１−ケストースの製造方法および１−ケストース産生酵素の製造方法、１−ケストース産生酵素
【課題】Ｎ比が低く、かつ、酵素効率が高い１−ケストースの製造方法を提供する。
【解決手段】Aspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を用い、ショ糖を基質として用いる１−ケストースの製造方法。反応条件として、酵素効率が５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上、Ｎ比が２２％以下、反応温度５５℃以下、ｐＨが５．５〜８、ショ糖の初期濃度は７０％〜１００％を用いる。その反応液を精製することで９８％以上の純度で回収できる。
【解決手段】Aspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を用い、ショ糖を基質として用いる１−ケストースの製造方法。反応条件として、酵素効率が５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上、Ｎ比が２２％以下、反応温度５５℃以下、ｐＨが５．５〜８、ショ糖の初期濃度は７０％〜１００％を用いる。その反応液を精製することで９８％以上の純度で回収できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Aspergillus japonicus菌体由来の酵素により１−ケストースを製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィズス菌増殖能を有するフラクトオリゴ糖の機能が認知され久しいが、それを構成する糖がどのような特異性を有しているかの知見は必ずしも明らかでなかった。近年、ＦＯＳを構成する糖の中で１−ケストースがビフィズス菌増殖能につき特に強いこと（特許文献１）、コレステロール低減作用を有すること（特許文献２）、肌水分改善効果を有すること（特許文献３）などその特異性が明らかになりつつある。そこで１−ケストースの効率的な製造方法が待望されている。
【０００３】
１−ケストースの製造は、通常、ショ糖を原料（基質）とし微生物由来の酵素に反応させて、１−ケストースを産生させる。ここで、酵素に反応させた後の基質は、１−ケストース以外の糖も含んでいるため、通常、１−ケストースを結晶可能な純度に引き上げてクロマト分離する。さらに、必要に応じて、結晶化する。
ここで、酵素反応における構成糖の中で１−ケストースはもとより４糖類であるニストースの量は反応後におけるクロマト分離後の１−ケストース純度をある程度決定付け、さらには結晶回収工程での結晶量にも影響を与える。
したがって酵素反応の終点での１−ケストースとニストース合計量に対するニストースの比率（Ｎ比）を極力抑えることが求められる。
【０００４】
そこで、特許文献４には、S.brevicaulis（スコプラリオプシス・ブレビカウリス）を培養することにより、その培地に１−ケストースが蓄積することを利用し、その中の１−ケストースを精製結晶化する方法が述べられている。ここで、該文献に記載の方法は、醗酵法による１−ケストースの生産であり、反応糖組成中の１−ケストース濃度を充分上げることができる（全糖分当りケストース比率７８％、ニストース比率３％、したがって、したがってＮ比４％）。しかしながら、醗酵法であるがゆえに基質濃度が低く、通常、２０％（ｖ／ｗ）以下である。また、ジャーファーメンターによる１バッチ当りの生産に７２時間以上を要するため、装置当りの生産性が低く工業的に利用するには問題が多い。さらにまたその後の精製工程でも醗酵法であるがゆえに培地成分を取り除く必要性などの煩雑性を伴う。
【０００５】
一方、特許文献５にはS.brevicaulis（スコプラリオプシス・ブレビカウリス）（ＩＦＯ４８３４株）から酵素を抽出し、その抽出酵素を用いる方法が記載されている。しかしながら、乾燥菌体当りの力価が８Ｕと低く、酵素効率が４ｇと実際に利用するには問題が多い。
また、該特許文献５には、P.roaueforti（ペニシリウム・ロックフォルティー）（ＩＡＭ７２５４株）由来の酵素を用いた反応が記載されている。しかしながら、酵素効率が１４ｇと低い。
さらにまた、該特許文献５には、A.niger（アスペルギルス・ニガー）（ＡＴＣＣ２０６１１株）由来菌体酵素を用いた方法も記載されている。しかしながら、これらの例示については、酵素効率が高い場合（４６７０ｇ／乾燥菌体１ｇ）、Ｎ比が高くなってしまう（２３％）。一方、Ｎ比を低くすると（１４％）、酵素効率が低くなる（２３３ｇ／乾燥菌体１ｇ）。つまり、Ｎ比を低くしようとすると、反応ｐＨをアルカリ側に移動させなければならず、結果として、至適ｐＨから大きく外れた状態で利用しなければならなくなる。つまり、実質的には採用できない。
【０００６】
また、非特許文献１には、A.phoenicis（アスペルギルス・ホエニシス）由来酵素を用いる方法が提唱されている。ここで、該非特許文献１の図５の記載における６０℃、基質濃度１２．５％、３０分後のオリゴ糖生産量から、該菌の力価は、乾燥菌体当たり８００Ｕと推定でき、すなわち、基質当りの酵素使用量は１．９Ｕと算出できる。よって、酵素効率は４２１（ｇ／乾燥菌体１ｇ）となる。このように、酵素効率が低いと工業的に利用できない。
【０００７】
すなわち、Ｎ比を低く保ち且つ酵素効率の高い１−ケストース産生菌および酵素が見出されていないのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−３０６７８１号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７７５２号公報
【特許文献３】特開２００５−３５０４４４号公報
【特許文献４】特公平６−７００７５号公報
【特許文献５】特許第３４５９２６４号公報
【非特許文献１】Appl.Microbial Biotechnol35,1991,216-221
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記課題を解決することを目的としたものであって、Ｎ比が低く、かつ、酵素効率が高い１−ケストースの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題のもと、発明者が鋭意検討を行った結果、下記手段により上記課題を解決しうることを見出した。
（１）Aspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を用いることを含む、１−ケストースの製造方法。
（２）ショ糖を基質としてAspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を反応させることを含む、１−ケストースの製造方法。
（３）酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、（２）に記載の１−ケストースの製造方法。
（４）Ｎ比が、２２％以下である、（２）または（３）に記載の１−ケストースの製造方法。
（５）反応温度が５５℃以下である、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
（６）前記ショ糖は溶媒中に含まれており、該溶媒のｐＨは５．５〜８である、（２）〜（５）のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
（７）前記溶媒中におけるショ糖の初期濃度は、７０〜１００％（Ｗ／Ｖ）である、（６）に記載の１−ケストースの製造方法。
（８）Aspergillus japonicus菌体を用いることを含む、１−ケストース産生酵素の製造方法。
（９）Aspergillus japonicus菌体由来の１−ケストース産生酵素。
（１０）酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、（９）に記載の酵素。
（１１）Ｎ比が、２２％以下である、（９）または（１０）に記載の酵素。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、高い効率で１−ケストースを産生することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
【００１３】
本明細書におけるＮ比とは、菌体または菌体由来の酵素を、基質に反応させた終点における１−ケストースとニストースの合計に対するニストースの割合（重量比）をいう。
また、本発明における酵素効率とは、乾燥菌体１ｇが処理できる基質（ショ糖）の量（ｇ）をいい、菌体由来の酵素を用いる場合も菌体あたりに換算して示している。酵素力価Ｕは、乾燥菌体１ｇ（または）これに相当する量の酵素を、４０℃、１０％ショ糖溶液中で、３０分間反応させたときに、１分当りに産生された１−ケストースの量をμモルで表示したものをいう。
また、乾燥菌体とは、培養し洗浄した後の菌を乾燥させたものをいう。
【００１４】
本発明では、Aspergillus japonicus （以下、「A.japonicus」と略することがある）の乾燥菌体を用いる。本発明で用いる、A.japonicus菌体は、好ましくはA.japonicus NBRC4060である。A.japonicus を用いることにより、高い酵素効率を有し、かつ、Ｎ比を低くすることができる。
本発明の１−ケストースの製造方法を採用することにより、例えば、酵素効率は、５００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上、さらには１０００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上、よりさらには２０００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上、特には３５００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上とすることができる。一方、Ｎ比は、例えば２２％以下、さらには２０％以下、特には１５％以下とすることができる。
【００１５】
本発明で用いる、A.japonicus菌体の培養方法としては公知の方法を用いることができる。
培地の組成としては、炭素源として、好ましくはショ糖を、好ましくは５〜３５％、より好ましくは１５〜３０％を、窒素源として、好ましくは酵母エキスを、好ましくは１〜３％、より好ましくは１．５〜２％を含むものである。さらに、その他微量成分として無機成分等を通常の範囲で含んでいることが好ましい。培地のｐＨは、滅菌前で、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくはｐＨ６〜７である。
本発明で用いる、A.japonicus菌体の培養条件としては、例えば、２０〜３０℃で、４０〜７２時間培養することができる。
【００１６】
培養して得られたA.japonicus菌体の回収方法としては、公知の方法を採用できるが、例えば、遠心分離により菌体を分取し洗浄して回収することがあげられる。ここで、菌体の洗浄は、得られた菌体の少なくとも２倍量の水を用いた洗浄が好ましい。
【００１７】
本発明の方法では、ショ糖を基質として、A.japonicus菌体またはA.japonicus菌体由来の酵素を反応させることが好ましい。
本発明の製造方法では、基質を溶媒に含めた状態でA.japonicus菌体またはA.japonicus菌体由来の酵素を反応させることが好ましい。ここで溶媒としては、水、あるいはエチルアルコールを微量（０．５〜２％程度）含んだ水等が挙げられる。
溶媒中における基質中のショ糖の初期濃度は、好ましくは７０〜１００％（Ｗ／Ｖ）であり、より好ましくは７７〜８６％（Ｗ／Ｖ）であり、さらに好ましくは８０％である。このような範囲とすることにより、より効果的に１−ケストースを産生できる。また、溶媒中には、ショ糖以外に、他の成分、ｐＨ調整剤、あるいはエチルアルコール等を含めても良い。
【００１８】
基質を含む溶媒（反応液）のｐＨは、好ましくは５．５〜８であり、より好ましくは６〜７である。
基質を反応させる際の温度（反応液の温度）は、好ましくは５５℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。下限は特に定めるものではないが、例えば、３０℃以上、好ましくは４０℃以上である。
【００１９】
本発明では、上記基質中で、A.japonicus菌体またはA.japonicus菌体由来の酵素を反応させることにより、１−ケストースと共に副成分（ニストース等）が産生される。本発明では１−ケストースと他の成分を含む混合液として用いてもよいが、好ましくは、１−ケストースを精製する。
１−ケストースの精製方法としては、公知の方法を採用できる。
例えば、クロマト分離（より具体的には、陽イオン交換樹脂を分離担体とする擬似移動床式２成分クロマト分離装置による分離等）により、分離することができる。この場合、クロマト分離は、１段階分離であってもよいし、２段階以上の分離であってもよい。
さらに、クロマト分離を行ったものについて結晶化を行っても良い。
このような分離作業を行うことにより、純度が、例えば９０％以上、さらには９５％以上、特には、９８％以上の純度で回収することができる。
【００２０】
本発明では、A.japonicus菌体をそのまま用いて１−ケストースを製造してもよいが、好ましくは、A.japonicus菌体由来の酵素（１−ケストース産生酵素）を用いて製造することが好ましい。
酵素の精製は、公知の方法に従って行うことができる。
本発明のA.japonicus菌体由来の精製酵素は、例えば、ｐＨが５．１〜５．７、４５〜５５℃で特に良好に1−ケストースを産生する。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００２２】
参考例１（Aspergillus japonicusの培養）
水に、ショ糖３０％、酵母エキス１．５％、リン酸１カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０３％、炭酸カルシウム０．１％の割合となるように添加した。この液を３０Ｌジャーファーメンターに入れ、ｐＨが６．５になるように調整した（総量２０Ｌ）。その後、１２０℃で２０分間滅菌した。
また、Aspergillus japonicus（ＮＢＲ４０６０）を上記と同じ組成の培地２００ｍｌが入った１Ｌの三角フラスコに接種し２４時間振倒培養したものを別に用意し、これを上記培地に接種し２５℃で通気量０．４ｖｖｍで４８時間培養した。
培養終了後にバスケット遠心分離機を用いて培養液から菌体を分離し、約２Ｌの水で洗浄後６００ｇ（湿菌重）を回収した。本菌体内に含まれる酵素力価は、乾燥菌体１ｇ当たり５，１００Ｕであった。
以下の実験は、この菌体を用いて行った。
【００２３】
実施例１
ｐＨ６．５、温度４０℃に調整したショ糖溶液（濃度７７％（Ｗ／Ｖ））を、１，０００Ｌの反応槽に入れ、これに上記参考例１で調整した菌体酵素をショ糖１ｇ当り１．８Ｕ加え、３５時間反応させた後、温度８０℃、３０分間の酵素失活処理を行った（サンプル１）。この失活液の糖組成（重量％）、酵素効率（乾燥菌体１ｇ当りのショ糖の処理量（ｇ））、Ｎ比をそれぞれ測定した。結果を表２に示した。また、ショ糖溶液の濃度、ｐＨ、温度を表１のように変更し、さらに、菌体酵素量および酵素処理反応時間も表１のように変更したほかは、上記と同様サンプル１と同様に行ってサンプル２〜６を得た。これらの失活液の糖組成、酵素効率およびＮ比結果も表２に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
実施例２
４塔４層方式による２成分擬似移動床のクロマト分離装置（１ｍ3）（三菱化学エンジニアリング（株）製、Ｍ６ＮＹＥ００）を用いて実施例１のサンプル１で得られた反応液を８０℃、５５Ｂｘに調整し、負荷量０．０５Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈｒおよび溶離水を負荷量の５倍量用い、１−ケストース区分を回収した。回収率８５％で純度８３％の１−ケストース区分（試験番号ａ−１）を得ることができた。
さらに、得られた１−ケストース回収区分を６０Ｂｘ、８０℃に調整後クロマト装置の分離条件を負荷量０．０４Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈｒ、溶離水を負荷量の５倍量を用い再度クロマト分離を行った。その結果、１−ケストース回収率７５％で純度９２％の１−ケストース区分を得ることができた（総回収率６４％）（試験番号ａ−２）。
【００２７】
また、サンプルの種類、負荷量、溶離水量を表３に記載のとおり変更し、他は同様に行った。これらの結果も表３に示した（試験番号ｂ〜ｄ）。尚、溶離水量は、溶離水を負荷量に対する量（倍量）で示している。
【００２８】
【表３】
【００２９】
実施例３
下記１段階目〜３段階目の結晶回収操作を行った。
（１段階目）
５０Ｌ容量結晶缶に実施例２の試験番号ａで得られた１−ケストース純度９２％溶液（１−ケストース溶液ａ−２）を６５Ｂｘに５０Ｌ調整し、その半分の２５Ｌを入れた。８０℃にて８５Ｂｘまで濃縮し、種結晶スラリーを加え起晶させた。その後２時間かけて缶内の蒸発量に応じ残りの２５Ｌを徐々に加え煎糖した。得られた白下を５０Ｌ助晶機内に移動させ、７０℃で２時間助晶後、バケット型遠心分離機により分離した。結晶の回収率は４５％で純度は９９％であった。分離された蜜の純度は８７％であったのでこの１段階目の蜜が充分に集まるまで繰り返し、以下２段階目の結晶回収を行った。
【００３０】
（２段階目）
５０Ｌ容量結晶缶内に１段階目結晶回収の結果得られた８７％純度の蜜を６５Ｂｘに調整し、５０Ｌとした中から２５Ｌを結晶缶内に入れ８０℃にて８７Ｂｘまで濃縮し、種結晶スラリー０．２ｍＬを加え起晶させた。その後３時間かけ缶内の蒸発量に応じ残りの２５Ｌを徐々に加え煎糖した。得られた白下を５０Ｌ容助晶機内に移動させ、７０℃で４時間助晶後、バケット型遠心分離機により結晶と蜜を分離した。結晶の回収率は４４％で純度は９８％であった。分離された蜜の純度は８０％であったのでこれを二段階目の蜜が充分に集まるまで、２段階目の煎糖を繰り返し、得られた蜜を３段階目の結晶工程に用いた。
【００３１】
（３段階目）
５０Ｌ容量結晶缶内に２段階目結晶の結果得られた８０％純度の蜜を６５Ｂｘに調整し、５０Ｌとした中から２５Ｌを結晶缶内に入れ８０℃にて９０Ｂｘまで濃縮し、種結晶スラリー０．５ｍＬを加え起晶させた。その後６時間かけ缶内の蒸発量に応じ残りの２５Ｌを徐々に加え煎糖した。得られた白下を５０Ｌ容助晶機内に移動させ、７０℃で１２時間助晶後、バケット型遠心分離機により結晶と蜜を分離した。結晶の回収率は４３％で純度は９６％であった。この時の分離された蜜の純度は７１％であった（総回収率８３％）。
【００３２】
実施例２の試験番号ｂで得られた１−ケストース純度８６％溶液（１−ケストース溶液ｂ）および試験番号ｃで得られた１−ケストース純度８８％溶液（1−ケストース溶液ｃ）について、１段階目の条件の煎糖を行わずに、２段階目の作業を行った後、３段階目の条件の煎糖を行った。その結果を表４に示す。
【表４】
【００３３】
さらに、上記３段階目の条件で回収した結晶を再溶解し６５Ｂｘに調整したもの５０Ｌを用意し、これを結晶化母液として再結晶化を行った。上記１段階目の方法で煎糖を行った結果、結晶の回収率は、いずれも５２％で得られた結晶純度はいずれも９９％であった。さらに、この時の分離された蜜の純度はいずれも９３％であったため、さらなる煎糖も可能であることが認められた。
【００３４】
実施例４ 酵素の精製
参考例１で得た菌体１６５．５ｇを１Ｌの２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)に懸濁し、氷冷しながら超音波破砕機を用いて１０分間ずつ３回、計３０分間破砕処理した。破砕後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃）し、その上澄み液をろ過して菌体内抽出液（総タンパク；７７７ｍｇ、総活性；３９，９００Ｕ、比活性；５１．４Ｕ/ｍｇ）とした。
超音波破砕によって得られた菌体内抽出液に硫酸アンモニウムを加えて９０％飽和とし、４℃で一晩静置後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃）により沈殿物を回収した。
回収した沈殿物は、２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ダイアライシスメンブラン３６（和光純薬（株）製）を用い２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で２日間透析を行い、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃)して得られた上澄み液を粗酵素液とした。この粗酵素液（総タンパク；９６．９ｍｇ、総活性；１６，４００Ｕ、比活性；１７０Ｕ/ｍｇ）を２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの製造元：ファルマシアバイオケミカルズ社）に添加、吸着後、０〜１．０ＭのＮａＣｌの直線的濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；３５．１ｍｇ、総活性；７，３１０Ｕ、比活性２０８Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分を５０％飽和硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、同緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−６５Ｓカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌの製造元：東ソー（株））に添加、吸着させ、５０〜０Ｍの濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；２１．１ｍｇ、総活性６，０００Ｕ、比活性；２８４Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分を０．１Ｍ Ｎａｃｌ、２ｍＭメルカプトエタノールを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、同緩衝液で平衡化したＴｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５Ｓカラムに添加し溶出させ、活性区分（総タンパク量；１２．０ｍｇ、総活性；５，８２０Ｕ、比活性；４８５Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分を２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラムに添加、吸着させた後、０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線的濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；１１．０ｍｇ、総活性；５，１８０Ｕ、比活性；４７１Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分をvivaspinを用いて０．５ｍｌまで濃縮し、さらに５０％飽和硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。その後、同緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｉｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｓカラム（Ｐｈｅｎｉｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌの製造元：東ソー（株））に添加、吸着させた後、５０〜０Ｍの濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；３．９４ｍｇ、総活性；３，３７０Ｕ、比活性；８５５Ｕ/ｍｇ）を回収した。この段階でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、単一バンドが確認されたため最終精製酵素標品とした。
【００３５】
【表５】
【００３６】
実施例５ 一般性質
（ａ）分子量
最終精製酵素標品の分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で９６，０００、ゲルろ過クロマトグラフィーでは、分子量２７０，０００であった。
（ｂ）至適ｐＨ
酵素反応は、０．０７Ｕ酵素溶液０．０２ｍｌ、０．２Ｍショ糖溶液０．１ｍｌ、各ｐＨのMacllvain緩衝液（ｐＨ３．５〜７．５）０．０８ｍｌの計０．２ｍｌを４０℃で３０分間反応させ、生成した１−ケストースをＨＰＬＣを用いて定量し、各ｐＨに対する相対活性を求め、ｐＨ−活性曲線をプロットした。本酵素の至適ｐＨは５．１〜５．７の間であった。
（ｃ）至適温度
酵素反応は、０．０７Ｕ酵素溶液０．０２ｍｌ、０．２Ｍショ糖溶液０．１ｍｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）０．０８ｍｌの計０．２ｍｌを各温度で反応させ、相対活性を求め、温度活性曲線をプロットした。その結果、本酵素の至適温度は４５〜５５℃であった。
（ｄ）速度パラメーター
酵素反応は、０．０７Ｕ酵素溶液０．０２ｍｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ５．５）０．０８ｍｌ、各濃度のショ糖溶液０．１ｍｌの計０．２ｍｌを４０℃で３０分間反応させて行った。生成した１−ケストースをＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）により測定して、諸速度を計算し、Lineweaver-Burkプロットから速度パラメーターを求めた。本酵素のＫｍ値は０．１６Ｍ、Ｖｍａｘは８４２３μg/ml of protein/minであった。
【００３７】
実施例６（精製酵素による反応例）
ｐＨ６．４、温度４０℃に調整したショ糖溶液(濃度８０％(ｗ／ｖ))を１００ｍｌの反応槽に入れ、これを上記実験例４で精製した酵素をショ糖１ｇ当たり１．４Ｕ加え、３５時間反応させた後、温度８０℃、３０分間の酵素失活処理を行った（サンプル７）。この酵素失活液の糖組成（重量％）、酵素効率、Ｎ比を測定した。結果を表６および表７に示した。
【００３８】
【表６】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Aspergillus japonicus菌体由来の酵素により１−ケストースを製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィズス菌増殖能を有するフラクトオリゴ糖の機能が認知され久しいが、それを構成する糖がどのような特異性を有しているかの知見は必ずしも明らかでなかった。近年、ＦＯＳを構成する糖の中で１−ケストースがビフィズス菌増殖能につき特に強いこと（特許文献１）、コレステロール低減作用を有すること（特許文献２）、肌水分改善効果を有すること（特許文献３）などその特異性が明らかになりつつある。そこで１−ケストースの効率的な製造方法が待望されている。
【０００３】
１−ケストースの製造は、通常、ショ糖を原料（基質）とし微生物由来の酵素に反応させて、１−ケストースを産生させる。ここで、酵素に反応させた後の基質は、１−ケストース以外の糖も含んでいるため、通常、１−ケストースを結晶可能な純度に引き上げてクロマト分離する。さらに、必要に応じて、結晶化する。
ここで、酵素反応における構成糖の中で１−ケストースはもとより４糖類であるニストースの量は反応後におけるクロマト分離後の１−ケストース純度をある程度決定付け、さらには結晶回収工程での結晶量にも影響を与える。
したがって酵素反応の終点での１−ケストースとニストース合計量に対するニストースの比率（Ｎ比）を極力抑えることが求められる。
【０００４】
そこで、特許文献４には、S.brevicaulis（スコプラリオプシス・ブレビカウリス）を培養することにより、その培地に１−ケストースが蓄積することを利用し、その中の１−ケストースを精製結晶化する方法が述べられている。ここで、該文献に記載の方法は、醗酵法による１−ケストースの生産であり、反応糖組成中の１−ケストース濃度を充分上げることができる（全糖分当りケストース比率７８％、ニストース比率３％、したがって、したがってＮ比４％）。しかしながら、醗酵法であるがゆえに基質濃度が低く、通常、２０％（ｖ／ｗ）以下である。また、ジャーファーメンターによる１バッチ当りの生産に７２時間以上を要するため、装置当りの生産性が低く工業的に利用するには問題が多い。さらにまたその後の精製工程でも醗酵法であるがゆえに培地成分を取り除く必要性などの煩雑性を伴う。
【０００５】
一方、特許文献５にはS.brevicaulis（スコプラリオプシス・ブレビカウリス）（ＩＦＯ４８３４株）から酵素を抽出し、その抽出酵素を用いる方法が記載されている。しかしながら、乾燥菌体当りの力価が８Ｕと低く、酵素効率が４ｇと実際に利用するには問題が多い。
また、該特許文献５には、P.roaueforti（ペニシリウム・ロックフォルティー）（ＩＡＭ７２５４株）由来の酵素を用いた反応が記載されている。しかしながら、酵素効率が１４ｇと低い。
さらにまた、該特許文献５には、A.niger（アスペルギルス・ニガー）（ＡＴＣＣ２０６１１株）由来菌体酵素を用いた方法も記載されている。しかしながら、これらの例示については、酵素効率が高い場合（４６７０ｇ／乾燥菌体１ｇ）、Ｎ比が高くなってしまう（２３％）。一方、Ｎ比を低くすると（１４％）、酵素効率が低くなる（２３３ｇ／乾燥菌体１ｇ）。つまり、Ｎ比を低くしようとすると、反応ｐＨをアルカリ側に移動させなければならず、結果として、至適ｐＨから大きく外れた状態で利用しなければならなくなる。つまり、実質的には採用できない。
【０００６】
また、非特許文献１には、A.phoenicis（アスペルギルス・ホエニシス）由来酵素を用いる方法が提唱されている。ここで、該非特許文献１の図５の記載における６０℃、基質濃度１２．５％、３０分後のオリゴ糖生産量から、該菌の力価は、乾燥菌体当たり８００Ｕと推定でき、すなわち、基質当りの酵素使用量は１．９Ｕと算出できる。よって、酵素効率は４２１（ｇ／乾燥菌体１ｇ）となる。このように、酵素効率が低いと工業的に利用できない。
【０００７】
すなわち、Ｎ比を低く保ち且つ酵素効率の高い１−ケストース産生菌および酵素が見出されていないのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−３０６７８１号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７７５２号公報
【特許文献３】特開２００５−３５０４４４号公報
【特許文献４】特公平６−７００７５号公報
【特許文献５】特許第３４５９２６４号公報
【非特許文献１】Appl.Microbial Biotechnol35,1991,216-221
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記課題を解決することを目的としたものであって、Ｎ比が低く、かつ、酵素効率が高い１−ケストースの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題のもと、発明者が鋭意検討を行った結果、下記手段により上記課題を解決しうることを見出した。
（１）Aspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を用いることを含む、１−ケストースの製造方法。
（２）ショ糖を基質としてAspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を反応させることを含む、１−ケストースの製造方法。
（３）酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、（２）に記載の１−ケストースの製造方法。
（４）Ｎ比が、２２％以下である、（２）または（３）に記載の１−ケストースの製造方法。
（５）反応温度が５５℃以下である、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
（６）前記ショ糖は溶媒中に含まれており、該溶媒のｐＨは５．５〜８である、（２）〜（５）のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
（７）前記溶媒中におけるショ糖の初期濃度は、７０〜１００％（Ｗ／Ｖ）である、（６）に記載の１−ケストースの製造方法。
（８）Aspergillus japonicus菌体を用いることを含む、１−ケストース産生酵素の製造方法。
（９）Aspergillus japonicus菌体由来の１−ケストース産生酵素。
（１０）酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、（９）に記載の酵素。
（１１）Ｎ比が、２２％以下である、（９）または（１０）に記載の酵素。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、高い効率で１−ケストースを産生することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
【００１３】
本明細書におけるＮ比とは、菌体または菌体由来の酵素を、基質に反応させた終点における１−ケストースとニストースの合計に対するニストースの割合（重量比）をいう。
また、本発明における酵素効率とは、乾燥菌体１ｇが処理できる基質（ショ糖）の量（ｇ）をいい、菌体由来の酵素を用いる場合も菌体あたりに換算して示している。酵素力価Ｕは、乾燥菌体１ｇ（または）これに相当する量の酵素を、４０℃、１０％ショ糖溶液中で、３０分間反応させたときに、１分当りに産生された１−ケストースの量をμモルで表示したものをいう。
また、乾燥菌体とは、培養し洗浄した後の菌を乾燥させたものをいう。
【００１４】
本発明では、Aspergillus japonicus （以下、「A.japonicus」と略することがある）の乾燥菌体を用いる。本発明で用いる、A.japonicus菌体は、好ましくはA.japonicus NBRC4060である。A.japonicus を用いることにより、高い酵素効率を有し、かつ、Ｎ比を低くすることができる。
本発明の１−ケストースの製造方法を採用することにより、例えば、酵素効率は、５００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上、さらには１０００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上、よりさらには２０００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上、特には３５００（ｇ／乾燥菌体１ｇ）以上とすることができる。一方、Ｎ比は、例えば２２％以下、さらには２０％以下、特には１５％以下とすることができる。
【００１５】
本発明で用いる、A.japonicus菌体の培養方法としては公知の方法を用いることができる。
培地の組成としては、炭素源として、好ましくはショ糖を、好ましくは５〜３５％、より好ましくは１５〜３０％を、窒素源として、好ましくは酵母エキスを、好ましくは１〜３％、より好ましくは１．５〜２％を含むものである。さらに、その他微量成分として無機成分等を通常の範囲で含んでいることが好ましい。培地のｐＨは、滅菌前で、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくはｐＨ６〜７である。
本発明で用いる、A.japonicus菌体の培養条件としては、例えば、２０〜３０℃で、４０〜７２時間培養することができる。
【００１６】
培養して得られたA.japonicus菌体の回収方法としては、公知の方法を採用できるが、例えば、遠心分離により菌体を分取し洗浄して回収することがあげられる。ここで、菌体の洗浄は、得られた菌体の少なくとも２倍量の水を用いた洗浄が好ましい。
【００１７】
本発明の方法では、ショ糖を基質として、A.japonicus菌体またはA.japonicus菌体由来の酵素を反応させることが好ましい。
本発明の製造方法では、基質を溶媒に含めた状態でA.japonicus菌体またはA.japonicus菌体由来の酵素を反応させることが好ましい。ここで溶媒としては、水、あるいはエチルアルコールを微量（０．５〜２％程度）含んだ水等が挙げられる。
溶媒中における基質中のショ糖の初期濃度は、好ましくは７０〜１００％（Ｗ／Ｖ）であり、より好ましくは７７〜８６％（Ｗ／Ｖ）であり、さらに好ましくは８０％である。このような範囲とすることにより、より効果的に１−ケストースを産生できる。また、溶媒中には、ショ糖以外に、他の成分、ｐＨ調整剤、あるいはエチルアルコール等を含めても良い。
【００１８】
基質を含む溶媒（反応液）のｐＨは、好ましくは５．５〜８であり、より好ましくは６〜７である。
基質を反応させる際の温度（反応液の温度）は、好ましくは５５℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。下限は特に定めるものではないが、例えば、３０℃以上、好ましくは４０℃以上である。
【００１９】
本発明では、上記基質中で、A.japonicus菌体またはA.japonicus菌体由来の酵素を反応させることにより、１−ケストースと共に副成分（ニストース等）が産生される。本発明では１−ケストースと他の成分を含む混合液として用いてもよいが、好ましくは、１−ケストースを精製する。
１−ケストースの精製方法としては、公知の方法を採用できる。
例えば、クロマト分離（より具体的には、陽イオン交換樹脂を分離担体とする擬似移動床式２成分クロマト分離装置による分離等）により、分離することができる。この場合、クロマト分離は、１段階分離であってもよいし、２段階以上の分離であってもよい。
さらに、クロマト分離を行ったものについて結晶化を行っても良い。
このような分離作業を行うことにより、純度が、例えば９０％以上、さらには９５％以上、特には、９８％以上の純度で回収することができる。
【００２０】
本発明では、A.japonicus菌体をそのまま用いて１−ケストースを製造してもよいが、好ましくは、A.japonicus菌体由来の酵素（１−ケストース産生酵素）を用いて製造することが好ましい。
酵素の精製は、公知の方法に従って行うことができる。
本発明のA.japonicus菌体由来の精製酵素は、例えば、ｐＨが５．１〜５．７、４５〜５５℃で特に良好に1−ケストースを産生する。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００２２】
参考例１（Aspergillus japonicusの培養）
水に、ショ糖３０％、酵母エキス１．５％、リン酸１カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０３％、炭酸カルシウム０．１％の割合となるように添加した。この液を３０Ｌジャーファーメンターに入れ、ｐＨが６．５になるように調整した（総量２０Ｌ）。その後、１２０℃で２０分間滅菌した。
また、Aspergillus japonicus（ＮＢＲ４０６０）を上記と同じ組成の培地２００ｍｌが入った１Ｌの三角フラスコに接種し２４時間振倒培養したものを別に用意し、これを上記培地に接種し２５℃で通気量０．４ｖｖｍで４８時間培養した。
培養終了後にバスケット遠心分離機を用いて培養液から菌体を分離し、約２Ｌの水で洗浄後６００ｇ（湿菌重）を回収した。本菌体内に含まれる酵素力価は、乾燥菌体１ｇ当たり５，１００Ｕであった。
以下の実験は、この菌体を用いて行った。
【００２３】
実施例１
ｐＨ６．５、温度４０℃に調整したショ糖溶液（濃度７７％（Ｗ／Ｖ））を、１，０００Ｌの反応槽に入れ、これに上記参考例１で調整した菌体酵素をショ糖１ｇ当り１．８Ｕ加え、３５時間反応させた後、温度８０℃、３０分間の酵素失活処理を行った（サンプル１）。この失活液の糖組成（重量％）、酵素効率（乾燥菌体１ｇ当りのショ糖の処理量（ｇ））、Ｎ比をそれぞれ測定した。結果を表２に示した。また、ショ糖溶液の濃度、ｐＨ、温度を表１のように変更し、さらに、菌体酵素量および酵素処理反応時間も表１のように変更したほかは、上記と同様サンプル１と同様に行ってサンプル２〜６を得た。これらの失活液の糖組成、酵素効率およびＮ比結果も表２に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
実施例２
４塔４層方式による２成分擬似移動床のクロマト分離装置（１ｍ3）（三菱化学エンジニアリング（株）製、Ｍ６ＮＹＥ００）を用いて実施例１のサンプル１で得られた反応液を８０℃、５５Ｂｘに調整し、負荷量０．０５Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈｒおよび溶離水を負荷量の５倍量用い、１−ケストース区分を回収した。回収率８５％で純度８３％の１−ケストース区分（試験番号ａ−１）を得ることができた。
さらに、得られた１−ケストース回収区分を６０Ｂｘ、８０℃に調整後クロマト装置の分離条件を負荷量０．０４Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈｒ、溶離水を負荷量の５倍量を用い再度クロマト分離を行った。その結果、１−ケストース回収率７５％で純度９２％の１−ケストース区分を得ることができた（総回収率６４％）（試験番号ａ−２）。
【００２７】
また、サンプルの種類、負荷量、溶離水量を表３に記載のとおり変更し、他は同様に行った。これらの結果も表３に示した（試験番号ｂ〜ｄ）。尚、溶離水量は、溶離水を負荷量に対する量（倍量）で示している。
【００２８】
【表３】
【００２９】
実施例３
下記１段階目〜３段階目の結晶回収操作を行った。
（１段階目）
５０Ｌ容量結晶缶に実施例２の試験番号ａで得られた１−ケストース純度９２％溶液（１−ケストース溶液ａ−２）を６５Ｂｘに５０Ｌ調整し、その半分の２５Ｌを入れた。８０℃にて８５Ｂｘまで濃縮し、種結晶スラリーを加え起晶させた。その後２時間かけて缶内の蒸発量に応じ残りの２５Ｌを徐々に加え煎糖した。得られた白下を５０Ｌ助晶機内に移動させ、７０℃で２時間助晶後、バケット型遠心分離機により分離した。結晶の回収率は４５％で純度は９９％であった。分離された蜜の純度は８７％であったのでこの１段階目の蜜が充分に集まるまで繰り返し、以下２段階目の結晶回収を行った。
【００３０】
（２段階目）
５０Ｌ容量結晶缶内に１段階目結晶回収の結果得られた８７％純度の蜜を６５Ｂｘに調整し、５０Ｌとした中から２５Ｌを結晶缶内に入れ８０℃にて８７Ｂｘまで濃縮し、種結晶スラリー０．２ｍＬを加え起晶させた。その後３時間かけ缶内の蒸発量に応じ残りの２５Ｌを徐々に加え煎糖した。得られた白下を５０Ｌ容助晶機内に移動させ、７０℃で４時間助晶後、バケット型遠心分離機により結晶と蜜を分離した。結晶の回収率は４４％で純度は９８％であった。分離された蜜の純度は８０％であったのでこれを二段階目の蜜が充分に集まるまで、２段階目の煎糖を繰り返し、得られた蜜を３段階目の結晶工程に用いた。
【００３１】
（３段階目）
５０Ｌ容量結晶缶内に２段階目結晶の結果得られた８０％純度の蜜を６５Ｂｘに調整し、５０Ｌとした中から２５Ｌを結晶缶内に入れ８０℃にて９０Ｂｘまで濃縮し、種結晶スラリー０．５ｍＬを加え起晶させた。その後６時間かけ缶内の蒸発量に応じ残りの２５Ｌを徐々に加え煎糖した。得られた白下を５０Ｌ容助晶機内に移動させ、７０℃で１２時間助晶後、バケット型遠心分離機により結晶と蜜を分離した。結晶の回収率は４３％で純度は９６％であった。この時の分離された蜜の純度は７１％であった（総回収率８３％）。
【００３２】
実施例２の試験番号ｂで得られた１−ケストース純度８６％溶液（１−ケストース溶液ｂ）および試験番号ｃで得られた１−ケストース純度８８％溶液（1−ケストース溶液ｃ）について、１段階目の条件の煎糖を行わずに、２段階目の作業を行った後、３段階目の条件の煎糖を行った。その結果を表４に示す。
【表４】
【００３３】
さらに、上記３段階目の条件で回収した結晶を再溶解し６５Ｂｘに調整したもの５０Ｌを用意し、これを結晶化母液として再結晶化を行った。上記１段階目の方法で煎糖を行った結果、結晶の回収率は、いずれも５２％で得られた結晶純度はいずれも９９％であった。さらに、この時の分離された蜜の純度はいずれも９３％であったため、さらなる煎糖も可能であることが認められた。
【００３４】
実施例４ 酵素の精製
参考例１で得た菌体１６５．５ｇを１Ｌの２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)に懸濁し、氷冷しながら超音波破砕機を用いて１０分間ずつ３回、計３０分間破砕処理した。破砕後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃）し、その上澄み液をろ過して菌体内抽出液（総タンパク；７７７ｍｇ、総活性；３９，９００Ｕ、比活性；５１．４Ｕ/ｍｇ）とした。
超音波破砕によって得られた菌体内抽出液に硫酸アンモニウムを加えて９０％飽和とし、４℃で一晩静置後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃）により沈殿物を回収した。
回収した沈殿物は、２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ダイアライシスメンブラン３６（和光純薬（株）製）を用い２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で２日間透析を行い、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃)して得られた上澄み液を粗酵素液とした。この粗酵素液（総タンパク；９６．９ｍｇ、総活性；１６，４００Ｕ、比活性；１７０Ｕ/ｍｇ）を２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの製造元：ファルマシアバイオケミカルズ社）に添加、吸着後、０〜１．０ＭのＮａＣｌの直線的濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；３５．１ｍｇ、総活性；７，３１０Ｕ、比活性２０８Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分を５０％飽和硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、同緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−６５Ｓカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌの製造元：東ソー（株））に添加、吸着させ、５０〜０Ｍの濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；２１．１ｍｇ、総活性６，０００Ｕ、比活性；２８４Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分を０．１Ｍ Ｎａｃｌ、２ｍＭメルカプトエタノールを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、同緩衝液で平衡化したＴｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５Ｓカラムに添加し溶出させ、活性区分（総タンパク量；１２．０ｍｇ、総活性；５，８２０Ｕ、比活性；４８５Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分を２ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラムに添加、吸着させた後、０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線的濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；１１．０ｍｇ、総活性；５，１８０Ｕ、比活性；４７１Ｕ/ｍｇ）を回収した。
この活性区分をvivaspinを用いて０．５ｍｌまで濃縮し、さらに５０％飽和硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。その後、同緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｉｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｓカラム（Ｐｈｅｎｉｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌの製造元：東ソー（株））に添加、吸着させた後、５０〜０Ｍの濃度勾配により溶出させ、活性区分（総タンパク量；３．９４ｍｇ、総活性；３，３７０Ｕ、比活性；８５５Ｕ/ｍｇ）を回収した。この段階でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、単一バンドが確認されたため最終精製酵素標品とした。
【００３５】
【表５】
【００３６】
実施例５ 一般性質
（ａ）分子量
最終精製酵素標品の分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で９６，０００、ゲルろ過クロマトグラフィーでは、分子量２７０，０００であった。
（ｂ）至適ｐＨ
酵素反応は、０．０７Ｕ酵素溶液０．０２ｍｌ、０．２Ｍショ糖溶液０．１ｍｌ、各ｐＨのMacllvain緩衝液（ｐＨ３．５〜７．５）０．０８ｍｌの計０．２ｍｌを４０℃で３０分間反応させ、生成した１−ケストースをＨＰＬＣを用いて定量し、各ｐＨに対する相対活性を求め、ｐＨ−活性曲線をプロットした。本酵素の至適ｐＨは５．１〜５．７の間であった。
（ｃ）至適温度
酵素反応は、０．０７Ｕ酵素溶液０．０２ｍｌ、０．２Ｍショ糖溶液０．１ｍｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）０．０８ｍｌの計０．２ｍｌを各温度で反応させ、相対活性を求め、温度活性曲線をプロットした。その結果、本酵素の至適温度は４５〜５５℃であった。
（ｄ）速度パラメーター
酵素反応は、０．０７Ｕ酵素溶液０．０２ｍｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ５．５）０．０８ｍｌ、各濃度のショ糖溶液０．１ｍｌの計０．２ｍｌを４０℃で３０分間反応させて行った。生成した１−ケストースをＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）により測定して、諸速度を計算し、Lineweaver-Burkプロットから速度パラメーターを求めた。本酵素のＫｍ値は０．１６Ｍ、Ｖｍａｘは８４２３μg/ml of protein/minであった。
【００３７】
実施例６（精製酵素による反応例）
ｐＨ６．４、温度４０℃に調整したショ糖溶液(濃度８０％(ｗ／ｖ))を１００ｍｌの反応槽に入れ、これを上記実験例４で精製した酵素をショ糖１ｇ当たり１．４Ｕ加え、３５時間反応させた後、温度８０℃、３０分間の酵素失活処理を行った（サンプル７）。この酵素失活液の糖組成（重量％）、酵素効率、Ｎ比を測定した。結果を表６および表７に示した。
【００３８】
【表６】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Aspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を用いることを含む、１−ケストースの製造方法。
【請求項２】
ショ糖を基質としてAspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を反応させることを含む、１−ケストースの製造方法。
【請求項３】
酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、請求項２に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項４】
Ｎ比が、２２％以下である、請求項２または３に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項５】
反応温度が５５℃以下である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項６】
前記ショ糖は溶媒中に含まれており、該溶媒のｐＨは５．５〜８である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項７】
前記溶媒中におけるショ糖の初期濃度は、７０〜１００％（Ｗ／Ｖ）である、請求項６に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項８】
Aspergillus japonicus菌体を用いることを含む、１−ケストース産生酵素の製造方法。
【請求項９】
Aspergillus japonicus菌体由来の１−ケストース産生酵素。
【請求項１０】
酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、請求項９に記載の酵素。
【請求項１１】
Ｎ比が、２２％以下である、請求項９または１０に記載の酵素。
【請求項１】
Aspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を用いることを含む、１−ケストースの製造方法。
【請求項２】
ショ糖を基質としてAspergillus japonicus菌体またはAspergillus japonicus菌体由来の酵素を反応させることを含む、１−ケストースの製造方法。
【請求項３】
酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、請求項２に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項４】
Ｎ比が、２２％以下である、請求項２または３に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項５】
反応温度が５５℃以下である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項６】
前記ショ糖は溶媒中に含まれており、該溶媒のｐＨは５．５〜８である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項７】
前記溶媒中におけるショ糖の初期濃度は、７０〜１００％（Ｗ／Ｖ）である、請求項６に記載の１−ケストースの製造方法。
【請求項８】
Aspergillus japonicus菌体を用いることを含む、１−ケストース産生酵素の製造方法。
【請求項９】
Aspergillus japonicus菌体由来の１−ケストース産生酵素。
【請求項１０】
酵素効率が、５００ｇ／乾燥菌体１ｇ以上である、請求項９に記載の酵素。
【請求項１１】
Ｎ比が、２２％以下である、請求項９または１０に記載の酵素。
【公開番号】特開２００７−２８９１２８（Ｐ２００７−２８９１２８Ａ）
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２３６１７（Ｐ２００６−１２３６１７）
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（３９００２２９５４）ホクレン農業協同組合連合会 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（３９００２２９５４）ホクレン農業協同組合連合会 (14)
【Ｆターム（参考）】
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