食中毒検出用プライマー、及び食品媒介病原菌の迅速検出方法
本発明は、食品媒介病原菌の検出用プライマー及び食中毒検出方法に関するものである。特に、本発明はサルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌O-157、リステリア・モノサイトゲネス及び腸炎ビブリオそれぞれに対して特異的であって、これらを迅速かつ正確に検出するのに利用されるＰＣＲプライマー、前記プライマーを利用した食中毒に対する検出方法及び検出キットに関する。本発明の検出方法を利用すれば、食品媒介病原菌を１００〜１０ＣＦＵ／ｍｌまで検出することができ、５時間以内に食中毒の迅速な調査を行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品媒介病原菌（food-borne pathogen）検出用プライマー、及びこれを利用した食中毒（food poisoning）検出方法に関する。より詳しくは、ＰＣＲプライマーを利用して食中毒の原因になる病原菌を迅速且つ正確に検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食中毒は発熱、吐き気、嘔吐、下痢及び腹痛などの症状を伴う疾患で、細菌が原因となる細菌性食中毒が大部分である。細菌性食中毒はその発病形態に応じて感染型、毒素型に分類される。
【０００３】
感染型食中毒は細菌に汚染された食品を摂取し、細菌が腸管内で増殖することによって引き起こされる。感染型食中毒の主な原因菌は、サルモネラ属菌(Salmonella spp.)、腸炎ビブリオ（ビブリオ・パラヘモリチカス：Vibrio parahaemolyticus）、大腸菌（エシェリキア・コリ：Escherichia coli）O157:H7等である。
【０００４】
毒素型食中毒は食品中で細菌が増殖しながら産生される毒素によって発生する食中毒である。したがって、この場合は、原因菌が食品内で既に死滅した後も、残存する毒素が食中毒を引き起こすことができる。黄色ブドウ球菌(スタフィロコッカス・アウレウス：Staphylococcus aureus)、ボツリヌス菌（Clostridiumbotulinum）等がこれに該当する。
【０００５】
食中毒発生に必要な細菌の数は細菌の種類（タイプ）によって異なる。通常は、１０６〜１０８ＣＦＵ／ｇ以上の細菌が必要である。しかし、大腸菌O157:H7やリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）の場合には、１０〜１０００個の菌数のみでも食中毒を発病させることができる。食中毒を誘発する細菌の種類及び数は下記表１の通りである。
【０００６】
【表１】
【０００７】
食中毒は、団体給食及び外食機会の増加などの食生活パターン変化と、地球温暖化及び室内温度上昇などの環境的変化によって食中毒の発生が増加し、そして、集団発生として大規模に生ずる傾向がある。食中毒を早期に予防するための食中毒を引き起こす病原菌を検出する方法の開発が早急に要求されている。
【０００８】
現在使用されるサルモネラ属菌の検出方法は、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）で先行培養し、細菌を選択培地で培養する１次検証工程と、生化学的、血清学的分析の２次検証工程を有し、通常、病原菌の同定に約５日から６日かかる。また、迅速な検出のため利用されるＰＣＲ方法は、これも分析可能な病原菌量をサンプルの培養によって得なければならず、検出には一日以上かかる。
【０００９】
病原菌の培養過程を必要としない、食中毒を引き起こす病原体の迅速な検出方法の開発が、早急に要求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記従来技術の問題を解決するため、本発明の目的は、人において食中毒を起こす病原菌の特異的な遺伝子を選択的に増幅するプライマーを提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、人において食中毒を起こす病原菌に対して、高い検出精度（detection accuracy）及び特異性をもつ２対のプライマーを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、人において食中毒を起こす病原性菌の特異的な遺伝子を選択的に増幅するプライマーでのＰＣＲ反応を利用することによって、病原菌を正確に検出し、診断時間を４日〜６日から約１２時間に短縮することである。
【００１３】
また、本発明の別の目的は、人において食中毒を起こす病原性微生物の特異遺伝子を選択的に増幅するプライマーでのＰＣＲ反応を利用することによって、短時間内に正確に病原菌を検出するキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的を達成するため、本発明は、下記１）〜５）のプライマー対からなる群より選択された１種以上の病原菌検出ためのプライマー対を提供する：
１）配列番号３及び４のプライマーを含むサルモネラ属菌検出用プライマー対；
２）配列番号７及び８のプライマーを含む黄色ブドウ球菌検出用プライマー対；
３）配列番号１１又は１３、及び配列番号１２又は１４のプライマーを含む大腸菌O157:H7検出用プライマー対；
４）配列番号１７及び１８のプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対；及び、
５）配列番号２１又は２３、及び配列番号２２又は２４のプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対。
【００１５】
さらに、本発明は、５種類の病原菌の特異的な遺伝子を増幅できる前記１）〜５）のプライマー対からなる群より選択された１種以上の病原菌検出のためのプライマー対を利用したＰＣＲでの病原菌検出のための方法に提供するものである。
【００１６】
さらに、前記ＰＣＲで病原菌を検出する方法において、本発明は、下記６）〜１０）のプライマー対からなる群より選択された１種以上の追加的なプライマー対を使用することができる：
６）配列番号１及び配列番号２のプライマーを含むサルモネラ属菌検出用プライマー対；
７）配列番号５及び配列番号６のプライマーを含む黄色ブドウ球菌検出用プライマー対；
８）配列番号９及び配列番号１０のプライマーを含む大腸菌O157：H7検出用プライマー対；
９）配列番号１５及び配列番号１６のプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対；及び
１０）配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対。
【００１７】
前記追加的なプライマー対は、ネステッドＰＣＲの第１ラウンドの増幅時に使用され、そして高いＰＣＲ効率で病原菌の検出限界を顕著に増進させる。前記追加的なプライマー対を利用したネステッドＰＣＲの場合、ＰＣＲを２段階で実施することができるか、又は前記２段階で使用されるプライマー対２種を同時に使用して１段階で実施することができる。
【００１８】
さらに、本発明は、病原菌検出用ＰＣＲプライマー、反応緩衝液及びTaq DNAポリメラーゼを含む、ＰＣＲによって病原菌を検出するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００１９】
以上のように、本発明の病原菌検出用プライマー対は、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌 、大腸菌O157、リステリア・モノサイトゲネス及び腸炎ビブリオの特異的な遺伝子を短時間に、正確に増幅させ、１００〜１０ＣＦＵ／ｍｌの検出限界を有する。したがって、前記プライマー対を利用して、５時間以内に感染の発生の急速な疫学調査を実行することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図面の簡単な説明
図１は、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）（ＫＣＣＭ１２０２１）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図２は、黄色ブドウ球菌（ＫＣＣＭ１９２７）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図３は、大腸菌O157：H7（ＡＴＣＣ１２０２４）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図４は、リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ１９１１２）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図５は、腸炎ビブリオ（ＫＣＣＭ１１９６５）のネステッドＰＣＲの電気泳動の結果である。
図６は、配列番号３及び４で示すサルモネラ属菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果である。
図７は、配列番号７及び８で示す黄色ブドウ球菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果である。
図８は、配列番号１５〜１８で示すリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果である。
図９は、研究室で人為的に汚染させた多様な食品におけるサルモネラ菌（Salmonella）検出の電気泳動結果である。
図１０は、配列番号１及び２で示すプライマー対を利用したＰＣＲの結果と、配列番号１〜４で示す２種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの結果の比較である。
図１１は、配列番号１〜４に示す２種のプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図１２は、配列番号３〜４に示すプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果である。
図１３は、配列番号７〜８に示すプライマー対を利用した黄色ブドウ球菌のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果である。
図１４は、配列番号１１及び１２に示すプライマー対を利用した大腸菌O157:H7のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果である。
【００２１】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００２２】
本発明は、食中毒を誘発する病原菌の検出方法に関する。前記病原菌は、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌O157:H7、リステリア・モノサイトゲネス、及び、腸炎ビブリオからなる群から選択される１種とすることができる。
【００２３】
本発明は、前記病原菌の特異的な遺伝子を検出するために病原菌の特異的な遺伝子を増幅するためのプライマー対を提供する。
【００２４】
本発明のプライマー対は、５種の病原菌の特異的な遺伝子を、異なるヌクレオチドサイズで同時に検出することができる。具体的な例は次の通りであり、配列は表２に記載されている。本発明のプライマー対は、広く知られたＰＣＲ法、例えば、ネステッドＰＣＲ又はマイクロ−ＰＣＲにおいて使用可能である。
【００２５】
【表２】
【００２６】
サルモネラ属菌検出用プライマー対は、配列番号３及び４に示されたプライマー対からなり、そしてサルモネラ属菌に特異的な遺伝子産物の約２００塩基対を増幅する。ネステッドＰＣＲの場合、配列番号１及び２のプライマーを含むサルモネラ属菌に対する公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時にＰＣＲ反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記サルモネラ属菌検出用プライマー対と反応させることができる。前記配列番号１及び２を含むプライマー対は、約６７８塩基対の特異的な遺伝子を増幅する。
【００２７】
配列番号７及び８で示す黄色ブドウ球菌検出用プライマー対は、黄色ブドウ球菌に特異的な約１３６塩基対の遺伝子産物をする。ネステッドＰＣＲに対して、配列番号５及び６のプライマーを含む黄色ブドウ球菌に対する公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記黄色ブドウ球菌検出用プライマー対と反応させることができる。前記配列番号５及び６を含むプライマー対は、特異的な遺伝子の約６７８塩基対を増幅する。
【００２８】
大腸菌O157検出用プライマー対は、配列番号１１又は１３に示すセンスプライマー、及び配列番号１２又は１４に示すアンチセンスプライマーからなる、例えば、大腸菌O157検出用プライマー対は、大腸菌O157に特異的な遺伝子の約１０８ｂｐを増幅する配列番号１１及び１２に示すプライマーを含み、そして、大腸菌O157に特異的な遺伝子の約１２９ｂｐを増幅する配列番号１３及び１４に示すプライマーを含む。
【００２９】
ネステッドＰＣＲに対して、配列番号９及び１０を含む公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記大腸菌O157検出用プライマー対と反応させることができる。配列番号９及び１０に示すプライマー対は、特異的な遺伝子の約２０８塩基対を増幅する。
【００３０】
配列番号１７及び１８に示すリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な遺伝子の約１９１塩基対を増幅する。
【００３１】
ネステッドＰＣＲに対して、配列番号１５及び１６を含むリステリア・モノサイトゲネス検出用の公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記リステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対と反応させることができる。配列番号１５及び１６に示すプライマー対は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な遺伝子の約４５４塩基対を増幅する。
【００３２】
腸炎ビブリオ検出用プライマー対は、配列番号２１又は２３に示すセンスプライマー、及び配列番号２２又は２４に示すアンチセンスプライマーからなる。例えば、腸炎ビブリオ検出用プライマー対は、腸炎ビブリオに特異的な遺伝子の約２１９ｂｐを増幅する配列番号２１及び２２に示すプライマーを含み、そして、腸炎ビブリオに特異的な遺伝子の約１５３ｂｐを増幅する配列番号２３及び２４に示すプライマーを含む。
【００３３】
ネステッドＰＣＲに対して、配列番号１９及び２０を含む腸炎ビブリオ検出用の公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記腸炎ビブリオ検出用プライマー対と反応させることができる。配列番号１９及び２０に示すプライマー対は、腸炎ビブリオに特異的な遺伝子の約６７８塩基対を増幅する。
【００３４】
本発明の検出方法は、前記１種の病原菌に対するＰＣＲプライマー対を利用して、それぞれの病原菌を検出するのみでなく、前記２種以上の病原菌を２種以上のＰＣＲプライマー対を利用してマルチプレックスＰＣＲを通して検出することができ、前記５種の病原菌を１度に迅速且つ正確に検出することができる。
【００３５】
本発明の検出方法のＰＣＲ反応条件は、ＰＣＲの様々な種類（例えば、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、マイクロ−ＰＣＲ、シングルＰＣＲ）における一般的なＰＣＲ反応条件、又はその一部変形とすることでき、これは本願発明が属する技術分野における当業者であれば、容易に予測できる範疇に該当する。
【００３６】
前記ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲの感度を高めるために一次ＰＣＲ内にインナープライマー（internal primer）を利用する２段階のＰＣＲ反応である。最初に、一次プライマーと、サンプルからの鋳型ＤＮＡを利用して１次ＰＣＲ反応を行う。前記反応産物と内部プライマー（inner primer）での２次ＰＣＲ反応が、検出感度を増加させる遺伝子増幅法を提供し、そして、PCR Primer，A Laboratory Manual，2ndedition、p65に詳しく記載されている。
【００３７】
小型ＰＣＲ用チップを利用する前記マイクロ−ＰＣＲは、チップ上に、鋳型ＤＮＡとインナープライマーのみ含む２０μl反応組成物を作製することができ、ここで、１μlを取ってシリコンチップに注入したものである。少量の反応組成物を使用するという点及びモニタリングが容易である点の長所がある。前記チップを、ＴＭＣ−１０００モジュールにマウントさせ、そして、ＤＮＡ増幅を、ＰＣＲ反応中にリアルタイムでモニターする。マイクロ−ＰＣＲ ＴＭＣ-１０００（登録商標）（三星テクウィンによって製造されたＰＣＲ装置）が市販の装置の例である。
【００３８】
ＰＣＲは、通常のサーマルブロックＰＣＲ（thermal block PCR）又はマイクロ−ＰＣＲ装置を利用して実施できるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の検出方法は、前述の病原菌が発見される全ての物質を対象として実施することができ、好ましくは食品または飼料に対して実施できる。例えば、病原菌の汚染が疑われる試料を、滅菌水又は０．８５％の生理食塩水に懸濁した後、プロテイナーゼＫで処理する。ペレットを回収した後、熱抽出（heat extract）してＰＣＲ試料を調製し、ＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲ結果は、一般的なＰＣＲ検出方法、例えば、電気泳動等によって、分析される。前記熱抽出は、一般的なＤＮＡ分離方法、例えば、前記ペレットを滅菌水に懸濁させ、そしてフェノール／クロロホルム（１：１容積混合物）混合液を処理した後、上層を収得しエタノールと混合した後、遠心分離してＤＮＡペレットを収得するものである。具体的な反応条件及び時間は通常の通りである。
【００４０】
本発明による検出方法は、病原菌を特異的且つ効率的に検出することができ、そしてネステッドＰＣＲは病原菌の検出限界を顕著に向上させる。特に、検出限界１０５ＣＦＵ／ｍｌを１００〜１０ＣＦＵ／ｍｌに増進させる。
【００４１】
また、本発明は、１種以上の病原菌を検出するためのプライマー対を含む病原菌検出キットを提供する。病原菌検出キットは、ＰＣＲ微生物検出キットの通常の構成成分（反応緩衝液、Taq DNAポリメラーゼ、標識物質等）含み、そしてプライマー７対（配列番号３〜４、７〜８、１１〜１４、１７〜１８、２１〜２４）を含む。
【００４２】
本発明の好ましい一実施例において、検出キットは以下を含む；
（１）配列番号３〜４、配列番号７〜８、配列番号１１〜１４、配列番号１７〜１８、及び配列番号２１〜２４に示すプラマーから構成される群から選択される１種以上のプライマー対を含むプライマーセット
（２）反応緩衝液
（３）Taq DNAポリメラーゼ。
【００４３】
また、前記検出キットは、配列番号１〜２、配列番号５〜６、配列番号９〜１０、配列番号１５〜１６及び配列番号１９〜２０に示すプライマーからなる群から選択される１種以上のプライマー対を更に含む。
【００４４】
本発明の好ましい一実施例において、検出キットは以下を含む；
（１）配列番号３〜４、配列番号７〜８、配列番号１１〜１４、配列番号１７〜１８、及び配列番号２１〜２４に示すプライマーからなる群から選択される１種以上のプライマー対を含むプライマーセット;
（２）（Taq DNAポリメラーゼ、ＳＹＢＲグリーンを含む、４ＸグリーンスターＰＣＲマスターミックス（4X Greenstar PCR Master Mix）
（３）コントロールＤＮＡ、及び
（４）１０ｍＭのＭｇＣｌ２。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の実施例を記載する。下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるわけではない。
【００４６】
実施例１：５種の病原菌の特異的DNAを増幅するためのＰＣＲプライマーの設計及び調製
サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌O157、リステリア・モノサイトゲネス及び腸炎ビブリオを同時に検出するため、前記表２にリストされたプライマーを設計及び合成した。
【００４７】
実施例２：ネステッドＰＣＲ
２−１．サルモネラ属菌
１０８〜１ＣＦＵ／ｍｌのサルモネラ・エンテリティディス（ＫＣＣＭ１２０２１）１ｍｌにプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）２０μｌを添加し、６０℃で１０分間反応させた。反応完了後、反応産物を１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを取得し、２００μｌの滅菌水中で懸濁させた。これを、１０５℃で２０分間加熱し、同一体積のフェノール／クロロホルムで混合し、そして、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を取得した。上澄液に同一体積のエタノールと混合し、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを回収した後、ペレットに２０ｕＬの滅菌水を加えてＰＣＲ試料を調製した。
【００４８】
ＰＣＲを２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したＰＣＲを実施し、一方、他の群は、配列番号１及び２に示すプライマ対でのＰＣＲからの反応産物が、配列番号３及び４に示す追加のプライマー対での第２ラウンドのＰＣＲを実施するのに使われた。２つの群のＰＣＲ反応条件は、その他の面では同一であり、次の通りである。
【００４９】
＜ＰＣＲ条件＞
９４℃、５分−＞（９４℃、３０秒−＞６０℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、３５サイクル−＞７２℃、５分。
【００５０】
【表３】
【００５１】
図１は、サルモネラ・エンテリティディスのＰＣＲ結果を示す。レーン１〜１０は、配列番号１及び２に示すプライマーセットに相当し、及び、レーン１１〜２０は、配列番号１〜４に示すプライマー２対を利用するネステッドＰＣＲに相当する。各レーンにおけるサルモネラ・エンテリティディス濃度は以下の通りである；
レーン１及び１１：１０８ＣＦＵ／ｍｌ レーン２及び１２：１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３及び１３：１０６ＣＦＵ／ｍｌ レーン４及び１４：１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５及び１５：１０４ＣＦＵ／ｍｌ レーン６及び１６：１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７及び１７：１０２ＣＦＵ／ｍｌ レーン８及び１８：１０ＣＦＵ／ｍｌ
レーン９及び１９：１ ＣＦＵ／ｍｌ レーン１０及び２０：サルモネラ菌ＤＮＡ１０ｎｇ
【００５２】
図１のネステッドＰＣＲは６７８ｂｐ及び２００ｂｐの増幅産物を示し、そして、配列番号１及び２に示すプライマーセットを利用するＰＣＲ結果を比較した改善された検出限界が分かる。つまり、サルモネラ・エンテリティディスに対する配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したＰＣＲの結果では、１０８ＣＦＵ／ｍｌでのみ６７８ｂｐの増幅産物を確認できるが、配列番号１及び２に示すプライマー対での反応からのＰＣＲ産物の更なる増幅をすべく、配列番号３及び４のプライマー対を利用したネステッドＰＣＲ結果では、１０ＣＦＵ／ｍｌにおいて２００ｂｐの増幅産物を検出することができる。
【００５３】
２−２．黄色ブドウ球菌
黄色ブドウ球菌（ＫＣＣＭ１９２７）の１０７〜１ＣＦＵ／ｍｌを調製し、前記２−１と同様な方法でＤＮＡを抽出した。
【００５４】
ＰＣＲは、２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号５及び６に示すプライマー対でＰＣＲを実施した。他の群について、反応は、配列番号５〜８に示す全てのプライマーをＰＣＲ反応組成物に混合して実施した。２群のＰＣＲのＰＣＲ条件は、その他は同じであり、そして、ＰＣＲ反応条件及び組成物は前記２-１のようにした。
【００５５】
図２は、黄色ブドウ球菌に対するＰＣＲ結果を示す。レーン１〜８は、配列番号５及び６に示すプライマーセットに相当し、レーン９〜１６は、配列番号５〜８に示す２対のプライマーを利用するネステッドＰＣＲに相当する。各レーンにおける、黄色ブドウ球菌の濃度は次の通りであった；
レーン１及び９：１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２及び１０：１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３及び１１：１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４及び１２：１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５及び１３：１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６及び１４：１０２ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７及び１５：１０ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８及び１６：１ＣＦＵ／ｍｌ
【００５６】
図２に、配列番号５〜６に示すプライマー対でのＰＣＲの検出限界が約１０６ＣＦＵ／ｍｌであるが、一方、配列番号７及び８に示す更なるプライマー対がネステッドＰＣＲにおいて使用された時、検出限界が１０２ＣＦＵ／ｍｌに顕著に向上することを示す。レーン１５と１６において、ＲＮＡバンドのみが検出された。
【００５７】
２−３．大腸菌O157
大腸菌O157:H7 ＡＴＣＣ１２０２４の４×１０８〜１ＣＦＵ／ｍｌを調製し、そして前記２−１．と同様な方法でＤＮＡを抽出した。
【００５８】
ＰＣＲ反応は、２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号９及び１０で示すプライマー対を使用するＰＣＲを実施した。他の群について、配列番号９〜１２、又は配列番号９〜１０及び１３〜１４に示すプライマー対を利用したネステッドＰＣＲを実施した。２群のＰＣＲの反応条件は、その他は同じであった。ＰＣＲ反応条件及び反応組成物は前記２−１のようにした。
【００５９】
大腸菌O157:H7に対するＰＣＲ結果を図３に示す。
【００６０】
配列番号９及び１０に示すプライマーセットのＰＣＲ結果をレーン１〜９に示す、そして、配列番号９〜１２に示すプライマー２対を利用するネステッドＰＣＲの結果をレーン９〜１８に示し、そして、配列番号９〜１０及び１３〜１４に示すプライマー２対を利用するネステッドＰＣＲの結果をレーン１９〜２７に示す。大腸菌O157:H7濃度は以下の通りである；
レーン１、１０及び１９：４ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２、１１及び２０：４ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３、１２及び２１：４ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４、１３及び２２：４ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５、１４及び２３：４ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６、１５及び２４：４ｘ１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７、１６及び２５：４ｘ１００ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８、１７及び２６：４ｘ１０ＣＦＵ／ｍＬ
レーン９、１８及び２７：４ｘ１ＣＦＵ／ｍｌ
【００６１】
図３は、配列番号９及び１０に示すプライマー対を利用してＰＣＲを実施した場合（レーン１〜９）の、レーン１の２０８ｂｐのＤＮＡバンドが、検出限界が約１０８ＣＦＵ／ｍｌであることを確認することを示す。これに反し、配列番号１１及び１２に示すプライマー対を利用するネステッドＰＣＲ（レーン１０〜１８）が、レーン１０〜１７における１２９ｂｐのＤＮＡバンドを検出する。したがって、検出限界が顕著に向上する。配列番号１３及び１４に示すプライマー対を利用するネステッドＰＣＲ（レーン１９〜２７）は、レーン１９〜２５において１０８ｂｐのＤＮＡバンドを検出し、そして検出限界が１０２ＣＦＵ／ｍｌであることを示す。
【００６２】
２−４．リステリア・モノサイトゲネス
リステリア・モノサイトゲネス ＡＴＣＣ１９１１２の１．１ｘ１０９〜１ＣＦＵ／ｍｌを調製した後、前記２−１と同様な方法でＤＮＡを抽出した。
【００６３】
ＰＣＲは２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号１５及び１６に示すプライマー対を利用したＰＣＲを実施した。他の群について、配列番号１７及び１８に示すプライマー対を利用したネステッドＰＣＲを実施した。２群の反応条件は、その他は同じであった。ＰＣＲ反応条件及び反応組成物は前記２−１のようにした。
【００６４】
リステリア・モノサイトゲネスに対するＰＣＲ結果を図４に示す。
【００６５】
配列番号１５及び１６に示すプライマーセットでのＰＣＲ結果を、レーン１〜１０に示し、そして、配列番号１７及び１８に示すプライマー対のネステッドＰＣＲをレーン１１〜２０に示す。リステリア・モノサイトゲネス濃度は以下の通りである；
レーン１及び１１：リステリア・モノサイトゲネス１．１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２及び１２：１．１ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３及び１３：１．１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４及び１４：１．１ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５及び１５：１．１ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６及び１６：１．１ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７及び１７：１．１ｘ１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８及び１８：１．１ｘ１００ＣＦＵ／ｍｌ
レーン９及び１９：１．１ｘ１０ＣＦＵ／ｍＬ
レーン１０及び２０：１．１ｘ１ＣＦＵ／ｍｌ。
【００６６】
図４において、配列番号１５及び１６に示すプライマー対を利用したＰＣＲ（レーン１〜１０）は、４５４ｂｐの増幅産物を検出し、配列番号１７及び１８に示すプライマー対をさらに利用したネステッドＰＣＲ（レーン１１〜２０）では、４５４ｂｐ及び１９１ｂｐの増幅産物を検出した。しかしながら、ネステッドＰＣＲが低濃度のリステリア・モノサイトゲネス検出により有用であった。
【００６７】
２−５．腸炎ビブリオ
２．１ｘ１０１０〜１ＣＦＵ／ｍｌの腸炎ビブリオＫＣＣＭ１１９６５を調製した後、前記２−１と同様にＤＮＡを抽出した。
【００６８】
ＰＣＲは、２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号１９及び２０で示すプライマー対を使用するＰＣＲを実施した。他の群について、配列番号１９〜２２、又は配列番号１９〜２０及び２３〜２４に示すプライマー対を利用したネステッドＰＣＲを実施した。２群の反応条件は、その他は同じであった。ＰＣＲ反応条件及び反応組成物は前記２−１のようにした。
【００６９】
腸炎ビブリオに対するＰＣＲ結果を図５に示す。
【００７０】
配列番号１９及び２０に示すプライマーセットを使用するＰＣＲ結果を、レーン１〜１１に示し、そして、配列番号１９〜２２の２対のプライマーを使用するネステッドＰＣＲをレーン１２〜２２に示し、配列番号１９〜２０及び２３〜２４に示す２対のプライマーを使用するネステッドＰＣＲをレーン２３〜３３に示す。腸炎ビブリオの濃度は以下の通りである；
レーン１、１２及び２３：腸炎ビブリオ２．１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２、１３及び２４：２．１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３、１４及び２５：２．１ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４、１５及び２６：２．１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５、１６及び２７：２．１ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６、１７及び２８：２．１ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７、１８及び２９：２．１ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８、１９及び３０：２．１ｘ１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン９、２０及び３１：２．１ｘ１００ＣＦＵ／ｍｌ
レーン１０、２１及び３２：２．１ｘ１０ＣＦＵ／ｍＬ
レーン１１、２２及び３３：２．１ｘ１ＣＦＵ／ｍｌ。
【００７１】
図５において、腸炎ビブリオ ＫＣＣＭ１１９６５に対する配列番号１９及び２０に示すプライマー対を利用したＰＣＲは、レーン１〜３のみにおいて３７５ｂｐの増幅産物を示す。配列番号１９及び２０に示すプライマー対を利用するＰＣＲの場合には、検出限界が約１０８ＣＦＵ／ｍｌであることを示す。また、配列番号１９及び２０に示すプライマー対を使用したものからの増幅産物を、さらに配列番号２１及び２２に示すプライマー対を利用するネステッドＰＣＲの結果は、レーン１２〜２２において２１９ｂｐの増幅産物が示された。また、配列番号２３及び２４のプライマー対を更に利用したネステッドＰＣＲは、レーン２３〜３３において１５３ｂｐの増幅産物を検出した。
【００７２】
したがって、本発明のプライマー対を利用したネステッドＰＣＲは、１０〜１ＣＦＵ／ｍｌの濃度で病原菌を検出でき、検出限界が非常に優れていた。
【００７３】
実施例３：プライマーの検証
実施例１におけるプライマー対の病原菌特異性を検証するために、病原菌に類似する微生物ＤＮＡに対してＰＣＲを実施した。
【００７４】
３−１．配列番号３及び４に示すプライマー対
図６は、サルモネラ属菌検出用の配列番号３及び４に示すプライマでネステッドＰＣＲを実行して得られた結果であり、レーンについては下記で説明するが、ここで、レーンＭはサイズマーカーである。
【００７５】
図６において、レーン１〜８、１３〜１４、３０及び３４において約２００ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。したがって、配列番号３及び４に示すプライマー対はサルモネラ属菌株を特異的に検出できることが理解された。
【００７６】
【表４−１】
【表４−２】
【００７７】
３−２．配列番号７及び８のプライマー対
図７は、黄色ブドウ球菌検出用のための配列番号７及び８に示すプライマーでのネステッドＰＣＲを実施して得られた結果であり、そして、レーンについては下記に説明するが、ここで、レーンＭはサイズマーカーである。
【００７８】
【表５−１】
【表５−２】
【００７９】
図７において、レーン１２〜１５において黄色ブドウ球菌のみが検出され、これは、配列番号７及び８に示すプライマー対は黄色ブドウ球菌を特異的に検出できることを意味する。
【００８０】
３−３．配列番号１７及び１８に示すプライマー対
図８は、リステリア・モノサイトゲネス検出用の配列番号１７及び１８に示すプライマーでのネステッドＰＣＲを実行することによって得られた結果であり、レーンについては下記で説明するが、レーンＭはサイズマーカーである。
【００８１】
図８は、レーン１７〜２６において、配列番号１７及び１８のプライマー対によって増幅された４５４ｂｐ及び／又は１９１ｂｐを示す。
【００８２】
【表６】
【００８３】
実施例４：ＰＣＲ検出キット
【００８４】
【表７】
【００８５】
実施例５：食品における食品媒介細菌の検出
人為的に汚染された食品の培養液を対象として前記実施例４−１における検出キットを使用してＰＣＲを実施した。
【００８６】
４種類の食品（サンドイッチ、ハンバーガー、酢豚、飛子）の各２５ｇの検体を、ＬＢ（Luria Burtani）培地２２５ｍｌに接種し、３７℃、８０ｒｐｍで１６時間培養した。培養液１ｍｌに対して、配列番号１及び２に示すプライマー対を利用してＰＣＲを行い、サルモネラ菌の存在しないことを確認した後、残余の培養液を滅菌した。滅菌された培養液９ｍｌに約１０８ＣＦＵ／ｍｌのネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３を添加した後、連続希釈して１〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの検体を製造した。
【００８７】
検体１ｍｌに、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μlを添加した後、６０℃で１０分間培養した。反応産物を１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ペレットを得て、そして、２００μlの滅菌水中で懸濁した。これを、１０５℃で２０分間加熱し、同一体積のフェノール／クロロホルム混合液と混合し、その後、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を得た。前記上澄液を、同一体積のエタノールと混合し、そして、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離をしてペレットを回収した後、前記ペレットに２０μlの滅菌水を添加してＰＣＲ試料ＤＮＡを調製した。
【００８８】
ＰＣＲは、バイオメトラ Ｔ−パーソナル サーマル ＰＣＲ装置（Biometra T-personal Thermal PCR Machine）で実施した。
【００８９】
＜ＰＣＲ条件＞
９４℃、５分−＞１次（９４℃、３０秒−＞６０℃、１５０秒−＞７２℃、３０秒）、５タイムサイクル−＞２次（８８℃、３０秒−＞６０℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、１５タイムサイクル）−＞３次（８８℃、３０秒−＞５４℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、１０タイムサイクル）−＞４次（８６℃、３０秒−＞５４℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、２５タイム−＞７２℃、１０分
【００９０】
図９は、ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３に汚染された食品に対する配列番号１〜４に示す２対のプライマー対でのネステッドＰＣＲを実施することにより得られた結果であり、そしてレーンは下記に説明するが、レーンＭはサイズマーカーである。
【００９１】
１：サルモネラ属菌のＤＮＡ１０ｎｇ、配列番号１及び２に示すプライマー対を利用するＰＣＲ
２：陰性コントロール群（ＤＮＡ含まない）
３：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０５ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
４：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
５：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
６：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
７：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
８：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０５ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
９：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１０：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１１：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１２：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１３：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１４：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１５：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１６：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１７：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０５ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
１８：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
１９：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
２０：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
２１：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
【００９２】
図９において、レーン３〜２１は、配列番号３及び４に示すプライマー対を使用して２００ｂｐのＤＮＡの増幅による１０ＣＦＵ／ｍｌまでの検出を示す。
【００９３】
実施例６：マイクロ−ＰＣＲ
６−１．配列番号３〜４のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ
１０８ＣＦＵ／ｍＬのサルモネラ・エンテリティディス ＫＣＣＭ１２０２１を対象としてＴＭＣ-１０００（登録商標）（三星テクウィン）を利用してマイクロ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは２群で実施した。１つの群は配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したＰＣＲを実施した。他の群は、配列番号１〜４の２対のプライマーを利用した。
【００９４】
マイクロ−ＰＣＲ条件は以下の通りである。
９４℃、１０分−＞（９４℃、５秒−＞６０℃、５秒−＞７２℃、５秒）１００タイムサイクル−＞７２℃、５分
【００９５】
図１０は、サルモネラ・エンテリティディスＫＣＣＭ１２０２１に対してマイクロ−ＰＣＲを実施することにより得られた結果である。１は配列番号１〜４に示す２対のプライマーを利用したものであり、２は配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したものである。右側のグラフは、融解曲線（melting curve）であり、Ｔｍ値を算出することができる。Ｔｍ値は、２本鎖及び一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０％存在する温度である。この時点でのシグナルを平均して標準定量曲線を作成できる。
【００９６】
図１０において、１のＣＴ（Cycle Time）値がライン２のそれより早いが、それは、配列番号３及び４に示すプライマー対を利用するＰＣＲが効率的であることが理解できる。
【００９７】
実施例７：マイクロ−ＰＣＲ検出キット
７−１．２種のプライマー対を含む検出キット
４Ｘグリーンスター------------------------５μl
１０ｍＭのＭｇＣｌ２-----------------------１μl
プライマー混合液（各０．２ｕＭ／μl）------８μl
試料ＤＮＡ（＜５００ｎｇ）----------------６μl
全体積------------------------------------２０μl
【００９８】
７−２．１種のプライマー対を含む検出キット
４Ｘグリーンスター-------------------------５μl
１０ｍＭのＭｇＣｌ２------------------------１μl
プライマー混合液（０．２ｕＭ／μl）---------４μl
試料ＤＮＡ（＜５００ｎｇ）
ヌクレアーゼ未含有水-----------------------２０μlに（up to 20μl）
前記プライマー混合液は、場合によって表８及び９からなる。
【００９９】
【表８】
【０１００】
【表９】
【０１０１】
実施例８：マイクロ−ＰＣＲ検出キットを利用した食中毒を引き起こす病原菌の検出
８−１．試料の調製
サルモネラ菌に汚染されたことが疑われる食品２５ｇを測定し、そして、１００ｍｌの滅菌水を添加して紛砕機で微粉砕した。微粉砕物を濾紙を通して濾過し濾液を得て、１ｍｌの濾液（２０ｍｇ／ｍｌ）に２０μｌのプロテイナーゼＫを添加し、６０℃で１０分間インキュベートした。反応産物を１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットを取得した後、２００μlの滅菌水に懸濁した。これを、１０５℃で２０分間熱処理した後、同一体積のフェノール／クロロホルムと混合し、そして１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を回収した。上澄液を同一体積のエタノールと混合し、そして１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを回収した後、ペレットに２０μlの滅菌水を添加してＰＣＲサンプルＤＮＡを調製した。
【０１０２】
８−２．マイクロ−ＰＣＲ条件
実施例７に記載された検出キット組成物を利用してＰＣＲ反応混合物を製造した後、混合物の１μlを三星総合技術院（SAMSUNG ADVANCED INSTITUTE OF TECHNOLOGY）にて製造されたゲンスペクターマイクロチップ（Genespector Micro chip）に気泡が形成されないように注入して密封した。
【０１０３】
ＰＣＲを前記チップ上でゲンスペクターマイクロ−ＰＣＲ機器を使用して以下のように実行した。
【０１０４】
（１）１種の病原菌に対して２種のプライマーセットを使用したネステッドＰＣＲ
【０１０５】
【表１０】
【０１０６】
（２）１種の病原菌に対して１種のプライマーセットを使用したＰＣＲ
− 初期変性（９４℃で１０分間）−＞変性（９４℃で５秒）、アニーリング（６０℃で５秒）、伸長（７２℃で５秒）を全１００タイム
【０１０７】
前記ＰＣＲ反応終了後、溶融曲線分析を下記条件で行う。
− 初期温度：６０℃
− 最終温度：９０℃
− ランプ レート（Ramp Rate）速度：℃／sec
− 出口温度：４０℃
【０１０８】
実施例９：マイクロ−ＰＣＲの検出限界の検証
９−１．サルモネラ属菌
【０１０９】
実施例７−１の２種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、実施例８（１）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。利用したプライマーは、配列番号１〜４であり、そして、検体はサルモネラ・エンテリティディス ＫＣＣＭ１２０２１であった。
【０１１０】
図１１は、サルモネラ・エンテリティディスの配列番号１〜４に示す２種プライマー対を利用したネステッドＰＣＲの場合において、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析を示す。図１１において、１はサルモネラ・エンテリティディスの１０７ＣＦＵ／ｍｌに対する結果である。２は１０ＣＦＵ／ｍｌに対する結果、そして３は陰性コントロール群である。
【０１１１】
９−２．サルモネラ属菌
実施例７-２の１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、そして実施例８（２）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。使用したプライマーは、配列番号３及び４であり、そして検体はサルモネラ・エンテリティディス ＫＣＣＭ１２０２１であった。
【０１１２】
図１２は、サルモネラ・エンテリティディスの配列番号３及び４に示す１種プライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの場合における、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析を示す。図１２において、４はサルモネラ・エンテリティディスの１０３ＣＦＵ／ｍｌの結果であり、３は１０２ＣＦＵ／ｍｌの結果であり、２は１０１ＣＦＵ／ｍｌの結果であり、１は配列番号１〜４の２種プライマー対を使用した結果である。図１２における２、３及び４は、同一な起始点（start point）を有し、２種のプライマー対は互いにダイマー（dimer）を形成したことが理解できる。同一な起始点はコピー数が同様であることを意味することから、同一の検出限界を有することが理解できた。上記マイクロ−ＰＣＲによる検出限界は１０ＣＦＵ／ｍｌである。
【０１１３】
９−３．黄色ブドウ球菌
実施例７-２における１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、実施例８（２）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。使用したプライマーは配列番号７及び８であり、検体は黄色ブドウ球菌ＫＣＣＭ１９２７であった。
【０１１４】
図１３は、黄色ブドウ球菌の配列番号７及び８に示す１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの場合における、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析を示す。図１３において、１は陽性コントロール群であり、２は配列番号５及び６に示す１種プライマー対を利用したものの結果であり、３は黄色ブドウ球菌１０４ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、４は１０３ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、５は１０２ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、６は１０１ＣＦＵ／ｍｌに対する結果である。上記の検出限界は１０ＣＦＵ／ｍｌである。
【０１１５】
９−４．大腸菌O157
実施例７−２の１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、実施例８（２）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。利用したプライマーは、配列番号１１及び１２であり、検体は大腸菌O157:H7 ＡＴＣＣ１２０２４であった。
【０１１６】
図１４は、大腸菌O157:H7の配列番号：＿及び＿に示す１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの場合における、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析である。図１４において、１は陽性コントロール群であり、２は陰性コントロール群であり、３は大腸菌O157:H7１０４ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、４は１０３ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、５は１０２ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、６は１０１ＣＦＵ／ｍｌに対する結果である。上記の検出限界は１０ＣＦＵ／ｍｌである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】サルモネラ・エンテリティディス（ＫＣＣＭ１２０２１）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図２】黄色ブドウ球菌（ＫＣＣＭ１９２７）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図３】大腸菌O157：H7（ＡＴＣＣ１２０２４）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図４】リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ１９１１２）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図５】腸炎ビブリオ（ＫＣＣＭ１１９６５）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図６】配列番号３及び４で示すサルモネラ属菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果を示す図。
【図７】配列番号７及び８で示す黄色ブドウ球菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果を示す図。
【図８】配列番号１５〜１８で示すリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果を示す図。
【図９】研究室で人為的に汚染させた多様な食品におけるサルモネラ菌検出の電気泳動結果を示す図。
【図１０】配列番号１及び２で示すプライマー対を利用したＰＣＲの結果と、配列番号１〜４で示す２種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの結果の比較を示すグラフ。
【図１１】配列番号１〜４に示す２種のプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【図１２】配列番号３〜４に示すプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【図１３】配列番号７〜８に示すプライマー対を利用した黄色ブドウ球菌のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【図１４】配列番号１１及び１２に示すプライマー対を利用した大腸菌O157:H7のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品媒介病原菌（food-borne pathogen）検出用プライマー、及びこれを利用した食中毒（food poisoning）検出方法に関する。より詳しくは、ＰＣＲプライマーを利用して食中毒の原因になる病原菌を迅速且つ正確に検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食中毒は発熱、吐き気、嘔吐、下痢及び腹痛などの症状を伴う疾患で、細菌が原因となる細菌性食中毒が大部分である。細菌性食中毒はその発病形態に応じて感染型、毒素型に分類される。
【０００３】
感染型食中毒は細菌に汚染された食品を摂取し、細菌が腸管内で増殖することによって引き起こされる。感染型食中毒の主な原因菌は、サルモネラ属菌(Salmonella spp.)、腸炎ビブリオ（ビブリオ・パラヘモリチカス：Vibrio parahaemolyticus）、大腸菌（エシェリキア・コリ：Escherichia coli）O157:H7等である。
【０００４】
毒素型食中毒は食品中で細菌が増殖しながら産生される毒素によって発生する食中毒である。したがって、この場合は、原因菌が食品内で既に死滅した後も、残存する毒素が食中毒を引き起こすことができる。黄色ブドウ球菌(スタフィロコッカス・アウレウス：Staphylococcus aureus)、ボツリヌス菌（Clostridiumbotulinum）等がこれに該当する。
【０００５】
食中毒発生に必要な細菌の数は細菌の種類（タイプ）によって異なる。通常は、１０６〜１０８ＣＦＵ／ｇ以上の細菌が必要である。しかし、大腸菌O157:H7やリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）の場合には、１０〜１０００個の菌数のみでも食中毒を発病させることができる。食中毒を誘発する細菌の種類及び数は下記表１の通りである。
【０００６】
【表１】
【０００７】
食中毒は、団体給食及び外食機会の増加などの食生活パターン変化と、地球温暖化及び室内温度上昇などの環境的変化によって食中毒の発生が増加し、そして、集団発生として大規模に生ずる傾向がある。食中毒を早期に予防するための食中毒を引き起こす病原菌を検出する方法の開発が早急に要求されている。
【０００８】
現在使用されるサルモネラ属菌の検出方法は、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）で先行培養し、細菌を選択培地で培養する１次検証工程と、生化学的、血清学的分析の２次検証工程を有し、通常、病原菌の同定に約５日から６日かかる。また、迅速な検出のため利用されるＰＣＲ方法は、これも分析可能な病原菌量をサンプルの培養によって得なければならず、検出には一日以上かかる。
【０００９】
病原菌の培養過程を必要としない、食中毒を引き起こす病原体の迅速な検出方法の開発が、早急に要求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記従来技術の問題を解決するため、本発明の目的は、人において食中毒を起こす病原菌の特異的な遺伝子を選択的に増幅するプライマーを提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、人において食中毒を起こす病原菌に対して、高い検出精度（detection accuracy）及び特異性をもつ２対のプライマーを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、人において食中毒を起こす病原性菌の特異的な遺伝子を選択的に増幅するプライマーでのＰＣＲ反応を利用することによって、病原菌を正確に検出し、診断時間を４日〜６日から約１２時間に短縮することである。
【００１３】
また、本発明の別の目的は、人において食中毒を起こす病原性微生物の特異遺伝子を選択的に増幅するプライマーでのＰＣＲ反応を利用することによって、短時間内に正確に病原菌を検出するキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的を達成するため、本発明は、下記１）〜５）のプライマー対からなる群より選択された１種以上の病原菌検出ためのプライマー対を提供する：
１）配列番号３及び４のプライマーを含むサルモネラ属菌検出用プライマー対；
２）配列番号７及び８のプライマーを含む黄色ブドウ球菌検出用プライマー対；
３）配列番号１１又は１３、及び配列番号１２又は１４のプライマーを含む大腸菌O157:H7検出用プライマー対；
４）配列番号１７及び１８のプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対；及び、
５）配列番号２１又は２３、及び配列番号２２又は２４のプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対。
【００１５】
さらに、本発明は、５種類の病原菌の特異的な遺伝子を増幅できる前記１）〜５）のプライマー対からなる群より選択された１種以上の病原菌検出のためのプライマー対を利用したＰＣＲでの病原菌検出のための方法に提供するものである。
【００１６】
さらに、前記ＰＣＲで病原菌を検出する方法において、本発明は、下記６）〜１０）のプライマー対からなる群より選択された１種以上の追加的なプライマー対を使用することができる：
６）配列番号１及び配列番号２のプライマーを含むサルモネラ属菌検出用プライマー対；
７）配列番号５及び配列番号６のプライマーを含む黄色ブドウ球菌検出用プライマー対；
８）配列番号９及び配列番号１０のプライマーを含む大腸菌O157：H7検出用プライマー対；
９）配列番号１５及び配列番号１６のプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対；及び
１０）配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対。
【００１７】
前記追加的なプライマー対は、ネステッドＰＣＲの第１ラウンドの増幅時に使用され、そして高いＰＣＲ効率で病原菌の検出限界を顕著に増進させる。前記追加的なプライマー対を利用したネステッドＰＣＲの場合、ＰＣＲを２段階で実施することができるか、又は前記２段階で使用されるプライマー対２種を同時に使用して１段階で実施することができる。
【００１８】
さらに、本発明は、病原菌検出用ＰＣＲプライマー、反応緩衝液及びTaq DNAポリメラーゼを含む、ＰＣＲによって病原菌を検出するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００１９】
以上のように、本発明の病原菌検出用プライマー対は、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌 、大腸菌O157、リステリア・モノサイトゲネス及び腸炎ビブリオの特異的な遺伝子を短時間に、正確に増幅させ、１００〜１０ＣＦＵ／ｍｌの検出限界を有する。したがって、前記プライマー対を利用して、５時間以内に感染の発生の急速な疫学調査を実行することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図面の簡単な説明
図１は、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）（ＫＣＣＭ１２０２１）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図２は、黄色ブドウ球菌（ＫＣＣＭ１９２７）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図３は、大腸菌O157：H7（ＡＴＣＣ１２０２４）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図４は、リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ１９１１２）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図５は、腸炎ビブリオ（ＫＣＣＭ１１９６５）のネステッドＰＣＲの電気泳動の結果である。
図６は、配列番号３及び４で示すサルモネラ属菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果である。
図７は、配列番号７及び８で示す黄色ブドウ球菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果である。
図８は、配列番号１５〜１８で示すリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果である。
図９は、研究室で人為的に汚染させた多様な食品におけるサルモネラ菌（Salmonella）検出の電気泳動結果である。
図１０は、配列番号１及び２で示すプライマー対を利用したＰＣＲの結果と、配列番号１〜４で示す２種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの結果の比較である。
図１１は、配列番号１〜４に示す２種のプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのネステッドＰＣＲの電気泳動結果である。
図１２は、配列番号３〜４に示すプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果である。
図１３は、配列番号７〜８に示すプライマー対を利用した黄色ブドウ球菌のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果である。
図１４は、配列番号１１及び１２に示すプライマー対を利用した大腸菌O157:H7のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果である。
【００２１】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００２２】
本発明は、食中毒を誘発する病原菌の検出方法に関する。前記病原菌は、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌O157:H7、リステリア・モノサイトゲネス、及び、腸炎ビブリオからなる群から選択される１種とすることができる。
【００２３】
本発明は、前記病原菌の特異的な遺伝子を検出するために病原菌の特異的な遺伝子を増幅するためのプライマー対を提供する。
【００２４】
本発明のプライマー対は、５種の病原菌の特異的な遺伝子を、異なるヌクレオチドサイズで同時に検出することができる。具体的な例は次の通りであり、配列は表２に記載されている。本発明のプライマー対は、広く知られたＰＣＲ法、例えば、ネステッドＰＣＲ又はマイクロ−ＰＣＲにおいて使用可能である。
【００２５】
【表２】
【００２６】
サルモネラ属菌検出用プライマー対は、配列番号３及び４に示されたプライマー対からなり、そしてサルモネラ属菌に特異的な遺伝子産物の約２００塩基対を増幅する。ネステッドＰＣＲの場合、配列番号１及び２のプライマーを含むサルモネラ属菌に対する公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時にＰＣＲ反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記サルモネラ属菌検出用プライマー対と反応させることができる。前記配列番号１及び２を含むプライマー対は、約６７８塩基対の特異的な遺伝子を増幅する。
【００２７】
配列番号７及び８で示す黄色ブドウ球菌検出用プライマー対は、黄色ブドウ球菌に特異的な約１３６塩基対の遺伝子産物をする。ネステッドＰＣＲに対して、配列番号５及び６のプライマーを含む黄色ブドウ球菌に対する公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記黄色ブドウ球菌検出用プライマー対と反応させることができる。前記配列番号５及び６を含むプライマー対は、特異的な遺伝子の約６７８塩基対を増幅する。
【００２８】
大腸菌O157検出用プライマー対は、配列番号１１又は１３に示すセンスプライマー、及び配列番号１２又は１４に示すアンチセンスプライマーからなる、例えば、大腸菌O157検出用プライマー対は、大腸菌O157に特異的な遺伝子の約１０８ｂｐを増幅する配列番号１１及び１２に示すプライマーを含み、そして、大腸菌O157に特異的な遺伝子の約１２９ｂｐを増幅する配列番号１３及び１４に示すプライマーを含む。
【００２９】
ネステッドＰＣＲに対して、配列番号９及び１０を含む公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記大腸菌O157検出用プライマー対と反応させることができる。配列番号９及び１０に示すプライマー対は、特異的な遺伝子の約２０８塩基対を増幅する。
【００３０】
配列番号１７及び１８に示すリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な遺伝子の約１９１塩基対を増幅する。
【００３１】
ネステッドＰＣＲに対して、配列番号１５及び１６を含むリステリア・モノサイトゲネス検出用の公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記リステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対と反応させることができる。配列番号１５及び１６に示すプライマー対は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な遺伝子の約４５４塩基対を増幅する。
【００３２】
腸炎ビブリオ検出用プライマー対は、配列番号２１又は２３に示すセンスプライマー、及び配列番号２２又は２４に示すアンチセンスプライマーからなる。例えば、腸炎ビブリオ検出用プライマー対は、腸炎ビブリオに特異的な遺伝子の約２１９ｂｐを増幅する配列番号２１及び２２に示すプライマーを含み、そして、腸炎ビブリオに特異的な遺伝子の約１５３ｂｐを増幅する配列番号２３及び２４に示すプライマーを含む。
【００３３】
ネステッドＰＣＲに対して、配列番号１９及び２０を含む腸炎ビブリオ検出用の公知のプライマー対を、上記プライマー対と同時に反応させることができ、又は増幅の第１ラウンドにおいて反応させ、そして第２ラウンドにおいて産物を上記腸炎ビブリオ検出用プライマー対と反応させることができる。配列番号１９及び２０に示すプライマー対は、腸炎ビブリオに特異的な遺伝子の約６７８塩基対を増幅する。
【００３４】
本発明の検出方法は、前記１種の病原菌に対するＰＣＲプライマー対を利用して、それぞれの病原菌を検出するのみでなく、前記２種以上の病原菌を２種以上のＰＣＲプライマー対を利用してマルチプレックスＰＣＲを通して検出することができ、前記５種の病原菌を１度に迅速且つ正確に検出することができる。
【００３５】
本発明の検出方法のＰＣＲ反応条件は、ＰＣＲの様々な種類（例えば、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、マイクロ−ＰＣＲ、シングルＰＣＲ）における一般的なＰＣＲ反応条件、又はその一部変形とすることでき、これは本願発明が属する技術分野における当業者であれば、容易に予測できる範疇に該当する。
【００３６】
前記ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲの感度を高めるために一次ＰＣＲ内にインナープライマー（internal primer）を利用する２段階のＰＣＲ反応である。最初に、一次プライマーと、サンプルからの鋳型ＤＮＡを利用して１次ＰＣＲ反応を行う。前記反応産物と内部プライマー（inner primer）での２次ＰＣＲ反応が、検出感度を増加させる遺伝子増幅法を提供し、そして、PCR Primer，A Laboratory Manual，2ndedition、p65に詳しく記載されている。
【００３７】
小型ＰＣＲ用チップを利用する前記マイクロ−ＰＣＲは、チップ上に、鋳型ＤＮＡとインナープライマーのみ含む２０μl反応組成物を作製することができ、ここで、１μlを取ってシリコンチップに注入したものである。少量の反応組成物を使用するという点及びモニタリングが容易である点の長所がある。前記チップを、ＴＭＣ−１０００モジュールにマウントさせ、そして、ＤＮＡ増幅を、ＰＣＲ反応中にリアルタイムでモニターする。マイクロ−ＰＣＲ ＴＭＣ-１０００（登録商標）（三星テクウィンによって製造されたＰＣＲ装置）が市販の装置の例である。
【００３８】
ＰＣＲは、通常のサーマルブロックＰＣＲ（thermal block PCR）又はマイクロ−ＰＣＲ装置を利用して実施できるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の検出方法は、前述の病原菌が発見される全ての物質を対象として実施することができ、好ましくは食品または飼料に対して実施できる。例えば、病原菌の汚染が疑われる試料を、滅菌水又は０．８５％の生理食塩水に懸濁した後、プロテイナーゼＫで処理する。ペレットを回収した後、熱抽出（heat extract）してＰＣＲ試料を調製し、ＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲ結果は、一般的なＰＣＲ検出方法、例えば、電気泳動等によって、分析される。前記熱抽出は、一般的なＤＮＡ分離方法、例えば、前記ペレットを滅菌水に懸濁させ、そしてフェノール／クロロホルム（１：１容積混合物）混合液を処理した後、上層を収得しエタノールと混合した後、遠心分離してＤＮＡペレットを収得するものである。具体的な反応条件及び時間は通常の通りである。
【００４０】
本発明による検出方法は、病原菌を特異的且つ効率的に検出することができ、そしてネステッドＰＣＲは病原菌の検出限界を顕著に向上させる。特に、検出限界１０５ＣＦＵ／ｍｌを１００〜１０ＣＦＵ／ｍｌに増進させる。
【００４１】
また、本発明は、１種以上の病原菌を検出するためのプライマー対を含む病原菌検出キットを提供する。病原菌検出キットは、ＰＣＲ微生物検出キットの通常の構成成分（反応緩衝液、Taq DNAポリメラーゼ、標識物質等）含み、そしてプライマー７対（配列番号３〜４、７〜８、１１〜１４、１７〜１８、２１〜２４）を含む。
【００４２】
本発明の好ましい一実施例において、検出キットは以下を含む；
（１）配列番号３〜４、配列番号７〜８、配列番号１１〜１４、配列番号１７〜１８、及び配列番号２１〜２４に示すプラマーから構成される群から選択される１種以上のプライマー対を含むプライマーセット
（２）反応緩衝液
（３）Taq DNAポリメラーゼ。
【００４３】
また、前記検出キットは、配列番号１〜２、配列番号５〜６、配列番号９〜１０、配列番号１５〜１６及び配列番号１９〜２０に示すプライマーからなる群から選択される１種以上のプライマー対を更に含む。
【００４４】
本発明の好ましい一実施例において、検出キットは以下を含む；
（１）配列番号３〜４、配列番号７〜８、配列番号１１〜１４、配列番号１７〜１８、及び配列番号２１〜２４に示すプライマーからなる群から選択される１種以上のプライマー対を含むプライマーセット;
（２）（Taq DNAポリメラーゼ、ＳＹＢＲグリーンを含む、４ＸグリーンスターＰＣＲマスターミックス（4X Greenstar PCR Master Mix）
（３）コントロールＤＮＡ、及び
（４）１０ｍＭのＭｇＣｌ２。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の実施例を記載する。下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるわけではない。
【００４６】
実施例１：５種の病原菌の特異的DNAを増幅するためのＰＣＲプライマーの設計及び調製
サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌O157、リステリア・モノサイトゲネス及び腸炎ビブリオを同時に検出するため、前記表２にリストされたプライマーを設計及び合成した。
【００４７】
実施例２：ネステッドＰＣＲ
２−１．サルモネラ属菌
１０８〜１ＣＦＵ／ｍｌのサルモネラ・エンテリティディス（ＫＣＣＭ１２０２１）１ｍｌにプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）２０μｌを添加し、６０℃で１０分間反応させた。反応完了後、反応産物を１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを取得し、２００μｌの滅菌水中で懸濁させた。これを、１０５℃で２０分間加熱し、同一体積のフェノール／クロロホルムで混合し、そして、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を取得した。上澄液に同一体積のエタノールと混合し、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを回収した後、ペレットに２０ｕＬの滅菌水を加えてＰＣＲ試料を調製した。
【００４８】
ＰＣＲを２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したＰＣＲを実施し、一方、他の群は、配列番号１及び２に示すプライマ対でのＰＣＲからの反応産物が、配列番号３及び４に示す追加のプライマー対での第２ラウンドのＰＣＲを実施するのに使われた。２つの群のＰＣＲ反応条件は、その他の面では同一であり、次の通りである。
【００４９】
＜ＰＣＲ条件＞
９４℃、５分−＞（９４℃、３０秒−＞６０℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、３５サイクル−＞７２℃、５分。
【００５０】
【表３】
【００５１】
図１は、サルモネラ・エンテリティディスのＰＣＲ結果を示す。レーン１〜１０は、配列番号１及び２に示すプライマーセットに相当し、及び、レーン１１〜２０は、配列番号１〜４に示すプライマー２対を利用するネステッドＰＣＲに相当する。各レーンにおけるサルモネラ・エンテリティディス濃度は以下の通りである；
レーン１及び１１：１０８ＣＦＵ／ｍｌ レーン２及び１２：１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３及び１３：１０６ＣＦＵ／ｍｌ レーン４及び１４：１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５及び１５：１０４ＣＦＵ／ｍｌ レーン６及び１６：１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７及び１７：１０２ＣＦＵ／ｍｌ レーン８及び１８：１０ＣＦＵ／ｍｌ
レーン９及び１９：１ ＣＦＵ／ｍｌ レーン１０及び２０：サルモネラ菌ＤＮＡ１０ｎｇ
【００５２】
図１のネステッドＰＣＲは６７８ｂｐ及び２００ｂｐの増幅産物を示し、そして、配列番号１及び２に示すプライマーセットを利用するＰＣＲ結果を比較した改善された検出限界が分かる。つまり、サルモネラ・エンテリティディスに対する配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したＰＣＲの結果では、１０８ＣＦＵ／ｍｌでのみ６７８ｂｐの増幅産物を確認できるが、配列番号１及び２に示すプライマー対での反応からのＰＣＲ産物の更なる増幅をすべく、配列番号３及び４のプライマー対を利用したネステッドＰＣＲ結果では、１０ＣＦＵ／ｍｌにおいて２００ｂｐの増幅産物を検出することができる。
【００５３】
２−２．黄色ブドウ球菌
黄色ブドウ球菌（ＫＣＣＭ１９２７）の１０７〜１ＣＦＵ／ｍｌを調製し、前記２−１と同様な方法でＤＮＡを抽出した。
【００５４】
ＰＣＲは、２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号５及び６に示すプライマー対でＰＣＲを実施した。他の群について、反応は、配列番号５〜８に示す全てのプライマーをＰＣＲ反応組成物に混合して実施した。２群のＰＣＲのＰＣＲ条件は、その他は同じであり、そして、ＰＣＲ反応条件及び組成物は前記２-１のようにした。
【００５５】
図２は、黄色ブドウ球菌に対するＰＣＲ結果を示す。レーン１〜８は、配列番号５及び６に示すプライマーセットに相当し、レーン９〜１６は、配列番号５〜８に示す２対のプライマーを利用するネステッドＰＣＲに相当する。各レーンにおける、黄色ブドウ球菌の濃度は次の通りであった；
レーン１及び９：１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２及び１０：１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３及び１１：１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４及び１２：１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５及び１３：１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６及び１４：１０２ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７及び１５：１０ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８及び１６：１ＣＦＵ／ｍｌ
【００５６】
図２に、配列番号５〜６に示すプライマー対でのＰＣＲの検出限界が約１０６ＣＦＵ／ｍｌであるが、一方、配列番号７及び８に示す更なるプライマー対がネステッドＰＣＲにおいて使用された時、検出限界が１０２ＣＦＵ／ｍｌに顕著に向上することを示す。レーン１５と１６において、ＲＮＡバンドのみが検出された。
【００５７】
２−３．大腸菌O157
大腸菌O157:H7 ＡＴＣＣ１２０２４の４×１０８〜１ＣＦＵ／ｍｌを調製し、そして前記２−１．と同様な方法でＤＮＡを抽出した。
【００５８】
ＰＣＲ反応は、２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号９及び１０で示すプライマー対を使用するＰＣＲを実施した。他の群について、配列番号９〜１２、又は配列番号９〜１０及び１３〜１４に示すプライマー対を利用したネステッドＰＣＲを実施した。２群のＰＣＲの反応条件は、その他は同じであった。ＰＣＲ反応条件及び反応組成物は前記２−１のようにした。
【００５９】
大腸菌O157:H7に対するＰＣＲ結果を図３に示す。
【００６０】
配列番号９及び１０に示すプライマーセットのＰＣＲ結果をレーン１〜９に示す、そして、配列番号９〜１２に示すプライマー２対を利用するネステッドＰＣＲの結果をレーン９〜１８に示し、そして、配列番号９〜１０及び１３〜１４に示すプライマー２対を利用するネステッドＰＣＲの結果をレーン１９〜２７に示す。大腸菌O157:H7濃度は以下の通りである；
レーン１、１０及び１９：４ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２、１１及び２０：４ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３、１２及び２１：４ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４、１３及び２２：４ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５、１４及び２３：４ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６、１５及び２４：４ｘ１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７、１６及び２５：４ｘ１００ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８、１７及び２６：４ｘ１０ＣＦＵ／ｍＬ
レーン９、１８及び２７：４ｘ１ＣＦＵ／ｍｌ
【００６１】
図３は、配列番号９及び１０に示すプライマー対を利用してＰＣＲを実施した場合（レーン１〜９）の、レーン１の２０８ｂｐのＤＮＡバンドが、検出限界が約１０８ＣＦＵ／ｍｌであることを確認することを示す。これに反し、配列番号１１及び１２に示すプライマー対を利用するネステッドＰＣＲ（レーン１０〜１８）が、レーン１０〜１７における１２９ｂｐのＤＮＡバンドを検出する。したがって、検出限界が顕著に向上する。配列番号１３及び１４に示すプライマー対を利用するネステッドＰＣＲ（レーン１９〜２７）は、レーン１９〜２５において１０８ｂｐのＤＮＡバンドを検出し、そして検出限界が１０２ＣＦＵ／ｍｌであることを示す。
【００６２】
２−４．リステリア・モノサイトゲネス
リステリア・モノサイトゲネス ＡＴＣＣ１９１１２の１．１ｘ１０９〜１ＣＦＵ／ｍｌを調製した後、前記２−１と同様な方法でＤＮＡを抽出した。
【００６３】
ＰＣＲは２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号１５及び１６に示すプライマー対を利用したＰＣＲを実施した。他の群について、配列番号１７及び１８に示すプライマー対を利用したネステッドＰＣＲを実施した。２群の反応条件は、その他は同じであった。ＰＣＲ反応条件及び反応組成物は前記２−１のようにした。
【００６４】
リステリア・モノサイトゲネスに対するＰＣＲ結果を図４に示す。
【００６５】
配列番号１５及び１６に示すプライマーセットでのＰＣＲ結果を、レーン１〜１０に示し、そして、配列番号１７及び１８に示すプライマー対のネステッドＰＣＲをレーン１１〜２０に示す。リステリア・モノサイトゲネス濃度は以下の通りである；
レーン１及び１１：リステリア・モノサイトゲネス１．１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２及び１２：１．１ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３及び１３：１．１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４及び１４：１．１ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５及び１５：１．１ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６及び１６：１．１ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７及び１７：１．１ｘ１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８及び１８：１．１ｘ１００ＣＦＵ／ｍｌ
レーン９及び１９：１．１ｘ１０ＣＦＵ／ｍＬ
レーン１０及び２０：１．１ｘ１ＣＦＵ／ｍｌ。
【００６６】
図４において、配列番号１５及び１６に示すプライマー対を利用したＰＣＲ（レーン１〜１０）は、４５４ｂｐの増幅産物を検出し、配列番号１７及び１８に示すプライマー対をさらに利用したネステッドＰＣＲ（レーン１１〜２０）では、４５４ｂｐ及び１９１ｂｐの増幅産物を検出した。しかしながら、ネステッドＰＣＲが低濃度のリステリア・モノサイトゲネス検出により有用であった。
【００６７】
２−５．腸炎ビブリオ
２．１ｘ１０１０〜１ＣＦＵ／ｍｌの腸炎ビブリオＫＣＣＭ１１９６５を調製した後、前記２−１と同様にＤＮＡを抽出した。
【００６８】
ＰＣＲは、２群で実施した。つまり、１つの群は、配列番号１９及び２０で示すプライマー対を使用するＰＣＲを実施した。他の群について、配列番号１９〜２２、又は配列番号１９〜２０及び２３〜２４に示すプライマー対を利用したネステッドＰＣＲを実施した。２群の反応条件は、その他は同じであった。ＰＣＲ反応条件及び反応組成物は前記２−１のようにした。
【００６９】
腸炎ビブリオに対するＰＣＲ結果を図５に示す。
【００７０】
配列番号１９及び２０に示すプライマーセットを使用するＰＣＲ結果を、レーン１〜１１に示し、そして、配列番号１９〜２２の２対のプライマーを使用するネステッドＰＣＲをレーン１２〜２２に示し、配列番号１９〜２０及び２３〜２４に示す２対のプライマーを使用するネステッドＰＣＲをレーン２３〜３３に示す。腸炎ビブリオの濃度は以下の通りである；
レーン１、１２及び２３：腸炎ビブリオ２．１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌ
レーン２、１３及び２４：２．１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌ
レーン３、１４及び２５：２．１ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ
レーン４、１５及び２６：２．１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ
レーン５、１６及び２７：２．１ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌ
レーン６、１７及び２８：２．１ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン７、１８及び２９：２．１ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８、１９及び３０：２．１ｘ１０３ＣＦＵ／ｍｌ
レーン９、２０及び３１：２．１ｘ１００ＣＦＵ／ｍｌ
レーン１０、２１及び３２：２．１ｘ１０ＣＦＵ／ｍＬ
レーン１１、２２及び３３：２．１ｘ１ＣＦＵ／ｍｌ。
【００７１】
図５において、腸炎ビブリオ ＫＣＣＭ１１９６５に対する配列番号１９及び２０に示すプライマー対を利用したＰＣＲは、レーン１〜３のみにおいて３７５ｂｐの増幅産物を示す。配列番号１９及び２０に示すプライマー対を利用するＰＣＲの場合には、検出限界が約１０８ＣＦＵ／ｍｌであることを示す。また、配列番号１９及び２０に示すプライマー対を使用したものからの増幅産物を、さらに配列番号２１及び２２に示すプライマー対を利用するネステッドＰＣＲの結果は、レーン１２〜２２において２１９ｂｐの増幅産物が示された。また、配列番号２３及び２４のプライマー対を更に利用したネステッドＰＣＲは、レーン２３〜３３において１５３ｂｐの増幅産物を検出した。
【００７２】
したがって、本発明のプライマー対を利用したネステッドＰＣＲは、１０〜１ＣＦＵ／ｍｌの濃度で病原菌を検出でき、検出限界が非常に優れていた。
【００７３】
実施例３：プライマーの検証
実施例１におけるプライマー対の病原菌特異性を検証するために、病原菌に類似する微生物ＤＮＡに対してＰＣＲを実施した。
【００７４】
３−１．配列番号３及び４に示すプライマー対
図６は、サルモネラ属菌検出用の配列番号３及び４に示すプライマでネステッドＰＣＲを実行して得られた結果であり、レーンについては下記で説明するが、ここで、レーンＭはサイズマーカーである。
【００７５】
図６において、レーン１〜８、１３〜１４、３０及び３４において約２００ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。したがって、配列番号３及び４に示すプライマー対はサルモネラ属菌株を特異的に検出できることが理解された。
【００７６】
【表４−１】
【表４−２】
【００７７】
３−２．配列番号７及び８のプライマー対
図７は、黄色ブドウ球菌検出用のための配列番号７及び８に示すプライマーでのネステッドＰＣＲを実施して得られた結果であり、そして、レーンについては下記に説明するが、ここで、レーンＭはサイズマーカーである。
【００７８】
【表５−１】
【表５−２】
【００７９】
図７において、レーン１２〜１５において黄色ブドウ球菌のみが検出され、これは、配列番号７及び８に示すプライマー対は黄色ブドウ球菌を特異的に検出できることを意味する。
【００８０】
３−３．配列番号１７及び１８に示すプライマー対
図８は、リステリア・モノサイトゲネス検出用の配列番号１７及び１８に示すプライマーでのネステッドＰＣＲを実行することによって得られた結果であり、レーンについては下記で説明するが、レーンＭはサイズマーカーである。
【００８１】
図８は、レーン１７〜２６において、配列番号１７及び１８のプライマー対によって増幅された４５４ｂｐ及び／又は１９１ｂｐを示す。
【００８２】
【表６】
【００８３】
実施例４：ＰＣＲ検出キット
【００８４】
【表７】
【００８５】
実施例５：食品における食品媒介細菌の検出
人為的に汚染された食品の培養液を対象として前記実施例４−１における検出キットを使用してＰＣＲを実施した。
【００８６】
４種類の食品（サンドイッチ、ハンバーガー、酢豚、飛子）の各２５ｇの検体を、ＬＢ（Luria Burtani）培地２２５ｍｌに接種し、３７℃、８０ｒｐｍで１６時間培養した。培養液１ｍｌに対して、配列番号１及び２に示すプライマー対を利用してＰＣＲを行い、サルモネラ菌の存在しないことを確認した後、残余の培養液を滅菌した。滅菌された培養液９ｍｌに約１０８ＣＦＵ／ｍｌのネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３を添加した後、連続希釈して１〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの検体を製造した。
【００８７】
検体１ｍｌに、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μlを添加した後、６０℃で１０分間培養した。反応産物を１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ペレットを得て、そして、２００μlの滅菌水中で懸濁した。これを、１０５℃で２０分間加熱し、同一体積のフェノール／クロロホルム混合液と混合し、その後、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を得た。前記上澄液を、同一体積のエタノールと混合し、そして、１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離をしてペレットを回収した後、前記ペレットに２０μlの滅菌水を添加してＰＣＲ試料ＤＮＡを調製した。
【００８８】
ＰＣＲは、バイオメトラ Ｔ−パーソナル サーマル ＰＣＲ装置（Biometra T-personal Thermal PCR Machine）で実施した。
【００８９】
＜ＰＣＲ条件＞
９４℃、５分−＞１次（９４℃、３０秒−＞６０℃、１５０秒−＞７２℃、３０秒）、５タイムサイクル−＞２次（８８℃、３０秒−＞６０℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、１５タイムサイクル）−＞３次（８８℃、３０秒−＞５４℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、１０タイムサイクル）−＞４次（８６℃、３０秒−＞５４℃、３０秒−＞７２℃、３０秒）、２５タイム−＞７２℃、１０分
【００９０】
図９は、ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３に汚染された食品に対する配列番号１〜４に示す２対のプライマー対でのネステッドＰＣＲを実施することにより得られた結果であり、そしてレーンは下記に説明するが、レーンＭはサイズマーカーである。
【００９１】
１：サルモネラ属菌のＤＮＡ１０ｎｇ、配列番号１及び２に示すプライマー対を利用するＰＣＲ
２：陰性コントロール群（ＤＮＡ含まない）
３：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０５ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
４：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
５：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
６：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
７：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-飛子
８：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０５ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
９：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１０：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１１：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１２：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-酢豚
１３：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１４：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１５：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１６：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-ハンバーガー
１７：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０５ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
１８：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０４ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
１９：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０３ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
２０：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０２ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
２１：ネズミチフス菌 ＡＴＣＣ１４０２３、１０１ＣＦＵ／ｍｌ-サンドイッチ
【００９２】
図９において、レーン３〜２１は、配列番号３及び４に示すプライマー対を使用して２００ｂｐのＤＮＡの増幅による１０ＣＦＵ／ｍｌまでの検出を示す。
【００９３】
実施例６：マイクロ−ＰＣＲ
６−１．配列番号３〜４のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ
１０８ＣＦＵ／ｍＬのサルモネラ・エンテリティディス ＫＣＣＭ１２０２１を対象としてＴＭＣ-１０００（登録商標）（三星テクウィン）を利用してマイクロ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは２群で実施した。１つの群は配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したＰＣＲを実施した。他の群は、配列番号１〜４の２対のプライマーを利用した。
【００９４】
マイクロ−ＰＣＲ条件は以下の通りである。
９４℃、１０分−＞（９４℃、５秒−＞６０℃、５秒−＞７２℃、５秒）１００タイムサイクル−＞７２℃、５分
【００９５】
図１０は、サルモネラ・エンテリティディスＫＣＣＭ１２０２１に対してマイクロ−ＰＣＲを実施することにより得られた結果である。１は配列番号１〜４に示す２対のプライマーを利用したものであり、２は配列番号１及び２に示すプライマー対を利用したものである。右側のグラフは、融解曲線（melting curve）であり、Ｔｍ値を算出することができる。Ｔｍ値は、２本鎖及び一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０％存在する温度である。この時点でのシグナルを平均して標準定量曲線を作成できる。
【００９６】
図１０において、１のＣＴ（Cycle Time）値がライン２のそれより早いが、それは、配列番号３及び４に示すプライマー対を利用するＰＣＲが効率的であることが理解できる。
【００９７】
実施例７：マイクロ−ＰＣＲ検出キット
７−１．２種のプライマー対を含む検出キット
４Ｘグリーンスター------------------------５μl
１０ｍＭのＭｇＣｌ２-----------------------１μl
プライマー混合液（各０．２ｕＭ／μl）------８μl
試料ＤＮＡ（＜５００ｎｇ）----------------６μl
全体積------------------------------------２０μl
【００９８】
７−２．１種のプライマー対を含む検出キット
４Ｘグリーンスター-------------------------５μl
１０ｍＭのＭｇＣｌ２------------------------１μl
プライマー混合液（０．２ｕＭ／μl）---------４μl
試料ＤＮＡ（＜５００ｎｇ）
ヌクレアーゼ未含有水-----------------------２０μlに（up to 20μl）
前記プライマー混合液は、場合によって表８及び９からなる。
【００９９】
【表８】
【０１００】
【表９】
【０１０１】
実施例８：マイクロ−ＰＣＲ検出キットを利用した食中毒を引き起こす病原菌の検出
８−１．試料の調製
サルモネラ菌に汚染されたことが疑われる食品２５ｇを測定し、そして、１００ｍｌの滅菌水を添加して紛砕機で微粉砕した。微粉砕物を濾紙を通して濾過し濾液を得て、１ｍｌの濾液（２０ｍｇ／ｍｌ）に２０μｌのプロテイナーゼＫを添加し、６０℃で１０分間インキュベートした。反応産物を１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットを取得した後、２００μlの滅菌水に懸濁した。これを、１０５℃で２０分間熱処理した後、同一体積のフェノール／クロロホルムと混合し、そして１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を回収した。上澄液を同一体積のエタノールと混合し、そして１０，０００ｇ ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを回収した後、ペレットに２０μlの滅菌水を添加してＰＣＲサンプルＤＮＡを調製した。
【０１０２】
８−２．マイクロ−ＰＣＲ条件
実施例７に記載された検出キット組成物を利用してＰＣＲ反応混合物を製造した後、混合物の１μlを三星総合技術院（SAMSUNG ADVANCED INSTITUTE OF TECHNOLOGY）にて製造されたゲンスペクターマイクロチップ（Genespector Micro chip）に気泡が形成されないように注入して密封した。
【０１０３】
ＰＣＲを前記チップ上でゲンスペクターマイクロ−ＰＣＲ機器を使用して以下のように実行した。
【０１０４】
（１）１種の病原菌に対して２種のプライマーセットを使用したネステッドＰＣＲ
【０１０５】
【表１０】
【０１０６】
（２）１種の病原菌に対して１種のプライマーセットを使用したＰＣＲ
− 初期変性（９４℃で１０分間）−＞変性（９４℃で５秒）、アニーリング（６０℃で５秒）、伸長（７２℃で５秒）を全１００タイム
【０１０７】
前記ＰＣＲ反応終了後、溶融曲線分析を下記条件で行う。
− 初期温度：６０℃
− 最終温度：９０℃
− ランプ レート（Ramp Rate）速度：℃／sec
− 出口温度：４０℃
【０１０８】
実施例９：マイクロ−ＰＣＲの検出限界の検証
９−１．サルモネラ属菌
【０１０９】
実施例７−１の２種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、実施例８（１）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。利用したプライマーは、配列番号１〜４であり、そして、検体はサルモネラ・エンテリティディス ＫＣＣＭ１２０２１であった。
【０１１０】
図１１は、サルモネラ・エンテリティディスの配列番号１〜４に示す２種プライマー対を利用したネステッドＰＣＲの場合において、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析を示す。図１１において、１はサルモネラ・エンテリティディスの１０７ＣＦＵ／ｍｌに対する結果である。２は１０ＣＦＵ／ｍｌに対する結果、そして３は陰性コントロール群である。
【０１１１】
９−２．サルモネラ属菌
実施例７-２の１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、そして実施例８（２）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。使用したプライマーは、配列番号３及び４であり、そして検体はサルモネラ・エンテリティディス ＫＣＣＭ１２０２１であった。
【０１１２】
図１２は、サルモネラ・エンテリティディスの配列番号３及び４に示す１種プライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの場合における、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析を示す。図１２において、４はサルモネラ・エンテリティディスの１０３ＣＦＵ／ｍｌの結果であり、３は１０２ＣＦＵ／ｍｌの結果であり、２は１０１ＣＦＵ／ｍｌの結果であり、１は配列番号１〜４の２種プライマー対を使用した結果である。図１２における２、３及び４は、同一な起始点（start point）を有し、２種のプライマー対は互いにダイマー（dimer）を形成したことが理解できる。同一な起始点はコピー数が同様であることを意味することから、同一の検出限界を有することが理解できた。上記マイクロ−ＰＣＲによる検出限界は１０ＣＦＵ／ｍｌである。
【０１１３】
９−３．黄色ブドウ球菌
実施例７-２における１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、実施例８（２）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。使用したプライマーは配列番号７及び８であり、検体は黄色ブドウ球菌ＫＣＣＭ１９２７であった。
【０１１４】
図１３は、黄色ブドウ球菌の配列番号７及び８に示す１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの場合における、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析を示す。図１３において、１は陽性コントロール群であり、２は配列番号５及び６に示す１種プライマー対を利用したものの結果であり、３は黄色ブドウ球菌１０４ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、４は１０３ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、５は１０２ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、６は１０１ＣＦＵ／ｍｌに対する結果である。上記の検出限界は１０ＣＦＵ／ｍｌである。
【０１１５】
９−４．大腸菌O157
実施例７−２の１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲ組成物を調製し、実施例８（２）の条件でマイクロ−ＰＣＲを実施した。利用したプライマーは、配列番号１１及び１２であり、検体は大腸菌O157:H7 ＡＴＣＣ１２０２４であった。
【０１１６】
図１４は、大腸菌O157:H7の配列番号：＿及び＿に示す１種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの場合における、サルモネラ菌の様々な濃度に応じた検出限界の分析である。図１４において、１は陽性コントロール群であり、２は陰性コントロール群であり、３は大腸菌O157:H7１０４ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、４は１０３ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、５は１０２ＣＦＵ／ｍｌに対する結果であり、６は１０１ＣＦＵ／ｍｌに対する結果である。上記の検出限界は１０ＣＦＵ／ｍｌである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】サルモネラ・エンテリティディス（ＫＣＣＭ１２０２１）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図２】黄色ブドウ球菌（ＫＣＣＭ１９２７）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図３】大腸菌O157：H7（ＡＴＣＣ１２０２４）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図４】リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ１９１１２）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図５】腸炎ビブリオ（ＫＣＣＭ１１９６５）のネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示す図。
【図６】配列番号３及び４で示すサルモネラ属菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果を示す図。
【図７】配列番号７及び８で示す黄色ブドウ球菌検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果を示す図。
【図８】配列番号１５〜１８で示すリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対の反応特異性を示す電気泳動結果を示す図。
【図９】研究室で人為的に汚染させた多様な食品におけるサルモネラ菌検出の電気泳動結果を示す図。
【図１０】配列番号１及び２で示すプライマー対を利用したＰＣＲの結果と、配列番号１〜４で示す２種のプライマー対を利用したマイクロ−ＰＣＲの結果の比較を示すグラフ。
【図１１】配列番号１〜４に示す２種のプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのネステッドＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【図１２】配列番号３〜４に示すプライマー対を利用したサルモネラ・エンテリティディスのマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【図１３】配列番号７〜８に示すプライマー対を利用した黄色ブドウ球菌のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【図１４】配列番号１１及び１２に示すプライマー対を利用した大腸菌O157:H7のマイクロ−ＰＣＲの電気泳動結果を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号４に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むサルモネラ属菌(Salmonella spp.)検出用プライマー対；
配列番号７に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号８に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)検出用プライマー対；
配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１２に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む大腸菌（Escherichia coli）O157:H7検出用プライマー対；
配列番号１３に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１４に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む大腸菌O157:H7検出用プライマー対；
配列番号１７に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１８に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）検出用プライマー対；
配列番号２１に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２２に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)検出用プライマー対；及び
配列番号２３に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２４に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対；
からなる群より選択される１以上のプライマー対を含む病原菌検出用プライマー。
【請求項２】
前記プライマーが、
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むサルモネラ属菌検出用プライマー対；
配列番号５に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号６に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む黄色ブドウ球菌検出用プライマー対；
配列番号９に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む大腸菌O157:H7検出用プライマー対；
配列番号１５に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１６に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対；
配列番号１９に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２０に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対；
からなる群より選択される１のプライマー対をさらに含む、請求項１に記載の病原菌検出用プライマー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプライマーでのＰＣＲを利用する病原菌検出方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲが、サーマルブロックＰＣＲ又はマイクロ−ＰＣＲである請求項３に記載の病原菌検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーを利用するＰＣＲに続いて、請求項２に記載のプライマーを使用してＰＣＲの第２ラウンドが実施される請求項３に記載の病原菌検出方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲが、請求項１及び２に記載のプライマーを同時に利用して実施される請求項３に記載の病原性菌検出方法。
【請求項７】
前記検出方法が、２種以上の異なる病原菌の検出用プライマー対を利用するマルチプレックスＰＣＲを通して２種以上の病原菌を同時に検出することによって実施される請求項３に記載の病原菌検出方法。
【請求項８】
ＰＣＲを通した病原菌検出のためのＰＣＲプライマー、反応緩衝液、及びTaq DNAポリメラーゼを含む病原菌検出用キットであって、前記ＰＣＲプライマーが、請求項１又は２に記載のプライマーセットである病原菌検出用キット。
【請求項１】
配列番号３に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号４に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むサルモネラ属菌(Salmonella spp.)検出用プライマー対；
配列番号７に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号８に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)検出用プライマー対；
配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１２に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む大腸菌（Escherichia coli）O157:H7検出用プライマー対；
配列番号１３に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１４に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む大腸菌O157:H7検出用プライマー対；
配列番号１７に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１８に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）検出用プライマー対；
配列番号２１に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２２に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)検出用プライマー対；及び
配列番号２３に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２４に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対；
からなる群より選択される１以上のプライマー対を含む病原菌検出用プライマー。
【請求項２】
前記プライマーが、
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むサルモネラ属菌検出用プライマー対；
配列番号５に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号６に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む黄色ブドウ球菌検出用プライマー対；
配列番号９に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む大腸菌O157:H7検出用プライマー対；
配列番号１５に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１６に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含むリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマー対；
配列番号１９に示すヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２０に示すヌクレオチド配列を含むプライマーを含む腸炎ビブリオ検出用プライマー対；
からなる群より選択される１のプライマー対をさらに含む、請求項１に記載の病原菌検出用プライマー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプライマーでのＰＣＲを利用する病原菌検出方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲが、サーマルブロックＰＣＲ又はマイクロ−ＰＣＲである請求項３に記載の病原菌検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーを利用するＰＣＲに続いて、請求項２に記載のプライマーを使用してＰＣＲの第２ラウンドが実施される請求項３に記載の病原菌検出方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲが、請求項１及び２に記載のプライマーを同時に利用して実施される請求項３に記載の病原性菌検出方法。
【請求項７】
前記検出方法が、２種以上の異なる病原菌の検出用プライマー対を利用するマルチプレックスＰＣＲを通して２種以上の病原菌を同時に検出することによって実施される請求項３に記載の病原菌検出方法。
【請求項８】
ＰＣＲを通した病原菌検出のためのＰＣＲプライマー、反応緩衝液、及びTaq DNAポリメラーゼを含む病原菌検出用キットであって、前記ＰＣＲプライマーが、請求項１又は２に記載のプライマーセットである病原菌検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５３８０７５（Ｐ２００８−５３８０７５Ａ）
【公表日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５７９２３（Ｐ２００７−５５７９２３）
【出願日】平成１７年３月１５日（２００５．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９０９４５
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０７２８９５６４）サムスン・エヴァーランド・インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１５日（２００５．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９０９４５
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０７２８９５６４）サムスン・エヴァーランド・インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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