魚類の免疫力増強方法
【課題】本発明は、魚類の免疫力を増強させる方法を提供することを課題とする。
【解決手段】閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理することを特徴とする魚類の免疫力を増強させる方法により、上記の課題を解決する。
【解決手段】閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理することを特徴とする魚類の免疫力を増強させる方法により、上記の課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養殖魚及び観賞魚を含む魚類の免疫力を増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
養殖魚や観賞魚のような人工的に飼育される魚類は、閉鎖水系に個体が存在し、１尾が病原菌に感染すると、閉鎖水系内の魚類の全体が感染する恐れがあるので、感染症による影響を受けやすい。
そこで、魚類の感染症の予防及び治療を目的として、ワクチンを使用することが知られている。ワクチンとしては、例えば、イリドウイルス感染症予防用のワクチン（特開２００７−１９７４５４号；特許文献１）、ウイルス性出血性敗血症に対するＤＮＡワクチン（特開２００５−１１２７２６号；特許文献２）、ヒラメのラブドウイルス感染防止用のＤＮＡワクチン（特開２００３−１５５２５４号；特許文献３）、錦鯉の新穴あき病の予防用ワクチン（特開２００２−２６５３８４号；特許文献４）などが知られている。
【０００３】
また、ワクチンを使用する際に、アジュバントを用いて、抗原に対する抗体産生能力を高める試みも行われている（特開２００６−３１２５９５号；特許文献５）。
【０００４】
さらに、ワクチンを含有する高濃度溶存酸素水中で魚類に対して超音波処理を行うことにより、感染の防止効果を増強させる方法が知られている（特開２００７−２１５４７５号；特許文献６）。
【０００５】
一方、過酸化水素を含有する水浴で魚類を処理して、魚類の体表面や鰓に寄生する寄生虫の駆除を行うことも知られている（特公平７−５１０２８号公報、特許２５７５２４０号、特許第２８１７７５３号；特許文献７〜９）。
【特許文献１】特開２００７−１９７４５４号公報
【特許文献２】特開２００５−１１２７２６号公報
【特許文献３】特開２００３−１５５２５４号公報
【特許文献４】特開２００２−２６５３８４号公報
【特許文献５】特開２００６−３１２５９５号公報
【特許文献６】特開２００７−２１５４７５号公報
【特許文献７】特公平７−５１０２８号公報公報
【特許文献８】特許第２５７５２４０号公報
【特許文献９】特許第２８１７７５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、魚類の免疫力を増強する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理する、魚類の免疫力を増強する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、魚類の免疫力を増強できる。免疫力が向上することにより、種々の疾患に対する魚類の抵抗力を向上させることができ、魚類が罹患することによる種々の悪影響を回避できる。
また、免疫力が増強された魚類は、体内に侵入した抗原に対する抗体を産生する能力が高められ得るので、このような魚類にワクチンを接種することにより、抗体の産生が増進され、魚類の免疫力がより増強され、ワクチン接種による細菌などの感染防止効果をより向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ニシキゴイの頭腎からの白血球の殺菌活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】ニシキゴイの血清リゾチーム活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】ニシキゴイの後腎のリゾチーム活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】ニシキゴイの白血球から産生される抗体産生細胞の数の測定結果を示すグラフである。
【図５】ニシキゴイの頭腎からの白血球の殺菌活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理することを含む、魚類の免疫力を増強させる方法である。
本明細書において、魚類の「免疫力を増強させる」とは、多くの疾患に対する非特異的生体防御能、及び／又は特定の疾患に対する特異的生体防御能を高めることを意味する。免疫力の増強は、具体的には、魚類の白血球（特に好中球）による殺菌活性を向上させること、補体の活性を向上させること、血液及び臓器でのリゾチーム活性を向上させること、魚類の体内で異種抗原と認識される種々の物質に対する抗体の産生を増強させることなどを含む。よって、免疫力の増強は、例えば、以下の実施例に示すように、白血球の殺菌活性、血清中の溶血補体活性、リゾチーム活性、血清中の抗体産生細胞数などを測定することにより確認できる。
魚類の生体防御については、「魚病学概論」室賀清邦及び江草周三編、恒星社厚生閣出版、1996年、第9〜20頁に詳述されている。
【００１１】
上記の過酸化水素発生化合物は、過酸化水素を発生可能な化合物であり、過酸化水素；過ホウ酸、過炭酸、ペルオキシ硫酸などの無機過酸；過酢酸のような有機過酸；及びこれらの塩類が挙げられる。該塩類としては、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウムなどが挙げられる。
上記の過酸化水素としては、通常、工業用として市販されている３０〜６０％程度の濃度（例えば３５％）の過酸化水素水溶液を用いることができる。
【００１２】
上記の過酸化水素発生化合物は、該化合物により発生する閉鎖水系内の過酸化水素の濃度が、好ましくは１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜１５００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１０〜６００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは１０〜３００ｍｇ／Ｌとなるように閉鎖水系内に存在させ得る。この範囲の過酸化水素の濃度であれば、魚類の生存に悪影響を与えることなく、免疫力を増強できる。
【００１３】
上記の過酸化水素発生化合物を、過酸化水素の閉鎖水系内での濃度が上記の好ましい範囲の濃度になるように、魚類を収容している閉鎖水系内に加えればよい。
上記の添加は、高い濃度の過酸化水素が魚類に直接降りかかって魚体に悪影響を与えることがないように、過酸化水素発生化合物を海水又は淡水で適切な濃度に希釈してから行うことが好ましい。また、過酸化水素発生化合物を閉鎖水系内に添加した後に、過酸化水素が閉鎖水系内に適当に分散するように、撹拌を行ってもよいし、過酸化水素発生化合物を閉鎖水系の上方から散布することにより添加してもよい。
【００１４】
本発明の方法において、魚類を過酸化水素発生化合物で処理する期間は、魚の種類にもよるが、１〜６０分が好ましく、より好ましくは１〜３０分である。この時間であれば、魚類の生存に悪影響を与えることなく、免疫力を増強できる。
【００１５】
魚類の過酸化水素発生化合物での処理は、魚類を通常飼育する温度で行うことができ、魚の種類にもよるが、１０〜２５℃の範囲で行うことが好ましい。
【００１６】
本発明の方法により処理できる魚類は、海水魚及び淡水魚のいずれであってもよく、好ましくは養殖魚及び観賞魚であり、より好ましくは海水で生息する養殖魚である。海水で生息する養殖魚としては、特に限定されないが、ハマチ、ブリ、カンパチ、シマアジ、タイ、トラフグ、ヒラメ、サケなどが挙げられる。本発明の方法は、淡水で生息する養殖魚、例えばアユ、フナなど、及び観賞魚、例えば金魚、コイ、メダカなどにも適用可能である。
【００１７】
上記の魚類を収容している閉鎖水系とは、隔壁をもって閉鎖された魚類の遊泳区画である。上記の隔壁としては、例えばビニールシート、ゴム引きシート、水槽などが挙げられる。閉鎖水系内に収容される水は、魚類の種類に応じて、海水又は淡水であり得る。
【００１８】
本発明の方法は、さらに、魚類と過酸化水素との接触を停止する工程を含むことができる。このような工程を含むことにより、過酸化水素と魚類との長時間の接触を回避して、魚類に対する悪影響が生じることを防ぐことができる。
魚類と過酸化水素との接触を停止する方法としては、過酸化水素類で処理した魚類を、過酸化水素を含む閉鎖水系から別の閉鎖水系に移動させる方法、過酸化水素を含む閉鎖水系内に、過酸化水素を中和又は分解できる物質を添加することにより過酸化水素を除去する方法などが挙げられる。
【００１９】
魚類を閉鎖水系内から外に移動させる方法は、魚類に負担をかけない方法であれば特に限定されず、過酸化水素を添加した閉鎖水系に別の生簀を隣接させ、閉鎖水系と該生簀との両方に設けた開口部を介して魚類を移動させる方法が挙げられる。
【００２０】
上記の過酸化水素を中和又は分解できる物質としては、工業的に過酸化水素を中和又は分解するために用いられている物質であって、生物に対する毒性が弱いものであれば特に限定されず、例えばチオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、水酸化ナトリウム、カタラーゼ、マンガン触媒、活性炭などが挙げられる。魚類に対する影響及び環境に対する影響の観点から、カタラーゼ、マンガン触媒、活性炭を用いることが好ましい。
カタラーゼは、過酸化水素の分解を触媒する酵素であり、ウシ、ブタなどの動物の肝臓、腎臓、赤血球などから得られるものが知られている。また、Aspegillus niger、Micrococcus lysodeikticusなどの微生物の培養液から得られるものを用いることもできる。カタラーゼは、精製品又は未精製品のいずれであってもよく、１０，０００〜１００，０００単位／ｍＬ（１単位は、３７℃にて１分間に１ｍＭのＨ2Ｏ2を分解できる酵素の量である）程度の量で閉鎖水系に添加することにより、過酸化水素を分解できる。
【００２１】
上記の過酸化水素を中和又は分解できる物質を閉鎖水系内に加える場合、該閉鎖水系内には魚類が存在していてもよいし、存在していなくてもよいが、魚類への負担を軽減する観点から、該物質を加える前に魚類を閉鎖水系内から外に移動させることが好ましい。
【００２２】
本発明の方法は、魚類にワクチンを接種する工程をさらに含むことができる。
魚類へのワクチンの接種は、当該技術において公知の方法で行うことができ、注射、経口投与又は浸漬により行うことが好ましい。
注射は、筋肉内又は腹腔内への注射により行うことができる。
経口投与は、魚類の飼料にワクチンを混合して投与する方法、及び製剤化したワクチン（例えばカプセル剤、錠剤など）を魚類に経口投与する方法などにより行うことができる。
浸漬は、魚類をワクチン液に適切な時間、通常、１〜３０分程度浸漬する方法、ベルトコンベア上を移動する魚類にワクチン液を振りかける方法などにより行うことができる。
【００２３】
上記のワクチンは、魚類用のワクチンであれば特に限定されず、病原体を不活性化した不活化ワクチン、病原体の病原性を低下させた弱毒化ワクチン、病原体の免疫原性部分に相当する成分ワクチン、病原体の産生する毒素を中和したトキソイドワクチン、遺伝子組み換えにより作製した遺伝子組み換えワクチン、免疫原性タンパク質をコードするＤＮＡであるＤＮＡワクチンなどのいずれであってもよい。
上記のワクチンとしては、ビブリオ病に対するワクチン、連鎖球菌症に対するワクチン、イリドウイルス感染症に対するワクチン、ウイルス性出血性敗血症に対するワクチン、ラブドウイルス感染症に対するワクチン、アエロモナス感染症に対するワクチン、α溶血性連鎖球菌症に対するワクチン、β溶血性連鎖球菌症に対するワクチン、類結節症に対するワクチン、エドワジエラ症に対するワクチンなどが挙げられる。
【００２４】
上記のワクチンは、抗原に対する免疫応答を修飾できるアジュバントを含み得る。アジュバントとしては、従来公知のものであれば特に限定されず、アルミナアジュバント、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントなどが挙げられる。
【００２５】
上記のワクチンの投与量は、ワクチンの種類、魚の種類などに応じて適宜選択できる。
【００２６】
本発明の方法において、魚類の過酸化水素類での処理工程は、ワクチン接種工程の前、同時又は後に行うことができる。
本発明の方法では、該処理工程により、魚類の免疫力が増強され得るので、ワクチンを接種することにより、ワクチンに対する抗体の産生が増進されて、ワクチン接種による感染症予防効果をより増強できる。ワクチンが上記のアジュバントを含む場合、接種されたワクチンは免疫原性を持続的に発揮できるので、ワクチン接種工程の後に魚類を過酸化水素類で処理して免疫力を増強させても、該ワクチンからの免疫原性物質に対する抗体の産生を増加させ得ると考えられる。
【００２７】
上記の処理工程をワクチン接種工程の前に行う場合、処理工程を行ってから３０分〜１０日後、より好ましくは１〜７日後にワクチン接種工程を行うことが好ましい。
【実施例】
【００２８】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
以下の実施例において用いた試薬は、次に記載するようにして調製した。
〔１０００unitsヘパリン溶液〕
蒸留水１０ｍｌに１３０units／ｍｇヘパリン（和光純薬工業（株）製）７６．９ｍｇを溶解させ、４℃で保存したものを１０００unitsヘパリン溶液とした。
〔リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）〕
蒸留水９００ｍｌにリン酸水素二ナトリウム１２水塩（和光純薬工業（株）製）３．０ｇ、リン酸二水素カリウム（関東化学（株）製）０．７ｇ及び塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）６．４ｇを溶解させて、メスフラスコで１０００ｍｌにメスアップした後、４℃で保存したものをＰＢＳとした。
【００２９】
〔１０％炭酸水素ナトリウム溶液〕
蒸留水２０ｍｌに炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）製）２ｇを溶解し、１２１℃にて１５分間滅菌し、４℃で保存したものを１０％炭酸水素ナトリウム溶液とした。
〔２Ｍ水酸化カリウム溶液〕
蒸留水１００ｍｌに水酸化カリウム（ナカライテスク（株））１１．２２ｇを溶解させたものを、２Ｍ水酸化カリウム溶液とした。
【００３０】
〔ＭＥＭ細胞培地〕
超純水３９６ｍｌにＭＥＭ培地２（ニッスイ）３．７６ｇを溶解し、１２１℃にて１５分間の滅菌を行なった。その後、１０％炭酸水素ナトリウム溶液でｐＨを７．２に調整し、４℃で保存したものをＭＥＭ細胞培地とした。
〔１０unitsヘパリン入りＭＥＭ細胞培地〕
ＭＥＭ細胞培地に、ヘパリンが１０unitsとなるように１０００unitsヘパリン溶液を加えたものを、１０unitsヘパリン入りＭＥＭ細胞培地とした。
【００３１】
〔ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液〕
ＮＢＴ（Sigma）８ｍｇに、ＭＥＭ２培地１６ｍｌ加えて溶解させ、４℃で保存したものをＮＢＴ溶液とした。
〔ザイモサンＮＢＴ混合溶液〕
ザイモサン（zymosan A（Sigma））３２ｍｇをＰＢＳに懸濁し、１００℃で３０分間煮沸した。その後ＰＢＳを用いて、室温で３回の遠心洗浄（２０００ｒｐｍで１０分間）を行ない、上澄みを取り除き、プール血清１６０μｌを加え２０℃でオプソニン化を３０分行なった。ＭＥＭ２培地を用いて同条件で２回の遠心洗浄を行ない、得られた沈殿にＮＢＴ溶液１６ｍｌを加えて、ザイモサンＮＢＴ混合溶液とした。
【００３２】
〔リン酸緩衝液ｐＨ７．０（ＰＢ）〕
リン酸水素二ナトリウム１２水塩１．７９gとリン酸二水素カリウム０．６８gをそれぞれ蒸留水５００ｍｌに溶解し、ｐＨ７．０に調整したリン酸緩衝液をＰＢとした。
〔ミクロコッカス菌液〕
Micrococcus lysodeikticus菌体（Sigma）を適度にＰＢで希釈した後、ＯＤ530での吸光度を０．５に調整したものを、ミクロコッカス菌液とした。
【００３３】
実施例１
供試魚として、養魚場から購入した平均体重３２．８ｇのニシキゴイ（Cyprinus carpio）を用いた。
６０リットルのガラス製水槽４基に、５０リットル中にチオ硫酸ナトリウム６粒を入れて脱塩素を行なった水道水を入れ、それぞれの水槽に２０尾ずつニシキゴイを入れて、２０℃で止水飼育した。浸漬中は無給餌で飼育した。
次に、過酸化水素発生化合物として、「マリンサワーＳＰ３０」（（株）片山化学工業研究所製）を用いて薬浴処理を実施した。７０リットルのタンク中にチオ硫酸ナトリウムを３粒入れ、水道水２０リットルを脱塩素して用いた。過酸化水素濃度が０（対照）、１６．５、１６５又は１６５０ｍｇ／リットルとなるように過酸化水素発生化合物を添加して、各試験区とした。上記のニシキゴイ２０尾を、各試験区に水温２０℃で２０分間浸漬させた後、元の飼育水に戻した。
【００３４】
＜血清試料の調製＞
ニシキゴイを過酸化水素で処理してから１、３及び５日後に、各水槽から無作為に５尾ずつニシキゴイを取り出し、尾静脈から血液を採取し、室温で１時間静置した。その後、静置した血液を４℃で遠心分離（２５００ｒｐｍ、１５分間）し、上清をマイクロチューブに移し、血清を得た。試験区毎にプール血清を１６０μｌとなるように調整し、氷上で保存した後、残った血清は使用時まで−８０℃で保存した。
【００３５】
＜頭腎白血球細胞浮遊液の調製＞
また、血清を採取したのと同じニシキゴイから頭腎を採取し、シャーレ上にＭＥＭ１０unitsヘパリン培地を２ｍｌ加えピンセットを用いて頭腎をチョッピングした。パスツールピペットを用い、ステンレスメッシュで頭腎を濾過し、得られた液を試験管に移した。ＭＥＭ１０unitsヘパリン培地１ｍｌで共洗いをしてから、得られた液を試験管に移し全量を３ｍｌとした。ＭＥＭ１０units培地を用いて、４℃で２回の遠心洗浄（１６００ｒｐｍで５分間）を行なった。得られた沈殿にＭＥＭ１０unitsヘパリン培地を２ｍｌ加え懸濁し、２０μｌトリパンブルーと等量混合した。トーマ血球計算盤を用いて白血球数を計数し、１．０×１０7細胞／ｍｌとなるように調整したものを、頭腎白血球浮遊液とした。
【００３６】
試験例１−１ 頭腎白血球による殺菌活性の測定
試験管に、ＭＥＭ２培地１．２ｍｌ、上記の頭腎白血球細胞浮遊液０．２４ｍｌ及びザイモサンＮＢＴ混合溶液１．２ｍｌの順に入れて反応させた。また予めＭＥＭ１０unitsヘパリン培地を用いて４℃で２回遠心洗浄（１６００ｒｐｍ、５分間）を行い、得られた沈殿にメタノール２００μｌを加えて、パスツールピペットで混合して、室温で３０分間固定した。
【００３７】
メタノール固定した沈殿を２０℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで５分間）し、上澄みを取り除いた。２M水酸化カリウム溶液１．４４ｍｌとジメチルスルホキシド（和光純薬）１．６８ｍｌを加えボルテックスで攪拌し、２０℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで１０分間）し、上澄みの吸光値（ＯＤ630）を測定した。なお、オートゼロにはＭＥＭ２培地を用いた。
測定結果を図１に示す。図１では、※は、対照からの有意差があることを示す。
【００３８】
この実験では、ザイモサンの刺激により白血球が活性酸素を産生する能力、すなわち白血球の殺菌能力を、活性酸素によるＮＢＴの還元反応により発生する青色のジフォルマザンの量を測定することにより、評価できる。
【００３９】
図１の結果から、過酸化水素発生化合物での薬浴処理をしなかったニシキゴイの白血球に比べて、本発明の方法により処理したニシキゴイの白血球は、より多くの活性酸素を産生したことがわかる。よって、本発明の方法により、ニシキゴイの免疫力が増強されたことがわかる。
【００４０】
試験例１−２ 血清のリゾチーム活性の測定
全量０．３ｍｌになるように、上記の血清試料をＰＢで１０倍希釈したものを試料として用いた。ＰＢのみを入れたものを、ブランクとして用いた。ミクロコッカス菌液をそれぞれの試験管に０．９ｍｌずつ加えて、すぐに吸光度（ＯＤ530）を測定した。３７℃でインキュベートしながら３０分毎に２時間まで吸光度を測定した。なお、オートゼロはＰＢで行なった。
【００４１】
得られた結果に基づいて、溶菌率を以下の式により計算した：
溶菌率（％）＝（Ｘ0−Ｘt）−（Ｂ0−Ｂt）／Ｘ0×１００
（式中、Ｘ0は、ｔ＝０での試料の吸光度であり、Ｘtは、所定の時間での試料の吸光度であり、Ｂ0は、ｔ＝０でのブランクの吸光度であり、Ｂtは、所定の時間でのブランクの吸光度である）。
溶菌率の測定結果を、図２に示す。図２では、※は、対照からの有意差があることを示す。
【００４２】
この実験により、血清中のリゾチーム活性を測定できる。
図２の結果から、過酸化水素発生化合物での薬浴処理をしなかったニシキゴイに比べて、本発明の方法により処理したニシキゴイは、血清中のリゾチーム活性が上昇していることがわかる。すなわち、本発明の方法により、ニシキゴイの免疫力が増強されたことがわかる。
【００４３】
試験例１−３ 後腎リゾチーム活性の測定
実施例１のようにして処理したニシキゴイから後腎を摘出した。この後腎０．０３ｇにＰＢ２．９７ｍｌを加え、ホモジナイザーでホモジナイズし、ＰＢで１００倍希釈して用いた。１００倍希釈液に等量のＰＢを加え２００倍希釈した。ＰＢのみを入れたものを、ブランクとして用いた。３７℃でインキュベートしながら３０分ごとに１時間まで吸光度を測定した以外は、試験例１−２と同様にして溶菌率を測定した。
測定結果を図３に示す。図３では、※は、対照からの有意差があることを示す。
【００４４】
図３の結果から、薬浴処理から１日経過したニシキゴイの後腎では、薬浴処理していないニシキゴイに比べて、リゾチーム活性はわずかしか上昇していなかった。しかし、薬浴処理から３及び５日後には、本発明の方法により処理したニシキゴイにおいて、処理していないニシキゴイに比べてリゾチーム活性が有意に上昇したことがわかる。
【００４５】
実施例２
供試魚として、養魚場から購入した平均体重１４．９gのニシキゴイ（Cyprinus carpio）を用いた。
６０リットルのガラス製水槽４基に、５０リットル中にチオ硫酸ナトリウム６粒を入れて脱塩素を行なった水道水を入れ、それぞれの水槽に１５尾ずつニシキゴイをいれて、２０℃で止水飼育した。浸漬中は無給餌で飼育した。
次に、過酸化水素発生化合物として、「マリンサワーＳＰ３０」（（株）片山化学工業研究所製）を用いて薬浴処理を実施した。７０リットルのタンク中にチオ硫酸ナトリウムを３粒入れ、水道水２０リットルを脱塩素して用いた。過酸化水素濃度が１６５ｍｇ／リットルとなるように過酸化水素発生化合物を添加した試験区と、水道水の試験区とに、それぞれニシキゴイを１５尾ずつ、２０℃で２０分浸漬させた後、元の飼育水に戻した。
【００４６】
ニシキゴイを過酸化水素で処理してから５日後に、１０ｍｇ／ｍｌに調製したザイモサンを各検体に０．１ｍｌずつ腹腔内投与した。対照区のニシキゴイには、生理食塩水を０．１ｍｌずつ腹腔内投与した。
水道水の試験区で処理した後、生理食塩水を腹腔内投与した試験区を「Ｃ／Ｃ」、水道水の試験区で処理した後、ザイモサンを腹腔内投与した試験区を「Ｃ／Ｚ」、１６５ｍｇ／リットルの過酸化水素水で処理した後、生理食塩水を腹腔内投与した試験区を「Ｈ2Ｏ2／Ｃ」、１６５ｍｇ／リットルの過酸化水素水で処理した後、ザイモサンを腹腔内投与した試験区を「Ｈ2Ｏ2／Ｚ」と表す。
生理食塩水又はザイモサンの投与から２及び４週間後に、各水槽から無作為に５尾ずつニシキゴイを取り出し、尾静脈から血液を採取し、室温で１時間静置した。その後、静置した血液を４℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで１５分間）し、上清をマイクロチューブに移し、血清を得た。試験区毎にプール血清１６０μｌとなるように調整し、氷上で保存した後、残った血清は使用時まで−８０℃で保存した。
【００４７】
また、生理食塩水又はザイモサンの投与から２及び４週間後に、各水槽から無作為に５尾ずつニシキゴイを取り出し、上記の＜頭腎白血球細胞浮遊液の調製＞に記載したようにして、頭腎白血球細胞浮遊液を得た。
【００４８】
この実施例において、腹腔内投与されるザイモサンは、抗原性を示す物質として用いた。
【００４９】
試験例２−１ 頭腎白血球の抗体産生細胞数の測定
採血用生理食塩水を用いてウサギの耳から血液を採血し、０．８５％生理食塩水を用い２回の遠心洗浄（２０００ｒｐｍで５分間）を行なった。洗浄後、０．８５％生理食塩水を用い、赤血球が２０％になるように調整した２０％ウサギ赤血球浮遊液と、０．１ｍｇ／ｍｌザイモサン液を等量混合し、３７℃のウォーターバスで６０分間反応させた。反応後０．８５％生理食塩水を用い２回の遠心洗浄（２０００ｒｐｍで５分間）を行ない、その後０．８５％生理食塩水で赤血球が１０％となるようにし、１０％感作赤血球浮遊液を調製した。
【００５０】
４５℃のウォーターバスで温めた試験管１本当たりに、２倍濃度ＭＥＭ培地３（ニッスイ）１．６ｍｌ、１％アガロース液１．６ｍｌ、１０％感作赤血球浮遊液０．４ｍｌ、及び実施例２で得られた１．０×１０7細胞／ｍｌの白血球を含む頭腎白血球細胞浮遊液０．４ｍｌを、ピペットにより混合した。得られた混合液１ｍｌをスライドガラスに塗布し、放置してゲル状にした。１検体につき３枚のスライドガラスを用意した。
バット１枚に、ＰＢＳで５倍希釈した未処理（過酸化水素での処理もザイモサンの腹腔内投与もしていない）のニシキゴイの血清１０ｍｌを広げ、ティッシュを敷き、その上にスライドガラスのゲル面を下にして並べた。バットにラップをかけて２０℃でインキュベートし、１６時間から２４時間後のプラーク数を測定した。
測定結果を図４に示す。
【００５１】
この実験では、ザイモサンに対する抗体を産生する白血球の能力を、プラーク形成細胞（抗体産生細胞の１種）による赤血球の溶血によるプラークの数を計数することにより評価できる。
【００５２】
図４の結果から、本発明の方法により過酸化水素発生化合物で処理したニシキゴイでは、抗原投与から４週間後に、過酸化水素発生化合物で薬浴処理せずに抗原を投与したニシキゴイに比べて、抗体産生細胞の数がより多いことがわかる。
よって、本発明のワクチン接種方法により、接種されたワクチンに対する抗体がより多く産生され、特定の病原菌に対する生体防御機能が増強されることが期待できる。
【００５３】
試験例２−２ 頭腎白血球による殺菌活性の測定
試験例１−１と同様にして、実施例２のようにして処理したニシキゴイからの頭腎白血球の殺菌活性を測定した。
測定結果を図５に示す。図５では、※は、対照からの有意差があることを示す。
図５の結果から、過酸化水素発生化合物で処理をしてから抗原を投与したニシキゴイからの白血球が、抗原投与から４週間後に、より多くの活性酸素を産生したことがわかる。よって、本発明のワクチン接種方法により、ニシキゴイの免疫力が増強され得ることがわかる。
【００５４】
実施例３
供試魚として、平均体重約７０ｇのマダイを用いた。６０リットルの海水が入ったポリカーボネート製水槽にマダイを入れて、過酸化水素として、「マリンサワーＳＰ３０」を用いて薬浴処理を実施した。「マリンサワーＳＰ３０」を６０ｍｌ（過酸化水素濃度として３００ｍｇ／リットル）添加した試験区と、無添加の試験区とに、それぞれマダイを３３個体ずつ、通気して２１〜２２℃で３分間浸漬させた後、２１〜２２℃の５００リットルタンクの飼育水に戻した。試験期間中は、市販の配合飼料を魚体重の約２％量で給餌した。
【００５５】
マダイを過酸化水素で処理してから５日後に、ワクチンとして、エドワジエラ症原因菌（Edwardsiella tarda）のホルマリン不活化菌体を各個体に湿菌重量として１０ｍｇずつ腹腔内投与した。菌体の投与から２週間後及び４週間後に、各水槽から無作為に５尾ずつマダイを取り出し、尾静脈から血液を採取し、室温で１時間静置した。その後、静置した血液を４℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで１５分間）し、上清をマイクロチューブに移し、血清を得た。
抗体価は、得られた血清をリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ、pH7.0、13mM)で２倍段階希釈したものとホルマリン不活化菌体を用いて測定し、幾何平均抗体価を算出した。具体的には、96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに被検血清25μlを入れ、ＰＢＳで２倍の段階希釈を作製した。各ウェルに、OD630 = 1.0に調整したホルマリン不活化エドワジエラ症原因菌体の懸濁液25μlを加えて混合し、室温で２時間及び４℃にて一晩静置して、肉眼で凝集の認められる最高希釈倍率を抗体価とした。
２週間後及び４週間後の幾何平均抗体価の測定結果を、それぞれ表１及び表２に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
表１及び表２の測定結果から、本発明の方法により過酸化水素で薬浴処理したマダイは、過酸化水素で処理しなかったマダイに比べて幾何平均抗体価が高くなることがわかる。
よって、本発明の免疫増強方法により、魚類において、接種されたワクチンに対する抗体がより多く産出されることが示された。本発明の免疫増強方法により、特定の病原体に対する魚類の生体防御機能を増強することが期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養殖魚及び観賞魚を含む魚類の免疫力を増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
養殖魚や観賞魚のような人工的に飼育される魚類は、閉鎖水系に個体が存在し、１尾が病原菌に感染すると、閉鎖水系内の魚類の全体が感染する恐れがあるので、感染症による影響を受けやすい。
そこで、魚類の感染症の予防及び治療を目的として、ワクチンを使用することが知られている。ワクチンとしては、例えば、イリドウイルス感染症予防用のワクチン（特開２００７−１９７４５４号；特許文献１）、ウイルス性出血性敗血症に対するＤＮＡワクチン（特開２００５−１１２７２６号；特許文献２）、ヒラメのラブドウイルス感染防止用のＤＮＡワクチン（特開２００３−１５５２５４号；特許文献３）、錦鯉の新穴あき病の予防用ワクチン（特開２００２−２６５３８４号；特許文献４）などが知られている。
【０００３】
また、ワクチンを使用する際に、アジュバントを用いて、抗原に対する抗体産生能力を高める試みも行われている（特開２００６−３１２５９５号；特許文献５）。
【０００４】
さらに、ワクチンを含有する高濃度溶存酸素水中で魚類に対して超音波処理を行うことにより、感染の防止効果を増強させる方法が知られている（特開２００７−２１５４７５号；特許文献６）。
【０００５】
一方、過酸化水素を含有する水浴で魚類を処理して、魚類の体表面や鰓に寄生する寄生虫の駆除を行うことも知られている（特公平７−５１０２８号公報、特許２５７５２４０号、特許第２８１７７５３号；特許文献７〜９）。
【特許文献１】特開２００７−１９７４５４号公報
【特許文献２】特開２００５−１１２７２６号公報
【特許文献３】特開２００３−１５５２５４号公報
【特許文献４】特開２００２−２６５３８４号公報
【特許文献５】特開２００６−３１２５９５号公報
【特許文献６】特開２００７−２１５４７５号公報
【特許文献７】特公平７−５１０２８号公報公報
【特許文献８】特許第２５７５２４０号公報
【特許文献９】特許第２８１７７５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、魚類の免疫力を増強する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理する、魚類の免疫力を増強する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、魚類の免疫力を増強できる。免疫力が向上することにより、種々の疾患に対する魚類の抵抗力を向上させることができ、魚類が罹患することによる種々の悪影響を回避できる。
また、免疫力が増強された魚類は、体内に侵入した抗原に対する抗体を産生する能力が高められ得るので、このような魚類にワクチンを接種することにより、抗体の産生が増進され、魚類の免疫力がより増強され、ワクチン接種による細菌などの感染防止効果をより向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ニシキゴイの頭腎からの白血球の殺菌活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】ニシキゴイの血清リゾチーム活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】ニシキゴイの後腎のリゾチーム活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】ニシキゴイの白血球から産生される抗体産生細胞の数の測定結果を示すグラフである。
【図５】ニシキゴイの頭腎からの白血球の殺菌活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理することを含む、魚類の免疫力を増強させる方法である。
本明細書において、魚類の「免疫力を増強させる」とは、多くの疾患に対する非特異的生体防御能、及び／又は特定の疾患に対する特異的生体防御能を高めることを意味する。免疫力の増強は、具体的には、魚類の白血球（特に好中球）による殺菌活性を向上させること、補体の活性を向上させること、血液及び臓器でのリゾチーム活性を向上させること、魚類の体内で異種抗原と認識される種々の物質に対する抗体の産生を増強させることなどを含む。よって、免疫力の増強は、例えば、以下の実施例に示すように、白血球の殺菌活性、血清中の溶血補体活性、リゾチーム活性、血清中の抗体産生細胞数などを測定することにより確認できる。
魚類の生体防御については、「魚病学概論」室賀清邦及び江草周三編、恒星社厚生閣出版、1996年、第9〜20頁に詳述されている。
【００１１】
上記の過酸化水素発生化合物は、過酸化水素を発生可能な化合物であり、過酸化水素；過ホウ酸、過炭酸、ペルオキシ硫酸などの無機過酸；過酢酸のような有機過酸；及びこれらの塩類が挙げられる。該塩類としては、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウムなどが挙げられる。
上記の過酸化水素としては、通常、工業用として市販されている３０〜６０％程度の濃度（例えば３５％）の過酸化水素水溶液を用いることができる。
【００１２】
上記の過酸化水素発生化合物は、該化合物により発生する閉鎖水系内の過酸化水素の濃度が、好ましくは１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜１５００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１０〜６００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは１０〜３００ｍｇ／Ｌとなるように閉鎖水系内に存在させ得る。この範囲の過酸化水素の濃度であれば、魚類の生存に悪影響を与えることなく、免疫力を増強できる。
【００１３】
上記の過酸化水素発生化合物を、過酸化水素の閉鎖水系内での濃度が上記の好ましい範囲の濃度になるように、魚類を収容している閉鎖水系内に加えればよい。
上記の添加は、高い濃度の過酸化水素が魚類に直接降りかかって魚体に悪影響を与えることがないように、過酸化水素発生化合物を海水又は淡水で適切な濃度に希釈してから行うことが好ましい。また、過酸化水素発生化合物を閉鎖水系内に添加した後に、過酸化水素が閉鎖水系内に適当に分散するように、撹拌を行ってもよいし、過酸化水素発生化合物を閉鎖水系の上方から散布することにより添加してもよい。
【００１４】
本発明の方法において、魚類を過酸化水素発生化合物で処理する期間は、魚の種類にもよるが、１〜６０分が好ましく、より好ましくは１〜３０分である。この時間であれば、魚類の生存に悪影響を与えることなく、免疫力を増強できる。
【００１５】
魚類の過酸化水素発生化合物での処理は、魚類を通常飼育する温度で行うことができ、魚の種類にもよるが、１０〜２５℃の範囲で行うことが好ましい。
【００１６】
本発明の方法により処理できる魚類は、海水魚及び淡水魚のいずれであってもよく、好ましくは養殖魚及び観賞魚であり、より好ましくは海水で生息する養殖魚である。海水で生息する養殖魚としては、特に限定されないが、ハマチ、ブリ、カンパチ、シマアジ、タイ、トラフグ、ヒラメ、サケなどが挙げられる。本発明の方法は、淡水で生息する養殖魚、例えばアユ、フナなど、及び観賞魚、例えば金魚、コイ、メダカなどにも適用可能である。
【００１７】
上記の魚類を収容している閉鎖水系とは、隔壁をもって閉鎖された魚類の遊泳区画である。上記の隔壁としては、例えばビニールシート、ゴム引きシート、水槽などが挙げられる。閉鎖水系内に収容される水は、魚類の種類に応じて、海水又は淡水であり得る。
【００１８】
本発明の方法は、さらに、魚類と過酸化水素との接触を停止する工程を含むことができる。このような工程を含むことにより、過酸化水素と魚類との長時間の接触を回避して、魚類に対する悪影響が生じることを防ぐことができる。
魚類と過酸化水素との接触を停止する方法としては、過酸化水素類で処理した魚類を、過酸化水素を含む閉鎖水系から別の閉鎖水系に移動させる方法、過酸化水素を含む閉鎖水系内に、過酸化水素を中和又は分解できる物質を添加することにより過酸化水素を除去する方法などが挙げられる。
【００１９】
魚類を閉鎖水系内から外に移動させる方法は、魚類に負担をかけない方法であれば特に限定されず、過酸化水素を添加した閉鎖水系に別の生簀を隣接させ、閉鎖水系と該生簀との両方に設けた開口部を介して魚類を移動させる方法が挙げられる。
【００２０】
上記の過酸化水素を中和又は分解できる物質としては、工業的に過酸化水素を中和又は分解するために用いられている物質であって、生物に対する毒性が弱いものであれば特に限定されず、例えばチオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、水酸化ナトリウム、カタラーゼ、マンガン触媒、活性炭などが挙げられる。魚類に対する影響及び環境に対する影響の観点から、カタラーゼ、マンガン触媒、活性炭を用いることが好ましい。
カタラーゼは、過酸化水素の分解を触媒する酵素であり、ウシ、ブタなどの動物の肝臓、腎臓、赤血球などから得られるものが知られている。また、Aspegillus niger、Micrococcus lysodeikticusなどの微生物の培養液から得られるものを用いることもできる。カタラーゼは、精製品又は未精製品のいずれであってもよく、１０，０００〜１００，０００単位／ｍＬ（１単位は、３７℃にて１分間に１ｍＭのＨ2Ｏ2を分解できる酵素の量である）程度の量で閉鎖水系に添加することにより、過酸化水素を分解できる。
【００２１】
上記の過酸化水素を中和又は分解できる物質を閉鎖水系内に加える場合、該閉鎖水系内には魚類が存在していてもよいし、存在していなくてもよいが、魚類への負担を軽減する観点から、該物質を加える前に魚類を閉鎖水系内から外に移動させることが好ましい。
【００２２】
本発明の方法は、魚類にワクチンを接種する工程をさらに含むことができる。
魚類へのワクチンの接種は、当該技術において公知の方法で行うことができ、注射、経口投与又は浸漬により行うことが好ましい。
注射は、筋肉内又は腹腔内への注射により行うことができる。
経口投与は、魚類の飼料にワクチンを混合して投与する方法、及び製剤化したワクチン（例えばカプセル剤、錠剤など）を魚類に経口投与する方法などにより行うことができる。
浸漬は、魚類をワクチン液に適切な時間、通常、１〜３０分程度浸漬する方法、ベルトコンベア上を移動する魚類にワクチン液を振りかける方法などにより行うことができる。
【００２３】
上記のワクチンは、魚類用のワクチンであれば特に限定されず、病原体を不活性化した不活化ワクチン、病原体の病原性を低下させた弱毒化ワクチン、病原体の免疫原性部分に相当する成分ワクチン、病原体の産生する毒素を中和したトキソイドワクチン、遺伝子組み換えにより作製した遺伝子組み換えワクチン、免疫原性タンパク質をコードするＤＮＡであるＤＮＡワクチンなどのいずれであってもよい。
上記のワクチンとしては、ビブリオ病に対するワクチン、連鎖球菌症に対するワクチン、イリドウイルス感染症に対するワクチン、ウイルス性出血性敗血症に対するワクチン、ラブドウイルス感染症に対するワクチン、アエロモナス感染症に対するワクチン、α溶血性連鎖球菌症に対するワクチン、β溶血性連鎖球菌症に対するワクチン、類結節症に対するワクチン、エドワジエラ症に対するワクチンなどが挙げられる。
【００２４】
上記のワクチンは、抗原に対する免疫応答を修飾できるアジュバントを含み得る。アジュバントとしては、従来公知のものであれば特に限定されず、アルミナアジュバント、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントなどが挙げられる。
【００２５】
上記のワクチンの投与量は、ワクチンの種類、魚の種類などに応じて適宜選択できる。
【００２６】
本発明の方法において、魚類の過酸化水素類での処理工程は、ワクチン接種工程の前、同時又は後に行うことができる。
本発明の方法では、該処理工程により、魚類の免疫力が増強され得るので、ワクチンを接種することにより、ワクチンに対する抗体の産生が増進されて、ワクチン接種による感染症予防効果をより増強できる。ワクチンが上記のアジュバントを含む場合、接種されたワクチンは免疫原性を持続的に発揮できるので、ワクチン接種工程の後に魚類を過酸化水素類で処理して免疫力を増強させても、該ワクチンからの免疫原性物質に対する抗体の産生を増加させ得ると考えられる。
【００２７】
上記の処理工程をワクチン接種工程の前に行う場合、処理工程を行ってから３０分〜１０日後、より好ましくは１〜７日後にワクチン接種工程を行うことが好ましい。
【実施例】
【００２８】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
以下の実施例において用いた試薬は、次に記載するようにして調製した。
〔１０００unitsヘパリン溶液〕
蒸留水１０ｍｌに１３０units／ｍｇヘパリン（和光純薬工業（株）製）７６．９ｍｇを溶解させ、４℃で保存したものを１０００unitsヘパリン溶液とした。
〔リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）〕
蒸留水９００ｍｌにリン酸水素二ナトリウム１２水塩（和光純薬工業（株）製）３．０ｇ、リン酸二水素カリウム（関東化学（株）製）０．７ｇ及び塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）６．４ｇを溶解させて、メスフラスコで１０００ｍｌにメスアップした後、４℃で保存したものをＰＢＳとした。
【００２９】
〔１０％炭酸水素ナトリウム溶液〕
蒸留水２０ｍｌに炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）製）２ｇを溶解し、１２１℃にて１５分間滅菌し、４℃で保存したものを１０％炭酸水素ナトリウム溶液とした。
〔２Ｍ水酸化カリウム溶液〕
蒸留水１００ｍｌに水酸化カリウム（ナカライテスク（株））１１．２２ｇを溶解させたものを、２Ｍ水酸化カリウム溶液とした。
【００３０】
〔ＭＥＭ細胞培地〕
超純水３９６ｍｌにＭＥＭ培地２（ニッスイ）３．７６ｇを溶解し、１２１℃にて１５分間の滅菌を行なった。その後、１０％炭酸水素ナトリウム溶液でｐＨを７．２に調整し、４℃で保存したものをＭＥＭ細胞培地とした。
〔１０unitsヘパリン入りＭＥＭ細胞培地〕
ＭＥＭ細胞培地に、ヘパリンが１０unitsとなるように１０００unitsヘパリン溶液を加えたものを、１０unitsヘパリン入りＭＥＭ細胞培地とした。
【００３１】
〔ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液〕
ＮＢＴ（Sigma）８ｍｇに、ＭＥＭ２培地１６ｍｌ加えて溶解させ、４℃で保存したものをＮＢＴ溶液とした。
〔ザイモサンＮＢＴ混合溶液〕
ザイモサン（zymosan A（Sigma））３２ｍｇをＰＢＳに懸濁し、１００℃で３０分間煮沸した。その後ＰＢＳを用いて、室温で３回の遠心洗浄（２０００ｒｐｍで１０分間）を行ない、上澄みを取り除き、プール血清１６０μｌを加え２０℃でオプソニン化を３０分行なった。ＭＥＭ２培地を用いて同条件で２回の遠心洗浄を行ない、得られた沈殿にＮＢＴ溶液１６ｍｌを加えて、ザイモサンＮＢＴ混合溶液とした。
【００３２】
〔リン酸緩衝液ｐＨ７．０（ＰＢ）〕
リン酸水素二ナトリウム１２水塩１．７９gとリン酸二水素カリウム０．６８gをそれぞれ蒸留水５００ｍｌに溶解し、ｐＨ７．０に調整したリン酸緩衝液をＰＢとした。
〔ミクロコッカス菌液〕
Micrococcus lysodeikticus菌体（Sigma）を適度にＰＢで希釈した後、ＯＤ530での吸光度を０．５に調整したものを、ミクロコッカス菌液とした。
【００３３】
実施例１
供試魚として、養魚場から購入した平均体重３２．８ｇのニシキゴイ（Cyprinus carpio）を用いた。
６０リットルのガラス製水槽４基に、５０リットル中にチオ硫酸ナトリウム６粒を入れて脱塩素を行なった水道水を入れ、それぞれの水槽に２０尾ずつニシキゴイを入れて、２０℃で止水飼育した。浸漬中は無給餌で飼育した。
次に、過酸化水素発生化合物として、「マリンサワーＳＰ３０」（（株）片山化学工業研究所製）を用いて薬浴処理を実施した。７０リットルのタンク中にチオ硫酸ナトリウムを３粒入れ、水道水２０リットルを脱塩素して用いた。過酸化水素濃度が０（対照）、１６．５、１６５又は１６５０ｍｇ／リットルとなるように過酸化水素発生化合物を添加して、各試験区とした。上記のニシキゴイ２０尾を、各試験区に水温２０℃で２０分間浸漬させた後、元の飼育水に戻した。
【００３４】
＜血清試料の調製＞
ニシキゴイを過酸化水素で処理してから１、３及び５日後に、各水槽から無作為に５尾ずつニシキゴイを取り出し、尾静脈から血液を採取し、室温で１時間静置した。その後、静置した血液を４℃で遠心分離（２５００ｒｐｍ、１５分間）し、上清をマイクロチューブに移し、血清を得た。試験区毎にプール血清を１６０μｌとなるように調整し、氷上で保存した後、残った血清は使用時まで−８０℃で保存した。
【００３５】
＜頭腎白血球細胞浮遊液の調製＞
また、血清を採取したのと同じニシキゴイから頭腎を採取し、シャーレ上にＭＥＭ１０unitsヘパリン培地を２ｍｌ加えピンセットを用いて頭腎をチョッピングした。パスツールピペットを用い、ステンレスメッシュで頭腎を濾過し、得られた液を試験管に移した。ＭＥＭ１０unitsヘパリン培地１ｍｌで共洗いをしてから、得られた液を試験管に移し全量を３ｍｌとした。ＭＥＭ１０units培地を用いて、４℃で２回の遠心洗浄（１６００ｒｐｍで５分間）を行なった。得られた沈殿にＭＥＭ１０unitsヘパリン培地を２ｍｌ加え懸濁し、２０μｌトリパンブルーと等量混合した。トーマ血球計算盤を用いて白血球数を計数し、１．０×１０7細胞／ｍｌとなるように調整したものを、頭腎白血球浮遊液とした。
【００３６】
試験例１−１ 頭腎白血球による殺菌活性の測定
試験管に、ＭＥＭ２培地１．２ｍｌ、上記の頭腎白血球細胞浮遊液０．２４ｍｌ及びザイモサンＮＢＴ混合溶液１．２ｍｌの順に入れて反応させた。また予めＭＥＭ１０unitsヘパリン培地を用いて４℃で２回遠心洗浄（１６００ｒｐｍ、５分間）を行い、得られた沈殿にメタノール２００μｌを加えて、パスツールピペットで混合して、室温で３０分間固定した。
【００３７】
メタノール固定した沈殿を２０℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで５分間）し、上澄みを取り除いた。２M水酸化カリウム溶液１．４４ｍｌとジメチルスルホキシド（和光純薬）１．６８ｍｌを加えボルテックスで攪拌し、２０℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで１０分間）し、上澄みの吸光値（ＯＤ630）を測定した。なお、オートゼロにはＭＥＭ２培地を用いた。
測定結果を図１に示す。図１では、※は、対照からの有意差があることを示す。
【００３８】
この実験では、ザイモサンの刺激により白血球が活性酸素を産生する能力、すなわち白血球の殺菌能力を、活性酸素によるＮＢＴの還元反応により発生する青色のジフォルマザンの量を測定することにより、評価できる。
【００３９】
図１の結果から、過酸化水素発生化合物での薬浴処理をしなかったニシキゴイの白血球に比べて、本発明の方法により処理したニシキゴイの白血球は、より多くの活性酸素を産生したことがわかる。よって、本発明の方法により、ニシキゴイの免疫力が増強されたことがわかる。
【００４０】
試験例１−２ 血清のリゾチーム活性の測定
全量０．３ｍｌになるように、上記の血清試料をＰＢで１０倍希釈したものを試料として用いた。ＰＢのみを入れたものを、ブランクとして用いた。ミクロコッカス菌液をそれぞれの試験管に０．９ｍｌずつ加えて、すぐに吸光度（ＯＤ530）を測定した。３７℃でインキュベートしながら３０分毎に２時間まで吸光度を測定した。なお、オートゼロはＰＢで行なった。
【００４１】
得られた結果に基づいて、溶菌率を以下の式により計算した：
溶菌率（％）＝（Ｘ0−Ｘt）−（Ｂ0−Ｂt）／Ｘ0×１００
（式中、Ｘ0は、ｔ＝０での試料の吸光度であり、Ｘtは、所定の時間での試料の吸光度であり、Ｂ0は、ｔ＝０でのブランクの吸光度であり、Ｂtは、所定の時間でのブランクの吸光度である）。
溶菌率の測定結果を、図２に示す。図２では、※は、対照からの有意差があることを示す。
【００４２】
この実験により、血清中のリゾチーム活性を測定できる。
図２の結果から、過酸化水素発生化合物での薬浴処理をしなかったニシキゴイに比べて、本発明の方法により処理したニシキゴイは、血清中のリゾチーム活性が上昇していることがわかる。すなわち、本発明の方法により、ニシキゴイの免疫力が増強されたことがわかる。
【００４３】
試験例１−３ 後腎リゾチーム活性の測定
実施例１のようにして処理したニシキゴイから後腎を摘出した。この後腎０．０３ｇにＰＢ２．９７ｍｌを加え、ホモジナイザーでホモジナイズし、ＰＢで１００倍希釈して用いた。１００倍希釈液に等量のＰＢを加え２００倍希釈した。ＰＢのみを入れたものを、ブランクとして用いた。３７℃でインキュベートしながら３０分ごとに１時間まで吸光度を測定した以外は、試験例１−２と同様にして溶菌率を測定した。
測定結果を図３に示す。図３では、※は、対照からの有意差があることを示す。
【００４４】
図３の結果から、薬浴処理から１日経過したニシキゴイの後腎では、薬浴処理していないニシキゴイに比べて、リゾチーム活性はわずかしか上昇していなかった。しかし、薬浴処理から３及び５日後には、本発明の方法により処理したニシキゴイにおいて、処理していないニシキゴイに比べてリゾチーム活性が有意に上昇したことがわかる。
【００４５】
実施例２
供試魚として、養魚場から購入した平均体重１４．９gのニシキゴイ（Cyprinus carpio）を用いた。
６０リットルのガラス製水槽４基に、５０リットル中にチオ硫酸ナトリウム６粒を入れて脱塩素を行なった水道水を入れ、それぞれの水槽に１５尾ずつニシキゴイをいれて、２０℃で止水飼育した。浸漬中は無給餌で飼育した。
次に、過酸化水素発生化合物として、「マリンサワーＳＰ３０」（（株）片山化学工業研究所製）を用いて薬浴処理を実施した。７０リットルのタンク中にチオ硫酸ナトリウムを３粒入れ、水道水２０リットルを脱塩素して用いた。過酸化水素濃度が１６５ｍｇ／リットルとなるように過酸化水素発生化合物を添加した試験区と、水道水の試験区とに、それぞれニシキゴイを１５尾ずつ、２０℃で２０分浸漬させた後、元の飼育水に戻した。
【００４６】
ニシキゴイを過酸化水素で処理してから５日後に、１０ｍｇ／ｍｌに調製したザイモサンを各検体に０．１ｍｌずつ腹腔内投与した。対照区のニシキゴイには、生理食塩水を０．１ｍｌずつ腹腔内投与した。
水道水の試験区で処理した後、生理食塩水を腹腔内投与した試験区を「Ｃ／Ｃ」、水道水の試験区で処理した後、ザイモサンを腹腔内投与した試験区を「Ｃ／Ｚ」、１６５ｍｇ／リットルの過酸化水素水で処理した後、生理食塩水を腹腔内投与した試験区を「Ｈ2Ｏ2／Ｃ」、１６５ｍｇ／リットルの過酸化水素水で処理した後、ザイモサンを腹腔内投与した試験区を「Ｈ2Ｏ2／Ｚ」と表す。
生理食塩水又はザイモサンの投与から２及び４週間後に、各水槽から無作為に５尾ずつニシキゴイを取り出し、尾静脈から血液を採取し、室温で１時間静置した。その後、静置した血液を４℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで１５分間）し、上清をマイクロチューブに移し、血清を得た。試験区毎にプール血清１６０μｌとなるように調整し、氷上で保存した後、残った血清は使用時まで−８０℃で保存した。
【００４７】
また、生理食塩水又はザイモサンの投与から２及び４週間後に、各水槽から無作為に５尾ずつニシキゴイを取り出し、上記の＜頭腎白血球細胞浮遊液の調製＞に記載したようにして、頭腎白血球細胞浮遊液を得た。
【００４８】
この実施例において、腹腔内投与されるザイモサンは、抗原性を示す物質として用いた。
【００４９】
試験例２−１ 頭腎白血球の抗体産生細胞数の測定
採血用生理食塩水を用いてウサギの耳から血液を採血し、０．８５％生理食塩水を用い２回の遠心洗浄（２０００ｒｐｍで５分間）を行なった。洗浄後、０．８５％生理食塩水を用い、赤血球が２０％になるように調整した２０％ウサギ赤血球浮遊液と、０．１ｍｇ／ｍｌザイモサン液を等量混合し、３７℃のウォーターバスで６０分間反応させた。反応後０．８５％生理食塩水を用い２回の遠心洗浄（２０００ｒｐｍで５分間）を行ない、その後０．８５％生理食塩水で赤血球が１０％となるようにし、１０％感作赤血球浮遊液を調製した。
【００５０】
４５℃のウォーターバスで温めた試験管１本当たりに、２倍濃度ＭＥＭ培地３（ニッスイ）１．６ｍｌ、１％アガロース液１．６ｍｌ、１０％感作赤血球浮遊液０．４ｍｌ、及び実施例２で得られた１．０×１０7細胞／ｍｌの白血球を含む頭腎白血球細胞浮遊液０．４ｍｌを、ピペットにより混合した。得られた混合液１ｍｌをスライドガラスに塗布し、放置してゲル状にした。１検体につき３枚のスライドガラスを用意した。
バット１枚に、ＰＢＳで５倍希釈した未処理（過酸化水素での処理もザイモサンの腹腔内投与もしていない）のニシキゴイの血清１０ｍｌを広げ、ティッシュを敷き、その上にスライドガラスのゲル面を下にして並べた。バットにラップをかけて２０℃でインキュベートし、１６時間から２４時間後のプラーク数を測定した。
測定結果を図４に示す。
【００５１】
この実験では、ザイモサンに対する抗体を産生する白血球の能力を、プラーク形成細胞（抗体産生細胞の１種）による赤血球の溶血によるプラークの数を計数することにより評価できる。
【００５２】
図４の結果から、本発明の方法により過酸化水素発生化合物で処理したニシキゴイでは、抗原投与から４週間後に、過酸化水素発生化合物で薬浴処理せずに抗原を投与したニシキゴイに比べて、抗体産生細胞の数がより多いことがわかる。
よって、本発明のワクチン接種方法により、接種されたワクチンに対する抗体がより多く産生され、特定の病原菌に対する生体防御機能が増強されることが期待できる。
【００５３】
試験例２−２ 頭腎白血球による殺菌活性の測定
試験例１−１と同様にして、実施例２のようにして処理したニシキゴイからの頭腎白血球の殺菌活性を測定した。
測定結果を図５に示す。図５では、※は、対照からの有意差があることを示す。
図５の結果から、過酸化水素発生化合物で処理をしてから抗原を投与したニシキゴイからの白血球が、抗原投与から４週間後に、より多くの活性酸素を産生したことがわかる。よって、本発明のワクチン接種方法により、ニシキゴイの免疫力が増強され得ることがわかる。
【００５４】
実施例３
供試魚として、平均体重約７０ｇのマダイを用いた。６０リットルの海水が入ったポリカーボネート製水槽にマダイを入れて、過酸化水素として、「マリンサワーＳＰ３０」を用いて薬浴処理を実施した。「マリンサワーＳＰ３０」を６０ｍｌ（過酸化水素濃度として３００ｍｇ／リットル）添加した試験区と、無添加の試験区とに、それぞれマダイを３３個体ずつ、通気して２１〜２２℃で３分間浸漬させた後、２１〜２２℃の５００リットルタンクの飼育水に戻した。試験期間中は、市販の配合飼料を魚体重の約２％量で給餌した。
【００５５】
マダイを過酸化水素で処理してから５日後に、ワクチンとして、エドワジエラ症原因菌（Edwardsiella tarda）のホルマリン不活化菌体を各個体に湿菌重量として１０ｍｇずつ腹腔内投与した。菌体の投与から２週間後及び４週間後に、各水槽から無作為に５尾ずつマダイを取り出し、尾静脈から血液を採取し、室温で１時間静置した。その後、静置した血液を４℃で遠心分離（２５００ｒｐｍで１５分間）し、上清をマイクロチューブに移し、血清を得た。
抗体価は、得られた血清をリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ、pH7.0、13mM)で２倍段階希釈したものとホルマリン不活化菌体を用いて測定し、幾何平均抗体価を算出した。具体的には、96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに被検血清25μlを入れ、ＰＢＳで２倍の段階希釈を作製した。各ウェルに、OD630 = 1.0に調整したホルマリン不活化エドワジエラ症原因菌体の懸濁液25μlを加えて混合し、室温で２時間及び４℃にて一晩静置して、肉眼で凝集の認められる最高希釈倍率を抗体価とした。
２週間後及び４週間後の幾何平均抗体価の測定結果を、それぞれ表１及び表２に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
表１及び表２の測定結果から、本発明の方法により過酸化水素で薬浴処理したマダイは、過酸化水素で処理しなかったマダイに比べて幾何平均抗体価が高くなることがわかる。
よって、本発明の免疫増強方法により、魚類において、接種されたワクチンに対する抗体がより多く産出されることが示された。本発明の免疫増強方法により、特定の病原体に対する魚類の生体防御機能を増強することが期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理することを特徴とする、魚類の免疫力を増強する方法。
【請求項２】
過酸化水素発生化合物により発生する閉鎖水系内の過酸化水素の濃度が、１０〜３０００ｍｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
閉鎖水系内での魚類の処理が、１〜６０分間の浸漬処理である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
魚類にワクチンを接種する工程をさらに含み、該接種工程が、過酸化水素発生化合物での処理工程の前、同時又は後に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
魚類へのワクチンの接種が、注射、経口投与又は浸漬により行われる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
魚類と過酸化水素との接触を停止する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
閉鎖水系内で過酸化水素発生化合物により魚類を処理することを特徴とする、魚類の免疫力を増強する方法。
【請求項２】
過酸化水素発生化合物により発生する閉鎖水系内の過酸化水素の濃度が、１０〜３０００ｍｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
閉鎖水系内での魚類の処理が、１〜６０分間の浸漬処理である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
魚類にワクチンを接種する工程をさらに含み、該接種工程が、過酸化水素発生化合物での処理工程の前、同時又は後に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
魚類へのワクチンの接種が、注射、経口投与又は浸漬により行われる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
魚類と過酸化水素との接触を停止する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２９１７９（Ｐ２０１０−２９１７９Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４５４３４（Ｐ２００９−１４５４３４）
【出願日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（０００１５４７２７）株式会社片山化学工業研究所 (82)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（０００１５４７２７）株式会社片山化学工業研究所 (82)
【Ｆターム（参考）】
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