１塩基多型の検出法
【課題】本発明は、核酸の１塩基多型の検出方法を提供する。
【解決手段】核酸の1塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡ(locked nucleic acid)を含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む、方法。
【解決手段】核酸の1塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡ(locked nucleic acid)を含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の１塩基多型の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子型を核酸レベルで識別する様々な方法が開発され、医学、法医学、農学などの分野で利用されている。農業分野では品種の識別や育種における選抜マーカーあるいは病害の診断などで実用に使われ効力を発揮している。このうち核酸の１塩基多型、例えば１塩基置換は、頻度高く存在するので利用価値が高い反面、検出に特別な機器を必要とするか、あるいは煩雑な手順を必要とするなどの課題がある。
【０００３】
ＬＮＡ(locked nucleic acid)は、ＤＮＡに比較して相補的な塩基との水素結合が強固になる特徴を有している（特許文献１、２）。このように塩基特異性の向上が期待されるので、ＰＣＲ反応により１塩基多型を検出する方法の検討がなされ（特許文献３、４）、後述のようないくつかの方法が考案されている。（ｉ）通常のＰＣＲ反応で増幅した核酸について、６〜７塩基からなるＬＮＡプローブとのハイブリダイゼーションのしやすさを検出する方法（非特許文献１）。（ｉｉ）プライマーの中央当たりに１〜数塩基のＬＮＡ塩基を入れることによりＰＣＲを行う方法（非特許文献２）。（ｉｉｉ）プライマーの３’端に検出すべき多型塩基を配置しこの位置にＬＮＡ塩基を用いたプライマーを使ったＰＣＲ反応による方法（非特許文献３、４）。（ｉｖ）検出すべき多型をプライマーの３’末端に配置し、これより１塩基内側の塩基にＬＮＡを用いたプライマーによるＰＣＲによる方法。このＰＣＲの場合プルーフリーディング酵素を利用しないと検出できないことが記載されている（非特許文献５）。
【０００４】
１塩基多型を検出する場合、これら各種の方法のうち、例えば通常のＰＣＲ反応により検討している（ｉｖ）の方法を実際に用いてみると、特異性が十分ではないか、あるいは、特異性はみられるがＬＮＡをプライマー内に含むことが要因でＰＣＲ反応の増幅効率が低く、そのためＰＣＲサイクル数増加や試薬量増量等の対策で増幅効率を向上しようとすると、代わりに特異性が減じてしまうことがあり、いずれにせよ多型を区別することが困難となる課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO02/018388
【特許文献２】特表2002-521310
【特許文献３】特表2002-539801
【特許文献４】特表2005-514005
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nucleic Acids Research (2002),30:e91
【非特許文献２】Mol Cell Probes (2003) 17:253-259
【非特許文献３】Plant Methods (2007) 3 :2(http://www.plantmethods.com/content/3/1/2)
【非特許文献４】Human mutation (2003) 22:79-85
【非特許文献５】Nucleic Acids Research (2004),32:e32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、１塩基置換の簡便な検出は頻度高く存在する多型を利用するために重要な技術である。ＬＮＡの利用はこのような１塩基置換の検出を実現すると期待されるが、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用しようとすると特異性と増幅効率両方を満足させることができない場合が多い。また、１塩基挿入や１塩基欠失の検出は、１塩基置換に比べさらに特異性をもたせることが困難である。
【０００８】
本発明は、１塩基多型、特に１塩基置換、１塩基挿入および１塩基欠失、のＰＣＲによる通常の増幅効率を維持もしくは向上させながら高い特異性を付与する検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はこのような従来の問題に鑑み、一般化しているＰＣＲ反応を用い、従前に比べ特異性を減じることなく十分な増幅を確保し簡便に１塩基多型、例えば１塩基置換、１塩基欠失あるいは１塩基挿入、を検出する方法を提供する。目的とする１塩基多型に特異的な核酸断片を増幅するためのプライマー対と、目的とする１塩基多型を含む核酸断片を増幅するためのプライマー対とを添加し、ＰＣＲ反応により該核酸断片の鋳型を増幅しながら、同時に、目的とする１塩基多型に特異的なＰＣＲ反応を行うことが可能である。このようにして特異性を確保した上で増幅効率を向上することが達成される。
【００１０】
本発明の特徴は、プライマーの特定の位置にＬＮＡを含み、かつ、核酸の１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基からなるプライマーを含む、合計３種以上の１０〜５０塩基からなるプライマーを用いたＰＣＲ反応により１塩基多型を検出することにある。本発明を利用することにより、１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、マイクロサテライトの多型などの1塩基多型を、通常のＰＣＲ反応とそれに続く増幅産物の解析により特異的に検出することが可能となる。
【００１１】
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
すなわち、本発明は、その一態様において、核酸の1塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む方法を提供する。１塩基多型の検出のためには、例えば電気泳動法などの、増幅核酸断片のサイズに基づく方法を使用できる。また、プライマーに蛍光標識を付けることで識別する等の方法も使用できる。
【００１２】
その実施形態において、上記１塩基多型が、１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型である。
【００１３】
別の実施形態において、上記1塩基多型部位において他の多型を示す核酸断片を増幅するための第４のプライマーをさらに含み、該第４のプライマーは、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、上記第２の１塩基多型の塩基に相当する塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなるプライマーであり、上記第２、第３等の複数のプライマーのうち適するプライマーとプライマー対を形成することができるプライマーである。
【００１４】
別の実施形態において、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の上記１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。
【００１５】
上記１塩基多型が１塩基欠失である場合、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の該１塩基欠失部位の３’側の１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。
【００１６】
別の実施形態において、上記１塩基多型が連続同一塩基からなる配列の多型である場合、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の該連続同一塩基の３’側に隣接する１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、少なくとも上記第１のプライマーの３’末端および上記核酸の該連続同一塩基の両端の塩基、および該連続同一塩基の５’側に隣接する１番目の塩基である。
【発明の効果】
【００１７】
１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型を通常のＰＣＲで十分な正確さと感度で検出可能とするには、特異性を維持しつつ増幅を確保する必要がある。本発明は、ＰＣＲ反応により、鋳型ＤＮＡを増幅しながら目的とする１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型などの１塩基多型を特異的にかつ高精度で検出することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】トマトのｄｇ変異の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌａはアデニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｇはグアニンを塩基としたＬＮＡを表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。
【図２】酵母のｆｌｏ８遺伝子変異の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｃはシトシンを塩基としたＬＮＡを表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。プライマー２種では、プライマー５とプライマー７を使用し、プライマー３種では、プライマー５、プライマー６、プライマー７を使用した。
【図３】酵母野生型ＦＬＯ８遺伝子の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｇはグアニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｔはチミンを塩基としたＬＮＡをそれぞれ表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。プライマー２種では、プライマー６とプライマー８を使用し、プライマー３種では、プライマー５、プライマー６、プライマー８を使用した。
【図４】トマトの野生型リコピンβ−シクラーゼ遺伝子の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｃはシトシンを塩基としたＬＮＡ、Ｌａはアデニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｔはチミンを塩基としたＬＮＡをそれぞれ表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。
【図５】トマトｏｇｃ変異遺伝子および野生型リコピンβ−シクラーゼ遺伝子の同時検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｃはシトシンを塩基としたＬＮＡ、Ｌａはアデニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｔはチミンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｇはグアニンを塩基としたＬＮＡをそれぞれ表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施の形態について説明する。
本明細書で使用する用語は、以下の定義を包含する。
【００２０】
「核酸」は、１本鎖または２本鎖のいずれでもよく、および、ＤＮＡまたはＲＮＡを表す。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含み、ＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。
【００２１】
「１塩基多型」(ＳＮＰ；single nucleotide polymorphism)は、核酸の塩基配列の中のある１塩基に変異（特に、置換）があることをいい、置換、欠失、付加または挿入により生じる。例えば、個体差（例えばヒトでは、個人差、人種間の差異など）の比較や病気の罹りやすさに関わるジェノタイピング(genotyping)のためにその検出が利用される。
【００２２】
「ＬＮＡ」(locked nucleic acid)は、リボ核酸の４’−Ｃ位と２’−Ｏ位との間にメチレン架橋が形成された２つの環状構造を有する核酸アナログである。
【００２３】
「マイクロサテライト」は、特に真核生物のゲノム上において見られる、モノ、ジ、トリ、テトラ、ペンタまたはヘキサヌクレオチド、などの繰り返しからなるポリヌクレオチドの配列を指す。
【００２４】
「相補的塩基」は、センス鎖上の特定の塩基と対合することができるアンチセンス鎖上の塩基をいう。
【００２５】
「センスプライマー」および「アンチセンスプライマー」はそれぞれ、核酸のセンス鎖配列の一部と同等の塩基配列からなるプライマー、核酸のアンチセンス鎖配列の一部と同等の塩基配列からなるプライマーをいう。
【００２６】
本発明を以下においてさらに詳細に説明する。
上記のとおり、本発明は、核酸の１塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の方法では、３種以上、例えば３種または４種、のプライマーを使用する。プライマーは、(i) 少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む第１のプライマーであって、適するサイズの核酸断片の増幅を可能にする１種類以上のプライマー、および(ii) 該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な第２、第３等のプライマーであって、適するサイズの核酸断片の増幅を可能にする２種類以上のプライマー、を含む。ここで、第２および第３のプライマーは互いに対向し、核酸断片の増幅を可能にするプライマーであり、第１のプライマーは第２または第３のプライマーのいずれかと対向し、核酸断片の増幅を可能にするプライマーである。
【００２８】
上記プライマーの他に、(iii)該１塩基多型部位において他の多型を有する核酸断片を増幅するための第４のプライマーをさらに含むことができる。この第４のプライマーは、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、上記１塩基多型の塩基に相当する塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含むプライマーであり、上記第２および第３のプライマーのうち適するプライマーとプライマー対を形成することができるプライマーである。
【００２９】
上記(i)、(ii)および(iii)のプライマーは、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１７〜２５塩基の塩基長を有する。具体的には、プライマーは、例えば図１〜図５に記載されるように、野生型核酸または変異型核酸に対して配置される３種または４種のプライマーとして設計され得る。
【００３０】
本発明では、増幅産物（すなわち、増幅核酸断片）は、そのサイズに基づく方法、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの電気泳動、ゲルろ過などのサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど、を利用して検出することが好ましい。例えば電気泳動法の場合、増幅産物のラダーを得たのち、臭化エチジウム染色にてバンドを検出することができる。上記検出法の場合、変異型核酸の増幅産物と野生型核酸の増幅産物の各バンドの位置が視覚的に差異を有するべきであり、これによって増幅産物のバンド位置から変異型か野生型かを識別することが可能である(図１Ｂ、図２Ｂなど)。したがって、プライマーの設計の際には、増幅産物のサイズを考慮しながらプライマーのアニーリング位置および配列を決定することが望ましい。各プライマー対は、限定されないが、例えば、１塩基多型部位を挟む約１００ｂｐ〜約３，０００ｂｐ、好ましくは約２００ｂｐ〜約１，０００ｂｐの核酸断片を増幅できるように設計される。
【００３１】
核酸は、上記定義のとおりＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、またＲＮＡの場合にはｃＤＮＡに変換されてもよく、さらにまたそれらの由来も特に制限されないものとし、動物、植物、微生物などを含むあらゆる生物由来、またはウイルス由来、の核酸である。被検用核酸は、生物の細胞、組織または体液、ウイルス粒子などから公知の手法によって調製することができる。ＤＮＡの場合、例えばフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって得ることができるし、ＲＮＡの場合、例えばＳＤＳ／フェノール、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールなどによる抽出とエタノール沈殿によって得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出のためのキットが市販されているため、そのような抽出キットを使用してもよい。
【００３２】
本発明で特徴的なプライマーは、ＬＮＡを含む第１のプライマーである。
本発明の実施形態において、上記第１のプライマーは、その３’末端が、上記核酸の上記１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。このようなプライマーの例は、図１のプライマー３または図２のプライマー７である。この場合、１塩基多型は、例えば１塩基置換または１塩基挿入であり、この場合、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基がプライマーの３’末端に配置される。プライマーは、センスプライマー、アンチセンスプライマー、またはその両方である。
【００３３】
上記第１のプライマーの特定例において、上記１塩基多型が１塩基欠失である場合、上記第１のプライマーは、その３’末端に配置された、欠失の結果元の配列とずれが生じてしまう塩基から数えて少なくとも２番目の塩基をＬＮＡとして含むことができる。言い換えれば、この例の第１のプライマーは、その３’末端が、上記核酸の該１塩基欠失部位の３’側の１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。
【００３４】
あるいは、上記１塩基多型が連続同一塩基からなる配列の多型である場合、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の該連続同一塩基の３’側に隣接する１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、少なくとも上記第１のプライマーの３’末端および上記核酸の該連続同一塩基の両端の塩基、および該連続同一塩基の５’側に隣接する１番目の塩基である。このようなプライマーの例は、図４のプライマー１１、図５のプライマー１１、１２である。図５の例では、同一塩基の繰り返しからなるマイクロサテライトの配列における同一塩基の挿入（Ａｘ９）または欠失（Ａｘ８）が検出されうることが示されている（例えば、図５Ｂの野生型遺伝子の増幅ＤＮＡバンドとｏｇｃ遺伝子の増幅ＤＮＡバンドの比較）。
【００３５】
上記のとおり、本発明の上記(ii)のプライマーは、核酸の１塩基多型部位もしくはその相補的部位を含む第１のプライマーを挟むように設計された少なくとも２種のプライマーであり、それらはともにプライマー対を構成する。また、それらのいずれか片方は上記(i)の第１のプライマーとともにプライマー対を構成する。例えば図１の場合、上記(i)の第１のプライマーはプライマー３であり、上記(ii)の第２および第３のプライマーはプライマー１とプライマー２であり、上記(iii)のプライマーはプライマー４である。
【００３６】
増幅産物は、プライマー１とプライマー２、プライマー１とプライマー３、およびプライマー２とプライマー４、のそれぞれのプライマー対から増幅される３つのバンドによって示される（図１Ｂ）。
【００３７】
本発明で使用されるプライマーは、上記(ii)のプライマーの場合、ホスホアミダイト法などのポリヌクレオチドの合成法を応用した市販の自動核酸合成機を使用することによって作製されうるし、また、上記(i)、(iii)および（ｉｖ）のプライマーの場合も、同様に、ホスホアミダイト化学を用いて作製可能であるし、自動合成も可能である。なお、プライマーに含まれるＬＮＡは市販されており、また、ＬＮＡを含むポリヌクレオチドの受託合成も行われている。
【００３８】
本発明の方法の手順の例は、まず、検出すべき１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、マイクロサテライトの多型などの１塩基多型を含む核酸試料を調製する。試料となる核酸は生物またはウイルスに由来するサンプルから抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡであるが、ＲＮＡの場合は逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し用いてもよい。核酸の抽出方法は、上記の公知の手法を利用しうる。ｃＤＮＡ合成も以降のＰＣＲ反応が起こる限りどのような方法を利用してもよい。次に、試料となるＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型に用い、目的とする１塩基多型に特異的なＤＮＡ断片を増幅させるためのプライマー対および目的とするＤＮＡ断片を含む断片を増幅するためのプライマー対を使用してＰＣＲ増幅反応を行う。
【００３９】
ＰＣＲの反応条件としては、通常利用される条件を使用することができる。ＰＣＲ反応は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する酵素反応であり、反応に必要な成分には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他に、ＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（例えば、約ｐＨ８．３）、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２を含有する）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、ＰＣＲプライマー、鋳型核酸（通常、ＤＮＡ）が含まれる。プライマーの性状により温度条件が、増幅されるＤＮＡ断片の長さにより時間が、期待する増幅の量によりサイクル数が、それぞれ設定される。また、用いるＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲ用に利用される耐熱性酵素であればいずれを用いてもよい。そのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなどが含まれる。このような耐熱性酵素は市販されているので、それらをＰＣＲ法に使用することができる。
【００４０】
ＰＣＲ反応は、市販のサーマルサイクラー装置を使用し、反応条件を設定することによって行うことができる。反応サイクルの前に、９４℃〜９６℃で約１分〜約５分の加熱変性処理を行ったのちに、変性（９４℃〜９６℃で１０秒〜６０秒）、アニーリング（５５℃〜６５℃で１０秒〜６０秒）および伸長（通常、７２℃で３０秒〜１０分）を１サイクルとして２０〜５０サイクルを実施し、そのあとで、７２℃で２分〜１０分の最終伸長反応を実施する。例えば、９５℃、２分→（９５℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、３０秒）×３０サイクル→７２℃、５分などの条件を利用し得る。
【００４１】
得られた増幅ＤＮＡ断片は、上記のような電気泳動などの分子サイズ分析が可能な手法を用い、エチジウムブロマイド染色法などを用いて可視化することができる。この場合、可視化された結果に、増幅されたＤＮＡ断片の量(例えば、ピークの大きさ、バンドの濃度など)と分子サイズの情報が存在すればいかなる手法を用いて可視化してもよい。設計されたプライマーから期待される大きさの増幅ＤＮＡ断片の有無により、１塩基多型の存在または有無を評価することが可能である。
【００４２】
本発明の方法によって、核酸の１塩基多型、すなわち１塩基置換、１塩基欠失または１塩基挿入を、増幅効率を維持もしくは向上させながら特異的にかつ高精度で検出可能である。また、マイクロサテライトにおける多型も検出可能であり、特に連続する同一塩基の繰り返し配列における１塩基の欠失または挿入を検出することも可能にする。すなわち、例えば、５連続アデニン塩基（(A)5）と４連続アデニン塩基（(A)4）の識別が可能である。
【００４３】
（実施例）
次に、本発明を、下記の実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の技術的範囲を何ら特定するものではない。
【００４４】
以下の実施例に利用したトマトゲノムＤＮＡは、トマト品種・系統「ＬＡ２４５１」、「Ｔｒｏｐｉｃ」、「ＮＴ６０４」の本葉を材料に、「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ」（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したＤＮＡは、５０ｎｇ／μｌ前後に濃度を調整し使用した。なおトマト系統「ＬＡ２４５１」およびトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」は、Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能である。アクセッション番号はそれぞれＬＡ２４５１、ＬＡ２８０３である。また、「ＮＴ６０４」は株式会社ナガノトマトから入手可能である。
【００４５】
また、以下の実施例に利用した酵母ＤＮＡは、酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」をＹＰＤ培地で一晩培養し、「Ｇｅｎとるくん（酵母用）」（タカラバイオ株式会社）を使用し添付のプロトコールに従い抽出し２００μｌのＴＥバッファーに溶解した。得られたＤＮＡに、終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ （ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅ） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を加え室温で１５分放置した。その後、等量のイソプロパノールを加え混和した後、１４，０００ｒｐｍで１０分遠心し沈殿を得た。沈殿に７０％エタノール２５０μｌを加え、１４，０００ｒｐｍで５分遠心し、上清を捨て沈殿を風乾し、５０μｌのＴＥバッファーに溶解した。抽出したＤＮＡは、４０ｎｇ／μｌ前後に濃度を調整し使用した。なお、「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」は、いずれもＡＴＣＣより入手可能である。それぞれのＡＴＣＣ Ｎｏ．は、２６１０８、６０７１５である。
【００４６】
[実施例１]
１塩基多型の検出（転換塩基の検出：ＡからＴへの変異）
トマトのｄｇ変異は、ＴＤＥＴ１遺伝子の第２エクソン内にあるＡからＴへの１塩基変異（塩基転換）によることが報告されている（Theor Appl Genet (2003) 106:454-460, WO 03/057917）。
【００４７】
この変異を特異的に検出すべく、ｄｇ変異をもつトマト系統「ＬＡ２４５１」およびｄｇ変異を持たないトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図１Ａ）。
【００４８】
プライマー１、プライマー２：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基多型を含むＤＮＡ部分約１ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００４９】
プライマー３：検出すべき１塩基多型（ｄｇ変異）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー１との組み合わせでｄｇ変異のあるＤＮＡ断片約０．４ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
【００５０】
プライマー４：検出すべき１塩基多型（野生型）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー２との組み合わせで野生型のＤＮＡ断片約０．６ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー１（配列番号１）：5’-TTCTTCACTgCTTATTgg-3’
プライマー２（配列番号２）：5’-AATgCTATgTgCCAAATTA-3’
プライマー３（配列番号３）：5’-TATggTATAACTTggTACAACLgA-3’（Ｌｇはグアニン塩基をもつＬＮＡ）
プライマー４（配列番号４）：5’-CgTgCCAgAAgATTTTATgAgLaA-3’（Ｌａはアデニン塩基をもつＬＮＡ）
【００５１】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１２．９μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→５６℃・３０秒→７２℃・３０秒）を３５サイクル行い最後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００５２】
図１Ｂに示すように、ｄｇ変異遺伝子をもつトマト系統「ＬＡ２４５１」では約０．４ｋｂに、ＴＤＥＴ１遺伝子が野生型であるトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」では約０．６ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、両遺伝子それぞれを特異的に検出することが可能であった。
【００５３】
[実施例２]
１塩基多型の検出（転位塩基の検出：ＧからＡへの変異）（その１）
酵母のｆｌｏ８変異は、コーディング塩基配列の６０８塩基目が、ＧからＡへの１塩基変異（塩基転位）によることが報告されている(Genetics (1996) 144:967-978、Mol Gen Genet. (1996) 251:707-715）。この変異を特異的に検出すべく、ｆｌｏ８変異を持つ酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」およびｆｌｏ８変異を持たない菌株「ＡＴＣＣ ６０７１５」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図２Ａ）。
【００５４】
プライマー５、プライマー６：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基多型を含むＤＮＡ部分約０．６ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００５５】
プライマー７：検出すべき１塩基多型（ｆｌｏ８変異）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー５との組み合わせでｆｌｏ８変異のあるＤＮＡ断片約０．２ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー５（配列番号５）：5’-CTTTCTTACgAAgTCgTCT-3’
プライマー６（配列番号６）：5’-TggCCAgCCAgTAACgT-3’
プライマー７（配列番号７）：5’-AAGATGTCCCAGAATATTTGLcT-3’（Ｌｃはシトシン塩基をもつＬＮＡ）
【００５６】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０ｘＥｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１３．４μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→５６℃・３０秒→７２℃・３０秒）を３５サイクル行い最後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００５７】
比較例としてプライマー５とプライマー７の２種のみを用い、他の条件を上記と同一としたＰＣＲ産物を同時に電気泳動し可視化した。
【００５８】
図２Ｂに示すように、３種のプライマーを用いた場合、ｆｌｏ８変異遺伝子をもつ酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」特異的に約０．２ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、ｆｌｏ８遺伝子を特異的に検出することが可能であった。しかし、２種のプライマーのみでＰＣＲ反応を行った場合には、ＤＮＡ断片の増幅はみられるものの特異性がなく「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」両サンプルとも増幅してしまった。１塩基多型を含むＤＮＡ断片を増幅しながら１塩基多型特異的なＰＣＲを実施することにより、偶然に非特異的な増幅がみられた場合でも常に正確な１塩基多型をもつ鋳型ＤＮＡ断片の存在割合が高く維持される。その結果、特異的増幅断片の割合が非特異的増幅断片に比べとても高くなり、１塩基多型特異的な増幅が可能となったと考えられる。
【００５９】
[実施例３]
１塩基多型の検出（転位塩基の検出：ＧからＡへの変異）（その２）
実施例２に示したｆｌｏ８遺伝子のみならず野生型遺伝子を検出すべく、ｆｌｏ８変異を持つ酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」およびｆｌｏ８変異を持たない菌株「ＡＴＣＣ ６０７１５」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図３Ａ）。
【００６０】
プライマー５、プライマー６：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基多型を含むＤＮＡ部分約０．６ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００６１】
プライマー８：検出すべき１塩基多型（野生型遺伝子）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目および３塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー６との組み合わせでＦＬＯ８遺伝子が野生型であるＤＮＡ断片約０．４５ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー５（配列番号５）：5’-CTTTCTTACgAAgTCgTCT-3’
プライマー６（配列番号６）：5’-TggCCAgCCAgTAACgT-3’
プライマー８（配列番号８）：5’- CAAggCTTTTTgTATgAATgLgLtg-3’
（Ｌｇはグアニン塩基をもつＬＮＡ、Ｌｔはチミン塩基をもつＬＮＡ）
【００６２】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１３．４μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→５６℃・３０秒→７２℃・３０秒）を３５サイクル行い最後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００６３】
比較例としてプライマー６とプライマー８の２種のみを用い、他の条件を上記と同一としたＰＣＲ産物を同時に電気泳動し可視化した。
【００６４】
図３Ｂに示すように、３種のプライマーを用いた場合、ＦＬＯ８遺伝子が野生型である酵母菌株「ＡＴＣＣ ６０７１５」特異的に約０．４５ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、ＦＬＯ８遺伝子（野生型遺伝子）を特異的に検出することが可能であった。しかし、２種のプライマーのみでＰＣＲ反応を行った場合には、ＤＮＡ断片の増幅はみられるものの特異性がなく「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」両サンプルとも増幅してしまった。１塩基多型を含むＤＮＡ断片を増幅しながら１塩基多型特異的なＰＣＲを実施することにより、偶然に非特異的な増幅がみられた場合でも常に正確な１塩基多型をもつ鋳型ＤＮＡ断片の存在割合が高く維持される。その結果、特異的増幅断片の割合が非特異的増幅断片に比べても高くなり、１塩基多型特異的な増幅が可能となったと考えられる。
【００６５】
[実施例４]
１塩基挿入の検出
トマトのｏｇｃ変異は、リコピンβ−シクラーゼのエクソンにある１塩基欠失によるフレームシフトによることが報告されている。野生型でアデニン残基（Ａ）が９塩基連続する部分が、変異遺伝子では８塩基連続となっている(PNAS (2000) 97: 11102-11107)。ｏｇｃ変異の検出は、Ａが９連続するか８連続するかを識別する必要があり、困難であるとされているが、プライマーにミスマッチを導入することで解決しようという試みが報告されている（特開2009-50214)。
【００６６】
野生型遺伝子（変異遺伝子に対して１塩基挿入）を特異的に検出すべく、ｏｇｃ変異を持つトマト品種「ＮＴ６０４」およびｏｇｃ変異を持たないトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図４Ａ）。
【００６７】
プライマー９、プライマー１０：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基挿入を含むＤＮＡ部分約０．９ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
プライマー１１：検出すべきＡ×９塩基（野生型）の次の塩基を３’端とし、連続塩基の両端およびその前後１塩基をＬＮＡとしたプライマー。プライマー１０との組み合わせで野生型のＤＮＡ断片約０．６ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー９（配列番号９）：5’-TAgCTTAgCAAAgATTCC-3’
プライマー１０（配列番号１０）：5’-ACTTgCATCCACAACC-3’
プライマー１１（配列番号１１）：5’-AAgTCCCACCACLcLaAAAAAAALaLt-3’
（Ｌｃ，Ｌａ，Ｌｔはそれぞれシトシン塩基，アデニン塩基，チミン塩基をもつＬＮＡ）
【００６８】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１３．４μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→６２℃・３０秒→７２℃・３０秒）を１５サイクル行い、さらに（９５℃・３０秒→６０℃・３０秒→７２℃・３０秒）を２５サイクル行った後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００６９】
図４Ｂに示すように、ｏｇｃ変異遺伝子をもたないトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」でのみ約０．６ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、野生型遺伝子を特異的に検出することが可能であった。
【００７０】
[実施例５]
１塩基欠失（挿入）の検出
実施例４に示した野生型遺伝子のみならずｏｇｃ変異遺伝子（野生型遺伝子に対して１塩基欠失）をも同時に検出すべく、ｏｇｃ変異を持つトマト品種「ＮＴ６０４」およびｏｇｃ変異を持たない品種「Ｔｒｏｐｉｃ」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図５Ａ）。
【００７１】
プライマー９、プライマー１０：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基欠失（挿入）を含むＤＮＡ部分約０．９ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００７２】
プライマー１１：検出すべきＡｘ９塩基（野生型）の次の塩基を３’端とし、連続塩基の両端およびその前後１塩基をＬＮＡとしたプライマー。プライマー１０との組み合わせで野生型のＤＮＡ断片約０．６ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
【００７３】
プライマー１２：検出すべきＡ×８塩基（ｏｇｃ遺伝子）においてプライマー１１と逆向きに設計されたプライマーである。連続塩基の次の塩基を３’端とし、連続塩基の両端およびその前後１塩基をＬＮＡとしたプライマー。プライマー９との組み合わせでｏｇｃ遺伝子のＤＮＡ断片約０．３ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー９（配列番号９）：5’-TAgCTTAgCAAAgATTCC-3’
プライマー１０（配列番号１０）：5’-ACTTgCATCCACAACC-3’
プライマー１１（配列番号１１）：5’-AAgTCCCACCACLcLaAAAAAAALaLt-3’
（Ｌｃ，Ｌａ，Ｌｔはそれぞれシトシン塩基，アデニン塩基，チミン塩基をもつＬＮＡ）
プライマー１２（配列番号１２）：5’-gAAgACATTTTCTTgLaLtTTTTTTLtLg-3’
（Ｌａ，Ｌｔ，Ｌｇはそれぞれアデニン塩基，チミン塩基，グアニン塩基をもつＬＮＡ）
【００７４】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー９を０．４μｌ、２０μＭのプライマー１０を０．２μｌ、２０μＭのプライマー１１を０．５μｌ、２０μＭのプライマー１２を０．８μｌ、水１３μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→６２℃・３０秒→７２℃・３０秒）を１５サイクル行い、さらに（９５℃・３０秒→６０℃・３０秒→７２℃・３０秒）を２５サイクル行った後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００７５】
図５Ｂに示すように、ｏｇｃ変異遺伝子をもつトマト系統「ＮＴ６０４」では約０．３ｋｂに、リコペンβ−シクラーゼ遺伝子が野生型であるトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」では約０．６ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、両遺伝子それぞれを特異的に検出することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、医学、法医学、農学などの分野で、生物やウイルス由来の核酸の１塩基多型を、特異性を維持しながらＰＣＲ増幅することにより検出することを可能にする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の１塩基多型の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子型を核酸レベルで識別する様々な方法が開発され、医学、法医学、農学などの分野で利用されている。農業分野では品種の識別や育種における選抜マーカーあるいは病害の診断などで実用に使われ効力を発揮している。このうち核酸の１塩基多型、例えば１塩基置換は、頻度高く存在するので利用価値が高い反面、検出に特別な機器を必要とするか、あるいは煩雑な手順を必要とするなどの課題がある。
【０００３】
ＬＮＡ(locked nucleic acid)は、ＤＮＡに比較して相補的な塩基との水素結合が強固になる特徴を有している（特許文献１、２）。このように塩基特異性の向上が期待されるので、ＰＣＲ反応により１塩基多型を検出する方法の検討がなされ（特許文献３、４）、後述のようないくつかの方法が考案されている。（ｉ）通常のＰＣＲ反応で増幅した核酸について、６〜７塩基からなるＬＮＡプローブとのハイブリダイゼーションのしやすさを検出する方法（非特許文献１）。（ｉｉ）プライマーの中央当たりに１〜数塩基のＬＮＡ塩基を入れることによりＰＣＲを行う方法（非特許文献２）。（ｉｉｉ）プライマーの３’端に検出すべき多型塩基を配置しこの位置にＬＮＡ塩基を用いたプライマーを使ったＰＣＲ反応による方法（非特許文献３、４）。（ｉｖ）検出すべき多型をプライマーの３’末端に配置し、これより１塩基内側の塩基にＬＮＡを用いたプライマーによるＰＣＲによる方法。このＰＣＲの場合プルーフリーディング酵素を利用しないと検出できないことが記載されている（非特許文献５）。
【０００４】
１塩基多型を検出する場合、これら各種の方法のうち、例えば通常のＰＣＲ反応により検討している（ｉｖ）の方法を実際に用いてみると、特異性が十分ではないか、あるいは、特異性はみられるがＬＮＡをプライマー内に含むことが要因でＰＣＲ反応の増幅効率が低く、そのためＰＣＲサイクル数増加や試薬量増量等の対策で増幅効率を向上しようとすると、代わりに特異性が減じてしまうことがあり、いずれにせよ多型を区別することが困難となる課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO02/018388
【特許文献２】特表2002-521310
【特許文献３】特表2002-539801
【特許文献４】特表2005-514005
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nucleic Acids Research (2002),30:e91
【非特許文献２】Mol Cell Probes (2003) 17:253-259
【非特許文献３】Plant Methods (2007) 3 :2(http://www.plantmethods.com/content/3/1/2)
【非特許文献４】Human mutation (2003) 22:79-85
【非特許文献５】Nucleic Acids Research (2004),32:e32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、１塩基置換の簡便な検出は頻度高く存在する多型を利用するために重要な技術である。ＬＮＡの利用はこのような１塩基置換の検出を実現すると期待されるが、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用しようとすると特異性と増幅効率両方を満足させることができない場合が多い。また、１塩基挿入や１塩基欠失の検出は、１塩基置換に比べさらに特異性をもたせることが困難である。
【０００８】
本発明は、１塩基多型、特に１塩基置換、１塩基挿入および１塩基欠失、のＰＣＲによる通常の増幅効率を維持もしくは向上させながら高い特異性を付与する検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はこのような従来の問題に鑑み、一般化しているＰＣＲ反応を用い、従前に比べ特異性を減じることなく十分な増幅を確保し簡便に１塩基多型、例えば１塩基置換、１塩基欠失あるいは１塩基挿入、を検出する方法を提供する。目的とする１塩基多型に特異的な核酸断片を増幅するためのプライマー対と、目的とする１塩基多型を含む核酸断片を増幅するためのプライマー対とを添加し、ＰＣＲ反応により該核酸断片の鋳型を増幅しながら、同時に、目的とする１塩基多型に特異的なＰＣＲ反応を行うことが可能である。このようにして特異性を確保した上で増幅効率を向上することが達成される。
【００１０】
本発明の特徴は、プライマーの特定の位置にＬＮＡを含み、かつ、核酸の１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基からなるプライマーを含む、合計３種以上の１０〜５０塩基からなるプライマーを用いたＰＣＲ反応により１塩基多型を検出することにある。本発明を利用することにより、１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、マイクロサテライトの多型などの1塩基多型を、通常のＰＣＲ反応とそれに続く増幅産物の解析により特異的に検出することが可能となる。
【００１１】
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
すなわち、本発明は、その一態様において、核酸の1塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む方法を提供する。１塩基多型の検出のためには、例えば電気泳動法などの、増幅核酸断片のサイズに基づく方法を使用できる。また、プライマーに蛍光標識を付けることで識別する等の方法も使用できる。
【００１２】
その実施形態において、上記１塩基多型が、１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型である。
【００１３】
別の実施形態において、上記1塩基多型部位において他の多型を示す核酸断片を増幅するための第４のプライマーをさらに含み、該第４のプライマーは、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、上記第２の１塩基多型の塩基に相当する塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなるプライマーであり、上記第２、第３等の複数のプライマーのうち適するプライマーとプライマー対を形成することができるプライマーである。
【００１４】
別の実施形態において、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の上記１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。
【００１５】
上記１塩基多型が１塩基欠失である場合、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の該１塩基欠失部位の３’側の１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。
【００１６】
別の実施形態において、上記１塩基多型が連続同一塩基からなる配列の多型である場合、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の該連続同一塩基の３’側に隣接する１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、少なくとも上記第１のプライマーの３’末端および上記核酸の該連続同一塩基の両端の塩基、および該連続同一塩基の５’側に隣接する１番目の塩基である。
【発明の効果】
【００１７】
１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型を通常のＰＣＲで十分な正確さと感度で検出可能とするには、特異性を維持しつつ増幅を確保する必要がある。本発明は、ＰＣＲ反応により、鋳型ＤＮＡを増幅しながら目的とする１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型などの１塩基多型を特異的にかつ高精度で検出することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】トマトのｄｇ変異の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌａはアデニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｇはグアニンを塩基としたＬＮＡを表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。
【図２】酵母のｆｌｏ８遺伝子変異の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｃはシトシンを塩基としたＬＮＡを表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。プライマー２種では、プライマー５とプライマー７を使用し、プライマー３種では、プライマー５、プライマー６、プライマー７を使用した。
【図３】酵母野生型ＦＬＯ８遺伝子の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｇはグアニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｔはチミンを塩基としたＬＮＡをそれぞれ表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。プライマー２種では、プライマー６とプライマー８を使用し、プライマー３種では、プライマー５、プライマー６、プライマー８を使用した。
【図４】トマトの野生型リコピンβ−シクラーゼ遺伝子の検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｃはシトシンを塩基としたＬＮＡ、Ｌａはアデニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｔはチミンを塩基としたＬＮＡをそれぞれ表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。
【図５】トマトｏｇｃ変異遺伝子および野生型リコピンβ−シクラーゼ遺伝子の同時検出を示す。Ａ：検出の模式図であり、Ｌｃはシトシンを塩基としたＬＮＡ、Ｌａはアデニンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｔはチミンを塩基としたＬＮＡ、Ｌｇはグアニンを塩基としたＬＮＡをそれぞれ表す。Ｂ：検出結果を示し、ＭＷは分子量マーカーとして用いたφＸ１７４ＤＮＡのＨｉｎＣＩＩ分解物である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施の形態について説明する。
本明細書で使用する用語は、以下の定義を包含する。
【００２０】
「核酸」は、１本鎖または２本鎖のいずれでもよく、および、ＤＮＡまたはＲＮＡを表す。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含み、ＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。
【００２１】
「１塩基多型」(ＳＮＰ；single nucleotide polymorphism)は、核酸の塩基配列の中のある１塩基に変異（特に、置換）があることをいい、置換、欠失、付加または挿入により生じる。例えば、個体差（例えばヒトでは、個人差、人種間の差異など）の比較や病気の罹りやすさに関わるジェノタイピング(genotyping)のためにその検出が利用される。
【００２２】
「ＬＮＡ」(locked nucleic acid)は、リボ核酸の４’−Ｃ位と２’−Ｏ位との間にメチレン架橋が形成された２つの環状構造を有する核酸アナログである。
【００２３】
「マイクロサテライト」は、特に真核生物のゲノム上において見られる、モノ、ジ、トリ、テトラ、ペンタまたはヘキサヌクレオチド、などの繰り返しからなるポリヌクレオチドの配列を指す。
【００２４】
「相補的塩基」は、センス鎖上の特定の塩基と対合することができるアンチセンス鎖上の塩基をいう。
【００２５】
「センスプライマー」および「アンチセンスプライマー」はそれぞれ、核酸のセンス鎖配列の一部と同等の塩基配列からなるプライマー、核酸のアンチセンス鎖配列の一部と同等の塩基配列からなるプライマーをいう。
【００２６】
本発明を以下においてさらに詳細に説明する。
上記のとおり、本発明は、核酸の１塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の方法では、３種以上、例えば３種または４種、のプライマーを使用する。プライマーは、(i) 少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む第１のプライマーであって、適するサイズの核酸断片の増幅を可能にする１種類以上のプライマー、および(ii) 該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な第２、第３等のプライマーであって、適するサイズの核酸断片の増幅を可能にする２種類以上のプライマー、を含む。ここで、第２および第３のプライマーは互いに対向し、核酸断片の増幅を可能にするプライマーであり、第１のプライマーは第２または第３のプライマーのいずれかと対向し、核酸断片の増幅を可能にするプライマーである。
【００２８】
上記プライマーの他に、(iii)該１塩基多型部位において他の多型を有する核酸断片を増幅するための第４のプライマーをさらに含むことができる。この第４のプライマーは、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、上記１塩基多型の塩基に相当する塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含むプライマーであり、上記第２および第３のプライマーのうち適するプライマーとプライマー対を形成することができるプライマーである。
【００２９】
上記(i)、(ii)および(iii)のプライマーは、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１７〜２５塩基の塩基長を有する。具体的には、プライマーは、例えば図１〜図５に記載されるように、野生型核酸または変異型核酸に対して配置される３種または４種のプライマーとして設計され得る。
【００３０】
本発明では、増幅産物（すなわち、増幅核酸断片）は、そのサイズに基づく方法、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの電気泳動、ゲルろ過などのサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど、を利用して検出することが好ましい。例えば電気泳動法の場合、増幅産物のラダーを得たのち、臭化エチジウム染色にてバンドを検出することができる。上記検出法の場合、変異型核酸の増幅産物と野生型核酸の増幅産物の各バンドの位置が視覚的に差異を有するべきであり、これによって増幅産物のバンド位置から変異型か野生型かを識別することが可能である(図１Ｂ、図２Ｂなど)。したがって、プライマーの設計の際には、増幅産物のサイズを考慮しながらプライマーのアニーリング位置および配列を決定することが望ましい。各プライマー対は、限定されないが、例えば、１塩基多型部位を挟む約１００ｂｐ〜約３，０００ｂｐ、好ましくは約２００ｂｐ〜約１，０００ｂｐの核酸断片を増幅できるように設計される。
【００３１】
核酸は、上記定義のとおりＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、またＲＮＡの場合にはｃＤＮＡに変換されてもよく、さらにまたそれらの由来も特に制限されないものとし、動物、植物、微生物などを含むあらゆる生物由来、またはウイルス由来、の核酸である。被検用核酸は、生物の細胞、組織または体液、ウイルス粒子などから公知の手法によって調製することができる。ＤＮＡの場合、例えばフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって得ることができるし、ＲＮＡの場合、例えばＳＤＳ／フェノール、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールなどによる抽出とエタノール沈殿によって得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出のためのキットが市販されているため、そのような抽出キットを使用してもよい。
【００３２】
本発明で特徴的なプライマーは、ＬＮＡを含む第１のプライマーである。
本発明の実施形態において、上記第１のプライマーは、その３’末端が、上記核酸の上記１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。このようなプライマーの例は、図１のプライマー３または図２のプライマー７である。この場合、１塩基多型は、例えば１塩基置換または１塩基挿入であり、この場合、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基がプライマーの３’末端に配置される。プライマーは、センスプライマー、アンチセンスプライマー、またはその両方である。
【００３３】
上記第１のプライマーの特定例において、上記１塩基多型が１塩基欠失である場合、上記第１のプライマーは、その３’末端に配置された、欠失の結果元の配列とずれが生じてしまう塩基から数えて少なくとも２番目の塩基をＬＮＡとして含むことができる。言い換えれば、この例の第１のプライマーは、その３’末端が、上記核酸の該１塩基欠失部位の３’側の１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３’末端の塩基の５’側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である。
【００３４】
あるいは、上記１塩基多型が連続同一塩基からなる配列の多型である場合、上記第１のプライマーの３’末端が、上記核酸の該連続同一塩基の３’側に隣接する１番目の塩基であり、上記ＬＮＡが、少なくとも上記第１のプライマーの３’末端および上記核酸の該連続同一塩基の両端の塩基、および該連続同一塩基の５’側に隣接する１番目の塩基である。このようなプライマーの例は、図４のプライマー１１、図５のプライマー１１、１２である。図５の例では、同一塩基の繰り返しからなるマイクロサテライトの配列における同一塩基の挿入（Ａｘ９）または欠失（Ａｘ８）が検出されうることが示されている（例えば、図５Ｂの野生型遺伝子の増幅ＤＮＡバンドとｏｇｃ遺伝子の増幅ＤＮＡバンドの比較）。
【００３５】
上記のとおり、本発明の上記(ii)のプライマーは、核酸の１塩基多型部位もしくはその相補的部位を含む第１のプライマーを挟むように設計された少なくとも２種のプライマーであり、それらはともにプライマー対を構成する。また、それらのいずれか片方は上記(i)の第１のプライマーとともにプライマー対を構成する。例えば図１の場合、上記(i)の第１のプライマーはプライマー３であり、上記(ii)の第２および第３のプライマーはプライマー１とプライマー２であり、上記(iii)のプライマーはプライマー４である。
【００３６】
増幅産物は、プライマー１とプライマー２、プライマー１とプライマー３、およびプライマー２とプライマー４、のそれぞれのプライマー対から増幅される３つのバンドによって示される（図１Ｂ）。
【００３７】
本発明で使用されるプライマーは、上記(ii)のプライマーの場合、ホスホアミダイト法などのポリヌクレオチドの合成法を応用した市販の自動核酸合成機を使用することによって作製されうるし、また、上記(i)、(iii)および（ｉｖ）のプライマーの場合も、同様に、ホスホアミダイト化学を用いて作製可能であるし、自動合成も可能である。なお、プライマーに含まれるＬＮＡは市販されており、また、ＬＮＡを含むポリヌクレオチドの受託合成も行われている。
【００３８】
本発明の方法の手順の例は、まず、検出すべき１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、マイクロサテライトの多型などの１塩基多型を含む核酸試料を調製する。試料となる核酸は生物またはウイルスに由来するサンプルから抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡであるが、ＲＮＡの場合は逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し用いてもよい。核酸の抽出方法は、上記の公知の手法を利用しうる。ｃＤＮＡ合成も以降のＰＣＲ反応が起こる限りどのような方法を利用してもよい。次に、試料となるＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型に用い、目的とする１塩基多型に特異的なＤＮＡ断片を増幅させるためのプライマー対および目的とするＤＮＡ断片を含む断片を増幅するためのプライマー対を使用してＰＣＲ増幅反応を行う。
【００３９】
ＰＣＲの反応条件としては、通常利用される条件を使用することができる。ＰＣＲ反応は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する酵素反応であり、反応に必要な成分には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他に、ＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（例えば、約ｐＨ８．３）、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２を含有する）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、ＰＣＲプライマー、鋳型核酸（通常、ＤＮＡ）が含まれる。プライマーの性状により温度条件が、増幅されるＤＮＡ断片の長さにより時間が、期待する増幅の量によりサイクル数が、それぞれ設定される。また、用いるＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲ用に利用される耐熱性酵素であればいずれを用いてもよい。そのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなどが含まれる。このような耐熱性酵素は市販されているので、それらをＰＣＲ法に使用することができる。
【００４０】
ＰＣＲ反応は、市販のサーマルサイクラー装置を使用し、反応条件を設定することによって行うことができる。反応サイクルの前に、９４℃〜９６℃で約１分〜約５分の加熱変性処理を行ったのちに、変性（９４℃〜９６℃で１０秒〜６０秒）、アニーリング（５５℃〜６５℃で１０秒〜６０秒）および伸長（通常、７２℃で３０秒〜１０分）を１サイクルとして２０〜５０サイクルを実施し、そのあとで、７２℃で２分〜１０分の最終伸長反応を実施する。例えば、９５℃、２分→（９５℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、３０秒）×３０サイクル→７２℃、５分などの条件を利用し得る。
【００４１】
得られた増幅ＤＮＡ断片は、上記のような電気泳動などの分子サイズ分析が可能な手法を用い、エチジウムブロマイド染色法などを用いて可視化することができる。この場合、可視化された結果に、増幅されたＤＮＡ断片の量(例えば、ピークの大きさ、バンドの濃度など)と分子サイズの情報が存在すればいかなる手法を用いて可視化してもよい。設計されたプライマーから期待される大きさの増幅ＤＮＡ断片の有無により、１塩基多型の存在または有無を評価することが可能である。
【００４２】
本発明の方法によって、核酸の１塩基多型、すなわち１塩基置換、１塩基欠失または１塩基挿入を、増幅効率を維持もしくは向上させながら特異的にかつ高精度で検出可能である。また、マイクロサテライトにおける多型も検出可能であり、特に連続する同一塩基の繰り返し配列における１塩基の欠失または挿入を検出することも可能にする。すなわち、例えば、５連続アデニン塩基（(A)5）と４連続アデニン塩基（(A)4）の識別が可能である。
【００４３】
（実施例）
次に、本発明を、下記の実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の技術的範囲を何ら特定するものではない。
【００４４】
以下の実施例に利用したトマトゲノムＤＮＡは、トマト品種・系統「ＬＡ２４５１」、「Ｔｒｏｐｉｃ」、「ＮＴ６０４」の本葉を材料に、「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ」（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し添付のプロトコールに従い抽出した。抽出したＤＮＡは、５０ｎｇ／μｌ前後に濃度を調整し使用した。なおトマト系統「ＬＡ２４５１」およびトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」は、Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能である。アクセッション番号はそれぞれＬＡ２４５１、ＬＡ２８０３である。また、「ＮＴ６０４」は株式会社ナガノトマトから入手可能である。
【００４５】
また、以下の実施例に利用した酵母ＤＮＡは、酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」をＹＰＤ培地で一晩培養し、「Ｇｅｎとるくん（酵母用）」（タカラバイオ株式会社）を使用し添付のプロトコールに従い抽出し２００μｌのＴＥバッファーに溶解した。得られたＤＮＡに、終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ （ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅ） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を加え室温で１５分放置した。その後、等量のイソプロパノールを加え混和した後、１４，０００ｒｐｍで１０分遠心し沈殿を得た。沈殿に７０％エタノール２５０μｌを加え、１４，０００ｒｐｍで５分遠心し、上清を捨て沈殿を風乾し、５０μｌのＴＥバッファーに溶解した。抽出したＤＮＡは、４０ｎｇ／μｌ前後に濃度を調整し使用した。なお、「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」は、いずれもＡＴＣＣより入手可能である。それぞれのＡＴＣＣ Ｎｏ．は、２６１０８、６０７１５である。
【００４６】
[実施例１]
１塩基多型の検出（転換塩基の検出：ＡからＴへの変異）
トマトのｄｇ変異は、ＴＤＥＴ１遺伝子の第２エクソン内にあるＡからＴへの１塩基変異（塩基転換）によることが報告されている（Theor Appl Genet (2003) 106:454-460, WO 03/057917）。
【００４７】
この変異を特異的に検出すべく、ｄｇ変異をもつトマト系統「ＬＡ２４５１」およびｄｇ変異を持たないトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図１Ａ）。
【００４８】
プライマー１、プライマー２：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基多型を含むＤＮＡ部分約１ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００４９】
プライマー３：検出すべき１塩基多型（ｄｇ変異）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー１との組み合わせでｄｇ変異のあるＤＮＡ断片約０．４ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
【００５０】
プライマー４：検出すべき１塩基多型（野生型）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー２との組み合わせで野生型のＤＮＡ断片約０．６ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー１（配列番号１）：5’-TTCTTCACTgCTTATTgg-3’
プライマー２（配列番号２）：5’-AATgCTATgTgCCAAATTA-3’
プライマー３（配列番号３）：5’-TATggTATAACTTggTACAACLgA-3’（Ｌｇはグアニン塩基をもつＬＮＡ）
プライマー４（配列番号４）：5’-CgTgCCAgAAgATTTTATgAgLaA-3’（Ｌａはアデニン塩基をもつＬＮＡ）
【００５１】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１２．９μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→５６℃・３０秒→７２℃・３０秒）を３５サイクル行い最後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００５２】
図１Ｂに示すように、ｄｇ変異遺伝子をもつトマト系統「ＬＡ２４５１」では約０．４ｋｂに、ＴＤＥＴ１遺伝子が野生型であるトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」では約０．６ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、両遺伝子それぞれを特異的に検出することが可能であった。
【００５３】
[実施例２]
１塩基多型の検出（転位塩基の検出：ＧからＡへの変異）（その１）
酵母のｆｌｏ８変異は、コーディング塩基配列の６０８塩基目が、ＧからＡへの１塩基変異（塩基転位）によることが報告されている(Genetics (1996) 144:967-978、Mol Gen Genet. (1996) 251:707-715）。この変異を特異的に検出すべく、ｆｌｏ８変異を持つ酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」およびｆｌｏ８変異を持たない菌株「ＡＴＣＣ ６０７１５」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図２Ａ）。
【００５４】
プライマー５、プライマー６：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基多型を含むＤＮＡ部分約０．６ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００５５】
プライマー７：検出すべき１塩基多型（ｆｌｏ８変異）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー５との組み合わせでｆｌｏ８変異のあるＤＮＡ断片約０．２ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー５（配列番号５）：5’-CTTTCTTACgAAgTCgTCT-3’
プライマー６（配列番号６）：5’-TggCCAgCCAgTAACgT-3’
プライマー７（配列番号７）：5’-AAGATGTCCCAGAATATTTGLcT-3’（Ｌｃはシトシン塩基をもつＬＮＡ）
【００５６】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０ｘＥｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１３．４μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→５６℃・３０秒→７２℃・３０秒）を３５サイクル行い最後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００５７】
比較例としてプライマー５とプライマー７の２種のみを用い、他の条件を上記と同一としたＰＣＲ産物を同時に電気泳動し可視化した。
【００５８】
図２Ｂに示すように、３種のプライマーを用いた場合、ｆｌｏ８変異遺伝子をもつ酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」特異的に約０．２ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、ｆｌｏ８遺伝子を特異的に検出することが可能であった。しかし、２種のプライマーのみでＰＣＲ反応を行った場合には、ＤＮＡ断片の増幅はみられるものの特異性がなく「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」両サンプルとも増幅してしまった。１塩基多型を含むＤＮＡ断片を増幅しながら１塩基多型特異的なＰＣＲを実施することにより、偶然に非特異的な増幅がみられた場合でも常に正確な１塩基多型をもつ鋳型ＤＮＡ断片の存在割合が高く維持される。その結果、特異的増幅断片の割合が非特異的増幅断片に比べとても高くなり、１塩基多型特異的な増幅が可能となったと考えられる。
【００５９】
[実施例３]
１塩基多型の検出（転位塩基の検出：ＧからＡへの変異）（その２）
実施例２に示したｆｌｏ８遺伝子のみならず野生型遺伝子を検出すべく、ｆｌｏ８変異を持つ酵母菌株「Ｓ２８８Ｃ」およびｆｌｏ８変異を持たない菌株「ＡＴＣＣ ６０７１５」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図３Ａ）。
【００６０】
プライマー５、プライマー６：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基多型を含むＤＮＡ部分約０．６ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００６１】
プライマー８：検出すべき１塩基多型（野生型遺伝子）を３’末端に配置し３’末端から２塩基目および３塩基目をＬＮＡとしたプライマー。プライマー６との組み合わせでＦＬＯ８遺伝子が野生型であるＤＮＡ断片約０．４５ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー５（配列番号５）：5’-CTTTCTTACgAAgTCgTCT-3’
プライマー６（配列番号６）：5’-TggCCAgCCAgTAACgT-3’
プライマー８（配列番号８）：5’- CAAggCTTTTTgTATgAATgLgLtg-3’
（Ｌｇはグアニン塩基をもつＬＮＡ、Ｌｔはチミン塩基をもつＬＮＡ）
【００６２】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１３．４μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→５６℃・３０秒→７２℃・３０秒）を３５サイクル行い最後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００６３】
比較例としてプライマー６とプライマー８の２種のみを用い、他の条件を上記と同一としたＰＣＲ産物を同時に電気泳動し可視化した。
【００６４】
図３Ｂに示すように、３種のプライマーを用いた場合、ＦＬＯ８遺伝子が野生型である酵母菌株「ＡＴＣＣ ６０７１５」特異的に約０．４５ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、ＦＬＯ８遺伝子（野生型遺伝子）を特異的に検出することが可能であった。しかし、２種のプライマーのみでＰＣＲ反応を行った場合には、ＤＮＡ断片の増幅はみられるものの特異性がなく「Ｓ２８８Ｃ」、「ＡＴＣＣ ６０７１５」両サンプルとも増幅してしまった。１塩基多型を含むＤＮＡ断片を増幅しながら１塩基多型特異的なＰＣＲを実施することにより、偶然に非特異的な増幅がみられた場合でも常に正確な１塩基多型をもつ鋳型ＤＮＡ断片の存在割合が高く維持される。その結果、特異的増幅断片の割合が非特異的増幅断片に比べても高くなり、１塩基多型特異的な増幅が可能となったと考えられる。
【００６５】
[実施例４]
１塩基挿入の検出
トマトのｏｇｃ変異は、リコピンβ−シクラーゼのエクソンにある１塩基欠失によるフレームシフトによることが報告されている。野生型でアデニン残基（Ａ）が９塩基連続する部分が、変異遺伝子では８塩基連続となっている(PNAS (2000) 97: 11102-11107)。ｏｇｃ変異の検出は、Ａが９連続するか８連続するかを識別する必要があり、困難であるとされているが、プライマーにミスマッチを導入することで解決しようという試みが報告されている（特開2009-50214)。
【００６６】
野生型遺伝子（変異遺伝子に対して１塩基挿入）を特異的に検出すべく、ｏｇｃ変異を持つトマト品種「ＮＴ６０４」およびｏｇｃ変異を持たないトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図４Ａ）。
【００６７】
プライマー９、プライマー１０：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基挿入を含むＤＮＡ部分約０．９ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
プライマー１１：検出すべきＡ×９塩基（野生型）の次の塩基を３’端とし、連続塩基の両端およびその前後１塩基をＬＮＡとしたプライマー。プライマー１０との組み合わせで野生型のＤＮＡ断片約０．６ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー９（配列番号９）：5’-TAgCTTAgCAAAgATTCC-3’
プライマー１０（配列番号１０）：5’-ACTTgCATCCACAACC-3’
プライマー１１（配列番号１１）：5’-AAgTCCCACCACLcLaAAAAAAALaLt-3’
（Ｌｃ，Ｌａ，Ｌｔはそれぞれシトシン塩基，アデニン塩基，チミン塩基をもつＬＮＡ）
【００６８】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー各々０．５μｌ、水１３．４μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→６２℃・３０秒→７２℃・３０秒）を１５サイクル行い、さらに（９５℃・３０秒→６０℃・３０秒→７２℃・３０秒）を２５サイクル行った後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００６９】
図４Ｂに示すように、ｏｇｃ変異遺伝子をもたないトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」でのみ約０．６ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、野生型遺伝子を特異的に検出することが可能であった。
【００７０】
[実施例５]
１塩基欠失（挿入）の検出
実施例４に示した野生型遺伝子のみならずｏｇｃ変異遺伝子（野生型遺伝子に対して１塩基欠失）をも同時に検出すべく、ｏｇｃ変異を持つトマト品種「ＮＴ６０４」およびｏｇｃ変異を持たない品種「Ｔｒｏｐｉｃ」のＤＮＡを用い、以下のプライマーによるＰＣＲ反応を行った（図５Ａ）。
【００７１】
プライマー９、プライマー１０：両プライマーを組み合わせて利用することで、検出すべき１塩基欠失（挿入）を含むＤＮＡ部分約０．９ｋｂを増幅するように設計されたプライマー対。
【００７２】
プライマー１１：検出すべきＡｘ９塩基（野生型）の次の塩基を３’端とし、連続塩基の両端およびその前後１塩基をＬＮＡとしたプライマー。プライマー１０との組み合わせで野生型のＤＮＡ断片約０．６ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
【００７３】
プライマー１２：検出すべきＡ×８塩基（ｏｇｃ遺伝子）においてプライマー１１と逆向きに設計されたプライマーである。連続塩基の次の塩基を３’端とし、連続塩基の両端およびその前後１塩基をＬＮＡとしたプライマー。プライマー９との組み合わせでｏｇｃ遺伝子のＤＮＡ断片約０．３ｋｂを特異的に増幅するように設計した。
プライマー９（配列番号９）：5’-TAgCTTAgCAAAgATTCC-3’
プライマー１０（配列番号１０）：5’-ACTTgCATCCACAACC-3’
プライマー１１（配列番号１１）：5’-AAgTCCCACCACLcLaAAAAAAALaLt-3’
（Ｌｃ，Ｌａ，Ｌｔはそれぞれシトシン塩基，アデニン塩基，チミン塩基をもつＬＮＡ）
プライマー１２（配列番号１２）：5’-gAAgACATTTTCTTgLaLtTTTTTTLtLg-3’
（Ｌａ，Ｌｔ，Ｌｇはそれぞれアデニン塩基，チミン塩基，グアニン塩基をもつＬＮＡ）
【００７４】
ＰＣＲ反応は、サンプルＤＮＡ１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社）２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）０．１μｌ、２０μＭのプライマー９を０．４μｌ、２０μＭのプライマー１０を０．２μｌ、２０μＭのプライマー１１を０．５μｌ、２０μＭのプライマー１２を０．８μｌ、水１３μｌからなる反応液で実施した。また、９５℃・２分の後に（９５℃・３０秒→６２℃・３０秒→７２℃・３０秒）を１５サイクル行い、さらに（９５℃・３０秒→６０℃・３０秒→７２℃・３０秒）を２５サイクル行った後に７２℃で５分反応させた。得られた反応産物１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）により分離し、エチジウムブロマイド染色の後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出した。
【００７５】
図５Ｂに示すように、ｏｇｃ変異遺伝子をもつトマト系統「ＮＴ６０４」では約０．３ｋｂに、リコペンβ−シクラーゼ遺伝子が野生型であるトマト品種「Ｔｒｏｐｉｃ」では約０．６ｋｂに十分な量の増幅ＤＮＡ断片がみられた。このように、両遺伝子それぞれを特異的に検出することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、医学、法医学、農学などの分野で、生物やウイルス由来の核酸の１塩基多型を、特異性を維持しながらＰＣＲ増幅することにより検出することを可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の1塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡ(locked nucleic acid)を含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記１塩基多型が、１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１塩基多型の検出が、増幅核酸断片のサイズに基づく方法によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記1塩基多型部位において他の多型を示す核酸断片を増幅するための第４のプライマーをさらに含み、該第４のプライマーは、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、前記第２の１塩基多型の塩基に相当する塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなるプライマーであり、前記第２および第３のプライマーのうち適するプライマーとプライマー対を形成することができるプライマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のプライマーの３'末端が、前記核酸の前記１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基であり、前記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３'末端の塩基の５'側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１塩基多型が１塩基欠失である場合、前記第１のプライマーの３’末端が、前記核酸の該１塩基欠失部位の３'側の１番目の塩基であり、前記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３'末端の塩基の５'側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１塩基多型が連続同一塩基からなる配列の多型である場合、前記第１のプライマーの３’末端が、前記核酸の該連続同一塩基の３'側に隣接する１番目の塩基であり、前記ＬＮＡが、少なくとも前記第１のプライマーの３'末端および前記核酸の該連続同一塩基の両端の塩基、および該連続同一塩基の５'側に隣接する１番目の塩基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
核酸の1塩基多型を検出するための方法であって、少なくとも１つのＬＮＡ(locked nucleic acid)を含み、かつ、該１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなる第1のプライマーと、該第１のプライマーを挟むように該核酸にアニーリング可能な１０〜５０塩基長からなる第２、第３等の複数のプライマーとを含む、合計３種またはそれ以上の１０〜５０塩基長のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、該核酸の断片を増幅し、１塩基多型を検出することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記１塩基多型が、１塩基置換、１塩基欠失、１塩基挿入、またはマイクロサテライトの多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１塩基多型の検出が、増幅核酸断片のサイズに基づく方法によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記1塩基多型部位において他の多型を示す核酸断片を増幅するための第４のプライマーをさらに含み、該第４のプライマーは、少なくとも１つのＬＮＡを含み、かつ、前記第２の１塩基多型の塩基に相当する塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基を含む１０〜５０塩基長からなるプライマーであり、前記第２および第３のプライマーのうち適するプライマーとプライマー対を形成することができるプライマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のプライマーの３'末端が、前記核酸の前記１塩基多型の塩基もしくはそれと塩基対を形成する相補的塩基であり、前記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３'末端の塩基の５'側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１塩基多型が１塩基欠失である場合、前記第１のプライマーの３’末端が、前記核酸の該１塩基欠失部位の３'側の１番目の塩基であり、前記ＬＮＡが、上記第１のプライマーの３'末端の塩基の５'側の、少なくとも１番目の塩基または少なくとも１番目および２番目の塩基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１塩基多型が連続同一塩基からなる配列の多型である場合、前記第１のプライマーの３’末端が、前記核酸の該連続同一塩基の３'側に隣接する１番目の塩基であり、前記ＬＮＡが、少なくとも前記第１のプライマーの３'末端および前記核酸の該連続同一塩基の両端の塩基、および該連続同一塩基の５'側に隣接する１番目の塩基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−３０５１４（Ｐ２０１１−３０５１４Ａ）
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８０９５４（Ｐ２００９−１８０９５４）
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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