ＢＡＣクローンを用いる腎細胞癌の予後予測方法
【課題】組織学的分類など既存の基準では予測不可能な腎細胞癌の予後不良リスクを決定するための新規な方法を提供する。
【解決手段】本発明は、（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップを含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に関する。
【解決手段】本発明は、（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップを含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、腎細胞癌の予後不良リスクの検出方法に関する。特に、本発明は、特定のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、腎細胞癌の予後不良リスクの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（renal cell carcinoma）は、腎臓実質に発生する悪性腫瘍のうち最もよく見られる腫瘍である。通常は尿細管上皮細胞が癌化して発生したものを指す。この癌は、４０歳以上の人々、特に５０〜６０歳代で発見されることが多く、女性よりも男性に多い。
【０００３】
腎細胞癌は、その病理学的特徴から、淡明細胞癌、顆粒細胞癌、嫌色素細胞癌、紡錘細胞癌、嚢胞随伴腎細胞癌、嚢胞由来腎細胞癌、嚢胞性腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌などに分類される。最も多く見られるものは淡明細胞癌である。紡錘細胞癌は組織学的異型度が高く、予後が不良である。
【０００４】
現在では、上記のように腎細胞癌のうち紡錘細胞癌については組織型から予後不良との予測が行われる。しかし、最も発生頻度が高い淡明細胞癌に分類された患者では、腎摘除術により根治し、予後良好なケースがある一方で、急速に遠隔転移を生じる症例が観察される場合がある。そのようなケースを考慮すると、組織学的分類などの既存の臨床病理学的因子から、特に淡明細胞型の腎細胞癌の予後を予測することは不可能である。
【０００５】
癌細胞ではゲノム配列の欠失及び増幅、ＣｐＧアイランドのメチル化による発現抑制、ヒストンタンパク質の脱アセチル化による遺伝子の発現抑制、遺伝子点突然変異等が起こっていることが、頻繁に報告されている。
【０００６】
本発明者らは、Ｃ型ＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化の蓄積が腎細胞癌の予後と有意に相関することを報告した（非特許文献１）。この文献では、他の臓器の癌に関してもメチル化が調べられている９箇所のＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化状態を、ＰＣＲを用いる方法で解析している。この知見は、ＤＮＡメチル化異常が腎細胞癌の発生に重要な影響を及ぼすことを示している。
【０００７】
【非特許文献１】Ａｒａｉ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９：２８８−２９６，２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり、腎細胞癌の予後は、組織学的分類など既存の基準では予測不可能であり、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するための有効な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、腎細胞癌検体でのゲノム配列のメチル化について、以下に詳細に説明するようにＢＡＭＣＡ法を用いて網羅的に解析し、複数の腎細胞癌関連領域を特定した。
【００１０】
本発明は、具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
〔２〕ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、上記〔１〕に記載の方法。
【００１１】
〔３〕前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１２】
〔４〕前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１３】
〔５〕前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１４】
〔６〕前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１５】
〔７〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１のいずれか１以上を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【００１６】
〔８〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３のいずれか１以上を含む、上記〔７〕に記載のアレイ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、組織学的観察などの既存の分類基準では検知し得ない、腎摘除術後の腎細胞癌の予後不良リスクを判定することができる。腎細胞癌の治療方法としては腎摘除術が第一選択であるが、転移・再発を早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬などの奏効が期待できる。よって、本発明により腎摘除術の対象となる大多数の腎細胞癌症例において、予後不良リスクが高い患者にはより精密な転移・再発スクリーニングを行い、その場合には早期発見により治療成績を向上させ得ると期待され、一方で、予後不良リスクが低い患者では転移・再発スクリーニングの負担を軽減させることができる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で非常に大きな利益をもたらすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に関する。
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＤＮＡメチル化をＢＡＭＣＡ法によって調べる。
【００１９】
ＢＡＭＣＡ法
本明細書中、ＢＡＭＣＡ法とは、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＡＣアレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法）の略称であり、特定のゲノム領域におけるメチル化を検出することができるアッセイ方法である。
【００２０】
以下に、ＢＡＭＣＡ法の代表的な態様を例示する。腎細胞癌組織と正常腎組織から、フェノール／クロロホルム法などによりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化する。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で腎細胞癌組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅する。一方、正常腎組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ５にて標識する。その両者を混合し、数多くのＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイ上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行う。ここで、腎細胞癌組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては切断されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅される。当該領域が腎細胞癌組織由来ＤＮＡのみでメチル化されており、正常対照ではメチル化されていない場合、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（腎細胞癌）／Ｃｙ５（正常対照）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。この一連のＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００２１】
競合ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件により行うことができる：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、場合により、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの存在下にてエタノール沈殿する。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させる。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて４８〜７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせる。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行う。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行う。
【００２２】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、例えば、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ等）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０等）によって数値化し、腎細胞癌検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出することができる。
【００２３】
腎細胞癌関連領域
好ましい実施形態では、本発明において用いる「腎細胞癌関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と腎細胞癌との関連が示されたゲノム領域である。
【００２４】
本発明者らは、全染色体領域を網羅的に解析するために、約４５００種類のＢＡＣ ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイであるＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、階層的クラスタリング（教師なし法）により腎細胞癌検体を予後良好クラスターと予後不良クラスターとに分類し、これらのクラスターへの高感度及び特異的な検体の分類を可能とする腎細胞癌関連領域を含むＢＡＣクローンを特定した。すなわち、本発明において、「腎細胞癌関連領域」とは、限定するものではないが、以下の７０のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１。
【００２５】
ここで、上記のＢＡＣクローンは、ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１に含まれるクローンであり、該ライブラリー中での参照番号により示されている。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１は、ヒト男性の血液から採取したゲノムを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＣベクターに挿入することにより作製されたライブラリーである。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリーはＲＰＣＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手可能である。また、一部のクローンについては、その全長配列をデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能である。全長配列がデータベースに登録されていないクローンについても、ＮＣＢＩ Ｃｌｏｎｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙデータベースから、ゲノム上の位置、末端配列などについての情報を得ることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｃｌｏｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。全長配列又は末端配列がデータベースから入手可能な６０クローンについての、全長配列又は末端配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を以下に挙げる：
【００２６】
全長配列 末端配列
ＲＰ１１−７１Ｈ２０ ＡＱ２６５６０１
ＲＰ１１−９０Ｍ２３ ＡＣ０９２４１７
ＲＰ１１−９０Ｂ２３ ＡＺ５１８３８４
ＡＱ２８３５６８
ＡＱ２８３５７１
ＲＰ１１−７９Ｃ６ ＡＣ１１２２０４
ＲＰ１１−１１０Ｌ１ ＡＬ４４９３０５
ＲＰ１１−４２Ｂ１９ ＡＬ３５８７９１
ＲＰ１１−８７Ｐ３ ＡＣ０１６０４２
ＲＰ１１−４０８Ｌ２０ ＡＣ０６７７４６
ＲＰ１１−４５３Ｄ５ ＡＺ０８１７８９
ＡＺ０８１８１９
ＡＺ５６４７３８
ＡＱ５８５９９８
ＲＰ１１−４４４Ｆ１５ ＡＺ０８１９６７
ＡＺ０８１９６８
ＲＰ１１−４４Ｆ３ ＡＱ１９８８５５
ＡＱ１９８８５６
ＲＰ１１−１４Ｊ１５ Ｂ８２３０９
Ｂ８７９７２
ＲＰ１１−３５９Ｈ１８ ＡＣ０７３５４４
ＲＰ１１−２６０Ｅ１８ ＡＣ０２４５８８
ＲＰ１１−３Ｄ１５ Ｂ６３７４３
Ｂ６３７４４
ＲＰ１１−８９Ｎ１４ ＡＱ２８６６５１
ＡＱ２８６６５３
ＲＰ１１−１１０Ｌ１３ ＡＱ３１９０１４
ＡＱ３５０７７４
ＲＰ１１−１６０Ｄ１３ ＡＱ３７６８２６
ＲＰ１１−１７０Ｏ１６ ＡＱ４１７９４８
ＲＰ１１−３１９Ｅ１６ ＡＣ００６２０６
ＲＰ１１−１４１Ｎ１ ＡＱ３８７４２７
ＡＱ３８７４３０
ＲＰ１１−４１６Ａ１４ ＡＬ３５６０５５
ＲＰ１１−１２６Ｊ１４ ＡＱ３５３８０３
ＡＱ３５３８０４
ＲＰ１１−２７７Ｅ１８ ＡＣ００７５３６
ＲＰ１１−２１３Ｃ２０ ＡＱ４８４３６４
ＡＱ４８４３６５
ＲＰ１１−３Ｊ１０ ＡＬ１３８７５２
ＲＰ１１−１８Ｂ１４ Ｂ８２８４８
ＲＰ１１−９０Ｊ１４ ＡＱ２８６２２０
ＡＱ３１８５５６
ＲＰ１１−７９Ｅ２２ ＡＺ５１９１６２
ＡＱ２８２６２９
ＡＱ２８２６３１
ＡＱ５８１３３５
ＡＱ６２９６０６
ＲＰ１１−２６４Ｎ７ ＡＱ４８８２１５
ＡＱ４８８２１７
ＲＰ１１−８０Ｈ４ ＡＱ２８４０５３
ＲＰ１１−９１Ｅ２４ ＡＱ２８５５５０
ＡＱ２８５５５３
ＲＰ１１−５１６Ｃ１ ＡＣ０２５０４３
ＲＰ１１−３Ｎ１６ ＡＣ０１１２１２
ＲＰ１１−１１０Ｉ１６ ＡＣ１０５１７８
ＲＰ１１−４０Ｃ６ ＡＬ１６１７８７
ＲＰ１１−８０Ｆ１３ ＡＱ２８２４６１
ＡＱ２８２４６３
ＲＰ１１−１５Ｃ９ Ｂ８２３９１
ＲＰ１１−３２８Ｊ１２ ＡＣ０１２４７５
ＲＰ１１−１４０Ｋ１６ ＡＱ３８６７２７
ＡＱ３８６７２９
ＲＰ１１−７５Ｈ６ ＡＱ２６６６９４
ＡＱ２６６６９３
ＲＰ１１−１３９Ｅ１９ ＡＣ００９２４８
ＲＰ１１−５１Ｏ５ ＡＱ０５３４４７
ＡＱ０５３４４９
ＲＰ１１−４８Ｍ７ ＣＬ４２３３５１
ＣＬ４２３３５２
ＡＱ１９８００７
ＡＱ１９８００９
ＲＰ１１−２２Ｂ２４ Ｂ８６１３０
ＲＰ１１−８１Ｄ１ ＡＺ５２１５２０
ＡＱ２８１００３
ＡＱ２８１００６
ＲＰ１１−１２０Ｏ１１ ＡＱ３４９７６０
ＡＱ３４９７６１
ＲＰ１１−５９Ｈ１ ＡＣ００７２１５
ＲＰ１１−７Ｇ２ Ｂ７１２９５
ＲＰ１１−８９Ｐ８ ＡＱ２８６７２２
ＡＱ２８６７２５
ＲＰ１１−１１７Ｎ１４ ＡＱ３５０５８４
ＡＱ３５０５８６
ＲＰ１１−３９７Ｄ１２ ＡＬ１５８１５５
ＲＰ１１−１４Ｃ１８ ＡＬ１５９９９１
ＲＰ１１−１２２Ｋ２２ ＡＣ００７４８９
ＲＰ１１−４４２Ｏ１ ＡＣ０２６４６９
ＲＰ１１−１２０Ｃ１７ ＡＱ３４２４９０
ＡＱ３４９０６１
ＲＰ１１−６３Ｐ１２ ＡＬ１３５９２４
ＲＰ１１−８０Ｊ１６ ＡＺ５２１４６６
ＡＱ２８４１２８
ＡＱ３１７７６５
ＲＰ１１−４２９Ａ８ ＡＣ０７３３６４
ＲＰ１１−７９Ｅ１１ ＡＺ５２０７１１
ＡＱ２８２４９１
ＡＱ２８２４９３
【００２７】
データベースに配列情報が開示されていない以下の１０クローン：ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ−１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１２８Ｊ２に関しては、それぞれについてＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）配列が特定されている。ＳＴＳ配列については、以下に示すコード番号を用いてデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｕｎｉｓｔｓ）を検索することにより、具体的な情報を得ることができる。それぞれのクローンに対して特定されているＳＴＳ配列についての情報を、以下に挙げる：
【００２８】
ＲＰ１１−５０８Ｎ１６
ＵｎｉＳＴＳ：１８１７９１
ｓｔＳＧ６７５０８
フォワードプライマー：ＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＴＴＡＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＧ（配列番号２）
ＰＣＲ産物サイズ：８７ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
【００２９】
ＲＰ１１−１８２Ｐ７
ＵｎｉＳＴＳ：８００２８
Ｄ１０Ｓ１１９９
フォワードプライマー：ＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＡＴＴＴ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＣＴＴＴＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡ（配列番号４）
ＰＣＲ産物サイズ：３０４ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ０３２４６
【００３０】
ＲＰ１１−３Ａ９
ＵｎｉＳＴＳ：７７６４７
Ｄ１６Ｓ３３１１
フォワードプライマー：ＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧＣ（配列番号５）
リバースプライマー：ＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴ（配列番号６）
ＰＣＲ産物サイズ：１２６ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ１４６１２ Ｔ５６９２３
【００３１】
ＲＰ１１−２５３Ｏ１０
ＵｎｉＳＴＳ：６２２１２
Ｄ１６Ｓ３０１６
フォワードプライマー：ＴＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧ（配列番号７）
リバースプライマー：ＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧ（配列番号８）
ＰＣＲ産物サイズ：１５１ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ０７４６１
【００３２】
ＲＰ１１−４６９Ｊ７
ＵｎｉＳＴＳ：１８１７４３
ｓｔｄＪ６２１Ｎ１１ＳＰ６
フォワードプライマー：ＴＴＴＡＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号９）
リバースプライマー：ＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＡＡＡＴＣＣＣ（配列番号１０）
ＰＣＲ産物サイズ：１４３ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
【００３３】
ＲＰ１１−２３０Ａ１３
ＵｎｉＳＴＳ：４５０６１
ＳＨＧＣ−５９００
フォワードプライマー：ＧＡＧＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＧＣ（配列番号１２）
ＰＣＲ産物サイズ：１１０ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ１７４３６
【００３４】
ＲＰ１１−８７Ｃ１６
ＵｎｉＳＴＳ：１４１７５
Ｄ２Ｓ１４５
フォワードプライマー：ＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＴＣＣ（配列番号１３）
リバースプライマー：ＧＧＧＣＡＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡ（配列番号１４）
ＰＣＲ産物サイズ：２４８−２７５ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ１６８４７
【００３５】
ＲＰ１１−２７３Ｊ１０
ＵｎｉＳＴＳ：２６５８
ＳＨＧＣ−２４３７８
フォワードプライマー：ＡＡＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧ（配列番号１５）
リバースプライマー：ＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧ（配列番号１６）
ＰＣＲ産物サイズ：９０ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ３９９０１
【００３６】
ＲＰ１１−３０１Ｋ１７
ＵｎｉＳＴＳ：２６４７５
Ｄ３Ｓ３１１４
フォワードプライマー：ＣＡＧＧＡＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号１７）
リバースプライマー：ＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡＡＴＣＴＧＴＴＡＧＡ（配列番号１８）
ＰＣＲ産物サイズ：１７５−１７６ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ０２６９３
【００３７】
ＲＰ１１−１２８Ｊ２
ＵｎｉＳＴＳ：３８９０７
ＨＵＭＸＴ００８６３
フォワードプライマー：ＣＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＧ（配列番号１９）
リバースプライマー：ＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧ（配列番号２０）
ＰＣＲ産物サイズ：１７９ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ７８７１５
【００３８】
当業者であれば、上記の入手可能な配列情報をもとに、前記ＢＡＣライブラリーから、本発明に係るＢＡＣクローンを入手することが可能である。
繰り返して言うが、本発明の方法を実施するために用いる腎細胞癌関連領域は、上記のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域には限定されず、ＢＡＭＣＡ法などの適切な方法によりそのメチル化が腎細胞癌と関連付けられる他の領域であり得る。
【００３９】
腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法をはじめとする、下記で例示するような公知の手法を用いて検査することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することが可能である。
【００４０】
ＤＮＡメチル化
本明細書中、「ＣｐＧアイランド」とは、高等生物、特に哺乳動物のゲノム配列中、非翻訳領域に存在するＧ（グアニン）Ｃ（シトシン）含量が多い領域である。「ＣｐＧアイランド」の「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「ｐ」はシトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表している。すなわち、ＣｐＧアイランドには、隣接したシトシンとグアニンとがホスホジエステル結合で結合されたジヌクレオチドの繰り返し配列が含まれる。ＣｐＧアイランドの長さは約３００〜３０００塩基対である。ＣｐＧアイランドは、一般に、全配列中にＣｐＧ配列を統計的に期待される６％と同じか又はそれを上回る割合で含む。ＣｐＧアイランド以外のゲノム領域では、ＣＧサプレッションのため、ＣｐＧ配列の含量は１％以下である。
【００４１】
本明細書中、「ＤＮＡメチル化」（又は単に「メチル化」）とは、上記のＣｐＧ配列において、シトシンの５位の炭素がメチル化されていることを意味する。
【００４２】
淡明細胞型腎細胞癌の５１検体について、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、結果を階層的クラスタリング（教師なし法）により分析すると、腎細胞癌検体は２つのクラスター（クラスターＡ及びクラスターＢ）に分類された（図２）。この２つのクラスターは、臨床病理学的悪性度において互いに異なり（図３）、予後も異なっていた（図４）。すなわち、これらクラスターと臨床像とを対比させた結果、組織学的分類においては区別し得なかったこれら２つのクラスターのうち、クラスターＡは予後良好であり、クラスターＢは予後不良であることが明らかとなった。
【００４３】
続いて、腎細胞癌検体が予後不良クラスターに属するかの判定を可能とする上記の７０のＢＡＣクローンを同定した。これらのＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域の１又は複数についてのＤＮＡメチル化の有無を判定することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。腎細胞癌の予後に関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図５に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表１に示す。
【００４４】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された腎細胞癌関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、これらの領域のうちの１つについてのみ検査した場合でさえ、多くの場合予後良好である淡明細胞型腎細胞癌の中から、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００４５】
すなわち、例えば上記の７０クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。
【００４６】
ゲノム領域におけるＤＮＡメチル化の状態を調べるためには、上記のＢＡＭＣＡ法（図１）の他に、ＰＣＲを利用する別の方法、及びサザンブロッティングを利用する方法などを用いることができる。
【００４７】
ＰＣＲを利用する別の方法としては、以下のものなどを挙げることができる：
（ａ）バイサルファイトシークエンシング法：ゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換するとシトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンにおいてはこの反応がほとんど進まず、シトシンのままとなる。この反応を利用すれば、ＤＮＡメチル化状態の差が塩基配列に変換される。バイサルファイト変換したゲノム領域をＰＣＲ増幅してクローン化するなどし、塩基配列を決定することにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｂ）ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、バイサルファイト変換−制限酵素法）：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換して塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して制限酵素の認識部位が残っているか残っていないかを調べることにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｃ）メチル化特異的ＰＣＲ法：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換し、塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを鋳型として、塩基配列が変化している場合（メチル化がない）に増幅できるプライマー、又は塩基配列が変化していない場合（メチル化がある）に増幅できるプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物の有無によってＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
【００４８】
サザンブロッティングを利用する方法は、以下のように実施することができる。試験する検体中のゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化すると、メチル化されている認識部位は切断されず、メチル化されていない認識部位は切断される。消化済みのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンなどにトランスファーし、３２Ｐなどで標識した標的特異的なプローブをハイブリダイズさせる。このとき、検出されるバンドの長さの違いから、対象となる領域のメチル化の有無を知ることができる。
【００４９】
これらの方法において用いる「メチル化感受性制限酵素」とは、例えばＳｍａＩ及びＨｐａＩＩであり、好ましくはＳｍａＩである。それらのメチル化感受性酵素と同じ認識配列を認識する非メチル化感受性酵素は当業者が容易に知ることができ、これをメチル化感受性酵素と組み合わせて上記のようなＤＮＡメチル化の検査方法において用いることができる。
【００５０】
これらの方法を用いるメチル化の検査における、腎細胞癌関連領域でのメチル化の有無の判定基準は、当業者ならば公知の統計学的手法等を用いて適宜決定することができる。具体的には、腎細胞癌検体の予後不良群を陽性対照とし、予後良好群を陰性対照として、所望のＤＮＡメチル化検査法により腎細胞癌関連領域のＤＮＡメチル化状態を調べる。その結果を陽性対照と陰性対照とで比較することにより、各腎細胞癌関連領域について有意な測定値の閾値を決定する。それにより、その閾値を用いたメチル化検査で陽性（又は陰性）と判定された場合に、検査対象の検体を予後不良群に含めるべきであると規定することができる。
【００５１】
アレイ
本発明は、さらに、上記のように特定された１４のＢＡＣクローン又は７０のＢＡＣクローンを搭載した、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイにも関する。
この場合、「アレイ」とは、適切な基板上にゲノム配列を含む複数のＤＮＡを位置特異的な様式で定着（スポット）させたデバイスを意味する。基板は、好ましくは固体基板であり、具体的には、ガラス、プラスチック、メンブレン等が挙げられる。好ましい基板はスライドガラスのようなガラス基板である。ガラス製の固体基板には、ＤＮＡの定着の前に、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着によるコーティングを施すことが望ましい。
【００５２】
また、この関連で、「腎細胞癌」とは特に組織学的分類により淡明細胞癌に分類されたものを指す場合がある。
【００５３】
本発明を、実施例を用いて以下により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によりなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
腎細胞癌（淡明細胞癌）検体のクラスタリング
ＢＡＭＣＡ法の結果に基づく階層的クラスタリング（教師なし法）により、５１の淡明細胞型腎細胞癌組織検体を、４３検体（クラスターＡ）と８検体（クラスターＢ）の２クラスターに分類した（図２）。以下に説明するＢＡＭＣＡ法の実施については、文献（Ｍｉｓａｗａ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６５：１０２３３−１０２４２，２００５；Ｓｕｇｉｎｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：７４０１−１３，２００７；Ｔａｎａｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：６４５６−６８，２００７）にも記載されている。
【００５５】
腎細胞癌組織と正常腎組織から、フェノール／クロロホルム法によりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化した。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で腎細胞癌組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅した。一方、正常腎組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ５にて標識した。蛍光色素での標識は、ＢｉｏＰｒｉｍｅ ａｒｒａｙ ＣＧＨ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。アダプターライゲーション及びＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｌ：ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣ（配列番号２１）
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｓ：ＣＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡ（配列番号２２）
ＰＣＲはＡｄａｐｔｏｒ−Ｌと同一の配列を有するプライマーを用いて行った。
【００５６】
腎細胞癌組織由来のＤＮＡ断片と正常腎組織由来のＤＮＡ断片の両者を混合し、４３６１種類のＢＡＣクローンを搭載した高密度ＣＧＨアレイ（ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００；Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。競合ハイブリダイゼーションは、以下の条件により行った：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にてエタノール沈殿した。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させた。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて４８〜７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせた。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行った。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行った。
【００５７】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０）によって数値化し、腎細胞癌検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出した。
【００５８】
ここで、腎細胞癌組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては認識されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅され、プローブが生成される。その結果、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（腎細胞癌）／Ｃｙ５（正常対照）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。ＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００５９】
階層的クラスタリング（教師なし法）の詳細は、例えば、宮本定明著「クラスター分析入門−ファジィクラスタリングの理論と応用（森北出版、１９９９）」などに記載されている。階層的クラスタリング（教師なし法）は、似ているものを集めて分類するデータマイニングの手法のひとつである。階層的クラスタリングでは、まず、Ｎ個の対象からなるデータが与えられた場合、１個の対象だけを含むＮ個のクラスターがある初期状態をつくり出し、対象間の距離（非類似度）からクラスター間の距離を計算し、この距離が最も近い２つのクラスターを逐次併合する。この併合をすべての対象がひとつのクラスターに併合されるまで繰り返すことで階層構造を獲得し、この階層構造をデンドログラムによって表示する。教師なし法は、与えられたデータを外的基準なしに自動的に分類する手法である。
【００６０】
この階層的クラスタリング（教師なし法）により、上記のＢＡＭＣＡ法を用いて得られた測定結果を分析し、５１の検体をクラスターＡ及びクラスターＢに分類した。非常に簡略化して言えば、これらのクラスターはＤＮＡメチル化パターンの違いにより分類されたと言うことができる。
【００６１】
クラスターＡとクラスターＢについて、臨床病理学的因子（顕微鏡的静脈侵襲、肉眼的腎静脈腫瘍栓及び臨床病期）を比較した（図３）。これらの因子に基づく悪性度では、クラスターＢの方がより悪性であり、その差異は統計学的に有意であった。
【００６２】
また、これらのクラスターについて、術後生存期間を比較すると、クラスターＢの方が顕著に予後が悪かった（図４）。
【００６３】
以上の結果から、実施例１でＢＡＭＣＡ法を用いるゲノム領域のＤＮＡメチル化パターンの階層的クラスタリング（教師なし法）から特定されたクラスターＡ及びＢは、臨床的悪性度及び術後生存期間に関して顕著な差異を有することが明らかとなった。このことは、ゲノム領域のＤＮＡメチル化パターンから、組織学的観察からは予測し得ない、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することが可能であることを示している。
【実施例２】
【００６４】
腎細胞癌関連領域の同定
ＤＮＡメチル化パターンの解析により腎細胞癌の予後不良リスクを決定するのに有効なゲノム領域を特定するために、上記５１検体の腎細胞癌検体を実施例１で特定した予後良好クラスターＡ及び予後不良クラスターＢに分類するのに有効なＢＡＣクローンを同定した。同定の手順は以下の通りである。
（１）はじめに、各検体が予後不良クラスターＢに属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝既定の判定基準により予後不良リスクが高いと判定される症例数／階層的クラスタリングで実際にクラスターＢに属していた症例数×１００（％）
特異度＝既定の判定基準により予後不良リスクが低いと判定される症例数／階層的クラスタリングで実際にクラスターＡに属していた症例数×１００（％）。
（２）上記５１検体の腎細胞癌検体のうち階層的クラスタリングでクラスターＢに振り分けられた症例を予後不良群に分類する際の感度及び特異度が、総合して最も高くなるように、アレイ上の各ＢＡＣクローンに対して検出値の閾値を設定した。具体的には、アレイ上のすべてのＢＡＣクローンに関して、クラスターＡに属する４３検体とクラスターＢに属する８検体の間で、Ｃｙ３／Ｃｙ５蛍光強度比についてウィルコクソン検定を行った。検定から導き出されたＰ値を参考にして、両クラスター間に有意差がある約１２０クローンを抜き出した。それらのクローンについて、蛍光強度比を縦軸にとった散布図を描き、該散布図から予後不良リスク判別の閾値を導いて、各クローンについての判定基準を定めた。
散布図の一例を図５に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−７１Ｈ２０については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が１．０未満であるとき、クラスターＢに属する検体を感度１００％、特異度１００％で予後不良群に分類することができる。
（３）上記（２）で設定した判定基準を用いた場合、クラスターＢに属する症例を予後不良群に分類する際の感度及び特異度が、感度１００％、特異性９０％以上となったＢＡＣクローンを特定した。それらのクローンに含まれるゲノム領域を、腎細胞癌関連領域と称した。
【００６５】
同定された腎細胞癌関連領域のＢＡＣクローンは、以下の７０クローンである：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１。
【００６６】
７０クローンについての判定基準
上記（３）で特定した腎細胞癌関連領域７０クローンについて、予後不良の判定基準を以下の表１に示す。判定基準の数値は、実施例１で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００６７】
【表１】
【００６８】
上記（３）で同定した７０クローンについて、上記（２）で設定した判定基準を用いた場合の感度及び特異度を、図６に示す。
【００６９】
上記のとおり、感度１００％、特異性９０％以上で予後不良リスクの高い検体を選定できるように判定基準及び腎細胞癌関連領域を定めているが、特に、ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３の１４のＢＡＣクローンを用いると、感度１００％、特異性１００％で判定を行うことができた（図６）。
【００７０】
考察
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された腎細胞癌関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、これらの領域のうちの１つについてのみ検査した場合でさえ、多くの場合予後良好である淡明細胞型腎細胞癌の中から、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００７１】
すなわち、上記の７０クローン又は１４クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。
【００７２】
本発明によれば、組織学的観察などの既存の分類基準では検知し得ない、腎摘除術後の腎細胞癌の予後不良リスクを判定することができる。腎細胞癌の治療方法としては腎摘除術が第一選択であるが、転移・再発を早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬などの奏効が期待できる。よって、本発明により腎摘除術の対象となる大多数の腎細胞癌症例において、予後不良リスクが高い患者にはより精密な転移・再発スクリーニングを行い、その場合には早期発見により治療成績を向上させ得ると期待され、一方で、予後不良リスクが低い患者では転移・再発スクリーニングの負担を軽減させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、組織学的観察などの既存の分類基準では検知し得ない、腎細胞癌の予後不良リスクを判定することができる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＢＡＭＣＡ法の概略を示す模式図である。
【図２】淡明細胞型腎細胞癌検体についての腎細胞癌関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく階層的クラスタリング（教師なし法）を示す図である。
【図３】ＤＮＡメチル化状態に基づく淡明細胞型腎細胞癌のクラスター分類が、腎細胞癌症例の臨床病理的悪性度と相関することを示す表である。
【図４】ＤＮＡメチル化状態に基づく淡明細胞型腎細胞癌のクラスター分類が、腎細胞癌症例の予後と相関することを示すグラフである。
【図５】各ＢＡＣクローンにおける、予後不良クラスターの判定のための判断基準を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図６】各ＢＡＣクローンを用いる予後不良群の判定での感度及び特異性を表す表である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、腎細胞癌の予後不良リスクの検出方法に関する。特に、本発明は、特定のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、腎細胞癌の予後不良リスクの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（renal cell carcinoma）は、腎臓実質に発生する悪性腫瘍のうち最もよく見られる腫瘍である。通常は尿細管上皮細胞が癌化して発生したものを指す。この癌は、４０歳以上の人々、特に５０〜６０歳代で発見されることが多く、女性よりも男性に多い。
【０００３】
腎細胞癌は、その病理学的特徴から、淡明細胞癌、顆粒細胞癌、嫌色素細胞癌、紡錘細胞癌、嚢胞随伴腎細胞癌、嚢胞由来腎細胞癌、嚢胞性腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌などに分類される。最も多く見られるものは淡明細胞癌である。紡錘細胞癌は組織学的異型度が高く、予後が不良である。
【０００４】
現在では、上記のように腎細胞癌のうち紡錘細胞癌については組織型から予後不良との予測が行われる。しかし、最も発生頻度が高い淡明細胞癌に分類された患者では、腎摘除術により根治し、予後良好なケースがある一方で、急速に遠隔転移を生じる症例が観察される場合がある。そのようなケースを考慮すると、組織学的分類などの既存の臨床病理学的因子から、特に淡明細胞型の腎細胞癌の予後を予測することは不可能である。
【０００５】
癌細胞ではゲノム配列の欠失及び増幅、ＣｐＧアイランドのメチル化による発現抑制、ヒストンタンパク質の脱アセチル化による遺伝子の発現抑制、遺伝子点突然変異等が起こっていることが、頻繁に報告されている。
【０００６】
本発明者らは、Ｃ型ＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化の蓄積が腎細胞癌の予後と有意に相関することを報告した（非特許文献１）。この文献では、他の臓器の癌に関してもメチル化が調べられている９箇所のＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化状態を、ＰＣＲを用いる方法で解析している。この知見は、ＤＮＡメチル化異常が腎細胞癌の発生に重要な影響を及ぼすことを示している。
【０００７】
【非特許文献１】Ａｒａｉ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９：２８８−２９６，２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり、腎細胞癌の予後は、組織学的分類など既存の基準では予測不可能であり、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するための有効な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、腎細胞癌検体でのゲノム配列のメチル化について、以下に詳細に説明するようにＢＡＭＣＡ法を用いて網羅的に解析し、複数の腎細胞癌関連領域を特定した。
【００１０】
本発明は、具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
〔２〕ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、上記〔１〕に記載の方法。
【００１１】
〔３〕前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１２】
〔４〕前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１３】
〔５〕前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１４】
〔６〕前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１５】
〔７〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１のいずれか１以上を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【００１６】
〔８〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３のいずれか１以上を含む、上記〔７〕に記載のアレイ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、組織学的観察などの既存の分類基準では検知し得ない、腎摘除術後の腎細胞癌の予後不良リスクを判定することができる。腎細胞癌の治療方法としては腎摘除術が第一選択であるが、転移・再発を早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬などの奏効が期待できる。よって、本発明により腎摘除術の対象となる大多数の腎細胞癌症例において、予後不良リスクが高い患者にはより精密な転移・再発スクリーニングを行い、その場合には早期発見により治療成績を向上させ得ると期待され、一方で、予後不良リスクが低い患者では転移・再発スクリーニングの負担を軽減させることができる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で非常に大きな利益をもたらすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に関する。
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＤＮＡメチル化をＢＡＭＣＡ法によって調べる。
【００１９】
ＢＡＭＣＡ法
本明細書中、ＢＡＭＣＡ法とは、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＡＣアレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法）の略称であり、特定のゲノム領域におけるメチル化を検出することができるアッセイ方法である。
【００２０】
以下に、ＢＡＭＣＡ法の代表的な態様を例示する。腎細胞癌組織と正常腎組織から、フェノール／クロロホルム法などによりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化する。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で腎細胞癌組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅する。一方、正常腎組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ５にて標識する。その両者を混合し、数多くのＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイ上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行う。ここで、腎細胞癌組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては切断されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅される。当該領域が腎細胞癌組織由来ＤＮＡのみでメチル化されており、正常対照ではメチル化されていない場合、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（腎細胞癌）／Ｃｙ５（正常対照）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。この一連のＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００２１】
競合ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件により行うことができる：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、場合により、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの存在下にてエタノール沈殿する。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させる。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて４８〜７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせる。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行う。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行う。
【００２２】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、例えば、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ等）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０等）によって数値化し、腎細胞癌検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出することができる。
【００２３】
腎細胞癌関連領域
好ましい実施形態では、本発明において用いる「腎細胞癌関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と腎細胞癌との関連が示されたゲノム領域である。
【００２４】
本発明者らは、全染色体領域を網羅的に解析するために、約４５００種類のＢＡＣ ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイであるＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、階層的クラスタリング（教師なし法）により腎細胞癌検体を予後良好クラスターと予後不良クラスターとに分類し、これらのクラスターへの高感度及び特異的な検体の分類を可能とする腎細胞癌関連領域を含むＢＡＣクローンを特定した。すなわち、本発明において、「腎細胞癌関連領域」とは、限定するものではないが、以下の７０のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１。
【００２５】
ここで、上記のＢＡＣクローンは、ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１に含まれるクローンであり、該ライブラリー中での参照番号により示されている。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１は、ヒト男性の血液から採取したゲノムを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＣベクターに挿入することにより作製されたライブラリーである。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリーはＲＰＣＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手可能である。また、一部のクローンについては、その全長配列をデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能である。全長配列がデータベースに登録されていないクローンについても、ＮＣＢＩ Ｃｌｏｎｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙデータベースから、ゲノム上の位置、末端配列などについての情報を得ることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｃｌｏｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。全長配列又は末端配列がデータベースから入手可能な６０クローンについての、全長配列又は末端配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を以下に挙げる：
【００２６】
全長配列 末端配列
ＲＰ１１−７１Ｈ２０ ＡＱ２６５６０１
ＲＰ１１−９０Ｍ２３ ＡＣ０９２４１７
ＲＰ１１−９０Ｂ２３ ＡＺ５１８３８４
ＡＱ２８３５６８
ＡＱ２８３５７１
ＲＰ１１−７９Ｃ６ ＡＣ１１２２０４
ＲＰ１１−１１０Ｌ１ ＡＬ４４９３０５
ＲＰ１１−４２Ｂ１９ ＡＬ３５８７９１
ＲＰ１１−８７Ｐ３ ＡＣ０１６０４２
ＲＰ１１−４０８Ｌ２０ ＡＣ０６７７４６
ＲＰ１１−４５３Ｄ５ ＡＺ０８１７８９
ＡＺ０８１８１９
ＡＺ５６４７３８
ＡＱ５８５９９８
ＲＰ１１−４４４Ｆ１５ ＡＺ０８１９６７
ＡＺ０８１９６８
ＲＰ１１−４４Ｆ３ ＡＱ１９８８５５
ＡＱ１９８８５６
ＲＰ１１−１４Ｊ１５ Ｂ８２３０９
Ｂ８７９７２
ＲＰ１１−３５９Ｈ１８ ＡＣ０７３５４４
ＲＰ１１−２６０Ｅ１８ ＡＣ０２４５８８
ＲＰ１１−３Ｄ１５ Ｂ６３７４３
Ｂ６３７４４
ＲＰ１１−８９Ｎ１４ ＡＱ２８６６５１
ＡＱ２８６６５３
ＲＰ１１−１１０Ｌ１３ ＡＱ３１９０１４
ＡＱ３５０７７４
ＲＰ１１−１６０Ｄ１３ ＡＱ３７６８２６
ＲＰ１１−１７０Ｏ１６ ＡＱ４１７９４８
ＲＰ１１−３１９Ｅ１６ ＡＣ００６２０６
ＲＰ１１−１４１Ｎ１ ＡＱ３８７４２７
ＡＱ３８７４３０
ＲＰ１１−４１６Ａ１４ ＡＬ３５６０５５
ＲＰ１１−１２６Ｊ１４ ＡＱ３５３８０３
ＡＱ３５３８０４
ＲＰ１１−２７７Ｅ１８ ＡＣ００７５３６
ＲＰ１１−２１３Ｃ２０ ＡＱ４８４３６４
ＡＱ４８４３６５
ＲＰ１１−３Ｊ１０ ＡＬ１３８７５２
ＲＰ１１−１８Ｂ１４ Ｂ８２８４８
ＲＰ１１−９０Ｊ１４ ＡＱ２８６２２０
ＡＱ３１８５５６
ＲＰ１１−７９Ｅ２２ ＡＺ５１９１６２
ＡＱ２８２６２９
ＡＱ２８２６３１
ＡＱ５８１３３５
ＡＱ６２９６０６
ＲＰ１１−２６４Ｎ７ ＡＱ４８８２１５
ＡＱ４８８２１７
ＲＰ１１−８０Ｈ４ ＡＱ２８４０５３
ＲＰ１１−９１Ｅ２４ ＡＱ２８５５５０
ＡＱ２８５５５３
ＲＰ１１−５１６Ｃ１ ＡＣ０２５０４３
ＲＰ１１−３Ｎ１６ ＡＣ０１１２１２
ＲＰ１１−１１０Ｉ１６ ＡＣ１０５１７８
ＲＰ１１−４０Ｃ６ ＡＬ１６１７８７
ＲＰ１１−８０Ｆ１３ ＡＱ２８２４６１
ＡＱ２８２４６３
ＲＰ１１−１５Ｃ９ Ｂ８２３９１
ＲＰ１１−３２８Ｊ１２ ＡＣ０１２４７５
ＲＰ１１−１４０Ｋ１６ ＡＱ３８６７２７
ＡＱ３８６７２９
ＲＰ１１−７５Ｈ６ ＡＱ２６６６９４
ＡＱ２６６６９３
ＲＰ１１−１３９Ｅ１９ ＡＣ００９２４８
ＲＰ１１−５１Ｏ５ ＡＱ０５３４４７
ＡＱ０５３４４９
ＲＰ１１−４８Ｍ７ ＣＬ４２３３５１
ＣＬ４２３３５２
ＡＱ１９８００７
ＡＱ１９８００９
ＲＰ１１−２２Ｂ２４ Ｂ８６１３０
ＲＰ１１−８１Ｄ１ ＡＺ５２１５２０
ＡＱ２８１００３
ＡＱ２８１００６
ＲＰ１１−１２０Ｏ１１ ＡＱ３４９７６０
ＡＱ３４９７６１
ＲＰ１１−５９Ｈ１ ＡＣ００７２１５
ＲＰ１１−７Ｇ２ Ｂ７１２９５
ＲＰ１１−８９Ｐ８ ＡＱ２８６７２２
ＡＱ２８６７２５
ＲＰ１１−１１７Ｎ１４ ＡＱ３５０５８４
ＡＱ３５０５８６
ＲＰ１１−３９７Ｄ１２ ＡＬ１５８１５５
ＲＰ１１−１４Ｃ１８ ＡＬ１５９９９１
ＲＰ１１−１２２Ｋ２２ ＡＣ００７４８９
ＲＰ１１−４４２Ｏ１ ＡＣ０２６４６９
ＲＰ１１−１２０Ｃ１７ ＡＱ３４２４９０
ＡＱ３４９０６１
ＲＰ１１−６３Ｐ１２ ＡＬ１３５９２４
ＲＰ１１−８０Ｊ１６ ＡＺ５２１４６６
ＡＱ２８４１２８
ＡＱ３１７７６５
ＲＰ１１−４２９Ａ８ ＡＣ０７３３６４
ＲＰ１１−７９Ｅ１１ ＡＺ５２０７１１
ＡＱ２８２４９１
ＡＱ２８２４９３
【００２７】
データベースに配列情報が開示されていない以下の１０クローン：ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ−１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１２８Ｊ２に関しては、それぞれについてＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）配列が特定されている。ＳＴＳ配列については、以下に示すコード番号を用いてデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｕｎｉｓｔｓ）を検索することにより、具体的な情報を得ることができる。それぞれのクローンに対して特定されているＳＴＳ配列についての情報を、以下に挙げる：
【００２８】
ＲＰ１１−５０８Ｎ１６
ＵｎｉＳＴＳ：１８１７９１
ｓｔＳＧ６７５０８
フォワードプライマー：ＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＴＴＡＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＧ（配列番号２）
ＰＣＲ産物サイズ：８７ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
【００２９】
ＲＰ１１−１８２Ｐ７
ＵｎｉＳＴＳ：８００２８
Ｄ１０Ｓ１１９９
フォワードプライマー：ＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＡＴＴＴ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＣＴＴＴＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡ（配列番号４）
ＰＣＲ産物サイズ：３０４ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ０３２４６
【００３０】
ＲＰ１１−３Ａ９
ＵｎｉＳＴＳ：７７６４７
Ｄ１６Ｓ３３１１
フォワードプライマー：ＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧＣ（配列番号５）
リバースプライマー：ＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴ（配列番号６）
ＰＣＲ産物サイズ：１２６ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ１４６１２ Ｔ５６９２３
【００３１】
ＲＰ１１−２５３Ｏ１０
ＵｎｉＳＴＳ：６２２１２
Ｄ１６Ｓ３０１６
フォワードプライマー：ＴＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧ（配列番号７）
リバースプライマー：ＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧ（配列番号８）
ＰＣＲ産物サイズ：１５１ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ０７４６１
【００３２】
ＲＰ１１−４６９Ｊ７
ＵｎｉＳＴＳ：１８１７４３
ｓｔｄＪ６２１Ｎ１１ＳＰ６
フォワードプライマー：ＴＴＴＡＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号９）
リバースプライマー：ＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＡＡＡＴＣＣＣ（配列番号１０）
ＰＣＲ産物サイズ：１４３ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
【００３３】
ＲＰ１１−２３０Ａ１３
ＵｎｉＳＴＳ：４５０６１
ＳＨＧＣ−５９００
フォワードプライマー：ＧＡＧＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＧＣ（配列番号１２）
ＰＣＲ産物サイズ：１１０ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ１７４３６
【００３４】
ＲＰ１１−８７Ｃ１６
ＵｎｉＳＴＳ：１４１７５
Ｄ２Ｓ１４５
フォワードプライマー：ＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＴＣＣ（配列番号１３）
リバースプライマー：ＧＧＧＣＡＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡ（配列番号１４）
ＰＣＲ産物サイズ：２４８−２７５ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ１６８４７
【００３５】
ＲＰ１１−２７３Ｊ１０
ＵｎｉＳＴＳ：２６５８
ＳＨＧＣ−２４３７８
フォワードプライマー：ＡＡＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧ（配列番号１５）
リバースプライマー：ＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧ（配列番号１６）
ＰＣＲ産物サイズ：９０ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ３９９０１
【００３６】
ＲＰ１１−３０１Ｋ１７
ＵｎｉＳＴＳ：２６４７５
Ｄ３Ｓ３１１４
フォワードプライマー：ＣＡＧＧＡＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号１７）
リバースプライマー：ＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡＡＴＣＴＧＴＴＡＧＡ（配列番号１８）
ＰＣＲ産物サイズ：１７５−１７６ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｇ０２６９３
【００３７】
ＲＰ１１−１２８Ｊ２
ＵｎｉＳＴＳ：３８９０７
ＨＵＭＸＴ００８６３
フォワードプライマー：ＣＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＧ（配列番号１９）
リバースプライマー：ＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧ（配列番号２０）
ＰＣＲ産物サイズ：１７９ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ７８７１５
【００３８】
当業者であれば、上記の入手可能な配列情報をもとに、前記ＢＡＣライブラリーから、本発明に係るＢＡＣクローンを入手することが可能である。
繰り返して言うが、本発明の方法を実施するために用いる腎細胞癌関連領域は、上記のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域には限定されず、ＢＡＭＣＡ法などの適切な方法によりそのメチル化が腎細胞癌と関連付けられる他の領域であり得る。
【００３９】
腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法をはじめとする、下記で例示するような公知の手法を用いて検査することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することが可能である。
【００４０】
ＤＮＡメチル化
本明細書中、「ＣｐＧアイランド」とは、高等生物、特に哺乳動物のゲノム配列中、非翻訳領域に存在するＧ（グアニン）Ｃ（シトシン）含量が多い領域である。「ＣｐＧアイランド」の「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「ｐ」はシトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表している。すなわち、ＣｐＧアイランドには、隣接したシトシンとグアニンとがホスホジエステル結合で結合されたジヌクレオチドの繰り返し配列が含まれる。ＣｐＧアイランドの長さは約３００〜３０００塩基対である。ＣｐＧアイランドは、一般に、全配列中にＣｐＧ配列を統計的に期待される６％と同じか又はそれを上回る割合で含む。ＣｐＧアイランド以外のゲノム領域では、ＣＧサプレッションのため、ＣｐＧ配列の含量は１％以下である。
【００４１】
本明細書中、「ＤＮＡメチル化」（又は単に「メチル化」）とは、上記のＣｐＧ配列において、シトシンの５位の炭素がメチル化されていることを意味する。
【００４２】
淡明細胞型腎細胞癌の５１検体について、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、結果を階層的クラスタリング（教師なし法）により分析すると、腎細胞癌検体は２つのクラスター（クラスターＡ及びクラスターＢ）に分類された（図２）。この２つのクラスターは、臨床病理学的悪性度において互いに異なり（図３）、予後も異なっていた（図４）。すなわち、これらクラスターと臨床像とを対比させた結果、組織学的分類においては区別し得なかったこれら２つのクラスターのうち、クラスターＡは予後良好であり、クラスターＢは予後不良であることが明らかとなった。
【００４３】
続いて、腎細胞癌検体が予後不良クラスターに属するかの判定を可能とする上記の７０のＢＡＣクローンを同定した。これらのＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域の１又は複数についてのＤＮＡメチル化の有無を判定することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。腎細胞癌の予後に関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図５に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表１に示す。
【００４４】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された腎細胞癌関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、これらの領域のうちの１つについてのみ検査した場合でさえ、多くの場合予後良好である淡明細胞型腎細胞癌の中から、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００４５】
すなわち、例えば上記の７０クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。
【００４６】
ゲノム領域におけるＤＮＡメチル化の状態を調べるためには、上記のＢＡＭＣＡ法（図１）の他に、ＰＣＲを利用する別の方法、及びサザンブロッティングを利用する方法などを用いることができる。
【００４７】
ＰＣＲを利用する別の方法としては、以下のものなどを挙げることができる：
（ａ）バイサルファイトシークエンシング法：ゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換するとシトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンにおいてはこの反応がほとんど進まず、シトシンのままとなる。この反応を利用すれば、ＤＮＡメチル化状態の差が塩基配列に変換される。バイサルファイト変換したゲノム領域をＰＣＲ増幅してクローン化するなどし、塩基配列を決定することにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｂ）ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、バイサルファイト変換−制限酵素法）：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換して塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して制限酵素の認識部位が残っているか残っていないかを調べることにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｃ）メチル化特異的ＰＣＲ法：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換し、塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを鋳型として、塩基配列が変化している場合（メチル化がない）に増幅できるプライマー、又は塩基配列が変化していない場合（メチル化がある）に増幅できるプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物の有無によってＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
【００４８】
サザンブロッティングを利用する方法は、以下のように実施することができる。試験する検体中のゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化すると、メチル化されている認識部位は切断されず、メチル化されていない認識部位は切断される。消化済みのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンなどにトランスファーし、３２Ｐなどで標識した標的特異的なプローブをハイブリダイズさせる。このとき、検出されるバンドの長さの違いから、対象となる領域のメチル化の有無を知ることができる。
【００４９】
これらの方法において用いる「メチル化感受性制限酵素」とは、例えばＳｍａＩ及びＨｐａＩＩであり、好ましくはＳｍａＩである。それらのメチル化感受性酵素と同じ認識配列を認識する非メチル化感受性酵素は当業者が容易に知ることができ、これをメチル化感受性酵素と組み合わせて上記のようなＤＮＡメチル化の検査方法において用いることができる。
【００５０】
これらの方法を用いるメチル化の検査における、腎細胞癌関連領域でのメチル化の有無の判定基準は、当業者ならば公知の統計学的手法等を用いて適宜決定することができる。具体的には、腎細胞癌検体の予後不良群を陽性対照とし、予後良好群を陰性対照として、所望のＤＮＡメチル化検査法により腎細胞癌関連領域のＤＮＡメチル化状態を調べる。その結果を陽性対照と陰性対照とで比較することにより、各腎細胞癌関連領域について有意な測定値の閾値を決定する。それにより、その閾値を用いたメチル化検査で陽性（又は陰性）と判定された場合に、検査対象の検体を予後不良群に含めるべきであると規定することができる。
【００５１】
アレイ
本発明は、さらに、上記のように特定された１４のＢＡＣクローン又は７０のＢＡＣクローンを搭載した、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイにも関する。
この場合、「アレイ」とは、適切な基板上にゲノム配列を含む複数のＤＮＡを位置特異的な様式で定着（スポット）させたデバイスを意味する。基板は、好ましくは固体基板であり、具体的には、ガラス、プラスチック、メンブレン等が挙げられる。好ましい基板はスライドガラスのようなガラス基板である。ガラス製の固体基板には、ＤＮＡの定着の前に、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着によるコーティングを施すことが望ましい。
【００５２】
また、この関連で、「腎細胞癌」とは特に組織学的分類により淡明細胞癌に分類されたものを指す場合がある。
【００５３】
本発明を、実施例を用いて以下により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によりなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
腎細胞癌（淡明細胞癌）検体のクラスタリング
ＢＡＭＣＡ法の結果に基づく階層的クラスタリング（教師なし法）により、５１の淡明細胞型腎細胞癌組織検体を、４３検体（クラスターＡ）と８検体（クラスターＢ）の２クラスターに分類した（図２）。以下に説明するＢＡＭＣＡ法の実施については、文献（Ｍｉｓａｗａ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６５：１０２３３−１０２４２，２００５；Ｓｕｇｉｎｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：７４０１−１３，２００７；Ｔａｎａｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：６４５６−６８，２００７）にも記載されている。
【００５５】
腎細胞癌組織と正常腎組織から、フェノール／クロロホルム法によりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化した。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で腎細胞癌組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅した。一方、正常腎組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ５にて標識した。蛍光色素での標識は、ＢｉｏＰｒｉｍｅ ａｒｒａｙ ＣＧＨ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。アダプターライゲーション及びＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｌ：ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣ（配列番号２１）
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｓ：ＣＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡ（配列番号２２）
ＰＣＲはＡｄａｐｔｏｒ−Ｌと同一の配列を有するプライマーを用いて行った。
【００５６】
腎細胞癌組織由来のＤＮＡ断片と正常腎組織由来のＤＮＡ断片の両者を混合し、４３６１種類のＢＡＣクローンを搭載した高密度ＣＧＨアレイ（ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００；Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。競合ハイブリダイゼーションは、以下の条件により行った：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にてエタノール沈殿した。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させた。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて４８〜７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせた。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行った。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行った。
【００５７】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０）によって数値化し、腎細胞癌検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出した。
【００５８】
ここで、腎細胞癌組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては認識されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅され、プローブが生成される。その結果、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（腎細胞癌）／Ｃｙ５（正常対照）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。ＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００５９】
階層的クラスタリング（教師なし法）の詳細は、例えば、宮本定明著「クラスター分析入門−ファジィクラスタリングの理論と応用（森北出版、１９９９）」などに記載されている。階層的クラスタリング（教師なし法）は、似ているものを集めて分類するデータマイニングの手法のひとつである。階層的クラスタリングでは、まず、Ｎ個の対象からなるデータが与えられた場合、１個の対象だけを含むＮ個のクラスターがある初期状態をつくり出し、対象間の距離（非類似度）からクラスター間の距離を計算し、この距離が最も近い２つのクラスターを逐次併合する。この併合をすべての対象がひとつのクラスターに併合されるまで繰り返すことで階層構造を獲得し、この階層構造をデンドログラムによって表示する。教師なし法は、与えられたデータを外的基準なしに自動的に分類する手法である。
【００６０】
この階層的クラスタリング（教師なし法）により、上記のＢＡＭＣＡ法を用いて得られた測定結果を分析し、５１の検体をクラスターＡ及びクラスターＢに分類した。非常に簡略化して言えば、これらのクラスターはＤＮＡメチル化パターンの違いにより分類されたと言うことができる。
【００６１】
クラスターＡとクラスターＢについて、臨床病理学的因子（顕微鏡的静脈侵襲、肉眼的腎静脈腫瘍栓及び臨床病期）を比較した（図３）。これらの因子に基づく悪性度では、クラスターＢの方がより悪性であり、その差異は統計学的に有意であった。
【００６２】
また、これらのクラスターについて、術後生存期間を比較すると、クラスターＢの方が顕著に予後が悪かった（図４）。
【００６３】
以上の結果から、実施例１でＢＡＭＣＡ法を用いるゲノム領域のＤＮＡメチル化パターンの階層的クラスタリング（教師なし法）から特定されたクラスターＡ及びＢは、臨床的悪性度及び術後生存期間に関して顕著な差異を有することが明らかとなった。このことは、ゲノム領域のＤＮＡメチル化パターンから、組織学的観察からは予測し得ない、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することが可能であることを示している。
【実施例２】
【００６４】
腎細胞癌関連領域の同定
ＤＮＡメチル化パターンの解析により腎細胞癌の予後不良リスクを決定するのに有効なゲノム領域を特定するために、上記５１検体の腎細胞癌検体を実施例１で特定した予後良好クラスターＡ及び予後不良クラスターＢに分類するのに有効なＢＡＣクローンを同定した。同定の手順は以下の通りである。
（１）はじめに、各検体が予後不良クラスターＢに属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝既定の判定基準により予後不良リスクが高いと判定される症例数／階層的クラスタリングで実際にクラスターＢに属していた症例数×１００（％）
特異度＝既定の判定基準により予後不良リスクが低いと判定される症例数／階層的クラスタリングで実際にクラスターＡに属していた症例数×１００（％）。
（２）上記５１検体の腎細胞癌検体のうち階層的クラスタリングでクラスターＢに振り分けられた症例を予後不良群に分類する際の感度及び特異度が、総合して最も高くなるように、アレイ上の各ＢＡＣクローンに対して検出値の閾値を設定した。具体的には、アレイ上のすべてのＢＡＣクローンに関して、クラスターＡに属する４３検体とクラスターＢに属する８検体の間で、Ｃｙ３／Ｃｙ５蛍光強度比についてウィルコクソン検定を行った。検定から導き出されたＰ値を参考にして、両クラスター間に有意差がある約１２０クローンを抜き出した。それらのクローンについて、蛍光強度比を縦軸にとった散布図を描き、該散布図から予後不良リスク判別の閾値を導いて、各クローンについての判定基準を定めた。
散布図の一例を図５に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−７１Ｈ２０については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が１．０未満であるとき、クラスターＢに属する検体を感度１００％、特異度１００％で予後不良群に分類することができる。
（３）上記（２）で設定した判定基準を用いた場合、クラスターＢに属する症例を予後不良群に分類する際の感度及び特異度が、感度１００％、特異性９０％以上となったＢＡＣクローンを特定した。それらのクローンに含まれるゲノム領域を、腎細胞癌関連領域と称した。
【００６５】
同定された腎細胞癌関連領域のＢＡＣクローンは、以下の７０クローンである：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１。
【００６６】
７０クローンについての判定基準
上記（３）で特定した腎細胞癌関連領域７０クローンについて、予後不良の判定基準を以下の表１に示す。判定基準の数値は、実施例１で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００６７】
【表１】
【００６８】
上記（３）で同定した７０クローンについて、上記（２）で設定した判定基準を用いた場合の感度及び特異度を、図６に示す。
【００６９】
上記のとおり、感度１００％、特異性９０％以上で予後不良リスクの高い検体を選定できるように判定基準及び腎細胞癌関連領域を定めているが、特に、ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３の１４のＢＡＣクローンを用いると、感度１００％、特異性１００％で判定を行うことができた（図６）。
【００７０】
考察
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された腎細胞癌関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、これらの領域のうちの１つについてのみ検査した場合でさえ、多くの場合予後良好である淡明細胞型腎細胞癌の中から、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００７１】
すなわち、上記の７０クローン又は１４クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、腎細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。
【００７２】
本発明によれば、組織学的観察などの既存の分類基準では検知し得ない、腎摘除術後の腎細胞癌の予後不良リスクを判定することができる。腎細胞癌の治療方法としては腎摘除術が第一選択であるが、転移・再発を早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬などの奏効が期待できる。よって、本発明により腎摘除術の対象となる大多数の腎細胞癌症例において、予後不良リスクが高い患者にはより精密な転移・再発スクリーニングを行い、その場合には早期発見により治療成績を向上させ得ると期待され、一方で、予後不良リスクが低い患者では転移・再発スクリーニングの負担を軽減させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、組織学的観察などの既存の分類基準では検知し得ない、腎細胞癌の予後不良リスクを判定することができる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＢＡＭＣＡ法の概略を示す模式図である。
【図２】淡明細胞型腎細胞癌検体についての腎細胞癌関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく階層的クラスタリング（教師なし法）を示す図である。
【図３】ＤＮＡメチル化状態に基づく淡明細胞型腎細胞癌のクラスター分類が、腎細胞癌症例の臨床病理的悪性度と相関することを示す表である。
【図４】ＤＮＡメチル化状態に基づく淡明細胞型腎細胞癌のクラスター分類が、腎細胞癌症例の予後と相関することを示すグラフである。
【図５】各ＢＡＣクローンにおける、予後不良クラスターの判定のための判断基準を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図６】各ＢＡＣクローンを用いる予後不良群の判定での感度及び特異性を表す表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
【請求項２】
ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域を包含する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域を包含する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１のいずれか１以上を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【請求項８】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３のいずれか１以上を含む、請求項７に記載のアレイ。
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）被験体の腎組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、腎細胞癌関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
【請求項２】
ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域を包含する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記腎細胞癌関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域を包含する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記腎細胞癌関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、ＲＰ１１−４４Ｆ３；ＲＰ１１−１４Ｊ１５、ＲＰ１１−２５３Ｏ１０、ＲＰ１１−３５９Ｈ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３５４４）、ＲＰ１１−２６０Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２４５８８）、ＲＰ１１−３Ｄ１５、ＲＰ１１−８９Ｎ１４、ＲＰ１１−１１０Ｌ１３、ＲＰ１１−１６０Ｄ１３、ＲＰ１１−１７０Ｏ１６、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００６２０６）、ＲＰ１１−１４１Ｎ１、ＲＰ１１−４１６Ａ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５６０５５）、ＲＰ１１−１２６Ｊ１４、ＲＰ１１−２７７Ｅ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７５３６）、ＲＰ１１−４６９Ｊ７、ＲＰ１１−２１３Ｃ２０、ＲＰ１１−３Ｊ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３８７５２）、ＲＰ１１−２３０Ａ１３、ＲＰ１１−１８Ｂ１４、ＲＰ１１−９０Ｊ１４、ＲＰ１１−７９Ｅ２２、ＲＰ１１−８７Ｃ１６、ＲＰ１１−２６４Ｎ７、ＲＰ１１−２７３Ｊ１０、ＲＰ１１−８０Ｈ４、ＲＰ１１−９１Ｅ２４、ＲＰ１１−５１６Ｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２５０４３）、ＲＰ１１−３Ｎ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１１２１２）、ＲＰ１１−１１０Ｉ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１０５１７８）、ＲＰ１１−４０Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１６１７８７）、ＲＰ１１−８０Ｆ１３、ＲＰ１１−１５Ｃ９、ＲＰ１１−３２８Ｊ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１２４７５）、ＲＰ１１−１４０Ｋ１６、ＲＰ１１−７５Ｈ６、ＲＰ１１−３０１Ｋ１７、ＲＰ１１−１３９Ｅ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００９２４８）、ＲＰ１１−５１Ｏ５、ＲＰ１１−４８Ｍ７、ＲＰ１１−２２Ｂ２４、ＲＰ１１−８１Ｄ１、ＲＰ１１−１２０Ｏ１１、ＲＰ１１−５９Ｈ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７２１５）、ＲＰ１１−７Ｇ２、ＲＰ１１−８９Ｐ８、ＲＰ１１−１２８Ｊ２、ＲＰ１１−１１７Ｎ１４、ＲＰ１１−３９７Ｄ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５８１５５）、ＲＰ１１−１４Ｃ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１５９９９１）、ＲＰ１１−１２２Ｋ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ００７４８９）、ＲＰ１１−４４２Ｏ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０２６４６９）、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＲＰ１１−６３Ｐ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ１３５９２４）、ＲＰ１１−８０Ｊ１６、ＲＰ１１−４２９Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０７３３６４）、及びＲＰ１１−７９Ｅ１１のいずれか１以上を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【請求項８】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−７１Ｈ２０、ＲＰ１１−９０Ｍ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０９２４１７）、ＲＰ１１−９０Ｂ２３、ＲＰ１１−７９Ｃ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ１１２２０４）、ＲＰ１１−１１０Ｌ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４９３０５）、ＲＰ１１−５０８Ｎ１６、ＲＰ１１−４２Ｂ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ３５８７９１）、ＲＰ１１−１８２Ｐ７、ＲＰ１１−８７Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０１６０４２）、ＲＰ１１−４０８Ｌ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣ０６７７４６）、ＲＰ１１−４５３Ｄ５、ＲＰ１１−４４４Ｆ１５、ＲＰ１１−３Ａ９、及びＲＰ１１−４４Ｆ３のいずれか１以上を含む、請求項７に記載のアレイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−６３４１３（Ｐ２０１０−６３４１３Ａ）
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３３４９１（Ｐ２００８−２３３４９１）
【出願日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、「健康安心プログラム／個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発／染色体解析技術開発／癌の染色体構造異常の解析と診断のコンテンツ開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、「健康安心プログラム／個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発／染色体解析技術開発／癌の染色体構造異常の解析と診断のコンテンツ開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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