高効率耐熱性ＤＮＡリガーゼ
【課題】ＤＮＡとの結合能および反応性が向上した耐熱性ＤＮＡリガーゼの提供。
【解決手段】好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち、少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【解決手段】好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち、少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。詳細には、ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存する荷電性アミノ酸のうち少なくとも２以上を置換して得られる高効率耐熱性ＤＮＡリガーゼ、あるいは前記置換とＣ末端ヘリックス部分の欠失を有する高効率耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ基と５’−リン酸基をホスホジエステル結合で連結する活性を有する酵素であり、生体内ではＤＮＡの複製や修復に関与している。近年、新しい遺伝子増幅技術として、Ligase Chain Reaction（ＬＣＲ）法が開発され、用いられている。ＬＣＲ法は、耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いて温度サイクリング反応を行って、標的遺伝子を増幅あるいは検出する方法である。ＬＣＲ法の効率を上げるために、より活性が高い耐熱性リガーゼが探索され、市場に供給されている。
【０００３】
最近、超好熱性古細菌由来のすぐれた熱安定性を有するＤＮＡリガーゼが発見された（非特許文献１参照）。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡリガーゼはＤＮＡに対する結合能が極めて低いため、熱安定性はあっても、反応効率が低いという問題があった。一方、ＤＮＡとの結合能の高い酵素としてファージ由来のＤＮＡリガーゼが知られているが、これらのＤＮＡリガーゼは耐熱性に乏しいためＬＣＲ法には不向きである。結局、高い耐熱性とＤＮＡ結合能を有し、十分な反応速度で効率よくＬＣＲ法を実行できるＤＮＡリガーゼは未だ見つかっていない。
【０００４】
【非特許文献１】独立行政法人産業技術総合研究所ホームページのプレス・リリース（２００３年）「世界最高の熱安定性を示す遺伝子診断用酵素（ＤＮＡリガーゼ）の開発に成功」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、高い耐熱性とＤＮＡ結合能を有し、十分な反応速度で基質と反応しうる高効率ＤＮＡリガーゼを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ね、ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分が酵素の柔軟性を抑制しており、そのことによりＤＮＡとの結合能が抑制されていることを発見した。そして、当該Ｃ末端ヘリックスの一部または全部を欠失させることにより、酵素のＤＮＡ結合能を向上させることに成功した。しかしながら、このＤＮＡリガーゼはＤＮＡ結合能は向上しているものの、安定性が低いという問題点を有していた。これは、前述のＣ末端部分の欠失によってＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸がタンパク表面に露出し、酵素の親水性が低下するためと考えられた。これに対し、発明者らは、Ｃ末端ヘリックスに存する荷電性アミノ酸の一部または全部を親水性で側鎖の小さなアミノ酸（アラニン、トレオニン、セリン）に置換したところ、これまでになく反応効率の高いＤＮＡリガーゼが得られることを見出した。さらに、前記荷電性アミノ酸の置換とＣ末端部分の欠失を組合せることにより、高温活性のみならず２０〜３０℃付近の活性も向上したＤＮＡリガーゼが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち、少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。改変する荷電性アミノ酸は、タンパク表面に露出しているアミノ酸が好ましく、たとえば、当該耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列とアライメントしたとき、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸を挙げることができる。
【０００８】
置換するアミノ酸は前述のように、アラニン、トレオニン、またはセリンといった親水性で側鎖が小さなアミノ酸であればよく、前記した４つのアミノ酸のうち、少なくとも２以上に対して行なわれることが好ましい。本発明の実施例では、特に好ましい一例として、２以上のアミノ酸をアラニンに置換した例を挙げる。
【０００９】
さらに、改変型耐熱性リガーゼは、前記置換とあわせて、Ｃ末端ヘリックス部分のＣ末端から４残基以上１２残基以下を欠失させることが好ましい。
【００１０】
また酵素の好適な例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼを挙げることができる。
【００１１】
本発明はまた、前記改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡや、このＤＮＡを含む発現ベクターも提供する。
【００１２】
さらに本発明は、前記ベクターを導入された宿主細胞を培養し、得られる培養物からＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの製造方法も提供する。
【００１３】
さらに本発明は、本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いることを特徴とするＬＣＲ法やそのためのキットも提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ネイティブな状態よりもＤＮＡ結合能および反応性（安定性）に優れた改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼが提供される。本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼにより、迅速で特異性の高いＬＣＲ法が実現され、遺伝子増幅、点突然変異の検出を効率よく実施することが可能となる。また本発明の前記改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼにより、選択性の高い遺伝子操作が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ
本発明は、好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる、天然型（ネイティブな）酵素よりもＤＮＡ結合能と反応性（安定性）に優れた改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。
【００１６】
本発明で用いられる「耐熱性ＤＮＡリガーゼ」は、好熱性細菌（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等）、超好熱性細菌（例えば、サーモトガ・マリテマ（Thermotoga maritima）等）、好熱性古細菌（例えば、サーモプラズマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）等）または超好熱性古細菌（例えば、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）等）から得られる熱安定性に優れたＤＮＡリガーゼである。このような耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列は既に公知であり、たとえば公共のデータベースであるGenBankに登録されている：Archaeglobus fulgidus (O29632)、Methanobacterium thermoautotrophicum (U51624-4)、Methanococcus jannaschii (U67474-4)、Thermococcus kodakaraensis (AB042527)、Pyrococcus abyssi (B75173)、Pyrococcus furiosus (NC003413 - complete genome - )。前記した耐熱性ＤＮＡリガーゼは、特に超好熱性細菌または超好熱性古細菌由来であることが好ましく、その最も好ましい一例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡリガーゼ（配列番号１）を挙げることができる。
【００１７】
通常のＤＮＡリガーゼは２０〜３０℃で作用するところ、前記した細菌から得られるＤＮＡリガーゼは高温でも安定に活性を維持できるため、熱サイクルを必要とするＬＣＲ等の核酸増幅技術や遺伝子改変技術において極めて有用である。限定するものではないが、本発明のＤＮＡリガーゼは、７０℃以上、特に９０℃以上で酵素活性を維持できることが好ましい。
【００１８】
本発明の耐熱性ＤＮＡリガーゼは、Ｃ末端にヘリックス部分を有し、配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡリガーゼ（配列番号１）と相同性（アミノ酸レベルでの配列同一性が60％以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上）を有する。ここで、「ヘリックス部分」とは、酵素のヘリックスを構成する連続したアミノ酸領域をいう。ＤＮＡリガーゼにはＣ末端にヘリックス部分を有するものが多く、ヒト、酵母、細菌由来のＤＮＡリガーゼもＣ末端にヘリックスを有する。このＣ末端ヘリックス部分は酵素の構造を堅固にしていると考えられるが、その反面、酵素の柔軟性を抑制しており、そのことによりＤＮＡとの結合能が抑制され、反応性を低下させる一因となる。
【００１９】
本発明では、前記Ｃ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン）の少なくとも２以上を親水性で側鎖の小さいアミノ酸（アラニン、トレオニン、またはセリン）に置換する。
【００２０】
より具体的には、対象とする耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列とアライメントしたとき、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸から選ばれる少なくとも２以上に前述のように置換する。図２にアライメントの一例を示す。図2中、Motif VIは、全てのDNAリガーゼに共通に見出される特に相同性の高い6つの部分(motif I - VI)の内の１つである。このmotifから近いほどアラインメント上相同であるという判断がしやすい。今回改変を加えるＣ末端のヘリックス部位はmotif VIに非常に近い。
【００２１】
当初、発明者らは、Ｃ末端のヘリックス部分のＣ末端から４残基以上１２残基以下を欠失させることにより、酵素の柔軟性を高め、ＤＮＡ分子に対する結合を向上させることに成功したが、この欠失は荷電性アミノ酸を露出させ、酵素の安定性を低下させた。そこで、Ｃ末端のヘリックス部分の荷電性アミノ酸の一部または全部を前述のように置換したところ、Ｃ末端部分の欠失がなくても、高温で反応性が高いＤＮＡリガーゼが得られた。さらに、Ｃ末端部分の欠失と前述の置換を組み合わせると、高温のみならず、２０〜３０℃の領域においても反応性が高い酵素が得られた。
【００２２】
前記アミノ酸置換は荷電性アミノ酸の少なくとも２以上について行なう。これは、２残基の変異は、ドメイン間相互作用を減じる効果をもたらすのに必要最小限と考えられるためである。
【００２３】
前述したように、アミノ酸置換はＣ末端ヘリックスの部分の欠失と組合せて行なっても良い。Ｃ末端ヘリックスの削除は酵素のＣ末端から４残基以上１２残基以下の連続したアミノ酸を欠失させることにより行うことが望ましい。
【００２４】
前記したアミノ酸置換やＣ末端部分の欠失は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。たとえば、アミノ酸置換は部位特異的突然変異法を用いて変異導入アミノ酸のコドンを目的とするアミノ酸のコドンに置換することによって行うことができる。またＣ末端部分の欠失は、ストップコドンの挿入によりストップコドン以下にコードされるＣ末端アミノ酸配列を欠失させることにより行うことができる。
【００２５】
かくして得られたＤＮＡリガーゼは７０〜８０℃の高温において高い反応性を有し、熱サイクルを必要とする核酸増幅技術や遺伝子改変技術において有用である。
【００２６】
２．改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの組換え生産
２．１ 改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡ
本発明にかかる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするDNAは、公知の天然型耐熱性ＤＮＡリガーゼ遺伝子に、部位特異的変異あるいは部位特異的変異とストップコドンの導入によるＣ末端部分欠失を導入して得られる。部位特的変異導入は、市販のキット（例えば、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit（STRATAGENE）、TransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit（CLONTECH）等）を用いて容易に行うことができる。
【００２７】
２．２ 発現ベクター
次いで、前記改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするDNAをプラスミド等の公知のベクターに連結（挿入）して発現ベクターを作製する。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
【００２８】
前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等、特に強力なT7プロモーターを有するpET21ベクターが好ましい）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
【００２９】
前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
【００３０】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
【００３１】
本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを発現しうるプラスミドの例としては、本発明により得られたｐＥＴ２１ｄ−ＰｆｕＬｉｇＤａｌａおよびｐＥＴ２１ｄ−ＰｆｕＬｉｇＤΔ１２が挙げられる。
【００３２】
２．３ 改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ発現系（宿主細胞）
次いで、前記ベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入し、改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ発現系を作製する。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるのもであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００３３】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HMS174(DE3)、K12、DH1、B株等が挙げられ、枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MI 114、207-21等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の上記宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。また、tacプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)]や、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００３４】
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を挙げることができる。酵母へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等を挙げることができる。
【００３５】
２．４ 形質転換体の培養
本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼは、前記形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物からＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて、適宜決定される。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
【００３６】
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。
【００３７】
培養後、本発明の酵素タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合は、菌体または細胞を破砕する。一方、本発明のタンパク質が菌体外または細胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって回収する。
【００３８】
タンパク質の単離・精製には、例えば硫安沈澱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いればよい。
【００３９】
本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの酵素活性は、実施例に記載したような方法によりライゲーションを蛍光等によって検出することで確認することができる。あるいは、目的とする改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼに特異的に結合する抗体を作製し、該抗体を用いたウェスタンブロッティングによって発現を確認することもできる。
【００４０】
３．改変型耐熱性リガーゼを利用したＬＣＲとＬＣＲ用キット
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を用いることを特徴とするＬＣＲ法、および本発明の改変型耐熱性リガーゼを含むＬＣＲ用キットを提供する。上述のごとく、本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼは高温でも高い酵素活性を維持し、熱サイクルを必要とするＬＣＲ法においてその威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにＤＮＡとの結合能および反応性が優れた本発明の改変型耐熱性リガーゼを用いれば、より特異的かつ迅速なＬＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。
【００４１】
本発明のＬＣＲ用キットは、その必須構成成分として本発明の改変型耐熱性リガーゼを含む。前記キットは、さらに、取扱説明書、界面活性剤、dNTP(核酸)、各種プライマー(核酸)、pH緩衝液、マグネシウム溶液、他のペプチドあるいは蛋白質などの補欠因子等、通常ＬＣＲに必要とされる試薬や器具を含んでいてもよい。
【００４２】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００４３】
Ｃ末端ヘリックス変異導入リガーゼの調製
（１）ピロコッカス・フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ゲノムＤＮＡの調製
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨより入手し、文献（ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research)，第２１巻、２５９−２６５ページ）の方法に従って培養した。５００ｍｌの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これを緩衝液Ｌ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍｌに懸濁し、１０％ ＳＤＳを１ｍｌ加えた。撹拌の後、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ加えて、５５℃で６０分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭトリス−塩酸，（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲＮａｓｅ Ａを加えて３７℃で６０分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。０．７５ｍｇのＤＮＡが得られた。
【００４４】
（２）ｌｉｇ遺伝子のクローン化
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡからｌｉｇ遺伝子と予想される領域をＰＣＲで増幅するためのプライマーを設計した。１ｓｔ ＰＣＲに用いるプライマーとして５’−ＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＴＧＧ−３’（配列番号９）、５’−ＴＣＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＡＣＣＴＴＡＧＣ−３’（配列番号１０）を合成した。また、２ｎｄ ＰＣＲに用いるプライマーとしてそれぞれの１ｓｔプライマーの内側にアニ−リングするように５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣ−３（配列番号１１）、５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１２）を作成した。ｌｉｇ遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるＡＴＧに合わせてＮｃｏＩ認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にＢａｍＨＩ認識配列を導入した。ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を３０サイクル行なうＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。１ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型として、同じ条件で２ｎｄ ＰＣＲを行ない、その産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ社）に組み込み、ＤＮＡシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔａｒ社）を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで切断してｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターから切り出したｌｉｇ遺伝子をｐＥＴ２１ｄベクター（EMD Bioscience社）に挿入し、プラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇを得た。この発現系構築のために、開始コドン部位にＮｃｏＩ配列を導入したために、配列番号１に示す２番目のコドンａｇｇがｇｇｔに変わり、得られる翻訳産物の２番目のアミノ酸は本来ＡｒｇであるところがＧｌｙになっている（配列番号３および４参照）。
【００４５】
このプラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇを鋳型として５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンを全てアラニンに置換した変異体（Ｄａｌａ）を作製するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。５５８番目のリジンをアラニンに置換した変異体（Ｋ５５８Ａ）作製用プライマーセット５’−ＧＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡ−３’（配列番号１３）、５’−ＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１４）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行なうＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。得られたＫ５５８Ａプラスミドを鋳型として、さらに５５４番目のリジンをアラニンに置換した変異体（Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）作成用プライマーセット５’−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＣＡ−３’（配列番号１５）、５’−ＴＧＣＴＣＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡ−３’（配列番号１６）を用いて同じ手法で目的の遺伝子を増幅した。つぎに得られたＫ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａプラスミドを鋳型として、さらに５４７番目のグルタミンをアラニンに置換した変異体（Ｑ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）作成用プライマーセット５’−ＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１７）、５’−ＣＡＡＣＴＣＧＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴ−３’（配列番号１８）を用いて同じ手法で目的の遺伝子を増幅した。さらに得られたＱ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａプラスミドを鋳型として、５４０番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体（Ｄａｌａ）作成用プライマーセット５’−ＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１９）、５’−ＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣ−３’（配列番号２０）を用いて同じ手法で最終目的のＤａｌａプラスミド（ｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤａｌａ）を得ることができた。
【００４６】
つぎに、５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミンをアラニンに置換し、かつ、Ｃ末端から12残基欠失させた変異体（ＤΔ１２）を作成するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。これは上記で得られたＤａｌａプラスミドを鋳型として、更にＣ末端から１２残基目にストップコドンを導入するため、ＤΔ１２作成用プライマーセット５’−ＡＴＣＧＣＡＣＡＡＣＴＴＴＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号２１）、５’−ＣＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＧＡＴ−３’（配列番号２２）を用いて同じ手法でＤΔ１２プラスミド（ｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤΔ１２）を得ることができた。
【００４７】
（３）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型リガーゼ、およびＣ末端ヘリックス変異導入リガーゼ（Ｄａｌａ、ＤΔ１２）の大量発現系の構築および精製
以下、無処理（野生型）リガーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、Ｃ末端ヘリックス変異導入リガーゼ（Ｄａｌａ、ＤΔ１２）についても、最初に用いるプラスミドがｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤａｌａおよびｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤΔ１２になるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、生成することができた。
【００４８】
プラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇをコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１ コドンプラスＲＩＬにトランスフォームして、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
【００４９】
沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ，５ｍｌ；アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．４−０．５Ｍでの溶出画分を採取した。この画分を更に陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ，５ｍｌ；アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて分離操作を行い、素通り画分を採取した。この溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ ２６／６０，アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて、流速２ｍｌ／分で分離操作を行い、１００分辺りに溶出されるメインピークを採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度である事、および、ネイティブ蛋白質に比してＣ末端欠失分だけ分子量が低い事、を確認する事ができた。このように、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を容易に得られることがわかった。
【００５０】
天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、ピロコッカス・フリオサスのＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックスは配列番号２のアミノ酸５４０（Ａｓｐ）から５６１（Ｓｅｒ）までにより構成されている。実施例１で得られた野生型のＤＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号４に示す。実施例１で得られた変異体Ｄａｌａをコードするヌクレオチド配列を配列番号５に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号６に示す。実施例１で得られた変異体ＤΔ１２をコードするヌクレオチド配列を配列番号７に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【実施例２】
【００５１】
Ｃ末端ヘリックス変異導入ＤＮＡリガーゼ変異体の反応活性の野生型との比較
（４）鋳型オリゴの60merと、5’末端にリン酸化修飾された30merのオリゴと、5'末端に蛍光体であるTET標識された20merのオリゴを分光光度計（GeneSpeckIII，ヒタチナカインスツルメンツ社）で波長260nmの吸光度（OD260）を測定して濃度を計算し、0.5mMに調製し、濃度を調整したそれぞれのオリゴを5 μlずつ添加してオリゴミックスを作製した。用いたオリゴの配列は60mer：aaacgggccg gtcaacaatc ctctggagtc gacctgtagg aatgcaagct tggcgtcacg（配列番号２３）、30mer：aggtcgactc cagaggattg ttgaccggcc（配列番号２４）、20mer：cgccaagctt gcattcctac（配列番号２５）である。次に、作製したオリゴミックスを95℃で5分間熱変性し、94℃から5分間につき１℃ずつ2℃まで降下させて3つのオリゴをハイブリダイズさせた。得られたアニーリング産物を鋳型として、ライゲーション反応を行った。反応産物を15％ アクリルアミド/8M Ureaゲルで泳動し、泳動後、フルオロイメージャー595（GE社）でライゲーション産物である50merとTET標識オリゴの20merの位置にあるバンドのTETの蛍光強度を、イメージ解析用ソフトウェアImageQuant（Molecular Dynamics社）により測定した。50merと20merの位置で検出した蛍光強度数値の和を100％としたときの、50merの数値の割合をライゲーション効率と定義し、後述する条件での各種リガーゼのライゲーション効率を比較した。
【００５２】
作製した２種類の変異体リガーゼのライゲーション効率を、野生型リガーゼの反応効率と比較した（N=2）。図１に、20℃から90℃で反応した２種類の変異体リガーゼと野生型リガーゼのライゲーション効率比（各反応温度で得られた野生型リガーゼのライゲーション効率の平均値を1としたときの、変異体リガーゼのライゲーション効率の規格値）を示す。図１中、黒（X軸）、黄緑、オレンジのプロットはそれぞれ、野生型、Dala、DΔ12を用いて得られた結果を示す。
【００５３】
以上の結果より、Dalaが低温（30℃）と高温（80℃）、ＤΔ12も低温（20℃，30℃）と高温（80℃）で、野生型リガーゼよりもライゲーション効率が上昇していることがわかった。
【実施例３】
【００５４】
本発明のＤＮＡリガーゼ変異体の耐熱性
実施例２で使用したＤＮＡリガーゼは、ネイティブ、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性タンパク質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、８５℃、２０分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体はネイティブに遜色のない耐熱性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、高いＤＮＡ結合能および反応性を有する改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼが提供される。当該改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼは、高温での反応を必要とするＬＣＲ等の核酸増幅技術や遺伝子改変技術に有用である。したがって、本発明は生化学の研究分野、研究用試薬分野、診断用試薬分野、製薬分野などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、野生型リガーゼの反応活性を１としたときの、Ｃ末端ヘリックス変異導入リガーゼ（Ｄａｌａ、ＤΔ１２）の各温度における比活性を示すグラフである。
【図２】図２は、各種ＤＮＡリガーゼのアライメントを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
配列番号１：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号２：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号３：実施例１で得られた野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号４：実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号５：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）
配列番号６：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）
配列番号７：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）
配列番号８：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）
配列番号９：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの1st PCR用プライマー
配列番号１０：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの1st PCR用プライマー
配列番号１１：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの2nd PCR用プライマー
配列番号１２：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの2nd PCR用プライマー
配列番号１３：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１４：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１５：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１６：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１７：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｑ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１８：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｑ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１９：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）増幅用プライマー
配列番号２０：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）増幅用プライマー
配列番号２１：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）増幅用プライマー
配列番号２２：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）増幅用プライマー
配列番号２３：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼおよびその変異体の60mer基質
配列番号２４：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼおよびその変異体の30mer基質
配列番号２５：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼおよびその変異体の20mer基質
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。詳細には、ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存する荷電性アミノ酸のうち少なくとも２以上を置換して得られる高効率耐熱性ＤＮＡリガーゼ、あるいは前記置換とＣ末端ヘリックス部分の欠失を有する高効率耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ基と５’−リン酸基をホスホジエステル結合で連結する活性を有する酵素であり、生体内ではＤＮＡの複製や修復に関与している。近年、新しい遺伝子増幅技術として、Ligase Chain Reaction（ＬＣＲ）法が開発され、用いられている。ＬＣＲ法は、耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いて温度サイクリング反応を行って、標的遺伝子を増幅あるいは検出する方法である。ＬＣＲ法の効率を上げるために、より活性が高い耐熱性リガーゼが探索され、市場に供給されている。
【０００３】
最近、超好熱性古細菌由来のすぐれた熱安定性を有するＤＮＡリガーゼが発見された（非特許文献１参照）。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡリガーゼはＤＮＡに対する結合能が極めて低いため、熱安定性はあっても、反応効率が低いという問題があった。一方、ＤＮＡとの結合能の高い酵素としてファージ由来のＤＮＡリガーゼが知られているが、これらのＤＮＡリガーゼは耐熱性に乏しいためＬＣＲ法には不向きである。結局、高い耐熱性とＤＮＡ結合能を有し、十分な反応速度で効率よくＬＣＲ法を実行できるＤＮＡリガーゼは未だ見つかっていない。
【０００４】
【非特許文献１】独立行政法人産業技術総合研究所ホームページのプレス・リリース（２００３年）「世界最高の熱安定性を示す遺伝子診断用酵素（ＤＮＡリガーゼ）の開発に成功」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、高い耐熱性とＤＮＡ結合能を有し、十分な反応速度で基質と反応しうる高効率ＤＮＡリガーゼを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ね、ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分が酵素の柔軟性を抑制しており、そのことによりＤＮＡとの結合能が抑制されていることを発見した。そして、当該Ｃ末端ヘリックスの一部または全部を欠失させることにより、酵素のＤＮＡ結合能を向上させることに成功した。しかしながら、このＤＮＡリガーゼはＤＮＡ結合能は向上しているものの、安定性が低いという問題点を有していた。これは、前述のＣ末端部分の欠失によってＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸がタンパク表面に露出し、酵素の親水性が低下するためと考えられた。これに対し、発明者らは、Ｃ末端ヘリックスに存する荷電性アミノ酸の一部または全部を親水性で側鎖の小さなアミノ酸（アラニン、トレオニン、セリン）に置換したところ、これまでになく反応効率の高いＤＮＡリガーゼが得られることを見出した。さらに、前記荷電性アミノ酸の置換とＣ末端部分の欠失を組合せることにより、高温活性のみならず２０〜３０℃付近の活性も向上したＤＮＡリガーゼが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち、少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。改変する荷電性アミノ酸は、タンパク表面に露出しているアミノ酸が好ましく、たとえば、当該耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列とアライメントしたとき、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸を挙げることができる。
【０００８】
置換するアミノ酸は前述のように、アラニン、トレオニン、またはセリンといった親水性で側鎖が小さなアミノ酸であればよく、前記した４つのアミノ酸のうち、少なくとも２以上に対して行なわれることが好ましい。本発明の実施例では、特に好ましい一例として、２以上のアミノ酸をアラニンに置換した例を挙げる。
【０００９】
さらに、改変型耐熱性リガーゼは、前記置換とあわせて、Ｃ末端ヘリックス部分のＣ末端から４残基以上１２残基以下を欠失させることが好ましい。
【００１０】
また酵素の好適な例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼを挙げることができる。
【００１１】
本発明はまた、前記改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡや、このＤＮＡを含む発現ベクターも提供する。
【００１２】
さらに本発明は、前記ベクターを導入された宿主細胞を培養し、得られる培養物からＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの製造方法も提供する。
【００１３】
さらに本発明は、本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いることを特徴とするＬＣＲ法やそのためのキットも提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ネイティブな状態よりもＤＮＡ結合能および反応性（安定性）に優れた改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼが提供される。本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼにより、迅速で特異性の高いＬＣＲ法が実現され、遺伝子増幅、点突然変異の検出を効率よく実施することが可能となる。また本発明の前記改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼにより、選択性の高い遺伝子操作が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ
本発明は、好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる、天然型（ネイティブな）酵素よりもＤＮＡ結合能と反応性（安定性）に優れた改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼに関する。
【００１６】
本発明で用いられる「耐熱性ＤＮＡリガーゼ」は、好熱性細菌（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等）、超好熱性細菌（例えば、サーモトガ・マリテマ（Thermotoga maritima）等）、好熱性古細菌（例えば、サーモプラズマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）等）または超好熱性古細菌（例えば、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）等）から得られる熱安定性に優れたＤＮＡリガーゼである。このような耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列は既に公知であり、たとえば公共のデータベースであるGenBankに登録されている：Archaeglobus fulgidus (O29632)、Methanobacterium thermoautotrophicum (U51624-4)、Methanococcus jannaschii (U67474-4)、Thermococcus kodakaraensis (AB042527)、Pyrococcus abyssi (B75173)、Pyrococcus furiosus (NC003413 - complete genome - )。前記した耐熱性ＤＮＡリガーゼは、特に超好熱性細菌または超好熱性古細菌由来であることが好ましく、その最も好ましい一例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡリガーゼ（配列番号１）を挙げることができる。
【００１７】
通常のＤＮＡリガーゼは２０〜３０℃で作用するところ、前記した細菌から得られるＤＮＡリガーゼは高温でも安定に活性を維持できるため、熱サイクルを必要とするＬＣＲ等の核酸増幅技術や遺伝子改変技術において極めて有用である。限定するものではないが、本発明のＤＮＡリガーゼは、７０℃以上、特に９０℃以上で酵素活性を維持できることが好ましい。
【００１８】
本発明の耐熱性ＤＮＡリガーゼは、Ｃ末端にヘリックス部分を有し、配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡリガーゼ（配列番号１）と相同性（アミノ酸レベルでの配列同一性が60％以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上）を有する。ここで、「ヘリックス部分」とは、酵素のヘリックスを構成する連続したアミノ酸領域をいう。ＤＮＡリガーゼにはＣ末端にヘリックス部分を有するものが多く、ヒト、酵母、細菌由来のＤＮＡリガーゼもＣ末端にヘリックスを有する。このＣ末端ヘリックス部分は酵素の構造を堅固にしていると考えられるが、その反面、酵素の柔軟性を抑制しており、そのことによりＤＮＡとの結合能が抑制され、反応性を低下させる一因となる。
【００１９】
本発明では、前記Ｃ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン）の少なくとも２以上を親水性で側鎖の小さいアミノ酸（アラニン、トレオニン、またはセリン）に置換する。
【００２０】
より具体的には、対象とする耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列とアライメントしたとき、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸から選ばれる少なくとも２以上に前述のように置換する。図２にアライメントの一例を示す。図2中、Motif VIは、全てのDNAリガーゼに共通に見出される特に相同性の高い6つの部分(motif I - VI)の内の１つである。このmotifから近いほどアラインメント上相同であるという判断がしやすい。今回改変を加えるＣ末端のヘリックス部位はmotif VIに非常に近い。
【００２１】
当初、発明者らは、Ｃ末端のヘリックス部分のＣ末端から４残基以上１２残基以下を欠失させることにより、酵素の柔軟性を高め、ＤＮＡ分子に対する結合を向上させることに成功したが、この欠失は荷電性アミノ酸を露出させ、酵素の安定性を低下させた。そこで、Ｃ末端のヘリックス部分の荷電性アミノ酸の一部または全部を前述のように置換したところ、Ｃ末端部分の欠失がなくても、高温で反応性が高いＤＮＡリガーゼが得られた。さらに、Ｃ末端部分の欠失と前述の置換を組み合わせると、高温のみならず、２０〜３０℃の領域においても反応性が高い酵素が得られた。
【００２２】
前記アミノ酸置換は荷電性アミノ酸の少なくとも２以上について行なう。これは、２残基の変異は、ドメイン間相互作用を減じる効果をもたらすのに必要最小限と考えられるためである。
【００２３】
前述したように、アミノ酸置換はＣ末端ヘリックスの部分の欠失と組合せて行なっても良い。Ｃ末端ヘリックスの削除は酵素のＣ末端から４残基以上１２残基以下の連続したアミノ酸を欠失させることにより行うことが望ましい。
【００２４】
前記したアミノ酸置換やＣ末端部分の欠失は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。たとえば、アミノ酸置換は部位特異的突然変異法を用いて変異導入アミノ酸のコドンを目的とするアミノ酸のコドンに置換することによって行うことができる。またＣ末端部分の欠失は、ストップコドンの挿入によりストップコドン以下にコードされるＣ末端アミノ酸配列を欠失させることにより行うことができる。
【００２５】
かくして得られたＤＮＡリガーゼは７０〜８０℃の高温において高い反応性を有し、熱サイクルを必要とする核酸増幅技術や遺伝子改変技術において有用である。
【００２６】
２．改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの組換え生産
２．１ 改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡ
本発明にかかる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするDNAは、公知の天然型耐熱性ＤＮＡリガーゼ遺伝子に、部位特異的変異あるいは部位特異的変異とストップコドンの導入によるＣ末端部分欠失を導入して得られる。部位特的変異導入は、市販のキット（例えば、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit（STRATAGENE）、TransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit（CLONTECH）等）を用いて容易に行うことができる。
【００２７】
２．２ 発現ベクター
次いで、前記改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするDNAをプラスミド等の公知のベクターに連結（挿入）して発現ベクターを作製する。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
【００２８】
前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等、特に強力なT7プロモーターを有するpET21ベクターが好ましい）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
【００２９】
前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
【００３０】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
【００３１】
本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを発現しうるプラスミドの例としては、本発明により得られたｐＥＴ２１ｄ−ＰｆｕＬｉｇＤａｌａおよびｐＥＴ２１ｄ−ＰｆｕＬｉｇＤΔ１２が挙げられる。
【００３２】
２．３ 改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ発現系（宿主細胞）
次いで、前記ベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入し、改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ発現系を作製する。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるのもであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００３３】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HMS174(DE3)、K12、DH1、B株等が挙げられ、枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MI 114、207-21等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の上記宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。また、tacプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)]や、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００３４】
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を挙げることができる。酵母へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等を挙げることができる。
【００３５】
２．４ 形質転換体の培養
本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼは、前記形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物からＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて、適宜決定される。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
【００３６】
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。
【００３７】
培養後、本発明の酵素タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合は、菌体または細胞を破砕する。一方、本発明のタンパク質が菌体外または細胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって回収する。
【００３８】
タンパク質の単離・精製には、例えば硫安沈澱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いればよい。
【００３９】
本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの酵素活性は、実施例に記載したような方法によりライゲーションを蛍光等によって検出することで確認することができる。あるいは、目的とする改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼに特異的に結合する抗体を作製し、該抗体を用いたウェスタンブロッティングによって発現を確認することもできる。
【００４０】
３．改変型耐熱性リガーゼを利用したＬＣＲとＬＣＲ用キット
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を用いることを特徴とするＬＣＲ法、および本発明の改変型耐熱性リガーゼを含むＬＣＲ用キットを提供する。上述のごとく、本発明の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼは高温でも高い酵素活性を維持し、熱サイクルを必要とするＬＣＲ法においてその威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにＤＮＡとの結合能および反応性が優れた本発明の改変型耐熱性リガーゼを用いれば、より特異的かつ迅速なＬＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。
【００４１】
本発明のＬＣＲ用キットは、その必須構成成分として本発明の改変型耐熱性リガーゼを含む。前記キットは、さらに、取扱説明書、界面活性剤、dNTP(核酸)、各種プライマー(核酸)、pH緩衝液、マグネシウム溶液、他のペプチドあるいは蛋白質などの補欠因子等、通常ＬＣＲに必要とされる試薬や器具を含んでいてもよい。
【００４２】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００４３】
Ｃ末端ヘリックス変異導入リガーゼの調製
（１）ピロコッカス・フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ゲノムＤＮＡの調製
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨより入手し、文献（ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research)，第２１巻、２５９−２６５ページ）の方法に従って培養した。５００ｍｌの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これを緩衝液Ｌ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍｌに懸濁し、１０％ ＳＤＳを１ｍｌ加えた。撹拌の後、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ加えて、５５℃で６０分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭトリス−塩酸，（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲＮａｓｅ Ａを加えて３７℃で６０分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。０．７５ｍｇのＤＮＡが得られた。
【００４４】
（２）ｌｉｇ遺伝子のクローン化
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡからｌｉｇ遺伝子と予想される領域をＰＣＲで増幅するためのプライマーを設計した。１ｓｔ ＰＣＲに用いるプライマーとして５’−ＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＴＧＧ−３’（配列番号９）、５’−ＴＣＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＡＣＣＴＴＡＧＣ−３’（配列番号１０）を合成した。また、２ｎｄ ＰＣＲに用いるプライマーとしてそれぞれの１ｓｔプライマーの内側にアニ−リングするように５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣ−３（配列番号１１）、５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１２）を作成した。ｌｉｇ遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるＡＴＧに合わせてＮｃｏＩ認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にＢａｍＨＩ認識配列を導入した。ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を３０サイクル行なうＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。１ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型として、同じ条件で２ｎｄ ＰＣＲを行ない、その産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ社）に組み込み、ＤＮＡシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔａｒ社）を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで切断してｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターから切り出したｌｉｇ遺伝子をｐＥＴ２１ｄベクター（EMD Bioscience社）に挿入し、プラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇを得た。この発現系構築のために、開始コドン部位にＮｃｏＩ配列を導入したために、配列番号１に示す２番目のコドンａｇｇがｇｇｔに変わり、得られる翻訳産物の２番目のアミノ酸は本来ＡｒｇであるところがＧｌｙになっている（配列番号３および４参照）。
【００４５】
このプラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇを鋳型として５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンを全てアラニンに置換した変異体（Ｄａｌａ）を作製するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。５５８番目のリジンをアラニンに置換した変異体（Ｋ５５８Ａ）作製用プライマーセット５’−ＧＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡ−３’（配列番号１３）、５’−ＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１４）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行なうＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。得られたＫ５５８Ａプラスミドを鋳型として、さらに５５４番目のリジンをアラニンに置換した変異体（Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）作成用プライマーセット５’−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＣＡ−３’（配列番号１５）、５’−ＴＧＣＴＣＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡ−３’（配列番号１６）を用いて同じ手法で目的の遺伝子を増幅した。つぎに得られたＫ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａプラスミドを鋳型として、さらに５４７番目のグルタミンをアラニンに置換した変異体（Ｑ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）作成用プライマーセット５’−ＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１７）、５’−ＣＡＡＣＴＣＧＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴ−３’（配列番号１８）を用いて同じ手法で目的の遺伝子を増幅した。さらに得られたＱ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａプラスミドを鋳型として、５４０番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体（Ｄａｌａ）作成用プライマーセット５’−ＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１９）、５’−ＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣ−３’（配列番号２０）を用いて同じ手法で最終目的のＤａｌａプラスミド（ｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤａｌａ）を得ることができた。
【００４６】
つぎに、５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミンをアラニンに置換し、かつ、Ｃ末端から12残基欠失させた変異体（ＤΔ１２）を作成するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。これは上記で得られたＤａｌａプラスミドを鋳型として、更にＣ末端から１２残基目にストップコドンを導入するため、ＤΔ１２作成用プライマーセット５’−ＡＴＣＧＣＡＣＡＡＣＴＴＴＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号２１）、５’−ＣＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＧＡＴ−３’（配列番号２２）を用いて同じ手法でＤΔ１２プラスミド（ｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤΔ１２）を得ることができた。
【００４７】
（３）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型リガーゼ、およびＣ末端ヘリックス変異導入リガーゼ（Ｄａｌａ、ＤΔ１２）の大量発現系の構築および精製
以下、無処理（野生型）リガーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、Ｃ末端ヘリックス変異導入リガーゼ（Ｄａｌａ、ＤΔ１２）についても、最初に用いるプラスミドがｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤａｌａおよびｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤΔ１２になるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、生成することができた。
【００４８】
プラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇをコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１ コドンプラスＲＩＬにトランスフォームして、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
【００４９】
沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ，５ｍｌ；アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．４−０．５Ｍでの溶出画分を採取した。この画分を更に陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ，５ｍｌ；アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて分離操作を行い、素通り画分を採取した。この溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ ２６／６０，アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて、流速２ｍｌ／分で分離操作を行い、１００分辺りに溶出されるメインピークを採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度である事、および、ネイティブ蛋白質に比してＣ末端欠失分だけ分子量が低い事、を確認する事ができた。このように、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を容易に得られることがわかった。
【００５０】
天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、ピロコッカス・フリオサスのＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックスは配列番号２のアミノ酸５４０（Ａｓｐ）から５６１（Ｓｅｒ）までにより構成されている。実施例１で得られた野生型のＤＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号４に示す。実施例１で得られた変異体Ｄａｌａをコードするヌクレオチド配列を配列番号５に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号６に示す。実施例１で得られた変異体ＤΔ１２をコードするヌクレオチド配列を配列番号７に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【実施例２】
【００５１】
Ｃ末端ヘリックス変異導入ＤＮＡリガーゼ変異体の反応活性の野生型との比較
（４）鋳型オリゴの60merと、5’末端にリン酸化修飾された30merのオリゴと、5'末端に蛍光体であるTET標識された20merのオリゴを分光光度計（GeneSpeckIII，ヒタチナカインスツルメンツ社）で波長260nmの吸光度（OD260）を測定して濃度を計算し、0.5mMに調製し、濃度を調整したそれぞれのオリゴを5 μlずつ添加してオリゴミックスを作製した。用いたオリゴの配列は60mer：aaacgggccg gtcaacaatc ctctggagtc gacctgtagg aatgcaagct tggcgtcacg（配列番号２３）、30mer：aggtcgactc cagaggattg ttgaccggcc（配列番号２４）、20mer：cgccaagctt gcattcctac（配列番号２５）である。次に、作製したオリゴミックスを95℃で5分間熱変性し、94℃から5分間につき１℃ずつ2℃まで降下させて3つのオリゴをハイブリダイズさせた。得られたアニーリング産物を鋳型として、ライゲーション反応を行った。反応産物を15％ アクリルアミド/8M Ureaゲルで泳動し、泳動後、フルオロイメージャー595（GE社）でライゲーション産物である50merとTET標識オリゴの20merの位置にあるバンドのTETの蛍光強度を、イメージ解析用ソフトウェアImageQuant（Molecular Dynamics社）により測定した。50merと20merの位置で検出した蛍光強度数値の和を100％としたときの、50merの数値の割合をライゲーション効率と定義し、後述する条件での各種リガーゼのライゲーション効率を比較した。
【００５２】
作製した２種類の変異体リガーゼのライゲーション効率を、野生型リガーゼの反応効率と比較した（N=2）。図１に、20℃から90℃で反応した２種類の変異体リガーゼと野生型リガーゼのライゲーション効率比（各反応温度で得られた野生型リガーゼのライゲーション効率の平均値を1としたときの、変異体リガーゼのライゲーション効率の規格値）を示す。図１中、黒（X軸）、黄緑、オレンジのプロットはそれぞれ、野生型、Dala、DΔ12を用いて得られた結果を示す。
【００５３】
以上の結果より、Dalaが低温（30℃）と高温（80℃）、ＤΔ12も低温（20℃，30℃）と高温（80℃）で、野生型リガーゼよりもライゲーション効率が上昇していることがわかった。
【実施例３】
【００５４】
本発明のＤＮＡリガーゼ変異体の耐熱性
実施例２で使用したＤＮＡリガーゼは、ネイティブ、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性タンパク質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、８５℃、２０分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体はネイティブに遜色のない耐熱性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、高いＤＮＡ結合能および反応性を有する改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼが提供される。当該改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼは、高温での反応を必要とするＬＣＲ等の核酸増幅技術や遺伝子改変技術に有用である。したがって、本発明は生化学の研究分野、研究用試薬分野、診断用試薬分野、製薬分野などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、野生型リガーゼの反応活性を１としたときの、Ｃ末端ヘリックス変異導入リガーゼ（Ｄａｌａ、ＤΔ１２）の各温度における比活性を示すグラフである。
【図２】図２は、各種ＤＮＡリガーゼのアライメントを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
配列番号１：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号２：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号３：実施例１で得られた野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号４：実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ
配列番号５：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）
配列番号６：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）
配列番号７：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）
配列番号８：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）
配列番号９：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの1st PCR用プライマー
配列番号１０：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの1st PCR用プライマー
配列番号１１：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの2nd PCR用プライマー
配列番号１２：野生型Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼの2nd PCR用プライマー
配列番号１３：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１４：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１５：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１６：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１７：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｑ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１８：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｑ５４７Ａ／Ｋ５５４Ａ／Ｋ５５８Ａ）増幅用プライマー
配列番号１９：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）増幅用プライマー
配列番号２０：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（Ｄａｌａ）増幅用プライマー
配列番号２１：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）増幅用プライマー
配列番号２２：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ＤΔ１２）増幅用プライマー
配列番号２３：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼおよびその変異体の60mer基質
配列番号２４：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼおよびその変異体の30mer基質
配列番号２５：Pyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼおよびその変異体の20mer基質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち、当該耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列とアライメントしたとき、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸から選ばれる少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項２】
前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸のすべてが置換されている請求項１に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３】
前記置換がアラニンへの置換である、請求項１または２に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４】
さらに、Ｃ末端ヘリックス部分のＣ末端から４残基以上１２残基以下を欠失していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項５】
ＤＮＡリガーゼがピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを導入された宿主細胞を培養し、得られる培養物からＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いることを特徴とするＬＣＲ法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを含むＬＣＲ用キット。
【請求項１】
好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち、当該耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示されるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列とアライメントしたとき、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸から選ばれる少なくとも２つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項２】
前記配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４０番目のアスパラギン酸、５４７番目のグルタミン、５５４番目のリジン、５５８番目のリジンに対応する４つのアミノ酸のすべてが置換されている請求項１に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３】
前記置換がアラニンへの置換である、請求項１または２に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４】
さらに、Ｃ末端ヘリックス部分のＣ末端から４残基以上１２残基以下を欠失していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項５】
ＤＮＡリガーゼがピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを導入された宿主細胞を培養し、得られる培養物からＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いることを特徴とするＬＣＲ法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変型耐熱性ＤＮＡリガーゼを含むＬＣＲ用キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２４５６０４（Ｐ２００８−２４５６０４Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９３４３６（Ｐ２００７−９３４３６）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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