正を実施する、請求項５又は６に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
照明視野絞りを有する照明光学系により投影された照明光のうちステージに設けられたサンプルを透過した透過光の一部を分岐して、分岐された前記透過光の位相差像を撮像素子により撮像するステップと、
前記撮像素子から出力された出力信号に基づいて、前記照明視野絞りのピントのズレ度合いを表す特徴量を算出するステップと、
算出された前記特徴量に応じて、前記照明視野絞りの結像位置を調整する照明視野絞りピント調整機構を駆動するステップと、
を含む、合焦点方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−８４５０（Ｐ２０１２−８４５０Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４６１２８（Ｐ２０１０−１４６１２８）
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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