Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法
【課題】 Ｂ型肝炎ウイルスの感染の診断のために、病原ウイルスであるＢ型肝炎ウイルスを遺伝子型にかかわらず高感度かつ迅速に検出する方法を提供すること。
【解決手段】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、該プライマーを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるＢ型肝炎ウイルス感染の診断方法、並びにＢ型肝炎ウイルス感染を診断するためのキット。
【解決手段】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、該プライマーを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるＢ型肝炎ウイルス感染の診断方法、並びにＢ型肝炎ウイルス感染を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＢＶ」という場合がある。）の検出方法に関し、さらに詳しくは、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、当該プライマーを用いたＢ型肝炎ウイルスの検出方法、Ｂ型肝炎ウイルス感染の診断方法及びＢ型肝炎ウイルス感染を診断するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は、ＨＢＶによって引き起こされ、急性肝炎だけでなく、慢性肝炎、肝硬変の原因や、さらには肝癌に至る場合もある疾患であり、その感染者数は世界でおよそ４億人に達すると見積もられている。
【０００３】
Ｂ型肝炎の感染の診断は主として、ヒト血清中に存在するウイルス抗原または抗体の有無により行われている。また、ＨＢＶ ＤＮＡを測定する核酸検出法も高感度法として用いられている。最近では、Amplicor（商標）ＨＢＶモニター検査及びリアルタイム検出用のTaqman（商標）技術の双方を用い、より感度の高いＰＣＲ法において、ＨＢＶ ＤＮＡを検出し、定量化を行っている。
【０００４】
輸血用血液において、献血時の血液スクリーニングには、核酸検出法であるＰＣＲ法が用いられている。しかしながら、これらのウイルス検査であってもすり抜けが起こり、輸血による感染が発生するという社会的に大きな問題となっている。
【０００５】
そこで、迅速かつ高感度にＢ型肝炎ウイルスを検出できる検査法が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】公開平０３−４３１００号公報
【特許文献２】公開２０００−２０１６９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、現在知られている全ての遺伝子型のＨＢＶ（Ａ−Ｈ）に特異的な塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification）法によりＢ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、Ｂ型肝炎ウイルスのみを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１） 配列番号１で示されるＢ型肝炎ウイルスのＳ領域の、３０４番〜５２６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（３）Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の標的核酸上の３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５'末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（４）B型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５'末端から３'末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５'−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３'。
（ｂ）５'−（配列番号６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３'。
（５） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
（６） Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
（７） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＢ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｂ型肝炎ウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（８） Ｂ型肝炎ウイルスの感染を診断するための、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＢ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、現在知られている全ての遺伝子型のＨＢＶ（Ａ−Ｈ）を高感度かつ迅速に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において使用される試料としては、Ｂ型肝炎ウイルス感染が疑われる人間又は他の動物の生体由来の検体、例えば、血液、血清、血漿、髄液、精液、喀痰、うがい液、唾液、尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む検体なども試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行っても良い。
【００１１】
このような核酸の増幅は、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）で達成される。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法は、最低６つの領域を認識する４つのプライマーを使う特異性の高い核酸増幅法である。
【００１２】
ＬＡＭＰ法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５'末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＢとアウタープライマーＦ及びＢと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の相補鎖をＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＦＩＰと略す）、そして「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＢＩＰと略す）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、Ｆ３と略す）、「Ｂ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３と略す）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｂとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであっても良く、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であっても良い。
【００１３】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマー（Loop Primer）は、ダンベル構造の５'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の５'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００１４】
オリゴヌクレオチドは、公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、所望の塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの合成法も、公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組合せて、かかるオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。
【００１５】
本明細書における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、一般的に知られたものを選択することができる。ストリンジェントな条件として、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄する、という条件があげられる。
【００１６】
本発明者らはＢ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の塩基配列（配列番号１で示される塩基配列）から、プライマーセットとして次の１組を選定した。
（プライマーセット）
ＦＩＰ：5'-GATAAAACGCCGCAGACACATCCCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3' （配列番号１０）
ＢＩＰ：5'-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTGACAAACGGGCAACATACCTT-3' （配列番号１１）
Ｆ３ ：5'-CCAAAATTCGCAGTCCCCAA-3' （配列番号４）
Ｂ３ ：5'-GCAGGTTTTGCATGGTCC-3' （配列番号８）
ＬＦ ：5'-CAGCGATAACCAGGACAA-3' （配列番号５）
ＬＢ ：5'-TGTTGGTTCTTCTGGA-3' （配列番号９）
【００１７】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
【００１８】
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌などから精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
【００１９】
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）を用いて検出することができ、また、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００２０】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化する事ができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ、核酸合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１：プライマーの反応性の確認
ＨＢＶの全ての遺伝子型（Ａ〜Ｈ）を同感度に検出するため、Ｇｅｎｂａｎｋより遺伝子型８種類を含む計２９サンプルをもとに遺伝子型で共通なＳ領域を選定し、プライマーを作製した。プライマーの反応性の確認を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法により核酸の増幅を行うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成はＱＩＡＧＥＮ社に依頼し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）精製したものを使用した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＦＩＰ
１．６μＭ ＢＩＰ
０．２μＭ Ｆ３
０．２μＭ Ｂ３
０．８μＭ ＬＦ
０．８μＭ ＬＢ
Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １６Ｕ（ＮＥＢ）
【００２３】
上記反応溶液に、ＨＢＶプラスミドＤＮＡ（栄研化学で作製）を１０から１０６コピーまでの希釈系列を加えて、６０℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学）を用いて、リアルタイムに反応を検出した。図１は、ＨＢＶプラスミドＤＮＡを使用した場合の検出感度の結果を表すグラフである。図１に示したように、このプライマーセットについて、ＨＢＶプラスミドＤＮＡ１０コピーまでの増幅が確認された。
【００２４】
実施例２：増幅産物の確認
上記プライマーセットで増幅したＬＡＭＰ産物について、電気泳動及び制限酵素ＦｏｋＩでの確認を行った。図２は、電気泳動の結果を表す図である。図２のレーン２から明らかなように、ＬＡＭＰ産物特有のラダーパターンが確認された。また、ＦｏｋＩで処理したサンプル（レーン３）では、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に増幅されていることが明らかとなった。
【００２５】
実施例３：プライマーの評価（特異性試験）
市販されているＨＢＶジェノタイプ別陽性検体（Genotype A,B,C,D,E,F,G,H）各１サンプルずつの合計８種類をヒト正常血清で希釈しサンプルとした。サンプル濃度としては、あらかじめこれら検体をAmplicor(商標)ＨＢＶモニター（Roche社）で定量し、ヒト正常血清でそれぞれ３０、１００，１０００コピー/ｍLに希釈した。各検体の詳細は以下の通りである。Genotype A（Code Number：536550、ProMedDx社）、Genotype B（Code Number：339347、ProMedDx社）、Genotype C（Code Number：536863、ProMedDx社）、Genotype D（Code Number：536461、ProMedDx社）、Genotype E（Code Number：44858、teragenix社）、Genotype F（Code Number：27485、teragenix社）、Genotype G（Code Number：61827、teragenix社）、Genotype H（Code Number：78621、teragenix社）。
【００２６】
血清中のＨＢＶ―ＤＮＡを単離するために以下の方法で抽出した。ＨＢＶ陽性検体１００μＬに３００μＬの溶解試薬［５．７６Ｍ グアニジンチオシアン酸塩、１９４ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）］を加え混合し、室温で５分間放置した後、９５℃、１０分間インキュベートした。次に、氷上で３分間急冷し、１μＬのPellet Paint(Novagen社)と４００μＬのイソプロパノールを加え混合し、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を除去した後、７０％エタノールを適量加え、混合し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。最後に、上清を除去し、室温で５分間放置して、５μLの滅菌水で溶解した。この溶液をすべてＬＡＭＰ反応に持ち込んだ。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１よりすべてのジェノタイプの検体について１００コピー／ｍＬまで１００％検出でき、ジェノタイプ間で検出感度が一定であることが確認された。
【００２９】
実施例４：プライマーの評価（感度試験）
ＷＨＯの国際標準品であるＷＨＯ ｓｔａｎｄａｒｄ ＨＢＶ ＤＮＡ ９７／７４６（ＮＩＢＳＣ）をヒト正常血清で希釈したサンプルを用いた。抽出及びＬＡＭＰ反応は、実施例３と同じ操作を行った。
【００３０】
【表２】
【００３１】
表２よりウイルス濃度が１５ＩＵ／ｍＬまで１００％検出することができた。
【００３２】
実施例５：感度比較
市販品のＨＢＶ Sero-conversion panels（Impath-BCP）３セット（Catalog No.6277,6290,6291）を用いて、他の検出法［Amplicor ＨＢＶモニター（Roche社）、PCR、PRISM HBsAg test (Abott社)］との感度比較を行なった。なお、Amplicor ＨＢＶモニターは株式会社エスアールエルに測定依頼を行い、PCRとPRISM HBsAg testは、Impath-BCP社での測定結果が添付されていた。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
【表５】
【００３６】
ＬＡＭＰ法による結果を○または×で表した。表３〜５に示すようにＬＡＭＰ法が最も検出感度が良く、ウインドウピリオドが短縮された。まとめとして、ＬＡＭＰ法＞Amplicor ＨＢＶモニター＞PCR＞PRISM HBsAg testの順で検出感度が高かった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】感度試験の結果を表すグラフである。１０〜１０６は、アッセイ当たりのプラスミドＤＮＡのコピー数を表す。
【図２】電気泳動の結果を表す図である。レーン１は100bp ladder markerであり、レーン２はＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン３はＬＡＭＰ産物をＦｏｋＩで処理したサンプルである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＢＶ」という場合がある。）の検出方法に関し、さらに詳しくは、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、当該プライマーを用いたＢ型肝炎ウイルスの検出方法、Ｂ型肝炎ウイルス感染の診断方法及びＢ型肝炎ウイルス感染を診断するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は、ＨＢＶによって引き起こされ、急性肝炎だけでなく、慢性肝炎、肝硬変の原因や、さらには肝癌に至る場合もある疾患であり、その感染者数は世界でおよそ４億人に達すると見積もられている。
【０００３】
Ｂ型肝炎の感染の診断は主として、ヒト血清中に存在するウイルス抗原または抗体の有無により行われている。また、ＨＢＶ ＤＮＡを測定する核酸検出法も高感度法として用いられている。最近では、Amplicor（商標）ＨＢＶモニター検査及びリアルタイム検出用のTaqman（商標）技術の双方を用い、より感度の高いＰＣＲ法において、ＨＢＶ ＤＮＡを検出し、定量化を行っている。
【０００４】
輸血用血液において、献血時の血液スクリーニングには、核酸検出法であるＰＣＲ法が用いられている。しかしながら、これらのウイルス検査であってもすり抜けが起こり、輸血による感染が発生するという社会的に大きな問題となっている。
【０００５】
そこで、迅速かつ高感度にＢ型肝炎ウイルスを検出できる検査法が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】公開平０３−４３１００号公報
【特許文献２】公開２０００−２０１６９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、現在知られている全ての遺伝子型のＨＢＶ（Ａ−Ｈ）に特異的な塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification）法によりＢ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、Ｂ型肝炎ウイルスのみを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１） 配列番号１で示されるＢ型肝炎ウイルスのＳ領域の、３０４番〜５２６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（３）Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の標的核酸上の３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５'末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（４）B型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５'末端から３'末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５'−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３'。
（ｂ）５'−（配列番号６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３'。
（５） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
（６） Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
（７） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＢ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｂ型肝炎ウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（８） Ｂ型肝炎ウイルスの感染を診断するための、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＢ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、現在知られている全ての遺伝子型のＨＢＶ（Ａ−Ｈ）を高感度かつ迅速に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において使用される試料としては、Ｂ型肝炎ウイルス感染が疑われる人間又は他の動物の生体由来の検体、例えば、血液、血清、血漿、髄液、精液、喀痰、うがい液、唾液、尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む検体なども試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行っても良い。
【００１１】
このような核酸の増幅は、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）で達成される。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法は、最低６つの領域を認識する４つのプライマーを使う特異性の高い核酸増幅法である。
【００１２】
ＬＡＭＰ法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５'末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＢとアウタープライマーＦ及びＢと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の相補鎖をＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＦＩＰと略す）、そして「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＢＩＰと略す）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、Ｆ３と略す）、「Ｂ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３と略す）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｂとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであっても良く、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であっても良い。
【００１３】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマー（Loop Primer）は、ダンベル構造の５'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の５'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００１４】
オリゴヌクレオチドは、公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、所望の塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの合成法も、公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組合せて、かかるオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。
【００１５】
本明細書における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、一般的に知られたものを選択することができる。ストリンジェントな条件として、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄する、という条件があげられる。
【００１６】
本発明者らはＢ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の塩基配列（配列番号１で示される塩基配列）から、プライマーセットとして次の１組を選定した。
（プライマーセット）
ＦＩＰ：5'-GATAAAACGCCGCAGACACATCCCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3' （配列番号１０）
ＢＩＰ：5'-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTGACAAACGGGCAACATACCTT-3' （配列番号１１）
Ｆ３ ：5'-CCAAAATTCGCAGTCCCCAA-3' （配列番号４）
Ｂ３ ：5'-GCAGGTTTTGCATGGTCC-3' （配列番号８）
ＬＦ ：5'-CAGCGATAACCAGGACAA-3' （配列番号５）
ＬＢ ：5'-TGTTGGTTCTTCTGGA-3' （配列番号９）
【００１７】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
【００１８】
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌などから精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
【００１９】
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）を用いて検出することができ、また、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００２０】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化する事ができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ、核酸合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１：プライマーの反応性の確認
ＨＢＶの全ての遺伝子型（Ａ〜Ｈ）を同感度に検出するため、Ｇｅｎｂａｎｋより遺伝子型８種類を含む計２９サンプルをもとに遺伝子型で共通なＳ領域を選定し、プライマーを作製した。プライマーの反応性の確認を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法により核酸の増幅を行うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成はＱＩＡＧＥＮ社に依頼し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）精製したものを使用した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＦＩＰ
１．６μＭ ＢＩＰ
０．２μＭ Ｆ３
０．２μＭ Ｂ３
０．８μＭ ＬＦ
０．８μＭ ＬＢ
Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １６Ｕ（ＮＥＢ）
【００２３】
上記反応溶液に、ＨＢＶプラスミドＤＮＡ（栄研化学で作製）を１０から１０６コピーまでの希釈系列を加えて、６０℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学）を用いて、リアルタイムに反応を検出した。図１は、ＨＢＶプラスミドＤＮＡを使用した場合の検出感度の結果を表すグラフである。図１に示したように、このプライマーセットについて、ＨＢＶプラスミドＤＮＡ１０コピーまでの増幅が確認された。
【００２４】
実施例２：増幅産物の確認
上記プライマーセットで増幅したＬＡＭＰ産物について、電気泳動及び制限酵素ＦｏｋＩでの確認を行った。図２は、電気泳動の結果を表す図である。図２のレーン２から明らかなように、ＬＡＭＰ産物特有のラダーパターンが確認された。また、ＦｏｋＩで処理したサンプル（レーン３）では、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に増幅されていることが明らかとなった。
【００２５】
実施例３：プライマーの評価（特異性試験）
市販されているＨＢＶジェノタイプ別陽性検体（Genotype A,B,C,D,E,F,G,H）各１サンプルずつの合計８種類をヒト正常血清で希釈しサンプルとした。サンプル濃度としては、あらかじめこれら検体をAmplicor(商標)ＨＢＶモニター（Roche社）で定量し、ヒト正常血清でそれぞれ３０、１００，１０００コピー/ｍLに希釈した。各検体の詳細は以下の通りである。Genotype A（Code Number：536550、ProMedDx社）、Genotype B（Code Number：339347、ProMedDx社）、Genotype C（Code Number：536863、ProMedDx社）、Genotype D（Code Number：536461、ProMedDx社）、Genotype E（Code Number：44858、teragenix社）、Genotype F（Code Number：27485、teragenix社）、Genotype G（Code Number：61827、teragenix社）、Genotype H（Code Number：78621、teragenix社）。
【００２６】
血清中のＨＢＶ―ＤＮＡを単離するために以下の方法で抽出した。ＨＢＶ陽性検体１００μＬに３００μＬの溶解試薬［５．７６Ｍ グアニジンチオシアン酸塩、１９４ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）］を加え混合し、室温で５分間放置した後、９５℃、１０分間インキュベートした。次に、氷上で３分間急冷し、１μＬのPellet Paint(Novagen社)と４００μＬのイソプロパノールを加え混合し、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を除去した後、７０％エタノールを適量加え、混合し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。最後に、上清を除去し、室温で５分間放置して、５μLの滅菌水で溶解した。この溶液をすべてＬＡＭＰ反応に持ち込んだ。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１よりすべてのジェノタイプの検体について１００コピー／ｍＬまで１００％検出でき、ジェノタイプ間で検出感度が一定であることが確認された。
【００２９】
実施例４：プライマーの評価（感度試験）
ＷＨＯの国際標準品であるＷＨＯ ｓｔａｎｄａｒｄ ＨＢＶ ＤＮＡ ９７／７４６（ＮＩＢＳＣ）をヒト正常血清で希釈したサンプルを用いた。抽出及びＬＡＭＰ反応は、実施例３と同じ操作を行った。
【００３０】
【表２】
【００３１】
表２よりウイルス濃度が１５ＩＵ／ｍＬまで１００％検出することができた。
【００３２】
実施例５：感度比較
市販品のＨＢＶ Sero-conversion panels（Impath-BCP）３セット（Catalog No.6277,6290,6291）を用いて、他の検出法［Amplicor ＨＢＶモニター（Roche社）、PCR、PRISM HBsAg test (Abott社)］との感度比較を行なった。なお、Amplicor ＨＢＶモニターは株式会社エスアールエルに測定依頼を行い、PCRとPRISM HBsAg testは、Impath-BCP社での測定結果が添付されていた。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
【表５】
【００３６】
ＬＡＭＰ法による結果を○または×で表した。表３〜５に示すようにＬＡＭＰ法が最も検出感度が良く、ウインドウピリオドが短縮された。まとめとして、ＬＡＭＰ法＞Amplicor ＨＢＶモニター＞PCR＞PRISM HBsAg testの順で検出感度が高かった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】感度試験の結果を表すグラフである。１０〜１０６は、アッセイ当たりのプラスミドＤＮＡのコピー数を表す。
【図２】電気泳動の結果を表す図である。レーン１は100bp ladder markerであり、レーン２はＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン３はＬＡＭＰ産物をＦｏｋＩで処理したサンプルである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるＢ型肝炎ウイルスのＳ領域の、３０４番〜５２６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の標的核酸上の３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５'末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜２記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５'末端から３'末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５'−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３'。
（ｂ）５'−（配列番号６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３'。
【請求項５】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項６】
Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項５記載のＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＢ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｂ型肝炎ウイルス感染の有無を診断することを特徴とするＢ型肝炎ウイルスの感染の診断方法。
【請求項８】
Ｂ型肝炎ウイルスの感染を診断するための、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
配列番号１で示されるＢ型肝炎ウイルスのＳ領域の、３０４番〜５２６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域の標的核酸上の３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５'末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜２記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５'末端から３'末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５'−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３'。
（ｂ）５'−（配列番号６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３'。
【請求項５】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項６】
Ｂ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項５記載のＢ型肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＢ型肝炎ウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｂ型肝炎ウイルス感染の有無を診断することを特徴とするＢ型肝炎ウイルスの感染の診断方法。
【請求項８】
Ｂ型肝炎ウイルスの感染を診断するための、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−４０（Ｐ２００７−４０Ａ）
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８１５８４（Ｐ２００５−１８１５８４）
【出願日】平成１７年６月２２日（２００５．６．２２）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２２日（２００５．６．２２）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
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