骨格筋の培養用足場、同培養装置及び骨格筋の形成方法
【課題】筋原繊維が配列された骨格筋を形成するための骨格筋の培養用足場、同培養装置、骨格筋の形成方法の提供。
【解決手段】骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、伸縮性を有することを特徴とする骨格筋の培養用足場。伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で、一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と、一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の両方もしくはいずれか一方を与えて培養する。
【解決手段】骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、伸縮性を有することを特徴とする骨格筋の培養用足場。伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で、一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と、一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の両方もしくはいずれか一方を与えて培養する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間、哺乳動物等の骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための培養用足場、同培養装置及び骨格筋の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療に用いるための培養技術が進み，心筋梗塞治療のための筋組織の培養が盛んになってきた。筋組織の中では、心筋の培養は従来から行われており、再生医療として注目されている（非特許文献１）。
筋組織をアクチュエータとしてとらえるならば、従来の人工的なアクチュエータでは得ることのできないしなやかさ、フレキシビリティと、投入エネルギーに比し発生されるエネルギーが大きいという高効率性を有している。このため、再生医療、ロボット等の分野で、培養筋を用いたしなやかなアクチュエータが望まれている。
【０００３】
しかるにアクチュエータには心筋のような二次元的収縮をするものよりも一次元的な強い収縮応力が求められる。したがってアクチュエータにはそのような性質を有する骨格筋を用いることが相応しい。
【０００４】
哺乳動物の骨格筋の培養については以下の方法が試みられている（特許文献１）。
シャーレの中で筋芽細胞を培池全面に１層培養し、離して置いた対向する二つの固形物のまわりに培養した最初の1層の筋細胞シートをシャーレからはがして巻きつけて丸め、両端を縛ることにより棒状をした筋肉様のものが得られ、筋肉様のものに電気刺激を与えると筋肉のように収縮する。
【０００５】
しかしながら上記方法で得られた筋肉様のものには以下の問題がある。すなわち最初の1層の筋肉細胞シートは、生体の骨格筋のように細胞が融合した長い筋原繊維（アクチンーミオシンが一列になった骨格筋の基本組織）ができない。したがってシートを巻きつけたものに刺激を与えると筋肉細胞は収縮するものの細胞の1個1個の方向がばらばらなので生体の筋肉のような強い収縮力が発現できない。
【０００６】
そこで、出来上がった筋肉様のものに、後から刺激を与えて、筋原繊維の成長を促す試みがなされている（特許文献２）。成長を促すための電気的刺激装置と機械的刺激装置が検討されている。機械刺激装置はサーボモータと力変換トランスデューサからなり、サーボモータでピストン様動作を行い、引っ張ることができるようになっている。トランスデューサは機械的刺激の強さまたは電気的刺激により筋組織が発生する力を測定するためのものである。
【０００７】
生体において骨格筋は腱と腱の間を細胞が融合した長い筋原繊維（アクチンーミオシン構造が一列になった骨格筋の基本組織）が繋いでおり、このため強い収縮力が出るのであるが、上記方法では原理的に、一旦無方向に成長した筋膜を形成して後に刺激を与えて一定方向に配向させようとするものであるため、培養した筋組織の切片が骨格筋として十分に組織されないという問題がある。
【０００８】
【非特許文献１】岡野光夫 細胞シート工学による心筋組織の構築，厚生労働省循環器病研究委託費による研究報告書，Vol．2003,Page 85 (2005.01)
【非特許文献２】Dawn M. Pedrotty, Jennifer Koh, Bryce H. Davis, Doris A. Taylor, Patrick Wolf, and Laura E. Niklason. Engineering skeletal myoblasts: roles of three-dimentional culture and electrical stimulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288: H1620-H1626, 2003
【特許文献１】ＵＳ６，２０７，４５１
【特許文献２】ＵＳ６，１１４，１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記問題点に鑑み、本発明は、筋原繊維が配列された骨格筋を形成するための骨格筋の培養用足場、同培養装置及び骨格筋の形成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、できた筋組織（切片）に直接機械的刺激を与えるのではなく、筋芽細胞が播種されて培養を開始すると同時または開始後に伸縮性を有する足場を伸縮させる機械的刺激およびまたは電気的刺激を与えることにより、その足場上で同一方向に筋芽細胞が融合して筋原繊維が成長し、筋原繊維が配列された組織を当初から供えた骨格筋が形成されることに着眼してなしたものである。
【００１１】
請求項１に記載の骨格筋の培養用足場は、骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、伸縮性を有することを特徴とする骨格筋の培養用足場である。
【００１２】
請求項２記載の骨格筋の培養用足場は、請求項１に記載の骨格筋の培養用足場であって足場がひも状又はひも状の集合体からなることを特徴とする。
【００１３】
請求項３記載の骨格筋の培養用足場は、請求項１又は２に記載の骨格筋の培養用足場であって、扁平体もしくは網状であることを特徴とする。
【００１４】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場であって、一端が端部固定部１に接続され他端が端部固定部２に接続されていることを特徴とする。
【００１５】
請求項５記載の発明は、請求項４に記載の骨格筋の培養用足場であって、端部固定部１および端部固定部２に電圧印加のための電極を有することを特徴とする。
【００１６】
請求項６記載の骨格筋の培養用足場は、請求項１乃至５のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場であって、足場を形成する材料がコラーゲンを主材料とすることを特徴とする。
【００１７】
請求項７記載の骨格筋の培養装置は、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に繰り返し伸縮させる機構とを備えることを特徴とする。
【００１８】
請求項８記載の骨格筋の形成方法は、伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で、一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の両方もしくはいずれか一方を与えて培養することを特徴とする。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において骨格筋とは、動物の運動を目的とする筋肉をいう。筋芽細胞の由来の動物の種類はアクチュエータとして使えるものであれば限定されず、人間、哺乳類その他が挙げられる。
骨格筋は、細長い筋線維が束になって構成される。構成単位となる筋原線維は多くの核を有する一つの細長い細胞であって長軸方向にアクチミオシン構造を有している。 筋線維には２種類あり、ミトコンドリアに富んで酸素を利用した持続的な収縮の可能な遅筋（Ｔｙｐｅ １、赤筋）と、ミトコンドリアは比較的少なくピルビン酸による瞬発的な収縮の可能な速筋（Ｔｙｐｅ ２、白筋）にわけられる。本発明の骨格筋は目的に応じ遅筋、速筋いずれでもよい。
【００２０】
本発明の培養に用いる足場は骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、足場に播種された筋芽細胞が増殖し、一方向に配向して成長融合し、筋原繊維を形成するように成長させるためには、機械的刺激と電気的刺激のいずれか一方または両方を、筋原繊維を成長させたい方向に与えることが必要である。
機械的刺激を与えるためには、足場は少なくとも培養液中で一定の伸縮性を有することが必要である。伸縮性を有すれば一定方向に機械的刺激を与えて筋芽細胞を一定の方向に成長融合させることができるからである。
【００２１】
伸縮させるには足場に機械的引っ張り応力を与えることで伸長させ、弛緩させることが好ましく、伸縮を繰り返すことにより筋芽細胞を一定の方向に成長融合させることができる。伸縮方向の変位は正弦波状、矩形波状、鋸歯状、三角波状等が挙げられる。尚、本発明において伸縮とは積極的な伸長と弛緩を意味するのみならず、連続又は断続的な伸長であってもよい。
足場を伸縮させるためには、必ずしも足場の外からの外力によらず、足場が自己伸縮する、たとえば電歪性、化学的、電磁気的等による変形材料で作られていてもよい。そのような材料として電歪性樹脂等が挙げられる。
更に、バイモルフ型のような構造のものであれば、表面が伸長しその間裏面が弛緩し、電位を反転させることで表面が弛緩し裏面が伸長するように、面毎に伸縮させることができる。
【００２２】
筋芽細胞を播種して培養するので、足場は細胞接着性を有する材料あるいは細胞毒性のない材料で構成されていることが好ましく、又は細胞接着性を有する材料あるいは細胞毒性のない材料で表面が覆われていることが好ましい。表面が細胞接着性材料で覆われている場合は芯部は細胞接着性を有しない材料であってもよい。再生医療に用いるには生体適合性を有していることが好ましい。
足場材料としてはコラーゲン、セルロース等が伸縮性と細胞接着性を有し更に、生体適合性、製作容易性を併せ有するため好ましく、特にコラーゲンが好ましい。セルロースの場合は直線状の繊維では伸縮性が不足するため編まれたものが好ましい。足場材料は、強度を補強するため短繊維あるいは長繊維等が複合されたものであってもよい。
【００２３】
足場の形状は一定の方向に伸びれば制限されないが、シート状、棒状、ひも状、網状、管状等が挙げられる。ひも状であれば、ひもの軸方向に引っ張り応力を負荷することで一定方向に伸縮させることができるため好ましく、ひも状の集合体にすれば筋芽細胞を播種させる表面積が増すためより好ましい。
又、足場の形状は扁平又は網状であることが好ましい。扁平であれば筋芽細胞を播種する際に、筋芽細胞を含む培養液を足場上に散布する場合に、扁平面を上向きにしておくことにより、接着効率を上げることができるからである。
筋芽細胞は足場を覆って成長するが、網目状であれば裏面への回り込みが容易となるからである。
更に足場は管状であってもよい。管状であれば管内に筋芽細胞を播種、接着させることができ、扁平化させることも容易である。播種を管内部にも行うには管の外面に播種するのとは別途操作で管内壁にも播種してもよいし、播種時に管の上側表面に細胞が通過できる開口を設けておいてもよい。
【００２４】
足場の表面は凹凸を有していてもよく、一方向に配向して筋繊維を形成しやすいように、伸縮あるいは伸張方向に溝が形成されていてもよい。更に筋原細胞が成長しやすいように、多孔材料等の液体透過性材料で形成されていてもよく、血管のように栄養・廃棄物交換のできる物質透過性材料でできていてもよい。
【００２５】
足場を伸縮させるため機械的外力を加えるため、足場には両端に端部固定部１、端部固定部２が設けられることが好ましい。図１に両端に端部固定部１、端部固定部２が設けられた足場の模式図を示す。したがって端部固定部は足場より強度の強い材料で出来ていることが好ましい。又電気的に刺激を与える場合の電極も併せ有することが好ましい。端部固定部は、腱としての役割を期待する場合には、特に強度を考慮して材料が選定される必要がある。さらに再生医療用途においては更に生体適合性も考慮して選定される。
【００２６】
播種された筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させるためには、電気的刺激も有効である。培養の時期に応じて筋原細胞を成長させたい方向に電場を形成する電気刺激を与えてもよい。
【００２７】
骨格筋の培養装置は、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に伸縮させる伸縮機構とを備えることを特徴とする。伸縮機構は制限されないが、圧電素子によるバイモルフ型アクチュエータ、ソレノイド等が挙げられる。波形の制御が容易なため圧電素子によるバイモルフ型アクチュエータが好ましい。
【００２８】
足場を一定方向に伸長させるため、足場の一端を、端部固定部１を容器に固定することにより固定し、端部固定部２を機械的にあるいは人的に容器外部から引っ張るようになっていてもよい。
培養装置は必要に応じ、筋の培養に通常必要とされる温度湿度制御装置、培養液供給、あるいは循環装置、無菌装置が用いられてもよい。
筋芽細胞が一方向に配向して筋繊維を形成するように成長させるためには、筋芽細胞の成長させたい方向に電場を形成する様、足場に電極が付着され、電極に電流を与える電源装置が付帯されていることが好ましい。
【００２９】
播種は対象となる動物より採取した筋芽細胞を、培養液中に浸漬した足場に接着させることにより行う。筋芽細胞は培養液よりも比重が大きいので、筋芽細胞を培養液と共に液中で静かに放出することにより足場上に落下させ接着させることができる。播種時に足場の下に皿状の受け部を当てがえば、筋芽細胞の付着効率が向上する。受け部は播種後除去すればよい。
尚、再生用途等として骨格筋に血管を形成させやすくするため、繊維芽細胞を筋芽細胞播種時に一部混合または交互に播種してもよい。
【００３０】
骨格筋の筋芽細胞を播種して培養した端部固定部１、端部固定部２の間に形成された端部固定部１、端部固定部２を結ぶ方向に筋原繊維が配列された骨格筋にてなるアクチュエータは従来得られていないが、上記方法により得ることができ、強い収縮力を発現することができる。
【００３１】
端部固定部１、端部固定部２を機構部分に固定し、骨格筋を電気刺激等により収縮させることにより、アクチュエータとして使用することができる。この場合端部固定部１、端部固定部２が導電性を有し電極機能も有することが好ましく、単一もしくは繰り返しパルス状電位勾配を与えることが好ましい。
【００３２】
アクチュエータはロボットに用いることができる。再生医療においては端部固定部１、端部固定部２を腱に固定することにより、筋肉として用いることもできる。
【００３３】
筋芽細胞を適用する対象から取り出したものであれば、免疫反応が抑えられるため、取り出した元の個体に適用することができる。このような利用としては、筋肉が大量に失われあるいは損傷された部位に少片を注入して回復の促進を図ることもできる。この場合、足場は生体適合性があるものが必要であるが、端部固定部１、端部固定部２を除去し、筋組織のみとして用いてもよい。
【発明の効果】
【００３４】
請求項１記載の発明の足場によれば、伸縮性を有するので、足場に対し一定の方向で足場を伸縮させることができるので、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【００３５】
請求項２記載の発明の足場によれば、ひも状又はひも状の集合体からなるので、ひもの軸方向に伸縮させることによりひもの軸に平行に、骨格筋の筋芽細胞を配向させて筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【００３６】
請求項３記載の発明の足場によれば、扁平体もしくは網状であるので、扁平であれば筋芽細胞を播種する際に、筋芽細胞を含む培養液を足場上に播種する場合に、扁平面を上向きにしておくことにより、接着効率を上げることができ、網状であれば裏面への細胞の増殖が容易となるからである。
【００３７】
請求項４記載の発明の足場によれば、一端が端部固定部１に接続され他端が端部固定部２に接続されているので、足場を伸縮させるため機械的外力を加えやすい。
【００３８】
請求項５記載の発明の足場によれば、端部固定部に電圧印加のための電極を有するので電気刺激を外部電源を端部固定部に接続することにより、両端部を結ぶ方向に電場を与えることができる。
【００３９】
請求項６記載の発明の足場によれば、材質がコラーゲンであるので、伸縮性を有しかつ細胞接着性を有するため筋芽細胞を播種しそのまま定着させ培養させることができ、筋芽細胞を播種した足場に対し一定の方向で足場を伸縮させることができるので、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。生体適合性を有するので再生医療用途にも適し、製作容易性を有するので加工も容易である。
【００４０】
請求項７記載の発明の骨格筋の培養装置によれば、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に繰り返し伸縮させる機構とを備えるので、繰り返し足場を伸縮させながら培養することができ、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【００４１】
請求項８記載の発明の骨格筋の形成方法によれば、伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の、両方もしくはいずれか一方を与えて培養するので、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
筋芽細胞から骨格筋へ成長させるには、足場の伸縮に異方性を付加する必要性があるために、足場の長手方向に固定または駆動のための支持部を取り付ける必要がある。ハンドリングの容易さを考慮し、足場および端部固定部の作製を行った。
（足場の作製）
コラーゲン溶液（組織培養用コラーゲン酸性溶液ｐＨ３．０）を用い、溶液中で電気泳動法を用いることにより、長軸状に伸びた直径約１ｍｍのひも状コラーゲンゲルを作製した。
【００４３】
コラーゲン溶液中に２本のプラチナ製ワイヤーを配置し、このプラチナワイヤーに正負の直流電圧を印加すると、溶液中でプラスの電荷を有するコラーゲン分子が電気泳動により負に印加したプラチナワイヤーに凝集する。この凝集したゲル状のコラーゲン分子を取り外し大気中で半乾燥させると、細いひも状の柔軟なコラーゲンを得ることができる。このコラーゲンを束ねるとひも状コラーゲンの集合体にてなる足場となり、プレスするとシート状等に加工することができる。コラーゲンは十分に乾燥させると大きく硬度を増すので、本発明の目的のためには水分を少し含んだ半乾燥状態が好ましい。
【００４４】
ひも状コラーゲンの集合体を凹凸を有する２個のローラー間で圧力下ローラー加工することにより表面に凹凸を有する扁平状コラーゲンシートを得た。また凹凸の激しいローラー間で強い圧力下ローラー加工することにより網状コラーゲンシートが得られた。
【００４５】
（端部固定部の設計）
足場を支持するための端部固定部は樹脂で作製し、縦２ｍｍ×横１．５ｍｍ×高さ１．５ｍｍｍの直方体形状とし、２分割して足場を挟み込む構造とする。端部固定部の設計形状を模式図１に示す。図２は端部固定部を基部と上部に２分割した状態であり、互いに組み合わせることにより直方体のマイクロ構造物を形成する。中央にはひも状コラーゲンを固定するための突起を形成する。また構造物は空洞を有しており，軽量化とともに細胞の接着性向上を考慮した。図３は組み立てた状態を示しており、中央部の空洞部にひも状コラーゲンを挟み込み，突起でひも状コラーゲンを固定する構造を有している。
また両端部固定部の一部に穴を開け、プラチナワイヤーを差し込むことにより、電極を形成した。
【００４６】
（端部固定部の作製）
端部固定部の作製はマイクロ光造形装置（Ｄ−ＭＥＣ社製：商品名ＡＣＣＵＬＡＳ）を用いて行った。マイクロ構造物の３次元ＣＡＤデータを作製し、そのデータを薄い断面体にスライスし等高線データに変換する。1スライス層を１０μｍと設定し、積層することにより構造物を作製した。光造形にはアクリル系感光樹脂を使用した。本マイクロ光造形装置はレーザー光の走査による光造形ではなく、画像パターンを直接縮小露光する方式であり、露光面の空間分解能（画素）は１．７μｍ角であり、高さ方向の分解能は1スライス層２〜１０μｍの積層が可能である。図４にマイクロ光造形装置を用いて作製した端部固定部の基部の写真を示す。端部固定部は両端用に２個作製した。固定部の底部は光造形の基板に対して前面ではなく一部のみ基板と接着させておくと、造形後またはコラーゲンを組み込み後容易に基板から取り外しが可能となり、足場への機械的刺激の付加を容易に行うことができる。
【００４７】
（端部固定部の取り付け）
ひも状コラーゲンゲルの片端を上記基部と上部で挟み固定し、他端も同様に端部固定部を固定する。図５にひも状コラーゲンゲルの両側に端部固定部を装着した状態の写真を示す。マイクロ構造物中の突起物の組み合わせにより、コラーゲンゲルはマイクロ構造物と十分に固着されている。両端に固定部が固定された足場の端部固定部を含む構造物の全長は８ｍｍであった。図６にひも状コラーゲンの集合体の両端部を端部固定部で固定したものの模式図を示す。図７にひも状コラーゲンの集合体の両端部を端部固定部で固定したものの写真を示す。
【００４８】
（培養装置の作製）
骨格筋の培養装置の模式図を図８に示す。シャーレを培養容器に用い、シャーレに一方の端部固定部１を接着固定できるようにした装置である。圧電材料を用いたバイモルフ型圧電素子の一端を固定し、もう一端を端部固定部３と固定し、バイモルフ型圧電素子に印加する電圧を制御することにより足場に機械的な応力を加えることができる。パルスッジェネレータにより電圧波形をパルスにすると急峻なパルス状の伸縮を加えることが可能になり、電圧波形をのこぎり状、正弦波状等にすると連続した繰り返しの伸縮を加えることができる。
さらに電気的刺激を加えることができるように、パルスジェネレータから両端部固定部に電気接続できるようになっている（図示省略）。
【００４９】
（筋芽細胞の播種）
培養液中に浸漬した足場にｒａｔの大腿筋より抽出した筋芽細胞を培養液と共に液中で静かに放出することにより落下させ播種させた。バイモルフ型圧電素子に印加する電圧を制御することにより足場に機械的な応力を加えることができる。
播種時に足場の下に皿状の受け部を当てがい、播種後除去した。筋芽細胞の付着効率が向上した。
【００５０】
（筋芽細胞の培養）
播種後一定時間経過した後にバイモルフ型圧電素子を駆動させて、伸縮を繰り返しながら、電気的刺激も併せ加えて培養した。一定時間の経過は細胞の播種を確実にするためのものであり、数分から２時間程度がよい。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の骨格筋の骨格筋の培養用足場、同培養装置、骨格筋の形成方法によれば、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋繊維を形成するように成長させることができるので、筋細胞が一方向に配列した骨格筋が得られるこのため、強い筋収縮力の必要とされるロボット用アクチュエータとして、あるいは再生医療等に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】両端に端部固定部を固定した足場の模式図である。
【図２】実施例の端部固定部の設計を説明するための模式図である。端部固定部を基部と上部に２分割した状態を示す。
【図３】実施例の端部固定部の設計を説明するための模式図であって基部と上部を組み立てた状態を示す。
【図４】実施例で作製した端部固定部の基部の写真を示す。
【図５】実施例で作製した、ひも状コラーゲンの両側に端部固定部を装着した状態の写真を示す。
【図６】両端に端部固定部を固定したひも状コラーゲンの集合体にてなる足場の模式図である。
【図７】実施例で作製した、ひも状コラーゲンの集合体の両側に端部固定部を装着した状態の写真を示す。
【図８】培養装置の模式図である。
【符号の説明】
【００５３】
１ 足場
２ 端部固定部１
３ 端部固定部２
４ シャーレ
１１培養装置本体
１２バイモルフ型圧電素子
１３パルスジェネレータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間、哺乳動物等の骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための培養用足場、同培養装置及び骨格筋の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療に用いるための培養技術が進み，心筋梗塞治療のための筋組織の培養が盛んになってきた。筋組織の中では、心筋の培養は従来から行われており、再生医療として注目されている（非特許文献１）。
筋組織をアクチュエータとしてとらえるならば、従来の人工的なアクチュエータでは得ることのできないしなやかさ、フレキシビリティと、投入エネルギーに比し発生されるエネルギーが大きいという高効率性を有している。このため、再生医療、ロボット等の分野で、培養筋を用いたしなやかなアクチュエータが望まれている。
【０００３】
しかるにアクチュエータには心筋のような二次元的収縮をするものよりも一次元的な強い収縮応力が求められる。したがってアクチュエータにはそのような性質を有する骨格筋を用いることが相応しい。
【０００４】
哺乳動物の骨格筋の培養については以下の方法が試みられている（特許文献１）。
シャーレの中で筋芽細胞を培池全面に１層培養し、離して置いた対向する二つの固形物のまわりに培養した最初の1層の筋細胞シートをシャーレからはがして巻きつけて丸め、両端を縛ることにより棒状をした筋肉様のものが得られ、筋肉様のものに電気刺激を与えると筋肉のように収縮する。
【０００５】
しかしながら上記方法で得られた筋肉様のものには以下の問題がある。すなわち最初の1層の筋肉細胞シートは、生体の骨格筋のように細胞が融合した長い筋原繊維（アクチンーミオシンが一列になった骨格筋の基本組織）ができない。したがってシートを巻きつけたものに刺激を与えると筋肉細胞は収縮するものの細胞の1個1個の方向がばらばらなので生体の筋肉のような強い収縮力が発現できない。
【０００６】
そこで、出来上がった筋肉様のものに、後から刺激を与えて、筋原繊維の成長を促す試みがなされている（特許文献２）。成長を促すための電気的刺激装置と機械的刺激装置が検討されている。機械刺激装置はサーボモータと力変換トランスデューサからなり、サーボモータでピストン様動作を行い、引っ張ることができるようになっている。トランスデューサは機械的刺激の強さまたは電気的刺激により筋組織が発生する力を測定するためのものである。
【０００７】
生体において骨格筋は腱と腱の間を細胞が融合した長い筋原繊維（アクチンーミオシン構造が一列になった骨格筋の基本組織）が繋いでおり、このため強い収縮力が出るのであるが、上記方法では原理的に、一旦無方向に成長した筋膜を形成して後に刺激を与えて一定方向に配向させようとするものであるため、培養した筋組織の切片が骨格筋として十分に組織されないという問題がある。
【０００８】
【非特許文献１】岡野光夫 細胞シート工学による心筋組織の構築，厚生労働省循環器病研究委託費による研究報告書，Vol．2003,Page 85 (2005.01)
【非特許文献２】Dawn M. Pedrotty, Jennifer Koh, Bryce H. Davis, Doris A. Taylor, Patrick Wolf, and Laura E. Niklason. Engineering skeletal myoblasts: roles of three-dimentional culture and electrical stimulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288: H1620-H1626, 2003
【特許文献１】ＵＳ６，２０７，４５１
【特許文献２】ＵＳ６，１１４，１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記問題点に鑑み、本発明は、筋原繊維が配列された骨格筋を形成するための骨格筋の培養用足場、同培養装置及び骨格筋の形成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、できた筋組織（切片）に直接機械的刺激を与えるのではなく、筋芽細胞が播種されて培養を開始すると同時または開始後に伸縮性を有する足場を伸縮させる機械的刺激およびまたは電気的刺激を与えることにより、その足場上で同一方向に筋芽細胞が融合して筋原繊維が成長し、筋原繊維が配列された組織を当初から供えた骨格筋が形成されることに着眼してなしたものである。
【００１１】
請求項１に記載の骨格筋の培養用足場は、骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、伸縮性を有することを特徴とする骨格筋の培養用足場である。
【００１２】
請求項２記載の骨格筋の培養用足場は、請求項１に記載の骨格筋の培養用足場であって足場がひも状又はひも状の集合体からなることを特徴とする。
【００１３】
請求項３記載の骨格筋の培養用足場は、請求項１又は２に記載の骨格筋の培養用足場であって、扁平体もしくは網状であることを特徴とする。
【００１４】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場であって、一端が端部固定部１に接続され他端が端部固定部２に接続されていることを特徴とする。
【００１５】
請求項５記載の発明は、請求項４に記載の骨格筋の培養用足場であって、端部固定部１および端部固定部２に電圧印加のための電極を有することを特徴とする。
【００１６】
請求項６記載の骨格筋の培養用足場は、請求項１乃至５のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場であって、足場を形成する材料がコラーゲンを主材料とすることを特徴とする。
【００１７】
請求項７記載の骨格筋の培養装置は、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に繰り返し伸縮させる機構とを備えることを特徴とする。
【００１８】
請求項８記載の骨格筋の形成方法は、伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で、一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の両方もしくはいずれか一方を与えて培養することを特徴とする。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において骨格筋とは、動物の運動を目的とする筋肉をいう。筋芽細胞の由来の動物の種類はアクチュエータとして使えるものであれば限定されず、人間、哺乳類その他が挙げられる。
骨格筋は、細長い筋線維が束になって構成される。構成単位となる筋原線維は多くの核を有する一つの細長い細胞であって長軸方向にアクチミオシン構造を有している。 筋線維には２種類あり、ミトコンドリアに富んで酸素を利用した持続的な収縮の可能な遅筋（Ｔｙｐｅ １、赤筋）と、ミトコンドリアは比較的少なくピルビン酸による瞬発的な収縮の可能な速筋（Ｔｙｐｅ ２、白筋）にわけられる。本発明の骨格筋は目的に応じ遅筋、速筋いずれでもよい。
【００２０】
本発明の培養に用いる足場は骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、足場に播種された筋芽細胞が増殖し、一方向に配向して成長融合し、筋原繊維を形成するように成長させるためには、機械的刺激と電気的刺激のいずれか一方または両方を、筋原繊維を成長させたい方向に与えることが必要である。
機械的刺激を与えるためには、足場は少なくとも培養液中で一定の伸縮性を有することが必要である。伸縮性を有すれば一定方向に機械的刺激を与えて筋芽細胞を一定の方向に成長融合させることができるからである。
【００２１】
伸縮させるには足場に機械的引っ張り応力を与えることで伸長させ、弛緩させることが好ましく、伸縮を繰り返すことにより筋芽細胞を一定の方向に成長融合させることができる。伸縮方向の変位は正弦波状、矩形波状、鋸歯状、三角波状等が挙げられる。尚、本発明において伸縮とは積極的な伸長と弛緩を意味するのみならず、連続又は断続的な伸長であってもよい。
足場を伸縮させるためには、必ずしも足場の外からの外力によらず、足場が自己伸縮する、たとえば電歪性、化学的、電磁気的等による変形材料で作られていてもよい。そのような材料として電歪性樹脂等が挙げられる。
更に、バイモルフ型のような構造のものであれば、表面が伸長しその間裏面が弛緩し、電位を反転させることで表面が弛緩し裏面が伸長するように、面毎に伸縮させることができる。
【００２２】
筋芽細胞を播種して培養するので、足場は細胞接着性を有する材料あるいは細胞毒性のない材料で構成されていることが好ましく、又は細胞接着性を有する材料あるいは細胞毒性のない材料で表面が覆われていることが好ましい。表面が細胞接着性材料で覆われている場合は芯部は細胞接着性を有しない材料であってもよい。再生医療に用いるには生体適合性を有していることが好ましい。
足場材料としてはコラーゲン、セルロース等が伸縮性と細胞接着性を有し更に、生体適合性、製作容易性を併せ有するため好ましく、特にコラーゲンが好ましい。セルロースの場合は直線状の繊維では伸縮性が不足するため編まれたものが好ましい。足場材料は、強度を補強するため短繊維あるいは長繊維等が複合されたものであってもよい。
【００２３】
足場の形状は一定の方向に伸びれば制限されないが、シート状、棒状、ひも状、網状、管状等が挙げられる。ひも状であれば、ひもの軸方向に引っ張り応力を負荷することで一定方向に伸縮させることができるため好ましく、ひも状の集合体にすれば筋芽細胞を播種させる表面積が増すためより好ましい。
又、足場の形状は扁平又は網状であることが好ましい。扁平であれば筋芽細胞を播種する際に、筋芽細胞を含む培養液を足場上に散布する場合に、扁平面を上向きにしておくことにより、接着効率を上げることができるからである。
筋芽細胞は足場を覆って成長するが、網目状であれば裏面への回り込みが容易となるからである。
更に足場は管状であってもよい。管状であれば管内に筋芽細胞を播種、接着させることができ、扁平化させることも容易である。播種を管内部にも行うには管の外面に播種するのとは別途操作で管内壁にも播種してもよいし、播種時に管の上側表面に細胞が通過できる開口を設けておいてもよい。
【００２４】
足場の表面は凹凸を有していてもよく、一方向に配向して筋繊維を形成しやすいように、伸縮あるいは伸張方向に溝が形成されていてもよい。更に筋原細胞が成長しやすいように、多孔材料等の液体透過性材料で形成されていてもよく、血管のように栄養・廃棄物交換のできる物質透過性材料でできていてもよい。
【００２５】
足場を伸縮させるため機械的外力を加えるため、足場には両端に端部固定部１、端部固定部２が設けられることが好ましい。図１に両端に端部固定部１、端部固定部２が設けられた足場の模式図を示す。したがって端部固定部は足場より強度の強い材料で出来ていることが好ましい。又電気的に刺激を与える場合の電極も併せ有することが好ましい。端部固定部は、腱としての役割を期待する場合には、特に強度を考慮して材料が選定される必要がある。さらに再生医療用途においては更に生体適合性も考慮して選定される。
【００２６】
播種された筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させるためには、電気的刺激も有効である。培養の時期に応じて筋原細胞を成長させたい方向に電場を形成する電気刺激を与えてもよい。
【００２７】
骨格筋の培養装置は、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に伸縮させる伸縮機構とを備えることを特徴とする。伸縮機構は制限されないが、圧電素子によるバイモルフ型アクチュエータ、ソレノイド等が挙げられる。波形の制御が容易なため圧電素子によるバイモルフ型アクチュエータが好ましい。
【００２８】
足場を一定方向に伸長させるため、足場の一端を、端部固定部１を容器に固定することにより固定し、端部固定部２を機械的にあるいは人的に容器外部から引っ張るようになっていてもよい。
培養装置は必要に応じ、筋の培養に通常必要とされる温度湿度制御装置、培養液供給、あるいは循環装置、無菌装置が用いられてもよい。
筋芽細胞が一方向に配向して筋繊維を形成するように成長させるためには、筋芽細胞の成長させたい方向に電場を形成する様、足場に電極が付着され、電極に電流を与える電源装置が付帯されていることが好ましい。
【００２９】
播種は対象となる動物より採取した筋芽細胞を、培養液中に浸漬した足場に接着させることにより行う。筋芽細胞は培養液よりも比重が大きいので、筋芽細胞を培養液と共に液中で静かに放出することにより足場上に落下させ接着させることができる。播種時に足場の下に皿状の受け部を当てがえば、筋芽細胞の付着効率が向上する。受け部は播種後除去すればよい。
尚、再生用途等として骨格筋に血管を形成させやすくするため、繊維芽細胞を筋芽細胞播種時に一部混合または交互に播種してもよい。
【００３０】
骨格筋の筋芽細胞を播種して培養した端部固定部１、端部固定部２の間に形成された端部固定部１、端部固定部２を結ぶ方向に筋原繊維が配列された骨格筋にてなるアクチュエータは従来得られていないが、上記方法により得ることができ、強い収縮力を発現することができる。
【００３１】
端部固定部１、端部固定部２を機構部分に固定し、骨格筋を電気刺激等により収縮させることにより、アクチュエータとして使用することができる。この場合端部固定部１、端部固定部２が導電性を有し電極機能も有することが好ましく、単一もしくは繰り返しパルス状電位勾配を与えることが好ましい。
【００３２】
アクチュエータはロボットに用いることができる。再生医療においては端部固定部１、端部固定部２を腱に固定することにより、筋肉として用いることもできる。
【００３３】
筋芽細胞を適用する対象から取り出したものであれば、免疫反応が抑えられるため、取り出した元の個体に適用することができる。このような利用としては、筋肉が大量に失われあるいは損傷された部位に少片を注入して回復の促進を図ることもできる。この場合、足場は生体適合性があるものが必要であるが、端部固定部１、端部固定部２を除去し、筋組織のみとして用いてもよい。
【発明の効果】
【００３４】
請求項１記載の発明の足場によれば、伸縮性を有するので、足場に対し一定の方向で足場を伸縮させることができるので、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【００３５】
請求項２記載の発明の足場によれば、ひも状又はひも状の集合体からなるので、ひもの軸方向に伸縮させることによりひもの軸に平行に、骨格筋の筋芽細胞を配向させて筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【００３６】
請求項３記載の発明の足場によれば、扁平体もしくは網状であるので、扁平であれば筋芽細胞を播種する際に、筋芽細胞を含む培養液を足場上に播種する場合に、扁平面を上向きにしておくことにより、接着効率を上げることができ、網状であれば裏面への細胞の増殖が容易となるからである。
【００３７】
請求項４記載の発明の足場によれば、一端が端部固定部１に接続され他端が端部固定部２に接続されているので、足場を伸縮させるため機械的外力を加えやすい。
【００３８】
請求項５記載の発明の足場によれば、端部固定部に電圧印加のための電極を有するので電気刺激を外部電源を端部固定部に接続することにより、両端部を結ぶ方向に電場を与えることができる。
【００３９】
請求項６記載の発明の足場によれば、材質がコラーゲンであるので、伸縮性を有しかつ細胞接着性を有するため筋芽細胞を播種しそのまま定着させ培養させることができ、筋芽細胞を播種した足場に対し一定の方向で足場を伸縮させることができるので、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。生体適合性を有するので再生医療用途にも適し、製作容易性を有するので加工も容易である。
【００４０】
請求項７記載の発明の骨格筋の培養装置によれば、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に繰り返し伸縮させる機構とを備えるので、繰り返し足場を伸縮させながら培養することができ、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【００４１】
請求項８記載の発明の骨格筋の形成方法によれば、伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の、両方もしくはいずれか一方を与えて培養するので、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋原繊維を形成するように成長させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
筋芽細胞から骨格筋へ成長させるには、足場の伸縮に異方性を付加する必要性があるために、足場の長手方向に固定または駆動のための支持部を取り付ける必要がある。ハンドリングの容易さを考慮し、足場および端部固定部の作製を行った。
（足場の作製）
コラーゲン溶液（組織培養用コラーゲン酸性溶液ｐＨ３．０）を用い、溶液中で電気泳動法を用いることにより、長軸状に伸びた直径約１ｍｍのひも状コラーゲンゲルを作製した。
【００４３】
コラーゲン溶液中に２本のプラチナ製ワイヤーを配置し、このプラチナワイヤーに正負の直流電圧を印加すると、溶液中でプラスの電荷を有するコラーゲン分子が電気泳動により負に印加したプラチナワイヤーに凝集する。この凝集したゲル状のコラーゲン分子を取り外し大気中で半乾燥させると、細いひも状の柔軟なコラーゲンを得ることができる。このコラーゲンを束ねるとひも状コラーゲンの集合体にてなる足場となり、プレスするとシート状等に加工することができる。コラーゲンは十分に乾燥させると大きく硬度を増すので、本発明の目的のためには水分を少し含んだ半乾燥状態が好ましい。
【００４４】
ひも状コラーゲンの集合体を凹凸を有する２個のローラー間で圧力下ローラー加工することにより表面に凹凸を有する扁平状コラーゲンシートを得た。また凹凸の激しいローラー間で強い圧力下ローラー加工することにより網状コラーゲンシートが得られた。
【００４５】
（端部固定部の設計）
足場を支持するための端部固定部は樹脂で作製し、縦２ｍｍ×横１．５ｍｍ×高さ１．５ｍｍｍの直方体形状とし、２分割して足場を挟み込む構造とする。端部固定部の設計形状を模式図１に示す。図２は端部固定部を基部と上部に２分割した状態であり、互いに組み合わせることにより直方体のマイクロ構造物を形成する。中央にはひも状コラーゲンを固定するための突起を形成する。また構造物は空洞を有しており，軽量化とともに細胞の接着性向上を考慮した。図３は組み立てた状態を示しており、中央部の空洞部にひも状コラーゲンを挟み込み，突起でひも状コラーゲンを固定する構造を有している。
また両端部固定部の一部に穴を開け、プラチナワイヤーを差し込むことにより、電極を形成した。
【００４６】
（端部固定部の作製）
端部固定部の作製はマイクロ光造形装置（Ｄ−ＭＥＣ社製：商品名ＡＣＣＵＬＡＳ）を用いて行った。マイクロ構造物の３次元ＣＡＤデータを作製し、そのデータを薄い断面体にスライスし等高線データに変換する。1スライス層を１０μｍと設定し、積層することにより構造物を作製した。光造形にはアクリル系感光樹脂を使用した。本マイクロ光造形装置はレーザー光の走査による光造形ではなく、画像パターンを直接縮小露光する方式であり、露光面の空間分解能（画素）は１．７μｍ角であり、高さ方向の分解能は1スライス層２〜１０μｍの積層が可能である。図４にマイクロ光造形装置を用いて作製した端部固定部の基部の写真を示す。端部固定部は両端用に２個作製した。固定部の底部は光造形の基板に対して前面ではなく一部のみ基板と接着させておくと、造形後またはコラーゲンを組み込み後容易に基板から取り外しが可能となり、足場への機械的刺激の付加を容易に行うことができる。
【００４７】
（端部固定部の取り付け）
ひも状コラーゲンゲルの片端を上記基部と上部で挟み固定し、他端も同様に端部固定部を固定する。図５にひも状コラーゲンゲルの両側に端部固定部を装着した状態の写真を示す。マイクロ構造物中の突起物の組み合わせにより、コラーゲンゲルはマイクロ構造物と十分に固着されている。両端に固定部が固定された足場の端部固定部を含む構造物の全長は８ｍｍであった。図６にひも状コラーゲンの集合体の両端部を端部固定部で固定したものの模式図を示す。図７にひも状コラーゲンの集合体の両端部を端部固定部で固定したものの写真を示す。
【００４８】
（培養装置の作製）
骨格筋の培養装置の模式図を図８に示す。シャーレを培養容器に用い、シャーレに一方の端部固定部１を接着固定できるようにした装置である。圧電材料を用いたバイモルフ型圧電素子の一端を固定し、もう一端を端部固定部３と固定し、バイモルフ型圧電素子に印加する電圧を制御することにより足場に機械的な応力を加えることができる。パルスッジェネレータにより電圧波形をパルスにすると急峻なパルス状の伸縮を加えることが可能になり、電圧波形をのこぎり状、正弦波状等にすると連続した繰り返しの伸縮を加えることができる。
さらに電気的刺激を加えることができるように、パルスジェネレータから両端部固定部に電気接続できるようになっている（図示省略）。
【００４９】
（筋芽細胞の播種）
培養液中に浸漬した足場にｒａｔの大腿筋より抽出した筋芽細胞を培養液と共に液中で静かに放出することにより落下させ播種させた。バイモルフ型圧電素子に印加する電圧を制御することにより足場に機械的な応力を加えることができる。
播種時に足場の下に皿状の受け部を当てがい、播種後除去した。筋芽細胞の付着効率が向上した。
【００５０】
（筋芽細胞の培養）
播種後一定時間経過した後にバイモルフ型圧電素子を駆動させて、伸縮を繰り返しながら、電気的刺激も併せ加えて培養した。一定時間の経過は細胞の播種を確実にするためのものであり、数分から２時間程度がよい。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の骨格筋の骨格筋の培養用足場、同培養装置、骨格筋の形成方法によれば、骨格筋の筋芽細胞が一方向に配向して筋繊維を形成するように成長させることができるので、筋細胞が一方向に配列した骨格筋が得られるこのため、強い筋収縮力の必要とされるロボット用アクチュエータとして、あるいは再生医療等に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】両端に端部固定部を固定した足場の模式図である。
【図２】実施例の端部固定部の設計を説明するための模式図である。端部固定部を基部と上部に２分割した状態を示す。
【図３】実施例の端部固定部の設計を説明するための模式図であって基部と上部を組み立てた状態を示す。
【図４】実施例で作製した端部固定部の基部の写真を示す。
【図５】実施例で作製した、ひも状コラーゲンの両側に端部固定部を装着した状態の写真を示す。
【図６】両端に端部固定部を固定したひも状コラーゲンの集合体にてなる足場の模式図である。
【図７】実施例で作製した、ひも状コラーゲンの集合体の両側に端部固定部を装着した状態の写真を示す。
【図８】培養装置の模式図である。
【符号の説明】
【００５３】
１ 足場
２ 端部固定部１
３ 端部固定部２
４ シャーレ
１１培養装置本体
１２バイモルフ型圧電素子
１３パルスジェネレータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、伸縮性を有することを特徴とする骨格筋の培養用足場。
【請求項２】
足場がひも状又はひも状の集合体からなることを特徴とする請求項１に記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項３】
足場が、扁平体もしくは網状であることを特徴とする請求項１又は２に記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項４】
骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、一端が端部固定部１に接続され他端が端部固定部２に接続されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項５】
端部固定部１および端部固定部２に電圧印加のための電極を有することを特徴とする請求項４に記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項６】
足場を形成する材料がコラーゲンを主材料とすることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項７】
骨格筋の培養装置であって、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に繰り返し伸縮させる機構とを備えることを特徴とする骨格筋の培養装置。
【請求項８】
伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の両方もしくはいずれか一方を与えて培養することを特徴とする骨格筋の形成方法。
【請求項１】
骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、伸縮性を有することを特徴とする骨格筋の培養用足場。
【請求項２】
足場がひも状又はひも状の集合体からなることを特徴とする請求項１に記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項３】
足場が、扁平体もしくは網状であることを特徴とする請求項１又は２に記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項４】
骨格筋の筋芽細胞を播種して培養するための足場であって、一端が端部固定部１に接続され他端が端部固定部２に接続されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項５】
端部固定部１および端部固定部２に電圧印加のための電極を有することを特徴とする請求項４に記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項６】
足場を形成する材料がコラーゲンを主材料とすることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の骨格筋の培養用足場。
【請求項７】
骨格筋の培養装置であって、筋芽細胞を播種した足場と、同足場と培養液を収める容器と、前記足場を一定方向に繰り返し伸縮させる機構とを備えることを特徴とする骨格筋の培養装置。
【請求項８】
伸縮性を有する足場に骨格筋の筋芽細胞を播種し、培養液中で一定方向に繰返し伸縮させる機械的刺激と一定方向に繰り返し電圧を印加して与える電気的刺激の両方もしくはいずれか一方を与えて培養することを特徴とする骨格筋の形成方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−７２９６７（Ｐ２００８−７２９６７Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５６４０４（Ｐ２００６−２５６４０４）
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０３４２０８３３）学校法人大阪工大摂南大学 (62)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０３４２０８３３）学校法人大阪工大摂南大学 (62)
【Ｆターム（参考）】
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