高スループット亜硫酸水素ＤＮＡシークエンシングのための方法および組成物ならびに有用性
化学改変および高スループットDNAシークエンシングに好適なDNA鋳型を作製するための新規な方法および組成物が開示される。構成要素であるシトシンが5−メチルシトシンで置換され、結果として生じるアダプターを亜硫酸水素媒介性脱アミノ化に対して耐性にするDNAアダプター設計の方法もまた開示される。前記アダプターが二本鎖DNA鋳型上に連結されると、その後のDNA変性および亜硫酸水素処理は、鋳型DNAシトシンを差次的にウラシルに脱アミノ化させるが、連結アダプターの5−メチルシトシンは化学変換に抵抗するので、結果としてアダプター配列を未変化で残留させる。そこで亜硫酸水素処理されたDNAの両方の鎖は、未変化アダプター配列にハイブリダイズする単一プライマーセットを用いて増幅させることができる。さらに、亜硫酸水素反応のための条件を最適化するための規定のメチル化組成物のコントロール鋳型を作製するための方法もまた開示される。好ましい実施形態では、本発明は、DNAメチル化を試験するための従来型のSolexa（商標）、SOLiD（商標）又は454（商標）−型DNAシークエンシング・プラットフォームを使用して、全ゲノム亜硫酸水素−DNAシークエンシングに好適な鋳型を作製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、2007年8月15日に出願された米国特許仮出願第60/935,472号明細書および2007年9月5日に出願された米国特許仮出願第60/935,867号明細書に基づく優先権を主張する。上記の仮出願特許の全内容は、参考として本明細書で援用される。
【０００２】
本発明は、化学改変および高スループットDNAシークエンシングに好適なDNA鋳型を作製するための新規な方法および組成物に関する。本発明の方法は、DNAアダプター設計に関するが、このとき構成要素であるシトシンは、5−メチルシトシンで置換されるため、結果として生じるアダプターを亜硫酸水素媒介性脱アミノ化に対して耐性にさせる。前記アダプターが二本鎖DNA鋳型上に連結されると、その後のDNA変性および亜硫酸水素処理は、鋳型DNAシトシンをウラシルへ差次的に脱アミノ化させるが、連結したアダプターの5−メチルシトシンは化学変換に抵抗するので、結果としてアダプター配列は未変化で残留する。そこで亜硫酸水素処理DNAの両方の鎖は、未変化アダプター配列にハイブリダイズする単一プライマーセットを用いて増幅させることができる。本発明は、さらに亜硫酸水素反応のための条件を最適化するための規定のメチル化組成物の対照鋳型を作製するための方法に関する。好ましい実施形態では、DNAメチル化を試験するための従来型のSolexa（商標）、SOLiD（商標）又は454（商標）−型DNAシークエンシング・プラットフォームを使用する全ゲノムでの亜硫酸水素−DNAシークエンシングに好適な鋳型を作製するのに使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
エピゲノム（epigenomic）調節の主要機序は、DNAメチル化が関与し、それによりS−アデノシル−メチオニンのメチル基がシトシンの5−炭素位へ酵素的にトランスファーされて5−メチルシトシンが産生される（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ヒトでは、大多数のシトシンのメチル化は、CpGアイランド、G＋Cアイソコア及びCpGホットスポットのCpGジヌクレオチドで発生するが、CpNG、CC（a／t）GG、CpAおよびCpT配列内に存在するシトシンが低頻度でメチル化されることもあり得る（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。調節領域内のCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化は、例えばX染色体活性化などの遺伝子サイレンシングに寄与し、癌における腫瘍サプレッサー遺伝子のサイレンシングにおいてしばしば重要な役割を果たすことができる。様々なゲノム領域の低メチル化および高メチル化は、発癌の様々な段階ならびに他の疾患の宿主において報告されてきた（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。そこで、薬物、薬物標的又は有用な疾患のバイオマーカーの発見を導くことができる制御ネットワークを解明するために、ゲノムのメチル化状態として規定されている「メチローム」を特性付ける方法に対する需要がある。
【０００４】
制御ネットワークを解明すべく、ますます増大する解析度でシトシンのメチル化を分析するため、そして疾患のバイオマーカーを同定するために様々な方法が開発されてきた。シトシンのメチル化をアッセイするための初期の方法はクロマトグラフィーに基づいていたが（非特許文献１４）、この方法や他の関連技術はDNAにおける大きなメチル化の変化を考察することしかできないので、低解析度に悩まされる。メチルシトシン分布におけるより精密な変化を分析できる改良された解析度を備える後の方法は、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ又はアフィニティークロマトグラフィーを利用する（非特許文献１５、非特許文献１６）。DNAシークエンシングと結合したシトシンの化学改変は、依然として、エピゲノム試験のための一塩基解析で5−メチルシトシンを検出するための選択法、いわゆる「ゴールドスタンダード」である。「亜硫酸水素−DNAシークエンシング」化学の開発は、シトシンのメチル化の直接的なポジティブな検出を許容する。亜硫酸水素−DNAシークエンシングは、1970年代に開示された化学に端を発し、それは、それにより亜硫酸水素ナトリウムがシトシンの効率的脱アミド化を触媒して、ウラシルを生産する（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。それは、シークエンシングおよびDNA増幅反応においてチミンと機能的に同等である。反応条件に依存して、5−メチルシトシンからチミンへの脱アミノ化速度は、シトシンからウラシルへの速度よりほぼ２桁緩徐であろう（非特許文献２０、非特許文献２１）。非特許文献２２は、メチルシトシンとシトシンとの選択的化学的識別をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と組み合わせて利用して、個々のDNA鎖内に存在する5−メチルシトシンのポジティブな表示を提供した。この最初の報告およびその他から、亜硫酸水素−DNAシークエンシングは、急速に、一塩基レベルでの解析での標的遺伝子座でのシトシンのメチル化を調査するための選択法となり、そして、選択法であり続けた（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献２２）。
【０００５】
近年、DNAメチル化を大規模な全ゲノムで検出するための方法を採用する試みがなされてきた。これらの試みの第１は、差次的DNAメチル化がメチル感受性制限酵素を用いて消化された末端標識DNAの連続分画によって検出される「制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法（RLGS法）」である（非特許文献３０）。このアプローチは、ゲノム内の制限酵素部位のアベイラビリティおよび分布によって制限され、解析度が低い。特許文献１は、別のアプローチについて記載しており、それは、それによって、亜硫酸水素処理DNAがPCRの使用によって選択的全ゲノムDNA増幅と結合される。増幅産物は、次に細胞メチル化状態を評価するために有用な複合DNAメチル化フィンガープリントを産生するためのプライマー伸長アッセイによって調査される。実施されたプライマー伸長アッセイの回数は、このアプローチによる解析度およびゲノム適用範囲の程度を示す。また別のストラテジーは、抗メチルシトシン抗体もしくはメチル−CpG結合タンパク質を用いるメチル化DNAセグメントのアフィニティー精製に基づいている（非特許文献１５；非特許文献１６）。メチル化されたシロイヌナズナ（Arabidopsis）DNAの免疫沈降およびアフィニティークロマトグラフィーは、捕捉された標識産物のゲノムオリゴヌクレオチド・タイリングアレイへのハイブリダイゼーションとの共役によって、最初の全ゲノムメチル化マップが作られた（非特許文献１５）。結果として生じたメチル化マップは、タイリングアレイ上のオリゴヌクレオチドの長さに対応する35塩基分解能を有している。より低い分解能のアレイを使用したヒト癌細胞系に関する類似の試験は、様々にメチル化された極めて多数の遺伝子を解明した（非特許文献３１；非特許文献３２）。このアプローチは、全ゲノムスキャンのためには有用であるが、アレイの分解能によって、および、それをアフィニティー精製によって捕捉できる前のDNAフラグメント上の最小閾値密度のメチル−CpGによって妨害される。したがって、相当に大量の出発材料が必要とされるので、多数の臨床用途における使用は不可能にされる。当技術分野においては、より少量の出発材料しか必要とせず、一塩基レベルでのより高い分解能を有する、明瞭、かつ更に感受性の高いの検出方法が必要とされる。
【０００６】
近年まで、技術的困難性が、全ゲノムでのメチル化変化をマッピングするための亜硫酸水素−DNAシークエンシングアプローチの使用を妨害してきた。非特許文献３３は、原理検証実験の小規模試験において、一塩基分解能でのゲノムDNAライブラリーインサートの5−メチルシトシンをマッピングするために亜硫酸水素−DNAシークエンシングを使用することの実現可能性を証明した。アダプターを備えた、サイズを選択してランダムに断片化されたゲノムDNAフラグメントは、亜硫酸水素により処理され、PCRにより増幅させられ、シークエンシングのためにベクター内へクローニングされた。結果として生じたシーケンスデータは99.9％を超えるシトシンからウラシルへの変換率を明らかにしたが、これはゲノムライブラリー・インサートのランダムショットガン亜硫酸水素−DNAシークエンシングを全ゲノム規模に適用できることを示している。しかし、このアプローチの使用は、従来型のサンガー法をベースとするジデオキシシークエンシングおよびキャピラリーをベースとする電気泳動法の高額な費用および低スループットによって本質的に妨げられ、制限される。したがって、当技術分野においては、低コストであって高スループットを備える亜硫酸水素−DNAシークエンシングの改良された方法に対する需要が依然として存在する。
【０００７】
次世代大規模並列処理塩基配列決定技術は、相当に大きな費用削減を伴って数桁大きいスループットを提供するが、現在のところ、これらのプラットフォームはDNAメチル化の経済的な全ゲノム調査を可能にする亜硫酸水素−DNAシークエンシングには採用されていない。現在、高スループットDNAシークエンシングのためには3種のシステムを市販で入手できる。The Genome Sequencer FLX（商標）システム（一般には、454（商標）−シーケンサーとして公知である）（Roche Diagnostics、米国インディアナ州インディアナポリス）、Solexa（商標）（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、およびSOLiD（商標）システム（Applied BioSystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）。
【０００８】
454−テクノロジーは、高密度光学プレートのエッチングされたウエルに個別に装填されたマイクロビーズ上でクローナルに増幅させるDNA鋳型上で実施される従来型ピロシークエンシング化学に基づいている（非特許文献３４）。各塩基伸長によって生成されたシグナルは、専用光ファイバーによって捕捉される。
【０００９】
Solexaシークエンシング鋳型は、専売のフローセル表面上に固定され、その場所でそれらは１平方センチメートル当たり1,000万個までのクラスター密度を備える分離したシーケンス鋳型クラスターを形成するために、in situでクローナルに増幅させられる。Solexaをベースとするシークエンシングは、可逆性３’−ジデオキシヌクレオチド成分および開裂可能なクロモフルオル（chromofluor）を有する専売の４つの改変ヌクレオチドの存在下において、段階的方法でプライマー媒介DNA合成法を用いて実施される。3’−ジデオキシヌクレオチド成分およびクロモフルオルは、連続的ベースコーリング（塩基呼出し）のための各伸長サイクル前に化学的に除去される。各鋳型クラスターからの段階的ヌクレオチド付加のサイクルは、レーザー励起、およびその後の、それからベースコーリングが達成されるイメージングによって検出される。
【００１０】
大規模並列処理塩基配列決定法のためのApplied BiosystemsのSOLiDアプローチは、ハーバード大学のGeorge Churchによって開発されたストラテジーであるDNA連結反応の連続サイクルに基づいている（非特許文献３５）。このアプローチによって、固定されたDNA鋳型は、ガラス製フローセルの表面上に高密度でプレーティングされているビーズ上でクローナルに増幅させられる（エマルジョンPCR）。塩基配列決定は、固定化された鋳型へハイブリダイズさせた一連のプライマー上で短い規定標識プローブの連結反応の連続サイクルによって遂行される。
【００１１】
これらの新規機器からのスループットは、機器1回のラン当たりのベースコールが数十億回を超えることができ、これは現世代の96レーンのキャピラリー電気泳動法に基づくシークエンシング機器のファクターのほぼ1万5千倍以上である。そこで、DNAメチル化の費用効果的な全ゲノム調査を可能にするために454−、Solexa、又はSOLiDシークエンシング・プラットフォームへ亜硫酸水素−DNAシークエンシング化学を採用するための方法および組成物の未だ満たされていない需要がある。非特許文献３３は、彼らの予備的研究において、新世代454−DNAシーケンサーであれば亜硫酸水素−DNAシークエンシングの全ゲノム適用を可能にするための経済的な解決策を提供できると提案したが、彼らは極めて重要な問題について考察せず、具体化するための方法についても開示しなかった。より重要なことに、上記の研究者らは、彼らのアプローチを典型的な配列解読が35〜50塩基長に過ぎないSolexaもしくはSOLiDプラットフォームに適用する際の大きな困難を認識していなかった。そこで本発明は、これらやその他の実質的な利点を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第6,214,556号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Caiafa P and Zampieri M, 2005. DNA methylation and chromatin structure: The puzzling CpG islands. J Cell Biochem 94: 257-265
【非特許文献２】Novik, KL et al, 2002. Epigenomics: Genome-wide study of mtheylation phenomena. Curr Issues Mol Biol 4: 111-128
【非特許文献３】Bird A, 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memmory. Genes Dev 16: 6-21
【非特許文献４】Costello JF and Plass C, 2001. Methylation matters. J Med Genet 38: 285-303
【非特許文献５】Laird PW and Jaenisch R, 1996. The role of DNA methylation in cancer genetics and epigenetics. Ann Rev Genet 30: 441-464
【非特許文献６】Lorincz MC and Groudine M, 2001. CmC(a/t)GG methylation: A new epigenetic mark in mammalian DNA? Proc Natl Acad Sci (USA) 98: 11034-10036
【非特許文献７】Woodcock DM et al, 1997. Asymmetic methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human Ll retrotransponson. J Biol Chem 272: 7810-7816
【非特許文献８】Clark SJ et al, 1995. CpNpG methylation in mammalian cells. Nat Genet 10: 20-27
【非特許文献９】Jones P and Baylin SB, 2007. The epigenomics of cancer. Cell 128: 683-692
【非特許文献１０】Brena RM and Costello JF, 2007. Genome-epigenome interactions in cancer. Hum Mol Genetics 16: R96-R105
【非特許文献１１】Esteller M, 2007. Epigenetic gene silencing in cancer: The DNA hypermethylome. Hum Mol Gen 16: R50-59
【非特許文献１２】Rodenhiser D and Mann M, 2006. Epigentics and human disease: Translating basic biology into clinical applications. CMAJ 174: 341-348
【非特許文献１３】Laird PW and Jaenisch R, 1996. The role of DNA methylation in cancer genetics and epigenetics. Ann Rev Genet 30: 441-464
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【非特許文献１８】Shapiro R et al, 1970. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulphite: A specific deamination method. J Am Chem Soc 92: 422-424
【非特許文献１９】Hayatsu H et al, 1970. Reaction of sodium bisulphite with uracil, cytosine, and their derivatives. Biochem 9: 2858-2865
【非特許文献２０】Hayatsu H and Shiragami M, 1979. Reaction of bisulphite with the 5-Hydroxymethyl groups in pyrimidines and in phage DNAs. Biochem 18: 632-637
【非特許文献２１】Wang RY et al, 1980. Comparison of bisulphite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nuc Acids Res 8: 4777-4790
【非特許文献２２】Frommer M et al, 1992. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci (USA) 89: 1827-1831
【非特許文献２３】Ehrich M et al, 2007. A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulphite treatment. Nuc Acids Res 35: e29
【非特許文献２４】Grunau C et al, 2001. Bisulphite genomic sequencing: Systematic investigation of critical experimental parameters. Nuc Acids Res 29: e65
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【非特許文献２７】Clark SJ et al, 1994. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nuc Acids Res 22: 2990-2997
【非特許文献２８】Raizis AM et al, 1995. ABIsulphite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem 226: 161-166
【非特許文献２９】Feil R et al, 1994. Methylation analysis on individual chromosomes: Improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nuc Acids Res 22: 695-696
【非特許文献３０】Hatada I et al, 1991. A genomic scanning method for higher organisms using restriction sites as landmarks. Proc Natl Acad Aci (USA) 88: 9523-9527
【非特許文献３１】Keshet I et al, 2006. Evidence for an instructive mechanism of de novo methylation in cancer cells. Nat Genet 38: 149-153
【非特許文献３２】Weber M et al, 2005. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet 37: 853-862
【非特許文献３３】Meissner A et al, 2005. Reduced representation bisulphite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nuc Acids Res 33: 5868-5877
【非特許文献３４】Margulies M et al, 2005. Genome sequencing in microfabricated high-density picrolitre reactors. Nature 437: 376-380
【非特許文献３５】Shendure J et al, 2005. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science 309: 1728-1732
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、シトシンのメチル化パターンにおける変化についての大規模高スループット全ゲノム調査を可能にする目的で次世代DNAシーケンサーにおいて使用するための、およびその他の好適な利用のための、亜硫酸水素−DNAシークエンシングのための新規の改良された方法および有用な組成物を提供する。
【００１５】
Meissner他著（2005）の予備的研究は、それによって短いDNAアダプターが、複数のサイズ選択された、そして、ランダムに断片化されたゲノムDNAフラグメントの各末端へ最初に連結される、亜硫酸水素−DNAシークエンシングアプローチについて記載している。アダプター連結DNAは、亜硫酸水素処理に対して感受性である一本鎖形態に変性させられ、ここで、存在するシトシンがウラシルに変換させられるが、5−メチルシトシンは変化を受けない。変換させられたDNAは、DNA鎖を再生するため、および従来型キャピラリー電気泳動法によるシークエンシング分析のための、ベクター内へ効率的にクローニングするための十分な質量の亜硫酸水素−変換DNA産物を生成するため、プライマーを用いてアダプター領域へ増幅させられる。この試験は、このアプローチが試験ゲノムDNAの普遍性の提示を提供し、規模の実行可能性を有することを証明している。しかし、Meissner他の標的DNAの亜硫酸水素処理の重要な結果は、連結されたアダプター内の全シトシンも同様にウラシルへ変換されることである。したがって、DNA増幅を実施するためには、PCRプライマーはアダプター配列にはハイブリダイズしないように設計され、その代りにアダプターの亜硫酸水素変換配列にハイブリダイズするように設計されるが、これはいわゆる「メチル化特異的PCR」法（Cottrell（2004）、Li and Dahlya（2002）、Herman and Baylin（1997）（米国特許第6,017,704号）、Herman他著（1996））の基礎となるストラテジーである。処理された亜硫酸水素を増幅させるために好適であることが当技術分野において公知な他の適切なPCRプライマー設計には、亜硫酸水素改変部位からDNAを増幅させることのできる縮重プライマーの使用又はDNAのシトシン非含有領域内のDNAを標的とする極めて短いプライマーの使用が含まれる（Olek他著（1998）（米国特許第6,214,556号））。
【００１６】
メチル化特異的PCRによって課されたプライマー設計における制限は、当技術分野において記載されているように、現在のABI社製SOLiD又はIllumina社製Solexaの高スループットシークエンシング・プラットフォームとともに使用するには適合しない。これらのプラットフォームは、サンプルDNAインサートのすぐ隣に位置する最適化され、そして検証された専売のアダプター配列の強制的使用を必要とする。これらの専売のアダプターは、DNAシークエンシング鋳型のクローナルな固相増幅およびシークエンシングプライマーの結合を媒介するように機能する。SolexaおよびSOLiDシーケンサーの解読長は、35塩基に過ぎない（2008年後期には50塩基以上に伸長している）。専売アダプターと、例えばメチル化特異的PCRのために必要とされるようなDNAインサートとの間に位置する外部配列は、サンプルDNAの既に短い解読長を許容できないレベルへ減少させるであろう。結果として、現代のSolexaおよびSOLiDのプラットフォームは、上述のように、メチル化特異的PCR法によって作製された産物をシーケンスできない（Meissner他著（2006）、Cottrell著（2004）、Li and Dahlya著（2002）、Herman and Baylin（1997）（米国特許第6,017,704号明細書）、Herman 他著（1996））。亜硫酸水素変換アダプター配列が固体支持体上でのクローナルな増幅ならびにSolexaおよびSOLiDプラットフォーム上でのシークエンシングプライマー結合を媒介できるアダプター設計を引き出すことは形式的には可能であるが、技術的および経済的挑戦は極めて厄介である。アダプター上でのシトシンからウラシルへの亜硫酸水素変換は遺伝コードをたった3つの塩基へと効果的に減少させるが、それによって、プラットフォームによって必要とされる固相増幅のためおよび高スループットDNAシークエンシングの特異的プライミングのために効率的および特異的に機能することのできる厳しい制限を設計に課すであろう。さらに、亜硫酸水素変換はアダプターの両方の鎖を非相補的にさせ、それにより固相増幅プライマーおよびシークエンシングプライマーの追加のセットの作製および検証が必要になり、このプライマーは他のサンプルDNA鎖のためのものである。SOLiDおよびSolexaのシークエンシング・プラットフォームの既存のアダプターおよびプライマー設計を開発および検証するために、企業の膨大な経費、時間および資源が消費されてきた。既に市場に存在する既存製品への大きな設計変化は、許容不可能な財政負担を課すであろう。454−シーケンサーの解読長は数百塩基であり、サンプルDNA鋳型内のメチル化特異的PCRプライマーの付加によって負わされる解読長の短縮に苦しまされるであろう。しかし、454−鋳型内の外部配列の排除は、そのプラットフォームの効率を高めるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、DNAメチル化を試験する目的で亜硫酸水素処理DNA鋳型をシーケンスするために既存のSOLiD、Solexa又は454−に基づくシークエンシング・プラットフォームを採用するための新規な単純で効果的かつ低コストの方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一態様は、新規なアダプター組成物であって、構成要素のシトシンは、結合した鋳型DNAの亜硫酸水素処理中に、前記アダプターを脱アミノ化に対して耐性にさせるために5−メチルシトシンで置換されるアダプター組成物の作製である。本発明のアダプターが鋳型DNAに連結されると、DNA変性および亜硫酸水素処理は鋳型DNAのシトシンをウラシルへ変換させるが、アダプターの配列は未変化のままとなる。そこで亜硫酸水素処理DNAの両方の鎖は、最初の変化したアダプター配列に相補的である単一プライマーセットを用いて増幅させることができる。これとは対照的に、従来型アダプターのシトシンは、亜硫酸水素処理鋳型を増幅させるためにアダプターの亜硫酸水素変換配列へハイブリダイズするPCRプライマーの使用を必要とする亜硫酸水素処理によってウラシルへ変換させられる。亜硫酸水素処理もまた、2本のDNA鋳型鎖を非相補的にさせる。従来型アダプターの2本鎖も、また亜硫酸水素処理によって非相補的にさせられ、結果として各DNA鎖を増幅させるために別個のセットのプライマーが必要になる。本発明のアダプター組成物は、この問題に悩まされず、2本のアダプター鎖は相補的なままとなり、そして、単一のプライマーセットは、Solexa、SOLiD又は454−シークエンシング・プラットフォーム上でシークエンシングのための鋳型を調製する目的での亜硫酸水素処理DNAの2本の鎖を増幅させるために十分である。これらの確立されたプラットフォームによる本発明の採用は、材料費用をほとんど、もしくは全く発生しないと予想されるが、これはプラットフォームの専売アダプターの一次配列が変化せず、したがって固相DNA増幅およびシークエンシングプライマー結合などの全ての下流の操作が影響を受けないからである。好ましい実施形態では、本発明の一態様は、SOLiD、Solexa、454−、もしくはその他のメチル化試験のためにシークエンシング・プラットフォーム上で高スループット亜硫酸水素−DNAシークエンシングを行う目的でDNA鋳型を調製するためのキットもしくはキット構成要素を作製するために使用できる。キット構成要素は、アダプター内のシトシンに対する5−メチルシトシンの単純および低コスト置換物以外は、従来型シークエンシングの供給業者によって現在供給されているキット構成要素と本質的には同一である。
【００１９】
典型的には、アダプターは、天然、もしくは、当技術分野において公知の様々な合成経路を用いて化学合成もしくは酵素支援合成によって作製される改変オリゴヌクレオチドを含む２本の相補的DNAオリゴヌクレオチド鎖を含んでいる（Review:Verma and Eckstein著（1998）、Goodchild著（1990））。5−メチルシトシンを産生するためにシトシンの5−炭素位でのメチル基のコンジュゲーションなどの改変塩基を含むオリゴヌクレオチドは、Operon社（独国ケルン）、Sigma-Proligo社（仏国パリ）、およびGenosys社（米国ミズーリ州セントルイス）を含む様々な市販の供給業者から入手できる。化学合成の代替法としては、シトシンが酵素認識部位内にあることを前提として、メチルトランスフェラーゼを用いてアダプター−DNAを酵素的にメチル化することが可能である。代用反応におけるDNAポリメラーゼの使用又はPCRによってアダプター−DNA内へ5−メチル−dCTPを組み込むこともまた可能である。当業者であれば、最適化されたアダプター設計および合成方法を知っている。操作上、アダプターの２本のDNA鎖は、二本鎖分子を形成するためにアニーリングさせられる。一般に、アダプター配列は、10〜100塩基対（bp）で変動してよいが、典型的には15〜30bpである。アダプターの配列組成は可変性であるが、一般に潜在的プライマー結合およびその他の官能性を妨害する可能性がある逆方向反復などは含まれていない。一部の用途では、アダプターは、連結したアダプターが１以上の標的DNA末端へ連結することを可能にするために空間的に一緒に連結させることができる。この用途の典型は、それが望ましい場合は、クローナルな増幅およびその後の次世代Solexa、SOLiD又は454−DNAシーケンサー上でのシークエンシングの場合と同様に、鋳型DNAの各末端に連結した相違するアダプターを有することである。標的DNAへ連結したアダプターの分子間連結反応は、環状分子を産生するための分子内連結反応が続き、それによって標的DNAは2つの相違するアダプターによってフランキングされる。環状分子を産生するための分子内連結反応の条件は、ある範囲のフラグメント長にわたるDNAセグメントについて記載されてきた（Collins and Weissman著（1984）、Dugaiczyk他著（1975）、Wang and Davidson著（1966））。アダプターは、DNAへの連結反応を促進するために相違する末端構造を有するように操作することができる。平滑末端は、パートナーの相補的末端を有するDNAフラグメントへ連結反応するための特異的な相補的付着端と同様に、一般的に使用されている。アダプターをDNAへ連結させるため、およびアダプターを連結された標的とするプライマーを用いた全ゲノムDNA増幅のための方法は、当該技術分野において公知である（Hughes他著（2005）、Klein他著（1999）、Lucito他著（1989）、Ludecke他著（1989）、Kinzler and Vogelstein（1989））。アダプターは、上記の5−メチルシトシンを用いたシトシンの置換に加えて、他の改変もしくは共役化ヌクレオチドを含むことができる。亜硫酸水素処理又は改変アダプターシトシンからゲノムシトシンを識別できる他の差次的化学処理に対してアダプター分子を耐性にさせることのできるシトシンの化学改変は、本発明の範囲および原理内に含まれると見なされる。さらにまた、他の細胞エピゲノム的なDNA改変を調べるために使用するためにゲノムDNAから改変アダプター−DNAを識別できる化学反応が存在する、その他のアダプター塩基の改変もまた本発明の範囲および原理内に含まれると見なされる。さらにまた、化学処理の様々な工程の前、後もしくはその最中にアダプター連結DNAの簡便なアフィニティー精製を許容するために、三重へリックス形成オリゴヌクレオチド（Review、Vasquez and Glazer（2002）、Sun他著（1996））等によって標的とされ得る成分もしくはDNA配列を含有するビオチンなどのエピトープもしくは精製タグをアダプターへ組み込むこともまた本発明の範囲および原理内に含まれると見なされる。
【実施例】
【００２０】
本発明によって分析するDNAは、任意の細胞、組織、又は器官に由来してよい。一部の実施形態では、DNAは、疾患状態におけるメチル化パターンにおける大域的変化を評価するために、臨床的治療の様々な時点もしくは段階にある疾患表現型を備える腫瘍もしくはその他の細胞に由来する。したがって、本発明を、疾患又は疾患感受性又は疾患予後のゲノム診断的又は予後診断的メチル化バイオマーカーとして使用することができる。Ordway他著（2006）、Sova他著（2006）、およびShames他著（2006）は、そのようなバイオマーカーの具体的実施例を提供している。その他の有用性には、治療的介入のための薬物もしくは薬物標的の同定をもたらす調節ネットワークの解明が含まれる。
【００２１】
全ゲノムメチル化試験のためのDNAは、ゲノムの不偏性の分析を提供するためのランダムフラグメント化によって生成することができる。適切なサイズのDNAは100〜5,000bp以上の範囲であってよく、典型的には100〜250bpが好ましい。ランダムDNAフラグメントを生成するための方法は：（１）マンガンイオンの存在下でDNAにランダム二本鎖開裂を作製するウシ膵臓デオキシリボ核酸ヌクレアーゼＩ（DNase I）（Melgar and Goldthwait（1968））、（２）物理的剪断（Shriefer他著（1990））、及び（３）超音波処理（Deininger（1983）を含んでいる。一部の実施形態では、ゲノムDNAは、ゲノム内で遺伝子と関連するGCリッチ領域であるCpGアイランド配列への消化を優先的に標的とする酵素を用いて消化することができる（Kato and Sasaki（1998））。大きな比率のメチル化はCpG配列内で発生するので、そこで例えばMsp I（CCGG）、Hae III（GGCC）、Taq I（TCGA）などの酵素によるゲノムDNAの消化は、ゲノムのそれらの領域への亜硫酸水素−DNAシークエンシングを優先的に標的とするであろう。GCジヌクレオチド位置でDNAを開裂する緩和条件下での制限エンドヌクレアーゼCviJ Iの使用（Fitzgerald他著（1992））は、DNAフラグメントサイズの有用な連続体を生成するための部分消化条件下で特に有用である。
【００２２】
コンピュータシミュレーション解析は、所与のランダムな50塩基の解読が、ヒトゲノム参照アッセンブリーへの明白な指定の約93％の見込みを表すことを示している。Msp I（CCGG）もしくはHae III（GGCC）部位とG＋Cリッチを有する他の酵素認識部位によってフランキングされた50bpフラグメントについては、ゲノムアッセンブリーへの明白な割当ては、ゲノム内の大多数の反復DNAエレメントはより低いGC含量を有する、そしてこれらの酵素部位はこれらのゲノム領域内で過小評価されるという観察所見に起因して99％より高い。コンピュータモデルは、さらにMsp I、Hae IIIおよびTaq I消化によって生成されるフラグメント内で高度のオーバーラップをも示す。50〜400bpフラグメントサイズ範囲内では、大多数のCpGアイランド配列は、3種の酵素による個別消化から構築されたゲノムライブラリーからのオーバーラップする50bpの解読によってカバーされる可能性がある。亜硫酸水素処理DNAは、一般に、ロークエリーを３塩基遺伝子コードへ効果的に短縮するシトシンからウラシル（チミン）への変換に起因して、参照配列への低比率の明白な割当てを経験する。この問題は、SolexaおよびSOLiD配列の配列長を伸長させるペア−末端解読能力を用いて、ならびに対向DNA鎖を用いたコンセンサス・アラインメントおよびコンティグ構築（contig-building）によって処理することができる。メチル化状態における変化を同定することに加えて、本発明は、配列データが参照配列と比較されると、さらに同時に他の遺伝子変化および体細胞変化を同定するであろう。メチル化データのクラスター化分析のための情報ツールは、当技術分野に存在する（Wang他著（2007）、Segal著（2006）、Siegmund著（2004）、Virmani他著（2002）、Model他著（2001）、Eads他著（2000））。
【００２３】
亜硫酸水素−DNAシークエンシングには有用性があり、広汎に使用されているにもかかわらず、本方法はプロセッシング誤差ならびに亜硫酸水素処理に固有の競合および望ましくない化学反応の問題を生じさせる傾向がある。これらの問題は、全ゲノム適用においてより顕著になるであろう。攻撃的な亜硫酸水素処理プロトコール（すなわち、長いインキュベーション時間、高温、又は高い亜硫酸水素濃度）は、シトシンからウラシルへの完全な変換を保証するが、脱プリンからのDNAの許容できない断片化ならびに5−メチルシトシンからチミンへの最終的な変換というリスクを備える（Hayatsu and Shiragami著（1979）、Wang他著（1980））。低攻撃的処理は、シトシンからウラシルへの不完全な変換に起因するメチル化レベルを過剰評価するというリスクをもたらす。したがって、温度、pH、反応時間、亜硫酸水素濃度、DNA変性の効率などの重要な実験条件に関して、亜硫酸水素変換プロセスの継続的な最適化に向けて多大な研究が行われている（Ehrich他著（2007）、Hayatsu他著（2006）、Grunau他著（2001）、Eads他著（2000）、Paulin他著（1998）、Clark他著（1994）、Raizis他著（1995）、Feil他著（1994）、Frommer他著（1992））。プロセスを最適化するための大きな制限事項は、亜硫酸水素変換に固有の複雑かつ競合する反応を監視するための簡便かつ包括的なコントロール鋳型が欠如することである。亜硫酸水素変換の効率を評価するための現行方法は、処理後のDNAの品質を試験するために高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、ゲル電気泳動法、および質量分析法を利用する（Ehrich他著（2007））。亜硫酸水素反応の最適化実験におけるウラシルへのシトシン変換率は、典型的にはメチル化−PCRアッセイ、およびその後の１以上のゲノム試験遺伝子座（locci）（Frommer他著（1992））に由来する、又はそれにより両方のDNA鎖の規定部位がメチルトランスフェラーゼを使用してメチル化される試験コントロール鋳型に由来するクローン産物のシークエンシングによって測定される。メチルトランスフェラーゼを利用したin vitroでのメチル化に由来するコントロール鋳型は、潜在的な不完全な酵素反応に悩まされ、特異的部位でのチミンの存在が不完全なin vitroでのメチル化に起因するのか、又はメチルシトシンをチミンへ変換させることのできる過度に攻撃的な亜硫酸水素変換に起因するのかを識別することを困難にする（Hayatsu and Shiragami著（1979）、Wang他著（1980））。さらに、所与のメチルトランスフェラーゼのための認識部位内にあるシトシンしか評価することができない。そこで、特に亜硫酸水素シークエンシングを全ゲノム規模で実施しなければならない場合には、亜硫酸水素変換プロセスにおける複雑かつ競合する反応を監視するための簡便で、頑丈かつ包括的アッセイに対する要求がある。
【００２４】
本発明のまた別の態様は、亜硫酸水素反応の条件を最適化するための精確に規定されたシトシンのメチル化組成物の合成コントロール鋳型を作製するための方法を提供する。本発明の1つの態様では、コントロール鋳型は、2つの相補的なアニーリングされたDNA鎖AおよびBを含んでおり、このときB鎖のシトシンは5−炭素位でメチル化され、A鎖のシトシンはメチル化されない。結果として生じるヘミメチル化DNA分子は、共通DNA鋳型に由来する2つの独立増幅反応の産物をアニーリングすることによって構築される。第1反応は、増幅プライマーAおよびBを含んでおり、このときプライマーAはビオチン成分で標識され、プライマーBのシトシンは5−メチルシトシンで置換され、増幅はdATP、dTTP、dGTPおよび5−メチルdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物（各ヌクレオチドの10mMが典型的濃度である）の存在下で実施される。第２増幅反応は、プライマーAおよびBを含んでおり、このときプライマーBはビオチン成分で標識され、増幅はdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で実施される。等モル量の２種の増幅産物を組み合わせ、変性、再アニーリングさせ、次にビオチンで標識されているDNA分子を除去するためにアビジンアフィニティークロマトグラフィーにかけられる。そこでアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉されなかった種は、メチル化シトシンA鎖および非メチル化シトシンB鎖の二本鎖ヘミメチル化分子を含んでいる。結果として生じるヘミメチル化コントロール鋳型（HM−コントロール鋳型）は、亜硫酸水素反応条件を最適化するために使用される。HM−コントロール鋳型のメチル化状態は2本のDNA鎖の各々について絶対的精度として知られているので、亜硫酸水素処理後の予測された配列からの偏差又は２本のコントロール鋳型鎖の収率は、不完全又は過剰に攻撃的な亜硫酸水素処理の程度の定量的測定値である。さらに、コントロール鋳型は、それらの変換に影響を及ぼす派生実験条件での亜硫酸水素処理に対してより耐性であることが公知である、例えばヘアピン、逆方向反復などの特徴を含有するようにエンジニアリングすることができる。本発明のまた別の態様では、HM−コントロール鋳型は、2つの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって作製することもできるが、このとき1の鎖はシトシン位置で置換する5−メチルシトシンを含んでおり、相補的鎖はシトシンを含んでいる。本発明のまた別の態様では、コントロール鋳型は、dATP、dTTP、dGTPおよび5−メチル−dCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下でPCRによって生成することもできる。結果として生じるコントロール鋳型は、両方のDNA鎖上でシトシンに完全に置換する5−メチルシトシンを有しており、過剰な亜硫酸水素処理を監視するための有用なコントロール鋳型である。好ましい実施形態では、二次構造又はホモポリマートラクトの重要度が増加する領域を有する対照鋳型を使用すると、インキュベーション時間、温度、pH、および亜硫酸水素濃度の様々な実験条件下で亜硫酸水素処理の効率を監視することができる。また別の好ましい実施形態では、コントロール鋳型は、複合DNA混合物の存在下で実験条件を検証するためのゲノムDNAに加えられる。また別の好ましい実施形態では、Solexa、SOLiD又は454−プラットフォーム上で高スループット亜硫酸水素−DNAシークエンシングのための内部コントロールを提供するために、微量のコントロール鋳型をゲノムDNAサンプルへ加えることができる。さらにまた別の好ましい実施形態では、本発明のコントロール鋳型は、SOLiD、Solexa、454−、もしくはその他のシークエンシング・プラットフォーム上で高スループットな亜硫酸水素−DNAシークエンシングを行うためのキットもしくはキット構成要素を提供することに使用できる。
【００２５】
当業者であれば、本明細書における開示を前提にすると、本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに、様々な他の改変が明白になる、そして容易に作製することができることが理解されるであろう。
【００２６】
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【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、2007年8月15日に出願された米国特許仮出願第60/935,472号明細書および2007年9月5日に出願された米国特許仮出願第60/935,867号明細書に基づく優先権を主張する。上記の仮出願特許の全内容は、参考として本明細書で援用される。
【０００２】
本発明は、化学改変および高スループットDNAシークエンシングに好適なDNA鋳型を作製するための新規な方法および組成物に関する。本発明の方法は、DNAアダプター設計に関するが、このとき構成要素であるシトシンは、5−メチルシトシンで置換されるため、結果として生じるアダプターを亜硫酸水素媒介性脱アミノ化に対して耐性にさせる。前記アダプターが二本鎖DNA鋳型上に連結されると、その後のDNA変性および亜硫酸水素処理は、鋳型DNAシトシンをウラシルへ差次的に脱アミノ化させるが、連結したアダプターの5−メチルシトシンは化学変換に抵抗するので、結果としてアダプター配列は未変化で残留する。そこで亜硫酸水素処理DNAの両方の鎖は、未変化アダプター配列にハイブリダイズする単一プライマーセットを用いて増幅させることができる。本発明は、さらに亜硫酸水素反応のための条件を最適化するための規定のメチル化組成物の対照鋳型を作製するための方法に関する。好ましい実施形態では、DNAメチル化を試験するための従来型のSolexa（商標）、SOLiD（商標）又は454（商標）−型DNAシークエンシング・プラットフォームを使用する全ゲノムでの亜硫酸水素−DNAシークエンシングに好適な鋳型を作製するのに使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
エピゲノム（epigenomic）調節の主要機序は、DNAメチル化が関与し、それによりS−アデノシル−メチオニンのメチル基がシトシンの5−炭素位へ酵素的にトランスファーされて5−メチルシトシンが産生される（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ヒトでは、大多数のシトシンのメチル化は、CpGアイランド、G＋Cアイソコア及びCpGホットスポットのCpGジヌクレオチドで発生するが、CpNG、CC（a／t）GG、CpAおよびCpT配列内に存在するシトシンが低頻度でメチル化されることもあり得る（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。調節領域内のCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化は、例えばX染色体活性化などの遺伝子サイレンシングに寄与し、癌における腫瘍サプレッサー遺伝子のサイレンシングにおいてしばしば重要な役割を果たすことができる。様々なゲノム領域の低メチル化および高メチル化は、発癌の様々な段階ならびに他の疾患の宿主において報告されてきた（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。そこで、薬物、薬物標的又は有用な疾患のバイオマーカーの発見を導くことができる制御ネットワークを解明するために、ゲノムのメチル化状態として規定されている「メチローム」を特性付ける方法に対する需要がある。
【０００４】
制御ネットワークを解明すべく、ますます増大する解析度でシトシンのメチル化を分析するため、そして疾患のバイオマーカーを同定するために様々な方法が開発されてきた。シトシンのメチル化をアッセイするための初期の方法はクロマトグラフィーに基づいていたが（非特許文献１４）、この方法や他の関連技術はDNAにおける大きなメチル化の変化を考察することしかできないので、低解析度に悩まされる。メチルシトシン分布におけるより精密な変化を分析できる改良された解析度を備える後の方法は、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ又はアフィニティークロマトグラフィーを利用する（非特許文献１５、非特許文献１６）。DNAシークエンシングと結合したシトシンの化学改変は、依然として、エピゲノム試験のための一塩基解析で5−メチルシトシンを検出するための選択法、いわゆる「ゴールドスタンダード」である。「亜硫酸水素−DNAシークエンシング」化学の開発は、シトシンのメチル化の直接的なポジティブな検出を許容する。亜硫酸水素−DNAシークエンシングは、1970年代に開示された化学に端を発し、それは、それにより亜硫酸水素ナトリウムがシトシンの効率的脱アミド化を触媒して、ウラシルを生産する（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。それは、シークエンシングおよびDNA増幅反応においてチミンと機能的に同等である。反応条件に依存して、5−メチルシトシンからチミンへの脱アミノ化速度は、シトシンからウラシルへの速度よりほぼ２桁緩徐であろう（非特許文献２０、非特許文献２１）。非特許文献２２は、メチルシトシンとシトシンとの選択的化学的識別をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と組み合わせて利用して、個々のDNA鎖内に存在する5−メチルシトシンのポジティブな表示を提供した。この最初の報告およびその他から、亜硫酸水素−DNAシークエンシングは、急速に、一塩基レベルでの解析での標的遺伝子座でのシトシンのメチル化を調査するための選択法となり、そして、選択法であり続けた（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献２２）。
【０００５】
近年、DNAメチル化を大規模な全ゲノムで検出するための方法を採用する試みがなされてきた。これらの試みの第１は、差次的DNAメチル化がメチル感受性制限酵素を用いて消化された末端標識DNAの連続分画によって検出される「制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法（RLGS法）」である（非特許文献３０）。このアプローチは、ゲノム内の制限酵素部位のアベイラビリティおよび分布によって制限され、解析度が低い。特許文献１は、別のアプローチについて記載しており、それは、それによって、亜硫酸水素処理DNAがPCRの使用によって選択的全ゲノムDNA増幅と結合される。増幅産物は、次に細胞メチル化状態を評価するために有用な複合DNAメチル化フィンガープリントを産生するためのプライマー伸長アッセイによって調査される。実施されたプライマー伸長アッセイの回数は、このアプローチによる解析度およびゲノム適用範囲の程度を示す。また別のストラテジーは、抗メチルシトシン抗体もしくはメチル−CpG結合タンパク質を用いるメチル化DNAセグメントのアフィニティー精製に基づいている（非特許文献１５；非特許文献１６）。メチル化されたシロイヌナズナ（Arabidopsis）DNAの免疫沈降およびアフィニティークロマトグラフィーは、捕捉された標識産物のゲノムオリゴヌクレオチド・タイリングアレイへのハイブリダイゼーションとの共役によって、最初の全ゲノムメチル化マップが作られた（非特許文献１５）。結果として生じたメチル化マップは、タイリングアレイ上のオリゴヌクレオチドの長さに対応する35塩基分解能を有している。より低い分解能のアレイを使用したヒト癌細胞系に関する類似の試験は、様々にメチル化された極めて多数の遺伝子を解明した（非特許文献３１；非特許文献３２）。このアプローチは、全ゲノムスキャンのためには有用であるが、アレイの分解能によって、および、それをアフィニティー精製によって捕捉できる前のDNAフラグメント上の最小閾値密度のメチル−CpGによって妨害される。したがって、相当に大量の出発材料が必要とされるので、多数の臨床用途における使用は不可能にされる。当技術分野においては、より少量の出発材料しか必要とせず、一塩基レベルでのより高い分解能を有する、明瞭、かつ更に感受性の高いの検出方法が必要とされる。
【０００６】
近年まで、技術的困難性が、全ゲノムでのメチル化変化をマッピングするための亜硫酸水素−DNAシークエンシングアプローチの使用を妨害してきた。非特許文献３３は、原理検証実験の小規模試験において、一塩基分解能でのゲノムDNAライブラリーインサートの5−メチルシトシンをマッピングするために亜硫酸水素−DNAシークエンシングを使用することの実現可能性を証明した。アダプターを備えた、サイズを選択してランダムに断片化されたゲノムDNAフラグメントは、亜硫酸水素により処理され、PCRにより増幅させられ、シークエンシングのためにベクター内へクローニングされた。結果として生じたシーケンスデータは99.9％を超えるシトシンからウラシルへの変換率を明らかにしたが、これはゲノムライブラリー・インサートのランダムショットガン亜硫酸水素−DNAシークエンシングを全ゲノム規模に適用できることを示している。しかし、このアプローチの使用は、従来型のサンガー法をベースとするジデオキシシークエンシングおよびキャピラリーをベースとする電気泳動法の高額な費用および低スループットによって本質的に妨げられ、制限される。したがって、当技術分野においては、低コストであって高スループットを備える亜硫酸水素−DNAシークエンシングの改良された方法に対する需要が依然として存在する。
【０００７】
次世代大規模並列処理塩基配列決定技術は、相当に大きな費用削減を伴って数桁大きいスループットを提供するが、現在のところ、これらのプラットフォームはDNAメチル化の経済的な全ゲノム調査を可能にする亜硫酸水素−DNAシークエンシングには採用されていない。現在、高スループットDNAシークエンシングのためには3種のシステムを市販で入手できる。The Genome Sequencer FLX（商標）システム（一般には、454（商標）−シーケンサーとして公知である）（Roche Diagnostics、米国インディアナ州インディアナポリス）、Solexa（商標）（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、およびSOLiD（商標）システム（Applied BioSystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）。
【０００８】
454−テクノロジーは、高密度光学プレートのエッチングされたウエルに個別に装填されたマイクロビーズ上でクローナルに増幅させるDNA鋳型上で実施される従来型ピロシークエンシング化学に基づいている（非特許文献３４）。各塩基伸長によって生成されたシグナルは、専用光ファイバーによって捕捉される。
【０００９】
Solexaシークエンシング鋳型は、専売のフローセル表面上に固定され、その場所でそれらは１平方センチメートル当たり1,000万個までのクラスター密度を備える分離したシーケンス鋳型クラスターを形成するために、in situでクローナルに増幅させられる。Solexaをベースとするシークエンシングは、可逆性３’−ジデオキシヌクレオチド成分および開裂可能なクロモフルオル（chromofluor）を有する専売の４つの改変ヌクレオチドの存在下において、段階的方法でプライマー媒介DNA合成法を用いて実施される。3’−ジデオキシヌクレオチド成分およびクロモフルオルは、連続的ベースコーリング（塩基呼出し）のための各伸長サイクル前に化学的に除去される。各鋳型クラスターからの段階的ヌクレオチド付加のサイクルは、レーザー励起、およびその後の、それからベースコーリングが達成されるイメージングによって検出される。
【００１０】
大規模並列処理塩基配列決定法のためのApplied BiosystemsのSOLiDアプローチは、ハーバード大学のGeorge Churchによって開発されたストラテジーであるDNA連結反応の連続サイクルに基づいている（非特許文献３５）。このアプローチによって、固定されたDNA鋳型は、ガラス製フローセルの表面上に高密度でプレーティングされているビーズ上でクローナルに増幅させられる（エマルジョンPCR）。塩基配列決定は、固定化された鋳型へハイブリダイズさせた一連のプライマー上で短い規定標識プローブの連結反応の連続サイクルによって遂行される。
【００１１】
これらの新規機器からのスループットは、機器1回のラン当たりのベースコールが数十億回を超えることができ、これは現世代の96レーンのキャピラリー電気泳動法に基づくシークエンシング機器のファクターのほぼ1万5千倍以上である。そこで、DNAメチル化の費用効果的な全ゲノム調査を可能にするために454−、Solexa、又はSOLiDシークエンシング・プラットフォームへ亜硫酸水素−DNAシークエンシング化学を採用するための方法および組成物の未だ満たされていない需要がある。非特許文献３３は、彼らの予備的研究において、新世代454−DNAシーケンサーであれば亜硫酸水素−DNAシークエンシングの全ゲノム適用を可能にするための経済的な解決策を提供できると提案したが、彼らは極めて重要な問題について考察せず、具体化するための方法についても開示しなかった。より重要なことに、上記の研究者らは、彼らのアプローチを典型的な配列解読が35〜50塩基長に過ぎないSolexaもしくはSOLiDプラットフォームに適用する際の大きな困難を認識していなかった。そこで本発明は、これらやその他の実質的な利点を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第6,214,556号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Caiafa P and Zampieri M, 2005. DNA methylation and chromatin structure: The puzzling CpG islands. J Cell Biochem 94: 257-265
【非特許文献２】Novik, KL et al, 2002. Epigenomics: Genome-wide study of mtheylation phenomena. Curr Issues Mol Biol 4: 111-128
【非特許文献３】Bird A, 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memmory. Genes Dev 16: 6-21
【非特許文献４】Costello JF and Plass C, 2001. Methylation matters. J Med Genet 38: 285-303
【非特許文献５】Laird PW and Jaenisch R, 1996. The role of DNA methylation in cancer genetics and epigenetics. Ann Rev Genet 30: 441-464
【非特許文献６】Lorincz MC and Groudine M, 2001. CmC(a/t)GG methylation: A new epigenetic mark in mammalian DNA? Proc Natl Acad Sci (USA) 98: 11034-10036
【非特許文献７】Woodcock DM et al, 1997. Asymmetic methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human Ll retrotransponson. J Biol Chem 272: 7810-7816
【非特許文献８】Clark SJ et al, 1995. CpNpG methylation in mammalian cells. Nat Genet 10: 20-27
【非特許文献９】Jones P and Baylin SB, 2007. The epigenomics of cancer. Cell 128: 683-692
【非特許文献１０】Brena RM and Costello JF, 2007. Genome-epigenome interactions in cancer. Hum Mol Genetics 16: R96-R105
【非特許文献１１】Esteller M, 2007. Epigenetic gene silencing in cancer: The DNA hypermethylome. Hum Mol Gen 16: R50-59
【非特許文献１２】Rodenhiser D and Mann M, 2006. Epigentics and human disease: Translating basic biology into clinical applications. CMAJ 174: 341-348
【非特許文献１３】Laird PW and Jaenisch R, 1996. The role of DNA methylation in cancer genetics and epigenetics. Ann Rev Genet 30: 441-464
【非特許文献１４】Hotchkiss RD, 1948. The quantitative separation of purine, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. J Biol Chem 175: 315-332
【非特許文献１５】Zhang X et al, 2006. Genome-wide high-resolutioin mapping and functional analysis of DNA methylation in ArABIdopsis. Cell 126: 1189-1201
【非特許文献１６】Cross SH et al, 1994. Purification of CpG islands using a methylated DNABInding column. Nature Genet 6: 236-244
【非特許文献１７】Shapiro R et al, 1973. Nucleic acid reactivity and conformation II: Reaction of cytosine and uracil with sodium bisulphite. J Biol Chem 248: 4060-4064
【非特許文献１８】Shapiro R et al, 1970. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulphite: A specific deamination method. J Am Chem Soc 92: 422-424
【非特許文献１９】Hayatsu H et al, 1970. Reaction of sodium bisulphite with uracil, cytosine, and their derivatives. Biochem 9: 2858-2865
【非特許文献２０】Hayatsu H and Shiragami M, 1979. Reaction of bisulphite with the 5-Hydroxymethyl groups in pyrimidines and in phage DNAs. Biochem 18: 632-637
【非特許文献２１】Wang RY et al, 1980. Comparison of bisulphite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nuc Acids Res 8: 4777-4790
【非特許文献２２】Frommer M et al, 1992. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci (USA) 89: 1827-1831
【非特許文献２３】Ehrich M et al, 2007. A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulphite treatment. Nuc Acids Res 35: e29
【非特許文献２４】Grunau C et al, 2001. Bisulphite genomic sequencing: Systematic investigation of critical experimental parameters. Nuc Acids Res 29: e65
【非特許文献２５】Eads CA et al, 2000. MethyLight: A high-throughput assay to measure DNA methylation. Nuc Acids Res 28: e32
【非特許文献２６】Paulin R et al, 1998. Urea improves efficiency of bisulphite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA. Nuc Acids Res 26: 5009-5010
【非特許文献２７】Clark SJ et al, 1994. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nuc Acids Res 22: 2990-2997
【非特許文献２８】Raizis AM et al, 1995. ABIsulphite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem 226: 161-166
【非特許文献２９】Feil R et al, 1994. Methylation analysis on individual chromosomes: Improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nuc Acids Res 22: 695-696
【非特許文献３０】Hatada I et al, 1991. A genomic scanning method for higher organisms using restriction sites as landmarks. Proc Natl Acad Aci (USA) 88: 9523-9527
【非特許文献３１】Keshet I et al, 2006. Evidence for an instructive mechanism of de novo methylation in cancer cells. Nat Genet 38: 149-153
【非特許文献３２】Weber M et al, 2005. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet 37: 853-862
【非特許文献３３】Meissner A et al, 2005. Reduced representation bisulphite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nuc Acids Res 33: 5868-5877
【非特許文献３４】Margulies M et al, 2005. Genome sequencing in microfabricated high-density picrolitre reactors. Nature 437: 376-380
【非特許文献３５】Shendure J et al, 2005. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science 309: 1728-1732
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、シトシンのメチル化パターンにおける変化についての大規模高スループット全ゲノム調査を可能にする目的で次世代DNAシーケンサーにおいて使用するための、およびその他の好適な利用のための、亜硫酸水素−DNAシークエンシングのための新規の改良された方法および有用な組成物を提供する。
【００１５】
Meissner他著（2005）の予備的研究は、それによって短いDNAアダプターが、複数のサイズ選択された、そして、ランダムに断片化されたゲノムDNAフラグメントの各末端へ最初に連結される、亜硫酸水素−DNAシークエンシングアプローチについて記載している。アダプター連結DNAは、亜硫酸水素処理に対して感受性である一本鎖形態に変性させられ、ここで、存在するシトシンがウラシルに変換させられるが、5−メチルシトシンは変化を受けない。変換させられたDNAは、DNA鎖を再生するため、および従来型キャピラリー電気泳動法によるシークエンシング分析のための、ベクター内へ効率的にクローニングするための十分な質量の亜硫酸水素−変換DNA産物を生成するため、プライマーを用いてアダプター領域へ増幅させられる。この試験は、このアプローチが試験ゲノムDNAの普遍性の提示を提供し、規模の実行可能性を有することを証明している。しかし、Meissner他の標的DNAの亜硫酸水素処理の重要な結果は、連結されたアダプター内の全シトシンも同様にウラシルへ変換されることである。したがって、DNA増幅を実施するためには、PCRプライマーはアダプター配列にはハイブリダイズしないように設計され、その代りにアダプターの亜硫酸水素変換配列にハイブリダイズするように設計されるが、これはいわゆる「メチル化特異的PCR」法（Cottrell（2004）、Li and Dahlya（2002）、Herman and Baylin（1997）（米国特許第6,017,704号）、Herman他著（1996））の基礎となるストラテジーである。処理された亜硫酸水素を増幅させるために好適であることが当技術分野において公知な他の適切なPCRプライマー設計には、亜硫酸水素改変部位からDNAを増幅させることのできる縮重プライマーの使用又はDNAのシトシン非含有領域内のDNAを標的とする極めて短いプライマーの使用が含まれる（Olek他著（1998）（米国特許第6,214,556号））。
【００１６】
メチル化特異的PCRによって課されたプライマー設計における制限は、当技術分野において記載されているように、現在のABI社製SOLiD又はIllumina社製Solexaの高スループットシークエンシング・プラットフォームとともに使用するには適合しない。これらのプラットフォームは、サンプルDNAインサートのすぐ隣に位置する最適化され、そして検証された専売のアダプター配列の強制的使用を必要とする。これらの専売のアダプターは、DNAシークエンシング鋳型のクローナルな固相増幅およびシークエンシングプライマーの結合を媒介するように機能する。SolexaおよびSOLiDシーケンサーの解読長は、35塩基に過ぎない（2008年後期には50塩基以上に伸長している）。専売アダプターと、例えばメチル化特異的PCRのために必要とされるようなDNAインサートとの間に位置する外部配列は、サンプルDNAの既に短い解読長を許容できないレベルへ減少させるであろう。結果として、現代のSolexaおよびSOLiDのプラットフォームは、上述のように、メチル化特異的PCR法によって作製された産物をシーケンスできない（Meissner他著（2006）、Cottrell著（2004）、Li and Dahlya著（2002）、Herman and Baylin（1997）（米国特許第6,017,704号明細書）、Herman 他著（1996））。亜硫酸水素変換アダプター配列が固体支持体上でのクローナルな増幅ならびにSolexaおよびSOLiDプラットフォーム上でのシークエンシングプライマー結合を媒介できるアダプター設計を引き出すことは形式的には可能であるが、技術的および経済的挑戦は極めて厄介である。アダプター上でのシトシンからウラシルへの亜硫酸水素変換は遺伝コードをたった3つの塩基へと効果的に減少させるが、それによって、プラットフォームによって必要とされる固相増幅のためおよび高スループットDNAシークエンシングの特異的プライミングのために効率的および特異的に機能することのできる厳しい制限を設計に課すであろう。さらに、亜硫酸水素変換はアダプターの両方の鎖を非相補的にさせ、それにより固相増幅プライマーおよびシークエンシングプライマーの追加のセットの作製および検証が必要になり、このプライマーは他のサンプルDNA鎖のためのものである。SOLiDおよびSolexaのシークエンシング・プラットフォームの既存のアダプターおよびプライマー設計を開発および検証するために、企業の膨大な経費、時間および資源が消費されてきた。既に市場に存在する既存製品への大きな設計変化は、許容不可能な財政負担を課すであろう。454−シーケンサーの解読長は数百塩基であり、サンプルDNA鋳型内のメチル化特異的PCRプライマーの付加によって負わされる解読長の短縮に苦しまされるであろう。しかし、454−鋳型内の外部配列の排除は、そのプラットフォームの効率を高めるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、DNAメチル化を試験する目的で亜硫酸水素処理DNA鋳型をシーケンスするために既存のSOLiD、Solexa又は454−に基づくシークエンシング・プラットフォームを採用するための新規な単純で効果的かつ低コストの方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一態様は、新規なアダプター組成物であって、構成要素のシトシンは、結合した鋳型DNAの亜硫酸水素処理中に、前記アダプターを脱アミノ化に対して耐性にさせるために5−メチルシトシンで置換されるアダプター組成物の作製である。本発明のアダプターが鋳型DNAに連結されると、DNA変性および亜硫酸水素処理は鋳型DNAのシトシンをウラシルへ変換させるが、アダプターの配列は未変化のままとなる。そこで亜硫酸水素処理DNAの両方の鎖は、最初の変化したアダプター配列に相補的である単一プライマーセットを用いて増幅させることができる。これとは対照的に、従来型アダプターのシトシンは、亜硫酸水素処理鋳型を増幅させるためにアダプターの亜硫酸水素変換配列へハイブリダイズするPCRプライマーの使用を必要とする亜硫酸水素処理によってウラシルへ変換させられる。亜硫酸水素処理もまた、2本のDNA鋳型鎖を非相補的にさせる。従来型アダプターの2本鎖も、また亜硫酸水素処理によって非相補的にさせられ、結果として各DNA鎖を増幅させるために別個のセットのプライマーが必要になる。本発明のアダプター組成物は、この問題に悩まされず、2本のアダプター鎖は相補的なままとなり、そして、単一のプライマーセットは、Solexa、SOLiD又は454−シークエンシング・プラットフォーム上でシークエンシングのための鋳型を調製する目的での亜硫酸水素処理DNAの2本の鎖を増幅させるために十分である。これらの確立されたプラットフォームによる本発明の採用は、材料費用をほとんど、もしくは全く発生しないと予想されるが、これはプラットフォームの専売アダプターの一次配列が変化せず、したがって固相DNA増幅およびシークエンシングプライマー結合などの全ての下流の操作が影響を受けないからである。好ましい実施形態では、本発明の一態様は、SOLiD、Solexa、454−、もしくはその他のメチル化試験のためにシークエンシング・プラットフォーム上で高スループット亜硫酸水素−DNAシークエンシングを行う目的でDNA鋳型を調製するためのキットもしくはキット構成要素を作製するために使用できる。キット構成要素は、アダプター内のシトシンに対する5−メチルシトシンの単純および低コスト置換物以外は、従来型シークエンシングの供給業者によって現在供給されているキット構成要素と本質的には同一である。
【００１９】
典型的には、アダプターは、天然、もしくは、当技術分野において公知の様々な合成経路を用いて化学合成もしくは酵素支援合成によって作製される改変オリゴヌクレオチドを含む２本の相補的DNAオリゴヌクレオチド鎖を含んでいる（Review:Verma and Eckstein著（1998）、Goodchild著（1990））。5−メチルシトシンを産生するためにシトシンの5−炭素位でのメチル基のコンジュゲーションなどの改変塩基を含むオリゴヌクレオチドは、Operon社（独国ケルン）、Sigma-Proligo社（仏国パリ）、およびGenosys社（米国ミズーリ州セントルイス）を含む様々な市販の供給業者から入手できる。化学合成の代替法としては、シトシンが酵素認識部位内にあることを前提として、メチルトランスフェラーゼを用いてアダプター−DNAを酵素的にメチル化することが可能である。代用反応におけるDNAポリメラーゼの使用又はPCRによってアダプター−DNA内へ5−メチル−dCTPを組み込むこともまた可能である。当業者であれば、最適化されたアダプター設計および合成方法を知っている。操作上、アダプターの２本のDNA鎖は、二本鎖分子を形成するためにアニーリングさせられる。一般に、アダプター配列は、10〜100塩基対（bp）で変動してよいが、典型的には15〜30bpである。アダプターの配列組成は可変性であるが、一般に潜在的プライマー結合およびその他の官能性を妨害する可能性がある逆方向反復などは含まれていない。一部の用途では、アダプターは、連結したアダプターが１以上の標的DNA末端へ連結することを可能にするために空間的に一緒に連結させることができる。この用途の典型は、それが望ましい場合は、クローナルな増幅およびその後の次世代Solexa、SOLiD又は454−DNAシーケンサー上でのシークエンシングの場合と同様に、鋳型DNAの各末端に連結した相違するアダプターを有することである。標的DNAへ連結したアダプターの分子間連結反応は、環状分子を産生するための分子内連結反応が続き、それによって標的DNAは2つの相違するアダプターによってフランキングされる。環状分子を産生するための分子内連結反応の条件は、ある範囲のフラグメント長にわたるDNAセグメントについて記載されてきた（Collins and Weissman著（1984）、Dugaiczyk他著（1975）、Wang and Davidson著（1966））。アダプターは、DNAへの連結反応を促進するために相違する末端構造を有するように操作することができる。平滑末端は、パートナーの相補的末端を有するDNAフラグメントへ連結反応するための特異的な相補的付着端と同様に、一般的に使用されている。アダプターをDNAへ連結させるため、およびアダプターを連結された標的とするプライマーを用いた全ゲノムDNA増幅のための方法は、当該技術分野において公知である（Hughes他著（2005）、Klein他著（1999）、Lucito他著（1989）、Ludecke他著（1989）、Kinzler and Vogelstein（1989））。アダプターは、上記の5−メチルシトシンを用いたシトシンの置換に加えて、他の改変もしくは共役化ヌクレオチドを含むことができる。亜硫酸水素処理又は改変アダプターシトシンからゲノムシトシンを識別できる他の差次的化学処理に対してアダプター分子を耐性にさせることのできるシトシンの化学改変は、本発明の範囲および原理内に含まれると見なされる。さらにまた、他の細胞エピゲノム的なDNA改変を調べるために使用するためにゲノムDNAから改変アダプター−DNAを識別できる化学反応が存在する、その他のアダプター塩基の改変もまた本発明の範囲および原理内に含まれると見なされる。さらにまた、化学処理の様々な工程の前、後もしくはその最中にアダプター連結DNAの簡便なアフィニティー精製を許容するために、三重へリックス形成オリゴヌクレオチド（Review、Vasquez and Glazer（2002）、Sun他著（1996））等によって標的とされ得る成分もしくはDNA配列を含有するビオチンなどのエピトープもしくは精製タグをアダプターへ組み込むこともまた本発明の範囲および原理内に含まれると見なされる。
【実施例】
【００２０】
本発明によって分析するDNAは、任意の細胞、組織、又は器官に由来してよい。一部の実施形態では、DNAは、疾患状態におけるメチル化パターンにおける大域的変化を評価するために、臨床的治療の様々な時点もしくは段階にある疾患表現型を備える腫瘍もしくはその他の細胞に由来する。したがって、本発明を、疾患又は疾患感受性又は疾患予後のゲノム診断的又は予後診断的メチル化バイオマーカーとして使用することができる。Ordway他著（2006）、Sova他著（2006）、およびShames他著（2006）は、そのようなバイオマーカーの具体的実施例を提供している。その他の有用性には、治療的介入のための薬物もしくは薬物標的の同定をもたらす調節ネットワークの解明が含まれる。
【００２１】
全ゲノムメチル化試験のためのDNAは、ゲノムの不偏性の分析を提供するためのランダムフラグメント化によって生成することができる。適切なサイズのDNAは100〜5,000bp以上の範囲であってよく、典型的には100〜250bpが好ましい。ランダムDNAフラグメントを生成するための方法は：（１）マンガンイオンの存在下でDNAにランダム二本鎖開裂を作製するウシ膵臓デオキシリボ核酸ヌクレアーゼＩ（DNase I）（Melgar and Goldthwait（1968））、（２）物理的剪断（Shriefer他著（1990））、及び（３）超音波処理（Deininger（1983）を含んでいる。一部の実施形態では、ゲノムDNAは、ゲノム内で遺伝子と関連するGCリッチ領域であるCpGアイランド配列への消化を優先的に標的とする酵素を用いて消化することができる（Kato and Sasaki（1998））。大きな比率のメチル化はCpG配列内で発生するので、そこで例えばMsp I（CCGG）、Hae III（GGCC）、Taq I（TCGA）などの酵素によるゲノムDNAの消化は、ゲノムのそれらの領域への亜硫酸水素−DNAシークエンシングを優先的に標的とするであろう。GCジヌクレオチド位置でDNAを開裂する緩和条件下での制限エンドヌクレアーゼCviJ Iの使用（Fitzgerald他著（1992））は、DNAフラグメントサイズの有用な連続体を生成するための部分消化条件下で特に有用である。
【００２２】
コンピュータシミュレーション解析は、所与のランダムな50塩基の解読が、ヒトゲノム参照アッセンブリーへの明白な指定の約93％の見込みを表すことを示している。Msp I（CCGG）もしくはHae III（GGCC）部位とG＋Cリッチを有する他の酵素認識部位によってフランキングされた50bpフラグメントについては、ゲノムアッセンブリーへの明白な割当ては、ゲノム内の大多数の反復DNAエレメントはより低いGC含量を有する、そしてこれらの酵素部位はこれらのゲノム領域内で過小評価されるという観察所見に起因して99％より高い。コンピュータモデルは、さらにMsp I、Hae IIIおよびTaq I消化によって生成されるフラグメント内で高度のオーバーラップをも示す。50〜400bpフラグメントサイズ範囲内では、大多数のCpGアイランド配列は、3種の酵素による個別消化から構築されたゲノムライブラリーからのオーバーラップする50bpの解読によってカバーされる可能性がある。亜硫酸水素処理DNAは、一般に、ロークエリーを３塩基遺伝子コードへ効果的に短縮するシトシンからウラシル（チミン）への変換に起因して、参照配列への低比率の明白な割当てを経験する。この問題は、SolexaおよびSOLiD配列の配列長を伸長させるペア−末端解読能力を用いて、ならびに対向DNA鎖を用いたコンセンサス・アラインメントおよびコンティグ構築（contig-building）によって処理することができる。メチル化状態における変化を同定することに加えて、本発明は、配列データが参照配列と比較されると、さらに同時に他の遺伝子変化および体細胞変化を同定するであろう。メチル化データのクラスター化分析のための情報ツールは、当技術分野に存在する（Wang他著（2007）、Segal著（2006）、Siegmund著（2004）、Virmani他著（2002）、Model他著（2001）、Eads他著（2000））。
【００２３】
亜硫酸水素−DNAシークエンシングには有用性があり、広汎に使用されているにもかかわらず、本方法はプロセッシング誤差ならびに亜硫酸水素処理に固有の競合および望ましくない化学反応の問題を生じさせる傾向がある。これらの問題は、全ゲノム適用においてより顕著になるであろう。攻撃的な亜硫酸水素処理プロトコール（すなわち、長いインキュベーション時間、高温、又は高い亜硫酸水素濃度）は、シトシンからウラシルへの完全な変換を保証するが、脱プリンからのDNAの許容できない断片化ならびに5−メチルシトシンからチミンへの最終的な変換というリスクを備える（Hayatsu and Shiragami著（1979）、Wang他著（1980））。低攻撃的処理は、シトシンからウラシルへの不完全な変換に起因するメチル化レベルを過剰評価するというリスクをもたらす。したがって、温度、pH、反応時間、亜硫酸水素濃度、DNA変性の効率などの重要な実験条件に関して、亜硫酸水素変換プロセスの継続的な最適化に向けて多大な研究が行われている（Ehrich他著（2007）、Hayatsu他著（2006）、Grunau他著（2001）、Eads他著（2000）、Paulin他著（1998）、Clark他著（1994）、Raizis他著（1995）、Feil他著（1994）、Frommer他著（1992））。プロセスを最適化するための大きな制限事項は、亜硫酸水素変換に固有の複雑かつ競合する反応を監視するための簡便かつ包括的なコントロール鋳型が欠如することである。亜硫酸水素変換の効率を評価するための現行方法は、処理後のDNAの品質を試験するために高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、ゲル電気泳動法、および質量分析法を利用する（Ehrich他著（2007））。亜硫酸水素反応の最適化実験におけるウラシルへのシトシン変換率は、典型的にはメチル化−PCRアッセイ、およびその後の１以上のゲノム試験遺伝子座（locci）（Frommer他著（1992））に由来する、又はそれにより両方のDNA鎖の規定部位がメチルトランスフェラーゼを使用してメチル化される試験コントロール鋳型に由来するクローン産物のシークエンシングによって測定される。メチルトランスフェラーゼを利用したin vitroでのメチル化に由来するコントロール鋳型は、潜在的な不完全な酵素反応に悩まされ、特異的部位でのチミンの存在が不完全なin vitroでのメチル化に起因するのか、又はメチルシトシンをチミンへ変換させることのできる過度に攻撃的な亜硫酸水素変換に起因するのかを識別することを困難にする（Hayatsu and Shiragami著（1979）、Wang他著（1980））。さらに、所与のメチルトランスフェラーゼのための認識部位内にあるシトシンしか評価することができない。そこで、特に亜硫酸水素シークエンシングを全ゲノム規模で実施しなければならない場合には、亜硫酸水素変換プロセスにおける複雑かつ競合する反応を監視するための簡便で、頑丈かつ包括的アッセイに対する要求がある。
【００２４】
本発明のまた別の態様は、亜硫酸水素反応の条件を最適化するための精確に規定されたシトシンのメチル化組成物の合成コントロール鋳型を作製するための方法を提供する。本発明の1つの態様では、コントロール鋳型は、2つの相補的なアニーリングされたDNA鎖AおよびBを含んでおり、このときB鎖のシトシンは5−炭素位でメチル化され、A鎖のシトシンはメチル化されない。結果として生じるヘミメチル化DNA分子は、共通DNA鋳型に由来する2つの独立増幅反応の産物をアニーリングすることによって構築される。第1反応は、増幅プライマーAおよびBを含んでおり、このときプライマーAはビオチン成分で標識され、プライマーBのシトシンは5−メチルシトシンで置換され、増幅はdATP、dTTP、dGTPおよび5−メチルdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物（各ヌクレオチドの10mMが典型的濃度である）の存在下で実施される。第２増幅反応は、プライマーAおよびBを含んでおり、このときプライマーBはビオチン成分で標識され、増幅はdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で実施される。等モル量の２種の増幅産物を組み合わせ、変性、再アニーリングさせ、次にビオチンで標識されているDNA分子を除去するためにアビジンアフィニティークロマトグラフィーにかけられる。そこでアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉されなかった種は、メチル化シトシンA鎖および非メチル化シトシンB鎖の二本鎖ヘミメチル化分子を含んでいる。結果として生じるヘミメチル化コントロール鋳型（HM−コントロール鋳型）は、亜硫酸水素反応条件を最適化するために使用される。HM−コントロール鋳型のメチル化状態は2本のDNA鎖の各々について絶対的精度として知られているので、亜硫酸水素処理後の予測された配列からの偏差又は２本のコントロール鋳型鎖の収率は、不完全又は過剰に攻撃的な亜硫酸水素処理の程度の定量的測定値である。さらに、コントロール鋳型は、それらの変換に影響を及ぼす派生実験条件での亜硫酸水素処理に対してより耐性であることが公知である、例えばヘアピン、逆方向反復などの特徴を含有するようにエンジニアリングすることができる。本発明のまた別の態様では、HM−コントロール鋳型は、2つの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって作製することもできるが、このとき1の鎖はシトシン位置で置換する5−メチルシトシンを含んでおり、相補的鎖はシトシンを含んでいる。本発明のまた別の態様では、コントロール鋳型は、dATP、dTTP、dGTPおよび5−メチル−dCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下でPCRによって生成することもできる。結果として生じるコントロール鋳型は、両方のDNA鎖上でシトシンに完全に置換する5−メチルシトシンを有しており、過剰な亜硫酸水素処理を監視するための有用なコントロール鋳型である。好ましい実施形態では、二次構造又はホモポリマートラクトの重要度が増加する領域を有する対照鋳型を使用すると、インキュベーション時間、温度、pH、および亜硫酸水素濃度の様々な実験条件下で亜硫酸水素処理の効率を監視することができる。また別の好ましい実施形態では、コントロール鋳型は、複合DNA混合物の存在下で実験条件を検証するためのゲノムDNAに加えられる。また別の好ましい実施形態では、Solexa、SOLiD又は454−プラットフォーム上で高スループット亜硫酸水素−DNAシークエンシングのための内部コントロールを提供するために、微量のコントロール鋳型をゲノムDNAサンプルへ加えることができる。さらにまた別の好ましい実施形態では、本発明のコントロール鋳型は、SOLiD、Solexa、454−、もしくはその他のシークエンシング・プラットフォーム上で高スループットな亜硫酸水素−DNAシークエンシングを行うためのキットもしくはキット構成要素を提供することに使用できる。
【００２５】
当業者であれば、本明細書における開示を前提にすると、本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに、様々な他の改変が明白になる、そして容易に作製することができることが理解されるであろう。
【００２６】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的DNA集団のエピゲノム状態を決定するための方法であって、
前記標的DNA集団を適切なサイズへ断片化する工程であって、ここで、１以上の位置又は全位置で未改変ヌクレオチドアナログと置換する改変ヌクレオチドを含む組成物の１以上の相違する改変アダプターが標的DNAへ連結反応され、（１）標的DNAフラグメントの両末端へ連結された同一改変アダプター、又は（２）標的DNAフラグメントの各末端へ連結された相違する改変アダプターを含む組成物が生産される、工程を含み、
その後、前記改変アダプターが連結された標的DNAは、標的DNA組成物および改変アダプター組成物を化学的および機能的に識別可能にするよう化学的に処理され、このとき、連結された前記改変アダプターは本質的かつ機能的には変化しないものであり、
その後、化学的に処理された前記改変アダプター連結DNAを、前記改変アダプターの配列に相補的であるプライマーを用いて少なくとも１回増幅し、
その後、増幅DNAはDNAシークエンシングに供される、方法。
【請求項２】
標的DNA集団のシトシンのメチル化状態を決定するための方法であって、
前記標的DNA集団を適切なサイズへ断片化する工程であって、ここで、１以上の位置又は全シトシン位置で、シトシンと置換する改変ヌクレオチドを含む組成物の１以上の相違する改変アダプターが標的DNAへ連結反応され、（１）標的DNAフラグメントの両末端へ連結された同一改変アダプター、又は（２）標的DNAフラグメントの各末端へ連結された相違する改変アダプターを含む組成物が産生される、工程を含み、
その後、前記改変アダプターが連結された標的DNAは、標的DNA組成物および改変アダプター組成物を化学的および機能的に識別可能にする化学処理にかけられ、このとき前記改変アダプターは本質的かつ機能的には変化しないものであり、
その後、前記化学処理された改変アダプター連結DNAを、前記改変アダプターの配列に相補的であるプライマーを用いて少なくとも１回増幅し、
その後、増幅DNAはDNAシークエンシングに供される、方法。
【請求項３】
前記標的DNA集団の前記エピゲノム状態が、5−炭素位でのシトシンのメチル化である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記改変アダプターが、任意の改変されたアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンヌクレオチドからなる群から選択される１以上の改変ヌクレオチドから構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記改変アダプターが、任意のメチル化ヌクレオチドからなる群から選択される１以上の改変ヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記改変アダプターが、5−メチルシトシンからなる群から選択される１以上の改変ヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記化学処理が、シトシンの亜硫酸水素媒介性脱アミノ化である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
任意の表現型と相関させることのできる遺伝的又はエピゲノム相違を識別するために１以上の参照DNA配列上でマッピングもしくはアライニングすることによって、正常、疾患もしくは他の表現型の起源に由来する配列データを特徴付ける、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記改変アダプターが、機器、又は目視検査によって読み取ることのできる検出可能なシグナルを生成できる成分に共役される任意のヌクレオチドからなる群から選択される１以上のヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変アダプターが、固体支持体上でDNA増幅を指示することができる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変アダプターが、固体支持体上で等温DNA増幅を指示することができる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変アダプターが、別の改変アダプターへ機能的および空間的に連結される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記改変アダプターが、アフィニティー精製タグに共役されている任意のヌクレオチドからなる群から選択される１以上のヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変アダプターが、ビオチン成分に共役されている任意のヌクレオチドからなる群から選択される１以上のヌクレオチドから構成される、請求項１および２に記載の方法。
【請求項１５】
前記DNAアダプターが、DNAとともに三重へリックス構造を形成することのできるオリゴヌクレオチドによって標的化され得る１以上の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記三重へリックス形成オリゴヌクレオチドが、アフィニティー精製タグに共役されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的DNAが、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、クロロプラストDNA、プラスチドDNA、cDNA、ウイルスDNA、微生物DNA、化学合成DNA、核酸増幅のDNA産物、およびRNAから転写されたDNAからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的DNAが、機械力の適用によって、又は１以上のヌクレアーゼ酵素を単独、又は併用して用いた完全もしくは部分消化によって、ランダムに断片化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼ酵素が、Bsh1236 I、BstU I、CviJ I、FspB I、Hae III、Hha I、Hpa II、Mse I、Msp I、Sau3 AI、Taq I、Tsp509 I、それらのアイソシゾマーおよびネオシゾマーを含む群から選択される制限エンドヌクレアーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
亜硫酸水素反応の効率を監視するためにヘミメチル化DNAコントロール鋳型を作成するための方法であって、
2つの相補的なDNAのA鎖およびB鎖をアニーリングさせる工程であって、このときB鎖のシトシンは5−炭素位でメチル化され、A鎖のシトシンはメチル化されていない、
前記A鎖は、プライマーAおよびBを含む増幅反応において作製され、これによりプライマーAはビオチン基で標識され、プライマーBのシトシンは5−メチルシトシンで置換され、DNA増幅はdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で行われ、
前記プライマーBは、プライマーAおよびBを含むプライマーAと同一DNA鋳型を用いる増幅反応で作製され、これにより、プライマーBはビオチン基で標識され、DNA増幅はdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で行われ、
そして、等モル量の２種の増幅産物を組み合わし、変性、再アニーリングさせ、次に望ましくない産物を除去するためにアビジンアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を含む、方法。
【請求項２１】
メチル化DNAコントロール鋳型を作成するための方法であって、両方の鎖のシトシンは亜硫酸水素反応の効率を監視するために５−炭素位でメチル化され、
プライマーを用いたコントロールDNA鋳型のDNA増幅工程であって、このとき構成要素のシトシンは5−メチルシトシンで置換され、そして、DNA増幅はdATP、dTTP、dGTPおよび5−メチル−dCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で行われる工程を含む、方法。
【請求項１】
標的DNA集団のエピゲノム状態を決定するための方法であって、
前記標的DNA集団を適切なサイズへ断片化する工程であって、ここで、１以上の位置又は全位置で未改変ヌクレオチドアナログと置換する改変ヌクレオチドを含む組成物の１以上の相違する改変アダプターが標的DNAへ連結反応され、（１）標的DNAフラグメントの両末端へ連結された同一改変アダプター、又は（２）標的DNAフラグメントの各末端へ連結された相違する改変アダプターを含む組成物が生産される、工程を含み、
その後、前記改変アダプターが連結された標的DNAは、標的DNA組成物および改変アダプター組成物を化学的および機能的に識別可能にするよう化学的に処理され、このとき、連結された前記改変アダプターは本質的かつ機能的には変化しないものであり、
その後、化学的に処理された前記改変アダプター連結DNAを、前記改変アダプターの配列に相補的であるプライマーを用いて少なくとも１回増幅し、
その後、増幅DNAはDNAシークエンシングに供される、方法。
【請求項２】
標的DNA集団のシトシンのメチル化状態を決定するための方法であって、
前記標的DNA集団を適切なサイズへ断片化する工程であって、ここで、１以上の位置又は全シトシン位置で、シトシンと置換する改変ヌクレオチドを含む組成物の１以上の相違する改変アダプターが標的DNAへ連結反応され、（１）標的DNAフラグメントの両末端へ連結された同一改変アダプター、又は（２）標的DNAフラグメントの各末端へ連結された相違する改変アダプターを含む組成物が産生される、工程を含み、
その後、前記改変アダプターが連結された標的DNAは、標的DNA組成物および改変アダプター組成物を化学的および機能的に識別可能にする化学処理にかけられ、このとき前記改変アダプターは本質的かつ機能的には変化しないものであり、
その後、前記化学処理された改変アダプター連結DNAを、前記改変アダプターの配列に相補的であるプライマーを用いて少なくとも１回増幅し、
その後、増幅DNAはDNAシークエンシングに供される、方法。
【請求項３】
前記標的DNA集団の前記エピゲノム状態が、5−炭素位でのシトシンのメチル化である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記改変アダプターが、任意の改変されたアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンヌクレオチドからなる群から選択される１以上の改変ヌクレオチドから構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記改変アダプターが、任意のメチル化ヌクレオチドからなる群から選択される１以上の改変ヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記改変アダプターが、5−メチルシトシンからなる群から選択される１以上の改変ヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記化学処理が、シトシンの亜硫酸水素媒介性脱アミノ化である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
任意の表現型と相関させることのできる遺伝的又はエピゲノム相違を識別するために１以上の参照DNA配列上でマッピングもしくはアライニングすることによって、正常、疾患もしくは他の表現型の起源に由来する配列データを特徴付ける、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記改変アダプターが、機器、又は目視検査によって読み取ることのできる検出可能なシグナルを生成できる成分に共役される任意のヌクレオチドからなる群から選択される１以上のヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変アダプターが、固体支持体上でDNA増幅を指示することができる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変アダプターが、固体支持体上で等温DNA増幅を指示することができる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変アダプターが、別の改変アダプターへ機能的および空間的に連結される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記改変アダプターが、アフィニティー精製タグに共役されている任意のヌクレオチドからなる群から選択される１以上のヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変アダプターが、ビオチン成分に共役されている任意のヌクレオチドからなる群から選択される１以上のヌクレオチドから構成される、請求項１および２に記載の方法。
【請求項１５】
前記DNAアダプターが、DNAとともに三重へリックス構造を形成することのできるオリゴヌクレオチドによって標的化され得る１以上の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記三重へリックス形成オリゴヌクレオチドが、アフィニティー精製タグに共役されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的DNAが、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、クロロプラストDNA、プラスチドDNA、cDNA、ウイルスDNA、微生物DNA、化学合成DNA、核酸増幅のDNA産物、およびRNAから転写されたDNAからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的DNAが、機械力の適用によって、又は１以上のヌクレアーゼ酵素を単独、又は併用して用いた完全もしくは部分消化によって、ランダムに断片化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼ酵素が、Bsh1236 I、BstU I、CviJ I、FspB I、Hae III、Hha I、Hpa II、Mse I、Msp I、Sau3 AI、Taq I、Tsp509 I、それらのアイソシゾマーおよびネオシゾマーを含む群から選択される制限エンドヌクレアーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
亜硫酸水素反応の効率を監視するためにヘミメチル化DNAコントロール鋳型を作成するための方法であって、
2つの相補的なDNAのA鎖およびB鎖をアニーリングさせる工程であって、このときB鎖のシトシンは5−炭素位でメチル化され、A鎖のシトシンはメチル化されていない、
前記A鎖は、プライマーAおよびBを含む増幅反応において作製され、これによりプライマーAはビオチン基で標識され、プライマーBのシトシンは5−メチルシトシンで置換され、DNA増幅はdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で行われ、
前記プライマーBは、プライマーAおよびBを含むプライマーAと同一DNA鋳型を用いる増幅反応で作製され、これにより、プライマーBはビオチン基で標識され、DNA増幅はdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で行われ、
そして、等モル量の２種の増幅産物を組み合わし、変性、再アニーリングさせ、次に望ましくない産物を除去するためにアビジンアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を含む、方法。
【請求項２１】
メチル化DNAコントロール鋳型を作成するための方法であって、両方の鎖のシトシンは亜硫酸水素反応の効率を監視するために５−炭素位でメチル化され、
プライマーを用いたコントロールDNA鋳型のDNA増幅工程であって、このとき構成要素のシトシンは5−メチルシトシンで置換され、そして、DNA増幅はdATP、dTTP、dGTPおよび5−メチル−dCTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩混合物の存在下で行われる工程を含む、方法。
【公表番号】特表２０１０−５３５５１３（Ｐ２０１０−５３５５１３Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０４０２（Ｐ２０１０−５２０４０２）
【出願日】平成２０年８月８日（２００８．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１４３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４０１９
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５０１３７２７９８）ザ ユニバーシティ オブ ホンコン (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｋｆｕｌａｍ Ｒｏａｄ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月８日（２００８．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１４３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４０１９
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５０１３７２７９８）ザ ユニバーシティ オブ ホンコン (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｋｆｕｌａｍ Ｒｏａｄ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ
【Ｆターム（参考）】
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