高勾配磁気分離用フィルター
【課題】超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離技術によって、微量含有タンパク質等の有用物質を高速各高効率で、しかも連続的に大量分離し、捕捉した磁性ビーズを高効率で回収する。
【解決手段】捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせて第１単位フィルター組立体を構成する。第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で重ね合わせると共に、第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成する。第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成する。このとき、互いに重ね合って上下に位置する第１及び第２単位フィルターの磁性細線の間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定する。
【解決手段】捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせて第１単位フィルター組立体を構成する。第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で重ね合わせると共に、第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成する。第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成する。このとき、互いに重ね合って上下に位置する第１及び第２単位フィルターの磁性細線の間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は溶液中において周囲に特定の抗体に特異的に結合する結合部位を備えた微細な磁性ビーズを混合し、溶液中の所望の抗体を結合させた状態で、高勾配で磁化した細線からなるフィルターを通して磁性ビーズを細線に吸着して分離する高勾配磁気分離用フィルターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年は特にバイオや創薬の分野において、マイクロビーズや更に微細なナノビーズを用いた細胞・分子のタンパク質を分離するスクリーニング技術が国際的に研究されており、その一つの手法として、多くの細胞・分子のタンパク質をビーズを用いて分離する技術が確立してきている。この技術では例えば図７（ａ）に示すように、直径がマイクロメータ或いはナノメータ単位の微細な磁性体からなる磁性ビーズ５１の周囲に固定化用機能性膜５２を形成し、それにより選択官能基５３を固定できるようにしている。
【０００３】
このような磁性ビーズを用いると、同図（ｂ）に一部を拡大して示すように、選択官能基５３の先端における特定の抗体に特異的に結合する結合部位５４に所望の抗体５５を結合させ、その状態でこの磁性ビーズ５１に磁気を帯びさせて磁気ビーズとし、この磁気ビーズを、周囲に配置した永久磁石や電磁石により吸着し収集することによって、特定の抗体５５を液体中から分離し精製することができる。
【０００４】
ビーズを用いた分離技術はビーズと目的物質との反応効率を向上させることが重要で、反応表面積を増大させることが、分離効率向上および作業時間短縮になるため、サイズを小さくすることが課題である。ビーズのサイズを1/10に出来れば、表面積は1/102になり、同じ質量のビーズであれば、個数は103倍になり、全反応面積は（1/102×103＝10）10倍になり、微量含有の目的物と結合する確率を飛躍的に大きくし、捕捉反応時間を大幅に短縮することが出来る。現在開発されているアフィニティー（Affinity ：分子間親和性）ビーズは、磁性ビーズと非磁性ビーズに大別される。非磁性ビーズはポリマービーズなどの有機系と多孔質シリカビーズなどの無機系に分けられ、サイズを小さくすることは比較的容易であり、すでにナノサイズのアフィニティービーズが開発されている。しかし、これらの非磁性ビーズはターゲットを希釈してカラムに導入し、アフィニティークロマトグラフィーによる分離・精製が必要になり、検査・分析用のバッチ処理には適するが、産業応用に必要な高濃度化や高速・大量・連続分離精製には向かない。これに対し、磁性ビーズは磁気力により分離・精製するので高濃度化が容易であり、高速・大量・連続分離精製には向いているため、産業用には磁性ナノビーズによる分離精製技術が嘱望される。しかし、現在開発されているものは、永久磁石による高勾配磁気分離で分離・検出するシステムであるため、磁気力に限界があり、磁気ビーズを溶液中の粘性抵抗に逆らって引き寄せ磁気回収するためにはある程度以上の磁気量を体積で稼ぐ必要があり、ナノサイズの磁性ビーズは使用されていない。現在は小さいものでも直径約1.5〜1.0ミクロン程度が使用限界である。磁気分離以外の利用では、直径数十ナノメートルの磁性ビーズのリゾヒスト（SPIO：Super Paramagnetic Iron Oxide）がMRI造影剤として臨床用に使用されている。そこで、本技術では、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離を採用することにより、磁性ナノビーズによる分離精製技術を確立しようとするものである。今や磁性ビーズは医療・メディカルエンジニアリングの発展にとって不可欠なツールとなっている。
【０００５】
このような微細な磁性ビーズを実際に用いるときには、種々の抗体や各種物質が含まれている液体中に存在する所望の抗体を前記のような官能基に固定し、液体中に設けた金属細線を磁化して磁石化したところに、前記磁気を帯びた磁気ビーズを吸着させ、その後金属細線の磁化を取り除くことによって、吸着していた磁気ビーズを金属細線から分離することによって、所望の抗体を収集している。この技術については既に、例えば２ないし４種類のスクリーニングを自動ロボット化した分析装置が市販されるようにもなって確立している。しかしながら未だ溶液中の抗体のほとんどを分離するところまでは至らず、効率的な分離・精製が行われているとはいえない。また、できる限り多くの分離を行おうとすると分離・精製に要する時間が長くなる。更に装置は大型であり、取り扱い性に未だ難がある。
【０００６】
したがって、より効率的な分離精製を行うと共に装置を小型化するには、ナノサイズの微細なビーズを用いるとともにそのビーズを高磁性化し、またこのビーズを吸着して捕捉する金属細線についてもより高磁性化、細線化し、更に多くの抗体を液体中から分離できるようにすることが望まれている。
【０００７】
本件発明者等は前記課題を解決するため、磁性ビーズ及びこれを吸着する金属細線を磁化するために、超伝導マグネットを用いて高勾配磁場を形成し、その磁場の中で前記のような所望の抗体の精製・分離を行い、微量含有タンパク質等の有用物質を高速・高効率で連続的に大量に分離精製するシステムを開発している。
【０００８】
この技術のシステム原理図を図９に示す。このシステムに基づく実験においては、小型冷凍機を採用した伝導冷却式である卓上型の小型超伝導電磁石７１を用いて、永久磁石の数十〜数百倍もの強力な磁場である、最大５Tの磁場を発生させる。小型超伝導電磁石７１の中心部分７２には直径約２６ｍｍの円筒状の室温の空間を持たせ、この空間に内径２０ｍｍ、外形２４ｍｍのガラス管７３を通し、この管７３の中に直径数〜数十ミクロン程度の磁性細線のステンレスウール７４からなるフィルター７５を挿入する。この直径数ミクロン程度のステンレス細線の周辺に高勾配磁場を作り出す。
【０００９】
このような装置において、所望の抗体のほか種々のタンパク質や他の物質が混入した溶液中に更に前記磁性ビーズを混合し、前記図７（ａ）〜（ｃ）のように磁性ビーズに所望の抗体を結合した状態となっている溶液７６を、管７３の上方から注ぎ込む。この溶液７６は前記のような高勾配磁場を周囲に作り出すステンレスウール７４からなるフィルター７５内を通過するとき、磁性ビーズは超伝導電磁石により得られる高磁界により磁気を帯びて磁気ビーズとなり、且つ４Ｔ程度の高磁界により局所的に磁化した磁性細線であるフィルター７５の周りに作られた非常に大きな磁場勾配によって所望の抗体を結合した磁気ビーズをフィルター７５に吸着する。
【００１０】
その後磁場を４Ｔから０Ｔに下げた後、磁性微粒子を含まないエタノールを前記と同様にフィルター７５に流し、それを更に濾紙で濾過して、濾紙上に磁性微粒子を捕捉することによって分離する。このように、固定したい目的物質を含む原液に磁性ナノビーズを混合し、この管に流すだけで、大容量の溶液から短時間に高効率で微量含有の貴重な目的物質を捕獲・分離できるようになった。
【００１１】
上記のような装置を用いて実際に免疫グロブリンを分離・精製する実験を行いその性能を確かめた。免疫グロフリンは糖を２％含むポリペプチドで、約１０〜１５ｎｍのＹ字形の分子で、図８（ａ）に示すようにＹ端部のＬ鎖（Light Chain)先端には抗体に特異的に結合する部位をもつ。したがってこの部位と特異的に結合する物質を磁性ナノ粒子の表面に付けることにより、免疫グロブリンの連続・高速の分離・精製が可能となる。このときに用いる表面活性剤は、既に酸化鉄等に対して開発されており、直径数ミクロンの磁性マイクロビーズは市販されている。
【００１２】
実験においては約１５０ｃｃのエタノールに、平均粒径約１００ｎｍのナノ磁性微粒子を０．０５ｇ加え、良く攪拌した後、強加工されて磁性を持った磁気分離用のＳＵＳ３０４細線フィルターとほぼ同一のフィルターで濾過した。次に濾過した磁性微粒子を含むエタノールを、４Ｔの磁場中にセットしたフィルターの中を約７〜２５ｃｃ／ｍｉｎの速度で流し、それを更に濾紙で濾過して磁性微粒子を捕捉した。その結果は、濾過後の液体について微粒子は検出できなかったのに対して、磁場をゼロにして同様の処理を行ったところ、０．０４ｇの微粒子が検出された。このことからこのシステムは極めて効率よく平均粒径約１００ｎｍの磁性微粒子を捕捉できることがわかった。このことから、医療用タンパク質のうち特に血清中に微量存在する免疫グロブリンの分離／精製に超伝導マグネットを用いた高勾配磁気分離システムが有効であることを確認した。
【００１３】
なお、粒子状物質の表面に特定の抗体に特異的結合性を有する性状を持たせ、液体中から所望の抗体等を分離する技術は特開２００２−１１６３号公報（特許文献１）に開示されている。
【特許文献１】特開２００２−１１６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者等が開発した上記のような装置において、ほぼ確実にフィルターに磁性微粒子を捕捉することができることがわかったが、ここで最も重要な点は、前記のように磁性ビーズを吸着したフィルターから、この磁性ビーズを確実に回収できることである。即ち、このフィルターに求められる性能は、磁場の印可時には効率よく磁気ビーズを捕捉・分離し、磁場を減少させた時にはほとんど全ての磁気ビーズをフィルターから回収できることである。現在一般的に採用しているステンレス細線のウールからなるフィルターは製造が容易であり、比較的捕捉率も良いという利点があるが、フィルターを通過しようとする各種物質が物理的に捕捉されて目詰まりを起こしやすく、また磁場を取り除いたときに、フィルターに電磁的に捕捉されていた磁気ビーズを効率よく回収するのは難しい。
【００１５】
その理由は、フィルターの細線の一部が交差接触する部分に一度捕捉されたビーズは、付近の他の磁化したビーズを引き付けて凝集してしまうため、磁場が全くなくなってもステンレスウールに物理的に挟まれた状態でフィルターに捕捉されたままとなり、回収され難いからである。高価で取り扱いに十分な注意を要する前記のような磁性ビーズを、医用タンパク質の高勾配磁気分離装置の分離・精製に利用するためには、捕捉後に付加価値の極めて高い目的物質（タンパク質）を捕捉しているビーズを回収する効率が極めて高いフィルターを用いることが必須である。
【００１６】
したがって本発明は、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離技術によって、微量含有タンパク質等の有用物質を高速且つ高効率で、しかも連続的に大量分離することができ、更に捕捉した高価な磁性ビーズを磁場を取り除くだけで高速・高効率で回収することができる、高勾配磁気分離用フィルターを提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は前記課題を解決するため、更に研究を重ねた結果以下の手法を採用するに至ったものである。即ち、磁性細線を１）補足したい磁気ビーズのサイズに合わせて、数十ミクロンから数百ミクロンの間隔で平行に磁性細線を並べた構造のフィルターAを作製する。このときフィルターの磁性細線の左右の間隔を小さくし過ぎると、細線間の空間では隣の細線の磁化の影響を受けて、磁性ビーズは細線から反発力を受け、捕捉効率が悪くなることが判明した。また、フィルターの磁性細線の平行な上下の間隔は、ある程度小さいほうが磁性ビーズに働く捕捉引力が増すことが分かった。また、このときフィルターの磁性細線を上下に平行に配置する場合は、下の平行磁性細線の配置を上の磁性細線間の中心の真下にくるように配置すると捕捉効率が大幅に向上することが分かった。そこで、（１）フィルターAの細線の左右間隔を細線径の数倍より大きくし、フィルターＡを同位相で上下に積層する時は、上下の細線間隔を、細線径の２倍以下程度にして、捕捉効率を改善する。
（２）フィルターＡを同位相で、上述した間隔で積層したフィルター群Bと、これに直交するようにもうひとつのフィルター群Bを重ねてフィルター群Cをつくる。このフィルター群Cをさらに積層したものをフィルターとする。
（３）フィルターC群を積層するにあたり、下の平行磁性細線の配置を上の磁性細線間の中心の真下にくるように配置し、格子状の流路の中心に次の積層するフィルター群Ｃの格子点が来るように平面内で細線間隔の2分の一だけ細線方向および直角方向に平行移動した形状にする。この２つのフィルター群Cを積層しフィルターをつくる。
（４）フィルターC群を積層するにあたり、フィルターC群の格子状の流路の中心につぎの積層するフィルター群Ｃ’の格子点が来るように平面内で位相を45度回転させたものを作製する。このとき、積層しフィルターＣ’群の平行細線間隔はC群のそれの√2分の一になる。このフィルターC群とＣ’群を積層した構造のフィルターをつくる。
【００１８】
本発明については、より具体的には次のような構成とする。即ち、本発明に係る高勾配磁気分離用フィルターは、前記課題を解決するため、捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな所定の間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせることにより第１単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせると共に、前記第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、前記単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成すると共に、前記互いに重ね合わされて上下に位置する第１単位フィルターの磁性細線と第２単位フィルターの磁性細線との間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定したことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る他の高勾配磁気分離用フィルターは、前記高勾配磁気分離用フィルターにおいて、前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに平行で同一ピッチとし、且つ位相をずらすことにより、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線の間隔の中間に、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が位置するように設定したことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る他の高勾配磁気分離用フィルターは、前記高勾配磁気分離用フィルターにおいて、前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに４５度回転させるとともに、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の交点が、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の格子の中心に位置するように、磁性細線のピッチを設定したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は上記のように構成したので、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離技術によって、微量含有タンパク質等の有用物質を高速且つ高効率で、しかも連続的に大量分離することができ、特に捕捉した高価な磁性ビーズを高効率で回収することができる、高勾配磁気分離用フィルターとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離技術によって、微量含有タンパク質等の有用物質を高速且つ高効率で、しかも連続的に大量分離することができ、特に捕捉した高価な磁性ビーズを高効率で回収するという課題を、捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな所定の間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせることにより第１単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で重ね合わせると共に、前記第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、前記単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成すると共に、前記互いに重ね合わされて上下に位置する第１単位フィルターの磁性細線と第２単位フィルターの磁性細線との間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定することにより実現した。
【実施例１】
【００２３】
本発明において、高効率のフィルターを得るために、磁性ビーズがどのように抗体に結合するかを詳細に検討し、それにより必要とされる磁性ビーズの態様、更にそのような磁性ビーズを捕捉するために必要とされるフィルターの特性と、そのフィルターのあるべき構造を検討し、本発明による高勾配磁気分離用フィルターを開発するに至ったので、これらを順に説明する。
【００２４】
抗体の模式構造は図８（ａ）に示すようにＹ字型の二股になっており、この二股部分の先は抗体結合部位と呼ばれ、ここに磁性ビーズを結合させることになる。捕捉・分離したい目的物質の抗体の溶液中の密度（濃度）は極めて小さいので、ビーズの個数を大幅に増やし、反応確立を高くする必要がある。このため、ビーズのサイズを小さくする必要がある。図８（ｂ）に径１００ｎｍの磁気ビーズによる免疫グロブリンの捕捉の概念図を示す。
【００２５】
したがって磁性ビーズを拡散させると、磁性ビーズの直径が小さいほど、多数のビーズが分散して含まれることになり、結合する確率は高くなって有利である。具体的には、同じ質量のビーズを使用すると仮定すると、直径が１／ｎになると表面積は１／ｎ２になり、個数はｎ３倍になり、反応活性面積はｎ倍（１／ｎ２×ｎ３＝ｎ）になり（したがって攪拌反応時間は約１／ｎになり、時間を短縮出来、高速化になり）、コストはｎ倍にはならず、同じ程度かもしくはそれ以下で可能である。したがって、可能な限り直径は小さい方がよい。しかしながら、磁性ビーズの直径が小さいと、磁気ビーズになったときの磁気力が小さくなり、磁気ビーズに働く電磁力も小さくなる為、補足が難しくなる。また、フィルターが密すぎるとフィルターの洗浄が必要になり、またビーズの回収効率が悪くなる。したがって、フィルターを構成する磁性細線の断面形状・寸法、配置間隔の検討が必要になる。
【００２６】
ここで磁性ビーズが受ける磁気力を検討すると、超伝導磁石を用いた高磁界・高勾配磁気分離装置により、磁気を帯びた磁性ビーズである磁気ビーズが受ける磁気力(magnetic force)ＦＭは、外部磁場が充分大きい場合、次式で表される。
ＦＭ＝ＶｐＭｓ▽Ｈ （１）
但し、Ｖｐは磁気ビーズの体積、Ｍｓは磁気ビーズの飽和磁化、Ｈは磁気ビーズが置かれている磁場の大きさである。
【００２７】
一方、流体が磁気ビーズを押し流そうとする力(drag force)ＦＤは、
ＦＤ＝６πｂηνｐ （２）
ここで、νｐは粒子の速度、ηは流体の粘性率、ｂは磁性ビーズの半径である。
【００２８】
ここで、一本のＳＵＳ丸細線の周囲に働く磁気力を計算すると、ＳＵＳ細線の直径を８、２０μｍとし、磁場を４．０Ｔとして径１００ｎｍの磁性ビーズ１個に作用する磁気力を、Ｍｓは０．１Ｔ、νｐは０．５ｍｍ／ｓ、ηは１．１×１０−３Ｐａｓとして計算するとき、その磁気力分布の計算結果は磁気力はＳＵＳ細線の直径が８μの時、直径と２倍程度、２０μｍの時直径の１．５倍程度まではたらくことがわかる。これらの結果から、径１００ｎｍの磁気ビーズに対して、２０μｍの細線でも磁気分離が十分可能であることがわかった。
【００２９】
このような事実を背景に、効率的に磁性ビーズをフィルター細線に吸着させる手法を検討した結果、図２(ａ)に示すような原理のフィルターを提案するものである。即ち図１（ｂ）図２（ａ）（ｂ）及び図３に示すフィルターは、互いに線間隔ｄ１として平行に配置している直径ｄ０の細線ａ、ａ・・・から第１単位フィルターＡ１を構成する。このときの線間隔ｄ１は細線の径ｄ０の数倍より大きく設定する。それにより、磁性細線の隣接する左右の間隔を小さくし過ぎることによって、細線間の空間で隣の細線の磁化の影響を受けて、磁性ビーズが細線から反発力を受けることのより、捕捉効率が悪くなることを防止することができる。
【００３０】
この第１単位フィルターＡ１と全く同一構成からなる他の第１単位フィルターＡ１を互いの細線ａが平行に重なるように、且つ互いの平行な細線ａの上下の線間隔ｄ２は、あまり広げすぎないように、細線径ｄ０の２倍以下とする。即ち、この上下の線間隔については、ある程度小さいほうが磁性ビーズに働く捕捉引力が増すことが分かり、また狭すぎるとその線の間隙に磁気ビーズが引っかかって磁気ビーズ収集時に洗い流すことができなくなるためである。このようにして、全く同一構成で細線を互いに平行に配置した第１単位フィルターＡ１を重ね合わせることにより、第１単位フィルター組立体Ｂ１が得られる。
【００３１】
上記のような第１単位フィルター組立体Ｂ１を構成する第１単位フィルターＡ１と同一構成からなり、第１単位フィルターＡ１の細線とは直角をなすように回転して配置した構成をなす第２単位フィルターＡ２を２個用い、互いの細線が平行に重なり合うように配置して第２単位フィルター組立体Ｂ２とする。したがってこの第２単位フィルター組立体Ｂ２を構成する各第２単位フィルターＡ２についても、互いに隣接する左右の細線の間隔ｄ１は、細線の径ｄ０の数倍より大きく設定し、また、第２単位フィルターを重ね合わせたときの上下の線間隔ｄ２は細線径ｄ０の２倍以下とすると共に、磁気ビーズの固まりが引っかからない程度とする。
【００３２】
前記のような第１単位フィルター組立体Ｂ１と第２単位フィルターＢ２とを重ね合わせて、図１（ｂ）、図２（ａ）、図３に示すような単位フィルター組立重合体Ｃを形成する。このようにして形成した単位フィルター組立重合体Ｃを図１（ｂ）、図２（ｂ）、図３のように重ね合わせ、必要に応じて更に多数積み重ねることにより最終的なフィルター５とする。図２（ｂ）の例においては、単位フィルター組立重合体Ｃを積み重ねるに際して、全ての平行な細線が重なり合うように配置した例を示している。
【００３３】
それに対して図２（ｃ）の例においては、上方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第１単位フィルター組立体Ａ１の細線と、下方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第１単位フィルター組立体Ａ１の細線とは、それぞれが隣接する左右の細線の中間位置になるように、１／２ピッチずらして配置している。同様に上方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第２単位フィルター組立体Ａ２の細線と、下方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第２単位フィルター組立体Ａ２の細線についても、それぞれが隣接する左右の細線の中間位置になるように１／２ピッチずらして配置している。このように構成することにより、前記図２（ｂ）の例よりも、磁気ビーズの捕捉効果が向上する。
【００３４】
このようなフィルターについてより具体的には、上記細線の直径は８〜２０ミクロンのステンレス細線とし、互いに平行な細線で形成される各層において、互いの線間隔は、捕捉したい磁性ビーズのサイズに合わせて、数十ミクロンから数百ミクロンとする。また、このような構造のフィルターは、例えば図１（ｂ）、及び図３に示すように、ドーナツ状のフレーム１１の上面１２に互いに平行に細線１３を固定することにより行われる。その際には例えば図４に示すような、従来から半導体等の電子部品のリード線を配線するボンディングマシン２１を用い、Ｘ−Ｙテーブル２２とＺ方向に移動する超音波ホーン２３を用いて、細線２４をフレーム１１の上面１２に対して互いに平行にボンディングすることにより、容易に製作することができる。
【００３５】
このようにして作成された１つの層としてフィルターの断面を図４（ｂ）（ｃ）に示す。同図に示す例においては、ドーナツ状に形成したフレーム１１の上面に、ボンディング部２４が突出しないように、上面１２より窪んだ凹部としての細線固定部２５を設け、この部分にボンディングマシン２１で細線端部を固定することにより、フレームの上面１２から突出しないフィルターの層が形成される。
【００３６】
また、本発明において、互いに平行な上下の細線間の間隔ｄ１を細線の径ｄ０の２倍以下程度とするため、細線の径が例えば数十μｍである時にはこの間隔ｄ１がその２倍程度でやはり数十μｍでなければならないことと、細線を固定するフレーム１１の厚さが十分に薄くできないことを考慮して、図５（ｂ）のように同一構成の単位フィルターを互いに向き合わせて重ね合わせることにより、同図（ａ）の前記のような条件に従った同図（ｃ）のような所定の間隔ｄ１となる単位フィルター組立体とすることができる。
【００３７】
本発明は更に図６に示すような構成のフィルターとすることもできる。即ち、図６に示すフィルターにおいては、同図（ａ）に示す前記の例と同様の第１単位フィルターＡ１が２枚からなる第１単位フィルター組立体Ｂ１と、第２単位フィルターＡ２が２枚からなる第２単位フィルター組立体Ｂ２とによって単位フィルタ組立重合体Ｃを構成しているのに対して、これを重ねる単位フィルター組立重合体Ｃ’を構成する単位フィルターＡ１’、Ａ２’は同図（ｂ）に示すように、前記単位フィルター組立重合体Ｃの各単位フィルターＡ１、Ａ２とは４５度回転した状態に配置すると共に、単位フィルターＡ１とＡ２が形成する正方形の格子の中心部分に、単位フィルターＡ１’とＡ２’が形成する正方形の格子の交差部分が位置するように設定している。その結果、単位フィルター組立重合体Ｃの隣接する細線の間隔が図６（ｃ）のようにｄ１であるとき、単位フィルター組立重合体Ｃ’の細線の間隔は同図（ｄ）のように１／√２×ｄ１となる。
【００３８】
上記のような単位フィルター組立重合体Ｃ’においても、第１単位フィルターＡ１’とＡ１’、及びＡ２’とＡ２’の、左右及び上下の細線配置並びに間隔は前記と同様に設定され、同様の作用をなす。したがって、前記のような単位フィルター組立重合体ＣとＣ’とを重合してなるフィルターは、図６（ｅ）のような細線の配置構成となり、このフィルターを通過する溶液中のビーズをより確実に捕捉することが可能となる。
【００３９】
本発明は上記のように種々の態様で実施することができるものであるが、そのほか単位フィルターを重ねて単位フィルター組立体を構成する際に、前記実施例のように２個重ねる以外に３個、４個と任意の個数重ねる等、前記と同様の技術思想によって、更に種々の態様で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の高勾配磁気分離用フィルターを用いる医療用抗体タンパク質分離・精製用高勾配磁気分離システムの構成概要図、及びフィルターの説明図である。
【図２】本発明のフィルターの基本的な説明図である。
【図３】本発明のフィルターの積層状態を示す斜視図である。
【図４】本発明のフィルターの細線部分の製造行程、及びそれにより製造されるフィルターの説明図である。
【図５】単位フィルターを重合するときの例を示す図である。
【図６】フィルターの他の態様を示す図である。
【図７】磁性ビーズを用いて所望の抗体を分離する原理を示す説明図である。
【図８】（ａ）は免疫グロブリンの模式構造図であり、（ｂ）は直径１００ｎｍの磁気ビーズによる免疫グロブリンの捕捉の概念図である。
【図９】本発明者等が先に提案している、ステンレスウールからなるフィルターを用いた医療用抗体タンパク質分離・精製用高勾配磁気分離システムの構成概要、及び超伝導マグネットの作用を示す図である。
【符号の説明】
【００４１】
１ 超伝導電磁石
２ 中心部分
３ 管
４ 冷凍システム
５ フィルター
６ システム制御装置
１１ フレーム
１２ 上面
１３ 細線
【技術分野】
【０００１】
この発明は溶液中において周囲に特定の抗体に特異的に結合する結合部位を備えた微細な磁性ビーズを混合し、溶液中の所望の抗体を結合させた状態で、高勾配で磁化した細線からなるフィルターを通して磁性ビーズを細線に吸着して分離する高勾配磁気分離用フィルターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年は特にバイオや創薬の分野において、マイクロビーズや更に微細なナノビーズを用いた細胞・分子のタンパク質を分離するスクリーニング技術が国際的に研究されており、その一つの手法として、多くの細胞・分子のタンパク質をビーズを用いて分離する技術が確立してきている。この技術では例えば図７（ａ）に示すように、直径がマイクロメータ或いはナノメータ単位の微細な磁性体からなる磁性ビーズ５１の周囲に固定化用機能性膜５２を形成し、それにより選択官能基５３を固定できるようにしている。
【０００３】
このような磁性ビーズを用いると、同図（ｂ）に一部を拡大して示すように、選択官能基５３の先端における特定の抗体に特異的に結合する結合部位５４に所望の抗体５５を結合させ、その状態でこの磁性ビーズ５１に磁気を帯びさせて磁気ビーズとし、この磁気ビーズを、周囲に配置した永久磁石や電磁石により吸着し収集することによって、特定の抗体５５を液体中から分離し精製することができる。
【０００４】
ビーズを用いた分離技術はビーズと目的物質との反応効率を向上させることが重要で、反応表面積を増大させることが、分離効率向上および作業時間短縮になるため、サイズを小さくすることが課題である。ビーズのサイズを1/10に出来れば、表面積は1/102になり、同じ質量のビーズであれば、個数は103倍になり、全反応面積は（1/102×103＝10）10倍になり、微量含有の目的物と結合する確率を飛躍的に大きくし、捕捉反応時間を大幅に短縮することが出来る。現在開発されているアフィニティー（Affinity ：分子間親和性）ビーズは、磁性ビーズと非磁性ビーズに大別される。非磁性ビーズはポリマービーズなどの有機系と多孔質シリカビーズなどの無機系に分けられ、サイズを小さくすることは比較的容易であり、すでにナノサイズのアフィニティービーズが開発されている。しかし、これらの非磁性ビーズはターゲットを希釈してカラムに導入し、アフィニティークロマトグラフィーによる分離・精製が必要になり、検査・分析用のバッチ処理には適するが、産業応用に必要な高濃度化や高速・大量・連続分離精製には向かない。これに対し、磁性ビーズは磁気力により分離・精製するので高濃度化が容易であり、高速・大量・連続分離精製には向いているため、産業用には磁性ナノビーズによる分離精製技術が嘱望される。しかし、現在開発されているものは、永久磁石による高勾配磁気分離で分離・検出するシステムであるため、磁気力に限界があり、磁気ビーズを溶液中の粘性抵抗に逆らって引き寄せ磁気回収するためにはある程度以上の磁気量を体積で稼ぐ必要があり、ナノサイズの磁性ビーズは使用されていない。現在は小さいものでも直径約1.5〜1.0ミクロン程度が使用限界である。磁気分離以外の利用では、直径数十ナノメートルの磁性ビーズのリゾヒスト（SPIO：Super Paramagnetic Iron Oxide）がMRI造影剤として臨床用に使用されている。そこで、本技術では、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離を採用することにより、磁性ナノビーズによる分離精製技術を確立しようとするものである。今や磁性ビーズは医療・メディカルエンジニアリングの発展にとって不可欠なツールとなっている。
【０００５】
このような微細な磁性ビーズを実際に用いるときには、種々の抗体や各種物質が含まれている液体中に存在する所望の抗体を前記のような官能基に固定し、液体中に設けた金属細線を磁化して磁石化したところに、前記磁気を帯びた磁気ビーズを吸着させ、その後金属細線の磁化を取り除くことによって、吸着していた磁気ビーズを金属細線から分離することによって、所望の抗体を収集している。この技術については既に、例えば２ないし４種類のスクリーニングを自動ロボット化した分析装置が市販されるようにもなって確立している。しかしながら未だ溶液中の抗体のほとんどを分離するところまでは至らず、効率的な分離・精製が行われているとはいえない。また、できる限り多くの分離を行おうとすると分離・精製に要する時間が長くなる。更に装置は大型であり、取り扱い性に未だ難がある。
【０００６】
したがって、より効率的な分離精製を行うと共に装置を小型化するには、ナノサイズの微細なビーズを用いるとともにそのビーズを高磁性化し、またこのビーズを吸着して捕捉する金属細線についてもより高磁性化、細線化し、更に多くの抗体を液体中から分離できるようにすることが望まれている。
【０００７】
本件発明者等は前記課題を解決するため、磁性ビーズ及びこれを吸着する金属細線を磁化するために、超伝導マグネットを用いて高勾配磁場を形成し、その磁場の中で前記のような所望の抗体の精製・分離を行い、微量含有タンパク質等の有用物質を高速・高効率で連続的に大量に分離精製するシステムを開発している。
【０００８】
この技術のシステム原理図を図９に示す。このシステムに基づく実験においては、小型冷凍機を採用した伝導冷却式である卓上型の小型超伝導電磁石７１を用いて、永久磁石の数十〜数百倍もの強力な磁場である、最大５Tの磁場を発生させる。小型超伝導電磁石７１の中心部分７２には直径約２６ｍｍの円筒状の室温の空間を持たせ、この空間に内径２０ｍｍ、外形２４ｍｍのガラス管７３を通し、この管７３の中に直径数〜数十ミクロン程度の磁性細線のステンレスウール７４からなるフィルター７５を挿入する。この直径数ミクロン程度のステンレス細線の周辺に高勾配磁場を作り出す。
【０００９】
このような装置において、所望の抗体のほか種々のタンパク質や他の物質が混入した溶液中に更に前記磁性ビーズを混合し、前記図７（ａ）〜（ｃ）のように磁性ビーズに所望の抗体を結合した状態となっている溶液７６を、管７３の上方から注ぎ込む。この溶液７６は前記のような高勾配磁場を周囲に作り出すステンレスウール７４からなるフィルター７５内を通過するとき、磁性ビーズは超伝導電磁石により得られる高磁界により磁気を帯びて磁気ビーズとなり、且つ４Ｔ程度の高磁界により局所的に磁化した磁性細線であるフィルター７５の周りに作られた非常に大きな磁場勾配によって所望の抗体を結合した磁気ビーズをフィルター７５に吸着する。
【００１０】
その後磁場を４Ｔから０Ｔに下げた後、磁性微粒子を含まないエタノールを前記と同様にフィルター７５に流し、それを更に濾紙で濾過して、濾紙上に磁性微粒子を捕捉することによって分離する。このように、固定したい目的物質を含む原液に磁性ナノビーズを混合し、この管に流すだけで、大容量の溶液から短時間に高効率で微量含有の貴重な目的物質を捕獲・分離できるようになった。
【００１１】
上記のような装置を用いて実際に免疫グロブリンを分離・精製する実験を行いその性能を確かめた。免疫グロフリンは糖を２％含むポリペプチドで、約１０〜１５ｎｍのＹ字形の分子で、図８（ａ）に示すようにＹ端部のＬ鎖（Light Chain)先端には抗体に特異的に結合する部位をもつ。したがってこの部位と特異的に結合する物質を磁性ナノ粒子の表面に付けることにより、免疫グロブリンの連続・高速の分離・精製が可能となる。このときに用いる表面活性剤は、既に酸化鉄等に対して開発されており、直径数ミクロンの磁性マイクロビーズは市販されている。
【００１２】
実験においては約１５０ｃｃのエタノールに、平均粒径約１００ｎｍのナノ磁性微粒子を０．０５ｇ加え、良く攪拌した後、強加工されて磁性を持った磁気分離用のＳＵＳ３０４細線フィルターとほぼ同一のフィルターで濾過した。次に濾過した磁性微粒子を含むエタノールを、４Ｔの磁場中にセットしたフィルターの中を約７〜２５ｃｃ／ｍｉｎの速度で流し、それを更に濾紙で濾過して磁性微粒子を捕捉した。その結果は、濾過後の液体について微粒子は検出できなかったのに対して、磁場をゼロにして同様の処理を行ったところ、０．０４ｇの微粒子が検出された。このことからこのシステムは極めて効率よく平均粒径約１００ｎｍの磁性微粒子を捕捉できることがわかった。このことから、医療用タンパク質のうち特に血清中に微量存在する免疫グロブリンの分離／精製に超伝導マグネットを用いた高勾配磁気分離システムが有効であることを確認した。
【００１３】
なお、粒子状物質の表面に特定の抗体に特異的結合性を有する性状を持たせ、液体中から所望の抗体等を分離する技術は特開２００２−１１６３号公報（特許文献１）に開示されている。
【特許文献１】特開２００２−１１６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者等が開発した上記のような装置において、ほぼ確実にフィルターに磁性微粒子を捕捉することができることがわかったが、ここで最も重要な点は、前記のように磁性ビーズを吸着したフィルターから、この磁性ビーズを確実に回収できることである。即ち、このフィルターに求められる性能は、磁場の印可時には効率よく磁気ビーズを捕捉・分離し、磁場を減少させた時にはほとんど全ての磁気ビーズをフィルターから回収できることである。現在一般的に採用しているステンレス細線のウールからなるフィルターは製造が容易であり、比較的捕捉率も良いという利点があるが、フィルターを通過しようとする各種物質が物理的に捕捉されて目詰まりを起こしやすく、また磁場を取り除いたときに、フィルターに電磁的に捕捉されていた磁気ビーズを効率よく回収するのは難しい。
【００１５】
その理由は、フィルターの細線の一部が交差接触する部分に一度捕捉されたビーズは、付近の他の磁化したビーズを引き付けて凝集してしまうため、磁場が全くなくなってもステンレスウールに物理的に挟まれた状態でフィルターに捕捉されたままとなり、回収され難いからである。高価で取り扱いに十分な注意を要する前記のような磁性ビーズを、医用タンパク質の高勾配磁気分離装置の分離・精製に利用するためには、捕捉後に付加価値の極めて高い目的物質（タンパク質）を捕捉しているビーズを回収する効率が極めて高いフィルターを用いることが必須である。
【００１６】
したがって本発明は、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離技術によって、微量含有タンパク質等の有用物質を高速且つ高効率で、しかも連続的に大量分離することができ、更に捕捉した高価な磁性ビーズを磁場を取り除くだけで高速・高効率で回収することができる、高勾配磁気分離用フィルターを提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は前記課題を解決するため、更に研究を重ねた結果以下の手法を採用するに至ったものである。即ち、磁性細線を１）補足したい磁気ビーズのサイズに合わせて、数十ミクロンから数百ミクロンの間隔で平行に磁性細線を並べた構造のフィルターAを作製する。このときフィルターの磁性細線の左右の間隔を小さくし過ぎると、細線間の空間では隣の細線の磁化の影響を受けて、磁性ビーズは細線から反発力を受け、捕捉効率が悪くなることが判明した。また、フィルターの磁性細線の平行な上下の間隔は、ある程度小さいほうが磁性ビーズに働く捕捉引力が増すことが分かった。また、このときフィルターの磁性細線を上下に平行に配置する場合は、下の平行磁性細線の配置を上の磁性細線間の中心の真下にくるように配置すると捕捉効率が大幅に向上することが分かった。そこで、（１）フィルターAの細線の左右間隔を細線径の数倍より大きくし、フィルターＡを同位相で上下に積層する時は、上下の細線間隔を、細線径の２倍以下程度にして、捕捉効率を改善する。
（２）フィルターＡを同位相で、上述した間隔で積層したフィルター群Bと、これに直交するようにもうひとつのフィルター群Bを重ねてフィルター群Cをつくる。このフィルター群Cをさらに積層したものをフィルターとする。
（３）フィルターC群を積層するにあたり、下の平行磁性細線の配置を上の磁性細線間の中心の真下にくるように配置し、格子状の流路の中心に次の積層するフィルター群Ｃの格子点が来るように平面内で細線間隔の2分の一だけ細線方向および直角方向に平行移動した形状にする。この２つのフィルター群Cを積層しフィルターをつくる。
（４）フィルターC群を積層するにあたり、フィルターC群の格子状の流路の中心につぎの積層するフィルター群Ｃ’の格子点が来るように平面内で位相を45度回転させたものを作製する。このとき、積層しフィルターＣ’群の平行細線間隔はC群のそれの√2分の一になる。このフィルターC群とＣ’群を積層した構造のフィルターをつくる。
【００１８】
本発明については、より具体的には次のような構成とする。即ち、本発明に係る高勾配磁気分離用フィルターは、前記課題を解決するため、捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな所定の間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせることにより第１単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせると共に、前記第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、前記単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成すると共に、前記互いに重ね合わされて上下に位置する第１単位フィルターの磁性細線と第２単位フィルターの磁性細線との間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定したことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る他の高勾配磁気分離用フィルターは、前記高勾配磁気分離用フィルターにおいて、前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに平行で同一ピッチとし、且つ位相をずらすことにより、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線の間隔の中間に、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が位置するように設定したことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る他の高勾配磁気分離用フィルターは、前記高勾配磁気分離用フィルターにおいて、前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに４５度回転させるとともに、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の交点が、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の格子の中心に位置するように、磁性細線のピッチを設定したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は上記のように構成したので、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離技術によって、微量含有タンパク質等の有用物質を高速且つ高効率で、しかも連続的に大量分離することができ、特に捕捉した高価な磁性ビーズを高効率で回収することができる、高勾配磁気分離用フィルターとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、超伝導磁石を用いた高勾配磁気分離技術によって、微量含有タンパク質等の有用物質を高速且つ高効率で、しかも連続的に大量分離することができ、特に捕捉した高価な磁性ビーズを高効率で回収するという課題を、捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな所定の間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせることにより第１単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で重ね合わせると共に、前記第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成し、前記第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、前記単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成すると共に、前記互いに重ね合わされて上下に位置する第１単位フィルターの磁性細線と第２単位フィルターの磁性細線との間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定することにより実現した。
【実施例１】
【００２３】
本発明において、高効率のフィルターを得るために、磁性ビーズがどのように抗体に結合するかを詳細に検討し、それにより必要とされる磁性ビーズの態様、更にそのような磁性ビーズを捕捉するために必要とされるフィルターの特性と、そのフィルターのあるべき構造を検討し、本発明による高勾配磁気分離用フィルターを開発するに至ったので、これらを順に説明する。
【００２４】
抗体の模式構造は図８（ａ）に示すようにＹ字型の二股になっており、この二股部分の先は抗体結合部位と呼ばれ、ここに磁性ビーズを結合させることになる。捕捉・分離したい目的物質の抗体の溶液中の密度（濃度）は極めて小さいので、ビーズの個数を大幅に増やし、反応確立を高くする必要がある。このため、ビーズのサイズを小さくする必要がある。図８（ｂ）に径１００ｎｍの磁気ビーズによる免疫グロブリンの捕捉の概念図を示す。
【００２５】
したがって磁性ビーズを拡散させると、磁性ビーズの直径が小さいほど、多数のビーズが分散して含まれることになり、結合する確率は高くなって有利である。具体的には、同じ質量のビーズを使用すると仮定すると、直径が１／ｎになると表面積は１／ｎ２になり、個数はｎ３倍になり、反応活性面積はｎ倍（１／ｎ２×ｎ３＝ｎ）になり（したがって攪拌反応時間は約１／ｎになり、時間を短縮出来、高速化になり）、コストはｎ倍にはならず、同じ程度かもしくはそれ以下で可能である。したがって、可能な限り直径は小さい方がよい。しかしながら、磁性ビーズの直径が小さいと、磁気ビーズになったときの磁気力が小さくなり、磁気ビーズに働く電磁力も小さくなる為、補足が難しくなる。また、フィルターが密すぎるとフィルターの洗浄が必要になり、またビーズの回収効率が悪くなる。したがって、フィルターを構成する磁性細線の断面形状・寸法、配置間隔の検討が必要になる。
【００２６】
ここで磁性ビーズが受ける磁気力を検討すると、超伝導磁石を用いた高磁界・高勾配磁気分離装置により、磁気を帯びた磁性ビーズである磁気ビーズが受ける磁気力(magnetic force)ＦＭは、外部磁場が充分大きい場合、次式で表される。
ＦＭ＝ＶｐＭｓ▽Ｈ （１）
但し、Ｖｐは磁気ビーズの体積、Ｍｓは磁気ビーズの飽和磁化、Ｈは磁気ビーズが置かれている磁場の大きさである。
【００２７】
一方、流体が磁気ビーズを押し流そうとする力(drag force)ＦＤは、
ＦＤ＝６πｂηνｐ （２）
ここで、νｐは粒子の速度、ηは流体の粘性率、ｂは磁性ビーズの半径である。
【００２８】
ここで、一本のＳＵＳ丸細線の周囲に働く磁気力を計算すると、ＳＵＳ細線の直径を８、２０μｍとし、磁場を４．０Ｔとして径１００ｎｍの磁性ビーズ１個に作用する磁気力を、Ｍｓは０．１Ｔ、νｐは０．５ｍｍ／ｓ、ηは１．１×１０−３Ｐａｓとして計算するとき、その磁気力分布の計算結果は磁気力はＳＵＳ細線の直径が８μの時、直径と２倍程度、２０μｍの時直径の１．５倍程度まではたらくことがわかる。これらの結果から、径１００ｎｍの磁気ビーズに対して、２０μｍの細線でも磁気分離が十分可能であることがわかった。
【００２９】
このような事実を背景に、効率的に磁性ビーズをフィルター細線に吸着させる手法を検討した結果、図２(ａ)に示すような原理のフィルターを提案するものである。即ち図１（ｂ）図２（ａ）（ｂ）及び図３に示すフィルターは、互いに線間隔ｄ１として平行に配置している直径ｄ０の細線ａ、ａ・・・から第１単位フィルターＡ１を構成する。このときの線間隔ｄ１は細線の径ｄ０の数倍より大きく設定する。それにより、磁性細線の隣接する左右の間隔を小さくし過ぎることによって、細線間の空間で隣の細線の磁化の影響を受けて、磁性ビーズが細線から反発力を受けることのより、捕捉効率が悪くなることを防止することができる。
【００３０】
この第１単位フィルターＡ１と全く同一構成からなる他の第１単位フィルターＡ１を互いの細線ａが平行に重なるように、且つ互いの平行な細線ａの上下の線間隔ｄ２は、あまり広げすぎないように、細線径ｄ０の２倍以下とする。即ち、この上下の線間隔については、ある程度小さいほうが磁性ビーズに働く捕捉引力が増すことが分かり、また狭すぎるとその線の間隙に磁気ビーズが引っかかって磁気ビーズ収集時に洗い流すことができなくなるためである。このようにして、全く同一構成で細線を互いに平行に配置した第１単位フィルターＡ１を重ね合わせることにより、第１単位フィルター組立体Ｂ１が得られる。
【００３１】
上記のような第１単位フィルター組立体Ｂ１を構成する第１単位フィルターＡ１と同一構成からなり、第１単位フィルターＡ１の細線とは直角をなすように回転して配置した構成をなす第２単位フィルターＡ２を２個用い、互いの細線が平行に重なり合うように配置して第２単位フィルター組立体Ｂ２とする。したがってこの第２単位フィルター組立体Ｂ２を構成する各第２単位フィルターＡ２についても、互いに隣接する左右の細線の間隔ｄ１は、細線の径ｄ０の数倍より大きく設定し、また、第２単位フィルターを重ね合わせたときの上下の線間隔ｄ２は細線径ｄ０の２倍以下とすると共に、磁気ビーズの固まりが引っかからない程度とする。
【００３２】
前記のような第１単位フィルター組立体Ｂ１と第２単位フィルターＢ２とを重ね合わせて、図１（ｂ）、図２（ａ）、図３に示すような単位フィルター組立重合体Ｃを形成する。このようにして形成した単位フィルター組立重合体Ｃを図１（ｂ）、図２（ｂ）、図３のように重ね合わせ、必要に応じて更に多数積み重ねることにより最終的なフィルター５とする。図２（ｂ）の例においては、単位フィルター組立重合体Ｃを積み重ねるに際して、全ての平行な細線が重なり合うように配置した例を示している。
【００３３】
それに対して図２（ｃ）の例においては、上方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第１単位フィルター組立体Ａ１の細線と、下方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第１単位フィルター組立体Ａ１の細線とは、それぞれが隣接する左右の細線の中間位置になるように、１／２ピッチずらして配置している。同様に上方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第２単位フィルター組立体Ａ２の細線と、下方に位置する単位フィルター組立重合体Ｃの第２単位フィルター組立体Ａ２の細線についても、それぞれが隣接する左右の細線の中間位置になるように１／２ピッチずらして配置している。このように構成することにより、前記図２（ｂ）の例よりも、磁気ビーズの捕捉効果が向上する。
【００３４】
このようなフィルターについてより具体的には、上記細線の直径は８〜２０ミクロンのステンレス細線とし、互いに平行な細線で形成される各層において、互いの線間隔は、捕捉したい磁性ビーズのサイズに合わせて、数十ミクロンから数百ミクロンとする。また、このような構造のフィルターは、例えば図１（ｂ）、及び図３に示すように、ドーナツ状のフレーム１１の上面１２に互いに平行に細線１３を固定することにより行われる。その際には例えば図４に示すような、従来から半導体等の電子部品のリード線を配線するボンディングマシン２１を用い、Ｘ−Ｙテーブル２２とＺ方向に移動する超音波ホーン２３を用いて、細線２４をフレーム１１の上面１２に対して互いに平行にボンディングすることにより、容易に製作することができる。
【００３５】
このようにして作成された１つの層としてフィルターの断面を図４（ｂ）（ｃ）に示す。同図に示す例においては、ドーナツ状に形成したフレーム１１の上面に、ボンディング部２４が突出しないように、上面１２より窪んだ凹部としての細線固定部２５を設け、この部分にボンディングマシン２１で細線端部を固定することにより、フレームの上面１２から突出しないフィルターの層が形成される。
【００３６】
また、本発明において、互いに平行な上下の細線間の間隔ｄ１を細線の径ｄ０の２倍以下程度とするため、細線の径が例えば数十μｍである時にはこの間隔ｄ１がその２倍程度でやはり数十μｍでなければならないことと、細線を固定するフレーム１１の厚さが十分に薄くできないことを考慮して、図５（ｂ）のように同一構成の単位フィルターを互いに向き合わせて重ね合わせることにより、同図（ａ）の前記のような条件に従った同図（ｃ）のような所定の間隔ｄ１となる単位フィルター組立体とすることができる。
【００３７】
本発明は更に図６に示すような構成のフィルターとすることもできる。即ち、図６に示すフィルターにおいては、同図（ａ）に示す前記の例と同様の第１単位フィルターＡ１が２枚からなる第１単位フィルター組立体Ｂ１と、第２単位フィルターＡ２が２枚からなる第２単位フィルター組立体Ｂ２とによって単位フィルタ組立重合体Ｃを構成しているのに対して、これを重ねる単位フィルター組立重合体Ｃ’を構成する単位フィルターＡ１’、Ａ２’は同図（ｂ）に示すように、前記単位フィルター組立重合体Ｃの各単位フィルターＡ１、Ａ２とは４５度回転した状態に配置すると共に、単位フィルターＡ１とＡ２が形成する正方形の格子の中心部分に、単位フィルターＡ１’とＡ２’が形成する正方形の格子の交差部分が位置するように設定している。その結果、単位フィルター組立重合体Ｃの隣接する細線の間隔が図６（ｃ）のようにｄ１であるとき、単位フィルター組立重合体Ｃ’の細線の間隔は同図（ｄ）のように１／√２×ｄ１となる。
【００３８】
上記のような単位フィルター組立重合体Ｃ’においても、第１単位フィルターＡ１’とＡ１’、及びＡ２’とＡ２’の、左右及び上下の細線配置並びに間隔は前記と同様に設定され、同様の作用をなす。したがって、前記のような単位フィルター組立重合体ＣとＣ’とを重合してなるフィルターは、図６（ｅ）のような細線の配置構成となり、このフィルターを通過する溶液中のビーズをより確実に捕捉することが可能となる。
【００３９】
本発明は上記のように種々の態様で実施することができるものであるが、そのほか単位フィルターを重ねて単位フィルター組立体を構成する際に、前記実施例のように２個重ねる以外に３個、４個と任意の個数重ねる等、前記と同様の技術思想によって、更に種々の態様で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の高勾配磁気分離用フィルターを用いる医療用抗体タンパク質分離・精製用高勾配磁気分離システムの構成概要図、及びフィルターの説明図である。
【図２】本発明のフィルターの基本的な説明図である。
【図３】本発明のフィルターの積層状態を示す斜視図である。
【図４】本発明のフィルターの細線部分の製造行程、及びそれにより製造されるフィルターの説明図である。
【図５】単位フィルターを重合するときの例を示す図である。
【図６】フィルターの他の態様を示す図である。
【図７】磁性ビーズを用いて所望の抗体を分離する原理を示す説明図である。
【図８】（ａ）は免疫グロブリンの模式構造図であり、（ｂ）は直径１００ｎｍの磁気ビーズによる免疫グロブリンの捕捉の概念図である。
【図９】本発明者等が先に提案している、ステンレスウールからなるフィルターを用いた医療用抗体タンパク質分離・精製用高勾配磁気分離システムの構成概要、及び超伝導マグネットの作用を示す図である。
【符号の説明】
【００４１】
１ 超伝導電磁石
２ 中心部分
３ 管
４ 冷凍システム
５ フィルター
６ システム制御装置
１１ フレーム
１２ 上面
１３ 細線
【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな所定の間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせることにより第１単位フィルター組立体を構成し、
前記第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせると共に、前記第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成し、
前記第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、
前記単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成すると共に、
前記互いに重ね合わされて上下に位置する第１単位フィルターの磁性細線と第２単位フィルターの磁性細線との間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定したことを特徴とする高勾配磁気分離用フィルター。
【請求項２】
前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、
前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに平行で同一ピッチとし、且つ位相をずらすことにより、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線の間隔の中間に、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が位置するように設定したことを特徴とする請求項１記載の高勾配磁気分離用フィルター。
【請求項３】
前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、
前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに４５度回転させるとともに、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の交点が、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の格子の中心に位置するように、磁性細線のピッチを設定したことを特徴とする請求項１記載の高勾配磁気分離用フィルター。
【請求項１】
捕捉する磁性ビーズの径の数倍より大きな所定の間隔で、互いに平行な磁性細線を備えた第１単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせることにより第１単位フィルター組立体を構成し、
前記第１単位フィルターと同一構成からなる第２単位フィルターを同一態様で複数重ね合わせると共に、前記第１単位フィルターの平行な磁性細線とは直角をなすように配置して第２単位フィルター組立体を構成し、
前記第１単位フィルター組立体と第２単位フィルター組立体とを重ね合わせて単位フィルター組立重合体を構成し、
前記単位フィルター組立重合体を１個または複数用いることによりフィルターを構成すると共に、
前記互いに重ね合わされて上下に位置する第１単位フィルターの磁性細線と第２単位フィルターの磁性細線との間隔を、磁性細線の２倍より小さく設定したことを特徴とする高勾配磁気分離用フィルター。
【請求項２】
前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、
前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに平行で同一ピッチとし、且つ位相をずらすことにより、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線の間隔の中間に、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が位置するように設定したことを特徴とする請求項１記載の高勾配磁気分離用フィルター。
【請求項３】
前記単位フィルター組立重合体を複数用いて互いに重ね合わせることによりフィルターを構成し、
前記互いに重ね合わせる上下の単位フィルター組立重合体の磁性細線を互いに４５度回転させるとともに、下方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の交点が、上方の単位フィルター組立重合体の磁性細線が形成する平面視格子状の磁性細線の格子の中心に位置するように、磁性細線のピッチを設定したことを特徴とする請求項１記載の高勾配磁気分離用フィルター。
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−４２３４９（Ｐ２０１０−４２３４９Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０７７８９（Ｐ２００８−２０７７８９）
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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