ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法
【課題】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法及びキット、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定を利用したウイルスタンパク質Ｖｉｆの測定方法及びキット、並びにＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性測定を利用した抗ウイルス薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】以下のステップを含む、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法；ａ）シトシンを含む基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップ、ｂ）ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ、ｃ）前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対するＧが標識物質で標識されており、該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ。
【解決手段】以下のステップを含む、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法；ａ）シトシンを含む基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップ、ｂ）ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ、ｃ）前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対するＧが標識物質で標識されており、該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス因子であるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法及び活性測定用キット、並びにＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定を利用したウイルスタンパク質Ｖｉｆの測定方法及び測定用キットに関する。本発明はまた、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性測定を利用した抗ウイルス薬のスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＰＯＢＥＣ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ）ファミリータンパク質は、シチジンデアミナーゼ活性を有し、一本鎖ＤＮＡのシトシンをウラシルに変換する酵素である。そのうちＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、ＨＩＶ−１の生活環において遺伝子の逆転写により生成されるマイナス鎖ＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換し、ＨＩＶ−１の正常な複製を阻害し得ることが知られており、ＨＩＶ−１ウイルスの増殖を抑制する内因性の抗ＨＩＶ−１因子であると考えられている。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、他のレトロウイルス及びレンチウイルスに対しても同様の作用を有することが報告されている。そのため、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは広範なウイルス種に対する潜在的な抗ウイルス因子であると考えられ、近年、抗ウイルス剤としての利用に期待が持たれている。
【０００３】
ヒトの体内で増殖し得るウイルスは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対する内因性の阻害物質が存在する細胞に増殖の場を限定されているか、又はＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対する何らかの阻害因子を有していると推測される。特に、ＨＩＶ−１ウイルスをはじめとするレンチウイルスが有するＶｉｆタンパク質によるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性阻害及び分解誘導がよく知られている。そのため、そのようなウイルス由来の因子による阻害からＡＰＯＢＥＣ３Ｇを解放する薬剤は、抗ウイルス剤の候補になると考えられる。
【０００４】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出又は測定する方法として、エンドポイントアッセイが知られている（非特許文献１）。このアッセイでは、放射性同位元素で標識した基質一本鎖ＤＮＡを被験試料と反応させ、有機溶媒で精製し、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで脱塩基処理し、さらにアルカリ処理を行う。これにより、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの作用により基質ＤＮＡ中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換された部分が切断される。続いて、得られた生成物をポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルによる電気泳動などにより分離して、基質ＤＮＡの鎖長を確認する。反応生成物中の基質ＤＮＡの切断の有無を検出することで、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性を検出することができる。また、切断された基質ＤＮＡからの放射線量を測定することにより、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を定量することができる。この方法では、放射線同位体を扱うことができる施設が必要とされるほか、有機溶媒での核酸の精製及び電気泳動などの手間と時間のかかる処理が含まれるため、大規模スクリーニングには不向きである。
【０００５】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性を検出する別の方法として、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する方法が提案されている（非特許文献２）。この方法では、５’末端及び３’末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識した一本鎖ＤＮＡを基質として被験試料と反応させ、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、さらにアルカリ処理を行う。これにより、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの作用により基質ＤＮＡ中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換された部分が切断される。この結果、基質ＤＮＡが切断されれば、基質ＤＮＡの末端を標識している蛍光色素によるＦＲＥＴが増強又は減弱され、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の有無を検出することができる。
【０００６】
しかし、上記のような既存の測定方法は煩雑な手順を必要とするため、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの簡便な測定方法は実現されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈｅｌｉｃｏ Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）１３，３９２−３９９
【非特許文献２】Ｔｈｉｅｌｅ ＢＫ．ら，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，（２００７），３，１３２０−１３３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは上記のとおり抗ウイルス活性を有しており、その内因性または外因性の阻害物質の結合を阻止する薬剤は、ウイルスの増殖抑制及びそれに起因する感染症の発症を阻止する抗ウイルス剤の候補となる。そこで、ウイルス感染の予防及び治療並びに抗ウイルス剤の開発に利用可能な、簡便かつ安価なＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定方法が求められている。特に、試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の検出・定量を、放射線同位体などを利用する煩雑な手順を経ずに行う、大量スクリーニングに利用可能な方法が所望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの基質となるオリゴヌクレオチドと、それに対して相補的な配列を有する相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出することによりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔２〕被験試料中のＶｉｆの測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔３〕ＰＫＡ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔４〕抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔５〕抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔６〕前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔７〕前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔８〕前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔９〕以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定するためのキット。
〔１０〕以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド；及び
（ｃ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、Ｖｉｆを測定するためのキット。
〔１１〕前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、上記〔９〕又は〔１０〕に記載のキット。
〔１２〕前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、上記〔９〕〜〔１１〕のいずれか１つに記載のキット。
〔１３〕前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、上記〔９〕〜〔１２〕のいずれか１つに記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、抗ウイルス因子であるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性を、少ないステップ数且つ短時間で簡便に測定することが可能になる。これにより、被験体細胞中の抗ウイルス活性（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性）の測定による被験体の易感染性の判定、試料中のウイルスタンパク質Ｖｉｆの測定、ウイルス由来の未知のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ阻害因子の探索、及び抗ウイルス剤の開発を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法の測定原理を表す模式図である。
【図２】ハイブリダイゼーションの測定を表すグラフである。エラーバー：±ＳＤ。
【図３Ａ】連続的な温度上昇による解離曲線解析を表す図である。
【図３Ｂ】連続的な温度上昇による解離曲線解析を表す図である。
【図４】経時的なハイブリダイゼーション測定を表す図である。
【図５】本発明の測定系の濃度依存性を表す図である。
【図６】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対するＶｉｆの阻害効果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法に関する。
【００１４】
本発明において、「測定」とは、所定の活性又はタンパク質の検出及び定量的な測定の両者を包含する。
【００１５】
本発明において、「被験試料」は、所定のタンパク質の存在が疑われる試料であれば特に限定されないが、例えば、ヒトを含む動物由来の体液、組織若しくは器官由来試料、又は分離細胞である。体液試料は周知の技術によって取得でき、それには、好ましくは血液、血漿、血清、または尿試料が含まれる。組織又は器官由来試料は例えば生検によって任意の組織又は器官から取得することができる。分離細胞は、分離技術、例えば遠心分離又は細胞選別によって、体液又は組織若しくは器官から取得することができる。
【００１６】
本発明において、「基質オリゴヌクレオチド」とは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性の基質となるオリゴヌクレオチドであり、その配列中にシトシン（Ｃ）を含む。このシトシンがＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性によりウラシル（Ｕ）に変換される。好ましくは、基質オリゴヌクレオチドは部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む。この部分配列中、３番目の塩基であるＣが最も効率よくＡＰＯＢＥＣ３Ｇの標的となり、該酵素タンパク質に触媒されて最初にＵ（ウラシル）に変換される（Ｉｗａｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｒｏｌｏｇｙ，２００６，８０，５９９２−６００２）。反応時間が進行するにつれ、その他のＣもＵに変換される。
【００１７】
本発明における基質オリゴヌクレオチドはＤＮＡである。その長さは特に制限されないが、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２０〜１５０塩基、さらに好ましくは４０〜１２０塩基、最も好ましくは６０〜１００塩基である。基質オリゴヌクレオチドは、上記部分配列よりも３’側に、少なくとも１０塩基の配列を含む。典型的には、基質オリゴヌクレオチドは以下の配列：
ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴ（配列番号１）
を含む。最も典型的には、基質オリゴヌクレオチドは配列番号１により示される配列を有する。
【００１８】
本発明の方法では、まず、基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させ、インキュベートする。インキュベートは、酵素反応が可能な温度及び時間の条件下で行なえばよく、例えば、１５〜４５℃、好ましくは２２〜３７℃にて、１〜７２時間、好ましくは３〜１５時間、行なう。検出可能な量の基質オリゴヌクレオチド中のシトシンをウラシルに変換するまでの時間を測定することにより、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を定量することができる。
【００１９】
本発明において、「相補オリゴヌクレオチド」とは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドである。本発明において、相補オリゴヌクレオチド中の、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である配列は、単に「相補配列」とも称される。相補オリゴヌクレオチドは、所望のヌクレオチドにより構成することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、核酸ミメティクスなどであり得る。典型的には、相補オリゴヌクレオチドは、基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃから３’側の配列と完全に相補的である。例えば、基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を有する場合、相補オリゴヌクレオチドはＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧ（配列番号３）という配列を有するＤＮＡである。しかし、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズ可能である限り、相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの配列に相補的でない塩基（例えば、完全に相補的な配列からの置換）を含むことができ、あるいは、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧより３’側及び／又は相補配列の５’側に、基質オリゴヌクレオチドと相補的か又は相補的でない追加の配列をさらに含むことができる。
【００２０】
相補オリゴヌクレオチドの配列のうち、基質オリゴヌクレオチドの配列と相補的な部分は、好ましくは連続的である。すなわち、相補配列中にミスマッチを含まないことが好ましい。上記の通り、相補オリゴヌクレオチドは、その５’末端側及び／又は３’末端側に、基質オリゴヌクレオチドと相補的でない（基質オリゴヌクレオチドに対応しない）配列を含むことができる。相補オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１５〜１５０塩基、さらに好ましくは２０〜１００塩基、最も好ましくは２５〜８０塩基である。相補配列の長さは、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１０〜１２０塩基、さらに好ましくは１５〜８０塩基、最も好ましくは２０〜７５塩基である。相補オリゴヌクレオチド中の相補配列の長さ（基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとの間で対応する部分の長さ）は、ハイブリダイゼーションのステップでの反応条件に影響を与える。ハイブリダイゼーションの測定を一定温度で行う場合のその温度、及び反応溶液中の塩濃度など、ハイブリダイゼーションに影響するパラメータを、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な値に設定する必要があるためである。
【００２１】
基質オリゴヌクレオチド中のＣ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧは、標識物質で標識されている。好ましくは、相補オリゴヌクレオチドが標識されている。標識物質は、検出可能なシグナルを発するものであれば特に制限されないが、好ましくは蛍光物質又は発光物質である。具体的な標識物質としては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、パシフィック・ブルーなどが挙げられる。これらの蛍光物質でも本発明の測定原理を用いることが可能であることが報告されている（Ｔｏｒｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，１７，１５５−１６０）。基質オリゴヌクレオチドのＣを標識する場合、標識は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる脱アミノ化反応を阻害しないために、シトシン塩基の４位のアミノ基以外の部分に結合させる。
【００２２】
基質オリゴヌクレオチド及び相補オリゴヌクレオチドの調製は、公知のオリゴヌクレオチド合成法により行うことができる。オリゴヌクレオチドの合成は、受託することもでき、例えばアプライドバイオシステムズ、つくばオリゴサービス、北海道システムサイエンス、エスペックなどに受託することができる。標識されたオリゴヌクレオチドも、受託合成することができる。
【００２３】
本発明において「ハイブリダイゼーション」とは、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとの間の、相補的な配列での結合を意味する。ハイブリダイゼーションは、例えば相補配列が約３０塩基である場合、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む溶液中で行うことができる。ハイブリダイゼーションの温度は、ハイブリダーゼーションの測定を一定温度で行なう場合には、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとの間で相補的な配列の構成に依存して決定できる融解温度よりも十分に低く設定するのが望ましい。例えば、温度を、融解温度よりも好ましくは１０℃、より好ましくは１５℃、さらに好ましくは２０℃以上低く設定する。相補的部分の融解温度は、公知の計算式又はソフトウェアを用いて算出することができる。
【００２４】
ハイブリダイゼーションに続いて、又は同時に、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの程度を測定する。この測定は、基質オリゴヌクレオチド又は相補オリゴヌクレオチドの標識からのシグナルを検出することにより行なう。例えば、標識物質として蛍光物質を用いた場合、蛍光強度を測定することによりハイブリダイゼーションを測定する。被験試料中にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が存在する場合には、上記基質オリゴヌクレオチド中のＣ（シトシン）がＵ（ウラシル）に変換されるため、このＣに対応する相補オリゴヌクレオチド中のＧとの間で相補鎖が形成されず、この部分で基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとが相互作用していない。この場合、標識物質は塩基から十分に離れた状態となり、蛍光が発生する。一方、被験試料中にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が存在しない場合には、基質オリゴヌクレオチド中のＣはＵに変換されず、相補オリゴヌクレオチド中のＧとの間で相補鎖を形成する。これにより、蛍光物質は塩基の近傍に存在するようになり、蛍光強度が減弱する。本発明の実施は特定の理論に拘束されないが、このことを利用して、蛍光強度からハイブリダイゼーションの程度、すなわち標的部位のＣ及びＵの割合を測定することができる。また、ハイブリダイゼーションの程度から被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を検出又は測定することができる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションの測定は、典型的には、十分低い温度（オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが起こる温度）でのシグナルを、十分高い温度（オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが起こらない温度）でのシグナルで除算して求めた値に基づき行なう。
【００２６】
あるいは、ハイブリダイゼーションの測定を、漸次的に上昇又は低下する温度で行なってもよい。漸次的に上昇する温度下で標識物質からの測定を行なうことで、解離曲線を得ることができる。解離曲線の形状を比較することで、ハイブリダイゼーションの程度を測定することができる。
【００２７】
本明細書中で具体的に示しているＡＰＯＢＥＣ３Ｇ以外のＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質のうちにも、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと同様のシチジンデアミナーゼ活性を有するものが存在することが知られている（Ｎａｖａｒａｔｎａｍ Ｎ，Ｓａｒｗａｒ Ｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００６，８３，１９５−２００；Ｓｏｕｓａ Ｍ．Ｍ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，２８，２７６−３０６；“ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈａｒｏｌｄ Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，２００８，ＷＩＬＥＹ−ＩＮＴＥＲＳＣＩＥＮＣＥ；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｍａｌｉｍ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄＢｉｓｈｏｐ，Ｋ．Ｎ．,２００７,Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ,３２（３），１１８−１２８；高折晃史，２００５，ウイルス，５５巻，第２号，ｐｐ１６７−２７２；Ａｎａｎｔ，Ｓ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｎ．Ｏ．，２０００，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０（６），１９８２−１９９２；Ｃｈｅｌｉｃｏ，Ｌ．，Ｐｈａｍ， Ｐ．，Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．，２００６，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１３（５），３９２−３９９；Ｖａｒｔａｎｉａｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｇｕｅｔａｒｄ，Ｄ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０（５８７３），２３０−２３３、等）。したがって、本発明の方法は、それらの他のＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質の酵素活性を測定するためにも用いることができる。
【００２８】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、被験試料中のＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質の活性測定方法にも関する。
【００２９】
以下の実施例にも示すように、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性はＨＩＶのＶｉｆタンパク質により阻害される。したがって、被験試料の存在下で本発明の方法によりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定することにより、被験試料中のＶｉｆタンパク質の検出又は測定を行うことができる。
【００３０】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験試料の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチドの前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、Ｖｉｆの測定方法にも関する。この場合、測定されたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が、被験試料を含まない（すなわち、Ｖｉｆを含まない）対照系よりも低下していれば、被験試料中のＶｉｆタンパク質の存在が示される。
【００３１】
上記Ｖｉｆ測定方法において、対照として、被験試料の非存在下でのＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定を同時に行なうことが好ましい。しかしながら、被験試料の非存在下での標識物質からのシグナルを予め測定し、それを参照値として用いることもできる。
【００３２】
Ｖｉｆタンパク質の存在はＨＩＶなどのウイルスの存在を示唆するものであるため、上記Ｖｉｆ測定方法は、ＨＩＶなどのウイルスの検出にも用いることができる。したがって、本発明は、上記のステップを有する、ウイルスの検出方法にも関する。本発明におけるウイルスとしては、ＨＩＶ等のレトロウイルス、レンチウイルスなどが挙げられる。
【００３３】
また、上記のとおりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性はＨＩＶのＶｉｆタンパク質の存在により阻害されるが、ＡＰＯＢＥＣ３ＧがＰＫＡ（Ａキナーゼ）によりリン酸化されると、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＶｉｆに対する耐性が高まることが報告されている。したがって、被験試料及びＶｉｆタンパク質の存在下で、本発明の方法によりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定することにより、被験試料中のＰＫＡ活性の検出又は測定を行うことができる。
【００３４】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験試料及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、ＰＫＡ活性の測定方法にも関する。この場合、測定されたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が、被験試料を含まない（すなわち、ＰＫＡを含まない）対照系よりも増大していれば、被験試料中のＰＫＡ活性の存在が示される。
【００３５】
さらに、上記のとおりＡＰＯＢＥＣ３Ｇは抗ウイルス因子として作用するため、その活性を増強することができる化合物は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる内因性の抗ウイルス作用を増強する抗ウイルス剤として用いることができる。
【００３６】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験化合物の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、抗ウイルス薬のスクリーニング方法に関する。
【００３７】
本発明において、「被験化合物」は、特に限定されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を用いることができる。
【００３８】
ウイルスタンパク質ＶｉｆによるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの阻害を低減させることができる化合物は、ウイルスタンパク質による細胞の内因性抗ウイルス作用の阻害を低減させる、したがって内因性抗ウイルス作用を増強させる抗ウイルス剤として用いることができる。
【００３９】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験化合物及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、抗ウイルス薬のスクリーニング方法にも関する。
【００４０】
本発明で用いるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆ等の精製タンパク質は、適切な宿主細胞で組み換え的に発現させた後に精製したものでもよいし、動物組織等の天然供給源から単離したものでもよい。好ましくは、精製タンパク質は組み換え的に発現させたものである。精製タンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の、対象となるタンパク質の発現及び精製を促進する融合ペアとの融合タンパク質として発現させ、適切なアフィニティークロマトグラフィー法を用いて精製するのがより好ましい。融合ペアとしてＭＢＰを用いる場合、組み換え発現のためのベクター・宿主系としては、ｐＭＡＬベクター（ＮＥＢ社製）と、大腸菌ＪＭ１０９又はＢＬ２１株との組み合わせが好適に用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明はさらに、上記の方法を実施するためのキットにも関する。そのようなキットのうち、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定するためのキットには、少なくとも、
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド
が含まれ、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている。好ましくは、基質オリゴヌクレオチドは部分配列ＣＣＣ若しくはＴＣＣを含むか、又は配列番号１により示される配列を含み、より好ましくは、基質オリゴヌクレオチドは配列番号１により示される配列を有する。さらに好ましくは、相補オリゴヌクレオチドは配列番号３により示される配列を含む。標識物質は、好ましくは蛍光物質又は発光物質である。
【００４２】
Ｖｉｆを測定するためのキット、及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の増強を指標として抗ウイルス剤をスクリーニングするためのキットにはさらに、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質が構成要素として含まれる。ＰＫＡ活性を測定するためのキット、及びＶｉｆによるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性阻害の低減を指標として抗ウイルス剤を測定するためのキットにはさらに、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質及びウイルス由来Ｖｉｆタンパク質が構成要素として含まれる。そのような追加構成要素としてのタンパク質は、天然に由来するものでもよいし、組換え的に製造したものでもよい。
【００４３】
これらのキットには、本発明の方法を実施するための使用説明書、及び本発明の方法を実施するためのバッファー等の追加の試薬をさらに含ませることができる。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］
相対的ハイブリダイゼーション強度によるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定
蛍光測定を利用したハイブリダイゼーション強度の測定により、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を検出した。
【００４６】
実験方法
基質オリゴヌクレオチドとして配列番号１により示される配列を有するＤＮＡ（ＡＰＯ−Ｃ）、対照基質オリゴヌクレオチドとして配列番号２により示される配列を有するＤＮＡ（ＡＰＯ−Ｕ）、及び相補オリゴヌクレオチドとして配列番号３により示される配列を有するＤＮＡ（ＡＰＯ−３−１）を使用した。各オリゴヌクレオチドはつくばオリゴサービス（株）に受託して合成した。相補オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−３−１）は、Ｊ−Ｂｉｏ２１（株）に受託して合成した。相補オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−３−１）は＊の位置でＢＯＤＩＰＹ ＦＬにより標識されている。
ＡＰＯ−Ｃ：
５’−ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴ−３’（配列番号１）
ＡＰＯ−Ｕ：
５’−ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＵＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴ−３’（配列番号２）
ＡＰＯ−３−１：
５’−ＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧ＊−３’（配列番号３）
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇは以下のようにして調製した。
【００４７】
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ遺伝子（ＯＰＥＮ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社のｃｌｏｎｅ ＩＤ ７２６２５５５、ＢＣ０６９６８８）を、ＰＣＲ法によりプラスミドベクターｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（ＮＥＢ社）のマルチクローニングサイトにサブクローニングすることで、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇの融合タンパク質を作製した。発現には大腸菌（ＪＭ１０９株）を使用した。大腸菌破砕液から、アミロースをリガンドとするアフィニティカラムに結合させて分離し、マルトースを含んだ緩衝液で溶出させた。溶出した融合タンパク質のシチジンデアミナーゼ活性は、空のｐＭＡＬ−ｃ２ｘから取得されるＭＢＰや、当該酵素活性を有しないＢＳＡを陰性対照とし、有意にシチジンデアミナーゼ活性があることを確認することにより検出した。この場合の確認には、文献でも用いられている、ＲＩを使用した切断法を使用した（Ｃｈｅｌｉｃｏ Ｌ．ら，上掲を参照のこと）。
【００４８】
使用したヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列は、登録番号ＡＡＨ６１９１４としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
【００４９】
以下の組成を有する２０μＬの反応溶液をマイクロチューブに入れた：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、２４０ｎＭ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。反応溶液を３７℃で１５時間インキュベートした。
【００５０】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００５１】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００５２】
結果
結果を図２に示す。
標的配列ＣＣＣを含む基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）を含む２種の反応系を比較すると、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加していない場合（ＣΔＡ３Ｇ）と比較して相対的蛍光強度が強く、その差は明らかであった。このことから、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ不添加の場合（ＣΔＡ３Ｇ）では、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、蛍光の低下が生じていること、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇにより触媒されるＣ→Ｕの変換によって、そのような低下が弱まることが示唆される。これにより、本発明の方法は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性の検出を可能にすることが示された。
【００５３】
結果から予測される本発明の測定原理を、図１に示す。
標的配列ＣＣＵを含む対照基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｕ）を含む２種の反応系では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの添加（Ｕ＋Ａ３Ｇ）、不添加（ＵΔＡ３Ｇ）に関わらず、蛍光の低下が生じていないことが見て取れる。このことは、ＡＰＯ−Ｃを用いた反応系での蛍光の低下がＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性以外の原因によるアーチファクトではないことを示している。また、ＡＰＯ−ＣにＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）とＡＰＯ−Ｕを使用した場合（Ｕ＋Ａ３Ｇ、ＵΔＡ３Ｇ）とを比較すると、相対的蛍光強度の差異は小さく、ＡＰＯ−ＣにＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）、標的配列がＡＰＯ−Ｕと同じくＣＣＵに変換されていることが示唆された。
【００５４】
［実施例２］
解離曲線解析
実施例１と同様にして反応溶液を調製し、３７℃で１５時間インキュベートした。４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、３７℃から７０℃まで漸次的に温度を上昇させ、その間の蛍光強度をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）により測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。
【００５５】
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａでは縦軸の値は蛍光値（Ｆ）を表し、図３Ｂでは縦軸の値は蛍光値の微分値（Ｆ／ｄＦ）を表している。
【００５６】
ＡＰＯ−ＣにＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）の解離曲線は、ＡＰＯ−Ｕを使用した場合（Ｕ＋Ａ３Ｇ、ＵΔＡ３Ｇ）に近く、ＡＰＯ−Ｃ中の標的配列ＣＣＣはＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性によりＣＣＵに変換されたことが示唆された。
【００５７】
［実施例３］
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる酵素反応の反応時間依存性
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる酵素反応の時間に依存した進行をモニターした。
実験方法
以下の組成を有する２０μＬの反応溶液をマイクロチューブに入れた：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、２４０ｎＭ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。
【００５８】
反応溶液を３７℃で１、３、６、２４、３２、４８、又は７２時間インキュベートした。
【００５９】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００６０】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００６１】
結果
結果を図４に示す。図中、Ｃ、Ｕ、ΔＡ、及びＮはそれぞれ、Ｃ：ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合、Ｕ：ＡＰＯ−Ｕを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合、ΔＡ：ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加しなかった場合、及びＮ：基質オリゴヌクレオチド、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのいずれも添加しなかった場合を表す。
【００６２】
ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合の結果（Ｃ０〜４８）では、Ｃ３において蛍光強度の増加が見られ、上記の反応条件では、反応時間１〜３時間で、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換が起こっていることが示された。
【００６３】
［実施例４］
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの濃度依存性
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの添加量に依存した酵素反応活性をモニターした。
実験方法
以下の組成を有する２０μＬの反応溶液をマイクロチューブに入れた：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを、０．１４、０．２８、０．７又は１．４μＭとなるように添加した。反応溶液を３７℃で３．５時間インキュベートした。
【００６４】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００６５】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００６６】
結果
結果を図５に示す。図中、ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）では、すべてのサンプルにおいて蛍光強度の増加が見られた。ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加しなかった場合（ＣΔＡ３Ｇ）では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加したいずれのサンプル（Ｃ＋Ａ３Ｇ、Ｃ＋０．５×Ａ３Ｇ、Ｃ＋０．２×Ａ３Ｇ、及びＡ＋０．１×Ａ３Ｇ）よりも相対蛍光強度が低く、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ濃度が高くなるにつれ、蛍光強度が強くなっていることが見て取れる。このことから、上記の反応条件では、添加したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの添加量に依存して、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換が起こっていることが示された。ＡＰＯ−Ｕを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｕ＋Ａ３Ｇ）、ＡＰＯ−Ｕを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加しなかった場合（ＵΔＡ３Ｇ）、及び基質オリゴヌクレオチド、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのいずれも添加しなかった場合（Ｎ）では、Ｃ＋Ａ３Ｇのいずれのサンプルよりも相対蛍光強度が大きかった。
【００６７】
以上の結果は、本発明の方法により、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を定量的に測定することが可能であることを示している。
【００６８】
［実施例５］
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対するＶｉｆの阻害効果
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性に対するＶｉｆの阻害効果について検討した。
実験方法
ＨＩＶ Ｖｉｆを、以下のように調製した：大腸菌を宿主として発現させるために、プラスミドベクターｐＥＴ−２２ｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に、ＰＣＲで増幅したＭＢＰ遺伝子、適切なリンカー、ＨＩＶ−１由来Ｖｉｆ遺伝子、停止コドンをこの順で挿入した。ＭＢＰは、発現の向上、アフィニティカラムを使用した精製、溶解度の向上のために使用した。本実施例では、ベクター由来の配列：ＥＡＬＫＤＡＱＴＮＡＡＡ（配列番号４）をリンカーとして使用した。Ｖｉｆ遺伝子は、Ｄｒ． Ｓｔｅｐｈａｎ ＢｏｕｒとＤｒ. Ｋｌａｕｓ ＳｔｒｅｂｅｌによってＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍに寄託されているｐｃＤＮＡ−ＨＶｉｆから、Ｖｉｆに相当する部分を使用した。この例で発現させた融合タンパク質（以下ＭＢＰ−Ｖｉｆと称する）のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００６９】
宿主として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｒｏｓｅｔｔａコンピテントセル；Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用した。コンピテントセルの一般的な使用方法に従い、宿主大腸菌を形質転換し、１０ｍＬの滅菌ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌアンピシリンナトリウム、２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。これを２Ｌの同様の滅菌培地に植え次ぎ、３７℃で振とう培養した。１〜２時間後、ＯＤ６００ｎｍが０．５増加した時点で２０℃に温度を下げ、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるよう添加して、さらに一晩培養した。遠心分離により大腸菌を回収した。
【００７０】
２Ｌの培養から得られた大腸菌に、溶液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、６ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム）及び１ｍＭ ＰＭＳＦ（最終濃度）を加え、超音波で細胞を破砕した。９０００×ｇで遠心分離し、上清を粗抽出液として回収した。
【００７１】
アフィニティーカラムを用いて精製を行なった。２０ｍＬ容のＮＥＢ社製アミロースカラムに上述の粗抽出液をアプライし、ＭＢＰ−Ｖｉｆを吸着させた。溶液Ａを用いてカラムを洗浄し、余分な細胞成分を洗い流した後、２０ｍＭマルトースを添加した溶液ＡでＭＢＰ−Ｖｉｆを溶出した。
【００７２】
続いて、陰イオン交換カラムを用いて、主として核酸などの不純物を除去した。そのために、アミロースカラムからの溶出液を、以下の組成を有する溶液に対して透析し、イオン強度を下げた：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ ＫＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール。透析後の溶出液を、同じ組成の溶液で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ ＨＰ（ＧＥ社製）にアプライし、フロースルーを回収した。この処理では、核酸はカラムに強く吸着するので、核酸を除去することができる。溶出液中の核酸含量を、吸光度２６０ｎｍと２８０ｎｍとの比で確認した。
【００７３】
次に、得られたフロースルーをヘパリンカラム（ＧＥ社製）にアプライし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールの存在下で、０．１５〜１Ｍ ＫＣｌ濃度勾配により、ＭＢＰ−Ｖｉｆを溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたアッセイにより、純度が９５％以上であることを確認した。
【００７４】
得られたタンパク質溶液を、１０ｍＭ ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．５）、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールに対して透析して緩衝液を置換し、限外濾過膜を使用して濃縮した。濃縮後、ＢｉｏＲａｄ社から市販されているタンパク質定量用ＩｇＧを標準試料として、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法タンパク質定量試薬（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、タンパク質濃度を決定した。
【００７５】
得られた精製Ｖｉｆ溶液を、分注して液体窒素で急速冷凍し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７６】
２．８μＭのＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及び０．９４μＭのＶｉｆを含む溶液を調製した。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのみ、Ｖｉｆのみを含む対照、及びいずれも含まない対照も作製した。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ−Ｖｉｆ溶液を、３７℃で２０分間プレインキュベートした。プレインキュベートを行なわない対照も作製した。
【００７７】
プレインキュベート後、最終的に以下の組成となる反応溶液を、全量２０μＬとなるように調製した：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドとして、配列ＣＣＣを含むＡＰＯ−Ｃ（配列番号１）又は配列ＣＣＵを含む対照であるＡＰＯ−Ｕ（配列番号２）を用いた。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。反応溶液を３７℃で３．５時間インキュベートした後、８０℃、２０分間の熱変性処理を行なった。
【００７８】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−３−１；配列番号３）を１．０μＬ添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行なった。
【００７９】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００８０】
結果
結果を図６に示す。基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆを含み、プレインキュベートを行なっていない反応系（Ｃ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ）、並びに同様の組成でプレインキュベートを行なった場合（Ｃ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ−ｐ）ではともに、Ｖｉｆを添加しなかった場合（Ｃ／Ａ３Ｇ及びＣ／Ａ３Ｇ−ｐ）と比較して、相対蛍光強度の低下が見られた。このことは、添加したＨＩＶ Ｖｉｆによって、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換が阻害されたことを示す。同じ反応液組成でプレインキュベートを行なった場合と行なわなかった場合とを比較すると（Ｃ／Ａ３Ｇ／ＶｉｆとＣ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ−ｐ）プレインキュベートを行なった場合の方が相対蛍光強度の低下が大きく、プレインキュベートによってＶｉｆの阻害効果が増大することが示された。
【００８１】
対照基質オリゴヌクレオチドＡＰＯ−Ｕを用いたサンプルでは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｕ／Ａ３Ｇ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆを添加した場合（Ｕ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加せずにＶｉｆのみを添加した場合（Ｕ／ΔＡ３Ｇ／Ｖｉｆ）、並びにＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆをいずれも添加しなかった場合（Ｕ）のいずれにおいても、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）を用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ／Ａ３Ｇ）と同等の相対蛍光強度が示された。また、基質オリゴヌクレオチドを添加せず、Ａ３Ｇのみを添加した場合（Ａ３Ｇ）、Ｖｉｆのみを添加した場合（Ｖｉｆ）、並びに基質オリゴヌクレオチド、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆのいずれも添加しなかった場合（Ｎ）においては、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）を用いたいずれのサンプルよりも、高い相対蛍光強度が示された。これらから、ＡＰＯ−Ｃを用いたサンプルでの蛍光強度の低下は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性以外によるアーチファクトではないことが示された。
【００８２】
以上より、ＨＩＶ Ｖｉｆは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換を阻害することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、抗ウイルス因子であるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの簡便で安価な測定方法を提供する。また、本発明は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性測定を利用した抗ウイルス薬のスクリーニング方法を提供する。よって、本発明は医療・製薬分野での利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの基質
配列番号２：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの対照基質
配列番号３：相補オリゴヌクレオチド
配列番号４：リンカー
配列番号５：融合タンパク質
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス因子であるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法及び活性測定用キット、並びにＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定を利用したウイルスタンパク質Ｖｉｆの測定方法及び測定用キットに関する。本発明はまた、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性測定を利用した抗ウイルス薬のスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＰＯＢＥＣ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ）ファミリータンパク質は、シチジンデアミナーゼ活性を有し、一本鎖ＤＮＡのシトシンをウラシルに変換する酵素である。そのうちＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、ＨＩＶ−１の生活環において遺伝子の逆転写により生成されるマイナス鎖ＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換し、ＨＩＶ−１の正常な複製を阻害し得ることが知られており、ＨＩＶ−１ウイルスの増殖を抑制する内因性の抗ＨＩＶ−１因子であると考えられている。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、他のレトロウイルス及びレンチウイルスに対しても同様の作用を有することが報告されている。そのため、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは広範なウイルス種に対する潜在的な抗ウイルス因子であると考えられ、近年、抗ウイルス剤としての利用に期待が持たれている。
【０００３】
ヒトの体内で増殖し得るウイルスは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対する内因性の阻害物質が存在する細胞に増殖の場を限定されているか、又はＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対する何らかの阻害因子を有していると推測される。特に、ＨＩＶ−１ウイルスをはじめとするレンチウイルスが有するＶｉｆタンパク質によるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性阻害及び分解誘導がよく知られている。そのため、そのようなウイルス由来の因子による阻害からＡＰＯＢＥＣ３Ｇを解放する薬剤は、抗ウイルス剤の候補になると考えられる。
【０００４】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出又は測定する方法として、エンドポイントアッセイが知られている（非特許文献１）。このアッセイでは、放射性同位元素で標識した基質一本鎖ＤＮＡを被験試料と反応させ、有機溶媒で精製し、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで脱塩基処理し、さらにアルカリ処理を行う。これにより、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの作用により基質ＤＮＡ中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換された部分が切断される。続いて、得られた生成物をポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルによる電気泳動などにより分離して、基質ＤＮＡの鎖長を確認する。反応生成物中の基質ＤＮＡの切断の有無を検出することで、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性を検出することができる。また、切断された基質ＤＮＡからの放射線量を測定することにより、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を定量することができる。この方法では、放射線同位体を扱うことができる施設が必要とされるほか、有機溶媒での核酸の精製及び電気泳動などの手間と時間のかかる処理が含まれるため、大規模スクリーニングには不向きである。
【０００５】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性を検出する別の方法として、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する方法が提案されている（非特許文献２）。この方法では、５’末端及び３’末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識した一本鎖ＤＮＡを基質として被験試料と反応させ、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、さらにアルカリ処理を行う。これにより、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの作用により基質ＤＮＡ中のシトシン塩基がウラシル塩基に変換された部分が切断される。この結果、基質ＤＮＡが切断されれば、基質ＤＮＡの末端を標識している蛍光色素によるＦＲＥＴが増強又は減弱され、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の有無を検出することができる。
【０００６】
しかし、上記のような既存の測定方法は煩雑な手順を必要とするため、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの簡便な測定方法は実現されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈｅｌｉｃｏ Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）１３，３９２−３９９
【非特許文献２】Ｔｈｉｅｌｅ ＢＫ．ら，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，（２００７），３，１３２０−１３３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは上記のとおり抗ウイルス活性を有しており、その内因性または外因性の阻害物質の結合を阻止する薬剤は、ウイルスの増殖抑制及びそれに起因する感染症の発症を阻止する抗ウイルス剤の候補となる。そこで、ウイルス感染の予防及び治療並びに抗ウイルス剤の開発に利用可能な、簡便かつ安価なＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定方法が求められている。特に、試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の検出・定量を、放射線同位体などを利用する煩雑な手順を経ずに行う、大量スクリーニングに利用可能な方法が所望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの基質となるオリゴヌクレオチドと、それに対して相補的な配列を有する相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出することによりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔２〕被験試料中のＶｉｆの測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔３〕ＰＫＡ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔４〕抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔５〕抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
〔６〕前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔７〕前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔８〕前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔９〕以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定するためのキット。
〔１０〕以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド；及び
（ｃ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、Ｖｉｆを測定するためのキット。
〔１１〕前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、上記〔９〕又は〔１０〕に記載のキット。
〔１２〕前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、上記〔９〕〜〔１１〕のいずれか１つに記載のキット。
〔１３〕前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、上記〔９〕〜〔１２〕のいずれか１つに記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、抗ウイルス因子であるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性を、少ないステップ数且つ短時間で簡便に測定することが可能になる。これにより、被験体細胞中の抗ウイルス活性（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性）の測定による被験体の易感染性の判定、試料中のウイルスタンパク質Ｖｉｆの測定、ウイルス由来の未知のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ阻害因子の探索、及び抗ウイルス剤の開発を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法の測定原理を表す模式図である。
【図２】ハイブリダイゼーションの測定を表すグラフである。エラーバー：±ＳＤ。
【図３Ａ】連続的な温度上昇による解離曲線解析を表す図である。
【図３Ｂ】連続的な温度上昇による解離曲線解析を表す図である。
【図４】経時的なハイブリダイゼーション測定を表す図である。
【図５】本発明の測定系の濃度依存性を表す図である。
【図６】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対するＶｉｆの阻害効果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性測定方法に関する。
【００１４】
本発明において、「測定」とは、所定の活性又はタンパク質の検出及び定量的な測定の両者を包含する。
【００１５】
本発明において、「被験試料」は、所定のタンパク質の存在が疑われる試料であれば特に限定されないが、例えば、ヒトを含む動物由来の体液、組織若しくは器官由来試料、又は分離細胞である。体液試料は周知の技術によって取得でき、それには、好ましくは血液、血漿、血清、または尿試料が含まれる。組織又は器官由来試料は例えば生検によって任意の組織又は器官から取得することができる。分離細胞は、分離技術、例えば遠心分離又は細胞選別によって、体液又は組織若しくは器官から取得することができる。
【００１６】
本発明において、「基質オリゴヌクレオチド」とは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性の基質となるオリゴヌクレオチドであり、その配列中にシトシン（Ｃ）を含む。このシトシンがＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性によりウラシル（Ｕ）に変換される。好ましくは、基質オリゴヌクレオチドは部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む。この部分配列中、３番目の塩基であるＣが最も効率よくＡＰＯＢＥＣ３Ｇの標的となり、該酵素タンパク質に触媒されて最初にＵ（ウラシル）に変換される（Ｉｗａｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｒｏｌｏｇｙ，２００６，８０，５９９２−６００２）。反応時間が進行するにつれ、その他のＣもＵに変換される。
【００１７】
本発明における基質オリゴヌクレオチドはＤＮＡである。その長さは特に制限されないが、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２０〜１５０塩基、さらに好ましくは４０〜１２０塩基、最も好ましくは６０〜１００塩基である。基質オリゴヌクレオチドは、上記部分配列よりも３’側に、少なくとも１０塩基の配列を含む。典型的には、基質オリゴヌクレオチドは以下の配列：
ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴ（配列番号１）
を含む。最も典型的には、基質オリゴヌクレオチドは配列番号１により示される配列を有する。
【００１８】
本発明の方法では、まず、基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させ、インキュベートする。インキュベートは、酵素反応が可能な温度及び時間の条件下で行なえばよく、例えば、１５〜４５℃、好ましくは２２〜３７℃にて、１〜７２時間、好ましくは３〜１５時間、行なう。検出可能な量の基質オリゴヌクレオチド中のシトシンをウラシルに変換するまでの時間を測定することにより、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を定量することができる。
【００１９】
本発明において、「相補オリゴヌクレオチド」とは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドである。本発明において、相補オリゴヌクレオチド中の、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である配列は、単に「相補配列」とも称される。相補オリゴヌクレオチドは、所望のヌクレオチドにより構成することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、核酸ミメティクスなどであり得る。典型的には、相補オリゴヌクレオチドは、基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃから３’側の配列と完全に相補的である。例えば、基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を有する場合、相補オリゴヌクレオチドはＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧ（配列番号３）という配列を有するＤＮＡである。しかし、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズ可能である限り、相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの配列に相補的でない塩基（例えば、完全に相補的な配列からの置換）を含むことができ、あるいは、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧより３’側及び／又は相補配列の５’側に、基質オリゴヌクレオチドと相補的か又は相補的でない追加の配列をさらに含むことができる。
【００２０】
相補オリゴヌクレオチドの配列のうち、基質オリゴヌクレオチドの配列と相補的な部分は、好ましくは連続的である。すなわち、相補配列中にミスマッチを含まないことが好ましい。上記の通り、相補オリゴヌクレオチドは、その５’末端側及び／又は３’末端側に、基質オリゴヌクレオチドと相補的でない（基質オリゴヌクレオチドに対応しない）配列を含むことができる。相補オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１５〜１５０塩基、さらに好ましくは２０〜１００塩基、最も好ましくは２５〜８０塩基である。相補配列の長さは、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１０〜１２０塩基、さらに好ましくは１５〜８０塩基、最も好ましくは２０〜７５塩基である。相補オリゴヌクレオチド中の相補配列の長さ（基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとの間で対応する部分の長さ）は、ハイブリダイゼーションのステップでの反応条件に影響を与える。ハイブリダイゼーションの測定を一定温度で行う場合のその温度、及び反応溶液中の塩濃度など、ハイブリダイゼーションに影響するパラメータを、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な値に設定する必要があるためである。
【００２１】
基質オリゴヌクレオチド中のＣ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧは、標識物質で標識されている。好ましくは、相補オリゴヌクレオチドが標識されている。標識物質は、検出可能なシグナルを発するものであれば特に制限されないが、好ましくは蛍光物質又は発光物質である。具体的な標識物質としては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ローダミン６Ｇ、パシフィック・ブルーなどが挙げられる。これらの蛍光物質でも本発明の測定原理を用いることが可能であることが報告されている（Ｔｏｒｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，１７，１５５−１６０）。基質オリゴヌクレオチドのＣを標識する場合、標識は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる脱アミノ化反応を阻害しないために、シトシン塩基の４位のアミノ基以外の部分に結合させる。
【００２２】
基質オリゴヌクレオチド及び相補オリゴヌクレオチドの調製は、公知のオリゴヌクレオチド合成法により行うことができる。オリゴヌクレオチドの合成は、受託することもでき、例えばアプライドバイオシステムズ、つくばオリゴサービス、北海道システムサイエンス、エスペックなどに受託することができる。標識されたオリゴヌクレオチドも、受託合成することができる。
【００２３】
本発明において「ハイブリダイゼーション」とは、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとの間の、相補的な配列での結合を意味する。ハイブリダイゼーションは、例えば相補配列が約３０塩基である場合、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む溶液中で行うことができる。ハイブリダイゼーションの温度は、ハイブリダーゼーションの測定を一定温度で行なう場合には、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとの間で相補的な配列の構成に依存して決定できる融解温度よりも十分に低く設定するのが望ましい。例えば、温度を、融解温度よりも好ましくは１０℃、より好ましくは１５℃、さらに好ましくは２０℃以上低く設定する。相補的部分の融解温度は、公知の計算式又はソフトウェアを用いて算出することができる。
【００２４】
ハイブリダイゼーションに続いて、又は同時に、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの程度を測定する。この測定は、基質オリゴヌクレオチド又は相補オリゴヌクレオチドの標識からのシグナルを検出することにより行なう。例えば、標識物質として蛍光物質を用いた場合、蛍光強度を測定することによりハイブリダイゼーションを測定する。被験試料中にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が存在する場合には、上記基質オリゴヌクレオチド中のＣ（シトシン）がＵ（ウラシル）に変換されるため、このＣに対応する相補オリゴヌクレオチド中のＧとの間で相補鎖が形成されず、この部分で基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとが相互作用していない。この場合、標識物質は塩基から十分に離れた状態となり、蛍光が発生する。一方、被験試料中にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が存在しない場合には、基質オリゴヌクレオチド中のＣはＵに変換されず、相補オリゴヌクレオチド中のＧとの間で相補鎖を形成する。これにより、蛍光物質は塩基の近傍に存在するようになり、蛍光強度が減弱する。本発明の実施は特定の理論に拘束されないが、このことを利用して、蛍光強度からハイブリダイゼーションの程度、すなわち標的部位のＣ及びＵの割合を測定することができる。また、ハイブリダイゼーションの程度から被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を検出又は測定することができる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションの測定は、典型的には、十分低い温度（オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが起こる温度）でのシグナルを、十分高い温度（オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが起こらない温度）でのシグナルで除算して求めた値に基づき行なう。
【００２６】
あるいは、ハイブリダイゼーションの測定を、漸次的に上昇又は低下する温度で行なってもよい。漸次的に上昇する温度下で標識物質からの測定を行なうことで、解離曲線を得ることができる。解離曲線の形状を比較することで、ハイブリダイゼーションの程度を測定することができる。
【００２７】
本明細書中で具体的に示しているＡＰＯＢＥＣ３Ｇ以外のＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質のうちにも、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと同様のシチジンデアミナーゼ活性を有するものが存在することが知られている（Ｎａｖａｒａｔｎａｍ Ｎ，Ｓａｒｗａｒ Ｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００６，８３，１９５−２００；Ｓｏｕｓａ Ｍ．Ｍ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，２８，２７６−３０６；“ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈａｒｏｌｄ Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，２００８，ＷＩＬＥＹ−ＩＮＴＥＲＳＣＩＥＮＣＥ；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｍａｌｉｍ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄＢｉｓｈｏｐ，Ｋ．Ｎ．,２００７,Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ,３２（３），１１８−１２８；高折晃史，２００５，ウイルス，５５巻，第２号，ｐｐ１６７−２７２；Ａｎａｎｔ，Ｓ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｎ．Ｏ．，２０００，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０（６），１９８２−１９９２；Ｃｈｅｌｉｃｏ，Ｌ．，Ｐｈａｍ， Ｐ．，Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．，２００６，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１３（５），３９２−３９９；Ｖａｒｔａｎｉａｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｇｕｅｔａｒｄ，Ｄ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０（５８７３），２３０−２３３、等）。したがって、本発明の方法は、それらの他のＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質の酵素活性を測定するためにも用いることができる。
【００２８】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、被験試料中のＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質の活性測定方法にも関する。
【００２９】
以下の実施例にも示すように、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性はＨＩＶのＶｉｆタンパク質により阻害される。したがって、被験試料の存在下で本発明の方法によりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定することにより、被験試料中のＶｉｆタンパク質の検出又は測定を行うことができる。
【００３０】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験試料の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチドの前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、Ｖｉｆの測定方法にも関する。この場合、測定されたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が、被験試料を含まない（すなわち、Ｖｉｆを含まない）対照系よりも低下していれば、被験試料中のＶｉｆタンパク質の存在が示される。
【００３１】
上記Ｖｉｆ測定方法において、対照として、被験試料の非存在下でのＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定を同時に行なうことが好ましい。しかしながら、被験試料の非存在下での標識物質からのシグナルを予め測定し、それを参照値として用いることもできる。
【００３２】
Ｖｉｆタンパク質の存在はＨＩＶなどのウイルスの存在を示唆するものであるため、上記Ｖｉｆ測定方法は、ＨＩＶなどのウイルスの検出にも用いることができる。したがって、本発明は、上記のステップを有する、ウイルスの検出方法にも関する。本発明におけるウイルスとしては、ＨＩＶ等のレトロウイルス、レンチウイルスなどが挙げられる。
【００３３】
また、上記のとおりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性はＨＩＶのＶｉｆタンパク質の存在により阻害されるが、ＡＰＯＢＥＣ３ＧがＰＫＡ（Ａキナーゼ）によりリン酸化されると、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＶｉｆに対する耐性が高まることが報告されている。したがって、被験試料及びＶｉｆタンパク質の存在下で、本発明の方法によりＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定することにより、被験試料中のＰＫＡ活性の検出又は測定を行うことができる。
【００３４】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験試料及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、ＰＫＡ活性の測定方法にも関する。この場合、測定されたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性が、被験試料を含まない（すなわち、ＰＫＡを含まない）対照系よりも増大していれば、被験試料中のＰＫＡ活性の存在が示される。
【００３５】
さらに、上記のとおりＡＰＯＢＥＣ３Ｇは抗ウイルス因子として作用するため、その活性を増強することができる化合物は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる内因性の抗ウイルス作用を増強する抗ウイルス剤として用いることができる。
【００３６】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験化合物の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、抗ウイルス薬のスクリーニング方法に関する。
【００３７】
本発明において、「被験化合物」は、特に限定されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を用いることができる。
【００３８】
ウイルスタンパク質ＶｉｆによるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの阻害を低減させることができる化合物は、ウイルスタンパク質による細胞の内因性抗ウイルス作用の阻害を低減させる、したがって内因性抗ウイルス作用を増強させる抗ウイルス剤として用いることができる。
【００３９】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験化合物及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、抗ウイルス薬のスクリーニング方法にも関する。
【００４０】
本発明で用いるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆ等の精製タンパク質は、適切な宿主細胞で組み換え的に発現させた後に精製したものでもよいし、動物組織等の天然供給源から単離したものでもよい。好ましくは、精製タンパク質は組み換え的に発現させたものである。精製タンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の、対象となるタンパク質の発現及び精製を促進する融合ペアとの融合タンパク質として発現させ、適切なアフィニティークロマトグラフィー法を用いて精製するのがより好ましい。融合ペアとしてＭＢＰを用いる場合、組み換え発現のためのベクター・宿主系としては、ｐＭＡＬベクター（ＮＥＢ社製）と、大腸菌ＪＭ１０９又はＢＬ２１株との組み合わせが好適に用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明はさらに、上記の方法を実施するためのキットにも関する。そのようなキットのうち、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定するためのキットには、少なくとも、
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド
が含まれ、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている。好ましくは、基質オリゴヌクレオチドは部分配列ＣＣＣ若しくはＴＣＣを含むか、又は配列番号１により示される配列を含み、より好ましくは、基質オリゴヌクレオチドは配列番号１により示される配列を有する。さらに好ましくは、相補オリゴヌクレオチドは配列番号３により示される配列を含む。標識物質は、好ましくは蛍光物質又は発光物質である。
【００４２】
Ｖｉｆを測定するためのキット、及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の増強を指標として抗ウイルス剤をスクリーニングするためのキットにはさらに、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質が構成要素として含まれる。ＰＫＡ活性を測定するためのキット、及びＶｉｆによるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性阻害の低減を指標として抗ウイルス剤を測定するためのキットにはさらに、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質及びウイルス由来Ｖｉｆタンパク質が構成要素として含まれる。そのような追加構成要素としてのタンパク質は、天然に由来するものでもよいし、組換え的に製造したものでもよい。
【００４３】
これらのキットには、本発明の方法を実施するための使用説明書、及び本発明の方法を実施するためのバッファー等の追加の試薬をさらに含ませることができる。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］
相対的ハイブリダイゼーション強度によるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定
蛍光測定を利用したハイブリダイゼーション強度の測定により、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を検出した。
【００４６】
実験方法
基質オリゴヌクレオチドとして配列番号１により示される配列を有するＤＮＡ（ＡＰＯ−Ｃ）、対照基質オリゴヌクレオチドとして配列番号２により示される配列を有するＤＮＡ（ＡＰＯ−Ｕ）、及び相補オリゴヌクレオチドとして配列番号３により示される配列を有するＤＮＡ（ＡＰＯ−３−１）を使用した。各オリゴヌクレオチドはつくばオリゴサービス（株）に受託して合成した。相補オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−３−１）は、Ｊ−Ｂｉｏ２１（株）に受託して合成した。相補オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−３−１）は＊の位置でＢＯＤＩＰＹ ＦＬにより標識されている。
ＡＰＯ−Ｃ：
５’−ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴ−３’（配列番号１）
ＡＰＯ−Ｕ：
５’−ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＵＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴ−３’（配列番号２）
ＡＰＯ−３−１：
５’−ＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧ＊−３’（配列番号３）
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇは以下のようにして調製した。
【００４７】
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ遺伝子（ＯＰＥＮ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社のｃｌｏｎｅ ＩＤ ７２６２５５５、ＢＣ０６９６８８）を、ＰＣＲ法によりプラスミドベクターｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（ＮＥＢ社）のマルチクローニングサイトにサブクローニングすることで、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇの融合タンパク質を作製した。発現には大腸菌（ＪＭ１０９株）を使用した。大腸菌破砕液から、アミロースをリガンドとするアフィニティカラムに結合させて分離し、マルトースを含んだ緩衝液で溶出させた。溶出した融合タンパク質のシチジンデアミナーゼ活性は、空のｐＭＡＬ−ｃ２ｘから取得されるＭＢＰや、当該酵素活性を有しないＢＳＡを陰性対照とし、有意にシチジンデアミナーゼ活性があることを確認することにより検出した。この場合の確認には、文献でも用いられている、ＲＩを使用した切断法を使用した（Ｃｈｅｌｉｃｏ Ｌ．ら，上掲を参照のこと）。
【００４８】
使用したヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列は、登録番号ＡＡＨ６１９１４としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
【００４９】
以下の組成を有する２０μＬの反応溶液をマイクロチューブに入れた：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、２４０ｎＭ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。反応溶液を３７℃で１５時間インキュベートした。
【００５０】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００５１】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００５２】
結果
結果を図２に示す。
標的配列ＣＣＣを含む基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）を含む２種の反応系を比較すると、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加していない場合（ＣΔＡ３Ｇ）と比較して相対的蛍光強度が強く、その差は明らかであった。このことから、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ不添加の場合（ＣΔＡ３Ｇ）では、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、蛍光の低下が生じていること、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇにより触媒されるＣ→Ｕの変換によって、そのような低下が弱まることが示唆される。これにより、本発明の方法は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性の検出を可能にすることが示された。
【００５３】
結果から予測される本発明の測定原理を、図１に示す。
標的配列ＣＣＵを含む対照基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｕ）を含む２種の反応系では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの添加（Ｕ＋Ａ３Ｇ）、不添加（ＵΔＡ３Ｇ）に関わらず、蛍光の低下が生じていないことが見て取れる。このことは、ＡＰＯ−Ｃを用いた反応系での蛍光の低下がＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性以外の原因によるアーチファクトではないことを示している。また、ＡＰＯ−ＣにＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）とＡＰＯ−Ｕを使用した場合（Ｕ＋Ａ３Ｇ、ＵΔＡ３Ｇ）とを比較すると、相対的蛍光強度の差異は小さく、ＡＰＯ−ＣにＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）、標的配列がＡＰＯ−Ｕと同じくＣＣＵに変換されていることが示唆された。
【００５４】
［実施例２］
解離曲線解析
実施例１と同様にして反応溶液を調製し、３７℃で１５時間インキュベートした。４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、３７℃から７０℃まで漸次的に温度を上昇させ、その間の蛍光強度をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）により測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。
【００５５】
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａでは縦軸の値は蛍光値（Ｆ）を表し、図３Ｂでは縦軸の値は蛍光値の微分値（Ｆ／ｄＦ）を表している。
【００５６】
ＡＰＯ−ＣにＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）の解離曲線は、ＡＰＯ−Ｕを使用した場合（Ｕ＋Ａ３Ｇ、ＵΔＡ３Ｇ）に近く、ＡＰＯ−Ｃ中の標的配列ＣＣＣはＡＰＯＢＥＣ３Ｇのシチジンデアミナーゼ活性によりＣＣＵに変換されたことが示唆された。
【００５７】
［実施例３］
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる酵素反応の反応時間依存性
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる酵素反応の時間に依存した進行をモニターした。
実験方法
以下の組成を有する２０μＬの反応溶液をマイクロチューブに入れた：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、２４０ｎＭ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。
【００５８】
反応溶液を３７℃で１、３、６、２４、３２、４８、又は７２時間インキュベートした。
【００５９】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００６０】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００６１】
結果
結果を図４に示す。図中、Ｃ、Ｕ、ΔＡ、及びＮはそれぞれ、Ｃ：ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合、Ｕ：ＡＰＯ−Ｕを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合、ΔＡ：ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加しなかった場合、及びＮ：基質オリゴヌクレオチド、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのいずれも添加しなかった場合を表す。
【００６２】
ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合の結果（Ｃ０〜４８）では、Ｃ３において蛍光強度の増加が見られ、上記の反応条件では、反応時間１〜３時間で、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換が起こっていることが示された。
【００６３】
［実施例４］
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの濃度依存性
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの添加量に依存した酵素反応活性をモニターした。
実験方法
以下の組成を有する２０μＬの反応溶液をマイクロチューブに入れた：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを、０．１４、０．２８、０．７又は１．４μＭとなるように添加した。反応溶液を３７℃で３．５時間インキュベートした。
【００６４】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチドを１．０μＬ／チューブで添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００６５】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００６６】
結果
結果を図５に示す。図中、ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ＋Ａ３Ｇ）では、すべてのサンプルにおいて蛍光強度の増加が見られた。ＡＰＯ−Ｃを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加しなかった場合（ＣΔＡ３Ｇ）では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加したいずれのサンプル（Ｃ＋Ａ３Ｇ、Ｃ＋０．５×Ａ３Ｇ、Ｃ＋０．２×Ａ３Ｇ、及びＡ＋０．１×Ａ３Ｇ）よりも相対蛍光強度が低く、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ濃度が高くなるにつれ、蛍光強度が強くなっていることが見て取れる。このことから、上記の反応条件では、添加したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの添加量に依存して、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換が起こっていることが示された。ＡＰＯ−Ｕを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｕ＋Ａ３Ｇ）、ＡＰＯ−Ｕを用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加しなかった場合（ＵΔＡ３Ｇ）、及び基質オリゴヌクレオチド、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのいずれも添加しなかった場合（Ｎ）では、Ｃ＋Ａ３Ｇのいずれのサンプルよりも相対蛍光強度が大きかった。
【００６７】
以上の結果は、本発明の方法により、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を定量的に測定することが可能であることを示している。
【００６８】
［実施例５］
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対するＶｉｆの阻害効果
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性に対するＶｉｆの阻害効果について検討した。
実験方法
ＨＩＶ Ｖｉｆを、以下のように調製した：大腸菌を宿主として発現させるために、プラスミドベクターｐＥＴ−２２ｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に、ＰＣＲで増幅したＭＢＰ遺伝子、適切なリンカー、ＨＩＶ−１由来Ｖｉｆ遺伝子、停止コドンをこの順で挿入した。ＭＢＰは、発現の向上、アフィニティカラムを使用した精製、溶解度の向上のために使用した。本実施例では、ベクター由来の配列：ＥＡＬＫＤＡＱＴＮＡＡＡ（配列番号４）をリンカーとして使用した。Ｖｉｆ遺伝子は、Ｄｒ． Ｓｔｅｐｈａｎ ＢｏｕｒとＤｒ. Ｋｌａｕｓ ＳｔｒｅｂｅｌによってＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍに寄託されているｐｃＤＮＡ−ＨＶｉｆから、Ｖｉｆに相当する部分を使用した。この例で発現させた融合タンパク質（以下ＭＢＰ−Ｖｉｆと称する）のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００６９】
宿主として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｒｏｓｅｔｔａコンピテントセル；Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用した。コンピテントセルの一般的な使用方法に従い、宿主大腸菌を形質転換し、１０ｍＬの滅菌ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌアンピシリンナトリウム、２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。これを２Ｌの同様の滅菌培地に植え次ぎ、３７℃で振とう培養した。１〜２時間後、ＯＤ６００ｎｍが０．５増加した時点で２０℃に温度を下げ、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるよう添加して、さらに一晩培養した。遠心分離により大腸菌を回収した。
【００７０】
２Ｌの培養から得られた大腸菌に、溶液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、６ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム）及び１ｍＭ ＰＭＳＦ（最終濃度）を加え、超音波で細胞を破砕した。９０００×ｇで遠心分離し、上清を粗抽出液として回収した。
【００７１】
アフィニティーカラムを用いて精製を行なった。２０ｍＬ容のＮＥＢ社製アミロースカラムに上述の粗抽出液をアプライし、ＭＢＰ−Ｖｉｆを吸着させた。溶液Ａを用いてカラムを洗浄し、余分な細胞成分を洗い流した後、２０ｍＭマルトースを添加した溶液ＡでＭＢＰ−Ｖｉｆを溶出した。
【００７２】
続いて、陰イオン交換カラムを用いて、主として核酸などの不純物を除去した。そのために、アミロースカラムからの溶出液を、以下の組成を有する溶液に対して透析し、イオン強度を下げた：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ ＫＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール。透析後の溶出液を、同じ組成の溶液で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ ＨＰ（ＧＥ社製）にアプライし、フロースルーを回収した。この処理では、核酸はカラムに強く吸着するので、核酸を除去することができる。溶出液中の核酸含量を、吸光度２６０ｎｍと２８０ｎｍとの比で確認した。
【００７３】
次に、得られたフロースルーをヘパリンカラム（ＧＥ社製）にアプライし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールの存在下で、０．１５〜１Ｍ ＫＣｌ濃度勾配により、ＭＢＰ−Ｖｉｆを溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたアッセイにより、純度が９５％以上であることを確認した。
【００７４】
得られたタンパク質溶液を、１０ｍＭ ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．５）、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールに対して透析して緩衝液を置換し、限外濾過膜を使用して濃縮した。濃縮後、ＢｉｏＲａｄ社から市販されているタンパク質定量用ＩｇＧを標準試料として、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法タンパク質定量試薬（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、タンパク質濃度を決定した。
【００７５】
得られた精製Ｖｉｆ溶液を、分注して液体窒素で急速冷凍し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７６】
２．８μＭのＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及び０．９４μＭのＶｉｆを含む溶液を調製した。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのみ、Ｖｉｆのみを含む対照、及びいずれも含まない対照も作製した。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ−Ｖｉｆ溶液を、３７℃で２０分間プレインキュベートした。プレインキュベートを行なわない対照も作製した。
【００７７】
プレインキュベート後、最終的に以下の組成となる反応溶液を、全量２０μＬとなるように調製した：２５ｎＭ基質オリゴヌクレオチド、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ。基質オリゴヌクレオチドとして、配列ＣＣＣを含むＡＰＯ−Ｃ（配列番号１）又は配列ＣＣＵを含む対照であるＡＰＯ−Ｕ（配列番号２）を用いた。基質オリゴヌクレオチドを含まない対照も作製した。反応溶液を３７℃で３．５時間インキュベートした後、８０℃、２０分間の熱変性処理を行なった。
【００７８】
反応溶液に４００ｎＭ相補オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−３−１；配列番号３）を１．０μＬ添加し、９５℃にて２分間、続いて３７℃にて２分間インキュベートし、それぞれの温度で蛍光強度を測定した（励起：４７０ｎｍ、蛍光：５３０ｎｍ）。蛍光測定は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行なった。
【００７９】
各反応溶液について、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な３７℃で測定された蛍光強度を、基質オリゴヌクレオチドと相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こらない９５℃で測定された蛍光強度で除して、相対的蛍光強度を算出した。
【００８０】
結果
結果を図６に示す。基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆを含み、プレインキュベートを行なっていない反応系（Ｃ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ）、並びに同様の組成でプレインキュベートを行なった場合（Ｃ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ−ｐ）ではともに、Ｖｉｆを添加しなかった場合（Ｃ／Ａ３Ｇ及びＣ／Ａ３Ｇ−ｐ）と比較して、相対蛍光強度の低下が見られた。このことは、添加したＨＩＶ Ｖｉｆによって、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換が阻害されたことを示す。同じ反応液組成でプレインキュベートを行なった場合と行なわなかった場合とを比較すると（Ｃ／Ａ３Ｇ／ＶｉｆとＣ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ−ｐ）プレインキュベートを行なった場合の方が相対蛍光強度の低下が大きく、プレインキュベートによってＶｉｆの阻害効果が増大することが示された。
【００８１】
対照基質オリゴヌクレオチドＡＰＯ−Ｕを用いたサンプルでは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｕ／Ａ３Ｇ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆを添加した場合（Ｕ／Ａ３Ｇ／Ｖｉｆ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加せずにＶｉｆのみを添加した場合（Ｕ／ΔＡ３Ｇ／Ｖｉｆ）、並びにＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆをいずれも添加しなかった場合（Ｕ）のいずれにおいても、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）を用いてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを添加した場合（Ｃ／Ａ３Ｇ）と同等の相対蛍光強度が示された。また、基質オリゴヌクレオチドを添加せず、Ａ３Ｇのみを添加した場合（Ａ３Ｇ）、Ｖｉｆのみを添加した場合（Ｖｉｆ）、並びに基質オリゴヌクレオチド、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ及びＶｉｆのいずれも添加しなかった場合（Ｎ）においては、基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）を用いたいずれのサンプルよりも、高い相対蛍光強度が示された。これらから、ＡＰＯ−Ｃを用いたサンプルでの蛍光強度の低下は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの酵素活性以外によるアーチファクトではないことが示された。
【００８２】
以上より、ＨＩＶ Ｖｉｆは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる基質オリゴヌクレオチド（ＡＰＯ−Ｃ）中の標的配列Ｃ→Ｕの変換を阻害することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、抗ウイルス因子であるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの簡便で安価な測定方法を提供する。また、本発明は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性測定を利用した抗ウイルス薬のスクリーニング方法を提供する。よって、本発明は医療・製薬分野での利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの基質
配列番号２：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの対照基質
配列番号３：相補オリゴヌクレオチド
配列番号４：リンカー
配列番号５：融合タンパク質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項２】
被験試料中のＶｉｆの測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項３】
被験試料中のＰＫＡ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項４】
抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項５】
抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項６】
前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定するためのキット。
【請求項１０】
以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド；及び
（ｃ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、Ｖｉｆを測定するためのキット。
【請求項１１】
前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１】
被験試料中のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）基質オリゴヌクレオチドを被験試料と接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で被験試料と接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項２】
被験試料中のＶｉｆの測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項３】
被験試料中のＰＫＡ活性の測定方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験試料及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項４】
抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物の存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項５】
抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）被験化合物及びウイルス由来Ｖｉｆの存在下で、基質オリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させるステップであって、該基質オリゴヌクレオチドはシトシン（Ｃ）を含むＤＮＡであるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）でＡＰＯＢＥＣ３Ｇと接触させた基質オリゴヌクレオチドに相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、該相補オリゴヌクレオチドは、前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的であるステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）でのハイブリダイゼーションの程度を測定するステップ
を含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されており、ステップ（ｃ）で該標識物質からのシグナルを検出することによりハイブリダイゼーションの程度を測定する、上記方法。
【請求項６】
前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ活性を測定するためのキット。
【請求項１０】
以下の要素：
（ａ）シトシン（Ｃ）を含むＤＮＡである、基質オリゴヌクレオチド；
（ｂ）前記基質オリゴヌクレオチドの前記Ｃから３’側の配列と少なくとも部分的に相補的である相補オリゴヌクレオチド；及び
（ｃ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｇタンパク質
を少なくとも含み、前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃ、又は前記相補オリゴヌクレオチド中の前記基質オリゴヌクレオチド中の前記Ｃに対応するＧが標識物質で標識されている、Ｖｉｆを測定するためのキット。
【請求項１１】
前記標識物質が蛍光物質又は発光物質である、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記基質オリゴヌクレオチドが部分配列ＣＣＣ又はＴＣＣを含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記基質オリゴヌクレオチドが配列番号１により示される配列を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１１５１５１（Ｐ２０１１−１１５１５１Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４４１２２（Ｐ２０１０−１４４１２２）
【出願日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
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