高血圧症のリスクの評価方法
【課題】高血圧症のリスクの評価手段を提供すること。
【解決手段】核酸試料について、ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位、ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位、−５１２位又はＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位における多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価する高血圧症のリスクの評価方法；該評価方法を行なうための高血圧症のリスクの評価用試薬；並びに、生検試料に含まれる核酸について、該多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法。
【解決手段】核酸試料について、ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位、ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位、−５１２位又はＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位における多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価する高血圧症のリスクの評価方法；該評価方法を行なうための高血圧症のリスクの評価用試薬；並びに、生検試料に含まれる核酸について、該多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧症のリスクの評価手段に関する。さらに詳しくは、本発明は、高血圧症のリスクの評価方法、高血圧症のリスクの評価用試薬及び高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は、血圧が正常域を超えている状態であり、動脈硬化を引き起こす。前記高血圧症のうち、原因疾患が明らかなものを二次性高血圧症といい、明らかでないものを本態性高血圧という。
【０００３】
一方、サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターの変異体は、低血圧性のナトリウムの消耗、続発性アルドステロン症、低カリウム血症、アルカローシス、低マグネシウム血症、低カルシウム尿症等を特徴とするギテルマン症候群（Ｇｉｔｅｌｍａｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と関連することが知られている〔例えば、非特許文献１〜３〕。前記ギテルマン症候群は、常染色体性劣性遺伝病として知られており、サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターにおける変異は、遠位尿細管内において、塩を再吸収するという該サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターの能力を低下させる可能性がある。
【０００４】
また、前記サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターの機能は、ＷＮＫの機能と密接に関係し、サイアザイド感受性の食塩の取込みを減少させる役割を果たしていることが知られている（非特許文献４及び５）。前記ＷＮＫは、ＴＳＣの機能を調節し、血圧の異常に関連する可能性が示唆されていた。
【０００５】
しかしながら、ＷＮＫ４遺伝子の多型は、高血圧とは関係しないことが報告されている（非特許文献６）。
【非特許文献１】マストロヤンニ(Mastroianni N.)ら、Am. J. Hum. Genet., 59, 1019-1026, 1996
【非特許文献２】サイモン(Simon DB.)ら、Nat. Genet., 12, 24-30, 1996
【非特許文献３】タケウチ(Takeuchi K.)ら、J. Clin. Endcrinol. Metab., 81, 4496-4499, 1996
【非特許文献４】チョート(Choate KA.)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 663-668, 2003
【非特許文献５】ウィルソン(Wilson FH.)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 680-684, 2003
【非特許文献６】ベンジャフィールド(Benjafield AV)ら、Clin Genet., 64, 433-438, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１つの側面では、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に判定することを可能にする、高血圧症のリスクの評価方法を提供することにある。また、本発明は、他の側面では、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に評価することを可能にする、高血圧症のリスクの評価用試薬を提供することにある。さらに、本発明は、別の側面では、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することを可能にする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 核酸試料について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価することを特徴とする、高血圧症のリスクの評価方法、
〔２〕 （１）核酸試料から、下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得るステップ、並びに
（２）（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、ａ）〜ｄ）の多型を検出するステップ、
を含む、前記〔１〕記載の評価方法、
〔３〕 動態が、電気泳動における移動度、質量又はＴｍ値を介して評価される、前記〔１〕又は〔２〕記載の評価方法、
〔４〕 下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有してなる、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬、
〔５〕 配列番号：５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対及び配列番号：１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対からなる群より選ばれた少なくとも１種のプライマー対を含有してなる、前記〔４〕記載の評価用試薬、
〔６〕 下記オリゴヌクレオチド群Ａ）〜Ｄ）：
Ａ）配列番号：５に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：６に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１５に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１６に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｂ）配列番号：７に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１７に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１８に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｃ）配列番号：９に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１０に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１９に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２０に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；及び
Ｄ）配列番号：１１に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１２に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２１に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２２に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群
からなる群より選ばれた少なくとも１種のオリゴヌクレオチド群を含有してなる、前記〔４〕記載の評価用試薬、並びに
〔７〕 生検試料に含まれる核酸について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の高血圧症のリスクの評価方法によれば、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に判定することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の評価方法により、高血圧症を迅速に診断し、しいては、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症予防につなげることができるという優れた効果を奏する。本発明の高血圧症のリスクの評価用試薬によれば、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に評価することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の高血圧症の評価用試薬によれば、高血圧症を迅速に診断し、しいては、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症予防につなげることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法によれば、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、１つの側面では、核酸試料について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価することを特徴とする、高血圧症のリスクの評価方法に関する。
【００１０】
本発明の評価方法によれば、前記ａ）〜ｄ）からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の存在を指標とするため、血圧に及ぼす影響を評価することができ、簡便に、迅速に高血圧症のリスクを判定することができるという優れた効果を発揮する。
【００１１】
本明細書において、「高血圧症」とは、収縮期血圧：１４０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧：９０ｍｍＨｇ以上、又は降圧剤服用の状態（ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸については、収縮期血圧：１６０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧：９５ｍｍＨｇ以上、又は降圧剤服用の状態）をいう。また、「正常状態」とは、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ未満であり拡張期血圧９０ｍｍＨｇ未満であり、かつ降圧剤服用していない状態をいう。
【００１２】
前記ＷＮＫ４〔ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ４〕をコードする核酸は、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０１０７５５．１３に示される塩基配列を有する。前記ＷＮＫ４は、チョート(Choate KA.)ら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 663-668, 2003〕において、高血圧症との関連性が否定されていたにもかかわらず、前記ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型が、高血圧症に関連することが、本発明者らにより見出されたものである。本発明の評価方法においては、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０１０７５５．１３に示される塩基配列の塩基番号：１４７１７（配列番号：１の塩基番号：５０１）のシトシン残基が、チミン残基に置換していることが、高血圧症のリスクを有することの１つの指標となる。
【００１３】
前記ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸は、脂肪酸や分岐鎖アミノ酸の代謝に関与するミトコンドリアの酵素である短鎖／分岐鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ〔ｓｈｏｒｔ／ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ〕をコードする核酸であり、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０３００５９．１２に示される塩基配列を有する。本発明の評価方法においては、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０３００５９．１２に示される塩基配列の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）のグアニン残基が、アデニン残基に置換していること、該ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０３００５９．１２に示される塩基配列の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）のアデニン残基が、グアニン残基に置換していることが、高血圧症のリスクを有することの１つの指標となる。
【００１４】
前記ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸は、細胞内シグナル伝達系に関与し、細胞増殖と関連するプロテインチロシンキナーゼ２〔ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２／ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ２／ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２〕をコードする核酸であり、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０２３６６６．１６に示される塩基配列を有する。本発明の評価方法においては、ＪＳＮＰ ＩＤ：ＩＭＳ−ＪＳＴ０１３５８６（配列番号：４の塩基番号：５０１）のシトシン残基が、アデニン残基に置換していることが、高血圧症のリスクを有することの１つの指標となる。
【００１５】
本発明の評価方法としては、具体的には、下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得るステップ、並びに
（２）（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、前記ａ）〜ｄ）の多型を検出するステップ、
を含む方法が挙げられる。本発明には、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸からなり、前記ａ）〜ｄ）の多型を検出するためのプローブも含まれる。
【００１６】
前記ステップ（１）において、被検試料である核酸試料から、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得る。
【００１７】
なお、後述のステップ（２）を、（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違に基づき行なう場合において、ハイブリダイゼーション技術又はＰＣＲに基づく評価手段を用いる場合等には、前記ステップ（１）を行なわなくてもよい場合がある。かかる態様も本発明に含まれる。
【００１８】
前記核酸試料は、被検対象の個体由来の生検試料〔例えば、皮膚、血液、毛髪、口腔粘膜、各種組織、細胞等〕、落屑等から慣用の核酸抽出法により得られうる。
【００１９】
前記ステップ（１）において、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸は、例えば、慣用の核酸増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ等）等を行なうことにより得られうる。かかる核酸増幅に用いられうるプライマー対としては、Ｔｍ値、二次構造の形成、公知配列等を考慮して、デザインされたオリゴヌクレオチドが用いられうる。前記プライマー対は、前記指標遺伝子の塩基配列と公知データベースに登録された配列とを参照して、慣用のプライマーデザイン用ソフトウェア等によりデザインされうる。前記プライマー対は、適宜、検出に適した標識物質（蛍光物質、放射性物質等）により標識されうる。プライマーの鎖長は、特に限定されないが、例えば、好ましくは、連続した少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、１７〜３０ヌクレオチドであることが望ましい。前記プライマー対としては、例えば、ａ’）の核酸について、配列番号：６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、ｂ’）の核酸について、配列番号：８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、ｃ’）の核酸について、配列番号：１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、ｄ’）の核酸について、配列番号：１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対も本発明に含まれる。
【００２０】
ついで、（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、前記ａ）〜ｄ）の多型を検出する〔ステップ（２）〕。
【００２１】
前記（Ｉ）の塩基配列は、マキサムギルバート法、ＰＣＲを用いたダイレクトシークエンシング等の慣用の配列決定法により決定されうる。
【００２２】
ここで、前記ステップ（１）で得られた核酸において、前記ａ）〜ｄ）の多型の位置に対応する位置において、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸とは異なる塩基が見出された場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００２３】
前記（ＩＩ）の動態は、例えば、電気泳動における移動度、質量、Ｔｍ値等を介して評価される。
【００２４】
電気泳動における移動度は、例えば、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析等により評価されうる。
【００２５】
具体的には、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析の場合、ポリアクリルアミドゲル上において、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を泳動し、移動度を測定し、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間で移動度が異なる場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００２６】
また、前記電気泳動における移動度は、ＰＣＲに基づく一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）によっても行なうことができる。この場合、前記ステップ（１）を行なわなくてもよい。前記ＰＣＲ−ＳＳＣＰで用いうるプライマー対としては、前記と同様のものが挙げられる。なお、この場合、かかるプライマーは、蛍光物質等の慣用の標識物質で、それぞれのプライマーの末端が標識されたものであってもよい。
【００２７】
前記質量は、例えば、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ）、四重極質量分析計等により測定されうる。ここで、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間で質量が異なる場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００２８】
前記Ｔｍ値は、ＤＮＡアレイを用いたハイブリダイゼーション、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法等により評価されうる。
【００２９】
前記ＤＮＡアレイを用いたハイブリダイゼーションの場合、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸を固定化した支持体〔例えば、ガラス（例えば、スライドグラス）、シリコンチップ等〕が用いられうる。前記ＤＮＡアレイを用いたハイブリダイゼーションの場合、前記ステップ（１）において、核酸試料は、該試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を適切な標識物質で標識すればよい。前記標識物質としては、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等が挙げられる。例えば、前記蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いた場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出されうる。前記ＤＮＡアレイは、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸に、支持体表面への固定化を容易にしうる修飾基を導入し、ついで、得られた修飾核酸を、慣用のＤＮＡアレイ作製装置を用いて、ＤＮＡアレイによるハイブリダーゼションを行ないうる範囲の固定化量、固定化密度で、整列、固定化することにより作製されうる。ＤＮＡアレイを用いて、多型を検出する場合、ハイブリダイゼーションにおける条件は、好ましくは、高ストリンジェンシーであることが望ましい。ここで、ＤＮＡアレイ上の前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸に、前記ステップ（１）で得られた核酸がハイブリダイズしない場合又は対照として前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸を用いたハイブリダイゼーションに基づく場合の蛍光強度と比較して、前記ステップ（１）で得られた核酸のハイブリダイゼーションに基づく蛍光強度が減少した場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。なお、本発明には、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸が固定化されたＤＮＡアレイも含まれる。
【００３０】
前記変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法の場合、変性剤（例えば、尿素等）の濃度勾配により、Ｔｍ値の差が、電気泳動の移動度の違いとして検出される。したがって、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を泳動し、移動度を測定し、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間で移動度が異なる場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００３１】
また、前記（ＩＩ）の動態は、ＴａｑＭａｎ法、インベーダー法、ＲＮａｓｅ Ａミスマッチ切断法等によっても評価されうる。
【００３２】
前記Ｔａｑｍａｎ法の場合、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸をプローブとして用いてもよい。ここで、前記プローブは、５’末端側をレポーターとなる蛍光物質で標識し、３’末端側をクエンチャーとなる物質で標識する。この場合、前記ステップ（１）を行なわなくてもよい。また、ＰＣＲの際には、核酸試料を鋳型とし、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて行なわれうる。ＴａｑＭａｎ法に用いられうるプライマー対及びプローブとしては後述の表１に示されるオリゴヌクレオチドが挙げられ、具体的には、例えば、配列番号：５に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：６に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１５に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１６に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：７に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１７に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１８に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：９に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１０に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１９に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２０に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：１１に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１２に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２１に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２２に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：１３に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１４に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２３に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２４に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群等が挙げられる。
【００３３】
また、インベーダー法の場合、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に基づき設計されたインベーダープローブのレポーター蛍光が、多型により生じるミスマッチ部分に侵入することで、ｃｌｅａｖａｓｅが認識する構造が生成され、該ｃｌｅａｖａｓｅによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊離したレポーター蛍光を検出することにより行なわれうる。この場合、蛍光強度が、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を対照として用いた場合に比べ、増加した場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００３４】
なお、本明細書において、「ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸」とは、核酸試料中に含まれる核酸において、ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸の塩基配列の他、該塩基配列中、ａ）〜ｄ）の多型を有する核酸、該多型の位置以外の位置における高血圧症に無関係である変異を有する核酸をも含むことを意図する。
【００３５】
なお、本発明においては、前記ａ）〜ｄ）の多型により、翻訳産物の発現に影響を及ぼすものである場合、かかる発現産物を指標として、高血圧症のリスクを評価することもできる。この場合、前記翻訳産物に対する抗体又は抗体断片を用いて、発現量、翻訳産物の構造変化等を評価すればよい。前記抗体は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ）編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｅｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、１９９２年〕に記載の方法により、前記多型に応じた翻訳産物を用いて、ウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。前記抗体は、前記翻訳産物に特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体断片が得られる。前記抗体の特異性は、例えば、前記多型に応じた翻訳産物を用い、オクタロニー法、ＥＬＩＳＡ等により評価されうる。例えば、前記オクタロニー法の場合、前記多型に応じた翻訳産物毎に適切な沈降線の形成を示すことを指標として評価されうる。したがって、前記ミスセンス変異に関する多型の場合、アミノ酸の変化に応じて、抗体を作製すればよく、かかる抗体を用いることにより、ミスセンス変異を検出し、高血圧症のリスクを評価することもできる。
【００３６】
また、本発明においては、前記ａ）〜ｄ）の多型により、オルタナティブスプライシング等を介して転写産物の生成に影響を及ぼすものである場合、かかる転写産物を指標として、高血圧症のリスクを評価することもできる。
【００３７】
本発明は、他の側面では、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有した、本発明の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬（態様１）；前記プライマー対の少なくとも１種を含有した、本発明の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬（態様２）に関する。
【００３８】
本発明の高血圧症のリスクの評価用試薬によれば、前記核酸又はプライマー対を含有しているため、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に評価することができるという優れた効果を発揮する。
【００３９】
なお、本発明の評価用試薬には、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸と、前記プライマー対の少なくとも１種とを含有した、本発明の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬も含まれる。
【００４０】
本発明の評価用試薬は、適宜、検出用試薬、対照試料等を含有していてもよい。
【００４１】
前記態様１の評価用試薬は、前記ＤＮＡアレイとして、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有していてもよい。かかる態様の評価用試薬によれば、ハイスループット解析が可能になる。
【００４２】
態様２の評価用試薬においては、例えば、用いられる指標、該指標を評価するための手法に応じて、適切なプライマー対を選択できる。
【００４３】
また、態様２の評価用試薬は、ＤＮＡの可視化用の電気泳動用ゲル等を適宜含有していてもよい。
【００４４】
本発明は、別の側面では、生検試料に含まれる核酸について、前記ａ）〜ｄ）からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法に関する。
【００４５】
本発明の選別方法は、本発明の評価方法と同様の手順で行なうことができる。したがって、本発明の選別方法によれば、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することができる。
【００４６】
かかる選別方法によれば、医師による疾患の診断を必要とする現場の他、分析、研究等の分野において、多数の生検試料のなかから、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することができる。
【００４７】
本発明の選別方法により得られた「高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料であること」を示す情報は、例えば、電磁的方法〔電気通信回線（単方向、相方向を含む）、電子媒体、書類等を介して、かかる情報を必要とする者、例えば、被検対象の個体、医師等に提供されうる。
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
吹田市在住の市民から、性及び年齢により階層的に選ばれた「吹田研究」の参加者のうち、国立循環器病センター 集団検診部に来診し、遺伝子解析に同意した１８１８人を対象者とした。
【００５０】
各対象者を、座位にて、少なくとも１０分間安静にさせた。その後、水銀血圧計を用いて、各対象者の最高血圧〔収縮期血圧（ＳＢＰ）〕及び最低血圧〔拡張期血圧（ＤＢＰ）〕を、２回測定した。なお、各測定の間には、３分間の間隔を設けた。
【００５１】
また、絶食から１２時間後の対象者の血液試料を、ＥＤＴＡを含む試験管内に回収した。自動分析装置（東芝株式会社製、商品名：ＴＢＡ−８０）を用いて、米国疾病予防管理センターの脂質標準化プログラムに従って総コレステロール値及びＨＤＬコレステロール値を測定した。
【００５２】
かかる測定結果に基づき、対象者を、喫煙者；飲酒者；高血圧症群〔ＳＢＰが１４０ｍｍＨｇ以上であり、かつＤＢＰが９０ｍｍＨｇ以上である状態又は現在、降圧剤を用いている状態の対象者〕；高コレステロール血症群〔総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ以上である状態又は現在、抗高脂血症薬を用いている状態の対象者〕；糖尿病群〔空腹時血漿血糖が１２６ｍｇ／ｄＬ以上若しくは非空腹時血糖が２００ｍｇ／ｄＬ以上である状態、ＨｂＡ１Ｃが６．５％以上又は現在、抗糖尿病薬を用いている状態〕に分類した。肥満度指数（ＢＭＩ）は、体重（ｋｇ）／身長（ｍ）2として算出した。
【００５３】
１８１８人の対象者の特徴を、表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
これらの対象者から採血した血液を、商品名：ＮＡ−３０００核酸分離システム（倉敷紡績株式会社）に供して、ゲノムＤＮＡを抽出した。ついで、高血圧に関連する候補遺伝子を選抜し、ダイレクトシークエンス法により、塩基配列を決定し、多型を評価した。
【００５６】
また、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法により、数十種類の遺伝子における多型のタイピングを行なった。
【００５７】
用いたプライマーの一例を、下記表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
商品名：Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（Ａｎｎ ＡｒｂｏｒのＧｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いることによって多型を評価した。遺伝子型を特定するための候補を、マイナーアレル頻度が５％よりも大きいＳＮＰとした。ＳＮＰが、連鎖不平衡の状態（決定係数が０．５より大きい）の場合に、代表的なＳＮＰの遺伝子型を特定した。ミスセンス変異を起こすＳＮＰ（以下、ミスセンスＳＮＰという）は、直接高血圧の影響している場合があるため、マイナーアレル頻度が５％未満のミスセンスＳＮＰについても遺伝子型を特定した。
【００６０】
共分散分析を用いてグループ間の平均値を比較し、全体の有意性が実証されれば、一般線形モデルを利用してグループ間の差を評価した。χ2検定によって頻度を比較した。
【００６１】
男女別の年齢、ＢＭＩ、現在の病気（高脂血症及び糖尿病）、ライフスタイル（喫煙及び飲酒）及び降圧剤の使用を含むリスクファクターにおける潜在的な交絡因子を考慮したロジスティック回帰分析によって、遺伝子型と血圧との関連解析を行なった。なお、多変量のリスクファクターについて、９５％の信頼区間で調整オッズ比が与えられた。商品名：ＳＡＳ統計学ソフトウェア（ｒｅｌｅａｓｅ ８．２、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ製）を用いてすべての分析を行なった。また、商品名：ＳＮＰＡｌｙｚｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１（ＤＹＮＡＣＯＭ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）を用いて、連鎖不平衡を計算した。
【００６２】
解析結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
その結果、ＷＮＫ４遺伝子、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子及びＰＴＫ２Ｂ遺伝子にＳＮＰが見出された。
【００６５】
ＷＮＫ４遺伝子には、９個のミスセンス変異が存在していた。これらの中で、マイナーアレル頻度が５％を超えるミスセンス変異は、存在していなかった。その結果、ＷＮＫ４遺伝子の１４７１７位におけるＳＮＰ（配列番号：１の塩基番号：５０１）、すなわち、Ｃ１４７１７ＴのＳＮＰは、男性の高血圧症と有意な関連があった（χ2＝７．５３、ｐ＝０．０２３）。また、年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、降圧剤の使用、喫煙及び飲酒について補正した場合、ＣＴ＋ＴＴ遺伝子型の男性におけるＳＢＰ、ＣＣ遺伝子型の男性のＳＢＰよりも、３．１ｍｍＨｇ高かった（ｐ＝０．０４２）。
【００６６】
年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、喫煙及び飲酒について補正した多変量ロジスティック回帰分析の結果、男性において、ＷＮＫ遺伝子のＣ１４７１７ＴのＳＮＰでは、「ＣＣの遺伝子型における高血圧症」に対する「ＣＴ＋ＴＴ遺伝子型における高血圧症」のオッズ比は、１．６２であった（ｐ＝０．０１０、９５％の信頼区間、１．１２〜２．３３）。
【００６７】
また、ＳＢＰ １２０ｍｍＨｇ以下であり、かつＤＢＰ ８０ｍｍＨｇ以下である状態又は降圧剤を用いていない状態の対象者を、対照群とし、収縮期血圧１６０ｍｍＨｇ以上であり、かつ拡張期血圧１００ｍｍＨｇ以上である状態又は現在、降圧剤を用いている状態の対象者を、高血圧症群とし、年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、喫煙及び飲酒について補正した結果、ＷＮＫ４遺伝子のＣ１４７１７Ｔにおける多型は、男性の高血圧症と有意な関連があることがわかった（ＣＣ対ＣＴ＋ＴＴ、ｐ＝０．０４５、オッズ比＝１．９１、９５％の信頼区間：１．０２〜３．５８）。
【００６８】
さらに、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子には、−２５４位におけるＳＮＰ（−２５４Ｇ＞Ａ；配列番号：２の塩基番号：５０１）及び−５１２位におけるＳＮＰ（−５１２Ａ＞Ｇ；配列番号：３の塩基番号：７５９）があった。前記−２５４Ｇ＞４及び−５１２Ａ＞Ｇは、連鎖不平衡であり、女性において、オッズ比１．４２で高血圧症と相関した。−２５４Ｄ＞Ａの場合、ＧＧ型の女性は、ＧＡ＋ＡＡ型の女性に比べて、ＳＢＰの平均値が、２．３５ｍｍＨｇ高かった。また、−５１２Ａ＞Ｇの場合、ＡＡ型の女性は、ＡＧ＋ＧＧ型の女性に比べて、ＳＢＰの平均値が、２．２９ｍｍＨｇ高かった。
【００６９】
また、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子の場合、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０２３６６６．１６（ＪＳＮＰ ＩＤ：ＩＭＳ−ＪＳＴ０１３５８６）；配列番号：４の塩基番号：５０１）のシトシン残基が、アデニン残基に置換していることがが、見出されており、男性において、オッズ比１．３９で、高血圧症と相関した。前記ＳＮＰの場合、ＣＣ型の男性は、ＣＡ＋ＡＡ型の男性に比べて、ＳＢＰが高かった。
【００７０】
以上のように、ＷＮＫ４遺伝子、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子及びＰＴＫ２Ｂ遺伝子それぞれにおける遺伝子多型により、高血圧症を診断できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明により、高血圧症及び関連する循環器疾患の診断を行なうことができ、しいては、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症予防や治療につなげることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号：１において、５０１位のｎは、ＳＮＰの位置である。
【００７３】
配列番号：２において、５０１位のｎは、ＳＮＰの位置である。
【００７４】
配列番号：３において、７５９位のｎは、ＳＮＰの位置である。
【００７５】
配列番号：４において、５０１位のｎは、ＳＮＰの位置を示す。
【００７６】
配列番号：5は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００７７】
配列番号：６は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００７８】
配列番号：７は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００７９】
配列番号：８は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８０】
配列番号：９は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８１】
配列番号：１０は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８２】
配列番号：１１は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８３】
配列番号：１２は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８４】
配列番号：１３は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８５】
配列番号：１４は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８６】
配列番号：１５は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００８７】
配列番号：１６は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００８８】
配列番号：１７は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００８９】
配列番号：１８は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９０】
配列番号：１９は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９１】
配列番号：２０は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９２】
配列番号：２１は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９３】
配列番号：２２は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９４】
配列番号：２３は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９５】
配列番号：２４は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧症のリスクの評価手段に関する。さらに詳しくは、本発明は、高血圧症のリスクの評価方法、高血圧症のリスクの評価用試薬及び高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は、血圧が正常域を超えている状態であり、動脈硬化を引き起こす。前記高血圧症のうち、原因疾患が明らかなものを二次性高血圧症といい、明らかでないものを本態性高血圧という。
【０００３】
一方、サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターの変異体は、低血圧性のナトリウムの消耗、続発性アルドステロン症、低カリウム血症、アルカローシス、低マグネシウム血症、低カルシウム尿症等を特徴とするギテルマン症候群（Ｇｉｔｅｌｍａｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と関連することが知られている〔例えば、非特許文献１〜３〕。前記ギテルマン症候群は、常染色体性劣性遺伝病として知られており、サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターにおける変異は、遠位尿細管内において、塩を再吸収するという該サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターの能力を低下させる可能性がある。
【０００４】
また、前記サイアザイド感受性Ｎａ-Ｃｌコトランスポーターの機能は、ＷＮＫの機能と密接に関係し、サイアザイド感受性の食塩の取込みを減少させる役割を果たしていることが知られている（非特許文献４及び５）。前記ＷＮＫは、ＴＳＣの機能を調節し、血圧の異常に関連する可能性が示唆されていた。
【０００５】
しかしながら、ＷＮＫ４遺伝子の多型は、高血圧とは関係しないことが報告されている（非特許文献６）。
【非特許文献１】マストロヤンニ(Mastroianni N.)ら、Am. J. Hum. Genet., 59, 1019-1026, 1996
【非特許文献２】サイモン(Simon DB.)ら、Nat. Genet., 12, 24-30, 1996
【非特許文献３】タケウチ(Takeuchi K.)ら、J. Clin. Endcrinol. Metab., 81, 4496-4499, 1996
【非特許文献４】チョート(Choate KA.)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 663-668, 2003
【非特許文献５】ウィルソン(Wilson FH.)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 680-684, 2003
【非特許文献６】ベンジャフィールド(Benjafield AV)ら、Clin Genet., 64, 433-438, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１つの側面では、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に判定することを可能にする、高血圧症のリスクの評価方法を提供することにある。また、本発明は、他の側面では、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に評価することを可能にする、高血圧症のリスクの評価用試薬を提供することにある。さらに、本発明は、別の側面では、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することを可能にする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 核酸試料について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価することを特徴とする、高血圧症のリスクの評価方法、
〔２〕 （１）核酸試料から、下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得るステップ、並びに
（２）（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、ａ）〜ｄ）の多型を検出するステップ、
を含む、前記〔１〕記載の評価方法、
〔３〕 動態が、電気泳動における移動度、質量又はＴｍ値を介して評価される、前記〔１〕又は〔２〕記載の評価方法、
〔４〕 下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有してなる、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬、
〔５〕 配列番号：５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対及び配列番号：１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対からなる群より選ばれた少なくとも１種のプライマー対を含有してなる、前記〔４〕記載の評価用試薬、
〔６〕 下記オリゴヌクレオチド群Ａ）〜Ｄ）：
Ａ）配列番号：５に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：６に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１５に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１６に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｂ）配列番号：７に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１７に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１８に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｃ）配列番号：９に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１０に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１９に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２０に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；及び
Ｄ）配列番号：１１に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１２に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２１に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２２に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群
からなる群より選ばれた少なくとも１種のオリゴヌクレオチド群を含有してなる、前記〔４〕記載の評価用試薬、並びに
〔７〕 生検試料に含まれる核酸について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の高血圧症のリスクの評価方法によれば、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に判定することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の評価方法により、高血圧症を迅速に診断し、しいては、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症予防につなげることができるという優れた効果を奏する。本発明の高血圧症のリスクの評価用試薬によれば、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に評価することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の高血圧症の評価用試薬によれば、高血圧症を迅速に診断し、しいては、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症予防につなげることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法によれば、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、１つの側面では、核酸試料について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価することを特徴とする、高血圧症のリスクの評価方法に関する。
【００１０】
本発明の評価方法によれば、前記ａ）〜ｄ）からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の存在を指標とするため、血圧に及ぼす影響を評価することができ、簡便に、迅速に高血圧症のリスクを判定することができるという優れた効果を発揮する。
【００１１】
本明細書において、「高血圧症」とは、収縮期血圧：１４０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧：９０ｍｍＨｇ以上、又は降圧剤服用の状態（ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸については、収縮期血圧：１６０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧：９５ｍｍＨｇ以上、又は降圧剤服用の状態）をいう。また、「正常状態」とは、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ未満であり拡張期血圧９０ｍｍＨｇ未満であり、かつ降圧剤服用していない状態をいう。
【００１２】
前記ＷＮＫ４〔ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ４〕をコードする核酸は、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０１０７５５．１３に示される塩基配列を有する。前記ＷＮＫ４は、チョート(Choate KA.)ら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 663-668, 2003〕において、高血圧症との関連性が否定されていたにもかかわらず、前記ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型が、高血圧症に関連することが、本発明者らにより見出されたものである。本発明の評価方法においては、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０１０７５５．１３に示される塩基配列の塩基番号：１４７１７（配列番号：１の塩基番号：５０１）のシトシン残基が、チミン残基に置換していることが、高血圧症のリスクを有することの１つの指標となる。
【００１３】
前記ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸は、脂肪酸や分岐鎖アミノ酸の代謝に関与するミトコンドリアの酵素である短鎖／分岐鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ〔ｓｈｏｒｔ／ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ〕をコードする核酸であり、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０３００５９．１２に示される塩基配列を有する。本発明の評価方法においては、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０３００５９．１２に示される塩基配列の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）のグアニン残基が、アデニン残基に置換していること、該ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０３００５９．１２に示される塩基配列の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）のアデニン残基が、グアニン残基に置換していることが、高血圧症のリスクを有することの１つの指標となる。
【００１４】
前記ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸は、細胞内シグナル伝達系に関与し、細胞増殖と関連するプロテインチロシンキナーゼ２〔ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２／ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ２／ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２〕をコードする核酸であり、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０２３６６６．１６に示される塩基配列を有する。本発明の評価方法においては、ＪＳＮＰ ＩＤ：ＩＭＳ−ＪＳＴ０１３５８６（配列番号：４の塩基番号：５０１）のシトシン残基が、アデニン残基に置換していることが、高血圧症のリスクを有することの１つの指標となる。
【００１５】
本発明の評価方法としては、具体的には、下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得るステップ、並びに
（２）（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、前記ａ）〜ｄ）の多型を検出するステップ、
を含む方法が挙げられる。本発明には、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸からなり、前記ａ）〜ｄ）の多型を検出するためのプローブも含まれる。
【００１６】
前記ステップ（１）において、被検試料である核酸試料から、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得る。
【００１７】
なお、後述のステップ（２）を、（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違に基づき行なう場合において、ハイブリダイゼーション技術又はＰＣＲに基づく評価手段を用いる場合等には、前記ステップ（１）を行なわなくてもよい場合がある。かかる態様も本発明に含まれる。
【００１８】
前記核酸試料は、被検対象の個体由来の生検試料〔例えば、皮膚、血液、毛髪、口腔粘膜、各種組織、細胞等〕、落屑等から慣用の核酸抽出法により得られうる。
【００１９】
前記ステップ（１）において、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸は、例えば、慣用の核酸増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ等）等を行なうことにより得られうる。かかる核酸増幅に用いられうるプライマー対としては、Ｔｍ値、二次構造の形成、公知配列等を考慮して、デザインされたオリゴヌクレオチドが用いられうる。前記プライマー対は、前記指標遺伝子の塩基配列と公知データベースに登録された配列とを参照して、慣用のプライマーデザイン用ソフトウェア等によりデザインされうる。前記プライマー対は、適宜、検出に適した標識物質（蛍光物質、放射性物質等）により標識されうる。プライマーの鎖長は、特に限定されないが、例えば、好ましくは、連続した少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、１７〜３０ヌクレオチドであることが望ましい。前記プライマー対としては、例えば、ａ’）の核酸について、配列番号：６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、ｂ’）の核酸について、配列番号：８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、ｃ’）の核酸について、配列番号：１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、ｄ’）の核酸について、配列番号：１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対も本発明に含まれる。
【００２０】
ついで、（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、前記ａ）〜ｄ）の多型を検出する〔ステップ（２）〕。
【００２１】
前記（Ｉ）の塩基配列は、マキサムギルバート法、ＰＣＲを用いたダイレクトシークエンシング等の慣用の配列決定法により決定されうる。
【００２２】
ここで、前記ステップ（１）で得られた核酸において、前記ａ）〜ｄ）の多型の位置に対応する位置において、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸とは異なる塩基が見出された場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００２３】
前記（ＩＩ）の動態は、例えば、電気泳動における移動度、質量、Ｔｍ値等を介して評価される。
【００２４】
電気泳動における移動度は、例えば、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析等により評価されうる。
【００２５】
具体的には、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析の場合、ポリアクリルアミドゲル上において、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を泳動し、移動度を測定し、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間で移動度が異なる場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００２６】
また、前記電気泳動における移動度は、ＰＣＲに基づく一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）によっても行なうことができる。この場合、前記ステップ（１）を行なわなくてもよい。前記ＰＣＲ−ＳＳＣＰで用いうるプライマー対としては、前記と同様のものが挙げられる。なお、この場合、かかるプライマーは、蛍光物質等の慣用の標識物質で、それぞれのプライマーの末端が標識されたものであってもよい。
【００２７】
前記質量は、例えば、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ）、四重極質量分析計等により測定されうる。ここで、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間で質量が異なる場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００２８】
前記Ｔｍ値は、ＤＮＡアレイを用いたハイブリダイゼーション、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法等により評価されうる。
【００２９】
前記ＤＮＡアレイを用いたハイブリダイゼーションの場合、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸を固定化した支持体〔例えば、ガラス（例えば、スライドグラス）、シリコンチップ等〕が用いられうる。前記ＤＮＡアレイを用いたハイブリダイゼーションの場合、前記ステップ（１）において、核酸試料は、該試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を適切な標識物質で標識すればよい。前記標識物質としては、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等が挙げられる。例えば、前記蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いた場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出されうる。前記ＤＮＡアレイは、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸に、支持体表面への固定化を容易にしうる修飾基を導入し、ついで、得られた修飾核酸を、慣用のＤＮＡアレイ作製装置を用いて、ＤＮＡアレイによるハイブリダーゼションを行ないうる範囲の固定化量、固定化密度で、整列、固定化することにより作製されうる。ＤＮＡアレイを用いて、多型を検出する場合、ハイブリダイゼーションにおける条件は、好ましくは、高ストリンジェンシーであることが望ましい。ここで、ＤＮＡアレイ上の前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸に、前記ステップ（１）で得られた核酸がハイブリダイズしない場合又は対照として前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸を用いたハイブリダイゼーションに基づく場合の蛍光強度と比較して、前記ステップ（１）で得られた核酸のハイブリダイゼーションに基づく蛍光強度が減少した場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。なお、本発明には、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた核酸が固定化されたＤＮＡアレイも含まれる。
【００３０】
前記変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法の場合、変性剤（例えば、尿素等）の濃度勾配により、Ｔｍ値の差が、電気泳動の移動度の違いとして検出される。したがって、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を泳動し、移動度を測定し、前記ステップ（１）で得られた核酸及び前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間で移動度が異なる場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００３１】
また、前記（ＩＩ）の動態は、ＴａｑＭａｎ法、インベーダー法、ＲＮａｓｅ Ａミスマッチ切断法等によっても評価されうる。
【００３２】
前記Ｔａｑｍａｎ法の場合、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸をプローブとして用いてもよい。ここで、前記プローブは、５’末端側をレポーターとなる蛍光物質で標識し、３’末端側をクエンチャーとなる物質で標識する。この場合、前記ステップ（１）を行なわなくてもよい。また、ＰＣＲの際には、核酸試料を鋳型とし、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて行なわれうる。ＴａｑＭａｎ法に用いられうるプライマー対及びプローブとしては後述の表１に示されるオリゴヌクレオチドが挙げられ、具体的には、例えば、配列番号：５に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：６に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１５に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１６に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：７に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１７に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１８に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：９に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１０に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１９に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２０に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：１１に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１２に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２１に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２２に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；配列番号：１３に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１４に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２３に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２４に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群等が挙げられる。
【００３３】
また、インベーダー法の場合、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に基づき設計されたインベーダープローブのレポーター蛍光が、多型により生じるミスマッチ部分に侵入することで、ｃｌｅａｖａｓｅが認識する構造が生成され、該ｃｌｅａｖａｓｅによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊離したレポーター蛍光を検出することにより行なわれうる。この場合、蛍光強度が、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を対照として用いた場合に比べ、増加した場合、多型が存在し、核酸試料の供給源の個体が、高血圧症のリスクを有することの指標として判断される。
【００３４】
なお、本明細書において、「ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸」とは、核酸試料中に含まれる核酸において、ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸の塩基配列の他、該塩基配列中、ａ）〜ｄ）の多型を有する核酸、該多型の位置以外の位置における高血圧症に無関係である変異を有する核酸をも含むことを意図する。
【００３５】
なお、本発明においては、前記ａ）〜ｄ）の多型により、翻訳産物の発現に影響を及ぼすものである場合、かかる発現産物を指標として、高血圧症のリスクを評価することもできる。この場合、前記翻訳産物に対する抗体又は抗体断片を用いて、発現量、翻訳産物の構造変化等を評価すればよい。前記抗体は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ）編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｅｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、１９９２年〕に記載の方法により、前記多型に応じた翻訳産物を用いて、ウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。前記抗体は、前記翻訳産物に特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体断片が得られる。前記抗体の特異性は、例えば、前記多型に応じた翻訳産物を用い、オクタロニー法、ＥＬＩＳＡ等により評価されうる。例えば、前記オクタロニー法の場合、前記多型に応じた翻訳産物毎に適切な沈降線の形成を示すことを指標として評価されうる。したがって、前記ミスセンス変異に関する多型の場合、アミノ酸の変化に応じて、抗体を作製すればよく、かかる抗体を用いることにより、ミスセンス変異を検出し、高血圧症のリスクを評価することもできる。
【００３６】
また、本発明においては、前記ａ）〜ｄ）の多型により、オルタナティブスプライシング等を介して転写産物の生成に影響を及ぼすものである場合、かかる転写産物を指標として、高血圧症のリスクを評価することもできる。
【００３７】
本発明は、他の側面では、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有した、本発明の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬（態様１）；前記プライマー対の少なくとも１種を含有した、本発明の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬（態様２）に関する。
【００３８】
本発明の高血圧症のリスクの評価用試薬によれば、前記核酸又はプライマー対を含有しているため、高血圧症のリスクを、簡便に、迅速に評価することができるという優れた効果を発揮する。
【００３９】
なお、本発明の評価用試薬には、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸と、前記プライマー対の少なくとも１種とを含有した、本発明の評価方法を行なうための、高血圧症のリスクの評価用試薬も含まれる。
【００４０】
本発明の評価用試薬は、適宜、検出用試薬、対照試料等を含有していてもよい。
【００４１】
前記態様１の評価用試薬は、前記ＤＮＡアレイとして、前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有していてもよい。かかる態様の評価用試薬によれば、ハイスループット解析が可能になる。
【００４２】
態様２の評価用試薬においては、例えば、用いられる指標、該指標を評価するための手法に応じて、適切なプライマー対を選択できる。
【００４３】
また、態様２の評価用試薬は、ＤＮＡの可視化用の電気泳動用ゲル等を適宜含有していてもよい。
【００４４】
本発明は、別の側面では、生検試料に含まれる核酸について、前記ａ）〜ｄ）からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法に関する。
【００４５】
本発明の選別方法は、本発明の評価方法と同様の手順で行なうことができる。したがって、本発明の選別方法によれば、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することができる。
【００４６】
かかる選別方法によれば、医師による疾患の診断を必要とする現場の他、分析、研究等の分野において、多数の生検試料のなかから、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料を、簡便に、迅速に選別することができる。
【００４７】
本発明の選別方法により得られた「高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料であること」を示す情報は、例えば、電磁的方法〔電気通信回線（単方向、相方向を含む）、電子媒体、書類等を介して、かかる情報を必要とする者、例えば、被検対象の個体、医師等に提供されうる。
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
吹田市在住の市民から、性及び年齢により階層的に選ばれた「吹田研究」の参加者のうち、国立循環器病センター 集団検診部に来診し、遺伝子解析に同意した１８１８人を対象者とした。
【００５０】
各対象者を、座位にて、少なくとも１０分間安静にさせた。その後、水銀血圧計を用いて、各対象者の最高血圧〔収縮期血圧（ＳＢＰ）〕及び最低血圧〔拡張期血圧（ＤＢＰ）〕を、２回測定した。なお、各測定の間には、３分間の間隔を設けた。
【００５１】
また、絶食から１２時間後の対象者の血液試料を、ＥＤＴＡを含む試験管内に回収した。自動分析装置（東芝株式会社製、商品名：ＴＢＡ−８０）を用いて、米国疾病予防管理センターの脂質標準化プログラムに従って総コレステロール値及びＨＤＬコレステロール値を測定した。
【００５２】
かかる測定結果に基づき、対象者を、喫煙者；飲酒者；高血圧症群〔ＳＢＰが１４０ｍｍＨｇ以上であり、かつＤＢＰが９０ｍｍＨｇ以上である状態又は現在、降圧剤を用いている状態の対象者〕；高コレステロール血症群〔総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ以上である状態又は現在、抗高脂血症薬を用いている状態の対象者〕；糖尿病群〔空腹時血漿血糖が１２６ｍｇ／ｄＬ以上若しくは非空腹時血糖が２００ｍｇ／ｄＬ以上である状態、ＨｂＡ１Ｃが６．５％以上又は現在、抗糖尿病薬を用いている状態〕に分類した。肥満度指数（ＢＭＩ）は、体重（ｋｇ）／身長（ｍ）2として算出した。
【００５３】
１８１８人の対象者の特徴を、表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
これらの対象者から採血した血液を、商品名：ＮＡ−３０００核酸分離システム（倉敷紡績株式会社）に供して、ゲノムＤＮＡを抽出した。ついで、高血圧に関連する候補遺伝子を選抜し、ダイレクトシークエンス法により、塩基配列を決定し、多型を評価した。
【００５６】
また、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法により、数十種類の遺伝子における多型のタイピングを行なった。
【００５７】
用いたプライマーの一例を、下記表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
商品名：Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（Ａｎｎ ＡｒｂｏｒのＧｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いることによって多型を評価した。遺伝子型を特定するための候補を、マイナーアレル頻度が５％よりも大きいＳＮＰとした。ＳＮＰが、連鎖不平衡の状態（決定係数が０．５より大きい）の場合に、代表的なＳＮＰの遺伝子型を特定した。ミスセンス変異を起こすＳＮＰ（以下、ミスセンスＳＮＰという）は、直接高血圧の影響している場合があるため、マイナーアレル頻度が５％未満のミスセンスＳＮＰについても遺伝子型を特定した。
【００６０】
共分散分析を用いてグループ間の平均値を比較し、全体の有意性が実証されれば、一般線形モデルを利用してグループ間の差を評価した。χ2検定によって頻度を比較した。
【００６１】
男女別の年齢、ＢＭＩ、現在の病気（高脂血症及び糖尿病）、ライフスタイル（喫煙及び飲酒）及び降圧剤の使用を含むリスクファクターにおける潜在的な交絡因子を考慮したロジスティック回帰分析によって、遺伝子型と血圧との関連解析を行なった。なお、多変量のリスクファクターについて、９５％の信頼区間で調整オッズ比が与えられた。商品名：ＳＡＳ統計学ソフトウェア（ｒｅｌｅａｓｅ ８．２、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ製）を用いてすべての分析を行なった。また、商品名：ＳＮＰＡｌｙｚｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１（ＤＹＮＡＣＯＭ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）を用いて、連鎖不平衡を計算した。
【００６２】
解析結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
その結果、ＷＮＫ４遺伝子、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子及びＰＴＫ２Ｂ遺伝子にＳＮＰが見出された。
【００６５】
ＷＮＫ４遺伝子には、９個のミスセンス変異が存在していた。これらの中で、マイナーアレル頻度が５％を超えるミスセンス変異は、存在していなかった。その結果、ＷＮＫ４遺伝子の１４７１７位におけるＳＮＰ（配列番号：１の塩基番号：５０１）、すなわち、Ｃ１４７１７ＴのＳＮＰは、男性の高血圧症と有意な関連があった（χ2＝７．５３、ｐ＝０．０２３）。また、年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、降圧剤の使用、喫煙及び飲酒について補正した場合、ＣＴ＋ＴＴ遺伝子型の男性におけるＳＢＰ、ＣＣ遺伝子型の男性のＳＢＰよりも、３．１ｍｍＨｇ高かった（ｐ＝０．０４２）。
【００６６】
年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、喫煙及び飲酒について補正した多変量ロジスティック回帰分析の結果、男性において、ＷＮＫ遺伝子のＣ１４７１７ＴのＳＮＰでは、「ＣＣの遺伝子型における高血圧症」に対する「ＣＴ＋ＴＴ遺伝子型における高血圧症」のオッズ比は、１．６２であった（ｐ＝０．０１０、９５％の信頼区間、１．１２〜２．３３）。
【００６７】
また、ＳＢＰ １２０ｍｍＨｇ以下であり、かつＤＢＰ ８０ｍｍＨｇ以下である状態又は降圧剤を用いていない状態の対象者を、対照群とし、収縮期血圧１６０ｍｍＨｇ以上であり、かつ拡張期血圧１００ｍｍＨｇ以上である状態又は現在、降圧剤を用いている状態の対象者を、高血圧症群とし、年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、喫煙及び飲酒について補正した結果、ＷＮＫ４遺伝子のＣ１４７１７Ｔにおける多型は、男性の高血圧症と有意な関連があることがわかった（ＣＣ対ＣＴ＋ＴＴ、ｐ＝０．０４５、オッズ比＝１．９１、９５％の信頼区間：１．０２〜３．５８）。
【００６８】
さらに、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子には、−２５４位におけるＳＮＰ（−２５４Ｇ＞Ａ；配列番号：２の塩基番号：５０１）及び−５１２位におけるＳＮＰ（−５１２Ａ＞Ｇ；配列番号：３の塩基番号：７５９）があった。前記−２５４Ｇ＞４及び−５１２Ａ＞Ｇは、連鎖不平衡であり、女性において、オッズ比１．４２で高血圧症と相関した。−２５４Ｄ＞Ａの場合、ＧＧ型の女性は、ＧＡ＋ＡＡ型の女性に比べて、ＳＢＰの平均値が、２．３５ｍｍＨｇ高かった。また、−５１２Ａ＞Ｇの場合、ＡＡ型の女性は、ＡＧ＋ＧＧ型の女性に比べて、ＳＢＰの平均値が、２．２９ｍｍＨｇ高かった。
【００６９】
また、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子の場合、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＴ＿０２３６６６．１６（ＪＳＮＰ ＩＤ：ＩＭＳ−ＪＳＴ０１３５８６）；配列番号：４の塩基番号：５０１）のシトシン残基が、アデニン残基に置換していることがが、見出されており、男性において、オッズ比１．３９で、高血圧症と相関した。前記ＳＮＰの場合、ＣＣ型の男性は、ＣＡ＋ＡＡ型の男性に比べて、ＳＢＰが高かった。
【００７０】
以上のように、ＷＮＫ４遺伝子、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子及びＰＴＫ２Ｂ遺伝子それぞれにおける遺伝子多型により、高血圧症を診断できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明により、高血圧症及び関連する循環器疾患の診断を行なうことができ、しいては、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症予防や治療につなげることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号：１において、５０１位のｎは、ＳＮＰの位置である。
【００７３】
配列番号：２において、５０１位のｎは、ＳＮＰの位置である。
【００７４】
配列番号：３において、７５９位のｎは、ＳＮＰの位置である。
【００７５】
配列番号：４において、５０１位のｎは、ＳＮＰの位置を示す。
【００７６】
配列番号：5は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００７７】
配列番号：６は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００７８】
配列番号：７は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００７９】
配列番号：８は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８０】
配列番号：９は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８１】
配列番号：１０は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８２】
配列番号：１１は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８３】
配列番号：１２は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８４】
配列番号：１３は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８５】
配列番号：１４は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プライマーの配列である。
【００８６】
配列番号：１５は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００８７】
配列番号：１６は、ＷＮＫ４遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００８８】
配列番号：１７は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００８９】
配列番号：１８は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９０】
配列番号：１９は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９１】
配列番号：２０は、ＡＣＡＤＳＢ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９２】
配列番号：２１は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９３】
配列番号：２２は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９４】
配列番号：２３は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【００９５】
配列番号：２４は、ＰＴＫ２Ｂ遺伝子におけるＳＮＰの検出用プローブの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価することを特徴とする、高血圧症のリスクの評価方法。
【請求項２】
（１）核酸試料から、下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得るステップ、並びに
（２）（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、ａ）〜ｄ）の多型を検出するステップ、
を含む、請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
動態が、電気泳動における移動度、質量又はＴｍ値を介して評価される、請求項１又は２記載の評価方法。
【請求項４】
下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有してなる、高血圧症のリスクの評価用試薬。
【請求項５】
配列番号：５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対及び配列番号：１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対からなる群より選ばれた少なくとも１種のプライマー対を含有してなる、請求項４記載の評価用試薬。
【請求項６】
下記オリゴヌクレオチド群Ａ）〜Ｄ）：
Ａ）配列番号：５に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：６に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１５に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１６に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｂ）配列番号：７に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１７に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１８に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｃ）配列番号：９に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１０に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１９に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２０に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；及び
Ｄ）配列番号：１１に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１２に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２１に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２２に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群
からなる群より選ばれた少なくとも１種のオリゴヌクレオチド群を含有してなる、請求項４記載の評価用試薬。
【請求項７】
生検試料に含まれる核酸について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法。
【請求項１】
核酸試料について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を検出し、該多型が存在する場合、高血圧症のリスクがあることの指標として評価することを特徴とする、高血圧症のリスクの評価方法。
【請求項２】
（１）核酸試料から、下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸に対応する核酸を得るステップ、並びに
（２）（Ｉ）前記ステップ（１）で得られた核酸の塩基配列、及び／又は
（ＩＩ）前記ステップ（１）で得られた核酸と前記ａ’）〜ｄ’）からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸との間の動態の相違、
に基づき、ａ）〜ｄ）の多型を検出するステップ、
を含む、請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
動態が、電気泳動における移動度、質量又はＴｍ値を介して評価される、請求項１又は２記載の評価方法。
【請求項４】
下記ａ’）〜ｄ’）：
ａ’） 配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｂ’） 配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
ｃ’） 配列番号：３に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：７５９を含む連続した１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、及び
ｄ’） 配列番号：４に示される塩基配列を含有した核酸若しくはそのアンチセンス核酸又は該塩基配列中における塩基番号：５０１を含む１０〜１００ヌクレオチド長の断片の核酸若しくはそのアンチセンス核酸、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の核酸を含有してなる、高血圧症のリスクの評価用試薬。
【請求項５】
配列番号：５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、配列番号：９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対及び配列番号：１１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号：１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対からなる群より選ばれた少なくとも１種のプライマー対を含有してなる、請求項４記載の評価用試薬。
【請求項６】
下記オリゴヌクレオチド群Ａ）〜Ｄ）：
Ａ）配列番号：５に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：６に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１５に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１６に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｂ）配列番号：７に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１７に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：１８に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；
Ｃ）配列番号：９に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１０に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：１９に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２０に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群；及び
Ｄ）配列番号：１１に示される塩基配列を含有したプライマーと配列番号：１２に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対と、配列番号：２１に示される塩基配列を含有したプローブと、配列番号：２２に示される塩基配列を含有したプローブとからなるオリゴヌクレオチド群
からなる群より選ばれた少なくとも１種のオリゴヌクレオチド群を含有してなる、請求項４記載の評価用試薬。
【請求項７】
生検試料に含まれる核酸について、
ａ） ＷＮＫ４をコードする核酸の１４７１７位（配列番号：１の塩基番号：５０１）における多型、
ｂ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−２５４位（配列番号：２の塩基番号：５０１）における多型、
ｃ） ＡＣＡＤＳＢをコードする核酸の−５１２位（配列番号：３の塩基番号：７５９）、及び
ｄ） ＰＴＫ２Ｂをコードする核酸の２４２９９位（配列番号：４の塩基番号：５０１）における多型、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の多型の有無を評価し、該多型が検出された試料を選別することを特徴とする、高血圧症のリスクのある個体由来の生検試料の選別方法。
【公開番号】特開２００６−１０１７８９（Ｐ２００６−１０１７８９Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９４３１８（Ｐ２００４−２９４３１８）
【出願日】平成１６年１０月６日（２００４．１０．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月６日（２００４．１０．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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