ＡＴＰ増幅−サイクリング法による微量ＡＴＰの定量方法およびキット
【課題】 高価な測定機器が必要なルシフェリン／ルシフェラーゼ系による発光測定方法を用いない簡便、高感度、かつ実用性の高いＡＴＰの定量方法およびキットを提供する。
【解決手段】 試料から抽出したＡＴＰを増幅させた後、ＡＴＰ増幅に用いた酵素を不活化し、当該増幅後のＡＴＰ試料を、ＡＴＰサイクリング法を併用した酵素比色法または電気的定量法を用いて定量する。この方法により、従来の比色法よるＡＴＰ定量方法と比較して、約１,０００,０００倍検出感度の高いＡＴＰ定量方法、ＡＴＰサイクリング法と比色法を組み合わせたものに比べて約１,０００倍検出感度の上昇が実現できる。
【解決手段】 試料から抽出したＡＴＰを増幅させた後、ＡＴＰ増幅に用いた酵素を不活化し、当該増幅後のＡＴＰ試料を、ＡＴＰサイクリング法を併用した酵素比色法または電気的定量法を用いて定量する。この方法により、従来の比色法よるＡＴＰ定量方法と比較して、約１,０００,０００倍検出感度の高いＡＴＰ定量方法、ＡＴＰサイクリング法と比色法を組み合わせたものに比べて約１,０００倍検出感度の上昇が実現できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量ＡＴＰの新規な定量方法および当該定量方法を実施するために用いられるキットに関するものであり、より詳細には、極微量のＡＴＰをＡＴＰ増幅−サイクリング法によって比色定量または電気的定量が可能なレベルまで増幅させ定量する方法、および当該方法を実施するために用いられるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、ＡＴＰの定量には、ホタル由来のルシフェラーゼの存在下でＡＴＰと発光基質であるルシフェリンを反応させて発する光を測定する方法（非特許文献１）が用いられている。発光は、ルシフェラーゼと２価の金属イオン（Mg2+、Mn2+など）の存在下で以下の反応により生じる。
ホタルルシフェリン＋ATP＋O2＋H2O→オキシルシフェリン＋AMP＋PPi＋CO2＋光
上記ルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光法によるＡＴＰの定量は、感度が良好であり迅速性にも優れているため、発光法以外のＡＴＰ定量方法はほとんど実用化されていない。
【０００３】
上記の方法以外にＡＴＰを定量する方法が提案されている。例えば、グルコースを定量する際に広く用いられているヘキソキナーゼ法をＡＴＰの定量に用いる方法が知られている。この方法は、図１に示したように、グルコースとＡＴＰをＭｇイオン存在下でヘキソキナーゼ（ＨＸ）の作用により反応させグルコース−６−リン酸を生成させ（図１（１））、次いでグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６Ｐ−ＤＨ）の作用で６−ホスホグルコノラクトンおよび電子を生成させる。この電子の授与体としてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を加えておくと、生じた電子によってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとなる（図１（２））。ここで色原体の存在下でジアホラーゼを作用させると、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは酸化されてＮＡＤまたはＮＡＤＰに戻ると共に色原体が還元され呈色する色素が生じる（図１（３））。すなわち、過剰のグルコースを含んだ反応液に測定しようとするＡＴＰを含んだ試料を添加することにより、ＡＴＰを比色定量できる。しかしながら、この方法は感度が低く、検出限界は３００ｐｍｏｌ（３×１０−１０ｍｏｌ）程度である。
【０００４】
そこで感度を上昇させるために、消費されたＡＴＰを再生することによって反応を増幅する方法が開発されている。すなわち、ＡＴＰから生成したＡＤＰにリン酸を供与してＡＴＰに再生する反応を同時に行わせる方法である。この方法は、ＡＴＰサイクリング法と呼ばれている。このＡＴＰサイクリング法を上記ヘキソキナーゼ法に適用することにより感度が約１０００倍上昇し、検出限界は３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度となる。
【０００５】
ＡＴＰサイクリング法を用いたＡＴＰ定量方法としては、例えば、特許文献１および非特許文献２には、ＡＴＰがグルコースと反応してグルコース−６−リン酸を生成することで生じたＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼの作用によりホスホエノールピルビン酸からリン酸を供与してＡＴＰに再生することで反応を増幅させ、その結果、増加したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを測定する方法が開示されている。また、特許文献２にはアセチルリン酸およびアセテートキナーゼを用いてＡＤＰをＡＴＰに再生させ、ジアホラーゼの作用により生じる色素を増加させることで、土壌微生物から遊離させたＡＴＰ量を目視により測定する方法が開示されている。
【０００６】
また、本発明者らは、微量のＡＴＰを検出するために、ＡＴＰを連鎖的に増幅させる方法（ＡＴＰ増幅法）を開発し（特許文献３）、さらにこのＡＴＰ増幅法を改良して細胞１個レベルの微生物のＡＴＰをルシフェリン／ルシフェラーゼ系による発光法で検出できることを報告している（非特許文献３）。
【特許文献１】特開昭６４−２３９００号公報（昭和６４年１月２６日公開）
【特許文献２】特開２００３−２２５０９８号公報（平成１５年８月１２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９９３９０号（公開日：平成１３年１０月３０日）
【非特許文献１】DeLuca, M., and McElroy, W. D., Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 26, 921-925 (1974).
【非特許文献２】Hansen, E. H., Gundstrup, M., Mikkelsen, H. S., Determination of minute amount of ATP by flow injection analysis using enzyme amplification reactions and fluorescence detection. Journal of Biotechnology, 31, 369-380 (1993).
【非特許文献３】Satoh, T., Kato, J., Takiguchu, N., Ohtake, H., and Kuroda, A., ATP Amplification for Ultrasensitive Bioluminescence Assay: Detection of a Single Bacterial Cell. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 1216-1220 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、現在最も実用化されているＡＴＰ定量方法は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系を利用した方法であるが、発光を測定するための測定機器を用いることが必要である。通常このような機器は、発光によって生じる光子を検出しているので、機器の内部に光学装置が必要であり、小型化・単純化することには限界がある。そのため、測定機器のコストダウンを図ることも困難である。
【０００８】
そこで、高価な測定機器を必要とせず、簡便かつ高感度にＡＴＰを定量できる方法の開発が望まれている。
【０００９】
発光を測定する高価な測定機器を必要としないＡＴＰの定量方法としては、上述のように、例えば、目視可能な比色によりＡＴＰを検出する方法が知られている。しかしこの方法では、検出するためには３００ｐｍｏｌ（３×１０−１０ｍｏｌ）程度以上のＡＴＰが必要である。
【００１０】
しかしながら、例えば大腸菌Ｏ１５７は数十匹（ＡＴＰとして１０−１６ｍｏｌ程度）でヒトへの感染が可能になる。それゆえ、実際のＡＴＰ検出の現場では、３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）程度の検出感度が必要であり、上記比色による検出方法で検出可能なレベルと比較した場合、１,０００,０００倍の差がある。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高価な測定機器が必要なルシフェリン／ルシフェラーゼ系を利用しない簡便なＡＴＰ定量方法であって、数百ａｍｏｌレベルの検出感度を有するＡＴＰ定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討を行った。
【００１３】
上述のように、ＡＴＰを増幅する方法としてはＡＴＰサイクリング法およびＡＴＰ増幅法が知られている。そこで、それぞれの技術の特徴を精査した。その結果、ＡＴＰ増幅法では３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）程度から３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度への約１，０００倍の増幅が得意であることが分かった。問題点としては、最終到達点のＡＴＰの濃度を高く（３００ｆｍｏｌ以上に）設定した場合、反応液中のＡＭＰ濃度や酵素濃度を増加させる必要が生じ、それに伴う微量のＡＤＰやＡＴＰのコンタミネーションが測定精度に悪影響を及ぼすことが明らかとなった。すなわち、増幅量を増加させるために反応液中のＡＭＰおよび酵素の量を増やすと測定精度が下がり、３００ａｍｏｌの感度を実現できないというジレンマが生じた。そこで、微量のＡＤＰやＡＴＰのコンタミネーションが測定精度に影響を及ぼさない範囲で、反応液中のＡＭＰ濃度および酵素濃度を最適化すると、３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）程度から３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度への約１，０００倍の増幅が最適であることが見出された。
【００１４】
また、ＡＴＰサイクリング法では、３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度の濃度以上のＡＴＰを比色により検出できるレベルの３００ｐｍｏｌ（３×１０−１０ｍｏｌ）程度まで１,０００倍程度増幅することは可能であるが、３００ｆｍｏｌ程度以下のＡＴＰを比色により検出できるレベルまで増幅することは困難であることが明らかとなった。しかしながら、ＡＴＰサイクリング法の特徴として、極微量のＡＤＰのコンタミネーションによる測定感度減少は見られなかった。すなわち、ＡＴＰ増幅法に比べ、ＡＴＰサイクリング法はＡＤＰのコンタミネーションによる測定精度への悪影響を受けず、それゆえ反応液中の酵素濃度を増やすことが可能であることが見出された。
【００１５】
以上の結果をまとめると、ＡＴＰ増幅法は超微量（１０−１６ｍｏｌ程度）のＡＴＰを微量（１０−１３ｍｏｌ程度）まで増幅し、ＡＴＰサイクリング法は微量（１０−１３ｍｏｌ程度）のＡＴＰをさらに増幅するのに有利であることが判明した。また、微量ＡＤＰのコンタミネーションは、ＡＴＰ増幅法の測定精度を低下させるが、ＡＴＰサイクリング法に影響を及ぼさないことが判明した。したがって、両方法の組み合わせの順序としては、ＡＴＰ増幅法を先に行い、その後ＡＴＰサイクリング法を後で行うことが最適であることが見出された。この組み合わせにより、お互いの不得意な部分を補って、合計１,０００,０００倍の増幅が可能であることが予想された。
【００１６】
そこで、本発明者らは、ＡＴＰ増幅法およびＡＴＰサイクリング法を実際に組み合わせて微量ＡＴＰの定量を試みたところ、予想に反して予期した結果が得られなかった。それどころか、ＡＴＰサイクリング法単独の場合より検出感度が低下するという結果が得られた（図７、不活化行程を行わない場合参照）。この原因を究明したところ、ＡＴＰ増幅法で用いられるアデニレートキナーゼがＡＴＰサイクリング法を阻害していることを見出した。すなわち、アデニレートキナーゼはＡＴＰサイクリング法におけるヘキソキナーゼと拮抗してしまうことが原因であることが明らかとなった。そこで、ＡＴＰ増幅法が終了した段階で、アデニレートキナーゼの活性を失わせるべく、高温による不活化工程を設けることで、この問題点を克服した。
【００１７】
しかしながら、不活化工程を設けるにあたり、リン酸供与体が同時に分解してしまうことは問題である。そこで、このような新たな問題が生じないために、リン酸供与体の安定性を考慮した結果、ポリリン酸が最も有利であると考えられた。
【００１８】
以上の検討により、従来不可能であった１,０００,０００倍のＡＴＰ増幅が可能となり、その結果、１０−１６ｍｏｌ程度の超微量のＡＴＰを、比色により検出可能な本発明を完成させるに至った。
【００１９】
すなわち本発明に係る方法は、試料中に含まれるＡＴＰを定量する方法であって、試料から抽出したＡＴＰを増幅させるＡＴＰ増幅工程、ＡＴＰ増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程を包含することを特徴としている。
【００２０】
上記構成により、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系による発光法を用いずに、比色法のような簡便な方法で、極微量のＡＴＰを定量することが可能となる。
【００２１】
上記ＡＴＰサイクリング工程では、ＡＤＰをＡＴＰに再生するためにポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることが好ましく、上記ＡＴＰ増幅工程では、ＡＭＰ、アデニレートキナーゼ、ポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることが好ましい。さらに、上記リン酸化可能な化合物がグルコースであり、上記リン酸化化合物がグルコース−６−リン酸であることが好ましい。
【００２２】
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を定量することにより行われることが好ましい。より具体的には、上記酸化還元反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下で、ジアホラーゼの作用により還元されて可視光領域で呈色する色素を生じる色原体を用いることで比色定量する方法を挙げることができる。また、酸化還元反応において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下で、ジアホラーゼの作用によりフェリシアン化イオンが還元され、生じたフェロシアン化イオンから電子を電極に受け渡し、電気的に定量する方法を挙げることができる。
【００２３】
本発明に係るキットは、上記本発明に係る方法を実施するために用いられるキットであって、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ＡＭＰ、グルコース、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼおよび色原体またはフェリシアン化化合物を備えることを特徴としている。
【００２４】
上記構成のキットを用いることにより、本発明に係る方法を簡便かつ迅速に実施することが可能となる。
【００２５】
また、本発明には、以下のＡＴＰ定量方法が含まれる。
【００２６】
（Ｉ）ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物を生成させるリン酸化化合物生成工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【００２７】
（II）ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【００２８】
上記構成により、従来実現されていない電気的な信号によりＡＴＰを定量する方法を実現することが可能となる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の方法は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系による発光法を用いずに、比色法や電気的定量法により簡便にＡＴＰを定量でき、しかも、従来比色によりＡＴＰを検出する方法に比べて、１,０００,０００倍、また、ＡＴＰサイクリングサイクリング法を併用したヘキソキナーゼ法による比色検出感度より約１,０００倍の超高感度で極微量のＡＴＰを定量できるという効果を奏する。また、電気的な信号により超微量のＡＴＰを検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
（１）ＡＴＰ定量方法
本発明のＡＴＰ定量方法は、試料から抽出したＡＴＰを増幅させるＡＴＰ増幅工程、ＡＴＰ増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程を包含するものであればよい。以下、各工程について順に説明する。なお、上記各工程以外の工程が設けられていてもよく、上記以外の工程の内容は限定されない。
【００３２】
〔ＡＴＰ増幅工程〕
ＡＴＰ増幅工程では、試料から抽出したＡＴＰを増幅させる。
【００３３】
本方法により定量する対象物質はＡＴＰである。したがって試料はＡＴＰを含む可能性があるものであればよい。ＡＴＰは、動物、植物、微生物などの全ての生物に存在するエネルギー物質であるので、生物由来の試料が本発明の対象試料となり得る。
【００３４】
本方法は超微量のＡＴＰを定量することができるため、本方法の適用対象としては、例えば、抗ガン剤の薬効試験として、アポトーシスが起きて死滅した細胞の検出、生物が存在した痕跡として残るＡＴＰの検出、衛生検査現場における将来微生物が生息するであろう食品残渣の検査、極少数の微生物の検出などを挙げることができる。なかでも微生物の検出に本発明の方法を適用すれば、非常に簡便に、かつ、極少数の微生物の存在を確認することができるため、微生物を含む可能性のある試料が本発明の対象試料として好適である。
【００３５】
試料からＡＴＰを抽出する方法は特に限定されるものではなく、試料の種類に応じて公知の方法から適宜選択して用いればよい。例えば、細胞を含む試料や微生物を含む試料からＡＴＰを抽出する場合には、物理的手段（例えばホモジナイザー、超音波など）により細胞または微生物を破砕する方法、酵素（例えばリゾチームなど）により細胞または微生物の膜を破砕する方法、界面活性剤（例えばTritonX-100（商品名）、Tween20（商品名）など）により細胞または微生物の膜を破砕する方法を用いることができる。
【００３６】
しかしながら、細胞を破砕等するのみでは、細胞中に含まれるポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼなどの酵素が、以下に説明するＡＴＰ増幅反応に影響を及ぼす可能性があるため、細胞を破砕等してＡＴＰを抽出した後に加熱処理を行って酵素を失活させるか、細胞を加熱処理することによりＡＴＰを溶出させる方法を用いることが好ましい。
【００３７】
ＡＴＰの増幅方法は特に限定されないが、本発明者らが開発した特許文献３および非特許文献３に記載の方法を好適に用いることができる。すなわち、ＡＭＰ、アデニレートキナーゼ（以下、「ＡＤＫ」と略記する）、ポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」と略記する）を用いる方法である。以下、ＡＴＰ増幅方法の一例として、本発明者らが開発したＡＭＰ、ＡＤＫ、ポリリン酸化合物およびＰＰＫを用いる方法について説明する。
【００３８】
ＡＴＰ増幅反応を触媒するＡＤＫは、ＡＭＰとＡＴＰとを反応させたとき、２分子のＡＤＰを生じさせる酵素であり、当該酵素活性を有するものは全てＡＤＫに含まれる。また、ＰＰＫはＡＤＰとポリリン酸化合物（ＰｏｌｙＰｎ）とを反応させ、ＡＴＰとポリリン酸化合物（ＰｏｌｙＰｎ−１）とに変換する酵素であり、当該酵素活性を有するものは全てＰＰＫに含まれる。
【００３９】
ポリリン酸化合物としては、ポリリン酸あるいはその塩を好適に用いることができる。好ましくは１０個〜１０００個、より好ましくは１０個〜１００個のリン酸が直鎖状に重合したものが用いられる。ポリリン酸は細菌由来でもよく、化学合成で得られたものでもよい。あるいは、ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰから合成したものでもよい。以下、説明の便宜上、ポリリン酸化合物を単にポリリン酸と称する。
【００４０】
このＡＴＰ増幅反応は、図２に示すように、ＡＴＰが存在するとＡＤＫによってＡＴＰからＡＭＰへのリン酸転移反応が起こり２分子のＡＤＰが生成する（第１反応）。生じた２分子のＡＤＰは、ＰＰＫの作用によりポリリン酸化合物（図中ＰｏｌｙＰｎ）からリン酸基を受け取り、２分子のＡＴＰを生じる（第２反応）。以上が図２に１回目として示されている。生じた２分子のＡＴＰは、再度第１反応に使用され、ＡＤＫによってＡＭＰへのリン酸転移反応が起こり４分子のＡＤＰを生成する。この４分子のＡＤＰは第２反応でＰＰＫによって４分子のＡＴＰに変換される（図中２回目）。このように過剰のＡＭＰとポリリン酸を存在させて、ＡＤＫとＰＰＫとの平衡状態をそれぞれＡＤＰ生成方向（第１反応）およびＡＴＰ生成方向（第２反応）に向かわせるようにし、第１反応と第２反応とを１つの反応系とし、ｎ回この反応系を繰り返すことにより、１個のＡＴＰが２ｎ個に増幅される。
【００４１】
上記ＡＤＫとＰＰＫとは別のタンパク質であるので、それぞれ別のタンパク質としてＡＴＰ増幅系に用いればよいが、ＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質としてもよい。融合タンパク質とすれば、ＡＤＫとＰＰＫとを個々に用いた場合、両酵素の活性に違いがあると反応効率が低下するが、融合タンパク質とした場合にはこのような問題は生じない。また、ＡＤＫとＰＰＫとが近接するため拡散律速にならず、効率良く反応が進む。さらに、２つの酵素を同時に調製できるので、調製が容易となる。
【００４２】
ＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質は、ＡＤＫをコードする遺伝子ａｄｋとＰＰＫをコードする遺伝子ｐｐｋとを連結した発現ベクターを公知の方法により構築し、適切な宿主細胞に導入して発現させることにより製造することができる。具体的には、例えば非特許文献３に記載されている手順で作製することができる。
【００４３】
上記ＰＰＫ、またはＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質はＡＤＰ除去処理を施されていることが好ましい。ＰＰＫには不純物としてＡＤＰが結合している場合がある。このＰＰＫに結合しているＡＤＰは、ポリリン酸の存在下でＰＰＫの基質とされ得、このＡＤＰがＰＰＫによりＡＴＰに変換され得る。すなわち、図２に示すような反応系において、ＡＴＰ非存在下であっても、まず第２反応であるＡＤＰからＡＴＰへの反応が生じ、このＡＴＰが第１反応で使用されることにより、自動的にＡＴＰ増幅反応が開始されることになる。
【００４４】
上記ＡＤＰ除去処理の方法は特に限定されるものではないが、例えばアピラーゼ処理を挙げることができる。アピラーゼはＡＴＰまたはＡＤＰからリン酸基を除去し、ＡＭＰを生成する。
【００４５】
ＡＴＰ増幅反応は、適切な緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液中で行うことができる。また、緩衝液には、例えばＭｇイオンなどの二価金属イオンが含まれていることが好ましい。反応温度は２０℃以上４０℃以下が好ましく、２５℃以上３０℃以下がより好ましい。２０℃より低いと酵素活性が低くＡＴＰが充分増幅されず、４０℃を超えると酵素が失活することによりＡＴＰが充分増幅されない。反応時間は５分以上１２０分以下が好ましく、１０分以上６０分以下がより好ましい。５分未満ではＡＴＰの増幅量が少ないため微量ＡＴＰを検出できず、１２０分を超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションにより測定精度が悪くなる。
【００４６】
ＡＴＰ増幅工程において増幅されるＡＴＰ量は、後段のＡＴＰサイクリング工程においてＡＴＰサイクリング反応に引き継がれ、発光反応を用いない比色等により検出できる量であればよい。したがって、ＡＴＰ増幅工程では少なくとも１ｆｍｏｌ以上にＡＴＰを増幅できればよい。このために、ＡＴＰ増幅反応液中のＡＭＰ濃度は６μＭ以上２５μＭ以下が好ましく、１２μＭ以上１５μＭ以下がより好ましい。６μＭより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、２５μＭを超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションにより測定精度が悪くなる。ＡＴＰ増幅反応液中のポリリン酸濃度は０．４ｍＭ以上６ｍＭ以下が好ましく、２．７ｍＭ以上５ｍＭ以下がより好ましい。０．４ｍＭより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、６ｍＭを超えると反応速度が速くなりすぎて測定精度が悪くなる。また、ＡＴＰ増幅反応液中のＡＤＫ濃度は０．４５μｇ／ｍＬ以上４μｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．９μｇ／ｍＬ以上２μｇ／ｍＬ以下がより好ましい。０．４５μｇ／ｍＬより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、４μｇ／ｍＬを超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションや反応速度が速くなりすぎることが原因で測定精度が悪くなる。また、ＡＴＰ増幅反応液中のＰＰＫ濃度は１．５μｇ／ｍＬ以上１２．５μｇ／ｍＬ以下が好ましく、３μｇ／ｍＬ以上６．５μｇ／ｍＬ以下がより好ましい。１．５μｇ／ｍＬより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、１２．５μｇ／ｍＬを超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションや反応速度が速くなりすぎることが原因で測定精度が悪くなる。
【００４７】
ＡＴＰ増幅反応の反応液量は特に限定されない。後段の定量工程で用いられる方法や用いる実験器具に応じて適宜選択すればよい。
【００４８】
〔不活化工程〕
不活化工程では、上記ＡＴＰ増幅工程で用いられたＡＤＫを不活化させる。
【００４９】
本発明者らは、上記ＡＴＰ増幅反応と後述のＡＴＰサイクリング反応を同時に行うとＡＴＰサイクリング反応が阻害されることを見出し、この原因がＡＤＫ活性にあることを見出した。そして、ＡＤＫ活性を熱処理により失活させた場合には、ＡＴＰサイクリング反応が阻害されないことを確認した。
【００５０】
本不活化工程で用いる方法としては、増幅したＡＴＰに影響を及ぼすことなくＡＤＫ活性を不活化できる方法であればよい。具体的には、例えば、熱処理を挙げることができる。熱処理温度は、５０℃以上１００℃以下が好ましく、７０℃以上１００℃以下がより好ましい。５０℃より低いと十分に酵素活性の不活化が行えず、１００℃を超えるとＡＴＰの分解が懸念される。また、処理時間は１分以上１５分以内が好ましく、１分以上３分以内がより好ましい。１分より短いとＡＴＰの十分に酵素活性の不活化が行えず、１５分より長いとＡＴＰの分解が懸念される。熱処理以外の方法としては、例えば、ＡＤＫ活性阻害剤、塩、キレート剤などを挙げることができる。
【００５１】
〔ＡＴＰサイクリング工程〕
ＡＴＰサイクリング工程では、上記ＡＴＰ増幅工程で増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させる。
【００５２】
リン酸化可能な化合物としては、ＡＴＰからリン酸基が１個転移されてリン酸化化合物に変換される化合物であればよい。このような化合物としては、具体的には、例えばグルコース、フルクトース、ラクトースなどを挙げることができる。また、リン酸化可能な化合物とＡＴＰを反応させてリン酸化化合物とＡＤＰを生じる反応には、ＡＴＰからリン酸基を転移させる酵素（キナーゼ）を作用させることが必要である。この反応においては、リン酸化可能な化合物（出発物質）に何を選択するかにより、用いる酵素および生成されるリン酸化化合物が決定される。
【００５３】
上記反応により生じるＡＤＰは、リン酸供与化合物の存在下でＡＤＰにリン酸基を転移させる酵素の作用によりＡＴＰに再生される。この再生されたＡＴＰも上記リン酸化可能な化合物と反応してリン酸化化合物を生成する。このように使用されてＡＤＰとなったＡＴＰを元のＡＴＰに再生し、元の反応を増幅する方法は、一般に「ＡＴＰサイクリング法」と呼ばれている。
【００５４】
ここで、ＡＤＰをＡＴＰに再生しなければ、１分子のＡＴＰに対して１分子のリン酸化化合物が生成されるが、例えばＡＴＰを１０００回再生させればリン酸化化合物量は１０００倍になる。再生回数は時間によって制御することができるので、一定時間後のリン酸化化合物量は試料中に含まれているＡＴＰ量の再生回数倍であり、元のＡＴＰ量に比例する。これによって、ＡＴＰの検出感度をさらに上昇させることができる。
【００５５】
ＡＴＰサイクリング反応に用いるリン酸供与化合物およびリン酸転移酵素の組み合わせとしては、例えば、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ、アセチルリン酸とアセテートキナーゼなどを挙げることができるが、特に限定されない。なかでも、ポリリン酸とＰＰＫの組み合わせを用いることが好ましい。
【００５６】
後述の実施例で示すように、ポリリン酸はアセチルリン酸やホスホエノールピルビン酸と比較して非常に安定な化合物であるという利点を有している。すなわち、ポリリン酸は、どのような温度やｐＨの条件の溶液中でも安定であるため、ＡＤＰからＡＴＰへの再生を長時間、安定して行うことができ、また特に不活化行程において分解しないので有利である。また、リン酸化合物を効率良く増幅できるため、微量のＡＴＰを高感度で定量できる。なぜなら、ホスホエノールピルビン酸やアセチルリン酸は１分子中に１個のリン酸基を有するのみであるが、ポリリン酸は１分子中に分子量に依存して多数のリン酸基を有するため、１分子で多数のＡＤＰをＡＴＰに生成できるからである。さらに、ホスホエノールピルビン酸やアセチルリン酸と比較して、安価に入手できるという利点も有する。
【００５７】
図３には、リン酸化可能な化合物をグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＡＴＰと反応して生成されるリン酸化化合物をグルコース−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、以下「Ｇ６Ｐ」と略記する）とし、ＡＴＰサイクリングにポリリン酸（図中ＰｏｌｙＰｎ）およびおよびＰＰＫを用いる場合を例示した。この場合グルコースからＧ６Ｐを生成する反応を触媒する酵素としては、図３に示したヘキソキナーゼ（図中Ｈｘ）を挙げることができる。またグルコキナーゼを用いることもできる。グルコキナーゼとヘキソキナーゼの違いについては、それぞれの酵素の性質において、グルコースへの反応や、反応の特異性などに若干の違いはあるものの、どちらの酵素も、その反応の本質において、ＡＴＰの共存下でグルコースをＧ６Ｐに変換しＡＤＰを生じる点は同じであるため、本発明の用途においては両酵素に差は認められない。
【００５８】
本ＡＴＰサイクリング工程の反応は、リン酸化可能な化合物、当該リン酸化可能な化合物にＡＴＰからリン酸基を転移させる酵素、ＡＤＰにリン酸を供与する化合物およびＡＤＰにリン酸基を転移させる酵素が同時に存在する状態、例えば上記化合物等がすべて溶解された適当な緩衝液にＡＴＰを含む試料を添加することで進行させることができる。
【００５９】
反応液に用いる緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液などを挙げることができる。また、反応液に含まれる各化合物や酵素の濃度は、反応が十分に行われる量であればよく、用いる化合物や酵素に応じて適宜選択すればよい。
【００６０】
〔定量工程〕
定量工程では、上記ＡＴＰサイクリング工程で生成したリン酸化化合物を定量する。リン酸化化合物を定量することによって、試料中のＡＴＰ量を間接的に定量することができる。
【００６１】
生成したリン酸化化合物の定量方法は特に限定されるものではない。リン酸化可能な化合物として何を用いるかによって生成するリン酸化化合物は異なるので、生成したリン酸化化合物の種類に応じて、公知の定量方法を用いて測定することができる。
【００６２】
リン酸化化合物の定量方法の一例として、当該リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を定量する方法を挙げることができる。また、当該酸化還元反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下「ＮＡＤ」と略記する）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下「ＮＡＤＰ」と略記する）が用いられること好ましい。
【００６３】
図４（ａ）および（ｂ）には、Ｇ６Ｐを開始物質とする酸化還元反応により受け渡された電子の総量を定量する方法を例示した。Ｇ６ＰはＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、図中Ｇ６ＰＤＨ）の作用により酸化されて６−ホスホグルコノラクトン（Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生成する。その際、ＮＡＤ等は還元されてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生じる。ここまでは図４（ａ）および（ｂ）とも共通である。この時点で生じたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを直接定量することが可能である。例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは３４０ｎｍの吸光度を測定することにより定量できる。
【００６４】
図４（ａ）では、Ｇ６Ｐの酸化の際に生じたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがジアホラーゼの作用により酸化されＮＡＤまたはＮＡＤＰに戻り、その際色原体が還元され可視光領域で呈色する色素を生じる。生じた色素の量（発色量）とＡＴＰ量は比例するため、発色量を測定することでＡＴＰを定量することができる。発色量は分光光度計を用いて測定することができる。また、あらかじめ検量線や比色表を作成しておくことにより、目視判定も可能である。
【００６５】
上記色原体は、還元型脱水素化剤（例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）から受け渡された電子により還元されて可視光領域（３００ｎｍ〜８００ｎｍ）で呈色する色素を生じるものであればよい。すなわち、色原体は当該反応により可視領域に吸収が無いものが有るように変化するか、吸収領域が有るものが無いように変化するか、または吸収スペクトルが異なるように変化するかのいずれかでもよい。
【００６６】
色原体は上述の条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、メチレン・ブルー、レザズリンなどの色素やテトラゾリウム類等を挙げることができる。
【００６７】
なかでもテトラゾリウム類が好適である。テトラゾリウムとしては、例えば、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレット、ＭＴＴ、ネオテトラゾリウム、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム、テトラニトロ・ブルー・テトラゾリウム、テトラゾリウム・ブル、テトラゾリウム・レッド（トリフェニル・テトラゾリウム）、テトラゾリウム・バイオレット、チオカルバミル・ニトロ・ブルー・テトラゾリウム、ＸＴＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３等、または、それらの塩等を挙げることができる。
【００６８】
上述のようにＡＴＰを呈色反応により定量する場合には、例えば図４（ａ）の場合、グルコース、ヘキソキナーゼ、ポリリン酸、ＰＰＫ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、ジアホラーゼおよび色原体が同時に存在する状態、例えば上記化合物等がすべて溶解された適当な緩衝液を、ＡＴＰ増幅工程および不活化工程を終えたＡＴＰ試料に添加し、発色量を分光光度計で測定することができる。あるいは、グルコース、ヘキソキナーゼ、ポリリン酸、ＰＰＫ、およびＮＡＤまたはＮＡＤＰが溶解された適当な緩衝液を、ＡＴＰ増幅工程および不活化工程を終えたＡＴＰ試料に添加して反応させた後、ジアホラーゼおよび色原体を添加し、発色量を測定してもよい。ただし、これらに限定されるものではない。
【００６９】
また、各化合物や酵素の濃度は特に限定されず、反応が十分行われる量を適宜選択して用いればよい。
【００７０】
図４（ｂ）では、引き続きジアホラーゼの作用によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは酸化されＮＡＤまたはＮＡＤＰに戻り、その際フェリシアン化イオン（Fe(CN)63-）を還元してフェロシアン化イオン（Fe(CN)64-）が生じる。例えば、図５に示すような作用極１、参照極２および対極３を反応槽５内の反応液中に挿入し、作用極１と参照極２との間に０．１Ｖ以上１．５Ｖ以下、好ましくは０．４Ｖ程度の電圧をかけると、上記フェロシアン化イオン（Fe(CN)64-）はフェリシアン化イオン（Fe(CN)63-）に変化して電子を作用極に受け渡すので電流が流れるようになる。なお、１．５Ｖを超えると水の電気分解が始まり、好ましくない。この電流を作用極１と対極２との間に設置した電流計４で測定することにより、当該酸化還元反応で受け渡された電子の総量を測定することができる。なお、ジアホラーゼによりＮＡＤＨを電流として検出する方法は、例えば、Analytica Chemica Acta 347: 63-70 (1997) に開示されている。ただし、ＡＴＰを電気的に検出する方法は、未だ実用化されていない。
【００７１】
上述のように、ＡＴＰ量を電流として測定する場合には、例えば図５に示されるような構成を有する検出計を用いて、反応槽５内にグルコース、ヘキソキナーゼ、ポリリン酸、ＰＰＫ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、ジアホラーゼおよびフェリシアン化イオン（Fe(CN)63-）をすべて溶解させた適当な緩衝液を入れておき、そこにＡＴＰ増幅工程および不活化工程を終えたＡＴＰ試料を添加することで電流の測定を行うことができる。ただし、これに限定されるものではない。
【００７２】
また、各化合物や酵素の濃度は特に限定されず、反応が十分行われる量を適宜選択して用いればよい。
【００７３】
上述の電気的にＡＴＰ量を測定する方法は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系を利用した方法で用いる測定機器と比較して小型化、簡便化が可能である。また、現在、酵素電極法で微量のグルコース等を測定する機器が市販されており、このような機器をＡＴＰ量の測定に利用することも可能であり、ＡＴＰ定量のコストを低下させることに繋がる。
【００７４】
（２）ＡＴＰ定量キット
本発明のキットは、上述の本発明のＡＴＰ定量方法を実施するために用いられるキットであればよい。キットの構成としては、ＡＴＰ増幅反応に用いられる試薬、ＡＴＰサイクリング反応およびＡＴＰサイクリング反応に用いられる試薬、リン酸化化合物の定量に用いられる試薬が含まれていることが好ましい。
【００７５】
具体的には、例えば、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ＡＭＰ、グルコース、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼおよび色原体またはフェリシアン化化合物を備えるキットを挙げることができる。
【００７６】
上記例示したもの以外にキットに含まれることが好ましいものとしては、例えば上記化合物等を溶解するための緩衝液、ＡＴＰ標準液、試料からＡＴＰを抽出するための試薬、反応に用いるプレートなどを挙げることができるが、限定されるものではない。
【００７７】
色原体が含まれるキットはＡＴＰを呈色反応によって定量する方法に使用でき、フェリシアン化化合物が含まれるキットはＡＴＰを電気的に定量する方法に使用できる。もちろん、１キット中にフェリシアン化化合物と色原体の両方が含まれるキットとしてもよい。
【００７８】
上記化合物等は、実際にＡＴＰ量を測定するときの反応時に同時に同一の溶液中に存在すればよく、反応前はその形態に特に限定はない。したがって、キットにはそれぞれ個別に、または同一に、またはいくつか組み合わされて、溶液状態、粉末状態、またはその他の状態で備えられていればよい。
【００７９】
キットに含まれる酵素（ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびジアホラーゼ）については、その供給源となる生物は特に限定されるものではなく、入手の容易さやコストを考慮して選択すればよい。
【００８０】
本発明のキットは、その構成にポリリン酸を備えている。このポリリン酸は非常に安定性が高いので、キットに含めるに際して安定性を高めるための方策を施す必要がなく、保存性に優れたキットを提供できるという利点を有している。また、ポリリン酸は安価であるため、キットの製造コストを低く抑えることができ、安価なキットを提供できるという利点を有している。
【００８１】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８３】
〔実施例１：比色によるＡＴＰの定量〕
ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法、およびヘキソキナーゼ法のみ、の３通りの方法を用いて比色によりＡＴＰ量を測定した。
【００８４】
（ｉ）実験材料
ＡＴＰ試料は、３．３×１０−４ｆｍｏｌ（０．３３ａｍｏｌ）〜３．３×１０７ｆｍｏｌ（３３ｎｍｏｌ）の範囲で公比１０の１２段階を用いた。
【００８５】
ＡＴＰ増幅溶液（２０μＬ／反応）の組成は、ＡＴＰ：上記各濃度、ＡＭＰ：１５μＭ、ポリリン酸（ｐｏｌｙＰ１５）：５ｍＭ、ＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質：１４．４μｇ／ｍＬ、ＭｇＣｌ２：８ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）：４０ｍＭとした。なお、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法およびヘキソキナーゼ法のみの場合は、上記よりＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質を除外した組成とした。
【００８６】
ＡＴＰサイクリング溶液（上記ＡＴＰ増幅反応液にＡＴＰサイクリング試薬１０μＬを加えて、合計３０μＬ／反応）の組成は、ヘキソキナーゼ：２４０μｇ／ｍＬ（３３ユニット／ｍＬ）、Ｇ６Ｐ脱水素酵素：５３μｇ／ｍＬ（１６．７ユニット／ｍＬ）、グルコース：１．５ｍＭ、ＮＡＤＰ：０．５ｍＭ、ＰＰＫ：６６．７μｇ／ｍＬとした。なお、ヘキソキナーゼ法のみの場合は、上記よりＰＰＫを除外した組成とした。
【００８７】
発色溶液（上記ＡＴＰサイクリング反応液に発色試薬１５．５μＬを加えて、合計４５．５μＬ／反応）の組成は、ＷＳＴ−１：２ｍＭ、ジアホラーゼ：５５μｇ／ｍＬ（０．５５ユニット／ｍＬ）とした。
【００８８】
（ｉｉ）実験方法
以下の手順で実験を行った。
(1) ２０μＬのＡＴＰ増幅反応溶液を２５℃で６０分間反応する。
(2) ９５℃で１分間処理し、酵素を不活化する。
(3) ＡＴＰサイクリング試薬１０μＬを添加し、２５℃で６０分間反応する。
(4) 発色試薬１５．５μＬを添加し、２５℃で１５分間反応する。
(5) 分光光度計を用いて、ＯＤ４５０を測定する。
【００８９】
なお、ＡＴＰ増幅を併用しない場合は、上記(3)から開始した。
【００９０】
（ｉｉｉ）結果
結果を図６に示した。図６から明らかなように、ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用した場合（図中、ＡＴＰ増幅＋サイクリング法）、ＡＴＰサイクリングのみを併用した場合（図中、サイクリング法のみ）、およびヘキソキナーゼ法による発色のみの場合（図中、これまでの発色法）のいずれも、試料中のＡＴＰ量に依存して吸光度の上昇が観察され、試料中のＡＴＰ量と吸光度が比例することが示された。しかし、試料を直接ヘキソキナーゼ法に適用した場合（ヘキソキナーゼ法による発色のみの場合）には、感度が非常に低く、検出限界は約３００ｐｍｏｌ（３×１０−９ｍｏｌ）であった。ＡＴＰサイクリングのみを併用した場合には、検出感度は約１０００倍上昇し、検出限界は約３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）であった。一方、ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用した場合には、検出感度がさらに約１０００倍上昇し、約３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）のＡＴＰを検出することが可能であった。
【００９１】
また、図７に示したように、この方法では測定機器を用いずに、ＡＴＰの存在を目視判定することが可能であった。なお、不活化工程を行わない場合は、ＡＴＰサイクリングのみを併用した場合より感度が低下した。
【００９２】
〔実施例２：電流によるＡＴＰの定量〕
ヘキソキナーゼ：１０ユニット、Ｇ６Ｐ脱水素酵素：１０ユニット、ジアホラーゼ：５ユニット、グルコース：１．８ｍＭ、ＮＡＤＰ：０．６ｍＭ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）：３３ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：２６．４ｍＭ、ＭｇＣｌ２：２．６４ｍＭ、[Ｆｅ（ＣＮ）６]３−：２．４ｍＭを含む溶液４．８ｍＬを調製し、作用極１、参照極２および対極３を挿入した（図５参照）。スターラーを用いて溶液を混合し、安定化した後、１６．５ｍＭのＡＴＰを０．３ｍＬ添加した。
【００９３】
結果を図８に示した。図８から明らかなように、ＡＴＰ添加後から電流が流れ始め、３分後には３μＡ（３×１０−６Ａ）の電流が流れた。
【００９４】
〔実施例３：ポリリン酸およびアセチルリン酸の安定性の比較〕
３−１．異なる温度における安定性の比較
純水（ｐＨ７．０）にポリリン酸（シグマ社製）またはアセチルリン酸（シグマ社製）を１ｍＭとなるようにそれぞれ溶解した。このポリリン酸溶液およびアセチルリン酸溶液を、それぞれ４℃、１８℃または３７℃の温度条件で保存し、１２時間後に溶液中の遊離リン酸量を既知のモリブデンリン法によって測定し、これを分解量とみなして分解率を算出した。
【００９５】
結果を図９に示した。図９から明らかなように、ポリリン酸はいずれの温度においてもほとんど分解されず、非常に安定であった。一方、アセチルリン酸は４℃では比較的安定であったが、１８℃では１２時間後の残存率が約７５％、３７℃では１２時間後の残存率が約２５％であり、酵素反応に適した温度においては分解しやすいことが明らかとなった。
【００９６】
３−２．異なるｐＨにおける安定性の比較
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．２）または純水（ｐＨ７．０）に、ポリリン酸（シグマ社製）またはアセチルリン酸（シグマ社製）を１ｍＭとなるようにそれぞれ溶解した。各溶液を３７℃で保温し、１５分後、３０分後、６０分後および１２０分後にサンプリングして遊離リン酸量を既知のモリブデンリン法によって測定し、これを分解量とみなして分解率を算出した。
【００９７】
結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、ポリリン酸は中性（ｐＨ７．０）、酸性（ｐＨ５．２）、アルカリ性（ｐＨ７．８）のいずれのｐＨにおいてもほとんど分解されず、非常に安定であった。一方、アセチルリン酸はいずれのｐＨにおいても経時的に分解が進み、１２０分後の残存率はいずれも約５０％程度であった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は、ＡＴＰの検出・定量を実施している様々な分野において利用可能である。特に、微生物の検査が必要な食品産業、医薬品産業、臨床検査分野、環境衛生分野などでの利用に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ヘキソキナーゼ法によりＡＴＰを定量する反応原理を示す図である。
【図２】ＡＴＰ増幅反応の反応原理を示す図である。
【図３】ＡＴＰサイクリング法を併用したヘキソキナーゼ法によりＡＴＰを定量する反応原理を示す図である。
【図４】（ａ）はＧ６Ｐを開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を呈色により定量する反応原理を示す図であり、（ｂ）はＧ６Ｐを開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を電気的に定量する反応原理を示す図である。
【図５】ＡＴＰを電気的に定量する検出計の概略を示す図である。
【図６】ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法、およびヘキソキナーゼ法のみ、の３通りの方法を用いて比色によりＡＴＰを定量した結果を示すグラフである。
【図７】ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法、ヘキソキナーゼ法のみ、および不活化工程を行わないＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法の４通りの方法を用いて比色によりＡＴＰを定量したときの、反応液の色調を示す画像である。
【図８】反応系にＡＴＰを添加することにより電流が発生することを示すグラフである。
【図９】ポリリン酸およびアセチルリン酸の、異なる温度における安定性を比較した結果を示すグラフである。
【図１０】ポリリン酸およびアセチルリン酸の、異なるｐＨにおける安定性を比較した結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１００】
１ 作用極
２ 参照極
３ 対極
４ 電流計
５ 反応槽
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量ＡＴＰの新規な定量方法および当該定量方法を実施するために用いられるキットに関するものであり、より詳細には、極微量のＡＴＰをＡＴＰ増幅−サイクリング法によって比色定量または電気的定量が可能なレベルまで増幅させ定量する方法、および当該方法を実施するために用いられるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、ＡＴＰの定量には、ホタル由来のルシフェラーゼの存在下でＡＴＰと発光基質であるルシフェリンを反応させて発する光を測定する方法（非特許文献１）が用いられている。発光は、ルシフェラーゼと２価の金属イオン（Mg2+、Mn2+など）の存在下で以下の反応により生じる。
ホタルルシフェリン＋ATP＋O2＋H2O→オキシルシフェリン＋AMP＋PPi＋CO2＋光
上記ルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光法によるＡＴＰの定量は、感度が良好であり迅速性にも優れているため、発光法以外のＡＴＰ定量方法はほとんど実用化されていない。
【０００３】
上記の方法以外にＡＴＰを定量する方法が提案されている。例えば、グルコースを定量する際に広く用いられているヘキソキナーゼ法をＡＴＰの定量に用いる方法が知られている。この方法は、図１に示したように、グルコースとＡＴＰをＭｇイオン存在下でヘキソキナーゼ（ＨＸ）の作用により反応させグルコース−６−リン酸を生成させ（図１（１））、次いでグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６Ｐ−ＤＨ）の作用で６−ホスホグルコノラクトンおよび電子を生成させる。この電子の授与体としてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を加えておくと、生じた電子によってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとなる（図１（２））。ここで色原体の存在下でジアホラーゼを作用させると、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは酸化されてＮＡＤまたはＮＡＤＰに戻ると共に色原体が還元され呈色する色素が生じる（図１（３））。すなわち、過剰のグルコースを含んだ反応液に測定しようとするＡＴＰを含んだ試料を添加することにより、ＡＴＰを比色定量できる。しかしながら、この方法は感度が低く、検出限界は３００ｐｍｏｌ（３×１０−１０ｍｏｌ）程度である。
【０００４】
そこで感度を上昇させるために、消費されたＡＴＰを再生することによって反応を増幅する方法が開発されている。すなわち、ＡＴＰから生成したＡＤＰにリン酸を供与してＡＴＰに再生する反応を同時に行わせる方法である。この方法は、ＡＴＰサイクリング法と呼ばれている。このＡＴＰサイクリング法を上記ヘキソキナーゼ法に適用することにより感度が約１０００倍上昇し、検出限界は３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度となる。
【０００５】
ＡＴＰサイクリング法を用いたＡＴＰ定量方法としては、例えば、特許文献１および非特許文献２には、ＡＴＰがグルコースと反応してグルコース−６−リン酸を生成することで生じたＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼの作用によりホスホエノールピルビン酸からリン酸を供与してＡＴＰに再生することで反応を増幅させ、その結果、増加したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを測定する方法が開示されている。また、特許文献２にはアセチルリン酸およびアセテートキナーゼを用いてＡＤＰをＡＴＰに再生させ、ジアホラーゼの作用により生じる色素を増加させることで、土壌微生物から遊離させたＡＴＰ量を目視により測定する方法が開示されている。
【０００６】
また、本発明者らは、微量のＡＴＰを検出するために、ＡＴＰを連鎖的に増幅させる方法（ＡＴＰ増幅法）を開発し（特許文献３）、さらにこのＡＴＰ増幅法を改良して細胞１個レベルの微生物のＡＴＰをルシフェリン／ルシフェラーゼ系による発光法で検出できることを報告している（非特許文献３）。
【特許文献１】特開昭６４−２３９００号公報（昭和６４年１月２６日公開）
【特許文献２】特開２００３−２２５０９８号公報（平成１５年８月１２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９９３９０号（公開日：平成１３年１０月３０日）
【非特許文献１】DeLuca, M., and McElroy, W. D., Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 26, 921-925 (1974).
【非特許文献２】Hansen, E. H., Gundstrup, M., Mikkelsen, H. S., Determination of minute amount of ATP by flow injection analysis using enzyme amplification reactions and fluorescence detection. Journal of Biotechnology, 31, 369-380 (1993).
【非特許文献３】Satoh, T., Kato, J., Takiguchu, N., Ohtake, H., and Kuroda, A., ATP Amplification for Ultrasensitive Bioluminescence Assay: Detection of a Single Bacterial Cell. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 1216-1220 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、現在最も実用化されているＡＴＰ定量方法は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系を利用した方法であるが、発光を測定するための測定機器を用いることが必要である。通常このような機器は、発光によって生じる光子を検出しているので、機器の内部に光学装置が必要であり、小型化・単純化することには限界がある。そのため、測定機器のコストダウンを図ることも困難である。
【０００８】
そこで、高価な測定機器を必要とせず、簡便かつ高感度にＡＴＰを定量できる方法の開発が望まれている。
【０００９】
発光を測定する高価な測定機器を必要としないＡＴＰの定量方法としては、上述のように、例えば、目視可能な比色によりＡＴＰを検出する方法が知られている。しかしこの方法では、検出するためには３００ｐｍｏｌ（３×１０−１０ｍｏｌ）程度以上のＡＴＰが必要である。
【００１０】
しかしながら、例えば大腸菌Ｏ１５７は数十匹（ＡＴＰとして１０−１６ｍｏｌ程度）でヒトへの感染が可能になる。それゆえ、実際のＡＴＰ検出の現場では、３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）程度の検出感度が必要であり、上記比色による検出方法で検出可能なレベルと比較した場合、１,０００,０００倍の差がある。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高価な測定機器が必要なルシフェリン／ルシフェラーゼ系を利用しない簡便なＡＴＰ定量方法であって、数百ａｍｏｌレベルの検出感度を有するＡＴＰ定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討を行った。
【００１３】
上述のように、ＡＴＰを増幅する方法としてはＡＴＰサイクリング法およびＡＴＰ増幅法が知られている。そこで、それぞれの技術の特徴を精査した。その結果、ＡＴＰ増幅法では３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）程度から３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度への約１，０００倍の増幅が得意であることが分かった。問題点としては、最終到達点のＡＴＰの濃度を高く（３００ｆｍｏｌ以上に）設定した場合、反応液中のＡＭＰ濃度や酵素濃度を増加させる必要が生じ、それに伴う微量のＡＤＰやＡＴＰのコンタミネーションが測定精度に悪影響を及ぼすことが明らかとなった。すなわち、増幅量を増加させるために反応液中のＡＭＰおよび酵素の量を増やすと測定精度が下がり、３００ａｍｏｌの感度を実現できないというジレンマが生じた。そこで、微量のＡＤＰやＡＴＰのコンタミネーションが測定精度に影響を及ぼさない範囲で、反応液中のＡＭＰ濃度および酵素濃度を最適化すると、３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）程度から３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度への約１，０００倍の増幅が最適であることが見出された。
【００１４】
また、ＡＴＰサイクリング法では、３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）程度の濃度以上のＡＴＰを比色により検出できるレベルの３００ｐｍｏｌ（３×１０−１０ｍｏｌ）程度まで１,０００倍程度増幅することは可能であるが、３００ｆｍｏｌ程度以下のＡＴＰを比色により検出できるレベルまで増幅することは困難であることが明らかとなった。しかしながら、ＡＴＰサイクリング法の特徴として、極微量のＡＤＰのコンタミネーションによる測定感度減少は見られなかった。すなわち、ＡＴＰ増幅法に比べ、ＡＴＰサイクリング法はＡＤＰのコンタミネーションによる測定精度への悪影響を受けず、それゆえ反応液中の酵素濃度を増やすことが可能であることが見出された。
【００１５】
以上の結果をまとめると、ＡＴＰ増幅法は超微量（１０−１６ｍｏｌ程度）のＡＴＰを微量（１０−１３ｍｏｌ程度）まで増幅し、ＡＴＰサイクリング法は微量（１０−１３ｍｏｌ程度）のＡＴＰをさらに増幅するのに有利であることが判明した。また、微量ＡＤＰのコンタミネーションは、ＡＴＰ増幅法の測定精度を低下させるが、ＡＴＰサイクリング法に影響を及ぼさないことが判明した。したがって、両方法の組み合わせの順序としては、ＡＴＰ増幅法を先に行い、その後ＡＴＰサイクリング法を後で行うことが最適であることが見出された。この組み合わせにより、お互いの不得意な部分を補って、合計１,０００,０００倍の増幅が可能であることが予想された。
【００１６】
そこで、本発明者らは、ＡＴＰ増幅法およびＡＴＰサイクリング法を実際に組み合わせて微量ＡＴＰの定量を試みたところ、予想に反して予期した結果が得られなかった。それどころか、ＡＴＰサイクリング法単独の場合より検出感度が低下するという結果が得られた（図７、不活化行程を行わない場合参照）。この原因を究明したところ、ＡＴＰ増幅法で用いられるアデニレートキナーゼがＡＴＰサイクリング法を阻害していることを見出した。すなわち、アデニレートキナーゼはＡＴＰサイクリング法におけるヘキソキナーゼと拮抗してしまうことが原因であることが明らかとなった。そこで、ＡＴＰ増幅法が終了した段階で、アデニレートキナーゼの活性を失わせるべく、高温による不活化工程を設けることで、この問題点を克服した。
【００１７】
しかしながら、不活化工程を設けるにあたり、リン酸供与体が同時に分解してしまうことは問題である。そこで、このような新たな問題が生じないために、リン酸供与体の安定性を考慮した結果、ポリリン酸が最も有利であると考えられた。
【００１８】
以上の検討により、従来不可能であった１,０００,０００倍のＡＴＰ増幅が可能となり、その結果、１０−１６ｍｏｌ程度の超微量のＡＴＰを、比色により検出可能な本発明を完成させるに至った。
【００１９】
すなわち本発明に係る方法は、試料中に含まれるＡＴＰを定量する方法であって、試料から抽出したＡＴＰを増幅させるＡＴＰ増幅工程、ＡＴＰ増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程を包含することを特徴としている。
【００２０】
上記構成により、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系による発光法を用いずに、比色法のような簡便な方法で、極微量のＡＴＰを定量することが可能となる。
【００２１】
上記ＡＴＰサイクリング工程では、ＡＤＰをＡＴＰに再生するためにポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることが好ましく、上記ＡＴＰ増幅工程では、ＡＭＰ、アデニレートキナーゼ、ポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることが好ましい。さらに、上記リン酸化可能な化合物がグルコースであり、上記リン酸化化合物がグルコース−６−リン酸であることが好ましい。
【００２２】
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を定量することにより行われることが好ましい。より具体的には、上記酸化還元反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下で、ジアホラーゼの作用により還元されて可視光領域で呈色する色素を生じる色原体を用いることで比色定量する方法を挙げることができる。また、酸化還元反応において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下で、ジアホラーゼの作用によりフェリシアン化イオンが還元され、生じたフェロシアン化イオンから電子を電極に受け渡し、電気的に定量する方法を挙げることができる。
【００２３】
本発明に係るキットは、上記本発明に係る方法を実施するために用いられるキットであって、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ＡＭＰ、グルコース、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼおよび色原体またはフェリシアン化化合物を備えることを特徴としている。
【００２４】
上記構成のキットを用いることにより、本発明に係る方法を簡便かつ迅速に実施することが可能となる。
【００２５】
また、本発明には、以下のＡＴＰ定量方法が含まれる。
【００２６】
（Ｉ）ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物を生成させるリン酸化化合物生成工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【００２７】
（II）ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【００２８】
上記構成により、従来実現されていない電気的な信号によりＡＴＰを定量する方法を実現することが可能となる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の方法は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系による発光法を用いずに、比色法や電気的定量法により簡便にＡＴＰを定量でき、しかも、従来比色によりＡＴＰを検出する方法に比べて、１,０００,０００倍、また、ＡＴＰサイクリングサイクリング法を併用したヘキソキナーゼ法による比色検出感度より約１,０００倍の超高感度で極微量のＡＴＰを定量できるという効果を奏する。また、電気的な信号により超微量のＡＴＰを検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
（１）ＡＴＰ定量方法
本発明のＡＴＰ定量方法は、試料から抽出したＡＴＰを増幅させるＡＴＰ増幅工程、ＡＴＰ増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程を包含するものであればよい。以下、各工程について順に説明する。なお、上記各工程以外の工程が設けられていてもよく、上記以外の工程の内容は限定されない。
【００３２】
〔ＡＴＰ増幅工程〕
ＡＴＰ増幅工程では、試料から抽出したＡＴＰを増幅させる。
【００３３】
本方法により定量する対象物質はＡＴＰである。したがって試料はＡＴＰを含む可能性があるものであればよい。ＡＴＰは、動物、植物、微生物などの全ての生物に存在するエネルギー物質であるので、生物由来の試料が本発明の対象試料となり得る。
【００３４】
本方法は超微量のＡＴＰを定量することができるため、本方法の適用対象としては、例えば、抗ガン剤の薬効試験として、アポトーシスが起きて死滅した細胞の検出、生物が存在した痕跡として残るＡＴＰの検出、衛生検査現場における将来微生物が生息するであろう食品残渣の検査、極少数の微生物の検出などを挙げることができる。なかでも微生物の検出に本発明の方法を適用すれば、非常に簡便に、かつ、極少数の微生物の存在を確認することができるため、微生物を含む可能性のある試料が本発明の対象試料として好適である。
【００３５】
試料からＡＴＰを抽出する方法は特に限定されるものではなく、試料の種類に応じて公知の方法から適宜選択して用いればよい。例えば、細胞を含む試料や微生物を含む試料からＡＴＰを抽出する場合には、物理的手段（例えばホモジナイザー、超音波など）により細胞または微生物を破砕する方法、酵素（例えばリゾチームなど）により細胞または微生物の膜を破砕する方法、界面活性剤（例えばTritonX-100（商品名）、Tween20（商品名）など）により細胞または微生物の膜を破砕する方法を用いることができる。
【００３６】
しかしながら、細胞を破砕等するのみでは、細胞中に含まれるポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼなどの酵素が、以下に説明するＡＴＰ増幅反応に影響を及ぼす可能性があるため、細胞を破砕等してＡＴＰを抽出した後に加熱処理を行って酵素を失活させるか、細胞を加熱処理することによりＡＴＰを溶出させる方法を用いることが好ましい。
【００３７】
ＡＴＰの増幅方法は特に限定されないが、本発明者らが開発した特許文献３および非特許文献３に記載の方法を好適に用いることができる。すなわち、ＡＭＰ、アデニレートキナーゼ（以下、「ＡＤＫ」と略記する）、ポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」と略記する）を用いる方法である。以下、ＡＴＰ増幅方法の一例として、本発明者らが開発したＡＭＰ、ＡＤＫ、ポリリン酸化合物およびＰＰＫを用いる方法について説明する。
【００３８】
ＡＴＰ増幅反応を触媒するＡＤＫは、ＡＭＰとＡＴＰとを反応させたとき、２分子のＡＤＰを生じさせる酵素であり、当該酵素活性を有するものは全てＡＤＫに含まれる。また、ＰＰＫはＡＤＰとポリリン酸化合物（ＰｏｌｙＰｎ）とを反応させ、ＡＴＰとポリリン酸化合物（ＰｏｌｙＰｎ−１）とに変換する酵素であり、当該酵素活性を有するものは全てＰＰＫに含まれる。
【００３９】
ポリリン酸化合物としては、ポリリン酸あるいはその塩を好適に用いることができる。好ましくは１０個〜１０００個、より好ましくは１０個〜１００個のリン酸が直鎖状に重合したものが用いられる。ポリリン酸は細菌由来でもよく、化学合成で得られたものでもよい。あるいは、ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰから合成したものでもよい。以下、説明の便宜上、ポリリン酸化合物を単にポリリン酸と称する。
【００４０】
このＡＴＰ増幅反応は、図２に示すように、ＡＴＰが存在するとＡＤＫによってＡＴＰからＡＭＰへのリン酸転移反応が起こり２分子のＡＤＰが生成する（第１反応）。生じた２分子のＡＤＰは、ＰＰＫの作用によりポリリン酸化合物（図中ＰｏｌｙＰｎ）からリン酸基を受け取り、２分子のＡＴＰを生じる（第２反応）。以上が図２に１回目として示されている。生じた２分子のＡＴＰは、再度第１反応に使用され、ＡＤＫによってＡＭＰへのリン酸転移反応が起こり４分子のＡＤＰを生成する。この４分子のＡＤＰは第２反応でＰＰＫによって４分子のＡＴＰに変換される（図中２回目）。このように過剰のＡＭＰとポリリン酸を存在させて、ＡＤＫとＰＰＫとの平衡状態をそれぞれＡＤＰ生成方向（第１反応）およびＡＴＰ生成方向（第２反応）に向かわせるようにし、第１反応と第２反応とを１つの反応系とし、ｎ回この反応系を繰り返すことにより、１個のＡＴＰが２ｎ個に増幅される。
【００４１】
上記ＡＤＫとＰＰＫとは別のタンパク質であるので、それぞれ別のタンパク質としてＡＴＰ増幅系に用いればよいが、ＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質としてもよい。融合タンパク質とすれば、ＡＤＫとＰＰＫとを個々に用いた場合、両酵素の活性に違いがあると反応効率が低下するが、融合タンパク質とした場合にはこのような問題は生じない。また、ＡＤＫとＰＰＫとが近接するため拡散律速にならず、効率良く反応が進む。さらに、２つの酵素を同時に調製できるので、調製が容易となる。
【００４２】
ＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質は、ＡＤＫをコードする遺伝子ａｄｋとＰＰＫをコードする遺伝子ｐｐｋとを連結した発現ベクターを公知の方法により構築し、適切な宿主細胞に導入して発現させることにより製造することができる。具体的には、例えば非特許文献３に記載されている手順で作製することができる。
【００４３】
上記ＰＰＫ、またはＡＤＫとＰＰＫとの融合タンパク質はＡＤＰ除去処理を施されていることが好ましい。ＰＰＫには不純物としてＡＤＰが結合している場合がある。このＰＰＫに結合しているＡＤＰは、ポリリン酸の存在下でＰＰＫの基質とされ得、このＡＤＰがＰＰＫによりＡＴＰに変換され得る。すなわち、図２に示すような反応系において、ＡＴＰ非存在下であっても、まず第２反応であるＡＤＰからＡＴＰへの反応が生じ、このＡＴＰが第１反応で使用されることにより、自動的にＡＴＰ増幅反応が開始されることになる。
【００４４】
上記ＡＤＰ除去処理の方法は特に限定されるものではないが、例えばアピラーゼ処理を挙げることができる。アピラーゼはＡＴＰまたはＡＤＰからリン酸基を除去し、ＡＭＰを生成する。
【００４５】
ＡＴＰ増幅反応は、適切な緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液中で行うことができる。また、緩衝液には、例えばＭｇイオンなどの二価金属イオンが含まれていることが好ましい。反応温度は２０℃以上４０℃以下が好ましく、２５℃以上３０℃以下がより好ましい。２０℃より低いと酵素活性が低くＡＴＰが充分増幅されず、４０℃を超えると酵素が失活することによりＡＴＰが充分増幅されない。反応時間は５分以上１２０分以下が好ましく、１０分以上６０分以下がより好ましい。５分未満ではＡＴＰの増幅量が少ないため微量ＡＴＰを検出できず、１２０分を超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションにより測定精度が悪くなる。
【００４６】
ＡＴＰ増幅工程において増幅されるＡＴＰ量は、後段のＡＴＰサイクリング工程においてＡＴＰサイクリング反応に引き継がれ、発光反応を用いない比色等により検出できる量であればよい。したがって、ＡＴＰ増幅工程では少なくとも１ｆｍｏｌ以上にＡＴＰを増幅できればよい。このために、ＡＴＰ増幅反応液中のＡＭＰ濃度は６μＭ以上２５μＭ以下が好ましく、１２μＭ以上１５μＭ以下がより好ましい。６μＭより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、２５μＭを超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションにより測定精度が悪くなる。ＡＴＰ増幅反応液中のポリリン酸濃度は０．４ｍＭ以上６ｍＭ以下が好ましく、２．７ｍＭ以上５ｍＭ以下がより好ましい。０．４ｍＭより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、６ｍＭを超えると反応速度が速くなりすぎて測定精度が悪くなる。また、ＡＴＰ増幅反応液中のＡＤＫ濃度は０．４５μｇ／ｍＬ以上４μｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．９μｇ／ｍＬ以上２μｇ／ｍＬ以下がより好ましい。０．４５μｇ／ｍＬより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、４μｇ／ｍＬを超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションや反応速度が速くなりすぎることが原因で測定精度が悪くなる。また、ＡＴＰ増幅反応液中のＰＰＫ濃度は１．５μｇ／ｍＬ以上１２．５μｇ／ｍＬ以下が好ましく、３μｇ／ｍＬ以上６．５μｇ／ｍＬ以下がより好ましい。１．５μｇ／ｍＬより少ないと十分ＡＴＰが増幅されず、１２．５μｇ／ｍＬを超えるとＡＴＰまたはＡＤＰのコンタミネーションや反応速度が速くなりすぎることが原因で測定精度が悪くなる。
【００４７】
ＡＴＰ増幅反応の反応液量は特に限定されない。後段の定量工程で用いられる方法や用いる実験器具に応じて適宜選択すればよい。
【００４８】
〔不活化工程〕
不活化工程では、上記ＡＴＰ増幅工程で用いられたＡＤＫを不活化させる。
【００４９】
本発明者らは、上記ＡＴＰ増幅反応と後述のＡＴＰサイクリング反応を同時に行うとＡＴＰサイクリング反応が阻害されることを見出し、この原因がＡＤＫ活性にあることを見出した。そして、ＡＤＫ活性を熱処理により失活させた場合には、ＡＴＰサイクリング反応が阻害されないことを確認した。
【００５０】
本不活化工程で用いる方法としては、増幅したＡＴＰに影響を及ぼすことなくＡＤＫ活性を不活化できる方法であればよい。具体的には、例えば、熱処理を挙げることができる。熱処理温度は、５０℃以上１００℃以下が好ましく、７０℃以上１００℃以下がより好ましい。５０℃より低いと十分に酵素活性の不活化が行えず、１００℃を超えるとＡＴＰの分解が懸念される。また、処理時間は１分以上１５分以内が好ましく、１分以上３分以内がより好ましい。１分より短いとＡＴＰの十分に酵素活性の不活化が行えず、１５分より長いとＡＴＰの分解が懸念される。熱処理以外の方法としては、例えば、ＡＤＫ活性阻害剤、塩、キレート剤などを挙げることができる。
【００５１】
〔ＡＴＰサイクリング工程〕
ＡＴＰサイクリング工程では、上記ＡＴＰ増幅工程で増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させる。
【００５２】
リン酸化可能な化合物としては、ＡＴＰからリン酸基が１個転移されてリン酸化化合物に変換される化合物であればよい。このような化合物としては、具体的には、例えばグルコース、フルクトース、ラクトースなどを挙げることができる。また、リン酸化可能な化合物とＡＴＰを反応させてリン酸化化合物とＡＤＰを生じる反応には、ＡＴＰからリン酸基を転移させる酵素（キナーゼ）を作用させることが必要である。この反応においては、リン酸化可能な化合物（出発物質）に何を選択するかにより、用いる酵素および生成されるリン酸化化合物が決定される。
【００５３】
上記反応により生じるＡＤＰは、リン酸供与化合物の存在下でＡＤＰにリン酸基を転移させる酵素の作用によりＡＴＰに再生される。この再生されたＡＴＰも上記リン酸化可能な化合物と反応してリン酸化化合物を生成する。このように使用されてＡＤＰとなったＡＴＰを元のＡＴＰに再生し、元の反応を増幅する方法は、一般に「ＡＴＰサイクリング法」と呼ばれている。
【００５４】
ここで、ＡＤＰをＡＴＰに再生しなければ、１分子のＡＴＰに対して１分子のリン酸化化合物が生成されるが、例えばＡＴＰを１０００回再生させればリン酸化化合物量は１０００倍になる。再生回数は時間によって制御することができるので、一定時間後のリン酸化化合物量は試料中に含まれているＡＴＰ量の再生回数倍であり、元のＡＴＰ量に比例する。これによって、ＡＴＰの検出感度をさらに上昇させることができる。
【００５５】
ＡＴＰサイクリング反応に用いるリン酸供与化合物およびリン酸転移酵素の組み合わせとしては、例えば、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ、アセチルリン酸とアセテートキナーゼなどを挙げることができるが、特に限定されない。なかでも、ポリリン酸とＰＰＫの組み合わせを用いることが好ましい。
【００５６】
後述の実施例で示すように、ポリリン酸はアセチルリン酸やホスホエノールピルビン酸と比較して非常に安定な化合物であるという利点を有している。すなわち、ポリリン酸は、どのような温度やｐＨの条件の溶液中でも安定であるため、ＡＤＰからＡＴＰへの再生を長時間、安定して行うことができ、また特に不活化行程において分解しないので有利である。また、リン酸化合物を効率良く増幅できるため、微量のＡＴＰを高感度で定量できる。なぜなら、ホスホエノールピルビン酸やアセチルリン酸は１分子中に１個のリン酸基を有するのみであるが、ポリリン酸は１分子中に分子量に依存して多数のリン酸基を有するため、１分子で多数のＡＤＰをＡＴＰに生成できるからである。さらに、ホスホエノールピルビン酸やアセチルリン酸と比較して、安価に入手できるという利点も有する。
【００５７】
図３には、リン酸化可能な化合物をグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＡＴＰと反応して生成されるリン酸化化合物をグルコース−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、以下「Ｇ６Ｐ」と略記する）とし、ＡＴＰサイクリングにポリリン酸（図中ＰｏｌｙＰｎ）およびおよびＰＰＫを用いる場合を例示した。この場合グルコースからＧ６Ｐを生成する反応を触媒する酵素としては、図３に示したヘキソキナーゼ（図中Ｈｘ）を挙げることができる。またグルコキナーゼを用いることもできる。グルコキナーゼとヘキソキナーゼの違いについては、それぞれの酵素の性質において、グルコースへの反応や、反応の特異性などに若干の違いはあるものの、どちらの酵素も、その反応の本質において、ＡＴＰの共存下でグルコースをＧ６Ｐに変換しＡＤＰを生じる点は同じであるため、本発明の用途においては両酵素に差は認められない。
【００５８】
本ＡＴＰサイクリング工程の反応は、リン酸化可能な化合物、当該リン酸化可能な化合物にＡＴＰからリン酸基を転移させる酵素、ＡＤＰにリン酸を供与する化合物およびＡＤＰにリン酸基を転移させる酵素が同時に存在する状態、例えば上記化合物等がすべて溶解された適当な緩衝液にＡＴＰを含む試料を添加することで進行させることができる。
【００５９】
反応液に用いる緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液などを挙げることができる。また、反応液に含まれる各化合物や酵素の濃度は、反応が十分に行われる量であればよく、用いる化合物や酵素に応じて適宜選択すればよい。
【００６０】
〔定量工程〕
定量工程では、上記ＡＴＰサイクリング工程で生成したリン酸化化合物を定量する。リン酸化化合物を定量することによって、試料中のＡＴＰ量を間接的に定量することができる。
【００６１】
生成したリン酸化化合物の定量方法は特に限定されるものではない。リン酸化可能な化合物として何を用いるかによって生成するリン酸化化合物は異なるので、生成したリン酸化化合物の種類に応じて、公知の定量方法を用いて測定することができる。
【００６２】
リン酸化化合物の定量方法の一例として、当該リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を定量する方法を挙げることができる。また、当該酸化還元反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下「ＮＡＤ」と略記する）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下「ＮＡＤＰ」と略記する）が用いられること好ましい。
【００６３】
図４（ａ）および（ｂ）には、Ｇ６Ｐを開始物質とする酸化還元反応により受け渡された電子の総量を定量する方法を例示した。Ｇ６ＰはＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、図中Ｇ６ＰＤＨ）の作用により酸化されて６−ホスホグルコノラクトン（Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生成する。その際、ＮＡＤ等は還元されてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生じる。ここまでは図４（ａ）および（ｂ）とも共通である。この時点で生じたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを直接定量することが可能である。例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは３４０ｎｍの吸光度を測定することにより定量できる。
【００６４】
図４（ａ）では、Ｇ６Ｐの酸化の際に生じたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがジアホラーゼの作用により酸化されＮＡＤまたはＮＡＤＰに戻り、その際色原体が還元され可視光領域で呈色する色素を生じる。生じた色素の量（発色量）とＡＴＰ量は比例するため、発色量を測定することでＡＴＰを定量することができる。発色量は分光光度計を用いて測定することができる。また、あらかじめ検量線や比色表を作成しておくことにより、目視判定も可能である。
【００６５】
上記色原体は、還元型脱水素化剤（例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）から受け渡された電子により還元されて可視光領域（３００ｎｍ〜８００ｎｍ）で呈色する色素を生じるものであればよい。すなわち、色原体は当該反応により可視領域に吸収が無いものが有るように変化するか、吸収領域が有るものが無いように変化するか、または吸収スペクトルが異なるように変化するかのいずれかでもよい。
【００６６】
色原体は上述の条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、メチレン・ブルー、レザズリンなどの色素やテトラゾリウム類等を挙げることができる。
【００６７】
なかでもテトラゾリウム類が好適である。テトラゾリウムとしては、例えば、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレット、ＭＴＴ、ネオテトラゾリウム、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム、テトラニトロ・ブルー・テトラゾリウム、テトラゾリウム・ブル、テトラゾリウム・レッド（トリフェニル・テトラゾリウム）、テトラゾリウム・バイオレット、チオカルバミル・ニトロ・ブルー・テトラゾリウム、ＸＴＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３等、または、それらの塩等を挙げることができる。
【００６８】
上述のようにＡＴＰを呈色反応により定量する場合には、例えば図４（ａ）の場合、グルコース、ヘキソキナーゼ、ポリリン酸、ＰＰＫ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、ジアホラーゼおよび色原体が同時に存在する状態、例えば上記化合物等がすべて溶解された適当な緩衝液を、ＡＴＰ増幅工程および不活化工程を終えたＡＴＰ試料に添加し、発色量を分光光度計で測定することができる。あるいは、グルコース、ヘキソキナーゼ、ポリリン酸、ＰＰＫ、およびＮＡＤまたはＮＡＤＰが溶解された適当な緩衝液を、ＡＴＰ増幅工程および不活化工程を終えたＡＴＰ試料に添加して反応させた後、ジアホラーゼおよび色原体を添加し、発色量を測定してもよい。ただし、これらに限定されるものではない。
【００６９】
また、各化合物や酵素の濃度は特に限定されず、反応が十分行われる量を適宜選択して用いればよい。
【００７０】
図４（ｂ）では、引き続きジアホラーゼの作用によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは酸化されＮＡＤまたはＮＡＤＰに戻り、その際フェリシアン化イオン（Fe(CN)63-）を還元してフェロシアン化イオン（Fe(CN)64-）が生じる。例えば、図５に示すような作用極１、参照極２および対極３を反応槽５内の反応液中に挿入し、作用極１と参照極２との間に０．１Ｖ以上１．５Ｖ以下、好ましくは０．４Ｖ程度の電圧をかけると、上記フェロシアン化イオン（Fe(CN)64-）はフェリシアン化イオン（Fe(CN)63-）に変化して電子を作用極に受け渡すので電流が流れるようになる。なお、１．５Ｖを超えると水の電気分解が始まり、好ましくない。この電流を作用極１と対極２との間に設置した電流計４で測定することにより、当該酸化還元反応で受け渡された電子の総量を測定することができる。なお、ジアホラーゼによりＮＡＤＨを電流として検出する方法は、例えば、Analytica Chemica Acta 347: 63-70 (1997) に開示されている。ただし、ＡＴＰを電気的に検出する方法は、未だ実用化されていない。
【００７１】
上述のように、ＡＴＰ量を電流として測定する場合には、例えば図５に示されるような構成を有する検出計を用いて、反応槽５内にグルコース、ヘキソキナーゼ、ポリリン酸、ＰＰＫ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、ジアホラーゼおよびフェリシアン化イオン（Fe(CN)63-）をすべて溶解させた適当な緩衝液を入れておき、そこにＡＴＰ増幅工程および不活化工程を終えたＡＴＰ試料を添加することで電流の測定を行うことができる。ただし、これに限定されるものではない。
【００７２】
また、各化合物や酵素の濃度は特に限定されず、反応が十分行われる量を適宜選択して用いればよい。
【００７３】
上述の電気的にＡＴＰ量を測定する方法は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系を利用した方法で用いる測定機器と比較して小型化、簡便化が可能である。また、現在、酵素電極法で微量のグルコース等を測定する機器が市販されており、このような機器をＡＴＰ量の測定に利用することも可能であり、ＡＴＰ定量のコストを低下させることに繋がる。
【００７４】
（２）ＡＴＰ定量キット
本発明のキットは、上述の本発明のＡＴＰ定量方法を実施するために用いられるキットであればよい。キットの構成としては、ＡＴＰ増幅反応に用いられる試薬、ＡＴＰサイクリング反応およびＡＴＰサイクリング反応に用いられる試薬、リン酸化化合物の定量に用いられる試薬が含まれていることが好ましい。
【００７５】
具体的には、例えば、ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ＡＭＰ、グルコース、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼおよび色原体またはフェリシアン化化合物を備えるキットを挙げることができる。
【００７６】
上記例示したもの以外にキットに含まれることが好ましいものとしては、例えば上記化合物等を溶解するための緩衝液、ＡＴＰ標準液、試料からＡＴＰを抽出するための試薬、反応に用いるプレートなどを挙げることができるが、限定されるものではない。
【００７７】
色原体が含まれるキットはＡＴＰを呈色反応によって定量する方法に使用でき、フェリシアン化化合物が含まれるキットはＡＴＰを電気的に定量する方法に使用できる。もちろん、１キット中にフェリシアン化化合物と色原体の両方が含まれるキットとしてもよい。
【００７８】
上記化合物等は、実際にＡＴＰ量を測定するときの反応時に同時に同一の溶液中に存在すればよく、反応前はその形態に特に限定はない。したがって、キットにはそれぞれ個別に、または同一に、またはいくつか組み合わされて、溶液状態、粉末状態、またはその他の状態で備えられていればよい。
【００７９】
キットに含まれる酵素（ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびジアホラーゼ）については、その供給源となる生物は特に限定されるものではなく、入手の容易さやコストを考慮して選択すればよい。
【００８０】
本発明のキットは、その構成にポリリン酸を備えている。このポリリン酸は非常に安定性が高いので、キットに含めるに際して安定性を高めるための方策を施す必要がなく、保存性に優れたキットを提供できるという利点を有している。また、ポリリン酸は安価であるため、キットの製造コストを低く抑えることができ、安価なキットを提供できるという利点を有している。
【００８１】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８３】
〔実施例１：比色によるＡＴＰの定量〕
ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法、およびヘキソキナーゼ法のみ、の３通りの方法を用いて比色によりＡＴＰ量を測定した。
【００８４】
（ｉ）実験材料
ＡＴＰ試料は、３．３×１０−４ｆｍｏｌ（０．３３ａｍｏｌ）〜３．３×１０７ｆｍｏｌ（３３ｎｍｏｌ）の範囲で公比１０の１２段階を用いた。
【００８５】
ＡＴＰ増幅溶液（２０μＬ／反応）の組成は、ＡＴＰ：上記各濃度、ＡＭＰ：１５μＭ、ポリリン酸（ｐｏｌｙＰ１５）：５ｍＭ、ＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質：１４．４μｇ／ｍＬ、ＭｇＣｌ２：８ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）：４０ｍＭとした。なお、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法およびヘキソキナーゼ法のみの場合は、上記よりＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質を除外した組成とした。
【００８６】
ＡＴＰサイクリング溶液（上記ＡＴＰ増幅反応液にＡＴＰサイクリング試薬１０μＬを加えて、合計３０μＬ／反応）の組成は、ヘキソキナーゼ：２４０μｇ／ｍＬ（３３ユニット／ｍＬ）、Ｇ６Ｐ脱水素酵素：５３μｇ／ｍＬ（１６．７ユニット／ｍＬ）、グルコース：１．５ｍＭ、ＮＡＤＰ：０．５ｍＭ、ＰＰＫ：６６．７μｇ／ｍＬとした。なお、ヘキソキナーゼ法のみの場合は、上記よりＰＰＫを除外した組成とした。
【００８７】
発色溶液（上記ＡＴＰサイクリング反応液に発色試薬１５．５μＬを加えて、合計４５．５μＬ／反応）の組成は、ＷＳＴ−１：２ｍＭ、ジアホラーゼ：５５μｇ／ｍＬ（０．５５ユニット／ｍＬ）とした。
【００８８】
（ｉｉ）実験方法
以下の手順で実験を行った。
(1) ２０μＬのＡＴＰ増幅反応溶液を２５℃で６０分間反応する。
(2) ９５℃で１分間処理し、酵素を不活化する。
(3) ＡＴＰサイクリング試薬１０μＬを添加し、２５℃で６０分間反応する。
(4) 発色試薬１５．５μＬを添加し、２５℃で１５分間反応する。
(5) 分光光度計を用いて、ＯＤ４５０を測定する。
【００８９】
なお、ＡＴＰ増幅を併用しない場合は、上記(3)から開始した。
【００９０】
（ｉｉｉ）結果
結果を図６に示した。図６から明らかなように、ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用した場合（図中、ＡＴＰ増幅＋サイクリング法）、ＡＴＰサイクリングのみを併用した場合（図中、サイクリング法のみ）、およびヘキソキナーゼ法による発色のみの場合（図中、これまでの発色法）のいずれも、試料中のＡＴＰ量に依存して吸光度の上昇が観察され、試料中のＡＴＰ量と吸光度が比例することが示された。しかし、試料を直接ヘキソキナーゼ法に適用した場合（ヘキソキナーゼ法による発色のみの場合）には、感度が非常に低く、検出限界は約３００ｐｍｏｌ（３×１０−９ｍｏｌ）であった。ＡＴＰサイクリングのみを併用した場合には、検出感度は約１０００倍上昇し、検出限界は約３００ｆｍｏｌ（３×１０−１３ｍｏｌ）であった。一方、ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用した場合には、検出感度がさらに約１０００倍上昇し、約３００ａｍｏｌ（３×１０−１６ｍｏｌ）のＡＴＰを検出することが可能であった。
【００９１】
また、図７に示したように、この方法では測定機器を用いずに、ＡＴＰの存在を目視判定することが可能であった。なお、不活化工程を行わない場合は、ＡＴＰサイクリングのみを併用した場合より感度が低下した。
【００９２】
〔実施例２：電流によるＡＴＰの定量〕
ヘキソキナーゼ：１０ユニット、Ｇ６Ｐ脱水素酵素：１０ユニット、ジアホラーゼ：５ユニット、グルコース：１．８ｍＭ、ＮＡＤＰ：０．６ｍＭ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）：３３ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：２６．４ｍＭ、ＭｇＣｌ２：２．６４ｍＭ、[Ｆｅ（ＣＮ）６]３−：２．４ｍＭを含む溶液４．８ｍＬを調製し、作用極１、参照極２および対極３を挿入した（図５参照）。スターラーを用いて溶液を混合し、安定化した後、１６．５ｍＭのＡＴＰを０．３ｍＬ添加した。
【００９３】
結果を図８に示した。図８から明らかなように、ＡＴＰ添加後から電流が流れ始め、３分後には３μＡ（３×１０−６Ａ）の電流が流れた。
【００９４】
〔実施例３：ポリリン酸およびアセチルリン酸の安定性の比較〕
３−１．異なる温度における安定性の比較
純水（ｐＨ７．０）にポリリン酸（シグマ社製）またはアセチルリン酸（シグマ社製）を１ｍＭとなるようにそれぞれ溶解した。このポリリン酸溶液およびアセチルリン酸溶液を、それぞれ４℃、１８℃または３７℃の温度条件で保存し、１２時間後に溶液中の遊離リン酸量を既知のモリブデンリン法によって測定し、これを分解量とみなして分解率を算出した。
【００９５】
結果を図９に示した。図９から明らかなように、ポリリン酸はいずれの温度においてもほとんど分解されず、非常に安定であった。一方、アセチルリン酸は４℃では比較的安定であったが、１８℃では１２時間後の残存率が約７５％、３７℃では１２時間後の残存率が約２５％であり、酵素反応に適した温度においては分解しやすいことが明らかとなった。
【００９６】
３−２．異なるｐＨにおける安定性の比較
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．２）または純水（ｐＨ７．０）に、ポリリン酸（シグマ社製）またはアセチルリン酸（シグマ社製）を１ｍＭとなるようにそれぞれ溶解した。各溶液を３７℃で保温し、１５分後、３０分後、６０分後および１２０分後にサンプリングして遊離リン酸量を既知のモリブデンリン法によって測定し、これを分解量とみなして分解率を算出した。
【００９７】
結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、ポリリン酸は中性（ｐＨ７．０）、酸性（ｐＨ５．２）、アルカリ性（ｐＨ７．８）のいずれのｐＨにおいてもほとんど分解されず、非常に安定であった。一方、アセチルリン酸はいずれのｐＨにおいても経時的に分解が進み、１２０分後の残存率はいずれも約５０％程度であった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は、ＡＴＰの検出・定量を実施している様々な分野において利用可能である。特に、微生物の検査が必要な食品産業、医薬品産業、臨床検査分野、環境衛生分野などでの利用に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ヘキソキナーゼ法によりＡＴＰを定量する反応原理を示す図である。
【図２】ＡＴＰ増幅反応の反応原理を示す図である。
【図３】ＡＴＰサイクリング法を併用したヘキソキナーゼ法によりＡＴＰを定量する反応原理を示す図である。
【図４】（ａ）はＧ６Ｐを開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を呈色により定量する反応原理を示す図であり、（ｂ）はＧ６Ｐを開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を電気的に定量する反応原理を示す図である。
【図５】ＡＴＰを電気的に定量する検出計の概略を示す図である。
【図６】ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法、およびヘキソキナーゼ法のみ、の３通りの方法を用いて比色によりＡＴＰを定量した結果を示すグラフである。
【図７】ＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法、ＡＴＰサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法、ヘキソキナーゼ法のみ、および不活化工程を行わないＡＴＰ増幅およびＡＴＰサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法の４通りの方法を用いて比色によりＡＴＰを定量したときの、反応液の色調を示す画像である。
【図８】反応系にＡＴＰを添加することにより電流が発生することを示すグラフである。
【図９】ポリリン酸およびアセチルリン酸の、異なる温度における安定性を比較した結果を示すグラフである。
【図１０】ポリリン酸およびアセチルリン酸の、異なるｐＨにおける安定性を比較した結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１００】
１ 作用極
２ 参照極
３ 対極
４ 電流計
５ 反応槽
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるＡＴＰを定量する方法であって、
試料から抽出したＡＴＰを増幅させるＡＴＰ増幅工程、
ＡＴＰ増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、
増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および
生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２】
上記ＡＴＰサイクリング工程では、ＡＤＰをＡＴＰに再生するためにポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＡＴＰ増幅工程では、ＡＭＰ、アデニレートキナーゼ、ポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記リン酸化可能な化合物がグルコースであり、上記リン酸化化合物がグルコース−６−リン酸であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を定量することにより行われることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記酸化還元反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が用いられることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記酸化還元反応では、さらにジアホラーゼおよび還元されることにより可視光領域で呈色する色素を生じる色原体が用いられ、受け渡された電子の総量を比色定量することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記色原体がテトラゾリウムであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記酸化還元反応では、さらにジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極が用いられ、受け渡された電子の総量を電気的に定量することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法を実施するために用いられるキットであって、
ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ＡＭＰ、グルコース、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼおよび色原体またはフェリシアン化化合物を備えることを特徴とするキット。
【請求項１１】
ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物を生成させるリン酸化化合物生成工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【請求項１２】
ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【請求項１】
試料中に含まれるＡＴＰを定量する方法であって、
試料から抽出したＡＴＰを増幅させるＡＴＰ増幅工程、
ＡＴＰ増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、
増幅されたＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および
生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２】
上記ＡＴＰサイクリング工程では、ＡＤＰをＡＴＰに再生するためにポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＡＴＰ増幅工程では、ＡＭＰ、アデニレートキナーゼ、ポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記リン酸化可能な化合物がグルコースであり、上記リン酸化化合物がグルコース−６−リン酸であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を定量することにより行われることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記酸化還元反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が用いられることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記酸化還元反応では、さらにジアホラーゼおよび還元されることにより可視光領域で呈色する色素を生じる色原体が用いられ、受け渡された電子の総量を比色定量することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記色原体がテトラゾリウムであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記酸化還元反応では、さらにジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極が用いられ、受け渡された電子の総量を電気的に定量することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法を実施するために用いられるキットであって、
ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ＡＭＰ、グルコース、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼおよび色原体またはフェリシアン化化合物を備えることを特徴とするキット。
【請求項１１】
ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物を生成させるリン酸化化合物生成工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【請求項１２】
ＡＴＰとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とＡＤＰとを生成させるとともに、生じたＡＤＰをＡＴＰに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるＡＴＰサイクリング工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するＡＴＰ定量方法であって、
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−２２３１６３（Ｐ２００６−２２３１６３Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３９８２５（Ｐ２００５−３９８２５）
【出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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