５’−ヌクレオチドの製造方法
【課題】酵母エキスをはじめとする各種調味料に有用に利用できる呈味性の５’−ヌクレオチドを、酵母抽出液中のリボ核酸から高収率で製造する方法を提供する。
【解決手段】リボ核酸を含む酵母抽出液に、ホスホジエステラーゼを作用させてリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解するに際し、該酵母抽出液を予め脱ポリアミン（特に、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミン）処理、弱酸性陽イオン交換樹脂又は吸着樹脂処理、する。
【解決手段】リボ核酸を含む酵母抽出液に、ホスホジエステラーゼを作用させてリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解するに際し、該酵母抽出液を予め脱ポリアミン（特に、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミン）処理、弱酸性陽イオン交換樹脂又は吸着樹脂処理、する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母から抽出したリボ核酸をホスホジエステラーゼにより酵素分解し、収率よく５’−ヌクレオチドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母エキスは強い呈味性を有するために他の調味料と配合され、食品素材、調味料等に広く用いられている。酵母エキスの呈味成分は、アミノ酸、ペプチド、糖類、５’−ヌクレオチド等であるが、中でも５’−ヌクレオチド類、特に５’−グアニル酸ナトリウム（以下、単にＧＭＰとも略称する。）及び５’−イノシン酸ナトリウム（以下、単にＩＭＰとも略称する。）は、旨味成分、コク味成分として重要である。そこで、酵母エキスに、これらの天然の５’−ヌクレオチド類を多量に含有させる方法がが開発されてきた（特許文献１）。
【０００３】
これら５’−ヌクレオチド類を多量に含有する酵母エキスは、リボ核酸の自己消化による３’−ヌクレオチドの生成を防ぐために、酵母菌体を熱処理し菌体内酵素を失活させると共に菌体内のリボ核酸を抽出し、ホスホジエステラーゼを作用させることにより製造される。
ホスホジエステラーゼによるリボ核酸の分解条件は古くから検討されており（特許文献２）、酵母抽出物においてもそれら条件が適用されるが、酵母抽出物によっては、特にリボ核酸の含有率の高いキャンディダ属の酵母抽出物においては、リボ核酸の分解率が十分ではなく、更なる検討が求められていた。
【特許文献１】ＷＯ８８／０５２６７号公報、特開平６−１１３７８９号公報
【特許文献２】特公昭３６−５２８７号公報、同３９−１２３４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、酵母、特にキャンディダ属酵母、菌体から抽出したリボ核酸を含む抽出液について、収率よくリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意研究の結果、酵母抽出物中のポリアミンがリボ核酸の分解率を抑えていること、ポリアミンを除去することによりリボ核酸の分解率が向上すること、を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）リボ核酸を含む酵母抽出液に、ホスホジエステラーゼを作用させてリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解するに際し、該酵母抽出液を予め脱ポリアミン処理することを特徴とする、５’−ヌクレオチドの製造方法、
（２）酵母がキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母である上記（１）記載の５’−ヌクレオチドの製造方法、
（３）ポリアミンが、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミンである、上記（１）乃至（２）記載の５’−ヌクレオチドの製造方法、
（４）脱ポリアミン処理が、弱酸性陽イオン交換樹脂又は吸着樹脂によるものである、上記（１）乃至（３）のいずれか一に記載の５’−ヌクレオチドの製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、酵母抽出物中のリボ核酸を収率よく呈味性の５’−リボヌクレオチドに分解できる。特にリボ核酸の含有量の高いキャンディダ属酵母はポリアミンの含有量も多く、酵母菌体中のリボ核酸含有量をあげることなく、酵母エキス中の５’−ヌクレオチド含有量をより高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用されるリボ核酸を含む酵母抽出液は、酵母菌体をプロテアーゼ処理、細胞壁溶解酵素処理、加熱抽出、アルカリ抽出等によってリボ核酸を抽出した抽出液であり、菌体内酵素を失活させたものが好ましい。
用いられる酵母は、食用酵母であるサッカロミセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母があげられるが、中でもリボ核酸の含有量が高く、抽出物中にはポリアミンの量も多い、キャンディダ属酵母が特に好ましい。
【０００８】
ポリアミン類とは、通常、酵母菌体中に含まれているポリアミンをいい、例えば、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン等であるが、中でも、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミンが、ホスホジエステラーゼのリボ核酸の分解能を低下させる割合が高い。
【０００９】
抽出液の脱ポリアミン処理は、任意の方法が用いられるが、特に弱酸性陽イオン交換樹脂あるいは吸着樹脂で処理する方法が、簡便で、酵母抽出物中の有効成分のロスも少なく、好ましい。
使用できる弱酸性陽イオン交換樹脂としては、アクリル系のものが好ましく、例えば、アンバーライトＩＲＣ−７６（オルガノ（株）製）、ダイヤイオンＷＫ１０、同２０（三菱化学（株）製）、レバチットＣＮＰ−８０、同ＣＮＰ−Ｃ（バイエル（株）製）等が例示される。
また、吸着樹脂としては、芳香族系又は芳香族系修飾型のものが好ましく、例えば、ダイヤイオンHP20、同２１、セパビーズＳＰ２０７、同８２５、同８５０（三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ２、同４、同７（オルガノ（株）製）等が挙げられる。
【００１０】
これら樹脂による処理条件は、ポリアミン類を吸着できる条件であれば特に制限はないが、通常、通液速度（ＳＶ）が０．５〜５程度が好ましい。
【００１１】
脱ポリアミン処理された抽出液のホスホジエステラーゼによる分解条件は、公知の条件に準じて実施することができる。
【実施例】
【００１２】
以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
なお、ＲＮＡ分解率は、以下の方法により求めた。
ＲＮＡの酵素分解溶液（０．５５ｍｌ）に０．４Ｍ過塩素酸溶液を加え、遠心分離（１０，０００ｐｐｍ、１０分間）して上澄と沈殿物に分け、沈殿物を取得した。沈殿物に０．３ＭＫＯＨ溶液０．２ｍｌを加えて攪拌後、４５℃で６０分間反応させた。反応後、６０％過塩素酸０．０６ｍｌ及び蒸留水０．７４ｍｌを加え、遠心分離（１０，０００ｐｐｍ、１０分間）した。上澄０．１ｍｌを採取して蒸留水２．４ｍｌを加え２５倍希釈とし、紫外可視分光光度計（島津製作所Ｕｖｍｉｎｉ−１２４０）を用いて波長２６０ｎｍでの吸光度（Ｉ）を測定した。反応前の溶液についても２５倍希釈し吸光度（ＩＩ）を測定した。
分解率は数１により算出した。
【００１３】
【数１】
【００１４】
実施例１
ＲＮＡ溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液５．９ｍｌと５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液１４．１ｍｌから調整した酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）に１０ｇ／ＬとなるようにＲＮＡを溶解したもの）５００μｌ、及び該ＲＮＡ溶液に０．４２ｍｍｏｌ／Ｌになるようにリン酸スペルミンを添加した溶液５００μｌ、に、酵素溶液（リボヌクレアーゼアマノＤ（天野製薬製）、２ｇ／Ｌ）をそれぞれ５０μＬ添加し、６５℃で反応した。
反応時間とＲＮＡ分解率の結果を表１及び図１に示す。
表１及び図１から、リン酸スペルミンが存在する場合は、ＲＮＡの分解率が低いことが分かる。
【００１５】
【表１】
【００１６】
実施例２
実施例１において、リン酸スペルミンの添加量を変化させた以外は実施例１と同様に実施し、ＲＮＡ分解率を求めた。なお、反応時間は、実施例１の結果から１０分間とした。
結果を表２及び図２に示す。
表２及び図２から、リン酸スペルミンの添加量が多いほど分解率も低下することが分かる。
【００１７】
【表２】
【００１８】
実施例３
実施例１において、ポリアミンとしてプトレッシン、スペルミジン、スペルミンを用いた以外は実施例１と同様に実施し、ＲＮＡ分解率を求めた。なお、反応時間は、実施例１の結果から１０分間とした。
結果を表３及び図３に示す。
表３及び図２から、分子内に有するアミノ基の数によってＲＮＡ分解率が異なることが分かる。
【００１９】
【表３】
【００２０】
実施例４
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株の１０％菌体懸濁液１０００ｍｌを９０℃３０分間加熱し、菌体内酵素を完全に失活させた後、４０℃に冷却し、プロチンＰＣ−１０（大和化成製プロテアーゼ製剤）０．５ｇを添加し、４０℃で１０時間撹拌し、次いで該酵素を加熱失活させることにより、酵素抽出物を得た。
得られた酵素抽出液１０ｍｌを用い、弱酸性陽イオン交換樹脂（ＷＫ−１１）２．５ｍｌを加え、ｐＨを５．６に制御撹拌した後、濾過することにより樹脂を除き、脱ポリアミン処理液を得た。
該処理液２ｍｌをとり、リボヌクレアーゼアマノＤ（天野製薬製）２ｍｌ（２ｇ／Ｌ溶液）を加え、６５℃で反応した。
結果を表４に示す。
【００２１】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００２２】
以上説明してきたように、本発明によると、酵母抽出液中のリボ核酸から高収率で呈味性の５’−ヌクレオチドを製造することができるため、酵母エキスをはじめとする各種調味料に有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】リン酸スペルミンのＲＮＡ分解率に対する影響を示す図である。
【図２】リン酸スペルミンの濃度とＲＮＡ分解率との関係を示す図である。
【図３】ポリアミン分子中のアミノ基の数とＲＮＡ分解率との関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母から抽出したリボ核酸をホスホジエステラーゼにより酵素分解し、収率よく５’−ヌクレオチドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母エキスは強い呈味性を有するために他の調味料と配合され、食品素材、調味料等に広く用いられている。酵母エキスの呈味成分は、アミノ酸、ペプチド、糖類、５’−ヌクレオチド等であるが、中でも５’−ヌクレオチド類、特に５’−グアニル酸ナトリウム（以下、単にＧＭＰとも略称する。）及び５’−イノシン酸ナトリウム（以下、単にＩＭＰとも略称する。）は、旨味成分、コク味成分として重要である。そこで、酵母エキスに、これらの天然の５’−ヌクレオチド類を多量に含有させる方法がが開発されてきた（特許文献１）。
【０００３】
これら５’−ヌクレオチド類を多量に含有する酵母エキスは、リボ核酸の自己消化による３’−ヌクレオチドの生成を防ぐために、酵母菌体を熱処理し菌体内酵素を失活させると共に菌体内のリボ核酸を抽出し、ホスホジエステラーゼを作用させることにより製造される。
ホスホジエステラーゼによるリボ核酸の分解条件は古くから検討されており（特許文献２）、酵母抽出物においてもそれら条件が適用されるが、酵母抽出物によっては、特にリボ核酸の含有率の高いキャンディダ属の酵母抽出物においては、リボ核酸の分解率が十分ではなく、更なる検討が求められていた。
【特許文献１】ＷＯ８８／０５２６７号公報、特開平６−１１３７８９号公報
【特許文献２】特公昭３６−５２８７号公報、同３９−１２３４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、酵母、特にキャンディダ属酵母、菌体から抽出したリボ核酸を含む抽出液について、収率よくリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意研究の結果、酵母抽出物中のポリアミンがリボ核酸の分解率を抑えていること、ポリアミンを除去することによりリボ核酸の分解率が向上すること、を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）リボ核酸を含む酵母抽出液に、ホスホジエステラーゼを作用させてリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解するに際し、該酵母抽出液を予め脱ポリアミン処理することを特徴とする、５’−ヌクレオチドの製造方法、
（２）酵母がキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母である上記（１）記載の５’−ヌクレオチドの製造方法、
（３）ポリアミンが、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミンである、上記（１）乃至（２）記載の５’−ヌクレオチドの製造方法、
（４）脱ポリアミン処理が、弱酸性陽イオン交換樹脂又は吸着樹脂によるものである、上記（１）乃至（３）のいずれか一に記載の５’−ヌクレオチドの製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、酵母抽出物中のリボ核酸を収率よく呈味性の５’−リボヌクレオチドに分解できる。特にリボ核酸の含有量の高いキャンディダ属酵母はポリアミンの含有量も多く、酵母菌体中のリボ核酸含有量をあげることなく、酵母エキス中の５’−ヌクレオチド含有量をより高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用されるリボ核酸を含む酵母抽出液は、酵母菌体をプロテアーゼ処理、細胞壁溶解酵素処理、加熱抽出、アルカリ抽出等によってリボ核酸を抽出した抽出液であり、菌体内酵素を失活させたものが好ましい。
用いられる酵母は、食用酵母であるサッカロミセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母があげられるが、中でもリボ核酸の含有量が高く、抽出物中にはポリアミンの量も多い、キャンディダ属酵母が特に好ましい。
【０００８】
ポリアミン類とは、通常、酵母菌体中に含まれているポリアミンをいい、例えば、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン等であるが、中でも、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミンが、ホスホジエステラーゼのリボ核酸の分解能を低下させる割合が高い。
【０００９】
抽出液の脱ポリアミン処理は、任意の方法が用いられるが、特に弱酸性陽イオン交換樹脂あるいは吸着樹脂で処理する方法が、簡便で、酵母抽出物中の有効成分のロスも少なく、好ましい。
使用できる弱酸性陽イオン交換樹脂としては、アクリル系のものが好ましく、例えば、アンバーライトＩＲＣ−７６（オルガノ（株）製）、ダイヤイオンＷＫ１０、同２０（三菱化学（株）製）、レバチットＣＮＰ−８０、同ＣＮＰ−Ｃ（バイエル（株）製）等が例示される。
また、吸着樹脂としては、芳香族系又は芳香族系修飾型のものが好ましく、例えば、ダイヤイオンHP20、同２１、セパビーズＳＰ２０７、同８２５、同８５０（三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ２、同４、同７（オルガノ（株）製）等が挙げられる。
【００１０】
これら樹脂による処理条件は、ポリアミン類を吸着できる条件であれば特に制限はないが、通常、通液速度（ＳＶ）が０．５〜５程度が好ましい。
【００１１】
脱ポリアミン処理された抽出液のホスホジエステラーゼによる分解条件は、公知の条件に準じて実施することができる。
【実施例】
【００１２】
以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
なお、ＲＮＡ分解率は、以下の方法により求めた。
ＲＮＡの酵素分解溶液（０．５５ｍｌ）に０．４Ｍ過塩素酸溶液を加え、遠心分離（１０，０００ｐｐｍ、１０分間）して上澄と沈殿物に分け、沈殿物を取得した。沈殿物に０．３ＭＫＯＨ溶液０．２ｍｌを加えて攪拌後、４５℃で６０分間反応させた。反応後、６０％過塩素酸０．０６ｍｌ及び蒸留水０．７４ｍｌを加え、遠心分離（１０，０００ｐｐｍ、１０分間）した。上澄０．１ｍｌを採取して蒸留水２．４ｍｌを加え２５倍希釈とし、紫外可視分光光度計（島津製作所Ｕｖｍｉｎｉ−１２４０）を用いて波長２６０ｎｍでの吸光度（Ｉ）を測定した。反応前の溶液についても２５倍希釈し吸光度（ＩＩ）を測定した。
分解率は数１により算出した。
【００１３】
【数１】
【００１４】
実施例１
ＲＮＡ溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液５．９ｍｌと５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液１４．１ｍｌから調整した酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）に１０ｇ／ＬとなるようにＲＮＡを溶解したもの）５００μｌ、及び該ＲＮＡ溶液に０．４２ｍｍｏｌ／Ｌになるようにリン酸スペルミンを添加した溶液５００μｌ、に、酵素溶液（リボヌクレアーゼアマノＤ（天野製薬製）、２ｇ／Ｌ）をそれぞれ５０μＬ添加し、６５℃で反応した。
反応時間とＲＮＡ分解率の結果を表１及び図１に示す。
表１及び図１から、リン酸スペルミンが存在する場合は、ＲＮＡの分解率が低いことが分かる。
【００１５】
【表１】
【００１６】
実施例２
実施例１において、リン酸スペルミンの添加量を変化させた以外は実施例１と同様に実施し、ＲＮＡ分解率を求めた。なお、反応時間は、実施例１の結果から１０分間とした。
結果を表２及び図２に示す。
表２及び図２から、リン酸スペルミンの添加量が多いほど分解率も低下することが分かる。
【００１７】
【表２】
【００１８】
実施例３
実施例１において、ポリアミンとしてプトレッシン、スペルミジン、スペルミンを用いた以外は実施例１と同様に実施し、ＲＮＡ分解率を求めた。なお、反応時間は、実施例１の結果から１０分間とした。
結果を表３及び図３に示す。
表３及び図２から、分子内に有するアミノ基の数によってＲＮＡ分解率が異なることが分かる。
【００１９】
【表３】
【００２０】
実施例４
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株の１０％菌体懸濁液１０００ｍｌを９０℃３０分間加熱し、菌体内酵素を完全に失活させた後、４０℃に冷却し、プロチンＰＣ−１０（大和化成製プロテアーゼ製剤）０．５ｇを添加し、４０℃で１０時間撹拌し、次いで該酵素を加熱失活させることにより、酵素抽出物を得た。
得られた酵素抽出液１０ｍｌを用い、弱酸性陽イオン交換樹脂（ＷＫ−１１）２．５ｍｌを加え、ｐＨを５．６に制御撹拌した後、濾過することにより樹脂を除き、脱ポリアミン処理液を得た。
該処理液２ｍｌをとり、リボヌクレアーゼアマノＤ（天野製薬製）２ｍｌ（２ｇ／Ｌ溶液）を加え、６５℃で反応した。
結果を表４に示す。
【００２１】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００２２】
以上説明してきたように、本発明によると、酵母抽出液中のリボ核酸から高収率で呈味性の５’−ヌクレオチドを製造することができるため、酵母エキスをはじめとする各種調味料に有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】リン酸スペルミンのＲＮＡ分解率に対する影響を示す図である。
【図２】リン酸スペルミンの濃度とＲＮＡ分解率との関係を示す図である。
【図３】ポリアミン分子中のアミノ基の数とＲＮＡ分解率との関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸を含む酵母抽出液に、ホスホジエステラーゼを作用させてリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解するに際し、該酵母抽出液を予め脱ポリアミン処理することを特徴とする、５’−ヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
酵母がキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母である請求項１記載の５’−ヌクレオチドの製造方法。
【請求項３】
ポリアミンが、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミンである、請求項１乃至２記載の５’−ヌクレオチドの製造方法。
【請求項４】
脱ポリアミン処理が、弱酸性陽イオン交換樹脂又は吸着樹脂によるものである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の５’−ヌクレオチドの製造方法。
【請求項１】
リボ核酸を含む酵母抽出液に、ホスホジエステラーゼを作用させてリボ核酸を５’−ヌクレオチドに分解するに際し、該酵母抽出液を予め脱ポリアミン処理することを特徴とする、５’−ヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
酵母がキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母である請求項１記載の５’−ヌクレオチドの製造方法。
【請求項３】
ポリアミンが、分子中にアミノ基を３基以上有しているポリアミンである、請求項１乃至２記載の５’−ヌクレオチドの製造方法。
【請求項４】
脱ポリアミン処理が、弱酸性陽イオン交換樹脂又は吸着樹脂によるものである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の５’−ヌクレオチドの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２３７１２５（Ｐ２００８−２３７１２５Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８３１７５（Ｐ２００７−８３１７５）
【出願日】平成１９年３月２８日（２００７．３．２８）
【出願人】（０００１４２２５２）株式会社興人 (182)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２８日（２００７．３．２８）
【出願人】（０００１４２２５２）株式会社興人 (182)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]