１２−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒
【課題】ナイロン等の原料として有用な、１２−アミノドデカン酸を安価に製造する方法、及びその方法に使用する生体触媒を提供する。
【解決手段】ラウロラクタムに、ラウロラクタムを加水分解する活性を有する生体触媒として、酵素６−アミノヘキサノアート−サイクリックダイマー−ヒドロラーゼ、またはそれを持つ細菌ロドコッカス、クプリアビドス、スフィンゴモナス、またはアシドボラックスを接触させることによる、１２−アミノドデカン酸の製造方法。６−アミノヘキサノアート−サイクリックダイマー−ヒドロラーゼ酵素は、これら細菌の該遺伝子を大腸菌等に導入して作製する。
【解決手段】ラウロラクタムに、ラウロラクタムを加水分解する活性を有する生体触媒として、酵素６−アミノヘキサノアート−サイクリックダイマー−ヒドロラーゼ、またはそれを持つ細菌ロドコッカス、クプリアビドス、スフィンゴモナス、またはアシドボラックスを接触させることによる、１２−アミノドデカン酸の製造方法。６−アミノヘキサノアート−サイクリックダイマー−ヒドロラーゼ酵素は、これら細菌の該遺伝子を大腸菌等に導入して作製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１２−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１２−アミノドデカン酸は、ナイロン原料、接着剤原料、硬化剤原料等に用いられる、工業的に有用な化合物である。
【０００３】
従来、１２−アミノドデカン酸の製法は、１１−シアノウンデカン酸を還元する方法が知られている（特許文献１参照）。しかし、原料の１１−シアノウンデカン酸を得るまでの工程数が長く、安価な１２−アミノドデカン酸の製造方法とは言えない。
【０００４】
又、安価なラウロラクタムを原料とする１２−アミノドデカン酸の製法が検討されている。例えば、濃塩酸を用いたラウロラクタムの加水分解による製法が知られているが（非特許文献１参照）、生成する１２−アミノドデカン酸が塩を形成することから、当量以上の酸、塩基が必要であり、更に、その後の用途に用いるためには、脱塩する必要があり、実用的な製造方法とは言い難い。更に、無触媒での加水分解は、高温、高圧の反応条件が必要であり、副生物が生成し、エネルギー的にも好ましくない。
【０００５】
このように、安価な１２−アミノドデカン酸の製造方法が望まれているにもかかわらず、適切な製造方法は知られていない。
【０００６】
一方、菌体、酵素などの生体触媒によるアミノカプロン酸ダイマーなどのアミド結合の加水分解は種々報告されているが（例えば、非特許文献２参照）、ラウロラクタムを菌体、酵素などの生体触媒による加水分解によりアミノドデカン酸を製造する方法は、知られていない。
【０００７】
又、微生物から得られる生体触媒である６−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー ヒドロラーゼ（6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolase）は、公知の生体触媒であるが、その作用は、環状アミノヘキサン酸ダイマーにのみ作用し、１００種以上のアミド結合を持つ化合物について調べても、作用せず、さらに、ε−カプロラクタムをはじめとする５員環〜７員環の環状アミドも、基質となり得ないことが報告され（非特許文献３、４、５及び６参照）、基質であるラウロラクタムに作用することは知られていない。
【特許文献１】特公昭６０−１６３８４９号公報。
【非特許文献１】Chem.Ber., vol.98, p3251〜3254, 1965.
【非特許文献２】J.Ferment,Technol., vol.53, No.4, p223, 1975.
【非特許文献３】J.Bacteriol., vol.171, p3187〜3191, 1989.
【非特許文献４】Appl.Microbiol.Biotechnol., vol.54, p461〜466, 2000.
【非特許文献５】Eur.J.Biochem., vol.80,p489〜495, 1977.
【非特許文献６】発酵と工業 40巻 1002頁 1982年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、ナイロン原料等として有用な１２−アミノドデカン酸を、ラウロラクタムを原料として、安価に製造する方法及びその製造する方法に使用する生体触媒を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、安価に、１２−アミノドデカン酸を製造する方法について鋭意検討を行った結果、ラウロラクタムを加水分解して１２−アミノドデカン酸を生成する微生物類を見出し、その微生物類から、ラウロラクタムを加水分解する生体触媒（タンパク質）を単離し、その生体触媒（タンパク質）をコードするＤＮＡを特定し、さらに遺伝子組み換え操作により、形質転換体を得ることにより本発明を完成するに至った、
【００１０】
即ち、本発明は、ラウロラクタムに、ラウロラクタムを加水分解する活性を有する微生物の菌体又は菌体の処理物を作用させて、１２−アミノドデカン酸を生成することを特徴とする、１２−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、安価なラウロラクタムを出発原料として、一工程で、目的とする１２−アミノドデカン酸を製造でき、更に、脱塩等の煩雑な後処理工程が必要ないため、工業的に有利な１２−アミノドデカン酸の製造方法である。
【００１２】
又、この製造方法において、疎水性溶媒及び水の二層系中で、ラウロラクタムに、微生物の菌体又は菌体の処理物（生体触媒）を接触させることにより、反応終了後、濾別のような簡便な操作により、反応混合物中から、目的物である１２−アミノドデカン酸が単離され、生体触媒が存在する水相を有機相から分離して得られる生体触媒が、再度、ラウロラクタムの加水分解反応の触媒に使用できるという、予期されない効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用される微生物は、細菌、放線菌、真菌及び酵母の中から、ラウロラクタムを加水分解する活性を有するものから選ばれる。
例えば、細菌に属するものは、アクロモバクター属、アエロバクラター属、アエロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバクラター属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクテリウム属、エルウイニア属、エシェリヒア属、クレブシーラ属、スフィンゴモナス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ブロタミノバクター属、ブロテウス属、クプリアビドス属、スルシナ属、アシドボラックス属、セラチア属又はキサントモナス属であり得、放線菌に属するものは、アクチノミセス属、アクチノプラネス属、ミコバクテリウム属、ロドコッカス属又はストレプトミセス属であり得、真菌に属するものは、アスペルギルス属、パエシロミセス属又はペニシリウム属であり得、酵母に属するものは、キャンディダ属、ハンゼヌラ属、ピヒア属、ロードトルラ属又はトルロプシス属であり得る。
【００１４】
好ましい微生物は、アルカリゲネス属、バチルス属、スフィンゴモナス属、シュードモナス属、クプリアビドス属、アシドボラックス属又はロドコッカス属に属する微生物であり、更に好ましい微生物は、ロドコッカス属、クプリアビドス属、アシドボラック属又はスフィンゴモナス属に属する微生物であり、更により好ましい微生物は、ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１９）、クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１８）、クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１６）、スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４２０）又は アシドボラック ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ−Ｐ２０７３４）であり、特に好ましい微生物は、ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１９）、クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１６）又は アシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ−Ｐ２０７３４）であり、最も好ましい微生物は、 ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１９）又は クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１６）である。
【００１５】
後述するように、微生物 クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４、微生物 クプリアビドス ｓｐ Ｔ７、微生物 ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４、微生物 スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８及び微生物 アシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１は、新規な菌株であり、以下の菌学的性質を有する。
【００１６】
１．形態学的特徴
形態学的特徴は、以下の表１に示すとおりである。
【表１】
【００１７】
２．各種培地における生育状況
１）肉汁寒天平板培養
肉汁寒天平板培地中で、３０℃、３日間の培養後の生育状況を表２に示す。
【表２】
【００１８】
２）肉汁寒天斜面培養
肉汁寒天斜面培地中で、３０℃、３日間の培養後の生育状況を表３に示す。
【表３】
【００１９】
３）肉汁液体培養
肉汁液体培地中で、３０℃、３日間の培養後の生育状況を表４に示す。
【表４】
又、肉汁ゼラチン培養（３０℃、３週間）においては、各菌とも、ゼラチンの液化がみられなかった。
【００２０】
３．生理学的性質
各菌の生理学的性質を以下の表５に示す。
【表５】
【００２１】
又、次の生理学的性質を有していた。
【００２２】
即ち、ＭＲテスト、ＶＰテスト、インドール生成、硫化水素の生成及びでんぷんの加水分解は、各菌とも、マイナスであり、色素生成は、KingA培地及びKingB培地を用いて、寒天平板培養及び液体培養を行ったが、各菌とも、マイナスであり、生育範囲（ｐＨ及び温度）は、Ｕ１２４、Ｔ７、Ｕ２２４、Ｕ２３８及びＴ３１について、それぞれ、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．５及び１９℃〜３８℃、ｐＨ５．５〜ｐＨ９．０及び２２℃〜４４℃、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０及び１０℃〜３２℃、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．０及び１０℃〜３４℃、及びｐＨ６．０〜ｐＨ８．５及び１０℃〜４１℃であり、酸素に対する態度は、各菌とも、好気性であり、ＯＦテスト（Ｄ−グルコース）では、各菌とも、マイナスであった。
【００２３】
更に、糖類からの酸及びガスの生成は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−グルコース、Ｄ−マンノトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、グリセリン、デンプン、ラフィノース、イヌリン、Ｄ−リボース、ソルボース、カルボキシメチルセルローズ及びグリコーゲンの糖類については、各菌とも、マイナスであった。
【００２４】
４．抗生物質に対する感受性
各菌の各種の抗生物質に対する感受性を以下の表６に示す。
【表６】
【００２５】
又、フェニルアラニン脱アミノ酵素に対する感受性は、各菌とも、マイナスであった。
【００２６】
５．その他の諸性質
各菌のその他の諸性質を以下の表７に示す。
【表７】
【００２７】
又、アルギニンの分解、リジンの脱炭酸反応、オルニチンの脱炭酸反応、フェニルアラニンの脱アミノ反応、シアン化カリウムの耐性、ホスファターゼ耐性、３−ケト−乳酸の生成及び酒石酸の利用は、各菌とも、マイナスであった。
【００２８】
又、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を解析し、塩基配列データベースとの相同性を検討した
ところ、微生物 Ｕ１２４は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、クプリアビドス・ネカター（Cupriavidus necator）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９７．１８％であり、微生物 Ｕ２２４は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、ロドコッカス・ワラティスラビエンシス（Rhodococcus wratislaviensis）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．３９％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＮＳＡ６株に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．５％であり、微生物 Ｕ２３８は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、スフィンゴモナス・カプスァタ（Sphingomonas capsulata）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９４．２０％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、スフィンゴモナス・サバルクティカ（Sphingomonas subarctica）ＫＦＩ株（基準株）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は１００％であり、微生物 Ｔ７は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、クプリアビドス・ネカター（Cupriavidus necator）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９７．５９％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、クプリアビドス・タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis）ＬＭＧ １９４２４（基準株）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．７％であり、微生物 Ｔ３１は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、アシドボラックス・テンペランス（Acidovorax temperans）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．９３％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、アシドボラックス・テンペランス（Acidovorax temperans）ＣＣＵＧ １１７７９（基準株）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．７％であった。
【００２９】
以上の菌学的性質及び１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の相同性の結果をもとに、バージイス・マニュアル・オブ・システマティク・バイオロジー（Bergey's Manual of Systematic Biology）を参考にして、菌（微生物）、Ｕ１２４、Ｔ７、Ｕ２２４，Ｕ２３８及びＴ３１が、それぞれ、クプリアビドス（Cupriavidus）属、クプリアビドス（Cupriavidus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属及びアシドボラックス（Acidovorax）属に属することを決定し、微生物 Ｕ１２４は、クプリアビドス ｓｐ．（Cupriavidus sp.）と、微生物 Ｔ７は、クプリアビドス ｓｐ．（Cupriavidus sp.）と、微生物 Ｕ２２４は、ロドコッカス ｓｐ．（Rhodococcus sp.）と、微生物 Ｕ２３８は、スフィンゴモナス ｓｐ．（Sphingomonas sp.）、及び、微生物 Ｔ３１は、アシドボラックス ｓｐ．（Acidovorax sp.）と命名した。
【００３０】
又、微生物 Ｕ１２４、微生物 Ｔ７、微生物 Ｕ２２４及び微生物 Ｕ２３８の新菌株を、平成１７年２月１８日に、産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。その微生物受領番号は、微生物 Ｕ１２４、Ｔ７、Ｕ２２４及びＵ２３８について、それぞれ、ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１８、ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１６、ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１９及びＦＥＲＭ Ｐ−２０４２０である。
【００３１】
更に、微生物 Ｔ３１の新菌株を、平成１７年１２月１４日に、産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、その微生物受領番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３４である。
【００３２】
本発明を実施するに際し、酵素的に加水分解する方法としては、微生物（後述する、本発明の寄託された微生物のＤＮＡを用いて得られる形質変換体を含む）をその生育に適した培養条件下培養し、原料化合物を培養液中に添加して接触させる方法又は微生物を培養し、必要に応じて、集菌し、得られた微生物菌体、微生物菌体処理物、又は微生物菌体若しくは微生物菌体処理物を必要に応じて、精製して得られた生体触媒を原料化合物と接触させる方法が採用される。
【００３３】
微生物の培養方法は、通常、微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養することができる。
【００３４】
栄養物は、一般に微生物の培養に利用される公知のもの利用できる。炭素源は、例えば、グルコース、シュウクロース、マルトースなどの糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸などの有機酸類、エタノール、グリセリンなどのアルコール類、パラフィンなどの炭化水素類、大豆油、菜種油などの油脂類、またはこれらの混合物であり得、好ましくは、グルコースである。
【００３５】
又、窒素源は、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチーブリカー、またはこれらの混合物であり得、好ましくは、酵母エキスである。
【００３６】
更に、その他の無機塩、ビタミン類などの栄養源を適宜添加することもできる。
【００３７】
培養方法は微生物一般に用いられる培養法、例えば、液体培養が用いられる。
【００３８】
培養は、好気的に行われ、ｐＨは、４〜９であり得、好適には、６〜８であり、培養温度は、１５℃〜５０℃であり得、好適には、２０℃〜４０℃であり、培養時間は、５時間〜９６時間であり得、好適には、１０時間〜７２時間である。
【００３９】
原料化合物を培養液中に添加して接触させる方法は、原料化合物を添加し培養することによって行われる。添加時期は、使用する微生物の至適条件、特に培養装置、培地組成、培養温度などのより異なるが、初期培養に添加してもよく、培養の進行にあわせて添加してもよくが、微生物の加水分解能が高まりはじめる時期がよく、微生物の培養開始後１〜３日経過した時点が好ましい。原料の添加量は、培地に対して０．０１〜５０％であり得、好適には、０．１〜２０％である。原料化合物の添加後の培養は好気的条件で、上記培養温度で行われる。培養期間は、原料化合物の添加後、１０時間〜３日である。
【００４０】
微生物を培養し、得られた微生物菌体、微生物菌体処理物、又は微生物菌体若しくは微生物菌体処理物を必要に応じて、精製して得られた生体触媒を原料化合物と接触させる方法は、上記方法により微生物を少量の基質（ラウロラクタム）の存在下で培養し、微生物の加水分解能が最大となるまで培養する。微生物の加水分解能は、培地組成、培養温度などにより異なるが、通常培養開始後、１〜４日で、最大となるので、この時点で培養を終了する。
【００４１】
使用される微生物菌体等は、このように微生物を培養した培養物そのまま、培養物の濃縮物、培養物を遠心分離し若しくはろ過して集菌された菌体（湿菌体）、菌体（湿菌体）を化学的又は物理的処理をした菌体処理物又は菌体（湿菌体）若しくは菌体処理物を精製した生体触媒であり得、好ましくは、菌体（湿菌体）、菌体処理物又は生体触媒である。
【００４２】
又、生体触媒は、後述するように、本発明の寄託された微生物のＤＮＡを用いて、遺伝子操作により、得られた大腸菌への形質変換体を培養して得られる酵素も含み、また、公知の６−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー ヒドロラーゼ（6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolase：例えば、J.Bacteriol., vol.171, p3187〜3191, 1989等）をも含む。
【００４３】
菌体（湿菌体）は通常、生理食塩水、緩衝液などで洗浄して使用する。
【００４４】
又、化学的又は物理的処理をした菌体処理物は、例えば、菌体をアセトン、五酸化リン等を用いて、脱水処理するか又は／及びデシケーター、扇風機等を利用して、乾燥処理して得られる乾燥菌体、菌体を、ツィーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）のような界面活性剤で処理した界面活性剤処理物、菌体を、リゾチームのような溶菌酵素で処理した溶菌酵素処理物、固定化菌体又は菌体を破砕した無細胞抽出物であり得、好ましくは、乾燥菌体である。
【００４５】
微生物菌体又は処理物菌体処理物（例えば、乾燥菌体）の精製は、酵素を精製する常法に従って行われる。
【００４６】
例えば、微生物を培養して得られた菌体液を超音波処理し、無細胞抽出液として、遠心分離して、除核酸して処理を行う。得られた上清に、飽和量の硫安を加え（例えば、３０％飽和、６０％飽和、９０％飽和等）、通常０℃〜１０℃で、１０分間〜１時間攪拌した後、遠心分離して、沈殿物を得る。沈殿物は、必要に応じて、緩衝液（例えば、２０ｍＭＫＰＢ（リン酸緩衝液）等）で透析することもできる。
【００４７】
得られた硫安分画画分を、さらに、各種クロマトグラフィー、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー（例えば、カラムとして、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−トヨパールゲル、モノＱＨＲ５／５等を用いる）、疎水カラムクロマトグラフィー（例えば、カラムとして、ブチル−トヨパールゲル等を用いる）、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、カラムとして、セファデックス ２００ １０／３０ＧＬ等を用いる）等を用いて、さらに精製することができる。また、これらの精製方法は、適宜、順序を代えて、行うこともできる。
【００４８】
精製された酵素（生体触媒）の分子量は、常法、例えば、ゲル電気泳動法、ゲルろ過法等で、測定され、それらのＮ−末端アミノ酸配列は、常法、例えば、エドマン（Ｅｄｍａｎ）法等で測定される。
【００４９】
このようにして得られた微生物菌体、又は菌体処理物若しくは微生物菌体処理物を必要に応じて、精製して得られた生体触媒を原料化合物と接触させる方法は、通常水性媒体中、例えば、ｐＨ４〜１１（好ましくは、ｐＨ６〜９のリン酸緩衝液中）で、振とう又は攪拌しながら行う。
【００５０】
原料化合物であるラウロラクタムは、反応初期に一括に添加してもよく、反応の進行に従って、分割して添加しても良い。又、原料化合物であるラウロラクタムの濃度は、通常、０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）であり、好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。
【００５１】
反応温度は、１０℃〜７０℃であり得、好ましくは、２０℃〜６５℃であり、更に好ましくは、２５℃〜３５℃である。
【００５２】
反応時間は、反応温度等により異なるが、通常２時間〜５日であり、好ましくは、４時間〜３日である。
【００５３】
又、原料化合物であるラウロラクタムの溶解度を高めるため、必要に応じて、水溶性有機溶媒を添加することもできる。
【００５４】
使用される水溶性有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノールのようなアルコール類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランのようなエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドのようなアミド類又はジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類であり、好ましくは、アルコール類、アミド類又はスルホキシド類であり、更に好ましくは、スルホキシド類である。
【００５５】
更に、疎水性有機溶媒と水の二層系で加水分解反応を行うこともできる。
【００５６】
使用される疎水性有機溶媒は、例えば、ヘキサン、石油エーテルのような脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロルベンゼンのような芳香族炭化水素類又はブチルメチルエーテルのような高級脂肪族エーテルであり得、好ましくは、芳香族炭化水素類であり、更に好ましくは、トルエン又はクロルベンゼンであり、特に好ましくは、トルエンである。
【００５７】
ここで、疎水性有機溶媒と水の体積比は、疎水性有機溶媒／水が、９／１〜１／９であり、好ましくは、１／１〜１／５である。この場合、疎水性有機溶媒中のラウロラクタムの濃度は、０．０１〜１０％（Ｗ／Ｖ）である。
【００５８】
目的物である、１２−アミノドデカン酸の単離の容易性（沈殿する１２−アミノドデカン酸をろ過等により単離する等）及び加水分解触媒の再利用の観点からは、疎水性有機溶媒と水の二層系で加水分解反応を行うことが好ましい。
【００５９】
加水分解反応終了後、目的物である１２−アミノドデカン酸は、常法に従って、反応混合物から採取される。例えば、目的物である１２−アミノドデカン酸が沈殿する場合には、ろ取することにより、１２−アミノドデカン酸が沈殿しない場合には、反応混合物を遠心分離又はろ過して、微生物などの酵素源を除去し、溶媒を留去することにより、目的物である１２−アミノドデカン酸が得られる。更に、常法、例えば、再結晶、クロマトグラフィー等を用いて、更に精製することもできる。
【００６０】
又、疎水性有機溶媒と水の二層系で加水分解反応を行う場合には、加水分解反応終了後、反応混合物をろ過し、ろ液から水相を分取して、酵素溶液を得、それを再び、加水分解反応反応に使用することができる。
【００６１】
次いで、本発明の寄託された微生物のＤＮＡを用いて、遺伝子操作により、大腸菌への形質変換体を得る方法について、説明する。
本発明の寄託された微生物のＤＮＡは、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等を用いて取得すればよいが、これらを取得できる方法であれば如何なる方法を用いて取得してもよい。
【００６２】
例えば、本発明の寄託された微生物の細胞から、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （2001）等に記載される遺伝子工学的方法に準じてＤＮＡを取得することができる。
【００６３】
一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列の部分塩基配列又は当該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応や、上記ｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列又は当該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６４】
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約１５塩基から約５０塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列の５’側の翻訳開始点から始まる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列の３’側の翻訳終了点から始まる塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００６５】
ＰＣＲの条件としては、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、プライマー、鋳型ｃＤＮＡを含む組成の反応液にて、以下の条件による３工程の増幅サイクルを繰り返して行う。まず変性工程として、例えば約９０℃から約９６℃、好ましくは約９４℃から約９５℃で、１分から１５分間、好ましくは１分から２分間の保温を行う。次にプライマーのアニーリング工程として、例えば約３０℃から約７０℃、好ましくは約４０℃から約６０℃で、約３秒から約３分間、好ましくは約５秒間から約２分間の保温が行われる。さらにＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程として、たとえば、約７０℃から約７５℃、好ましくは約７２℃から約７３℃で、約１５秒間から約５分間、好ましくは約３０秒間から約４分間の保温が行われる。この３工程からなる増幅サイクルを、約２０回から約５０回、好ましくは約２５回から約４０回行う。このようなＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して精製した後、エタノール沈殿又は市販のＤＮＡ断片精製用のカラムを用いて、精製及び回収することができる。
【００６６】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、当該ポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１（ｗ／ｖ）フィコール４００、０．１（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）、０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、６５℃で保温し、次いで１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下に、室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下に、６８℃で３０分間保温する条件等を挙げることができる。
このようにして得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （2001）等に記載された遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
【００６７】
具体的には例えば、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）やpBluescriptII（Stratagene）等の市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの塩基配列は、Maxam Gilbert法やSanger法に準じて確認することができる。
【００６８】
次に、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例１
微生物 Ｕ２２４のアセトンパウダーを用いるラウロラクタムの加水分解
（１）ＴＧＹ液体培地の調製
ポリペプトン５ｇ、イースト抽出物５ｇ及び燐酸２水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）４．２ｇを純水９８０ｍｌに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液で、ｐＨ７に調製した。なお、平板培地の場合には、寒天１７ｇを加えた。
１２１℃で２０分間、滅菌後、別途滅菌したＤ−グルコースの１０％水溶液２０ｍｌを無菌的に加え、ＴＧＹ液体培地１Lを調製した。
【００７０】
（２）前培養
微生物 Ｕ２２４のスラントから白金耳を用い、菌体の一部をかき取り、バッフル付き１００ｍｌの三角フラスコ中のＴＧＹ液体培地に接種し、３０℃、旋回振とう（２００ｒｐｍ）で、７２時間培養した。
【００７１】
（３）本培養、
ＴＧＹ液体培地２００ｍｌを加えた、バッフル付き５００ｍｌの坂口フラスコ１０本に前培養の培地２ｍｌを接種し、３０℃、１６０ｒｐｍ（往復振とう）で、６０時間培養した。
培養終了後、液体培地を遠心分離（５０００ｒｐｍで１０分）で、集菌し、０．８５％食塩水で洗菌した。洗菌後、再び、遠心分離（５０００ｒｐｍで１０分）で、集菌し、湿菌６．２ｇを得た。
【００７２】
（４）アセトンパウダーの調製
１Ｌビーカーにアセトン０．５Ｌを加え、ドライアイス−メタノール浴中で、マグネッチックスターラを用いて、攪拌した。そこに、上記で得られた湿菌を純水２５ｍｌに再懸濁したものを少しづずつ加えた。その後、３分間攪拌を続けて、ヌッチェでろ過した。得られた固形物を冷アセトン及び冷エーテルで洗浄した後、デシケーター中で、一晩放置し、減圧で乾燥して、アセトン粉末を得た。粉末を回収して、冷蔵保存した。
【００７３】
（５）ラウロラクタムの加水分解
２ｍｌチューブに、アセトン粉末１ｍｇをはかり取り、そこに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍｌ及びラウロラクタムのトルエン溶液（１％Ｗ／Ｖ）０．２ｍｌを加え、ボルッテクスミキサーで混合した。その後、往復振とうして（２００ｒｐｍ）、３０℃で、２０時間反応させた。
反応終了後、反応混合物を−２０℃で凍結させた後、遠心濃縮器を用いて、減圧乾固した。その後，残渣にアセトニトリル１ｍｌ及びエステル化剤（ジメチルホルムアミドジメチルアセタール）０．２ｍｌを加え、ボルテックスミキサーで激しく振とうした後、ブロックヒーターを用いて、７０℃で、２時間反応させ、アミノドデカン酸メチルに転化させた。
室温まで放冷し、内部標準として、テトラデカン５ｍｇを加えて攪拌し、その溶液１μｌを採取して、ガスクロマトグラフィーを用いて、分析し、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率を決定し、収率４１％が得られた。
ガスクロマトグラフィーの測定条件
装置：島津 ＧＣ−１７００（昇温型）
カラム：ＤＢ−１７０１（３０ｍ、０．２５ｍｍＩＤ）
カラム温度：１５０℃（５分間）、１５０℃から２８０℃に昇温（２０℃／分）及び２８０℃（５分間）
Ｉｎｊ（注入部）：２７０
Ｄｅｔ．（検出部）：２８０、ＦＩＤ（検出器）
スプリット比： １：１０
保持時間：１２．３分（アミノドデカン酸メチル）、１１．３分（ラウロラクタム）、４．８分（テトラデカン：内部標準）
【００７４】
実施例２〜４
微生物 Ｕ１２４、微生物 Ｔ７及び微生物 Ｕ２３８のアセトンパウダーを用いるラウロラクタムの加水分解
微生物 Ｕ２２４の代わりに、それぞれ、微生物 Ｕ１２４（実施例２）、微生物 Ｔ７（実施例３）及び微生物 Ｕ２３８（実施例４）を用いて、実施例１と同様な操作を行い、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率を決定した。
【００７５】
その結果を以下の表８に示す。
【表８】
【００７６】
実施例５
微生物 Ｕ２２４を用いるラウロラクタムの加水分解
上記実施例１（１）〜（３）と同様の操作を行い、得られた湿菌体６．２ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに再懸濁し、休止菌体を得た。
【００７７】
１００ｍｌメジューム瓶に、ラウロラクタムのトルエン溶液（１％Ｗ／Ｖ）２０ｍｌを加え、マグネッチックスターラを用いて，攪拌した。そこに、上記休止菌体１０ｍｌを加え、密栓をして、攪拌しながら、３０℃で、２４時間反応させた。
【００７８】
反応終了後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、トルエンを留去させ、残った溶液を凍結乾燥させた。得られた残渣に、メタノール１００ｍｌを加え、激しく振とうして、抽出した。不溶物をろ過し、ろ液から溶媒を留去して、粗生成物を得た。この粗生成物にエタノール約２０ｍｌを加え、ホットプレート上で、還流した。素早くろ過し、ろ液を室温まで放冷し、ｎ−ヘキサンを数滴加え、−１８℃で、数時間放置した。生成した結晶をろ取して、目的物である１２−アミノドデカン酸９６ｍｇ（収率４４％）を得た。
【００７９】
得られた１２−アミノドデカン酸（メチルエステル体）のガスクロマトグラムは、標品の１２−アミノドデカン酸（メチルエステル体）のそれと一致した。
【００８０】
実施例６
微生物 Ｕ２２４由来のラウロラクタム加水分解酵素
（１）微生物 Ｕ２２４の大量培養
５ｍＬのＴＧＹ培地（０．５％ポリペプトン、０．５％イースト抽出物、０．１％燐酸２水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、０．１％Ｄ-グルコース、ｐＨ ７．０）で、微生物 Ｕ２２４を前培養した（２００ｒｐｍ、３０℃で１２時間）培養液を５００ｍｌのＴＧＹ培地に植菌し、バッフル付き２Ｌ坂口フラスコ中で、３０℃、振とう（９６ｒｐｍ）で、２４時間培養した。大型遠心機で集菌し（５０００ｒｐｍで１０分間、４℃）、生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で洗浄した後，培地５Ｌ分の菌体を、１００ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液に懸濁した。
【００８１】
（２）超音波及び除核酸処理
１００ｍＬの菌体液をガラスビーズ（０．５〜０．７５ｍｍ）と共に、３０分間超音波処理し、無細胞抽出液とした。無細胞抽出液に、プロタミン硫酸ナトリウムを５％加え、１０分間攪伴した後、大型遠心機で分離して（３０００ｒｐｍで１０分間、４℃）、上清を得た。
【００８２】
上記無細胞抽出液（上清）を用いて、実施例１（５）に準じて、ラウロラクタムの加水分解を行い（３０℃、ｐＨ ７．０）、ガスクロマトグラフィー分析を行い、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率を測定し、この収率から、比活性 ０．０７Ｕ／ｍｇを得た。なお、比活性は、酵素１ｍｇ当たりの活性ユニット（Ｕ）であり、ここで、活性ユニット（Ｕ）は、反応温度が３０℃で、反応ｐＨが７．０である反応条件において、１分間に、ラウロラクタムの加水分解の目的物である１２−アミノドデカン酸が生成する量（μモル）である。つまり、０．０７Ｕ／ｍｇは、上記無細胞抽出液から得られた粉末酵素１ｍｇあたり、反応温度が３０℃で、反応ｐＨが ７．０である反応条件において、１分間に、１２−アミノドデカン酸が０．０７μモル生成することを意味する。
【００８３】
又、上記無細胞抽出液（上清）０．５ｍＬを採り、Bradford法を用いて、タンパク質濃度を測定し、全タンパク質量 １２０１ｍｇを得た。
【００８４】
以下の（３）〜（７）で得られた酵素についても、上記と同様の操作により、比活性及び 全タンパク質量を決定した。
【００８５】
（３）硫安分画
無細胞抽出液（上清）を氷中にてスターラーで撹拌しながら、３０％飽和となるように粉末状硫安を少しずつ加えた。３０分間撹拌した後、遠心分離した（８０００ｒｐｍで１０分間、４℃）。上清を氷中で撹拌しながら、６０％飽和となるように粉末状硫安を加え、３０分間撹拌した後、遠心分離した。同様に、９０％飽和となるように粉末状硫安を加え、遠心分離した。各ステップで得られた沈殿（０〜３０％画分、３０〜６０％画分及び６０〜９０％画分）を５ｍＬの２０ｍＭ ＫＰＢ（リン酸緩衝液）に懸濁し、５Ｌの同緩衝液（ｘ３回）にて、１晩透析を行った。
透析した３０〜６０％硫安分画画分の酵素の比活性は、０．１２Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、２００ｍｇであった。
【００８６】
（４）イオン交換カラムクロマトグラフィー
２０ｍＭ ＫＰＢにより平衡化したＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−トヨパールゲル１５ｍｌをカラムに充填し、透析した３０〜６０％硫安分画画分の酵素をカラムに吸着させた。１００ｍＬの２０ｍＬ ＫＰＢでカラムを洗浄した後、２０ｍＭ ＫＰＢ ２００ｍＬ及び５００ｍＭ ＮａＣｌ を含む２０ｍＭ ＫＰＢ ２００ｍＬを用いて、グラジエントによりＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、１５ｍＬずつ試験管にフラクションを採取し、各フラクションのラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。
透析後の酵素の比活性は、０．６１Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、３８．１ｍｇであった。
【００８７】
（５）疎水カラムクロマトグラフィー
上記（４）における、活性が認められたフラクション３９ｍＬに、３０％飽和となるように硫安を加え、遠心分離して、上清を得た。硫安３０％飽和にした、２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したブチル−トヨパールゲル５ｍＬに酵素液を吸着させた。硫安３０％飽和にした、２０ｍＭ ＫＰＢでカラムを洗浄した後、２０ｍＭ ＫＰＢ ３０ｍＬ及び硫安３０％飽和にした２０ｍＭ ＫＰＢ ３０ｍＬを用いて、グラジエントにより硫安濃度を徐々に下げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、３ｍＬずつ試験管にフラクションを採取し、各フラクションのラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。透析した後、酵素液を限外ろ過にて200μLまで濃縮した。
濃縮した酵素（上清）の比活性 １．３１Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、１２．８ｍｇであった。
【００８８】
（６）イオン交換カラムクロマトグラフィー
中圧高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、カラム：２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したモノＱ ＨＲ５／５カラム）を用いた。サンプルループに酵素液２００μＬを注入し、２０ｍＭ ＫＰＢ及び０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢの２つの溶媒を用いて、ＦＰＬＣのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５ｍＬ）のラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め。１晩透析した。透析した後、酵素液を限外ろ過にて200μLまで濃縮した。
濃縮した酵素（上清）比活性は、４．６７Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、１．８ｍｇであった。
【００８９】
（７）ゲルろ過クロマトグラフィー
中圧高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、カラム：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したセファデックス（Sephadex）２００ １０／３０ＧＬカラム）を用いた。サンプルループに酵素液２００μＬを注入し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢの溶媒を用いて、ＦＰＬＣのシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５ｍＬ）のラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。
【００９０】
透析された酵素の比活性は、６．５４Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、０．１ｍｇあった。
【００９１】
透析された酵素の分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて、測定し、約４７ｋＤａ（キロダルトン）であり、ＨＰＬＣを用いるゲルろ過法（カラム：Sephadex ２００ＨＲ １０／３０、流出溶媒（流速）：１５０ｍＭ ＮａＣｌ含む２０ｍＭ ＫＰＢ（０．８ｍＬ／分）、検出器：ＵＶ検出器、吸光度２８０ｎｍ）を用いて、測定して、約７９．５ｋＤａ（キロダルトン）であった。
【００９２】
なお、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を以下の条件で行った。
【００９３】
泳動ゲルとして、３６％アクリルアミド ５．２５ｍＬ、０．６８Ｍ トリス（Tris:ｐＨ ８．８）８．２５ｍＬ、１％ＳＤＳ（ソディウムドデシルサルフェート）１．５８ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）１８７．５μＬ、２％ＡＰＳ（アンモニウムパーサルフェート）５６２．５μＬ組成のゲルに３６％ ポリアクリルアミド ０．５ｍＬ、０．１７９Ｍ トリス（Tris:ｐＨ ６．８）３．５ｍＬ、１％ＳＤＳ０．５ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ１２５μＬ、２％ＡＰＳ３７５．１μＬ組成の濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液（グリセロール２００μＬ、１Ｍ トリス（Tris）４０μＬ、水３６０μＬ、２−メルカプトエタノール２００μＬ及び１０％ＳＤＳ２００μＬ）と等量混合した精製酵素サンプル２５μＬをランニング緩衝液（トリス３．０３ｇ、グリシン １４．１４ｇ及びＳＤＳ１０ｇ）中、３０ｍＡで電気泳動を行い、その後、1時間タンパク染色液（ＣＢＢ（クマジーブリリアントブルー）２．５ｇ、メタノール５００ｍＬ、酢酸 ５０ｍＬ及び超純水４５０ｍＬ）で染色し、脱色液（メタノール：酢酸：水＝３：１：６）でバンドが鮮明になるまで脱色した。
【００９４】
透析された酵素酵素のＮ−末端アミノ酸配列は、エドマン（Edman）法により決定し、その結果を配列番号２５に示す。
【００９５】
実施例７
微生物 Ｔ７由来のラウロラクタム加水分解酵素
微生物 Ｕ２２４の代わりに、微生物 Ｔ７を用いて、実施例６と同様の操作を行い、最後に、再度、中圧高速液体クロマトグラフィー（カラム：２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したモノＱ ＨＲ５／５カラム）を用いて、精製して、目的とする加水分解酵素を得た。
【００９６】
また、実施例６と同様にして、得られた酵素の比活性及び全タンパク質量を求めた結果、超音波及び除核酸処理された酵素、ゲルろ過クロマトグラフィーで精製された酵素及び最後に中圧高速液体クロマトグラフィーで精製された酵素の比活性（及び全タンパク質量）は、それぞれ、０．０２Ｕ／ｍｇ（１６７０ｍｇ）、１．２４Ｕ／ｍｇ（０．４ｍｇ）及び２．２４Ｕ／ｍｇ（０．２ｍｇ）であった。
【００９７】
又、最後に中圧高速液体クロマトグラフィーで精製された酵素は、ＨＰＬＣを用いるゲルろ過法に用いるＨＰＬＣにおいて、単一のピークを示し、その保持時間は、実施例６のゲルろ過クロマトグラフィーで精製された酵素とほぼ同一であった。
【００９８】
実施例８
微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素
（１）前培養
実施例１８で得られた微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌のスラントから白金耳を用い、菌体の一部をかき取り、バッフル付き１Ｌ三角フラスコ中のＬＢ培地（Car（カルベニシリン）１００μｇ／ｍＬ）１００ｍＬに接種し、３７℃、旋回振とう（２００ｒｐｍ）で、１６時間培養した。
【００９９】
（２）本培養
バッフル付き１２Ｌの培養器（ナルゲン製）中、１０Ｌの Terrific Broth（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）に前培養の培地１００ｍＬを接種し、３７℃で、好気培養した。接種６時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を加え、インキュベーターの温度を３０℃に設定して、さらに、１２時間培養した。
培養終了後、液体培地を遠心分離（５，０００ｒｐｍで１０分、４℃）により、集菌し、０．８５％食塩水で洗菌した。洗菌した後、再び、遠心分離（５，０００ｒｐｍで１０分）により、集菌し、湿菌体９５．２ｇを得た。得られた湿菌体を超音波破砕し、遠心分離をした後、ストレプトマイシンを添加して、核酸成分を除去した。その後、３０〜６０％硫安分画画分を分取し、透析チューブにて、透析した後、凍結乾燥して、粉末酵素７．７ｇを得た。
【０１００】
実施例９
微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素
微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌の代わりに、実施例２３で得られた、微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌を用いて、実施例８と同様に、培養及び単離を行い、湿菌体１２３ｇ及び粉末酵素３．０ｇを得た。
【０１０１】
実施例１０
微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素を用いるラウロラクタムの加水分解
【０１０２】
（１）２ｍｌチューブに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３５０μＬ、０．１Ｍラウロラクタム溶液（１９．６ｍｇのラウロラクタムを１ｍＬのトルエン又はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた溶液）５０μＬ及び酵素溶液（微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素（実施例８の酵素）１０ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに溶解させた溶液又はこの溶液を水で１０倍希釈させた溶液）１００μＬを加え、往復振とうして（２５０ｒｐｍ）、３０℃で、１時間反応させた。
反応終了後、実施例１に準じて、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、トルエンを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率６２％及び１７％を得た。また、ＤＭＳＯを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率６７％及び１５％を得た。
【０１０３】
（２）３０ｍスクリュー管中に、ラウロラクタム０．０９９ｇ、実施例８の酵素５０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ及びクロルベンゼン９ｍＬの混合溶液（なお、ガスクロマトグラフィー分析の内部標準物質として、テトラデカン０．１００ｇを含む）を入れ、密栓して、マグネチックスターラで激しく攪拌しながら、３０℃で、反応させた。
反応開始後、３時間及び６時間後に、反応混合物の有機相からサンプル０．１ｍＬを分取し、メタノール０．９ｍＬを加えて、実施例１に準じて、ガスクロマトグラフィー分析を行い、それぞれ、原料であるラウロラクタムの転化率４６．４％及び７４．１％を得た。
【０１０４】
（３）１１０ｍＬのスクリュー管中に、ラウロラクタム０．４００ｇ、実施例８の酵素２００ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌ及びトルエン３６ｍＬの混合溶液を入れ、密栓して、マグネチックスターラで激しく攪拌しながら、３０℃で、６時間反応させた。
反応終了後、反応混合物をろ過し、得られた白色析出物をトルエン及び純水で洗浄・溶解させ、減圧で、溶媒を留去・乾燥させ、白色粉末として、粗１２−アミノドデカン酸０．４３１ｇ得た。
この白色粉末の純度は、ガスクロマトグラフィー分析により、８７．４％であった（収率 ８６％）。
【０１０５】
（４）３０ｍｌスクリュー管中に、ラウロラクタム０．９８６ｇ、実施例８の酵素５０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ及びトルエン９ｍＬの混合溶液（なお、ガスクロマトグラフィー分析の内部標準物質として、テトラデカン０．１００ｇを含む）を入れ、密栓して、マグネチックスターラで激しく攪拌しながら、３０℃で、１０時間反応させた。
反応終了後、反応混合物の有機相からサンプル０．１ｍＬを分取し、メタノール０．９ｍＬを加えて、実施例１に準じて、ガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率９９．８％を得た。
又、反応混合物をろ過し、白色析出物をトルエン約５ｍＬ及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）約１ｍＬで洗浄した。ろ液と洗浄液を合せて、水相を分離させ、反応に1回使用した酵素溶液を得た。
この反応に1回使用した酵素溶液を用いて、上記と同様の加水分解反応、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率９９．６％を得た。
ついで、同様にして、反応に２回使用した酵素溶液を得て、それを用いて、上記と同様の加水分解反応、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率９７．４％を得た。
【０１０６】
実施例１１
微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素を用いるラウロラクタムの加水分解
（１）実施例８の酵素の代わりに、微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素（実施例９の酵素）を用いる他、実施例１０（１）と同様にして、トルエンを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率４４％及び１．７％を得た。また、ＤＭＳＯを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率２５％及び１．６％を得た。
【０１０７】
（２）実施例８の酵素の代わりに、実施例９の酵素を用いる他、実施例１０（２）と同様に反応を行い、反応開始後の３時間及び６時間について、それぞれ、原料であるラウロラクタムの転化率２５．６％及び４６．１％を得た。
【０１０８】
実施例１２
微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
（１）微生物 Ｔ３１の染色体ＤＮＡ及びプラスミドの精製
（ｉ）微生物 Ｔ３１の染色体ＤＮＡの抽出
微生物 Ｔ３１をＴＧＹ培地３ｍＬで、３０℃、２００ｒｐｍ（振とう）で、１２時間培養した。培養液１ｍLから菌体を遠心分離して（１５，０００ｒｐｍで５分間、４℃）、集菌した。ＳＴＥ緩衝液（ＮａＣｌ ０．５８４ｇ、１Mトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬ及び０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２００μＬを超純水で１００ｍＬに定量したもの）１ｍＬで洗浄した後，同緩衝液に懸濁した。６８℃で、１５分間加熱した後、遠心分離し（１５，０００ｒｐｍで５分間、4℃）、上清を除いて、リゾチーム−ＲＮａｓｅ液（リゾチーム ５ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬＲＮａｓｅ１０ｍＬを１液：グルコース０．９ｇ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２．５ｍＬ、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２ｍＬを超純水で、１００ｍＬに定量したもの１ｍＬで溶解したもの）３００μＬに懸濁した。３７℃で３０分間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ／Ｌ 液 （プロテイナーゼＫ１０ｍｇ／Ｌ液１ｍＬ）６μＬを加え、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。Ｎ−ラウロイルザリコシン３ｍｇを加えて、穏やかに混合した後、３７℃で３時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム処理を穏やかに２回行った。上清３００μＬに５ＭＮａＣＬ溶液１０μＬとエタノール６００μＬを加えて混合した後、遠心分離した（１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）。７０％エタノールで洗浄した後、風乾し、ＴＥ緩衝液１００μＬに溶解し、目的とする染色体ＤＮＡを得た。
【０１０９】
（ii）微生物 Ｔ３１のプラスミドの抽出
ＴＧＹ培地１０ｍＬで，３０℃、２００ｒｐｍ（振とう）で、２４時間培養した、微生物 Ｔ３１菌体をディスポチューブ内で、遠心分離して（３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）、集菌した。ＴＥ緩衝液で洗浄した後、ＴＥＮＳ溶液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２０％サッカロース）４００μＬに懸濁し、リゾチーム１０ｍｇを加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。懸濁液に、１０％ＳＤＡ４０μＬと５Ｎ ＮａＯＨ４０μＬを加え、１０分間、氷冷し、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）６００μＬを加えて、再び１０分間氷冷した。遠心分離した（１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）後、上清を２回フェノール−クロロホルムで処理し、スピッツ管中でエタノール２．７ｍＬを加え、−８０℃で３０分間インキュベートして、遠心分離した（３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）。７０％エタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液２０μＬに溶解し、目的とするプラスミドを得た。
【０１１０】
（２）微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の増幅
ＰＣＲ反応液の組成は，水３５μＬ、１０ｘBlend Taq buffer ５μＬ、２ｍＭ dNTP ５μＬ、１００pmol プライマー１（5'-AGAAGGAGCGCGACAGTGAGCAAGGTGGAC-3'：配列番号１３）１μＬ、１００ pmolプライマー２（5'-CATCTCCCGCAAGCATCAGGCCGCTGGGATC-3'：配列番号１４）１μＬ、Template ＤＮＡ２μＬ及びBlend Taq １μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８．０℃で５分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間及び（ii）までを２４サイクルとし、（ｖ）４℃で、連続的に続けた。増幅した微生物 Ｔ３１由来の遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE（USA）社のＧｅｌ−Ｍ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて抽出した。
【０１１１】
（３）微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子配列のシーケンシング
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー１、プライマー２、プライマー３（5'-GCGGCGGGGTTCGTTTTGCTCGGCAAA-3'：配列番号１５）及び、プライマー４（5'-CGAGATAAAGGCGGACTGACGCCCTTC-3'：配列番号１６）を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、１．６μＬの各プライマー、１．６μＬの 16s ｒＤＮＡ（ＰＣＲ産物）、１μＬのBigDyeプレミックスソリューション、１．６μＬの５ｘBigDye シーケンシングバッファーと２．８μＬの 滅菌水とし、全量１０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９６℃で２分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間、（ｖ）（ii）〜（iv）を２５回及び（vi）７２℃で５分間とした。
【０１１２】
ＰＣＲ産物に、１μＬの３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、１μＬの０．１２５ＭＥＤＴＡと２５μＬのエタノールを加え、室温で１５分間放置した後、遠心分離により（１５，０００ｒｐｍで１５分間、４℃）、沈殿させた。上清を廃棄した後、１０μＬの Hi Di Formamideを加え、１００℃で５分間加熱した後に、氷水で急冷したものをABI PRISM（登録商標）310 Genetic Analyzerで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はGenetyxで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。
【０１１３】
（４）微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
Ligationの組成は、遺伝子 ５μＬ、pT7 Blue T-Vecter （Novagen）１μＬ、T4 ligase buffer １μＬ、T4 ligase １μＬ及び水２ｍＬとし、１６℃で一晩反応させた。大腸菌（E.coli JM 109）のコンピテントセル９０μＬに１μＬのpT7 Blue T-Vecterを加え、ヒートショック法で形質転換を行った。８０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むLB培地 （１．０％ ポリペプトン、０．５％イースト抽出物及び１．０％ＮａＣｌ）に生育したコロニーを２５株選別し、TLCによる活性とEcoRIとHindIII処理によるインサートの有無の確認を行った。
【０１１４】
実施例１３
微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｔ７を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１１５】
実施例１４
微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｕ１２４を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 のE.coli JM 109への形質転換体を得た。
【０１１６】
実施例１５
微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｕ２２４を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１１７】
実施例１６
微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｕ２３８を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１１８】
実施例１７
微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
【０１１９】
（１）微生物 Ｔ３１の代わりに、Ｕ２２４を用いて、実施例１２（１）と同様な操作を行い、得られた微生物 Ｕ２２４由来のプラスミド（ｐＵ２２４）の５つのポイントミューテーションを、QuikChange（登録商標）Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて行った。
【０１２０】
反応組成は、２．５μＬのl QuikChange（登録商標）Multi reaction buffer、１μＬの dNTP mix、９．５μＬの水、５０ｎｇのds-DNA template （ｐＵ２２４）、以下の４センス プライマー（sense primer）及び以下の４のアンチセンス プライマー（antisense primer）、それぞれ、５０ｎｇ及び１μＬの QuikChange（登録商標）Multi enzyme blend、
センスプライマー１（5'-AAAACTAATACACCGGAGATGGGCAATCAG-3'：配列番号１７）、
センスプライマー２（5'-CGCACGGCAATGACGCGGCAGGTTCCGTGC-3'：配列番号１８）、
センスプライマー３（5'-CTTCCTCAAGGACTACTCGACGATTTGCGA-3'：配列番号１９）、
センスプライマー４（5'-TCTCGGGCAGTCTGCAGATGCTGGCCTTCA-3'：配列番号２０）、
アンチセンスプライマー１（5'-CTGATTGCCCATCTCCGGTGTATTAGTTTT-3'：配列番号２１）、
アンチセンスプライマー２（5'-GCACGGAACCTGCCGCGTCATTGCCGTGCG-3'：配列番号２２）、
アンチセンスプライマー３（5'-TCGCAAATCGTCGAGTAGTCCTTGAGGAAG-3'：配列番号２３）、
アンチセンスプライマー４（5'-TGAAGGCCAGCATCCGCAGACTGCCCGAGA-3'：配列番号２４）
とした。
【０１２１】
ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９５℃で１分間、（ii）５５℃で１分間、（iii）６５℃で８分間及び（iv）（ｉ）〜（iii）を２５回とした。反応終了後、１μＬのＤｐｎＩを 加え、１時間インキュベートした後、大腸菌（E.coli JM109）へ導入した。
【０１２２】
ミューテーション後のＤＮＡシーケンシングはサイクルシーケンス反応により行った。得られたプラスミドをｐＵ２２４Ｍとした。
【０１２３】
ｐＵ２２４Ｍのシーケンスは、公知のフラボバクテリウム・エスピー（Flavobacterium sp.）Ｋ１７２株由来の遺伝子（F-nylA）のアミノ酸配列（配列番号１２）と一致した。
【０１２４】
（２）微生物 Ｔ３１由来のプラスミドの代わりに、ｐＵ２２４Ｍを用いて、実施例１２（２）〜（４）と同様な操作を行い、微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１２５】
実施例１８
微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
【０１２６】
（１）ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の増幅
実施例１２（４）で調製した、微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１２（１）と同様にして得たプラスミドをTemplate DNAとした。
ＰＣＲ反応液の組成は、水３５μＬ、１０ｘ Blend Taq buffer ５μＬ、２ｍＭ dNTP ５μＬ、１００ pmol/μＬ プライマー５（5'-ACAGCGAAGCTTTAAGGAGGAATAGACAATGAGCAAGGTGGACCTTTGG-3'：配列番号２６）1 μＬ、 １００ pmol/μＬ プライマー６ （5'-GGAGGACGTCTAGATCAGGCCGCTGGGATC-3'：配列番号２７）１μＬ、Template DNA １００ｎｇ及びBlend Taq ５ unitとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８．０℃で５分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間及び（ii）までを２４サイクルとし、４℃で連続的に続けた。
【０１２７】
（２）ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子のｐＵＣ１９ベクターへの組み換えと大腸菌（E.coli JM109）への形質転換
ＰＣＲ反応で得られた、それぞれの菌株由来のＰＣＲ産物５μＬに、１μＬ HindIIIと１μＬ XbaIを加え、３７℃で１時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、５μＬ DNA、１μＬ ｐＵＣ１９（増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの）、２μＬ T4 DNA ligase bufferと１μＬ T4 DNA ligaseとし、１６℃で1晩インキュベートした。得られたベクター を、ヒートショック法により、大腸菌（E.coli JM109）に導入した。
【０１２８】
実施例１９
微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１３で調製した、微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１２９】
実施例２０
微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１４で調製した、微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１３０】
実施例２１
微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１５で調製した、微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１３１】
実施例２２
微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１６で調製した、微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１３２】
実施例２３
微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１７で調製した、微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、ナイロン原料、接着剤原料、硬化剤原料等に用いられ、工業的に有用な１２−アミノドデカン酸を製造する方法及びその製造する方法に使用する生体触媒に関し、安価なラウロラクタムを出発原料として、１工程で、目的とする１２−アミノドデカン酸を製造でき、更に、脱塩等の煩雑な後処理工程が必要ないため、工業的に有利な１２−アミノドデカン酸の製造方法である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１２−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１２−アミノドデカン酸は、ナイロン原料、接着剤原料、硬化剤原料等に用いられる、工業的に有用な化合物である。
【０００３】
従来、１２−アミノドデカン酸の製法は、１１−シアノウンデカン酸を還元する方法が知られている（特許文献１参照）。しかし、原料の１１−シアノウンデカン酸を得るまでの工程数が長く、安価な１２−アミノドデカン酸の製造方法とは言えない。
【０００４】
又、安価なラウロラクタムを原料とする１２−アミノドデカン酸の製法が検討されている。例えば、濃塩酸を用いたラウロラクタムの加水分解による製法が知られているが（非特許文献１参照）、生成する１２−アミノドデカン酸が塩を形成することから、当量以上の酸、塩基が必要であり、更に、その後の用途に用いるためには、脱塩する必要があり、実用的な製造方法とは言い難い。更に、無触媒での加水分解は、高温、高圧の反応条件が必要であり、副生物が生成し、エネルギー的にも好ましくない。
【０００５】
このように、安価な１２−アミノドデカン酸の製造方法が望まれているにもかかわらず、適切な製造方法は知られていない。
【０００６】
一方、菌体、酵素などの生体触媒によるアミノカプロン酸ダイマーなどのアミド結合の加水分解は種々報告されているが（例えば、非特許文献２参照）、ラウロラクタムを菌体、酵素などの生体触媒による加水分解によりアミノドデカン酸を製造する方法は、知られていない。
【０００７】
又、微生物から得られる生体触媒である６−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー ヒドロラーゼ（6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolase）は、公知の生体触媒であるが、その作用は、環状アミノヘキサン酸ダイマーにのみ作用し、１００種以上のアミド結合を持つ化合物について調べても、作用せず、さらに、ε−カプロラクタムをはじめとする５員環〜７員環の環状アミドも、基質となり得ないことが報告され（非特許文献３、４、５及び６参照）、基質であるラウロラクタムに作用することは知られていない。
【特許文献１】特公昭６０−１６３８４９号公報。
【非特許文献１】Chem.Ber., vol.98, p3251〜3254, 1965.
【非特許文献２】J.Ferment,Technol., vol.53, No.4, p223, 1975.
【非特許文献３】J.Bacteriol., vol.171, p3187〜3191, 1989.
【非特許文献４】Appl.Microbiol.Biotechnol., vol.54, p461〜466, 2000.
【非特許文献５】Eur.J.Biochem., vol.80,p489〜495, 1977.
【非特許文献６】発酵と工業 40巻 1002頁 1982年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、ナイロン原料等として有用な１２−アミノドデカン酸を、ラウロラクタムを原料として、安価に製造する方法及びその製造する方法に使用する生体触媒を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、安価に、１２−アミノドデカン酸を製造する方法について鋭意検討を行った結果、ラウロラクタムを加水分解して１２−アミノドデカン酸を生成する微生物類を見出し、その微生物類から、ラウロラクタムを加水分解する生体触媒（タンパク質）を単離し、その生体触媒（タンパク質）をコードするＤＮＡを特定し、さらに遺伝子組み換え操作により、形質転換体を得ることにより本発明を完成するに至った、
【００１０】
即ち、本発明は、ラウロラクタムに、ラウロラクタムを加水分解する活性を有する微生物の菌体又は菌体の処理物を作用させて、１２−アミノドデカン酸を生成することを特徴とする、１２−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、安価なラウロラクタムを出発原料として、一工程で、目的とする１２−アミノドデカン酸を製造でき、更に、脱塩等の煩雑な後処理工程が必要ないため、工業的に有利な１２−アミノドデカン酸の製造方法である。
【００１２】
又、この製造方法において、疎水性溶媒及び水の二層系中で、ラウロラクタムに、微生物の菌体又は菌体の処理物（生体触媒）を接触させることにより、反応終了後、濾別のような簡便な操作により、反応混合物中から、目的物である１２−アミノドデカン酸が単離され、生体触媒が存在する水相を有機相から分離して得られる生体触媒が、再度、ラウロラクタムの加水分解反応の触媒に使用できるという、予期されない効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用される微生物は、細菌、放線菌、真菌及び酵母の中から、ラウロラクタムを加水分解する活性を有するものから選ばれる。
例えば、細菌に属するものは、アクロモバクター属、アエロバクラター属、アエロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバクラター属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクテリウム属、エルウイニア属、エシェリヒア属、クレブシーラ属、スフィンゴモナス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ブロタミノバクター属、ブロテウス属、クプリアビドス属、スルシナ属、アシドボラックス属、セラチア属又はキサントモナス属であり得、放線菌に属するものは、アクチノミセス属、アクチノプラネス属、ミコバクテリウム属、ロドコッカス属又はストレプトミセス属であり得、真菌に属するものは、アスペルギルス属、パエシロミセス属又はペニシリウム属であり得、酵母に属するものは、キャンディダ属、ハンゼヌラ属、ピヒア属、ロードトルラ属又はトルロプシス属であり得る。
【００１４】
好ましい微生物は、アルカリゲネス属、バチルス属、スフィンゴモナス属、シュードモナス属、クプリアビドス属、アシドボラックス属又はロドコッカス属に属する微生物であり、更に好ましい微生物は、ロドコッカス属、クプリアビドス属、アシドボラック属又はスフィンゴモナス属に属する微生物であり、更により好ましい微生物は、ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１９）、クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１８）、クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１６）、スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４２０）又は アシドボラック ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ−Ｐ２０７３４）であり、特に好ましい微生物は、ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１９）、クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１６）又は アシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ−Ｐ２０７３４）であり、最も好ましい微生物は、 ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１９）又は クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ−Ｐ２０４１６）である。
【００１５】
後述するように、微生物 クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４、微生物 クプリアビドス ｓｐ Ｔ７、微生物 ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４、微生物 スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８及び微生物 アシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１は、新規な菌株であり、以下の菌学的性質を有する。
【００１６】
１．形態学的特徴
形態学的特徴は、以下の表１に示すとおりである。
【表１】
【００１７】
２．各種培地における生育状況
１）肉汁寒天平板培養
肉汁寒天平板培地中で、３０℃、３日間の培養後の生育状況を表２に示す。
【表２】
【００１８】
２）肉汁寒天斜面培養
肉汁寒天斜面培地中で、３０℃、３日間の培養後の生育状況を表３に示す。
【表３】
【００１９】
３）肉汁液体培養
肉汁液体培地中で、３０℃、３日間の培養後の生育状況を表４に示す。
【表４】
又、肉汁ゼラチン培養（３０℃、３週間）においては、各菌とも、ゼラチンの液化がみられなかった。
【００２０】
３．生理学的性質
各菌の生理学的性質を以下の表５に示す。
【表５】
【００２１】
又、次の生理学的性質を有していた。
【００２２】
即ち、ＭＲテスト、ＶＰテスト、インドール生成、硫化水素の生成及びでんぷんの加水分解は、各菌とも、マイナスであり、色素生成は、KingA培地及びKingB培地を用いて、寒天平板培養及び液体培養を行ったが、各菌とも、マイナスであり、生育範囲（ｐＨ及び温度）は、Ｕ１２４、Ｔ７、Ｕ２２４、Ｕ２３８及びＴ３１について、それぞれ、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．５及び１９℃〜３８℃、ｐＨ５．５〜ｐＨ９．０及び２２℃〜４４℃、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０及び１０℃〜３２℃、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．０及び１０℃〜３４℃、及びｐＨ６．０〜ｐＨ８．５及び１０℃〜４１℃であり、酸素に対する態度は、各菌とも、好気性であり、ＯＦテスト（Ｄ−グルコース）では、各菌とも、マイナスであった。
【００２３】
更に、糖類からの酸及びガスの生成は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−グルコース、Ｄ−マンノトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、グリセリン、デンプン、ラフィノース、イヌリン、Ｄ−リボース、ソルボース、カルボキシメチルセルローズ及びグリコーゲンの糖類については、各菌とも、マイナスであった。
【００２４】
４．抗生物質に対する感受性
各菌の各種の抗生物質に対する感受性を以下の表６に示す。
【表６】
【００２５】
又、フェニルアラニン脱アミノ酵素に対する感受性は、各菌とも、マイナスであった。
【００２６】
５．その他の諸性質
各菌のその他の諸性質を以下の表７に示す。
【表７】
【００２７】
又、アルギニンの分解、リジンの脱炭酸反応、オルニチンの脱炭酸反応、フェニルアラニンの脱アミノ反応、シアン化カリウムの耐性、ホスファターゼ耐性、３−ケト−乳酸の生成及び酒石酸の利用は、各菌とも、マイナスであった。
【００２８】
又、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を解析し、塩基配列データベースとの相同性を検討した
ところ、微生物 Ｕ１２４は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、クプリアビドス・ネカター（Cupriavidus necator）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９７．１８％であり、微生物 Ｕ２２４は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、ロドコッカス・ワラティスラビエンシス（Rhodococcus wratislaviensis）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．３９％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＮＳＡ６株に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．５％であり、微生物 Ｕ２３８は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、スフィンゴモナス・カプスァタ（Sphingomonas capsulata）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９４．２０％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、スフィンゴモナス・サバルクティカ（Sphingomonas subarctica）ＫＦＩ株（基準株）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は１００％であり、微生物 Ｔ７は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、クプリアビドス・ネカター（Cupriavidus necator）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９７．５９％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、クプリアビドス・タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis）ＬＭＧ １９４２４（基準株）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．７％であり、微生物 Ｔ３１は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー（MicroSeq Bacterial Full Gene Library）に対する相同性検索の結果、アシドボラックス・テンペランス（Acidovorax temperans）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．９３％であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、アシドボラックス・テンペランス（Acidovorax temperans）ＣＣＵＧ １１７７９（基準株）に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は９９．７％であった。
【００２９】
以上の菌学的性質及び１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の相同性の結果をもとに、バージイス・マニュアル・オブ・システマティク・バイオロジー（Bergey's Manual of Systematic Biology）を参考にして、菌（微生物）、Ｕ１２４、Ｔ７、Ｕ２２４，Ｕ２３８及びＴ３１が、それぞれ、クプリアビドス（Cupriavidus）属、クプリアビドス（Cupriavidus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属及びアシドボラックス（Acidovorax）属に属することを決定し、微生物 Ｕ１２４は、クプリアビドス ｓｐ．（Cupriavidus sp.）と、微生物 Ｔ７は、クプリアビドス ｓｐ．（Cupriavidus sp.）と、微生物 Ｕ２２４は、ロドコッカス ｓｐ．（Rhodococcus sp.）と、微生物 Ｕ２３８は、スフィンゴモナス ｓｐ．（Sphingomonas sp.）、及び、微生物 Ｔ３１は、アシドボラックス ｓｐ．（Acidovorax sp.）と命名した。
【００３０】
又、微生物 Ｕ１２４、微生物 Ｔ７、微生物 Ｕ２２４及び微生物 Ｕ２３８の新菌株を、平成１７年２月１８日に、産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。その微生物受領番号は、微生物 Ｕ１２４、Ｔ７、Ｕ２２４及びＵ２３８について、それぞれ、ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１８、ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１６、ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１９及びＦＥＲＭ Ｐ−２０４２０である。
【００３１】
更に、微生物 Ｔ３１の新菌株を、平成１７年１２月１４日に、産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、その微生物受領番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３４である。
【００３２】
本発明を実施するに際し、酵素的に加水分解する方法としては、微生物（後述する、本発明の寄託された微生物のＤＮＡを用いて得られる形質変換体を含む）をその生育に適した培養条件下培養し、原料化合物を培養液中に添加して接触させる方法又は微生物を培養し、必要に応じて、集菌し、得られた微生物菌体、微生物菌体処理物、又は微生物菌体若しくは微生物菌体処理物を必要に応じて、精製して得られた生体触媒を原料化合物と接触させる方法が採用される。
【００３３】
微生物の培養方法は、通常、微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養することができる。
【００３４】
栄養物は、一般に微生物の培養に利用される公知のもの利用できる。炭素源は、例えば、グルコース、シュウクロース、マルトースなどの糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸などの有機酸類、エタノール、グリセリンなどのアルコール類、パラフィンなどの炭化水素類、大豆油、菜種油などの油脂類、またはこれらの混合物であり得、好ましくは、グルコースである。
【００３５】
又、窒素源は、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチーブリカー、またはこれらの混合物であり得、好ましくは、酵母エキスである。
【００３６】
更に、その他の無機塩、ビタミン類などの栄養源を適宜添加することもできる。
【００３７】
培養方法は微生物一般に用いられる培養法、例えば、液体培養が用いられる。
【００３８】
培養は、好気的に行われ、ｐＨは、４〜９であり得、好適には、６〜８であり、培養温度は、１５℃〜５０℃であり得、好適には、２０℃〜４０℃であり、培養時間は、５時間〜９６時間であり得、好適には、１０時間〜７２時間である。
【００３９】
原料化合物を培養液中に添加して接触させる方法は、原料化合物を添加し培養することによって行われる。添加時期は、使用する微生物の至適条件、特に培養装置、培地組成、培養温度などのより異なるが、初期培養に添加してもよく、培養の進行にあわせて添加してもよくが、微生物の加水分解能が高まりはじめる時期がよく、微生物の培養開始後１〜３日経過した時点が好ましい。原料の添加量は、培地に対して０．０１〜５０％であり得、好適には、０．１〜２０％である。原料化合物の添加後の培養は好気的条件で、上記培養温度で行われる。培養期間は、原料化合物の添加後、１０時間〜３日である。
【００４０】
微生物を培養し、得られた微生物菌体、微生物菌体処理物、又は微生物菌体若しくは微生物菌体処理物を必要に応じて、精製して得られた生体触媒を原料化合物と接触させる方法は、上記方法により微生物を少量の基質（ラウロラクタム）の存在下で培養し、微生物の加水分解能が最大となるまで培養する。微生物の加水分解能は、培地組成、培養温度などにより異なるが、通常培養開始後、１〜４日で、最大となるので、この時点で培養を終了する。
【００４１】
使用される微生物菌体等は、このように微生物を培養した培養物そのまま、培養物の濃縮物、培養物を遠心分離し若しくはろ過して集菌された菌体（湿菌体）、菌体（湿菌体）を化学的又は物理的処理をした菌体処理物又は菌体（湿菌体）若しくは菌体処理物を精製した生体触媒であり得、好ましくは、菌体（湿菌体）、菌体処理物又は生体触媒である。
【００４２】
又、生体触媒は、後述するように、本発明の寄託された微生物のＤＮＡを用いて、遺伝子操作により、得られた大腸菌への形質変換体を培養して得られる酵素も含み、また、公知の６−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー ヒドロラーゼ（6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolase：例えば、J.Bacteriol., vol.171, p3187〜3191, 1989等）をも含む。
【００４３】
菌体（湿菌体）は通常、生理食塩水、緩衝液などで洗浄して使用する。
【００４４】
又、化学的又は物理的処理をした菌体処理物は、例えば、菌体をアセトン、五酸化リン等を用いて、脱水処理するか又は／及びデシケーター、扇風機等を利用して、乾燥処理して得られる乾燥菌体、菌体を、ツィーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）のような界面活性剤で処理した界面活性剤処理物、菌体を、リゾチームのような溶菌酵素で処理した溶菌酵素処理物、固定化菌体又は菌体を破砕した無細胞抽出物であり得、好ましくは、乾燥菌体である。
【００４５】
微生物菌体又は処理物菌体処理物（例えば、乾燥菌体）の精製は、酵素を精製する常法に従って行われる。
【００４６】
例えば、微生物を培養して得られた菌体液を超音波処理し、無細胞抽出液として、遠心分離して、除核酸して処理を行う。得られた上清に、飽和量の硫安を加え（例えば、３０％飽和、６０％飽和、９０％飽和等）、通常０℃〜１０℃で、１０分間〜１時間攪拌した後、遠心分離して、沈殿物を得る。沈殿物は、必要に応じて、緩衝液（例えば、２０ｍＭＫＰＢ（リン酸緩衝液）等）で透析することもできる。
【００４７】
得られた硫安分画画分を、さらに、各種クロマトグラフィー、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー（例えば、カラムとして、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−トヨパールゲル、モノＱＨＲ５／５等を用いる）、疎水カラムクロマトグラフィー（例えば、カラムとして、ブチル−トヨパールゲル等を用いる）、ゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、カラムとして、セファデックス ２００ １０／３０ＧＬ等を用いる）等を用いて、さらに精製することができる。また、これらの精製方法は、適宜、順序を代えて、行うこともできる。
【００４８】
精製された酵素（生体触媒）の分子量は、常法、例えば、ゲル電気泳動法、ゲルろ過法等で、測定され、それらのＮ−末端アミノ酸配列は、常法、例えば、エドマン（Ｅｄｍａｎ）法等で測定される。
【００４９】
このようにして得られた微生物菌体、又は菌体処理物若しくは微生物菌体処理物を必要に応じて、精製して得られた生体触媒を原料化合物と接触させる方法は、通常水性媒体中、例えば、ｐＨ４〜１１（好ましくは、ｐＨ６〜９のリン酸緩衝液中）で、振とう又は攪拌しながら行う。
【００５０】
原料化合物であるラウロラクタムは、反応初期に一括に添加してもよく、反応の進行に従って、分割して添加しても良い。又、原料化合物であるラウロラクタムの濃度は、通常、０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）であり、好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。
【００５１】
反応温度は、１０℃〜７０℃であり得、好ましくは、２０℃〜６５℃であり、更に好ましくは、２５℃〜３５℃である。
【００５２】
反応時間は、反応温度等により異なるが、通常２時間〜５日であり、好ましくは、４時間〜３日である。
【００５３】
又、原料化合物であるラウロラクタムの溶解度を高めるため、必要に応じて、水溶性有機溶媒を添加することもできる。
【００５４】
使用される水溶性有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノールのようなアルコール類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランのようなエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドのようなアミド類又はジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類であり、好ましくは、アルコール類、アミド類又はスルホキシド類であり、更に好ましくは、スルホキシド類である。
【００５５】
更に、疎水性有機溶媒と水の二層系で加水分解反応を行うこともできる。
【００５６】
使用される疎水性有機溶媒は、例えば、ヘキサン、石油エーテルのような脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロルベンゼンのような芳香族炭化水素類又はブチルメチルエーテルのような高級脂肪族エーテルであり得、好ましくは、芳香族炭化水素類であり、更に好ましくは、トルエン又はクロルベンゼンであり、特に好ましくは、トルエンである。
【００５７】
ここで、疎水性有機溶媒と水の体積比は、疎水性有機溶媒／水が、９／１〜１／９であり、好ましくは、１／１〜１／５である。この場合、疎水性有機溶媒中のラウロラクタムの濃度は、０．０１〜１０％（Ｗ／Ｖ）である。
【００５８】
目的物である、１２−アミノドデカン酸の単離の容易性（沈殿する１２−アミノドデカン酸をろ過等により単離する等）及び加水分解触媒の再利用の観点からは、疎水性有機溶媒と水の二層系で加水分解反応を行うことが好ましい。
【００５９】
加水分解反応終了後、目的物である１２−アミノドデカン酸は、常法に従って、反応混合物から採取される。例えば、目的物である１２−アミノドデカン酸が沈殿する場合には、ろ取することにより、１２−アミノドデカン酸が沈殿しない場合には、反応混合物を遠心分離又はろ過して、微生物などの酵素源を除去し、溶媒を留去することにより、目的物である１２−アミノドデカン酸が得られる。更に、常法、例えば、再結晶、クロマトグラフィー等を用いて、更に精製することもできる。
【００６０】
又、疎水性有機溶媒と水の二層系で加水分解反応を行う場合には、加水分解反応終了後、反応混合物をろ過し、ろ液から水相を分取して、酵素溶液を得、それを再び、加水分解反応反応に使用することができる。
【００６１】
次いで、本発明の寄託された微生物のＤＮＡを用いて、遺伝子操作により、大腸菌への形質変換体を得る方法について、説明する。
本発明の寄託された微生物のＤＮＡは、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等を用いて取得すればよいが、これらを取得できる方法であれば如何なる方法を用いて取得してもよい。
【００６２】
例えば、本発明の寄託された微生物の細胞から、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （2001）等に記載される遺伝子工学的方法に準じてＤＮＡを取得することができる。
【００６３】
一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列の部分塩基配列又は当該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応や、上記ｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列又は当該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６４】
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約１５塩基から約５０塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列の５’側の翻訳開始点から始まる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１、３、５、７又は９で示される塩基配列の３’側の翻訳終了点から始まる塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００６５】
ＰＣＲの条件としては、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、プライマー、鋳型ｃＤＮＡを含む組成の反応液にて、以下の条件による３工程の増幅サイクルを繰り返して行う。まず変性工程として、例えば約９０℃から約９６℃、好ましくは約９４℃から約９５℃で、１分から１５分間、好ましくは１分から２分間の保温を行う。次にプライマーのアニーリング工程として、例えば約３０℃から約７０℃、好ましくは約４０℃から約６０℃で、約３秒から約３分間、好ましくは約５秒間から約２分間の保温が行われる。さらにＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程として、たとえば、約７０℃から約７５℃、好ましくは約７２℃から約７３℃で、約１５秒間から約５分間、好ましくは約３０秒間から約４分間の保温が行われる。この３工程からなる増幅サイクルを、約２０回から約５０回、好ましくは約２５回から約４０回行う。このようなＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して精製した後、エタノール沈殿又は市販のＤＮＡ断片精製用のカラムを用いて、精製及び回収することができる。
【００６６】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、当該ポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１（ｗ／ｖ）フィコール４００、０．１（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）、０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、６５℃で保温し、次いで１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下に、室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下に、６８℃で３０分間保温する条件等を挙げることができる。
このようにして得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （2001）等に記載された遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
【００６７】
具体的には例えば、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）やpBluescriptII（Stratagene）等の市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの塩基配列は、Maxam Gilbert法やSanger法に準じて確認することができる。
【００６８】
次に、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例１
微生物 Ｕ２２４のアセトンパウダーを用いるラウロラクタムの加水分解
（１）ＴＧＹ液体培地の調製
ポリペプトン５ｇ、イースト抽出物５ｇ及び燐酸２水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）４．２ｇを純水９８０ｍｌに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液で、ｐＨ７に調製した。なお、平板培地の場合には、寒天１７ｇを加えた。
１２１℃で２０分間、滅菌後、別途滅菌したＤ−グルコースの１０％水溶液２０ｍｌを無菌的に加え、ＴＧＹ液体培地１Lを調製した。
【００７０】
（２）前培養
微生物 Ｕ２２４のスラントから白金耳を用い、菌体の一部をかき取り、バッフル付き１００ｍｌの三角フラスコ中のＴＧＹ液体培地に接種し、３０℃、旋回振とう（２００ｒｐｍ）で、７２時間培養した。
【００７１】
（３）本培養、
ＴＧＹ液体培地２００ｍｌを加えた、バッフル付き５００ｍｌの坂口フラスコ１０本に前培養の培地２ｍｌを接種し、３０℃、１６０ｒｐｍ（往復振とう）で、６０時間培養した。
培養終了後、液体培地を遠心分離（５０００ｒｐｍで１０分）で、集菌し、０．８５％食塩水で洗菌した。洗菌後、再び、遠心分離（５０００ｒｐｍで１０分）で、集菌し、湿菌６．２ｇを得た。
【００７２】
（４）アセトンパウダーの調製
１Ｌビーカーにアセトン０．５Ｌを加え、ドライアイス−メタノール浴中で、マグネッチックスターラを用いて、攪拌した。そこに、上記で得られた湿菌を純水２５ｍｌに再懸濁したものを少しづずつ加えた。その後、３分間攪拌を続けて、ヌッチェでろ過した。得られた固形物を冷アセトン及び冷エーテルで洗浄した後、デシケーター中で、一晩放置し、減圧で乾燥して、アセトン粉末を得た。粉末を回収して、冷蔵保存した。
【００７３】
（５）ラウロラクタムの加水分解
２ｍｌチューブに、アセトン粉末１ｍｇをはかり取り、そこに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍｌ及びラウロラクタムのトルエン溶液（１％Ｗ／Ｖ）０．２ｍｌを加え、ボルッテクスミキサーで混合した。その後、往復振とうして（２００ｒｐｍ）、３０℃で、２０時間反応させた。
反応終了後、反応混合物を−２０℃で凍結させた後、遠心濃縮器を用いて、減圧乾固した。その後，残渣にアセトニトリル１ｍｌ及びエステル化剤（ジメチルホルムアミドジメチルアセタール）０．２ｍｌを加え、ボルテックスミキサーで激しく振とうした後、ブロックヒーターを用いて、７０℃で、２時間反応させ、アミノドデカン酸メチルに転化させた。
室温まで放冷し、内部標準として、テトラデカン５ｍｇを加えて攪拌し、その溶液１μｌを採取して、ガスクロマトグラフィーを用いて、分析し、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率を決定し、収率４１％が得られた。
ガスクロマトグラフィーの測定条件
装置：島津 ＧＣ−１７００（昇温型）
カラム：ＤＢ−１７０１（３０ｍ、０．２５ｍｍＩＤ）
カラム温度：１５０℃（５分間）、１５０℃から２８０℃に昇温（２０℃／分）及び２８０℃（５分間）
Ｉｎｊ（注入部）：２７０
Ｄｅｔ．（検出部）：２８０、ＦＩＤ（検出器）
スプリット比： １：１０
保持時間：１２．３分（アミノドデカン酸メチル）、１１．３分（ラウロラクタム）、４．８分（テトラデカン：内部標準）
【００７４】
実施例２〜４
微生物 Ｕ１２４、微生物 Ｔ７及び微生物 Ｕ２３８のアセトンパウダーを用いるラウロラクタムの加水分解
微生物 Ｕ２２４の代わりに、それぞれ、微生物 Ｕ１２４（実施例２）、微生物 Ｔ７（実施例３）及び微生物 Ｕ２３８（実施例４）を用いて、実施例１と同様な操作を行い、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率を決定した。
【００７５】
その結果を以下の表８に示す。
【表８】
【００７６】
実施例５
微生物 Ｕ２２４を用いるラウロラクタムの加水分解
上記実施例１（１）〜（３）と同様の操作を行い、得られた湿菌体６．２ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに再懸濁し、休止菌体を得た。
【００７７】
１００ｍｌメジューム瓶に、ラウロラクタムのトルエン溶液（１％Ｗ／Ｖ）２０ｍｌを加え、マグネッチックスターラを用いて，攪拌した。そこに、上記休止菌体１０ｍｌを加え、密栓をして、攪拌しながら、３０℃で、２４時間反応させた。
【００７８】
反応終了後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、トルエンを留去させ、残った溶液を凍結乾燥させた。得られた残渣に、メタノール１００ｍｌを加え、激しく振とうして、抽出した。不溶物をろ過し、ろ液から溶媒を留去して、粗生成物を得た。この粗生成物にエタノール約２０ｍｌを加え、ホットプレート上で、還流した。素早くろ過し、ろ液を室温まで放冷し、ｎ−ヘキサンを数滴加え、−１８℃で、数時間放置した。生成した結晶をろ取して、目的物である１２−アミノドデカン酸９６ｍｇ（収率４４％）を得た。
【００７９】
得られた１２−アミノドデカン酸（メチルエステル体）のガスクロマトグラムは、標品の１２−アミノドデカン酸（メチルエステル体）のそれと一致した。
【００８０】
実施例６
微生物 Ｕ２２４由来のラウロラクタム加水分解酵素
（１）微生物 Ｕ２２４の大量培養
５ｍＬのＴＧＹ培地（０．５％ポリペプトン、０．５％イースト抽出物、０．１％燐酸２水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、０．１％Ｄ-グルコース、ｐＨ ７．０）で、微生物 Ｕ２２４を前培養した（２００ｒｐｍ、３０℃で１２時間）培養液を５００ｍｌのＴＧＹ培地に植菌し、バッフル付き２Ｌ坂口フラスコ中で、３０℃、振とう（９６ｒｐｍ）で、２４時間培養した。大型遠心機で集菌し（５０００ｒｐｍで１０分間、４℃）、生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で洗浄した後，培地５Ｌ分の菌体を、１００ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液に懸濁した。
【００８１】
（２）超音波及び除核酸処理
１００ｍＬの菌体液をガラスビーズ（０．５〜０．７５ｍｍ）と共に、３０分間超音波処理し、無細胞抽出液とした。無細胞抽出液に、プロタミン硫酸ナトリウムを５％加え、１０分間攪伴した後、大型遠心機で分離して（３０００ｒｐｍで１０分間、４℃）、上清を得た。
【００８２】
上記無細胞抽出液（上清）を用いて、実施例１（５）に準じて、ラウロラクタムの加水分解を行い（３０℃、ｐＨ ７．０）、ガスクロマトグラフィー分析を行い、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率を測定し、この収率から、比活性 ０．０７Ｕ／ｍｇを得た。なお、比活性は、酵素１ｍｇ当たりの活性ユニット（Ｕ）であり、ここで、活性ユニット（Ｕ）は、反応温度が３０℃で、反応ｐＨが７．０である反応条件において、１分間に、ラウロラクタムの加水分解の目的物である１２−アミノドデカン酸が生成する量（μモル）である。つまり、０．０７Ｕ／ｍｇは、上記無細胞抽出液から得られた粉末酵素１ｍｇあたり、反応温度が３０℃で、反応ｐＨが ７．０である反応条件において、１分間に、１２−アミノドデカン酸が０．０７μモル生成することを意味する。
【００８３】
又、上記無細胞抽出液（上清）０．５ｍＬを採り、Bradford法を用いて、タンパク質濃度を測定し、全タンパク質量 １２０１ｍｇを得た。
【００８４】
以下の（３）〜（７）で得られた酵素についても、上記と同様の操作により、比活性及び 全タンパク質量を決定した。
【００８５】
（３）硫安分画
無細胞抽出液（上清）を氷中にてスターラーで撹拌しながら、３０％飽和となるように粉末状硫安を少しずつ加えた。３０分間撹拌した後、遠心分離した（８０００ｒｐｍで１０分間、４℃）。上清を氷中で撹拌しながら、６０％飽和となるように粉末状硫安を加え、３０分間撹拌した後、遠心分離した。同様に、９０％飽和となるように粉末状硫安を加え、遠心分離した。各ステップで得られた沈殿（０〜３０％画分、３０〜６０％画分及び６０〜９０％画分）を５ｍＬの２０ｍＭ ＫＰＢ（リン酸緩衝液）に懸濁し、５Ｌの同緩衝液（ｘ３回）にて、１晩透析を行った。
透析した３０〜６０％硫安分画画分の酵素の比活性は、０．１２Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、２００ｍｇであった。
【００８６】
（４）イオン交換カラムクロマトグラフィー
２０ｍＭ ＫＰＢにより平衡化したＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−トヨパールゲル１５ｍｌをカラムに充填し、透析した３０〜６０％硫安分画画分の酵素をカラムに吸着させた。１００ｍＬの２０ｍＬ ＫＰＢでカラムを洗浄した後、２０ｍＭ ＫＰＢ ２００ｍＬ及び５００ｍＭ ＮａＣｌ を含む２０ｍＭ ＫＰＢ ２００ｍＬを用いて、グラジエントによりＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、１５ｍＬずつ試験管にフラクションを採取し、各フラクションのラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。
透析後の酵素の比活性は、０．６１Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、３８．１ｍｇであった。
【００８７】
（５）疎水カラムクロマトグラフィー
上記（４）における、活性が認められたフラクション３９ｍＬに、３０％飽和となるように硫安を加え、遠心分離して、上清を得た。硫安３０％飽和にした、２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したブチル−トヨパールゲル５ｍＬに酵素液を吸着させた。硫安３０％飽和にした、２０ｍＭ ＫＰＢでカラムを洗浄した後、２０ｍＭ ＫＰＢ ３０ｍＬ及び硫安３０％飽和にした２０ｍＭ ＫＰＢ ３０ｍＬを用いて、グラジエントにより硫安濃度を徐々に下げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、３ｍＬずつ試験管にフラクションを採取し、各フラクションのラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。透析した後、酵素液を限外ろ過にて200μLまで濃縮した。
濃縮した酵素（上清）の比活性 １．３１Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、１２．８ｍｇであった。
【００８８】
（６）イオン交換カラムクロマトグラフィー
中圧高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、カラム：２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したモノＱ ＨＲ５／５カラム）を用いた。サンプルループに酵素液２００μＬを注入し、２０ｍＭ ＫＰＢ及び０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢの２つの溶媒を用いて、ＦＰＬＣのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５ｍＬ）のラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め。１晩透析した。透析した後、酵素液を限外ろ過にて200μLまで濃縮した。
濃縮した酵素（上清）比活性は、４．６７Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、１．８ｍｇであった。
【００８９】
（７）ゲルろ過クロマトグラフィー
中圧高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、カラム：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したセファデックス（Sephadex）２００ １０／３０ＧＬカラム）を用いた。サンプルループに酵素液２００μＬを注入し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢの溶媒を用いて、ＦＰＬＣのシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５ｍＬ）のラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。
【００９０】
透析された酵素の比活性は、６．５４Ｕ／ｍｇであり、全タンパク質量は、０．１ｍｇあった。
【００９１】
透析された酵素の分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて、測定し、約４７ｋＤａ（キロダルトン）であり、ＨＰＬＣを用いるゲルろ過法（カラム：Sephadex ２００ＨＲ １０／３０、流出溶媒（流速）：１５０ｍＭ ＮａＣｌ含む２０ｍＭ ＫＰＢ（０．８ｍＬ／分）、検出器：ＵＶ検出器、吸光度２８０ｎｍ）を用いて、測定して、約７９．５ｋＤａ（キロダルトン）であった。
【００９２】
なお、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を以下の条件で行った。
【００９３】
泳動ゲルとして、３６％アクリルアミド ５．２５ｍＬ、０．６８Ｍ トリス（Tris:ｐＨ ８．８）８．２５ｍＬ、１％ＳＤＳ（ソディウムドデシルサルフェート）１．５８ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）１８７．５μＬ、２％ＡＰＳ（アンモニウムパーサルフェート）５６２．５μＬ組成のゲルに３６％ ポリアクリルアミド ０．５ｍＬ、０．１７９Ｍ トリス（Tris:ｐＨ ６．８）３．５ｍＬ、１％ＳＤＳ０．５ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ１２５μＬ、２％ＡＰＳ３７５．１μＬ組成の濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液（グリセロール２００μＬ、１Ｍ トリス（Tris）４０μＬ、水３６０μＬ、２−メルカプトエタノール２００μＬ及び１０％ＳＤＳ２００μＬ）と等量混合した精製酵素サンプル２５μＬをランニング緩衝液（トリス３．０３ｇ、グリシン １４．１４ｇ及びＳＤＳ１０ｇ）中、３０ｍＡで電気泳動を行い、その後、1時間タンパク染色液（ＣＢＢ（クマジーブリリアントブルー）２．５ｇ、メタノール５００ｍＬ、酢酸 ５０ｍＬ及び超純水４５０ｍＬ）で染色し、脱色液（メタノール：酢酸：水＝３：１：６）でバンドが鮮明になるまで脱色した。
【００９４】
透析された酵素酵素のＮ−末端アミノ酸配列は、エドマン（Edman）法により決定し、その結果を配列番号２５に示す。
【００９５】
実施例７
微生物 Ｔ７由来のラウロラクタム加水分解酵素
微生物 Ｕ２２４の代わりに、微生物 Ｔ７を用いて、実施例６と同様の操作を行い、最後に、再度、中圧高速液体クロマトグラフィー（カラム：２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したモノＱ ＨＲ５／５カラム）を用いて、精製して、目的とする加水分解酵素を得た。
【００９６】
また、実施例６と同様にして、得られた酵素の比活性及び全タンパク質量を求めた結果、超音波及び除核酸処理された酵素、ゲルろ過クロマトグラフィーで精製された酵素及び最後に中圧高速液体クロマトグラフィーで精製された酵素の比活性（及び全タンパク質量）は、それぞれ、０．０２Ｕ／ｍｇ（１６７０ｍｇ）、１．２４Ｕ／ｍｇ（０．４ｍｇ）及び２．２４Ｕ／ｍｇ（０．２ｍｇ）であった。
【００９７】
又、最後に中圧高速液体クロマトグラフィーで精製された酵素は、ＨＰＬＣを用いるゲルろ過法に用いるＨＰＬＣにおいて、単一のピークを示し、その保持時間は、実施例６のゲルろ過クロマトグラフィーで精製された酵素とほぼ同一であった。
【００９８】
実施例８
微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素
（１）前培養
実施例１８で得られた微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌のスラントから白金耳を用い、菌体の一部をかき取り、バッフル付き１Ｌ三角フラスコ中のＬＢ培地（Car（カルベニシリン）１００μｇ／ｍＬ）１００ｍＬに接種し、３７℃、旋回振とう（２００ｒｐｍ）で、１６時間培養した。
【００９９】
（２）本培養
バッフル付き１２Ｌの培養器（ナルゲン製）中、１０Ｌの Terrific Broth（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）に前培養の培地１００ｍＬを接種し、３７℃で、好気培養した。接種６時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を加え、インキュベーターの温度を３０℃に設定して、さらに、１２時間培養した。
培養終了後、液体培地を遠心分離（５，０００ｒｐｍで１０分、４℃）により、集菌し、０．８５％食塩水で洗菌した。洗菌した後、再び、遠心分離（５，０００ｒｐｍで１０分）により、集菌し、湿菌体９５．２ｇを得た。得られた湿菌体を超音波破砕し、遠心分離をした後、ストレプトマイシンを添加して、核酸成分を除去した。その後、３０〜６０％硫安分画画分を分取し、透析チューブにて、透析した後、凍結乾燥して、粉末酵素７．７ｇを得た。
【０１００】
実施例９
微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素
微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌の代わりに、実施例２３で得られた、微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌を用いて、実施例８と同様に、培養及び単離を行い、湿菌体１２３ｇ及び粉末酵素３．０ｇを得た。
【０１０１】
実施例１０
微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素を用いるラウロラクタムの加水分解
【０１０２】
（１）２ｍｌチューブに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３５０μＬ、０．１Ｍラウロラクタム溶液（１９．６ｍｇのラウロラクタムを１ｍＬのトルエン又はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた溶液）５０μＬ及び酵素溶液（微生物 Ｔ３１の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素（実施例８の酵素）１０ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに溶解させた溶液又はこの溶液を水で１０倍希釈させた溶液）１００μＬを加え、往復振とうして（２５０ｒｐｍ）、３０℃で、１時間反応させた。
反応終了後、実施例１に準じて、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、トルエンを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率６２％及び１７％を得た。また、ＤＭＳＯを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率６７％及び１５％を得た。
【０１０３】
（２）３０ｍスクリュー管中に、ラウロラクタム０．０９９ｇ、実施例８の酵素５０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ及びクロルベンゼン９ｍＬの混合溶液（なお、ガスクロマトグラフィー分析の内部標準物質として、テトラデカン０．１００ｇを含む）を入れ、密栓して、マグネチックスターラで激しく攪拌しながら、３０℃で、反応させた。
反応開始後、３時間及び６時間後に、反応混合物の有機相からサンプル０．１ｍＬを分取し、メタノール０．９ｍＬを加えて、実施例１に準じて、ガスクロマトグラフィー分析を行い、それぞれ、原料であるラウロラクタムの転化率４６．４％及び７４．１％を得た。
【０１０４】
（３）１１０ｍＬのスクリュー管中に、ラウロラクタム０．４００ｇ、実施例８の酵素２００ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌ及びトルエン３６ｍＬの混合溶液を入れ、密栓して、マグネチックスターラで激しく攪拌しながら、３０℃で、６時間反応させた。
反応終了後、反応混合物をろ過し、得られた白色析出物をトルエン及び純水で洗浄・溶解させ、減圧で、溶媒を留去・乾燥させ、白色粉末として、粗１２−アミノドデカン酸０．４３１ｇ得た。
この白色粉末の純度は、ガスクロマトグラフィー分析により、８７．４％であった（収率 ８６％）。
【０１０５】
（４）３０ｍｌスクリュー管中に、ラウロラクタム０．９８６ｇ、実施例８の酵素５０ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ及びトルエン９ｍＬの混合溶液（なお、ガスクロマトグラフィー分析の内部標準物質として、テトラデカン０．１００ｇを含む）を入れ、密栓して、マグネチックスターラで激しく攪拌しながら、３０℃で、１０時間反応させた。
反応終了後、反応混合物の有機相からサンプル０．１ｍＬを分取し、メタノール０．９ｍＬを加えて、実施例１に準じて、ガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率９９．８％を得た。
又、反応混合物をろ過し、白色析出物をトルエン約５ｍＬ及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）約１ｍＬで洗浄した。ろ液と洗浄液を合せて、水相を分離させ、反応に1回使用した酵素溶液を得た。
この反応に1回使用した酵素溶液を用いて、上記と同様の加水分解反応、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率９９．６％を得た。
ついで、同様にして、反応に２回使用した酵素溶液を得て、それを用いて、上記と同様の加水分解反応、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率９７．４％を得た。
【０１０６】
実施例１１
微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素を用いるラウロラクタムの加水分解
（１）実施例８の酵素の代わりに、微生物 Ｕ２２４Ｍの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素（実施例９の酵素）を用いる他、実施例１０（１）と同様にして、トルエンを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率４４％及び１．７％を得た。また、ＤＭＳＯを用いる溶媒系における、酵素濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれを水で１０倍希釈させた酵素濃度（１ｍｇ／ｍＬ）について、それぞれ、目的物である１２−アミノドデカン酸の収率２５％及び１．６％を得た。
【０１０７】
（２）実施例８の酵素の代わりに、実施例９の酵素を用いる他、実施例１０（２）と同様に反応を行い、反応開始後の３時間及び６時間について、それぞれ、原料であるラウロラクタムの転化率２５．６％及び４６．１％を得た。
【０１０８】
実施例１２
微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
（１）微生物 Ｔ３１の染色体ＤＮＡ及びプラスミドの精製
（ｉ）微生物 Ｔ３１の染色体ＤＮＡの抽出
微生物 Ｔ３１をＴＧＹ培地３ｍＬで、３０℃、２００ｒｐｍ（振とう）で、１２時間培養した。培養液１ｍLから菌体を遠心分離して（１５，０００ｒｐｍで５分間、４℃）、集菌した。ＳＴＥ緩衝液（ＮａＣｌ ０．５８４ｇ、１Mトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬ及び０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２００μＬを超純水で１００ｍＬに定量したもの）１ｍＬで洗浄した後，同緩衝液に懸濁した。６８℃で、１５分間加熱した後、遠心分離し（１５，０００ｒｐｍで５分間、4℃）、上清を除いて、リゾチーム−ＲＮａｓｅ液（リゾチーム ５ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬＲＮａｓｅ１０ｍＬを１液：グルコース０．９ｇ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２．５ｍＬ、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２ｍＬを超純水で、１００ｍＬに定量したもの１ｍＬで溶解したもの）３００μＬに懸濁した。３７℃で３０分間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ／Ｌ 液 （プロテイナーゼＫ１０ｍｇ／Ｌ液１ｍＬ）６μＬを加え、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。Ｎ−ラウロイルザリコシン３ｍｇを加えて、穏やかに混合した後、３７℃で３時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム処理を穏やかに２回行った。上清３００μＬに５ＭＮａＣＬ溶液１０μＬとエタノール６００μＬを加えて混合した後、遠心分離した（１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）。７０％エタノールで洗浄した後、風乾し、ＴＥ緩衝液１００μＬに溶解し、目的とする染色体ＤＮＡを得た。
【０１０９】
（ii）微生物 Ｔ３１のプラスミドの抽出
ＴＧＹ培地１０ｍＬで，３０℃、２００ｒｐｍ（振とう）で、２４時間培養した、微生物 Ｔ３１菌体をディスポチューブ内で、遠心分離して（３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）、集菌した。ＴＥ緩衝液で洗浄した後、ＴＥＮＳ溶液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２０％サッカロース）４００μＬに懸濁し、リゾチーム１０ｍｇを加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。懸濁液に、１０％ＳＤＡ４０μＬと５Ｎ ＮａＯＨ４０μＬを加え、１０分間、氷冷し、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）６００μＬを加えて、再び１０分間氷冷した。遠心分離した（１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）後、上清を２回フェノール−クロロホルムで処理し、スピッツ管中でエタノール２．７ｍＬを加え、−８０℃で３０分間インキュベートして、遠心分離した（３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃）。７０％エタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液２０μＬに溶解し、目的とするプラスミドを得た。
【０１１０】
（２）微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の増幅
ＰＣＲ反応液の組成は，水３５μＬ、１０ｘBlend Taq buffer ５μＬ、２ｍＭ dNTP ５μＬ、１００pmol プライマー１（5'-AGAAGGAGCGCGACAGTGAGCAAGGTGGAC-3'：配列番号１３）１μＬ、１００ pmolプライマー２（5'-CATCTCCCGCAAGCATCAGGCCGCTGGGATC-3'：配列番号１４）１μＬ、Template ＤＮＡ２μＬ及びBlend Taq １μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８．０℃で５分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間及び（ii）までを２４サイクルとし、（ｖ）４℃で、連続的に続けた。増幅した微生物 Ｔ３１由来の遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE（USA）社のＧｅｌ−Ｍ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて抽出した。
【０１１１】
（３）微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子配列のシーケンシング
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー１、プライマー２、プライマー３（5'-GCGGCGGGGTTCGTTTTGCTCGGCAAA-3'：配列番号１５）及び、プライマー４（5'-CGAGATAAAGGCGGACTGACGCCCTTC-3'：配列番号１６）を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、１．６μＬの各プライマー、１．６μＬの 16s ｒＤＮＡ（ＰＣＲ産物）、１μＬのBigDyeプレミックスソリューション、１．６μＬの５ｘBigDye シーケンシングバッファーと２．８μＬの 滅菌水とし、全量１０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９６℃で２分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間、（ｖ）（ii）〜（iv）を２５回及び（vi）７２℃で５分間とした。
【０１１２】
ＰＣＲ産物に、１μＬの３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、１μＬの０．１２５ＭＥＤＴＡと２５μＬのエタノールを加え、室温で１５分間放置した後、遠心分離により（１５，０００ｒｐｍで１５分間、４℃）、沈殿させた。上清を廃棄した後、１０μＬの Hi Di Formamideを加え、１００℃で５分間加熱した後に、氷水で急冷したものをABI PRISM（登録商標）310 Genetic Analyzerで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はGenetyxで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。
【０１１３】
（４）微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
Ligationの組成は、遺伝子 ５μＬ、pT7 Blue T-Vecter （Novagen）１μＬ、T4 ligase buffer １μＬ、T4 ligase １μＬ及び水２ｍＬとし、１６℃で一晩反応させた。大腸菌（E.coli JM 109）のコンピテントセル９０μＬに１μＬのpT7 Blue T-Vecterを加え、ヒートショック法で形質転換を行った。８０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むLB培地 （１．０％ ポリペプトン、０．５％イースト抽出物及び１．０％ＮａＣｌ）に生育したコロニーを２５株選別し、TLCによる活性とEcoRIとHindIII処理によるインサートの有無の確認を行った。
【０１１４】
実施例１３
微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｔ７を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１１５】
実施例１４
微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｕ１２４を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 のE.coli JM 109への形質転換体を得た。
【０１１６】
実施例１５
微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｕ２２４を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１１７】
実施例１６
微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
微生物 Ｔ３１の代わりに、微生物 Ｕ２３８を用いて、実施例１２と同様な操作を行い、微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１１８】
実施例１７
微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換
【０１１９】
（１）微生物 Ｔ３１の代わりに、Ｕ２２４を用いて、実施例１２（１）と同様な操作を行い、得られた微生物 Ｕ２２４由来のプラスミド（ｐＵ２２４）の５つのポイントミューテーションを、QuikChange（登録商標）Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて行った。
【０１２０】
反応組成は、２．５μＬのl QuikChange（登録商標）Multi reaction buffer、１μＬの dNTP mix、９．５μＬの水、５０ｎｇのds-DNA template （ｐＵ２２４）、以下の４センス プライマー（sense primer）及び以下の４のアンチセンス プライマー（antisense primer）、それぞれ、５０ｎｇ及び１μＬの QuikChange（登録商標）Multi enzyme blend、
センスプライマー１（5'-AAAACTAATACACCGGAGATGGGCAATCAG-3'：配列番号１７）、
センスプライマー２（5'-CGCACGGCAATGACGCGGCAGGTTCCGTGC-3'：配列番号１８）、
センスプライマー３（5'-CTTCCTCAAGGACTACTCGACGATTTGCGA-3'：配列番号１９）、
センスプライマー４（5'-TCTCGGGCAGTCTGCAGATGCTGGCCTTCA-3'：配列番号２０）、
アンチセンスプライマー１（5'-CTGATTGCCCATCTCCGGTGTATTAGTTTT-3'：配列番号２１）、
アンチセンスプライマー２（5'-GCACGGAACCTGCCGCGTCATTGCCGTGCG-3'：配列番号２２）、
アンチセンスプライマー３（5'-TCGCAAATCGTCGAGTAGTCCTTGAGGAAG-3'：配列番号２３）、
アンチセンスプライマー４（5'-TGAAGGCCAGCATCCGCAGACTGCCCGAGA-3'：配列番号２４）
とした。
【０１２１】
ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９５℃で１分間、（ii）５５℃で１分間、（iii）６５℃で８分間及び（iv）（ｉ）〜（iii）を２５回とした。反応終了後、１μＬのＤｐｎＩを 加え、１時間インキュベートした後、大腸菌（E.coli JM109）へ導入した。
【０１２２】
ミューテーション後のＤＮＡシーケンシングはサイクルシーケンス反応により行った。得られたプラスミドをｐＵ２２４Ｍとした。
【０１２３】
ｐＵ２２４Ｍのシーケンスは、公知のフラボバクテリウム・エスピー（Flavobacterium sp.）Ｋ１７２株由来の遺伝子（F-nylA）のアミノ酸配列（配列番号１２）と一致した。
【０１２４】
（２）微生物 Ｔ３１由来のプラスミドの代わりに、ｐＵ２２４Ｍを用いて、実施例１２（２）〜（４）と同様な操作を行い、微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM 109）への形質転換体を得た。
【０１２５】
実施例１８
微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
【０１２６】
（１）ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の増幅
実施例１２（４）で調製した、微生物 Ｔ３１由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１２（１）と同様にして得たプラスミドをTemplate DNAとした。
ＰＣＲ反応液の組成は、水３５μＬ、１０ｘ Blend Taq buffer ５μＬ、２ｍＭ dNTP ５μＬ、１００ pmol/μＬ プライマー５（5'-ACAGCGAAGCTTTAAGGAGGAATAGACAATGAGCAAGGTGGACCTTTGG-3'：配列番号２６）1 μＬ、 １００ pmol/μＬ プライマー６ （5'-GGAGGACGTCTAGATCAGGCCGCTGGGATC-3'：配列番号２７）１μＬ、Template DNA １００ｎｇ及びBlend Taq ５ unitとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８．０℃で５分間、（ii）９６℃で１０秒間、（iii）５０℃で５秒間、（iv）６０℃で４分間及び（ii）までを２４サイクルとし、４℃で連続的に続けた。
【０１２７】
（２）ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子のｐＵＣ１９ベクターへの組み換えと大腸菌（E.coli JM109）への形質転換
ＰＣＲ反応で得られた、それぞれの菌株由来のＰＣＲ産物５μＬに、１μＬ HindIIIと１μＬ XbaIを加え、３７℃で１時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、５μＬ DNA、１μＬ ｐＵＣ１９（増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの）、２μＬ T4 DNA ligase bufferと１μＬ T4 DNA ligaseとし、１６℃で1晩インキュベートした。得られたベクター を、ヒートショック法により、大腸菌（E.coli JM109）に導入した。
【０１２８】
実施例１９
微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１３で調製した、微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｔ７由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１２９】
実施例２０
微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１４で調製した、微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ１２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１３０】
実施例２１
微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１５で調製した、微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ２２４由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１３１】
実施例２２
微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１６で調製した、微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ２３８由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【０１３２】
実施例２３
微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系構築
実施例１７で調製した、微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例１８と同様の操作を行い、微生物 Ｕ２２４Ｍ由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌（E.coli JM109）における発現系を構築した。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、ナイロン原料、接着剤原料、硬化剤原料等に用いられ、工業的に有用な１２−アミノドデカン酸を製造する方法及びその製造する方法に使用する生体触媒に関し、安価なラウロラクタムを出発原料として、１工程で、目的とする１２−アミノドデカン酸を製造でき、更に、脱塩等の煩雑な後処理工程が必要ないため、工業的に有利な１２−アミノドデカン酸の製造方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラウロラクタムに、ラウロラクタムを加水分解する活性を有する生体触媒を接触させて、１２−アミノドデカン酸を生成することを特徴とする、１２−アミノドデカン酸の製造方法。
【請求項２】
生体触媒が微生物の菌体又はその処理物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物が、ロドコッカス（Rhodococcus）属、クプリアビドス（Cupriavidus）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属又はアシドボラックス（Acidovorax）属に属する微生物である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
微生物が、ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１９）、クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１８）、クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１６）、スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４２０）又はアシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３４）である、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
生体触媒が６−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー ヒドロラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項６】
生体触媒が、配列番号２、４、６、８又は１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
疎水性溶媒及び水の二層系中で、加水分解反応を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
疎水性溶媒が、芳香族炭化水素類である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
芳香族炭化水素類が、トルエン又はクロルベンゼンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１９）。
【請求項１１】
クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１８）。
【請求項１２】
クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１６）。
【請求項１３】
スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４２０）。
【請求項１４】
アシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３４）。
【請求項１５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項１６】
配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１７】
配列番号６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１８】
配列番号８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１９】
配列番号１０記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２０】
請求項１５乃至１９記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２１】
請求項２０記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項２３】
請求項２２記載の形質転換体を培養し、請求項１５乃至１９記載のタンパク質を産生させることを含む、該タンパク質の製造方法。
【請求項１】
ラウロラクタムに、ラウロラクタムを加水分解する活性を有する生体触媒を接触させて、１２−アミノドデカン酸を生成することを特徴とする、１２−アミノドデカン酸の製造方法。
【請求項２】
生体触媒が微生物の菌体又はその処理物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物が、ロドコッカス（Rhodococcus）属、クプリアビドス（Cupriavidus）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属又はアシドボラックス（Acidovorax）属に属する微生物である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
微生物が、ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１９）、クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１８）、クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１６）、スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４２０）又はアシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３４）である、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
生体触媒が６−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー ヒドロラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項６】
生体触媒が、配列番号２、４、６、８又は１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
疎水性溶媒及び水の二層系中で、加水分解反応を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
疎水性溶媒が、芳香族炭化水素類である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
芳香族炭化水素類が、トルエン又はクロルベンゼンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ロドコッカス ｓｐ．Ｕ２２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１９）。
【請求項１１】
クプリアビドス ｓｐ．Ｕ１２４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１８）。
【請求項１２】
クプリアビドス ｓｐ．Ｔ７（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４１６）。
【請求項１３】
スフィンゴモナス ｓｐ．Ｕ２３８（ＦＥＲＭ Ｐ−２０４２０）。
【請求項１４】
アシドボラックス ｓｐ．Ｔ３１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３４）。
【請求項１５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項１６】
配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１７】
配列番号６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１８】
配列番号８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１９】
配列番号１０記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２０】
請求項１５乃至１９記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２１】
請求項２０記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項２３】
請求項２２記載の形質転換体を培養し、請求項１５乃至１９記載のタンパク質を産生させることを含む、該タンパク質の製造方法。
【公開番号】特開２００６−２７１３７８（Ｐ２００６−２７１３７８Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５７３２９（Ｐ２００６−５７３２９）
【出願日】平成１８年３月３日（２００６．３．３）
【出願人】（００００００２０６）宇部興産株式会社 (2,022)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３日（２００６．３．３）
【出願人】（００００００２０６）宇部興産株式会社 (2,022)
【Ｆターム（参考）】
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