骨形成促進剤
【課題】日常的に摂取可能で副作用がなく、そして大量にかつ容易に製造し得る骨形成促進剤を提供すること。
【解決手段】本発明の骨形成促進剤は、リゾレシチンを有効成分として含有する。本発明の骨形成促進剤は、日常的に摂取可能で副作用がないので、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【解決手段】本発明の骨形成促進剤は、リゾレシチンを有効成分として含有する。本発明の骨形成促進剤は、日常的に摂取可能で副作用がないので、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会が進むにつれて、骨粗鬆症、骨折、腰痛などの骨疾患が急増している。骨組織には、骨芽細胞および破骨細胞が存在し、健康な骨は、骨芽細胞による骨の形成と破骨細胞による骨の再吸収とのバランスが保たれている。骨疾患は、このような骨の形成と骨の再吸収とのバランスが崩れることによって引き起こされる。現在、骨疾患を治療するために、エストロゲン類、ビタミンＤ３などの薬剤または注射用剤が使用されている。しかし、これらの薬剤または注射用剤は、副作用のおそれがある。
【０００３】
骨疾患を予防するためには、カルシウム塩のサプリメント、牛乳、小魚などのようなカルシウムリッチな食品などを、日常的に摂取する必要がある。しかし、これらのサプリメント、食品などは、摂取しても速やかに体内に吸収されにくいため、カルシウムの吸収量には限界がある。したがって、骨疾患を予防するために、骨の形成を促進する骨形成促進剤、骨の吸収を抑制する骨吸収抑制剤などの新たな薬剤または食品が求められている。
【０００４】
例えば、乳清成分タンパク質およびそのペプチド画分が、骨の形成促進および骨の吸収抑制作用を有し、その作用によって骨が強化されることが開示されている（特許文献１〜４）。乳清成分タンパク質以外のタンパク質としては、乳、血漿、および臓器成分に含まれるアンジオジェニンを含有する骨形成促進または骨吸収防止剤（特許文献５）、ＨＭＧＰｒｏｔｅｉｎおよびアンホテリンのようなタンパク質を含有する骨形成促進または骨吸収防止剤（特許文献６）、コラーゲンまたはゼラチンから得られるトリペプチドを有効成分とする骨の強化または密度向上剤（特許文献７）、およびラクトパーオキシダーゼおよびその酵素分解物を有効成分とする骨形成促進剤（特許文献８）が開示されている。
【０００５】
タンパク質以外の成分を含有する骨形成促進剤などとしては、キノコから単離された（２２Ｅ，２４Ｒ）−エルゴスタ−７，２２−ジエン−３β，５α，６β−トリオールで表される骨形成促進剤（特許文献９）、食用キノコから抽出されるエストロゲン様活性物質を含む骨粗鬆症の予防食品および治療薬（特許文献１０）、動物の血漿抽出物を含有する骨形成促進および骨吸収抑制剤（特許文献１１）、動物の骨などの天然硬組織を可食性酸または果汁に溶解させた骨疾患予防食品（特許文献１２）、植物の抽出物を含有する食品組成物（特許文献１３および１４）、全卵または卵黄からの抽出物を含有する骨強化組成物（特許文献１５）、およびα−オキシ脂肪酸およびスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤（特許文献１６）が開示されている。
【０００６】
しかし、これらの骨形成促進剤は、天然物などから有効成分を単離して調製される。単離方法としては、例えば、有機溶媒による抽出、クロマトグラフィーによる精製、電気泳動による精製などの方法が挙げられる。より効果の高い有効成分を得るためには、これらの単離方法を複数組み合わせた多段階の工程を経なければならず、有効成分の収率は非常に低くなり、コストも高くなる。さらに、大量に摂取すると、副作用のおそれがある成分もある（例えば、エストロゲン様活性物質など）。
【０００７】
したがって、安価で大量に製造し得、副作用の心配もなく、かつ優れた効果を有する骨形成促進剤は、未だに開発されていない。
【特許文献１】特許第２８０２４３６号公報
【特許文献２】特許第３０９２８７４号公報
【特許文献３】特許第３６０４１５９号公報
【特許文献４】特許第３０７３４３９号公報
【特許文献５】特開平１０−７５８５号公報
【特許文献６】特許第３０１８３１３号公報
【特許文献７】特開２００２−２５５８４７号公報
【特許文献８】特開２００５−６０３２１号公報
【特許文献９】特開２００２−２８４６８９号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７７４１４号公報
【特許文献１１】特開２００５−１０４９０９号公報
【特許文献１２】特開平９−３２８４３３号公報
【特許文献１３】特表２００５−５１２５５３号公報
【特許文献１４】特表２００５−５１３０７８号公報
【特許文献１５】特開２００５−２１０８７号公報
【特許文献１６】特開２００４−２３１６１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、日常的に摂取可能で副作用がなく、そして大量にかつ容易に製造し得る骨形成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、リゾレシチンを有効成分とする、骨形成促進剤を提供する。
【００１０】
１つの実施態様においては、上記リゾレシチンは、リゾホスファチジルエタノールアミンである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リゾレシチンを有効成分とする骨形成促進剤が提供される。この骨形成促進剤は、日常的に摂取可能で生体親和性に優れ、副作用がなく、そして大量にかつ容易に製造し得る。本発明の骨形成促進剤は、日常的に摂取することができるので、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（骨の形成）
骨の形成は、次のような過程によって行われる。まず、骨芽細胞前駆細胞が、破骨細胞によって形成された骨吸収窩上で活発に増殖する。次いで、増殖した骨芽細胞前駆細胞が、骨芽細胞に分化する。このとき、骨芽細胞の増殖・分化のマーカーの１つであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が発現して、このＡＬＰの活性が上昇する。次いで、コラーゲンＩ、オステオカルシンなどの細胞外骨基質タンパク質が合成され、骨基質にハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムが沈着し石灰化が進行し、骨芽細胞中のカルシウムの沈着量が増加する。次いで、骨芽細胞は、周囲の骨基質に埋め込まれて骨細胞となり、造骨活動は停止する。
【００１３】
骨を健康に保つためには、骨を強くする、すなわち上述のように骨の形成を促進させる必要がある。あるいは、骨吸収の抑制、すなわち破骨細胞前駆細胞の増殖抑制、破骨細胞への分化の抑制、成熟破骨細胞の機能の抑制などによっても、骨を健康に保つことができる。
【００１４】
（リゾレシチン）
本発明の骨形成促進剤に用いられるリゾレシチンは、リゾリン脂質の１種であり、レシチンのグリセロールの１位または２位に結合している脂肪酸１分子が脱離した化合物である。リゾレシチンには、１−アシルリゾレシチンおよび２−アシルリゾレシチンの２種が存在する。本発明においては、これらのうちのいずれか１種を用いてもよく、２種の混合物を用いてもよい。
【００１５】
リゾレシチンは、例えば、天然レシチンと酵素との酵素反応によって得られる。天然レシチンとしては、例えば、大豆、なたね、魚などの水産物、卵黄などに由来するレシチンが挙げられる。酵素としては、好ましくは、リパーゼ、ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＡ１、およびホスホリパーゼＡ２からなる群より選択される少なくとも１種が用いられる。酵素反応条件は、用いる酵素に応じて、当業者により適宜決定され得る。
【００１６】
本明細書において、「リゾレシチン」とは、リゾレシチン誘導体も含む。リゾレシチン誘導体としては、例えば、リゾホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リゾホスファチジルエタノールアミンには、１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンが存在する。本発明においては、これらのうちのいずれか１種を用いてもよく、２種の混合物を用いてもよい。
【００１７】
リゾホスファチジルエタノールアミンもリゾレシチンと同様に、天然レシチンから得られ得る。上述の酵素反応において、さらに、適量のエタノールアミンを添加して反応を行えばよい。
【００１８】
（骨形成促進剤）
本発明の骨形成促進剤は、上述のようにリゾレシチンを有効成分として含有する。リゾレシチンは、本発明の骨形成促進剤中に、好ましくは１〜１００質量％、より好ましくは１０〜１００質量％の割合で含有される。本発明の骨形成促進剤は、リゾレシチンを有効成分として含有するため、骨芽細胞前駆細胞の増殖および骨芽細胞への分化を促進し、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を増強させる。
【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、必要に応じて、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤などのその他の成分を含有してもよい。
【００２０】
本発明の骨形成促進剤は、食品または医薬品として利用されることが好ましい。例えば、本発明の骨形成促進剤を、そのまま食品または医薬品として利用してもよく、その他の食品原料、医薬品原料などと組み合わせて、食品または医薬品として利用してもよい。このような食品または医薬品は、日常的に摂取しやすくなり、そのため骨疾患の予防および治療が可能となる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この範囲に限定されるものではない。
【００２２】
（調製例１：リゾホスファチジルエタノールアミンの調製）
大豆レシチンＳＬＰ−ＰＣ７０（辻製油株式会社製）２００ｇにヘプタンとアセトンとの混液（３：１（容量比））を加えて溶解し、全量を２Ｌとした（大豆レシチン溶液とする）。次いで、２０，０００ＵのホスホリパーゼＤ（ナガセケムテックス株式会社製）および２．７モルのエタノールアミンを含む酵素溶液（ｐＨ＝８．０）７４０ｍＬを調製した。この酵素溶液を大豆レシチン溶液に添加して、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。次いで、分液後、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥという場合がある）を含む有機溶媒層を、エバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）した。濃縮後、濃縮物の５倍容量のアセトンを加え、不溶物として得られるＰＥを減圧乾燥してＰＥ晶析物１８０ｇを得た。
【００２３】
次いで、２７０，０００ＵのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２ナガセ：ナガセケムテックス株式会社製）を含む緩衝液（０．１Ｍトリス緩衝液、５０ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ８）に、得られたＰＥ晶析物１８０ｇを分散させ、１．８Ｌとなるように調製した。次いで、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。反応終了後、反応液にエタノール１６Ｌを添加してＬＰＥを抽出し、減圧ろ過によってＬＰＥ抽出液を得た。このＬＰＥ抽出液をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）した。濃縮後、濃縮物の５倍容量のアセトンを加え、不溶物として得られるＬＰＥをろ過によって回収し、減圧乾燥してＬＰＥ晶析物１２０ｇを得た。得られた晶析物中には、ＬＰＥが７０質量％含まれていた。
【００２４】
（実施例１：ＡＬＰ活性の測定）
（１）前培養
１０容量％牛胎児血清含有のα−ＭＥＭ培地（以下、α−ＭＥＭ培地と略する）（Ｇｉｂｃｏ）で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（新生マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞：独立行政法人理化学研究所）を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。次いで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの割合でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００２５】
（２）分化培地の調製（培地交換の当日に調製）
（基礎分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、ＨＥＰＥＳを１０ｍＭおよびβ−グリセロリン酸２ナトリウム塩を１０ｍＭ混合して、基礎分化培地を調製した。
【００２６】
（サンプル入り分化培地の調製）
上記基礎分化培地に、ＬＰＥを１０μｇ／ｍＬとなるように添加して、サンプル入り分化培地１を調製した。さらに、ＬＰＥを１００μｇ／ｍＬとなるように添加したこと以外は、サンプル入り分化培地１と同様の手順で、サンプル入り分化培地２を調製した。
【００２７】
（陽性対照入り分化培地の調製）
上記基礎分化培地に、ケンフェロール（Kaempferol：Ｗａｋｏ製）を２０μＭとなるように添加して、陽性対照入り分化培地１を調製した。
【００２８】
（３）培養
上記前培養で用いた１０容量％牛胎児血清含有のα−ＭＥＭ培地を除去した後、前培養を行った細胞に、上記基礎分化培地（対照）、陽性対照入り分化培地１（陽性対照）、サンプル入り分化培地１、およびサンプル入り分化培地２を、それぞれ２ｍＬ添加して、６日間培養を行った。培養開始から３日目に、これらの培地を、それぞれ新しい培地に交換した。
【００２９】
６日間の培養終了後、それぞれのウェル中の培地を捨て、３７℃に加温した０．２５Ｍスクロース溶液で細胞を３回洗浄した。次いで、１ウェルあたり０．９ｍＬの反応緩衝液（５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）、スクロースを２５ｍＭ、およびＭｇＣｌ２を１ｍＭの濃度で含有）を添加して、３０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、２．５ｍＭパラ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム塩の水溶液を、１ウェルあたり０．１ｍＬ添加して、室温で１５分間振とうを行った。１５分後、それぞれのウェル中の反応生成物（パラ−ニトロフェノール）の量を、ＯＤ４２０ｎｍ吸光度を測定することによって、ＡＬＰ活性を求めた。結果を図１に示す。図１には、対照である基礎分化培地で培養した細胞のＡＬＰ活性を１００とした場合の相対値を示す。
【００３０】
図１に示すように、ＬＰＥは、ＡＬＰ活性増強作用を有することがわかった。
【００３１】
（実施例２：石灰化の測定）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内の石灰化を、アリザリンレッドＳ染色法によって、目視で評価した。アリザリンレッドは、キレート反応によってカルシウムに吸着するため、石灰化が進んでいるほど、細胞は濃く染色される。
【００３２】
（１）前培養
α−ＭＥＭ培地で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。次いで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの割合でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００３３】
（２）分化培地の調製（培地交換の当日に調製）
（サンプル入り分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、ＬＰＥを２０μｇ／ｍＬとなるように添加して、サンプル入り分化培地３を調製した。さらに、ＬＰＥを１００μｇ／ｍＬとなるように添加したこと以外は、サンプル入り分化培地３と同様の手順で、サンプル入り分化培地４を調製した。
【００３４】
（陽性対照入り分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、イプリフラボン（Ipriflavone：Ｗａｋｏ製）を１０μＭおよびケンフェロールを１０μＭとなるように添加して、陽性対照入り分化培地２を調製した。
【００３５】
（３）培養
上記前培養で用いたα−ＭＥＭ培地を除去した後、前培養を行った細胞に、上記α−ＭＥＭ培地（対照）、陽性対照入り分化培地２（陽性対照）、サンプル入り分化培地３、およびサンプル入り分化培地４を、それぞれ２ｍＬ添加して、７日間、１４日間、および２１日間培養を行った。培養開始から３日おきに、これらの培地を、それぞれ新しい培地に交換した。
【００３６】
各培養期間終了後、それぞれのウェル中の培地を捨て、３７℃に加温したＰＢＳ（−）で細胞をそれぞれ３回洗浄し、５０％エタノールで細胞を固定した。次いで、アリザリンレッドＳを０．１ｇ含む１０ｍＬの水溶液に２８％アンモニア水溶液を１０μＬ添加してアリザリンレッドＳ溶液とし、このアリザリンレッドＳ溶液を、１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して染色した。石灰化の評価は、対照であるα−ＭＥＭ培地で培養した細胞の色と比較し、下記の基準で評価した。結果を表１に示す。
【００３７】
（評価基準）
対照培地で培養された細胞と色の濃さが同程度の場合 ：±
対照培地で培養された細胞より、やや色が濃い場合 ：＋
対照培地で培養された細胞より、色が濃い場合 ：＋＋
対照培地で培養された細胞より、非常に色が濃い場合 ：＋＋＋
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１に示すように、ＬＰＥを含む培地（サンプル入り分化培地３および４）で培養した細胞は、培養開始から１４日目以降では、対照と比較して色が濃くなっていることがわかる。すなわち、α−ＭＥＭ培地で培養した細胞と比較して、石灰化が進んでいることがわかった。
【００４０】
（実施例３：細胞内のカルシウム濃度の測定）
（１）前培養
α−ＭＥＭ培地で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。次いで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの割合でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００４１】
（２）分化培地の調製（培地交換の当日に調製）
（サンプル入り分化培地の調製）
上記実施例２で用いたサンプル入り分化培地３およびサンプル入り分化培地４を使用した。
【００４２】
（陽性対照入り分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、イプリフラボンを２０μＭおよびケンフェロールを２０μＭとなるように添加して、陽性対照入り分化培地３を調製した。
【００４３】
（３）培養
上記前培養で用いたα−ＭＥＭ培地を除去した後、前培養を行った細胞に、上記α−ＭＥＭ培地（対照）、陽性対照入り分化培地３（陽性対照）、サンプル入り分化培地３、およびサンプル入り分化培地４を、それぞれ２ｍＬ添加して、１４日間および２１日間培養を行った。培養開始から３日おきに、これらの培地を、それぞれ新しい培地に交換した。
【００４４】
各培養期間終了後、それぞれのウェル中の培地を捨てて、ＰＢＳ（−）で得られた細胞をそれぞれ３回洗浄した。次いで、１Ｎの塩酸を１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して、カルシウムを溶出させた。カルシウム濃度の測定は、カルシウムＣテストワコー（和光純薬）を用いて行った。結果を図２および３に示す。
【００４５】
図２および３に示すように、ＬＰＥを含む培地（サンプル入り分化培地３および４）で培養された細胞は、α−ＭＥＭ培地で培養された細胞よりもカルシウム量が多いことがわかった。特に、図３に示すように、培養開始から２１日目では、ＬＰＥを１００μｇ／ｍＬの割合で含むサンプル入り分化培地４で培養した細胞内に含まれるカルシウム量は、陽性対照である陽性対照入り分化培地３で培養した細胞のカルシウム量よりも多いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、リゾレシチンを有効成分として含有することにより、日常的に摂取可能で生体親和性に優れ、副作用がない骨形成促進剤を大量にかつ容易に製造し得る。したがって、本発明の骨形成促進剤は、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できるので、食品分野および医薬品分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】種々の物質を添加した培地で培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＬＰ活性を示すグラフである。
【図２】種々の物質を添加した培地での培養開始から１４日目におけるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中のカルシウム濃度を示すグラフである。
【図３】種々の物質を添加した培地での培養開始から２１日目におけるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中のカルシウム濃度を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会が進むにつれて、骨粗鬆症、骨折、腰痛などの骨疾患が急増している。骨組織には、骨芽細胞および破骨細胞が存在し、健康な骨は、骨芽細胞による骨の形成と破骨細胞による骨の再吸収とのバランスが保たれている。骨疾患は、このような骨の形成と骨の再吸収とのバランスが崩れることによって引き起こされる。現在、骨疾患を治療するために、エストロゲン類、ビタミンＤ３などの薬剤または注射用剤が使用されている。しかし、これらの薬剤または注射用剤は、副作用のおそれがある。
【０００３】
骨疾患を予防するためには、カルシウム塩のサプリメント、牛乳、小魚などのようなカルシウムリッチな食品などを、日常的に摂取する必要がある。しかし、これらのサプリメント、食品などは、摂取しても速やかに体内に吸収されにくいため、カルシウムの吸収量には限界がある。したがって、骨疾患を予防するために、骨の形成を促進する骨形成促進剤、骨の吸収を抑制する骨吸収抑制剤などの新たな薬剤または食品が求められている。
【０００４】
例えば、乳清成分タンパク質およびそのペプチド画分が、骨の形成促進および骨の吸収抑制作用を有し、その作用によって骨が強化されることが開示されている（特許文献１〜４）。乳清成分タンパク質以外のタンパク質としては、乳、血漿、および臓器成分に含まれるアンジオジェニンを含有する骨形成促進または骨吸収防止剤（特許文献５）、ＨＭＧＰｒｏｔｅｉｎおよびアンホテリンのようなタンパク質を含有する骨形成促進または骨吸収防止剤（特許文献６）、コラーゲンまたはゼラチンから得られるトリペプチドを有効成分とする骨の強化または密度向上剤（特許文献７）、およびラクトパーオキシダーゼおよびその酵素分解物を有効成分とする骨形成促進剤（特許文献８）が開示されている。
【０００５】
タンパク質以外の成分を含有する骨形成促進剤などとしては、キノコから単離された（２２Ｅ，２４Ｒ）−エルゴスタ−７，２２−ジエン−３β，５α，６β−トリオールで表される骨形成促進剤（特許文献９）、食用キノコから抽出されるエストロゲン様活性物質を含む骨粗鬆症の予防食品および治療薬（特許文献１０）、動物の血漿抽出物を含有する骨形成促進および骨吸収抑制剤（特許文献１１）、動物の骨などの天然硬組織を可食性酸または果汁に溶解させた骨疾患予防食品（特許文献１２）、植物の抽出物を含有する食品組成物（特許文献１３および１４）、全卵または卵黄からの抽出物を含有する骨強化組成物（特許文献１５）、およびα−オキシ脂肪酸およびスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤（特許文献１６）が開示されている。
【０００６】
しかし、これらの骨形成促進剤は、天然物などから有効成分を単離して調製される。単離方法としては、例えば、有機溶媒による抽出、クロマトグラフィーによる精製、電気泳動による精製などの方法が挙げられる。より効果の高い有効成分を得るためには、これらの単離方法を複数組み合わせた多段階の工程を経なければならず、有効成分の収率は非常に低くなり、コストも高くなる。さらに、大量に摂取すると、副作用のおそれがある成分もある（例えば、エストロゲン様活性物質など）。
【０００７】
したがって、安価で大量に製造し得、副作用の心配もなく、かつ優れた効果を有する骨形成促進剤は、未だに開発されていない。
【特許文献１】特許第２８０２４３６号公報
【特許文献２】特許第３０９２８７４号公報
【特許文献３】特許第３６０４１５９号公報
【特許文献４】特許第３０７３４３９号公報
【特許文献５】特開平１０−７５８５号公報
【特許文献６】特許第３０１８３１３号公報
【特許文献７】特開２００２−２５５８４７号公報
【特許文献８】特開２００５−６０３２１号公報
【特許文献９】特開２００２−２８４６８９号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７７４１４号公報
【特許文献１１】特開２００５−１０４９０９号公報
【特許文献１２】特開平９−３２８４３３号公報
【特許文献１３】特表２００５−５１２５５３号公報
【特許文献１４】特表２００５−５１３０７８号公報
【特許文献１５】特開２００５−２１０８７号公報
【特許文献１６】特開２００４−２３１６１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、日常的に摂取可能で副作用がなく、そして大量にかつ容易に製造し得る骨形成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、リゾレシチンを有効成分とする、骨形成促進剤を提供する。
【００１０】
１つの実施態様においては、上記リゾレシチンは、リゾホスファチジルエタノールアミンである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リゾレシチンを有効成分とする骨形成促進剤が提供される。この骨形成促進剤は、日常的に摂取可能で生体親和性に優れ、副作用がなく、そして大量にかつ容易に製造し得る。本発明の骨形成促進剤は、日常的に摂取することができるので、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（骨の形成）
骨の形成は、次のような過程によって行われる。まず、骨芽細胞前駆細胞が、破骨細胞によって形成された骨吸収窩上で活発に増殖する。次いで、増殖した骨芽細胞前駆細胞が、骨芽細胞に分化する。このとき、骨芽細胞の増殖・分化のマーカーの１つであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が発現して、このＡＬＰの活性が上昇する。次いで、コラーゲンＩ、オステオカルシンなどの細胞外骨基質タンパク質が合成され、骨基質にハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムが沈着し石灰化が進行し、骨芽細胞中のカルシウムの沈着量が増加する。次いで、骨芽細胞は、周囲の骨基質に埋め込まれて骨細胞となり、造骨活動は停止する。
【００１３】
骨を健康に保つためには、骨を強くする、すなわち上述のように骨の形成を促進させる必要がある。あるいは、骨吸収の抑制、すなわち破骨細胞前駆細胞の増殖抑制、破骨細胞への分化の抑制、成熟破骨細胞の機能の抑制などによっても、骨を健康に保つことができる。
【００１４】
（リゾレシチン）
本発明の骨形成促進剤に用いられるリゾレシチンは、リゾリン脂質の１種であり、レシチンのグリセロールの１位または２位に結合している脂肪酸１分子が脱離した化合物である。リゾレシチンには、１−アシルリゾレシチンおよび２−アシルリゾレシチンの２種が存在する。本発明においては、これらのうちのいずれか１種を用いてもよく、２種の混合物を用いてもよい。
【００１５】
リゾレシチンは、例えば、天然レシチンと酵素との酵素反応によって得られる。天然レシチンとしては、例えば、大豆、なたね、魚などの水産物、卵黄などに由来するレシチンが挙げられる。酵素としては、好ましくは、リパーゼ、ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＡ１、およびホスホリパーゼＡ２からなる群より選択される少なくとも１種が用いられる。酵素反応条件は、用いる酵素に応じて、当業者により適宜決定され得る。
【００１６】
本明細書において、「リゾレシチン」とは、リゾレシチン誘導体も含む。リゾレシチン誘導体としては、例えば、リゾホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リゾホスファチジルエタノールアミンには、１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンが存在する。本発明においては、これらのうちのいずれか１種を用いてもよく、２種の混合物を用いてもよい。
【００１７】
リゾホスファチジルエタノールアミンもリゾレシチンと同様に、天然レシチンから得られ得る。上述の酵素反応において、さらに、適量のエタノールアミンを添加して反応を行えばよい。
【００１８】
（骨形成促進剤）
本発明の骨形成促進剤は、上述のようにリゾレシチンを有効成分として含有する。リゾレシチンは、本発明の骨形成促進剤中に、好ましくは１〜１００質量％、より好ましくは１０〜１００質量％の割合で含有される。本発明の骨形成促進剤は、リゾレシチンを有効成分として含有するため、骨芽細胞前駆細胞の増殖および骨芽細胞への分化を促進し、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を増強させる。
【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、必要に応じて、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤などのその他の成分を含有してもよい。
【００２０】
本発明の骨形成促進剤は、食品または医薬品として利用されることが好ましい。例えば、本発明の骨形成促進剤を、そのまま食品または医薬品として利用してもよく、その他の食品原料、医薬品原料などと組み合わせて、食品または医薬品として利用してもよい。このような食品または医薬品は、日常的に摂取しやすくなり、そのため骨疾患の予防および治療が可能となる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この範囲に限定されるものではない。
【００２２】
（調製例１：リゾホスファチジルエタノールアミンの調製）
大豆レシチンＳＬＰ−ＰＣ７０（辻製油株式会社製）２００ｇにヘプタンとアセトンとの混液（３：１（容量比））を加えて溶解し、全量を２Ｌとした（大豆レシチン溶液とする）。次いで、２０，０００ＵのホスホリパーゼＤ（ナガセケムテックス株式会社製）および２．７モルのエタノールアミンを含む酵素溶液（ｐＨ＝８．０）７４０ｍＬを調製した。この酵素溶液を大豆レシチン溶液に添加して、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。次いで、分液後、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥという場合がある）を含む有機溶媒層を、エバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）した。濃縮後、濃縮物の５倍容量のアセトンを加え、不溶物として得られるＰＥを減圧乾燥してＰＥ晶析物１８０ｇを得た。
【００２３】
次いで、２７０，０００ＵのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２ナガセ：ナガセケムテックス株式会社製）を含む緩衝液（０．１Ｍトリス緩衝液、５０ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ８）に、得られたＰＥ晶析物１８０ｇを分散させ、１．８Ｌとなるように調製した。次いで、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。反応終了後、反応液にエタノール１６Ｌを添加してＬＰＥを抽出し、減圧ろ過によってＬＰＥ抽出液を得た。このＬＰＥ抽出液をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）した。濃縮後、濃縮物の５倍容量のアセトンを加え、不溶物として得られるＬＰＥをろ過によって回収し、減圧乾燥してＬＰＥ晶析物１２０ｇを得た。得られた晶析物中には、ＬＰＥが７０質量％含まれていた。
【００２４】
（実施例１：ＡＬＰ活性の測定）
（１）前培養
１０容量％牛胎児血清含有のα−ＭＥＭ培地（以下、α−ＭＥＭ培地と略する）（Ｇｉｂｃｏ）で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（新生マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞：独立行政法人理化学研究所）を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。次いで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの割合でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００２５】
（２）分化培地の調製（培地交換の当日に調製）
（基礎分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、ＨＥＰＥＳを１０ｍＭおよびβ−グリセロリン酸２ナトリウム塩を１０ｍＭ混合して、基礎分化培地を調製した。
【００２６】
（サンプル入り分化培地の調製）
上記基礎分化培地に、ＬＰＥを１０μｇ／ｍＬとなるように添加して、サンプル入り分化培地１を調製した。さらに、ＬＰＥを１００μｇ／ｍＬとなるように添加したこと以外は、サンプル入り分化培地１と同様の手順で、サンプル入り分化培地２を調製した。
【００２７】
（陽性対照入り分化培地の調製）
上記基礎分化培地に、ケンフェロール（Kaempferol：Ｗａｋｏ製）を２０μＭとなるように添加して、陽性対照入り分化培地１を調製した。
【００２８】
（３）培養
上記前培養で用いた１０容量％牛胎児血清含有のα−ＭＥＭ培地を除去した後、前培養を行った細胞に、上記基礎分化培地（対照）、陽性対照入り分化培地１（陽性対照）、サンプル入り分化培地１、およびサンプル入り分化培地２を、それぞれ２ｍＬ添加して、６日間培養を行った。培養開始から３日目に、これらの培地を、それぞれ新しい培地に交換した。
【００２９】
６日間の培養終了後、それぞれのウェル中の培地を捨て、３７℃に加温した０．２５Ｍスクロース溶液で細胞を３回洗浄した。次いで、１ウェルあたり０．９ｍＬの反応緩衝液（５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）、スクロースを２５ｍＭ、およびＭｇＣｌ２を１ｍＭの濃度で含有）を添加して、３０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、２．５ｍＭパラ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム塩の水溶液を、１ウェルあたり０．１ｍＬ添加して、室温で１５分間振とうを行った。１５分後、それぞれのウェル中の反応生成物（パラ−ニトロフェノール）の量を、ＯＤ４２０ｎｍ吸光度を測定することによって、ＡＬＰ活性を求めた。結果を図１に示す。図１には、対照である基礎分化培地で培養した細胞のＡＬＰ活性を１００とした場合の相対値を示す。
【００３０】
図１に示すように、ＬＰＥは、ＡＬＰ活性増強作用を有することがわかった。
【００３１】
（実施例２：石灰化の測定）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内の石灰化を、アリザリンレッドＳ染色法によって、目視で評価した。アリザリンレッドは、キレート反応によってカルシウムに吸着するため、石灰化が進んでいるほど、細胞は濃く染色される。
【００３２】
（１）前培養
α−ＭＥＭ培地で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。次いで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの割合でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００３３】
（２）分化培地の調製（培地交換の当日に調製）
（サンプル入り分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、ＬＰＥを２０μｇ／ｍＬとなるように添加して、サンプル入り分化培地３を調製した。さらに、ＬＰＥを１００μｇ／ｍＬとなるように添加したこと以外は、サンプル入り分化培地３と同様の手順で、サンプル入り分化培地４を調製した。
【００３４】
（陽性対照入り分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、イプリフラボン（Ipriflavone：Ｗａｋｏ製）を１０μＭおよびケンフェロールを１０μＭとなるように添加して、陽性対照入り分化培地２を調製した。
【００３５】
（３）培養
上記前培養で用いたα−ＭＥＭ培地を除去した後、前培養を行った細胞に、上記α−ＭＥＭ培地（対照）、陽性対照入り分化培地２（陽性対照）、サンプル入り分化培地３、およびサンプル入り分化培地４を、それぞれ２ｍＬ添加して、７日間、１４日間、および２１日間培養を行った。培養開始から３日おきに、これらの培地を、それぞれ新しい培地に交換した。
【００３６】
各培養期間終了後、それぞれのウェル中の培地を捨て、３７℃に加温したＰＢＳ（−）で細胞をそれぞれ３回洗浄し、５０％エタノールで細胞を固定した。次いで、アリザリンレッドＳを０．１ｇ含む１０ｍＬの水溶液に２８％アンモニア水溶液を１０μＬ添加してアリザリンレッドＳ溶液とし、このアリザリンレッドＳ溶液を、１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して染色した。石灰化の評価は、対照であるα−ＭＥＭ培地で培養した細胞の色と比較し、下記の基準で評価した。結果を表１に示す。
【００３７】
（評価基準）
対照培地で培養された細胞と色の濃さが同程度の場合 ：±
対照培地で培養された細胞より、やや色が濃い場合 ：＋
対照培地で培養された細胞より、色が濃い場合 ：＋＋
対照培地で培養された細胞より、非常に色が濃い場合 ：＋＋＋
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１に示すように、ＬＰＥを含む培地（サンプル入り分化培地３および４）で培養した細胞は、培養開始から１４日目以降では、対照と比較して色が濃くなっていることがわかる。すなわち、α−ＭＥＭ培地で培養した細胞と比較して、石灰化が進んでいることがわかった。
【００４０】
（実施例３：細胞内のカルシウム濃度の測定）
（１）前培養
α−ＭＥＭ培地で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。次いで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの割合でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００４１】
（２）分化培地の調製（培地交換の当日に調製）
（サンプル入り分化培地の調製）
上記実施例２で用いたサンプル入り分化培地３およびサンプル入り分化培地４を使用した。
【００４２】
（陽性対照入り分化培地の調製）
上記α−ＭＥＭ培地に、イプリフラボンを２０μＭおよびケンフェロールを２０μＭとなるように添加して、陽性対照入り分化培地３を調製した。
【００４３】
（３）培養
上記前培養で用いたα−ＭＥＭ培地を除去した後、前培養を行った細胞に、上記α−ＭＥＭ培地（対照）、陽性対照入り分化培地３（陽性対照）、サンプル入り分化培地３、およびサンプル入り分化培地４を、それぞれ２ｍＬ添加して、１４日間および２１日間培養を行った。培養開始から３日おきに、これらの培地を、それぞれ新しい培地に交換した。
【００４４】
各培養期間終了後、それぞれのウェル中の培地を捨てて、ＰＢＳ（−）で得られた細胞をそれぞれ３回洗浄した。次いで、１Ｎの塩酸を１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して、カルシウムを溶出させた。カルシウム濃度の測定は、カルシウムＣテストワコー（和光純薬）を用いて行った。結果を図２および３に示す。
【００４５】
図２および３に示すように、ＬＰＥを含む培地（サンプル入り分化培地３および４）で培養された細胞は、α−ＭＥＭ培地で培養された細胞よりもカルシウム量が多いことがわかった。特に、図３に示すように、培養開始から２１日目では、ＬＰＥを１００μｇ／ｍＬの割合で含むサンプル入り分化培地４で培養した細胞内に含まれるカルシウム量は、陽性対照である陽性対照入り分化培地３で培養した細胞のカルシウム量よりも多いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、リゾレシチンを有効成分として含有することにより、日常的に摂取可能で生体親和性に優れ、副作用がない骨形成促進剤を大量にかつ容易に製造し得る。したがって、本発明の骨形成促進剤は、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できるので、食品分野および医薬品分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】種々の物質を添加した培地で培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＬＰ活性を示すグラフである。
【図２】種々の物質を添加した培地での培養開始から１４日目におけるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中のカルシウム濃度を示すグラフである。
【図３】種々の物質を添加した培地での培養開始から２１日目におけるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中のカルシウム濃度を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾレシチンを有効成分とする、骨形成促進剤。
【請求項２】
前記リゾレシチンが、リゾホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項１】
リゾレシチンを有効成分とする、骨形成促進剤。
【請求項２】
前記リゾレシチンが、リゾホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載の骨形成促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−１３７８０４（Ｐ２００７−１３７８０４Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３２００２（Ｐ２００５−３３２００２）
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【出願人】（０００２１４２５０）ナガセケムテックス株式会社 (173)
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【出願人】（０００２１４２５０）ナガセケムテックス株式会社 (173)
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【Ｆターム（参考）】
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