食中毒菌に対する抗体の産生方法
【課題】哺乳類より免疫力の高い鳥類を用いて、食中毒菌に対する抗体を、大量かつ均質に産生する方法、及び該抗体を用いた食中毒菌の診断薬、更に食中毒の予防・治療に有用で、鶏卵アレルギー患者にも適用可能な食用組成物の提供。
【解決手段】ダチョウに食中毒菌を摂取し、その卵からＩｇＹ抗体を抽出する、食中毒菌に対する抗体の産生方法。該抗体を用いた食中毒菌の診断キット。更にダチョウの卵の少なくとも一部を使った、食中毒菌特異的抗体含有物。
【解決手段】ダチョウに食中毒菌を摂取し、その卵からＩｇＹ抗体を抽出する、食中毒菌に対する抗体の産生方法。該抗体を用いた食中毒菌の診断キット。更にダチョウの卵の少なくとも一部を使った、食中毒菌特異的抗体含有物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食中毒菌に対する抗体の産生方法に関する。より詳しくは鳥類、特にダチョウを用いその卵から食中毒菌の抗体を産生する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類と比べ鳥類は大変高い免疫能力を持つことが知られている。これは鳥類が哺乳類とは全く異なった進化の過程を経てきているからといわれている。また鳥類の雌が有する抗体は卵となって体外に排出されるので、抗体の作製にも利用されている。
【０００３】
鶏は従来からこのような抗体産生のために検討され、実際に利用されている動物である。例えば、鶏に抗原を接種し、抗原に特異的な抗体を鶏体内に形成させる。抗体が形成された後、この鶏が産卵した卵の全卵、卵黄または卵白より特異的抗体を含有する材料を大量に得る方法が開示されている（特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、鶏の卵では量産性に課題があると考え、より量産性を向上させた抗体の産生方法が提案された。特許文献２は、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリおよびサルモネラ菌を抗原化させて、幼いひよこに３種の抗原を同時に接種することで、抗−病原性バクテリア抗体を１つの卵に共存させる技術を開示している。すなわち、複数の抗原によって免疫させた鶏に複数の抗体を作らせ、１つの鶏卵から複数の抗体を得ようとするものである。
【特許文献１】特願昭６２−２１５５３４号公報
【特許文献２】特表２００４−５１７１１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
鶏は１つの卵が小さく、大量に抗体を産生する場合は多くの鶏を用いる必要がある。鶏は個体が違えば免疫力も異なり、産生される抗体もそれぞれ異なる。従って同じ抗原を用いても免疫した個体が異なれば、全くの同一物ではない。それゆえ、得られた抗体は個体の違いによるロット差が発生してしまうという課題があった。抗体を利用する場合はできるだけ、均一な品質でロット間による違いのないものが望ましい。
【０００６】
また、鶏卵に対するアレルギーを有する人は比較的多いので、鶏卵から得ることのできる特異的抗体含有物を経口摂取し、予防若しくは治療効果を図る場合は、アレルギー反応に注意しなければならないという課題もある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はかかる課題の解決のために想到されたものである。本発明では鳥類としてダチョウ（Struthio camelus）を用いて、その卵から抗体を得る。また、その卵から特異的抗体含有物を得る。
【発明の効果】
【０００８】
ダチョウの卵は鶏卵のおよそ２０〜３０倍であり、その卵から得ることのできる抗体の量も同等倍である。従って、１羽のダチョウから大量の抗体を得ることができ、これはすなわちロット間の差を少なくすることができるという効果を得る。
【０００９】
また、ダチョウの卵は鶏卵と比較しアレルギーが少ないという特徴がある。従って、卵から得られた抗体含有物を経口摂取し、予防若しくは治療効果を図る場合には、アレルギー反応というリスクを回避しやすいという効果を得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ダチョウに抗原を免疫すれば血液に特異抗体が産生され、そのうちＩｇＹが卵黄に移行し、産卵と同時に排出される。この卵黄よりＩｇＹを抽出すれば特異的で高感度の抗体を大量に得ることができ、それを診断・検査薬や治療薬として利用できる。一個の卵黄から２〜４ｇのＩｇＹの精製が可能であり、１羽のダチョウから年間４００ｇの抗体を得ることが可能である。つまり１羽で約４０００万人分以上のロット差の少ない診断キットの作製が可能となる。多数のダチョウを使用すれば莫大な量の抗体の生産も可能であり、工業用としての利用価値がある。
【実施例】
【００１１】
ここでは、食中毒菌として有名サルモネラ・エンテリティヂス（Salmonella Enteritidis 以下ＳＥと呼ぶ）に対する抗体をダチョウの卵黄にて作製した。
【００１２】
市販のＳＥ抗原ワクチン（商品名 レイヤーミューンＳＥ）（第一製薬社製）１ｍｌを産卵ダチョウに隔週免疫（筋肉内注射）し、初回免疫より4週目の卵黄を採取した。卵黄の精製は以下のように行う。
【００１３】
まず、卵黄を5倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と同量の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分攪拌する。
【００１４】
次に、１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収する。
【００１５】
さらに、最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置する。静置後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収する。最後に、卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する。この課程により９０％以上の純度のＩｇＹの回収が可能となった。１個の卵黄より２〜４ｇのＩｇＹを精製することができた。
【００１６】
図１は、ＳＥ非接種（１羽）と接種ダチョウ（免疫４週目）（４羽）の卵黄抽出液に対して寒天ゲル内沈降反応を用いて抗体の存在を調べた結果の写真である。写真中央（Ａ）が抗原として用いたインフルエンザウイルスＨＡ抗原の結果である。抗原が存在すると白色の沈降線が出現する。
【００１７】
図１で１はリン酸緩衝液（ＰＢＳ），２はＳＥ非接種ダチョウの卵黄、３〜６はＳＥ接種ダチョウ（免疫４週目）４羽の卵黄抽出液を添加したものである。ＰＢＳおよび非接種ダチョウでは卵黄は白色の沈降線は出現せず、抗体が存在しないと結論できる。一方、接種ダチョウ４羽の場合は全て白色の沈降性が出現した。従ってＳＥを接種した全てのダチョウの卵で、抗体の存在が確認できた。
【００１８】
1羽のダチョウメスから4月から９月までの産卵期に約１００個の卵が得られることより、最大約４００ｇの抗体（ＩｇＹ）が得られる。同じ個体から得られる抗体は、卵が変わっても同じ抗体であるので、ロット間の違いのない抗体を大量に産生することができる。また、ここで得られた抗体は、精製しサルモネラ感染患者（食中毒）の治療薬として応用可能である。
【００１９】
また、抗体を精製せずに卵黄を特異的抗体含有物として食用に用いてもサルモネラの感染予防、治療として応用可能である。この場合そのままでもよいが、粉末乾燥させて用いてもよい。特にダチョウ卵は卵アレルギー性が極めて少ないので、鶏卵アレルギー患者においても服用可能と考えられる。
【００２０】
さらに、卵黄粉末を産卵鶏の飼料に含有させれば、鶏のサルモネラ感染も予防でき、サルモネラ非含有の鶏卵の産生にもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】寒天ゲル内沈降反応を用いて抗体の存在を調べた結果の写真
【技術分野】
【０００１】
本発明は食中毒菌に対する抗体の産生方法に関する。より詳しくは鳥類、特にダチョウを用いその卵から食中毒菌の抗体を産生する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類と比べ鳥類は大変高い免疫能力を持つことが知られている。これは鳥類が哺乳類とは全く異なった進化の過程を経てきているからといわれている。また鳥類の雌が有する抗体は卵となって体外に排出されるので、抗体の作製にも利用されている。
【０００３】
鶏は従来からこのような抗体産生のために検討され、実際に利用されている動物である。例えば、鶏に抗原を接種し、抗原に特異的な抗体を鶏体内に形成させる。抗体が形成された後、この鶏が産卵した卵の全卵、卵黄または卵白より特異的抗体を含有する材料を大量に得る方法が開示されている（特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、鶏の卵では量産性に課題があると考え、より量産性を向上させた抗体の産生方法が提案された。特許文献２は、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリおよびサルモネラ菌を抗原化させて、幼いひよこに３種の抗原を同時に接種することで、抗−病原性バクテリア抗体を１つの卵に共存させる技術を開示している。すなわち、複数の抗原によって免疫させた鶏に複数の抗体を作らせ、１つの鶏卵から複数の抗体を得ようとするものである。
【特許文献１】特願昭６２−２１５５３４号公報
【特許文献２】特表２００４−５１７１１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
鶏は１つの卵が小さく、大量に抗体を産生する場合は多くの鶏を用いる必要がある。鶏は個体が違えば免疫力も異なり、産生される抗体もそれぞれ異なる。従って同じ抗原を用いても免疫した個体が異なれば、全くの同一物ではない。それゆえ、得られた抗体は個体の違いによるロット差が発生してしまうという課題があった。抗体を利用する場合はできるだけ、均一な品質でロット間による違いのないものが望ましい。
【０００６】
また、鶏卵に対するアレルギーを有する人は比較的多いので、鶏卵から得ることのできる特異的抗体含有物を経口摂取し、予防若しくは治療効果を図る場合は、アレルギー反応に注意しなければならないという課題もある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はかかる課題の解決のために想到されたものである。本発明では鳥類としてダチョウ（Struthio camelus）を用いて、その卵から抗体を得る。また、その卵から特異的抗体含有物を得る。
【発明の効果】
【０００８】
ダチョウの卵は鶏卵のおよそ２０〜３０倍であり、その卵から得ることのできる抗体の量も同等倍である。従って、１羽のダチョウから大量の抗体を得ることができ、これはすなわちロット間の差を少なくすることができるという効果を得る。
【０００９】
また、ダチョウの卵は鶏卵と比較しアレルギーが少ないという特徴がある。従って、卵から得られた抗体含有物を経口摂取し、予防若しくは治療効果を図る場合には、アレルギー反応というリスクを回避しやすいという効果を得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ダチョウに抗原を免疫すれば血液に特異抗体が産生され、そのうちＩｇＹが卵黄に移行し、産卵と同時に排出される。この卵黄よりＩｇＹを抽出すれば特異的で高感度の抗体を大量に得ることができ、それを診断・検査薬や治療薬として利用できる。一個の卵黄から２〜４ｇのＩｇＹの精製が可能であり、１羽のダチョウから年間４００ｇの抗体を得ることが可能である。つまり１羽で約４０００万人分以上のロット差の少ない診断キットの作製が可能となる。多数のダチョウを使用すれば莫大な量の抗体の生産も可能であり、工業用としての利用価値がある。
【実施例】
【００１１】
ここでは、食中毒菌として有名サルモネラ・エンテリティヂス（Salmonella Enteritidis 以下ＳＥと呼ぶ）に対する抗体をダチョウの卵黄にて作製した。
【００１２】
市販のＳＥ抗原ワクチン（商品名 レイヤーミューンＳＥ）（第一製薬社製）１ｍｌを産卵ダチョウに隔週免疫（筋肉内注射）し、初回免疫より4週目の卵黄を採取した。卵黄の精製は以下のように行う。
【００１３】
まず、卵黄を5倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と同量の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分攪拌する。
【００１４】
次に、１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収する。
【００１５】
さらに、最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置する。静置後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収する。最後に、卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する。この課程により９０％以上の純度のＩｇＹの回収が可能となった。１個の卵黄より２〜４ｇのＩｇＹを精製することができた。
【００１６】
図１は、ＳＥ非接種（１羽）と接種ダチョウ（免疫４週目）（４羽）の卵黄抽出液に対して寒天ゲル内沈降反応を用いて抗体の存在を調べた結果の写真である。写真中央（Ａ）が抗原として用いたインフルエンザウイルスＨＡ抗原の結果である。抗原が存在すると白色の沈降線が出現する。
【００１７】
図１で１はリン酸緩衝液（ＰＢＳ），２はＳＥ非接種ダチョウの卵黄、３〜６はＳＥ接種ダチョウ（免疫４週目）４羽の卵黄抽出液を添加したものである。ＰＢＳおよび非接種ダチョウでは卵黄は白色の沈降線は出現せず、抗体が存在しないと結論できる。一方、接種ダチョウ４羽の場合は全て白色の沈降性が出現した。従ってＳＥを接種した全てのダチョウの卵で、抗体の存在が確認できた。
【００１８】
1羽のダチョウメスから4月から９月までの産卵期に約１００個の卵が得られることより、最大約４００ｇの抗体（ＩｇＹ）が得られる。同じ個体から得られる抗体は、卵が変わっても同じ抗体であるので、ロット間の違いのない抗体を大量に産生することができる。また、ここで得られた抗体は、精製しサルモネラ感染患者（食中毒）の治療薬として応用可能である。
【００１９】
また、抗体を精製せずに卵黄を特異的抗体含有物として食用に用いてもサルモネラの感染予防、治療として応用可能である。この場合そのままでもよいが、粉末乾燥させて用いてもよい。特にダチョウ卵は卵アレルギー性が極めて少ないので、鶏卵アレルギー患者においても服用可能と考えられる。
【００２０】
さらに、卵黄粉末を産卵鶏の飼料に含有させれば、鶏のサルモネラ感染も予防でき、サルモネラ非含有の鶏卵の産生にもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】寒天ゲル内沈降反応を用いて抗体の存在を調べた結果の写真
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の雌に食中毒菌を接種する工程と、
前記食中毒菌を接種した個体が産卵した卵の卵黄からＩｇＹを抽出する工程とを含む食中毒菌に対する抗体の産生方法。
【請求項２】
前記鳥類はダチョウである請求項１記載の食中毒菌に対する抗体の産生方法。
【請求項３】
請求項１若しくは２の何れかによって得られた抗体を用いた診断キット。
【請求項４】
ダチョウの雌に食中毒菌を接種し、前記食中毒菌を摂取した個体が産卵した卵の少なくとも一部を含む特異的抗体含有物。
【請求項１】
鳥類の雌に食中毒菌を接種する工程と、
前記食中毒菌を接種した個体が産卵した卵の卵黄からＩｇＹを抽出する工程とを含む食中毒菌に対する抗体の産生方法。
【請求項２】
前記鳥類はダチョウである請求項１記載の食中毒菌に対する抗体の産生方法。
【請求項３】
請求項１若しくは２の何れかによって得られた抗体を用いた診断キット。
【請求項４】
ダチョウの雌に食中毒菌を接種し、前記食中毒菌を摂取した個体が産卵した卵の少なくとも一部を含む特異的抗体含有物。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１６９１４２（Ｐ２００８−１６９１４２Ａ）
【公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３０６（Ｐ２００７−３３０６）
【出願日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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