本明細書には、イソプレンの生産を増加させるよう改良された組成物及び方法が提供される。同様に、本明細書は、生物活性を有する非相同ポリペプチドの生産を増加させるよう改良された組成物及び方法も提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを生産することのできるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の組み換え細胞又はそれらの子孫細胞であって、前記細胞は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー（ここで、前記核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）；並びに（ｂ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；を含み、
前記エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、
得られる前記組み換え細胞は、（ａ）及び（ｂ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する、組み換え細胞又はそれらの子孫細胞。
【請求項２】
前記エシェリキア・コリ染色体に、モリブデン取り込みポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピーが更に組み込まれる、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項３】
前記モリブデン取り込みポリペプチドが、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択される、請求項２に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項４】
前記エシェリキア・コリ染色体に、ガラクトース代謝ポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピーが更に組み込まれる、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項５】
前記ガラクトース代謝ポリペプチドがｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される、請求項４に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項６】
前記エシェリキア・コリ染色体に、ガラクトース代謝ポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピー及びモリブデン取り込みポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピーが更に組み込まれる、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項７】
（ａ）前記ＰＧＬポリペプチドがエシェリキア・コリＰＧＬポリペプチドであり；（ｂ）前記モリブデン取り込みポリペプチドが、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択され；並びに（ｃ）前記ガラクトース代謝ポリペプチドが、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される、請求項６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項８】
前記ＰＧＬポリペプチド、ガラクトース代謝ポリペプチド、及びモリブデン取り込みポリペプチドをコードしている核酸が、図２０に示すような１７，２５７塩基対片の一部である、請求項７に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項９】
前記細胞が、（ａ）及び（ｂ）を含有しない同様の細胞よりもより高い比生産性でイソプレンを生産する、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１０】
比生産性が少なくとも１５ｍｇ／ＯＤ／時間である、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１１】
前記ＰＧＬポリペプチド、モリブデン取り込みポリペプチド、及び／又はガラクトース代謝ポリペプチドをコードしている核酸が、エシェリキア・コリ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５又はエシェリキア・コリ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５の誘導体である、請求項７に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１２】
前記細胞がエシェリキア・コリ株Ｂのものである、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１のものである、請求項１２に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のものである、請求項１２に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１５】
更に（ｃ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする非相同性の核酸を含む、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１６】
更に（ｄ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする非相同性の核酸を含む、請求項７に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１７】
前記ＭＶＡ経路上流のポリペプチドが：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１８】
前記ＭＶＡ経路下流のポリペプチドが：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）；からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１９】
（ａ）前記ＰＧＬポリペプチドがエシェリキア・コリＰＧＬポリペプチドであり；（ｂ）前記モリブデン取り込みポリペプチドがｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択され；並びに（ｃ）前記ガラクトース代謝ポリペプチドが、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される、請求項１６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項２０】
イソプレン合成酵素がウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来である、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項２１】
イソプレン生産法であって：
（ａ）イソプレンを生産させるために、請求項１又は７に記載の組み換え細胞を含む組成物を、好適な培養条件下で培養すること、並びに
（ｂ）イソプレンを生産させること、を含む、方法。
【請求項２２】
更に、前記イソプレンを回収することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組み換え細胞が、約１５ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
メバロン酸生産法であって、
（ａ）メバロン酸生産に好適な培養条件下で、請求項１５に記載の組み換え細胞を含む組成物を培養すること、並びに
（ｂ）メバロン酸を生産させること、を含む、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の組み換え細胞の製造方法であって：
（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸をエシェリキア・コリ細胞に形質導入すること（ここで、前記エシェリキア・コリ細胞は組み換え前にＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を含有しない）；
（ｂ）前記ＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸を、エシェリキア・コリ染色体に組み込むこと；及び
（ｃ）イソプレン合成酵素をコードしている非相同性の核酸（１つ以上）をエシェリキア・コリ細胞に１つ以上導入すること；を含む、製造方法。
【請求項２６】
請求項１又は７に記載の組み換え細胞を含む組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１４Ｄ】

【図１４Ｅ】

【図１４Ｆ】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図１９Ｄ】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４Ａ】

【図３４Ｂ】

【図３４Ｃ】

【図３４Ｄ】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０Ａ】

【図４０Ｂ】

【図４０Ｃ】

【図４０Ｄ】

【図４１Ａ】

【図４１Ｂ】

【図４２Ａ】

【図４２Ｂ】

【公表番号】特表２０１３−５１５４９１（Ｐ２０１３−５１５４９１Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６２４８（Ｐ２０１２−５４６２４８）
【出願日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６２０９９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７９３１４
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【出願人】（５９０００２９７６）ザ・グッドイヤー・タイヤ・アンド・ラバー・カンパニー (256)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ　ＧＯＯＤＹＥＡＲ　ＴＩＲＥ　＆　ＲＵＢＢＥＲ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１１４４　Ｅａｓｔ　Ｍａｒｋｅｔ　Ｓｔｒｅｅｔ，Ａｋｒｏｎ，Ｏｈｉｏ　４４３１６−０００１，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】