４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法
【課題】優れた抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合物を効率よく、安全に生成する方法、該化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供すること。
【解決手段】フェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することを特徴とする下記式（１）
で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物の製造方法、該化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤、食品及び医薬品。
【解決手段】フェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することを特徴とする下記式（１）
で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物の製造方法、該化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤、食品及び医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、より安全、簡便な方法でフェルラ酸から抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、前記４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む抗癌剤、食品、医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フェルラ酸は、植物の二次代謝産物の一つであり、例えば樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となり、天然界に比較的多く存在する成分である。また、フェルラ酸は、米糠やジャガイモの皮層部に多く含まれている。これらは全て食経験があり人に対する安全性も高い成分である。
【０００３】
前記フェルラ酸の生理機能に関連した先行技術としては、例えば、フェルラ酸を有効成分とする細胞分化促進剤（特許文献１）、フェルラ酸を有効成分とする美白用皮膚外用薬（特許文献２）、フェルラ酸を有効成分とする酸化防止剤（特許文献３）、フェルラ酸とニコチン酸アミドからなる魚卵の発色助剤（特許文献４）、フェルラ酸を有効成分とする抗菌剤（特許文献５）フェルラ酸のアルツハイマー病予防効果（非特許文献１）が知られている。
【０００４】
また、フェルラ酸を原料として、４−ビニルグアイアコールを製造する方法がいくつか開示されている。４−ビニルグアイアコールは、焼酎、泡盛あるいはビール製造時に微量に生成されることが知られており、これら酒類の香気の醸成に関与している。酒類原料由来のフェルラ酸に、麹菌などの微生物が産生するフェルラ酸脱炭酸酵素が作用し、４−ビニルグアイアコールが生成されるとされている。したがって、発酵に用いる酵母を特定した焼酎の製造方法（特許文献６）、乳酸菌を特定した蒸留酒の製造方法（特許文献７）、発酵に使用する主原料を麦類に限った麦焼酎及びその製造方法（特許文献８）、あるいはフェルラ酸の脱炭酸酵素（特許文献９）などが開示されている。
【０００５】
また、４−ビニルグアイアコールは、香気の構成成分であるばかりではなく、４−ビニルグアイアコールからバニリンが生成されることからも関連技術が散見される（特許文献１０）。
しかしながら、上述したいずれの公知技術においても、４−ビニルグアイアコール重合化合物の生成に関する記載はなく、またその可能性すら示唆されていない。
【０００６】
また、フェルラ酸から４−ビニルグアイアコール重合化合物の化学的合成方法（非特許文献２）も知られているが、本法では、フェルラ酸のみを融点以上に昇温させ２０５℃で維持することにより４−ビニルグアイアコール重合化合物を得ている。したがって、融点以下の温度条件では、目的の反応が進行しないことは明らかである。また、本法は、工程上も密閉させたり、ガス抜きしたりなど制御が困難であり、大量合成を行うには、作業性や安全性などに大きな問題がある。
その他にも、リグニン関連化合物から４−ビニルグアイアコール重合化合物を取得する報告（非特許文献３）があるが、本法ではフェルラ酸は使用されておらず、反応条件も２５０℃と高温である。同様に４−ビニルグアイアコール重合化合物を取得する報告（非特許文献４）があるが、本法でもフェルラ酸は使用されず、酸性条件下で溶媒にベンゼンが使用されている。
【０００７】
また、フェルラ酸誘導体に関連した先行技術が示されている。フェルラ酸エステル誘導体を有効成分とする紫外線吸収剤（特許文献１１）、フィトステロール類のフェルラ酸エステルを有効成分とする皮膚外用薬（特許文献１２）が知られている。
【０００８】
このように、フェルラ酸そしてそれら誘導体は優れた有用性を示すものが多いことから、原料やリード化合物としてのこれらを効率的に製造する技術開示もなされている。フェルラ酸の製造方法の例としては、バニリンとマロン酸の縮合反応による製造（非特許文献５）、米糠からの製造方法（特許文献１３）、オイゲノールを原料とした菌体での製造法（特許文献１４）、コニフェリルアルデヒドからの酵素での製造法（特許文献１５）が知られている。
【０００９】
すなわち、原体及び前駆物質としてのフェルラ酸の価値の高さから、フェルラ酸の効率的な製造方法は進歩しており、現にフェルラ酸は試薬のみでなく食品添加物としてすら安価に供給されている。このような現状において、より安全、簡便そして効率的な方法により、有用なフェルラ酸関連物質の製造方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平５−３１０５２６号公報
【特許文献２】特開平６−２５６１３７号公報
【特許文献３】特開平９−２２１６６７号公報
【特許文献４】特開２０００−３２５０４９号公報
【特許文献５】特開２０００−２４７９００号公報
【特許文献６】特開２００７−２６７６７９号公報
【特許文献７】特開２００８−７５号公報
【特許文献８】特開２００９−２７３４０１号公報
【特許文献９】特許第４２５２１２０号公報
【特許文献１０】特開平５−２４４９６５号公報
【特許文献１１】特開２００３−１２８６３２号公報
【特許文献１２】特開平８−８１３５２号公報
【特許文献１３】特公平７−７８０３２号公報
【特許文献１４】特許平９−１５４５９１号公報
【特許文献１５】特許平１０−１５５４９６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １３３， ８９−９６（２００１）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１６６６−１６７０（１１９２）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７，１２１−１３３（２００７）
【非特許文献４】Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，１３， Ｎｏ．６， ５６３―５６８（１９８１）
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，７４， ５３４６―５３４８（１９５２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、フェルラ酸や該化合物を用いた有用化合物に関する前記の状況を鑑みて、フェルラ酸関連化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにフェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することで、原料であるフェルラ酸には認められない優れた抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を生成させることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
したがって、本発明は、優れた抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合物及びその薬学的に許容可能な塩を効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗癌剤さらには前記４−ビニルグアイアコール重合物を含有する食品及び医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の要旨は、
〔１〕フェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより下記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物を生成させることを特徴とする、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、
【００１５】
【化１】
【００１６】
〔２〕フェルラ酸をアルカリ条件下で９０℃から１５０℃で加熱処理する前記〔１〕記載の式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、
〔３〕前記〔１〕又は〔２〕記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤、
〔４〕前記〔１〕又は〔２〕記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、優れた抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を効率よく、安全に生成する方法を提供することができる。
本発明は、前記４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗癌剤さらには前記式（１）で示した４−ビニルグアイアコール重合物を含有する食品及び医薬品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１で行ったＨＰＬＣの分析結果を示す。上図が生成反応前、下図が生成反応後の結果であり、「Ａ」が４−ビニルグアイアコール重合化合物のピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
本発明の４−ビニルグアイアコール重合化合物は、式（１）：
【００２１】
【化２】
【００２２】
で表される構造式を有する。
【００２３】
また、本発明では、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物は、薬学的に許容可能な塩でもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２４】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩（以下、本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物と略する）は、前駆体であるフェルラ酸には認められない強い抗癌活性を有する化合物である。
【００２５】
本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物は、フェルラ酸を含有する組成物を、アルカリ条件下で加熱処理することで、生成することができる。
【００２６】
本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物は、前記非特許文献２で示されているように、合成方法は知られている。しかし、２００℃以上という高温が必要であり、反応中に発生するガス抜きを行うなど、産業化する上でコスト面において大きな障害がある。これに対して、本発明の製造方法は、比較的安価に入手できるフェルラ酸をアルカリ条件下で９０〜１５０℃に加熱処理することで生成する方法であり、非特許文献２に記載の合成方法と比べて、効率的で安全な製造方法である。
【００２７】
本発明の製造方法では、前記４−ビニルグアイアコール重合化合物の前駆体としてフェルラ酸が必要である。フェルラ酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のフェルラ酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、その後の所望の反応が進み最終的に前記４−ビニルグアイアコール重合化合物が得られるから、フェルラ酸以外の成分を含む混合物であってもよい。ただし、回収量の観点からは、フェルラ酸が５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、米糠やジャガイモの抽出物又は高純度の食品添加物のフェルラ酸がある。
【００２８】
フェルラ酸の純品、あるいはフェルラ酸含有混合物を、適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであればフェルラ酸の溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類に特に制限はなく、フェルラ酸が十分に溶解すれば良い。望ましくは、メタノールやエタノールのみか、水とメタノール、水とエタノールの混合液を使用することが、安全性やコスト面から望ましい。前記溶媒としては、最終的な精製を十分に適用せずに食品に使用する場合には、安全性や法規面からエタノールや含水エタノールが望ましい。
【００２９】
上記で得られたフェルラ酸含有溶液を、アルカリ性に調整する。例えば、フェルラ酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加しフェルラ酸含有溶液のｐＨを調整しても良いし、前述のフェルラ酸含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。フェルラ酸含有溶液のｐＨは最終的に７．１以上であれば目的の生成反応が進むが、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために、本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物の最終的な回収量が低下する。したがって、反応開始時のフェルラ酸含有溶液のｐＨは７．１〜１３．０が望ましい。フェルラ酸含有溶液中のフェルラ酸の濃度に制限はなく、反応前に十分に溶解していなくとも反応時に溶解することがある。フェルラ酸の濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、前記濃度は各々の溶媒に対しフェルラ酸が飽和する濃度近辺が好ましい。
【００３０】
前記フェルラ酸含有溶液をアルカリ性に調整するために使用できるｐＨ調整剤に特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が望ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いても良いが、必ずしも必要な手法ではない。
【００３１】
前記のようにアルカリ性に調整されたフェルラ酸含有溶液は、加熱処理される。所望の生成反応を効率的に進ませるために、加熱温度は９０℃以上であることが好ましい。また、溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。例えば、開放容器にフェルラ酸含有溶液を入れ高温で容器を加温する、密閉容器にフェルラ酸含有溶液を入れ加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が９０℃以上に達することが必要である。前記４−ビニルグアイアコール重合化合物等の回収効率面から、溶液温度が均一に９０〜１５０℃になることがさらに好ましい。溶液温度が１５０℃を越えると回収効率が低く適さない。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の生成反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近でフェルラ酸含有溶液を加熱する場合は、５分〜３００分の加熱時間が望ましい。また、加熱処理は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良く、効率面から判断すればよい。
【００３２】
前記加熱処理による４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬理学的に許容可能な塩の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の生成量を確認して判断すればよい。
【００３３】
前記のフェルラ酸含有溶液をアルカリ条件下で加熱処理することでフェルラ酸が処理されて、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を含有した混合物が得られる。安全な原料のみを用いた工程で得られた場合には、混合物の状態で使用することが可能である。例えば、天然由来のフェルラ酸をエタノール溶媒に溶解し重曹を加え、加熱反応させた場合には、混合物として食品原料の一つとして使用が可能である。
【００３４】
風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を濃縮して濃度を高める、あるいは精製し純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等により、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を抽出して濃縮できる。カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。最後に減圧乾燥や凍結乾燥により溶媒除去すると、粉末状の前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩の純品を得ることができる。
【００３５】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩は、後述のように、優れた抗癌活性を有するために、本化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供することができる。また、前記抗癌剤では、他の有効成分を含有しても良い。
【００３６】
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤等のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせて、また医薬品の場合には、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤等と組み合わせて、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を使用することが出来る。特に、本化合物の生理活性分野を考慮すると、癌予防・癌治療等の健康維持増進、さらには疾病治癒分野において用いることが好ましい。
【００３７】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。
【００３８】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を医薬用途で使用する場合、例えば、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩の摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。例えば、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩は、１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００３９】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。食品の形態としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、例えば、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。
【００４０】
また、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を医薬品又は食品として経口から投与又は摂取する場合には、常法に基づいて、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等としてもよい。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。また、前記錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等は、胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００４１】
前記の医薬品又は食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤、予防剤又は飼料に配合してもよい。
【００４２】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
（実施例１：４−ビニルグアイアコール重合化合物の生成）
フェルラ酸（和光純薬工業（株）製）５００ｍｇをエタノール１０ｍＬに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（和光純薬工業（株）製）１０ｍＬを加えた混合液（ｐH＝７．３）をオートクレーブ（商品名「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、三洋電機（株）製）にて１３０℃、４０分間加熱した。得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００４４】
得られたクロマトグラムを図１に示す。上図が生成反応前、下図が生成反応後のクロマトグラムを示している。上図ではフェルラ酸のピークが示されている。下図に示すように、生成反応によりフェルラ酸が減少し、増大したピークがいくつか確認されたことから、複数の化合物が生成されていることが確認された。中でも、Ａのピークで示された化合物は、フェルラ酸から生成されていることがわかる。
【００４５】
（実施例２：４−ビニルグアイアコール重合化合物の単離・構造決定）
実施例１で得られた反応物のうち、図１のＡで示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離した。常法に従って、乾燥したところ、黄色粉末状の化合物（以下、ＵＨＡ７００４）が３０１ｍｇ得られた。
【００４６】
次いで、前記ＵＨＡ７００４の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値はＵＨＡ７００４：３００．３４９５であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
ＵＨＡ７００４
理論値Ｃ１８Ｈ２０Ｏ４（Ｍ+）： ３００．３４９０
分子式Ｃ18Ｈ20Ｏ4
【００４７】
次に、前記ＵＨＡ７００４を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３C−NMR及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、ＵＨＡ７００４が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。このことから、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００４８】
なお、ＮＭＲ測定値について、式（１）で表されるＵＨＡ７００４の各部位を
【００４９】
【化３】
【００５０】
とし、１Ｈ核磁気共鳴スペクトル、１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルをそれぞれ表１で示す。
値はδ、ｐｐｍで、メタノール−ｄ３で測定した値である。
【００５１】
【表１】
【００５２】
また、ＵＨＡ７００４の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水： 不溶
メタノール： 可溶
エタノール： 可溶
ＤＭＳＯ： 可溶
クロロホルム： 可溶
酢酸エチル： 可溶
【００５３】
（実施例３：ＵＨＡ７００４の抗癌作用）
次にＵＨＡ７００４の抗癌作用を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制試験をした。
【００５４】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチジャパン（株）製）、１０％ＦＢＳ（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、バイオロジカルインダストリーズ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６９０」（シグマアルドリッチジャパン（株）製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍLとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μLずつ播種した。
【００５５】
試料は、フェルラ酸と、本発明品であるＵＨＡ７００４の２種類を用いた。試料調製については、各々の化合物をジメトキシスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、５０μM、１００μM、５００μM、１０００μM、２０００μMとなるように調製した。これをＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭとなるように添加して試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。
【００５６】
生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８」（商品名、ドージンドー・モレキュラー・テクノロジー（株）製）を用いたＭＴＴ法にて行った。試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で１時間の遮光反応後にプレートリーダー（「ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０」、バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した（表２）。これらの結果から、ＵＨＡ７００４には、強い癌細胞増殖抑制能が認められた。この効果は、フェルラ酸には全く認められず、フェルラ酸を４−ビニルグアイアコール重合化合物に変換する有意性が強く示唆された。
【００５７】
【表２】
【００５８】
（実施例４：加熱温度によるＵＨＡ７００４の生成量の違い）
フェルラ酸５０ｍｇ、エタノール１ｍＬ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍＬの混合溶液（ｐＨ＝７．３）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００５９】
その結果、７０℃以外の条件下においてＵＨＡ７００４の生成が確認できた。フェルラ酸からＵＨＡ７００４の生成比率は７０℃で非生成、９０℃で極微量、１１０℃で５重量％、１３０℃で４４重量％であった。すなわち、１３０℃での加熱が最も効率的であった。
【００６０】
（実施例５：ＵＨＡ７００４含有エキスの調製）
食品添加物のフェルラ酸１ｇ、エタノール２０ｍＬ、５％重曹水溶液２０ｍＬを加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝７．３）を、オートクレーブにて１３０℃、６０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ７００４含有エキスを１１ｇ得た。得られたＵＨＡ７００４含有エキス中には、実施例２と同様の手法で確認したところＵＨＡ７００４が０．６ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６１】
（実施例６：ＵＨＡ７００４を含有する食品）
実施例５で得たＵＨＡ７００４含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。本ミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
【００６２】
（実施例７：ＵＨＡ７００４を含有する医薬品）
実施例１及び２と同様の方法で得たＵＨＡ７００４をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに吸着させた後に、減圧乾燥させた。これを常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ７００４ １０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌の治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、より安全、簡便な方法でフェルラ酸から抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、前記４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む抗癌剤、食品、医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フェルラ酸は、植物の二次代謝産物の一つであり、例えば樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となり、天然界に比較的多く存在する成分である。また、フェルラ酸は、米糠やジャガイモの皮層部に多く含まれている。これらは全て食経験があり人に対する安全性も高い成分である。
【０００３】
前記フェルラ酸の生理機能に関連した先行技術としては、例えば、フェルラ酸を有効成分とする細胞分化促進剤（特許文献１）、フェルラ酸を有効成分とする美白用皮膚外用薬（特許文献２）、フェルラ酸を有効成分とする酸化防止剤（特許文献３）、フェルラ酸とニコチン酸アミドからなる魚卵の発色助剤（特許文献４）、フェルラ酸を有効成分とする抗菌剤（特許文献５）フェルラ酸のアルツハイマー病予防効果（非特許文献１）が知られている。
【０００４】
また、フェルラ酸を原料として、４−ビニルグアイアコールを製造する方法がいくつか開示されている。４−ビニルグアイアコールは、焼酎、泡盛あるいはビール製造時に微量に生成されることが知られており、これら酒類の香気の醸成に関与している。酒類原料由来のフェルラ酸に、麹菌などの微生物が産生するフェルラ酸脱炭酸酵素が作用し、４−ビニルグアイアコールが生成されるとされている。したがって、発酵に用いる酵母を特定した焼酎の製造方法（特許文献６）、乳酸菌を特定した蒸留酒の製造方法（特許文献７）、発酵に使用する主原料を麦類に限った麦焼酎及びその製造方法（特許文献８）、あるいはフェルラ酸の脱炭酸酵素（特許文献９）などが開示されている。
【０００５】
また、４−ビニルグアイアコールは、香気の構成成分であるばかりではなく、４−ビニルグアイアコールからバニリンが生成されることからも関連技術が散見される（特許文献１０）。
しかしながら、上述したいずれの公知技術においても、４−ビニルグアイアコール重合化合物の生成に関する記載はなく、またその可能性すら示唆されていない。
【０００６】
また、フェルラ酸から４−ビニルグアイアコール重合化合物の化学的合成方法（非特許文献２）も知られているが、本法では、フェルラ酸のみを融点以上に昇温させ２０５℃で維持することにより４−ビニルグアイアコール重合化合物を得ている。したがって、融点以下の温度条件では、目的の反応が進行しないことは明らかである。また、本法は、工程上も密閉させたり、ガス抜きしたりなど制御が困難であり、大量合成を行うには、作業性や安全性などに大きな問題がある。
その他にも、リグニン関連化合物から４−ビニルグアイアコール重合化合物を取得する報告（非特許文献３）があるが、本法ではフェルラ酸は使用されておらず、反応条件も２５０℃と高温である。同様に４−ビニルグアイアコール重合化合物を取得する報告（非特許文献４）があるが、本法でもフェルラ酸は使用されず、酸性条件下で溶媒にベンゼンが使用されている。
【０００７】
また、フェルラ酸誘導体に関連した先行技術が示されている。フェルラ酸エステル誘導体を有効成分とする紫外線吸収剤（特許文献１１）、フィトステロール類のフェルラ酸エステルを有効成分とする皮膚外用薬（特許文献１２）が知られている。
【０００８】
このように、フェルラ酸そしてそれら誘導体は優れた有用性を示すものが多いことから、原料やリード化合物としてのこれらを効率的に製造する技術開示もなされている。フェルラ酸の製造方法の例としては、バニリンとマロン酸の縮合反応による製造（非特許文献５）、米糠からの製造方法（特許文献１３）、オイゲノールを原料とした菌体での製造法（特許文献１４）、コニフェリルアルデヒドからの酵素での製造法（特許文献１５）が知られている。
【０００９】
すなわち、原体及び前駆物質としてのフェルラ酸の価値の高さから、フェルラ酸の効率的な製造方法は進歩しており、現にフェルラ酸は試薬のみでなく食品添加物としてすら安価に供給されている。このような現状において、より安全、簡便そして効率的な方法により、有用なフェルラ酸関連物質の製造方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平５−３１０５２６号公報
【特許文献２】特開平６−２５６１３７号公報
【特許文献３】特開平９−２２１６６７号公報
【特許文献４】特開２０００−３２５０４９号公報
【特許文献５】特開２０００−２４７９００号公報
【特許文献６】特開２００７−２６７６７９号公報
【特許文献７】特開２００８−７５号公報
【特許文献８】特開２００９−２７３４０１号公報
【特許文献９】特許第４２５２１２０号公報
【特許文献１０】特開平５−２４４９６５号公報
【特許文献１１】特開２００３−１２８６３２号公報
【特許文献１２】特開平８−８１３５２号公報
【特許文献１３】特公平７−７８０３２号公報
【特許文献１４】特許平９−１５４５９１号公報
【特許文献１５】特許平１０−１５５４９６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １３３， ８９−９６（２００１）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１６６６−１６７０（１１９２）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７，１２１−１３３（２００７）
【非特許文献４】Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，１３， Ｎｏ．６， ５６３―５６８（１９８１）
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，７４， ５３４６―５３４８（１９５２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、フェルラ酸や該化合物を用いた有用化合物に関する前記の状況を鑑みて、フェルラ酸関連化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにフェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することで、原料であるフェルラ酸には認められない優れた抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を生成させることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
したがって、本発明は、優れた抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合物及びその薬学的に許容可能な塩を効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗癌剤さらには前記４−ビニルグアイアコール重合物を含有する食品及び医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の要旨は、
〔１〕フェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより下記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物を生成させることを特徴とする、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、
【００１５】
【化１】
【００１６】
〔２〕フェルラ酸をアルカリ条件下で９０℃から１５０℃で加熱処理する前記〔１〕記載の式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、
〔３〕前記〔１〕又は〔２〕記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤、
〔４〕前記〔１〕又は〔２〕記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、優れた抗癌活性を有する４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を効率よく、安全に生成する方法を提供することができる。
本発明は、前記４−ビニルグアイアコール重合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗癌剤さらには前記式（１）で示した４−ビニルグアイアコール重合物を含有する食品及び医薬品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１で行ったＨＰＬＣの分析結果を示す。上図が生成反応前、下図が生成反応後の結果であり、「Ａ」が４−ビニルグアイアコール重合化合物のピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
本発明の４−ビニルグアイアコール重合化合物は、式（１）：
【００２１】
【化２】
【００２２】
で表される構造式を有する。
【００２３】
また、本発明では、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物は、薬学的に許容可能な塩でもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２４】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩（以下、本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物と略する）は、前駆体であるフェルラ酸には認められない強い抗癌活性を有する化合物である。
【００２５】
本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物は、フェルラ酸を含有する組成物を、アルカリ条件下で加熱処理することで、生成することができる。
【００２６】
本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物は、前記非特許文献２で示されているように、合成方法は知られている。しかし、２００℃以上という高温が必要であり、反応中に発生するガス抜きを行うなど、産業化する上でコスト面において大きな障害がある。これに対して、本発明の製造方法は、比較的安価に入手できるフェルラ酸をアルカリ条件下で９０〜１５０℃に加熱処理することで生成する方法であり、非特許文献２に記載の合成方法と比べて、効率的で安全な製造方法である。
【００２７】
本発明の製造方法では、前記４−ビニルグアイアコール重合化合物の前駆体としてフェルラ酸が必要である。フェルラ酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のフェルラ酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、その後の所望の反応が進み最終的に前記４−ビニルグアイアコール重合化合物が得られるから、フェルラ酸以外の成分を含む混合物であってもよい。ただし、回収量の観点からは、フェルラ酸が５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、米糠やジャガイモの抽出物又は高純度の食品添加物のフェルラ酸がある。
【００２８】
フェルラ酸の純品、あるいはフェルラ酸含有混合物を、適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであればフェルラ酸の溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類に特に制限はなく、フェルラ酸が十分に溶解すれば良い。望ましくは、メタノールやエタノールのみか、水とメタノール、水とエタノールの混合液を使用することが、安全性やコスト面から望ましい。前記溶媒としては、最終的な精製を十分に適用せずに食品に使用する場合には、安全性や法規面からエタノールや含水エタノールが望ましい。
【００２９】
上記で得られたフェルラ酸含有溶液を、アルカリ性に調整する。例えば、フェルラ酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加しフェルラ酸含有溶液のｐＨを調整しても良いし、前述のフェルラ酸含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。フェルラ酸含有溶液のｐＨは最終的に７．１以上であれば目的の生成反応が進むが、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために、本発明品中の有効成分である４−ビニルグアイアコール重合化合物の最終的な回収量が低下する。したがって、反応開始時のフェルラ酸含有溶液のｐＨは７．１〜１３．０が望ましい。フェルラ酸含有溶液中のフェルラ酸の濃度に制限はなく、反応前に十分に溶解していなくとも反応時に溶解することがある。フェルラ酸の濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、前記濃度は各々の溶媒に対しフェルラ酸が飽和する濃度近辺が好ましい。
【００３０】
前記フェルラ酸含有溶液をアルカリ性に調整するために使用できるｐＨ調整剤に特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が望ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いても良いが、必ずしも必要な手法ではない。
【００３１】
前記のようにアルカリ性に調整されたフェルラ酸含有溶液は、加熱処理される。所望の生成反応を効率的に進ませるために、加熱温度は９０℃以上であることが好ましい。また、溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。例えば、開放容器にフェルラ酸含有溶液を入れ高温で容器を加温する、密閉容器にフェルラ酸含有溶液を入れ加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が９０℃以上に達することが必要である。前記４−ビニルグアイアコール重合化合物等の回収効率面から、溶液温度が均一に９０〜１５０℃になることがさらに好ましい。溶液温度が１５０℃を越えると回収効率が低く適さない。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の生成反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近でフェルラ酸含有溶液を加熱する場合は、５分〜３００分の加熱時間が望ましい。また、加熱処理は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良く、効率面から判断すればよい。
【００３２】
前記加熱処理による４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬理学的に許容可能な塩の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の生成量を確認して判断すればよい。
【００３３】
前記のフェルラ酸含有溶液をアルカリ条件下で加熱処理することでフェルラ酸が処理されて、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を含有した混合物が得られる。安全な原料のみを用いた工程で得られた場合には、混合物の状態で使用することが可能である。例えば、天然由来のフェルラ酸をエタノール溶媒に溶解し重曹を加え、加熱反応させた場合には、混合物として食品原料の一つとして使用が可能である。
【００３４】
風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を濃縮して濃度を高める、あるいは精製し純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等により、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を抽出して濃縮できる。カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。最後に減圧乾燥や凍結乾燥により溶媒除去すると、粉末状の前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩の純品を得ることができる。
【００３５】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩は、後述のように、優れた抗癌活性を有するために、本化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供することができる。また、前記抗癌剤では、他の有効成分を含有しても良い。
【００３６】
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤等のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせて、また医薬品の場合には、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤等と組み合わせて、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を使用することが出来る。特に、本化合物の生理活性分野を考慮すると、癌予防・癌治療等の健康維持増進、さらには疾病治癒分野において用いることが好ましい。
【００３７】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。
【００３８】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を医薬用途で使用する場合、例えば、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩の摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。例えば、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩は、１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００３９】
前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。食品の形態としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、例えば、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。
【００４０】
また、前記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又は薬学的に許容可能な塩を医薬品又は食品として経口から投与又は摂取する場合には、常法に基づいて、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等としてもよい。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。また、前記錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等は、胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００４１】
前記の医薬品又は食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤、予防剤又は飼料に配合してもよい。
【００４２】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
（実施例１：４−ビニルグアイアコール重合化合物の生成）
フェルラ酸（和光純薬工業（株）製）５００ｍｇをエタノール１０ｍＬに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（和光純薬工業（株）製）１０ｍＬを加えた混合液（ｐH＝７．３）をオートクレーブ（商品名「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、三洋電機（株）製）にて１３０℃、４０分間加熱した。得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００４４】
得られたクロマトグラムを図１に示す。上図が生成反応前、下図が生成反応後のクロマトグラムを示している。上図ではフェルラ酸のピークが示されている。下図に示すように、生成反応によりフェルラ酸が減少し、増大したピークがいくつか確認されたことから、複数の化合物が生成されていることが確認された。中でも、Ａのピークで示された化合物は、フェルラ酸から生成されていることがわかる。
【００４５】
（実施例２：４−ビニルグアイアコール重合化合物の単離・構造決定）
実施例１で得られた反応物のうち、図１のＡで示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離した。常法に従って、乾燥したところ、黄色粉末状の化合物（以下、ＵＨＡ７００４）が３０１ｍｇ得られた。
【００４６】
次いで、前記ＵＨＡ７００４の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値はＵＨＡ７００４：３００．３４９５であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
ＵＨＡ７００４
理論値Ｃ１８Ｈ２０Ｏ４（Ｍ+）： ３００．３４９０
分子式Ｃ18Ｈ20Ｏ4
【００４７】
次に、前記ＵＨＡ７００４を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３C−NMR及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、ＵＨＡ７００４が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。このことから、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００４８】
なお、ＮＭＲ測定値について、式（１）で表されるＵＨＡ７００４の各部位を
【００４９】
【化３】
【００５０】
とし、１Ｈ核磁気共鳴スペクトル、１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルをそれぞれ表１で示す。
値はδ、ｐｐｍで、メタノール−ｄ３で測定した値である。
【００５１】
【表１】
【００５２】
また、ＵＨＡ７００４の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水： 不溶
メタノール： 可溶
エタノール： 可溶
ＤＭＳＯ： 可溶
クロロホルム： 可溶
酢酸エチル： 可溶
【００５３】
（実施例３：ＵＨＡ７００４の抗癌作用）
次にＵＨＡ７００４の抗癌作用を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制試験をした。
【００５４】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチジャパン（株）製）、１０％ＦＢＳ（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、バイオロジカルインダストリーズ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６９０」（シグマアルドリッチジャパン（株）製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍLとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μLずつ播種した。
【００５５】
試料は、フェルラ酸と、本発明品であるＵＨＡ７００４の２種類を用いた。試料調製については、各々の化合物をジメトキシスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、５０μM、１００μM、５００μM、１０００μM、２０００μMとなるように調製した。これをＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭとなるように添加して試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。
【００５６】
生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８」（商品名、ドージンドー・モレキュラー・テクノロジー（株）製）を用いたＭＴＴ法にて行った。試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で１時間の遮光反応後にプレートリーダー（「ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０」、バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した（表２）。これらの結果から、ＵＨＡ７００４には、強い癌細胞増殖抑制能が認められた。この効果は、フェルラ酸には全く認められず、フェルラ酸を４−ビニルグアイアコール重合化合物に変換する有意性が強く示唆された。
【００５７】
【表２】
【００５８】
（実施例４：加熱温度によるＵＨＡ７００４の生成量の違い）
フェルラ酸５０ｍｇ、エタノール１ｍＬ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍＬの混合溶液（ｐＨ＝７．３）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００５９】
その結果、７０℃以外の条件下においてＵＨＡ７００４の生成が確認できた。フェルラ酸からＵＨＡ７００４の生成比率は７０℃で非生成、９０℃で極微量、１１０℃で５重量％、１３０℃で４４重量％であった。すなわち、１３０℃での加熱が最も効率的であった。
【００６０】
（実施例５：ＵＨＡ７００４含有エキスの調製）
食品添加物のフェルラ酸１ｇ、エタノール２０ｍＬ、５％重曹水溶液２０ｍＬを加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝７．３）を、オートクレーブにて１３０℃、６０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ７００４含有エキスを１１ｇ得た。得られたＵＨＡ７００４含有エキス中には、実施例２と同様の手法で確認したところＵＨＡ７００４が０．６ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６１】
（実施例６：ＵＨＡ７００４を含有する食品）
実施例５で得たＵＨＡ７００４含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。本ミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
【００６２】
（実施例７：ＵＨＡ７００４を含有する医薬品）
実施例１及び２と同様の方法で得たＵＨＡ７００４をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに吸着させた後に、減圧乾燥させた。これを常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ７００４ １０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌の治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより下記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を生成させることを特徴とする、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【化１】
【請求項２】
フェルラ酸をアルカリ条件下で９０℃から１５０℃で加熱処理する請求項１記載の式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品。
【請求項１】
フェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより下記式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩を生成させることを特徴とする、式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【化１】
【請求項２】
フェルラ酸をアルカリ条件下で９０℃から１５０℃で加熱処理する請求項１記載の式（１）で表される４−ビニルグアイアコール重合化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の製造方法より得られる４−ビニルグアイアコール重合化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１１１７３６（Ｐ２０１２−１１１７３６Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６４１７３（Ｐ２０１０−２６４１７３）
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
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