ＢＭＰ結合タンパク質に関する外科的適用
【課題】主な限定課題は、持続的な生物学的に適当な濃度のＢＭＰ−２を癒合ベッドの側部に提供する、よりよい送達システムの必要性である。ＢＭＰ群は非常に短い生物学的半減期、すなわち完全な骨形成性応答を刺激するために必要とされる数日または数週間というよりむしろ、通常数分または数時間というオーダーを有するため、送達は持続される必要がある。
【解決手段】本発明は、骨の治癒への適用、例えば脊椎手術において使用するためのＢＢＰの、単独、または他の成長因子と組み合わせての臨床適用に関する。付加的な適用として、整形外科の埋め込み可能な人工関節、および骨が所望されるその他の手術部位（例えば外科的再建、局所的骨減少症など）内への埋め込みを含む。
【解決手段】本発明は、骨の治癒への適用、例えば脊椎手術において使用するためのＢＢＰの、単独、または他の成長因子と組み合わせての臨床適用に関する。付加的な適用として、整形外科の埋め込み可能な人工関節、および骨が所望されるその他の手術部位（例えば外科的再建、局所的骨減少症など）内への埋め込みを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１２月２２日に提出された米国仮特許出願６０/８７６，８２１号からの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
成長因子はin vivo またはin vitroにおいて、定義された細胞集団の成長および分化に影響を及ぼす、ペプチドを含む物質である。正常な骨の形成は発育中に起こり、骨のリモデリングは成体期に起こり、そして骨の修復は骨格の完全性を保存するために起こる。骨の形成、リモデリングおよび修復は、破骨細胞による骨の再吸収、および骨芽細胞による骨の形成を伴う。細胞の分化ならびに骨芽細胞および破骨細胞の活性は、成長因子により制御される。このように細胞の分化および再吸収のバランス間へのあらゆる干渉が、骨の恒常性、骨の形成および修復に影響し得る。
【０００３】
骨芽細胞は骨髄間質細胞(marrow stromal cells)（間葉系幹細胞としても知られている）のプールから送達される。ＭＳＣは多様な組織中に存在するが、骨髄間質中に豊富に存在する。ＭＳＣは多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞、および脂肪細胞を含む軟骨形成性または骨形成性の細胞に分化することができる。
【０００４】
脱灰骨マトリックス（demineralized bone matrix、ＤＢＭ）による異所性骨形成の誘導が記述された（Urist, M.R.:Bone:Formation by autoinduction（骨：自己誘導による形成）. Science 150:893-899, 1965; Urist, et al., Purification of bovine morphogenetic protein by hydroxyapatite chromatography（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるウシ骨形成タンパク質の精製）. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :371-375, 1984; Urist, M. R. Emerging concepts of bone morphogenet-protein（骨形成タンパク質の新興概念）. Fundamentals of Bone Growth: Methodology and Applications, Boston CR. C. Press, pp. 189-198, 1991.）さらに部分的に精製されたタンパク質画分である骨形成タンパク質/非コラーゲン性タンパク質(bone morphogenic protein/non-collagenous protein)（“ＢＭＰ/ＮＣＰ”または“ＢＭＰ”群）の特性について記述された。（Urist, et al. Methods of Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and Polypeptide Fragments（骨形成タンパク質およびポリペプチドフラグメントの調製法およびバイオアッセイ法）. Methods in Enzymology. Vol. 146. New York, Academic Press, pp. 294-312, 1987; Urist, et al., Hydroxyapatite affinity, electroelution, and radioimmunoassay for identification of human and bovine bone morphogenetic proteins and polypeptides（ヒトおよびウシの骨形成タンパク質およびポリペプチドの同定のためのヒドロキシアパタイトアフィニティー、電気泳動による溶出、およびラジオイムノアッセイ）. Development and Diseases of Cartilage and Bone Matrix. New York, Alan R, Liss, Inc., pp. 149-176, 1987.）
ＢＭＰ/ＮＣＰは均一なレベルまでは精製されていないが、他の研究者らは類似の出発材料を使用して、いくつかのリコンビナント“ＢＭＰ群”をクローン化している。しかしこれら分子のいくつかは、骨形成活性をほとんどまたは全く持っていない。“ＢＭＰ群”およびその他の骨形成性因子は、臨床適用にて使用するために研究されてきた。しかしＢＭＰ−７（ＯＰ−１としても知られている）の最小の有効投与量を使用するコストが、例えば臨床での使用の限定要因となってきた。それ故、有効かつ入手可能な組成物および方法が骨に関する臨床適用のために求められている。
【０００５】
骨の治癒を増強するためのアジュバント療法は、整形外科の多くの側面において重要であるが、迅速かつ徹底的な骨形成が重大な意味を持つ脊椎固定に関しては特に重要である。現在利用可能な最も有用な薬剤として、骨成長因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ群）を含む。これらのタンパク質は、未分化の中胚葉系細胞での内軟骨性骨形成の反復発生を誘導する。しかしそれらの有用性は、費用により、そして局所的有害作用、例えば脊椎固定術に今日使用される用量に付随する望ましくない異所性骨形成、および炎症反応により限定されている。
【０００６】
さらに、より長い癒合に使用される場合の、高用量のＢＭＰ群の潜在的な全身性有害作用は十分には決定されていない。それ故、より安全で、より安価な、そしてより効果的なアジュバント剤を提供するため、いくつかの戦略が開発されている。
【０００７】
脊椎固定のための骨の発生装置としてのＢＭＰ-２の使用は、ますます注目されるようになってきている。最近の研究は、全脊柱管を通して前方固定術および後方固定術の双方についてＢＭＰ−２を効率的に使用してよいことを示した。しかしＢＭＰ−２が非常に高価であること、ならびに報告されている局所的副作用、例えば望ましくない骨形成、および前頚部固定術後の危険な首の腫脹が、脊椎固定術へのその広範な使用の妨げとなってきた。現在、ＢＭＰ−２の有効性を増大させると同時に、その用量を減少し副作用をコントロールすることに、焦点がシフトしてきている。主な限定課題は、持続的な生物学的に適当な濃度のＢＭＰ−２を癒合ベッドの側部に提供する、よりよい送達システムの必要性である。ＢＭＰ群は非常に短い生物学的半減期、すなわち完全な骨形成性応答を刺激するために必要とされる数日または数週間というよりむしろ、通常数分または数時間というオーダーを有するため、送達は持続される必要がある。例えばｒＢＭＰ−２は、わずか数時間の半減期を有すると記述されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、成長因子、例えばｒｈＢＭＰ−２と貪欲に結合するＢＭＰ結合ペプチド（ＢＢＰ）と名付けられた環状ペプチドに関する。ＢＢＰは、ｒｈＢＭＰ−２が骨の形成を誘導する速度および程度を増大させる。ＢＢＰは、他の骨成長因子の滞留率を増大させることによりこれを達成する。しかしＢＢＰは単独では軟骨形成細胞、骨形成細胞、および骨芽細胞の石灰化を誘導する。ＢＢＰを含む組成物および物質、ＢＢＰに対する抗体、ならびにＢＢＰを使用する方法は、骨に関する適用において有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様において本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を高め、そして/または骨の修復を高めるための薬剤を用いての治療法を含んでよい。
【００１０】
１つの態様において本発明は、骨を誘導する物質、例えばＢＭＰの滞留時間を増大するための方法およびデバイスを含む。１つの態様において本発明は、骨を誘導する物質、例えばＢＭＰの速度および骨形成活性全体を増大するための方法およびデバイスを含む。さらに１つの態様において本発明は、骨を誘導する物質による骨形成および石灰化の効果に必要な時間を短縮するための方法およびデバイスを含む。
【００１１】
本発明の１つの適用において本方法は、骨の局所的な修復を誘導するため、または骨に関連する障害、例えば骨粗鬆症を治療するために適用してよい。本発明の１つの態様においてＢＢＰは、膜性骨の癒合（例えば脊椎固定）または内軟骨性骨の癒合におけるその他の骨成長因子の効果を誘導するために使用してよい。
【００１２】
１つの態様において本発明は、薬剤を保有するインプラント、または骨の形成もしくは修復を誘導するための多能性細胞もしくは分化した細胞を植え付けたインプラントを含んでよい。本発明はまた、骨の形成または骨の修復が所望される部位での、物質または分化した細胞の投与を含んでよい。
【００１３】
本発明は、少なくともＢＢＰ単独で、または軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞の石灰化を高めるその他の成長因子との組み合わせにおいて、有利である。さらに本発明は少なくとも、ＢＢＰが骨形成性を高めて、より速くより広範囲に骨形成を起こさせ、そのことがＢＭＰによる治療の臨床速度および有効性を改善し、そして用量を低減し、それ故にＢＭＰ単独治療のコストおよび副作用を低減する点で、有利である。
【００１４】
これらならびにその他の目的、特色および利点は、以下の説明のための態様および付記した図面の詳細な記載のまとめから今明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは各々、ウシＢＢＰの（１）アミノ酸配列、および（２）核酸配列である。図１Ｂは、シスタチン相同領域、ＢＭＰ−２相同領域、およびＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメインを示す、ウシＢＭＰ結合タンパク質（“ＢＢＰ”）の部分的なアミノ酸配列である。
【図２】図２は、ヒトＢＭＰ−２、およびウシＳＰＰ−２４のＢＭＰ−２相同領域のアミノ酸配列アラインメントである；（ｉ、同一；ｃ、保存的置換；ｓｃ、半保存的置換）。
【図３】図３は、ウシフェチュインおよびヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ（上）、ならびにヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩおよびウシＳＰＰ−２４（ＢＢＰに対応する）のＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメイン（下）のアミノ酸配列アラインメントである；（ｉ、同一；ｃ、保存的置換；ｓｃ、半保存的置換）。
【図４】図４は、アテロコラーゲン中の５００μｇのＢＢＰ（上）、またはアテロコラーゲン単独（下）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。
【図５】図５は、アテロコラーゲン中の５００μｇのＢＢＰの埋め込み後２１日のマウス筋肉の組織学的切片である。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率１００Ｘ。）
【図６】図６は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。
【図７】図７は、５μｇのＢＭＰ−２（左）、または５μｇのＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後、９日（上）および１２日（下）のマウス後四半身のＸ線写真である。
【図８】図８は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（Ａ）、および５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００μｇのＢＢＰ（Ｂ）の埋め込み後９日の、マウス後四半身の組織学的切片である。
【図９】図９は、ｒｈＢＭＰ−２（チップに固定）および１×１０−５Ｍから１×１０−４Ｍの範囲の濃度での環状化ＢＢＰの相互作用に関する、表面プラズモン共鳴のセンサグラムである。
【図１０】図１０は、ＢＢＰの存在下または不在下における１、３、および７日にわたるｒｈＢＭＰ−２保持のパーセントを示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、特異的ＳＳＰ−２４/ＢＢＰ抗体が産生されるアミノ酸配列を含む。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の例示としての方法の流れ図を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明の例示としての方法の流れ図を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の２つの態様を図示したものである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本発明の２つの態様を図示したものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、様々な種におけるＢＰＰに関するアミノ酸配列（上から順に各々配列番号１１、１および１２−１９）を示すチャートである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、様々な種におけるＢＰＰに関する核酸配列（上から順に各々配列番号２０−２８）のリストである。
【図１５】図１５は、ＢＢＰ高用量（１０００μｇ）＋ｒｈＢＭＰ−２低用量（１μｇ）の投与によるＬ４−Ｌ５で癒合したラット脊椎の前後方向のＸ線写真である。
【図１６】図１６は、ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）治療の投与による右側の偽関節炎（および）左側Ｌ４−Ｌ５の癒合を示す、ラット脊椎の前側−後側のＸ線写真である。
【図１７】図１７は、ＢＢＰおよびｒｈＢＭＰ−２の組み合わせの治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片である。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４Ｘ。）
【図１８】図１８は、低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）による治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片である。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４Ｘ。）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の１つの態様は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。ウシ由来アミノ酸配列番号：１はＢＢＰと命名されており、配列番号：２は、ＢＢＰをコードするウシ核酸配列に対応する。
【００１７】
本発明の１つの態様は、ヒトＢＢＰの配列である、配列番号１２のアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。配列番号２１は、ヒトＢＢＰをコードするヒト核酸配列に対応する。
【００１８】
ＢＢＰは、公知の２４ｋＤ分泌型リン酸化タンパク質（24 kD secreted phosphoprotein、“ＳＰＰ−２４”）の１８．５ｋＤフラグメントに由来する、１９アミノ酸、２．１ｋＤペプチドである。ＳＰＰ−２４は、配列番号：２により表される。ＳＰＰ-２４は、ＢＭＰ−２に誘導される骨形成を著しく阻害する。ＢＢＰは、ＳＰＰ−２４のシスタチン様ドメインを含有する。ＢＢＰは、少なくとも肝臓および骨（少なくとも脱灰皮質骨および骨膜を含む）において発現される。
【００１９】
ＢＢＰアミノ酸配列は、プロテアーゼインヒビターのシスタチンファミリーのメンバーであるフェチュインの、ＴＧＦ−β/ＢＭＰ結合領域に類似する。ＢＢＰは、ＫＤ ×１０−５ＭでｒｈＢＭＰ−２（リコンビナントヒトＢＭＰ−２）に貪欲に結合する。ＢＢＰはまた、ＢＭＰ−２に類似する結合ドメインを有するその他の分子、例えば他のＴＧＦ−βタンパク質（ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、ＢＭＰ−９、およびＴＧＦ−βを含むがこれに限定されない）とも結合し、それらの保持率および/または活性にも同様に影響を与えと思われる。例えばＢＭＰ−４およびＢＭＰ−２間には高度の程度の配列類似性（約９０％）がある。加えて様々な骨誘導性のＢＭＰ群（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、およびＢＭＰ−９）が、同じ受容体に（アフィニティーに多少の変動はあるが）結合することが実証された。それ故、配列および結合の類似性を考慮すると、これらの付加的なＢＭＰ群との結合が予想される。本発明において有用な付加的な成長因子として：ＧＤＦ５、およびその他のＢＭＰ群、例えばＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９を含んでよい。
【００２０】
ＢＢＰは単独では、脊椎動物の軟骨形成性および骨形成性の前駆細胞の石灰化を誘導する。ＢＢＰは、ｒｈＢＭＰ−２が誘導する骨の形成の速度および程度の増大を増大させる。驚くことにin vivoにおいてＢＭＰ−２と組み合わせたＢＢＰは、ＢＭＰ−２単独の効果と比較して、より少量のｒｈＢＭＰ−２を用いて、より速くそしてより広範囲に起こる骨形成を引き起こす。この結果は、上に考察したようにＢＭＰ−２による骨の形成を阻害するＳＳＰ−２の役割を考慮すると、予想外であった。
【００２１】
例えば、マウス筋肉中にＢＢＰを単独で埋め込んだ場合、ＢＢＰは異栄養性石灰化を誘導する。“マウスの後四半身”モデルまたは“筋肉の窪み”モデルの、修復時の骨形成または異所性骨形成におけるプロセスは、内軟骨性骨形成を要約するものである。最初のステップは軟骨の産生であり、これが骨に置き換わる。同じプロセスは、発育中の内軟骨性骨形成時に起こるが、一方ある種の膜性骨形成は、軟骨という中間体を経ずに直接起こる。
【００２２】
本発明の１つの態様において、ＢＢＰのフラグメントが、哺乳類の細胞におけるＢＭＰ−２による骨形成の程度もしくは速度を増大する、あるいは脊椎動物の細胞、または特に哺乳類の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞における石灰化の程度もしくは速度を増大するのであれば、そのフラグメントを包含するペプチドは、同様に有用であると思われる。
【００２３】
配列番号１のアミノ酸の修飾を有するＢＢＰの形もまた、本発明において有用である。例えば種間で保存されたＢＢＰのアミノ酸配列、欠失または挿入による修飾、保存的または半保存的置換による修飾は、修飾されたアミノ酸配列がＢＭＰ−２またはその他のＴＧＦ−β相同分子の滞留時間および/または活性を増大する限りにおいて、主張したＢＢＰに包括的に含まれることを意図する。ＢＢＰは、β−プリーツシート−ターン−シートプリーツシート分子のモチーフ（“Ｂ−Ｔ−Ｂ”）である。成長因子が結合するアミノ酸残基は、Ｔ−部分に属すると、現在考えられている。それ故、Ｔ−部分におけるアミノ酸の置換は、Ｂ領域における置換より大きくＢＢＰの活性に影響を及ぼすと思われる。
【００２４】
上のようにＢＢＰは、成長因子が埋め込み部位に留まっている時間量（“滞留時間”）を増大する、および/またはＢＭＰ−２もしくはその他のＴＧＦ−β相同分子の全体的な活性を増大することにより、ＢＭＰ−２のような成長因子の効果を増大すると考えられる。例えばＢＭＰ単独では、埋め込み部位から急速に除去されるが、一方ＢＢＰと共にＢＭＰを埋め込むと、滞留時間を増大することが示された。滞留時間の増大は、例えば：１）成長因子の半減期を増大するＢＢＰ群の能力（例えばタンパク質分解の速度を低減することによる）、および/または２）投与部位からの成長因子の拡散速度の低下、に起因すると思われる。
【００２５】
本発明の１つの態様は、ＢＢＰに関する哺乳類の共通配列である、配列番号１１の配列：Ｃ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｖ−Ｘ−Ｙ−Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｖ Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｃを有するペプチドを包含する。図１４Ａは、ウシ（配列番号１；核酸配列は配列番号２で示す）、ヒト（配列番号１２；核酸配列は配列番号２１で示す（９位はＡまたはＶのいずれかである））、ブタ（配列番号１３；核酸配列は配列番号２２で示す）、ヒツジ（配列番号１４；核酸配列は配列番号２３で示す）、ラット（配列番号１５；核酸配列は配列番号２４に示す）、およびマウス（配列番号１６；核酸配列は配列番号２５で示す）のＢＢＰにわたる、アミノ酸配列の相同性を示す。図１４Ａはまた、ニワトリ（配列番号１７；核酸配列は配列番号２６で示す）、サケ（配列番号１８；核酸配列は配列番号２７で示す）、およびマス（配列番号１９；核酸配列は配列番号２８で示す）における高度に保存された領域を示す。
【００２６】
図１４Ａにおいて“Ｘ”および“Ｙ”は、各々半保存的または保存的であると理解されるアミノ酸の置換を表示するために使用する。保存的置換は同じグループから選択されるアミノ酸を含み、半保存的置換は、ＢＭＰ−２結合ドメインまたはＢＢＰの機能に影響を与えないと考えられる置換を含む。例えば６位の置換は、ヒト、ラットおよびヒツジ間で保存的であるが、いくつかのその他の種では半保存的である。というのは異なる種でその位置で報告されたアミノ酸は：ＱおよびＥ（ブタ、ラットおよびマウスのＢＢＰではＱ、ニワトリではＥ）であるからである。ＫおよびＲは双方とも塩基性アミノ酸と分類されるが、Ｑは非電荷の極性アミノ酸と分類され、それ故置換は保存的ではない。しかしＢＢＰの機能は影響を受けないと考えられるため、置換は半保存的である。半保存的置換はまた９、１０、１１および１６位にも見出される。９位では、アミノ酸Ａがウシ、ヒト、ブタおよびヒツジのＢＢＰにおいて、それに比してＫがラットおよびマウスのＢＢＰにおいて見出される。１０位では、アミノ酸Ｅがウシ、ブタ、およびヒツジのＢＢＰに関して報告されており、ヒトＢＢＰはその位置にＱを含有し、ラットおよびマウスのＢＢＰはアミノ酸Ｇを含有する。１１位では、アミノ酸Ｑがウシ、ヒト、ラットおよびマウスにおいて見出され、一方Ｋが、ブタＢＢＰに関して、そしてＲがヒツジＢＢＰに関して報告されている。１６位では、Ｗが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラットおよびマウスのＢＢＰにおいて見出されており、一方ヒトＢＢＰはＨを含有する。１３および１４位でも、他の種とは対照的にラット/ヒト間で反保存的な置換が存在する。
【００２７】
保存的置換の例は、７位に見出される。この位置では異なる種において異なる疎水性アミノ酸が、すなわちウシ、ヒツジ、ラット、およびマウスのＢＢＰではＭが、それに比してヒトＢＢＰではＶが、そしてブタＢＢＰではＩが観察される。Ｍ、Ｖ、およびＩはすべて疎水性アミノ酸であるため、この置換は保存的であると考察される。他の保存的置換は、１７および１８位にある。２つの疎水性アミノ酸、ＡおよびＶが１７位で見出されている。１８位では、２つの塩基性アミノ酸、ＲおよびＨが見出されている。
【００２８】
本発明の１つの態様は、脊椎動物の細胞、またはより特定すれば哺乳類の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞における石灰化の程度または速度を増大するＢＢＰ、を含む組成物であってよい。さらに本発明は、ＢＭＰ−２、およびＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスの１つによる骨形成の、程度または速度を増大させるＢＢＰを含んでいてよい。さらに当該組成物は付加的にまたは代替え的に、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７を別々にまたはそれらの混合物を含むがこれに限定されない、他のＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含んでよい。
【００２９】
１つの態様において本発明は、治療有効投与量のＢＢＰを単独で、または成長因子、例えばＢＭＰまたはＤＢＭと組み合わせて含む、脊椎動物における骨形成の速度または程度の誘導において使用するための医薬剤を含んでよい。本発明はさらに、脊椎動物における石灰化の速度または程度の誘導において使用するための、ＢＢＰを包含するペプチドを含む医薬剤を含んでよい。
【００３０】
１つの態様において、ＢＢＰ、またはＢＢＰおよび１つもしくはそれより多くの他の成長因子との組み合わせは、骨の形成および/またはインプラントの統合が所望される部位での埋め込みのために、基材または担体、例えばコラーゲンスポンジまたは整形外科用のインプラントもしくは人工関節の上またはそれらの中にセットしてよい。
【００３１】
ＢＢＰに関する投与。ＢＢＰに関するいくつかの投与を、その薬理学的（生物学的活性）特性から示唆する。例えばＢＢＰは単独で、または他のＴＧＦ−βファミリーのメンバー、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７、もしくは脱灰骨マトリックスと組み合わせて、骨の形成を誘導する、骨の恒常性を維持する、および/または骨の修復を高めるための、臨床または研究の方法において使用してよい。ＢＢＰは、発育時または恒常性の骨の障害（例えば骨粗鬆症）、骨の傷害（例えば扁平（例えば膜性）骨および長管（例えば内軟骨性）骨の骨折治癒、癒合不全骨折）を治療するため、および再建手術のために、単独でまたは組み合わせて使用してよい。本発明はまた、歯周炎、歯周部の再生の治療、歯のインプラントの再建のための歯槽堤増大術、癒合不全骨折の治療、膝関節/股関節の修復術または置換術部位において使用してもよい。
【００３２】
一例として、ＢＭＰは脊椎固定を提供する上で有効であることが実証されているが、例えば、特に頚椎における炎症および異所性骨形成を引き起こす有害な副作用により、広範な使用は限定される。１つの態様において、ＢＢＰをより低用量のＢＭＰと組み合わせて使用して、その効能を保ち、投与部位でのその保持性を高めてよい。本明細書において考察するように、ＢＢＰは、リコンビナントヒトＢＭＰ−２を含むＢＭＰと結合することが実証されているが、in vitro およびin vivoにおいて７日間までというｒｈＢＭＰ−２の２倍の保持性を可能にした。
【００３３】
骨の恒常性を維持する方法、またはその能力のある化合物の臨床指数は、少なくともＤＥＸＡスキャンにより評価した場合の、体全体の異なる部位での骨密度の改善により証明される。骨折治癒における高められた骨の形成は、選択された時間間隔での骨折部位の標準的なＸ線によりルーチンに評価できる。上の指数を決定するためのより高度な技術、例えば定量的ＣＴスキャンまたは定量的な組織学的方法（例えば組織を処理、染色し、顕微鏡下で調べ、骨を画像分析により定義および測定する）を使用してもよい。さらに骨密度、骨領域、骨塩量、異所性骨の形成、およびＸ線検査での組織の不透過性の増加、アルカリホスファターゼ活性の発現、カルシウムの取り込み、ミネラル化、またはオステオカルシンｍＲＮＡの発現の測定を使用して、ＢＢＰの石灰化および/または骨形成性の効果を観察してもよい。
【００３４】
本発明はまた破骨細胞の骨再吸収を阻害する薬剤の使用を含んでよい。破骨細胞の骨再吸収（の阻害）を達成するために本発明において有用であると思われる薬剤として、ビスホスホネート製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニン、およびビタミンＤ/カルシウム補給剤を含むが、これに限定されない。本発明はまた、骨芽細胞の骨の形成を誘導する薬剤の使用を含んでよい。本発明に有用であると思われる薬剤として、ＰＴＨ、フッ化ナトリウム、ならびに成長因子、例えばインスリン用成長因子ＩおよびＩＩを含むが、これに限定されない。
【００３５】
ＢＢＰ単独の石灰化効果、またはＢＭＰと組み合わせての骨形成効果を示すために使用したin vivoモデルは、他の化合物の類似のふるまいを実証する上で、以前に使用されている。特にin vivoモデルはまた以前に化合物、例えばＢＭＰおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のin vivoの骨形成効果の予測に成功することを可能にした。具体的には、ラット大腿骨を使用する動物モデル、すなわち異所性骨形成モデルにおいてＢＢＰの骨形成効果が実証された。それ故これらの類似の知見に基づき、ＢＢＰは、ヒトにおいてin vivoでの骨形成効果を有すると予測される。これらのin vivoモデルにおいて化合物の骨形成効果を実証することが、in vivoのヒトにおけるそれらの効果を実証する試み前に必要である。
【００３６】
治療有効量。本発明において有用なＢＢＰまたはＴＧＦ−βファミリーのメンバーの治療有効量は、上に述べたように石灰化または骨形成性を高める薬剤の能力により測定した場合に、患者におけるポジティブな臨床効果または細胞における所望の効果を有する量である。各薬剤の治療有効量は、所望の臨床効果を達成し、同時にネガティブな副作用を最小とするように調節することができる。薬剤の投与量は、個々の投与計画、および特定の患者に適当な用量レベルを決定する時に、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢および体重、患者が受けているその他の薬物療法、ならびに担当医により通常考えられるその他の因子に依存して、個々の患者のために選択してよい。
【００３７】
本発明は、少なくとも骨形成の所定の速度または程度を誘導するために必要なＢＭＰ−２の投与量を、ＢＭＰ−２をＢＢＰと組み合わせた時には低減してよいという点において、有利であり、我々には予想外なことでもある。ＢＭＰは投与によってはコストがかさむ可能性があるため、この点は、少なくとも治療のコストを低減する上で有利である。さらに、ＢＭＰを組み合わせて治療することにより、ＢＭＰ（またはその他の骨成長因子）の治療の用量レベルを低減することは、例えば首の軟組織内の炎症、または異所性骨形成を含む、使用するＢＭＰの量に関連する副作用もまた、低減するものと思われる。このように外来の成長因子の保持を増大させるための、骨成長因子の結合剤としてのＢＢＰの使用は、治癒を達成するために必要な成長因子の量を低減することにより、成長因子の使用のネガティブな側面を克服する一助とすることができる。
【００３８】
投与剤形。投与剤形中に含まれる薬剤の治療有効量は、選択する薬剤のタイプおよび投与経路を考慮することにより選択してよい。投与剤形は、医薬分野の当業者に公知であるように、患者への投与の促進のためのアジュバント、および医薬的に受容可能な担体を含む、その他の不活性成分と組み合わせて、薬剤を含んでよい。
【００３９】
ＢＢＰの治療用剤形化は（請求項がＢＢＰの修飾またはフラグメントを含むことを意図する場合）、凍結乾燥したケークまたは水溶液の剤形中に、所望の程度の純度を有するＢＢＰを、所望の生理学的に受容可能な担体、賦形剤または安定剤と共に混合することにより、貯蔵用に調製してよい。受容可能な担体、賦形剤または安定剤は、利用する投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、バッファー、例えばリン酸、クエン酸およびその他の有機酸の塩；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン、を含む。その他の成分として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、およびその他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；ならびに/または非イオン性界面活性剤、例えばTween（ツイーン）、Pluronic（プルロニック）もしくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む。
【００４０】
投与剤形は、例えば皮下（例えば徐放性カプセルで）、静脈内、腹腔内、筋肉内、骨格周囲または骨格内用の調製物にて提供してよい。いずれか１つの薬剤、または薬剤の組み合わせを、投与剤形中に含んでよい。あるいは薬剤を組み合わせは、別々の剤形にて患者に投与してもよい。薬剤の組み合わせは、患者が治療のための少なくとも２つの薬剤に暴露されるような時間内に、同時に投与してよい。
【００４１】
付加的な薬剤。本発明は、ＢＢＰとは独立してまたは相乗的に作用して、石灰化および骨形成を高める付加的な薬剤を伴う治療を含んでよい。例えばＢＢＰは、ＢＭＰ、ビスホスホネート製剤、ホルモン療法治療薬、例えばエストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニン、およびビタミンＤ/カルシウム補給剤、ＰＴＨ（例えばForteo もしくはテリパラチド、EIi Lilly）、フッ化ナトリウム、ならびに骨にポジティブな効果を有する成長因子、例えばインスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、およびＴＧＦ−βと共に、組み合わせてよい。当業者は、標準的な治療投与量のパラメータを使用して、各治療に受容される投与量を決定する、またはＢＢＰの効果が第二の薬剤、例えばＢＭＰ群と相乗的である場合には低減した投与量を決定することができる。
【００４２】
ＢＢＰは、基材に含まれるＢＭＰ−２の滞留時間を少なくとも増大することにより、ＢＭＰ−２に作用すると今のところ考えられる。本発明の１つの態様は、一定量のＴＧＦ−β相同分子を第一および第二の選択された位置に投与することを含む、ＴＧＦ−β相同分子の滞留時間を高めるＢＢＰの能力を検出する方法である。さらに、選択された量のＢＢＰを第１の選択された位置に投与し、そして選択された時間間隔の後に第１および第２の位置のＴＧＦ−β相同分子の量を最終的に検出し；そして第１および第２の位置のＴＧＦ−β相同分子の量の間の差異を算出する。
【００４３】
１つの態様において本発明は、哺乳類細胞中のＢＭＰ−２およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーの１つ、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスによる骨形成、の程度または速度を増大させるＢＢＰの投与を含む、脊椎動物の組織における骨形成の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４４】
１つの態様において本発明は、ＢＢＰの投与を含む、脊椎動物の組織、またはより具体的には脊椎動物の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞の、石灰化を誘導する方法を含んでよい。
【００４５】
１つの態様において本発明は、患者の、骨形成の所望の位置の近位の位置に、軟骨形成性または骨形成性の前駆細胞を投与すること；さらにＢＢＰを投与すること、そしてＴＧＦ−βファミリーのメンバーの１つ、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスを投与することを含む、脊椎動物の組織における骨形成の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４６】
１つの態様において本発明は、患者の、石灰化の所望の位置の近位の位置に、骨形成性細胞を投与すること、そしてさらにＢＢＰを投与することを含む、脊椎動物の組織における石灰化の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４７】
１つの態様において本発明は、細胞の骨形成を誘導するために、脊椎動物の未分化の間葉系幹細胞を、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの１つ、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスで処置すること、さらに、間葉系幹細胞をＢＢＰで処置すること；そして脊椎動物の間葉系幹細胞を、患者の、骨形成の所望の位置の近位の位置に投与すること、を含む、脊椎動物における骨形成の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４８】
例えば、哺乳類の細胞、例えば間葉系幹細胞は、患者または細胞ドナーから採集することができる。この細胞は、骨の形成または修復が所望される位置（例えば骨の成長が必要とされる骨折部位もしくはインプラント部位）、またはＢＢＰおよび/もしくはＢＭＰで最初に処置した位置に注入してよい。その後この細胞は、患者に、全身、または石灰化（または）骨形成が所望される選択された部位のいずれかに、再投与してよい。加えて患者には、骨形成または石灰化を達成する少なくとも１つの付加的な薬剤で、局所的にまたは全身に処置してよい。
【００４９】
図１２ＡおよびＢは、本発明の例示としての方法の流れ図を示すが、そのステップはあらゆる順序で行ってよい。
【００５０】
本発明の１つの態様は、固体支持体上に固定化したＢＢＰを包含する製品を含んでよい。固体支持体はさらに、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスを含んでよい。
【００５１】
本発明の１つの態様は、少なくともインプラントの表面がＢＢＰを含む基材を含む、in vivoで使用するためのインプラントを含んでよい。インプラントはさらに、ＭＳＣ、軟骨細胞または骨芽細胞の前駆細胞を含んでよい。さらにインプラントは、例えばピン、ネジ、プレート、または人工関節の形に成形してよい。
【００５２】
例えば図１３Ａ＆Ｂは、本発明の２つの態様を示す。図１３Ａにおいて本発明は、表面（２０１）を有する基材を包含する、体内で使用するためのインプラントまたは移植片（２００）を含んでよく、その場合少なくともインプラントの表面は、周辺の組織における石灰化または骨形成を誘導するための十分量のＢＢＰ（２０３）を含む。インプラントは、間葉系幹細胞、ＢＢＰを発現する軟骨形成性細胞もしくは骨形成性細胞、および/またはＢＭＰ−２、脱灰骨マトリックス、もしくはコラーゲン培養物を含んでよい。インプラントはまた、ピン、ネジ、プレート、または人工関節の形であってよく、骨の除去、骨折、またはその他の骨傷害の部位（２０４）の形成または修復を刺激することにより、骨折を固定化し、骨の形成を高め、または人工関節のインプラントを安定化するために使用する骨（２０２）の近位に、または骨に接触して設置してよい。
【００５３】
図１３Ｂに示したように本発明はまた、in vitroの適用（例えばコラーゲンまたは軟骨細胞の培養において）、または骨（２０２）の近位にもしくは接触しての、少なくともＢＢＰを含有する組成物またはＢＢＰ発現細胞（２０６）のin vivo の投与、すなわち骨形成および/または石灰化が所望される骨除去、骨折またはその他の骨傷害の部位（２０４）でのインプラント（２００）、を含んでよい。ＢＢＰ組成物は、その他の薬剤、例えばＢＭＰ−２、脱灰骨マトリックス、またはコラーゲン培養物と組み合わせて投与してよい。
【００５４】
例えば、ヒトにおける骨に関連する障害を治療するための幹細胞の使用についてもまた、検討されてきた。健常な個体由来の骨芽細胞前駆体の幹細胞の、疾患の個体への注入は、これらの患者における骨密度を改善することが示された。細胞はＢＭＰおよびＢＢＰを用いて前処理してもよいし、またはそれらと共に同時に投与してもよい。
【００５５】
１つの態様において本発明は、ＢＢＰのあらゆる部分、またはＢＢＰ前駆体であるＳＳＰ−２４のＢＢＰ部分への選択的結合を有する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含んでよい。
【００５６】
ＢＢＰまたはそのフラグメントは、免疫原性ポリペプチドに（例えばリコンビナントの発現またはin vitroでの共有結合の方法により）融合させてよく、今度はこれを使用して、ＢＢＰに対する抗体を作成するために動物を免疫してよい。抗体は免疫された動物の血清から回収する。あるいは従来の様式で免疫された動物由来の細胞から、モノクローナル抗体を調製してもよい。固定化した抗体は、ＢＢＰの検出または精製において特に有用である。
【００５７】
ウサギのポリクローナル抗体を作成した特定のペプチド配列の２つの例として以下を含む：（１）ＢＢＰ前駆体であるウシおよびヒトのＳＳＰ−２４の双方と反応する、ペプチド配列“ＩＱＥＴＴＣＲＲＥＳＥＡＤＰＡＴＣＤＦＱＲＧＹＨＶＰＶＡＶＣＲＳＴＶＲＭＳＡＥＱＶ”（図１１−配列番号３）に対する抗体。この抗体は、上に示した合成ペプチドで免疫したウサギにおいて作成した。さらに（２）配列“ＣＧＥＰＬＹＥＰＳＲＥＭＲＲＮ”（図１１−配列番号４）に対して作成した抗体。この抗体もまた、示した配列に対応する合成ポリペプチドで免疫したウサギにおいて作成した。この２つ目の抗体は、ウシＳＳＰ−２４と反応する。Ｎ末端のシステインは、ネイティブＳＳＰ−２４配列の部分ではない；しかし好ましくは、このペプチドがアフィニティークロマトグラフィー用のクロマトグラフ樹脂に結合することを可能にするために含める。付加的なペプチド配列を、ＢＢＰとの特異的な結合のために同定してもよく、この配列を、ＢＢＰとの選択的結合を有する抗体を作成するために選択してよいが、ＢＢＰの結合、例えばＢＭＰ−２、またはその他のＴＧＦ−βファミリーのメンバーと結合するＢＢＰの領域（配列番号３および４を含む）を妨げないものとする。これらの特定のペプチド配列を使用して、モノクローナル抗体を作成することができ、この調製法は当該技術分野において公知である。
【００５８】
上の配列、マウス、ヒトおよびラットのゲノムにおける対応する配列、または免疫原性配列のあらゆる誘導体に対する抗体もまた、本発明において有用である。これらの抗体は、少なくともそれらが高い特異性を持ってＢＢＰアミノ酸配列を認識するという限りにおいて有用である。そのような抗体が、他の分子と相互作用するペプチド上の位置に結合する場合、その抗体はまた、ＢＢＰと他の分子とのタンパク質特異的な相互作用を阻害するという点で有用であると思われる。軟骨形成または骨形成の速度または程度が修飾されると思われる状況におけるＢＢＰ活性の阻害。
【００５９】
本発明の１つの態様において、ＢＢＰに対して特異的な抗体は、脊椎動物の細胞におけるＢＭＰ−２による骨形成の程度もしくは速度を減少させる、あるいは脊椎動物の細胞における、またはより具体的には哺乳類の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞における石灰化の程度もしくは速度を減少させる上で、有用であると思われる。
【００６０】
本発明の１つの態様はまた、サンプル（細胞培養液、組織サンプル、ペプチド画分、Westernブロットを含むがこれに限定されない）をＢＢＰ選択的抗体に暴露させ、ＳＳＰ−２４/ＢＢＰおよびＢＢＰ抗体の複合体を可視化することを含む、サンプル中のＳＳＰ−２４/ＢＢＰの存在を検出するために、ＢＢＰ選択的抗体を使用する方法を含む。
【００６１】
本発明の１つの態様においてＢＢＰ抗体は、リコンビナント細胞培養液または天然の原料からのＢＢＰのアフィニティーによる精製に使用してよい。他の成長因子と検出可能な交差反応をしないＢＢＰ抗体を使用して、これらの他のファミリーメンバーからＢＢＰを精製することができる。
【００６２】
１つの態様において本発明は、ＢＢＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列、または上述の修飾されたアミノ酸配列に対応する修飾された配列を包含する、核酸コンストラクトを含んでよい。
【００６３】
本発明はまた、ＢＢＰ、または前駆体のＳＳＰ−２４をコードする核酸配列に、操作可能なように連結した発現ベクターを含んでよい。さらにＢＢＰ、またはその前駆体であるＳＳＰ−２４をホスト細胞中にコードする核酸コンストラクトを導入することにより、形質転換体を得てもよい。
【００６４】
本発明の実践は、ＢＢＰ、および哺乳類またはウイルスの発現ベクター中に操作可能なように連結されたプロモーターをコードする配列を包含する、オリゴヌクレオチドコンストラクトの使用を含んでよい。発現ベクターおよびクローニングベクターは、そのベクターが１つまたはそれより多くの選択されたホスト細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターがホストの染色体とは独立して複製することを可能にするものであり、複製の原型または自発的に複製する配列を含む。そのようなクローニングベクターは、当業者に周知されている。発現ベクターはクローニングベクターと異なり、ホスト有機体により認識され、ＢＢＰ核酸に操作可能なように連結された、誘導可能なまたは構成的なプロモーターを含有してよい。核酸は、それが別の核酸配列との機能的関連性の中に置かれている場合、操作可能なように連結してよい。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがあるポリペプチドに分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドに関するＤＮＡに操作可能なように連結する。
【００６５】
本発明の１つの態様はまた、相補的なＢＢＰ ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列にサンプルを暴露させ、ハイブリッドの複合体を可視化することを含む、ＢＢＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対して相補的で、特異的な結合を有するＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列を使用して、サンプル（細胞培養液、組織サンプル、核酸画分、またはSouthern もしくは Northernブロットを含むがこれに限定されない）中のＢＢＰ ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を各々検出する方法を含んでよい。
【実施例】
【００６６】
実施例１：非コラーゲン性骨タンパク質（ＮＰＣ）群の抽出および分離
方法：ＮＣＰ群は、脱脂、脱灰したヒト皮質骨粉末より、４Ｍ ＧｕＨＣＩ、０．５Ｍ ＣａＣＩ２、２ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、０．１ｍＭ ベンズアミジンＨＣＩ、および２ｍＭ ＮａＮ３を用いて、１８時間、６℃で抽出した。残渣のコラーゲンおよびクエン酸可溶性ＮＣＰは、２５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ３．１に対する６℃、２４時間の透析により抽出した。残渣を遠心（１０，０００×ｇ、６℃、３０分間）によりペレット化し、１：１（ｖ/ｖ）クロロホルム：メタノールを用いて、２４時間、２３℃で脱脂し、濾過により集め、２２℃で乾燥させた。この材料を４Ｍ ＧｕＨＣＩ中に再懸濁し、４Ｍ ＧｕＨＣＩ、０．２％（ｖ/ｖ）Triton Ｘ−１００、１００ｍＭ Tris−ＨＣＩ、ｐＨ７．２に、２４時間、６℃で透析した後、水に透析し、１０，０００×ｇ、３０分間、６℃で遠心した。ペレットを凍結乾燥し、その後ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離した。
【００６７】
クロマトグラフィーは、ＣＨＴ−１０セラミックヒドロキシアパタイトカラム (BioRad, Hercules, CA)を用いて、BioLogicクロマトグラフィーワークステーションを使用して行った。ウシＢＭＰ/ＮＣＰは６Ｍ 尿素、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中に溶解させた。サンプルをヒドロキシアパタイトカラムにのせ、非結合画分を集めた。結合したタンパク質は、カラム容積の５倍量の直線濃度勾配で、リン酸ナトリウムの濃度を３００ｍＭまで増加して溶出させた。カラムを流している間、５ｍｌの分画で集めた。１８０ｍＭ リン酸塩で分離された分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりさらに分離した。１８．５のＭｒに対応するバンドを切り出し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）による配列分析を行った。
【００６８】
結果：配列の同定および分析：ヒドロキシアパタイトから１８０ｍＭ リン酸塩で溶出されたｂＢＭＰ/ＮＣＰの分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、１８．５ｋＤのＭｒの材料を、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ分析した。この材料の主要なタンパク質成分は、そのタンパク質の複数領域と同一な配列を有する６つのペプチドに基づき、ＳＰＰ−２４のフラグメントであると決定した。(Hu, et al., Isolation and molecular cloning of a novel bone phosphoprotein related in sequence to the cystatin family of thiol protease inhibitors(チオールプロテアーゼインヒビターのシスタチンファミリーと配列の関連する、新規骨リン酸化タンパク質の単離および分子のクローニング). J. Biol. Chem. 270:431-436, 1995.)これらのペプチドの配列を表１に示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
この配列のＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースによる分析から、以前に記載されているシスタチン様ドメインであることが明らかになったが、他の配列の骨代謝との関連性への類似性は認められなかった（Hu, et al.）。しかし他の研究から、他のシスタチン様タンパク質は、骨代謝に一役を担うタンパク質と相互作用することが知られている。具体的にはシスタチンファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−β受容体との類似性の基づいて、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ−２との結合特性を有する。（(Brown, et al., Friends and relations of the cystatin superfamily- new members and their evolution（シスタチンスーパーファミリーの新規メンバーの仲間および関連性−新規メンバーおよびそれらの進化）.: Protein Sci. 6:5-12, 1997； Demetriou, et al., Fetuin/α 2-HS glycoprotein is a transforming growth factor-β type Il receptor mimic and cytokine antagonist（フェチュイン/α２−ＨＳ糖タンパク質は、トランスフォーミング成長因子−βＩＩ型受容体の擬態およびサイトカインアンタゴニストである）. J. Biol. Chem. 271:12755- 12761 , 1996.）しかしフェチュインはＢＭＰの活性と拮抗する（Hu, et al.）。それ故ＳＰＰ−２４のシスタチン様領域、およびフェチュインのシスタチン様ドメインの手作業による比較を行った。
【００７１】
図１Ｂは、ウシＳＳＰ−２４、ＢＭＰ−２相同領域、およびＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同領域の部分的なアミノ酸配列である。下線のアミノ酸は、質量分析により存在することが確認された。(GenBank アクセション番号Ｕ０８０１８； Hu, et al.)
興味ある２つの領域が、ＳＳＰ−２４のシスタチン様領域において同定された。１つの領域は、ＢＭＰ−２と類似するある配列を有し、一方他の領域は、フェチュインのＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメインとの類似性を有していた。これら２つの領域を含有するＳＳＰ−２４の配列の部分を図１Ｂに示す。
【００７２】
ヒトＢＭＰ−２およびヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩに対する、興味ある２つの領域の比較を図２および３に示す。図２は、ヒトＢＭＰ−２、およびウシＳＳＰ−２４のＢＭＰ−２相同領域の、アミノ酸配列アラインメントである。図３は、ウシフェチュインおよびヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ（上）、ならびにヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩおよびウシＳＰＰ−２４のＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメイン（ＢＢＰに対応する）（下）のアミノ酸配列アラインメントである。ＳＰＰ−２４、フェチュイン、ヒトＢＭＰ−２、およびヒトＴＧＦ−βＩＩ受容体の配列のアラインメントは、T-Coffeeプログラムを使用して行った。(Notredame, et al, T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments（複数の配列アラインメントのための新規方法）. J. Molecular Biol. 302:205-217, 2000.)これら２つの領域に対応する合成ペプチドを、以下に記載するように得、化学的分析およびin vivo分析を行った。
【００７３】
実施例２：ＢＢＰのin vivo活性
方法：材料の骨形成活性は、８から１０週齢のオスSwiss-Weberマウス(Taconic Farms, Germantown, NY)を使用して検査した。アッセイの前に、ＢＢＰを可溶化し、２ｍｇのアテロコラーゲン中に凍結乾燥した。乾燥した材料を＃５ゼラチンカプセル内に入れ、クロロホルム蒸気への暴露により無菌化した。アッセイを行うため、小動物麻酔機(VetEquip, Pleasanton, CA)に通して、２ ｌ/分の酸素中に送達した１％イソフルランを使用して麻酔した。動物は手術用ボードに固定し、後四半身全体の被毛を剪毛した。皮膚を７０％エタノールで清浄にし、後四半身に隣接する脊椎上に正中切開を加えた。はさみでの鈍的切開を使用して、片側の四頭筋を露出させた。はさみの先で筋肉中に小さ窪み嚢を作り、検査材料を含有する＃５カプセルを窪みの中に挿入した。その後皮膚を、３つの１１ｍｍ Michelサージカルクリップで閉じ、動物をモニタリングのためケージに戻した。
【００７４】
２１日後動物を屠殺し、後四半身を切除した。検体の放射線学的検査は、スモールパーツＸ線キャビネット(Faxitron, Wheeling, IL)を使用して行った。骨形成の定量化のため、骨領域、および異所性骨形成部位を包括的に含む興味ある領域の骨塩量（ＢＭＣ）を、PIXImus2 小動物デンシトメーター(GE Lunar, Madison, Wl)を使用して決定した。次に検体を緩衝化ホルマリン中に入れ、組織学的検査のためのルーチンの処理を行った。
【００７５】
様々な量のｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰを組み合わせ、インプラント用に調製した。以下の量のすべての可能な組み合わせを、パイロット試験で使用した。ｒｈＢＭＰ−２：０μｇ、０．０５μｇ、０．５μｇ、５μｇ、および５０μｇ；ＢＢＰ：０μｇ、５０μｇ、およびμｇ、５００ｍｇ。５μｇのｒｈＢＭＰ−２のサンプル量が、信頼できる分析のための多すぎもせず少なすぎもしない異所性骨の量を一貫して産生したため、この量をより広範なその後の研究に使用した。
【００７６】
結果：ＢＢＰを、単独でまたはｒｆＢＭＰ−２と組み合わせて検査した。
【００７７】
図４は、アテロコラーゲン中５００μｇのＢＢＰ（上）、またはアテロコラーゲン単独（下）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。ＢＢＰを単独で担体と共に埋め込んだ場合、ＢＢＰは石灰化を誘導した。
【００７８】
図５は、アテロコラーゲン中５００μｇのＢＢＰの埋め込み後２１日の、マウスの筋肉の組織学的切片である。筋肉内脂肪組織に主に付随する異栄養性石灰化に注目のこと。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率１００Ｘ。）
ＴＧＦ−β受容体ＩＩと類似の配列をもつＢＢＰ ５００μｇを、５μｇのｒｈＢＭＰ−２と共に埋め込んだところ、形成された異所性骨の量は、デンシトメトリーにより測定した場合、同量のｒｈＢＭＰ−２単独を埋め込んだ動物において形成された骨の量より一貫して多かった。
【００７９】
図６は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ双方を含有するサンプルに付随する、増加した乳濁度に注目のこと。
【００８０】
さらに、ペプチドおよびｒｈＢＭＰ−２の双方を含有するインプラントは、ＢＭＰ−２単独のインプラントより早期に、検出可能な軟骨および骨を産生した。
【００８１】
図７は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後、９日（上）および１２日（下）のマウス後四半身のＸ線写真である。ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ双方を含有する第９日のサンプルからは、サンプル内に石灰化の出現が認められるが、ＢＭＰ−２単独を含有するサンプルにはないことに注目のこと。
【００８２】
図８は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（Ａ）、および５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００μｇのＢＢＰ（Ｂ）の埋め込み後９日の、マウス後四半身の組織学的切片である。ＢＭＰ＋ＢＢＰ検体における豊富な軟骨に注目のこと、一方ＢＭＰ単独の検体は炎症および中胚葉細胞の増殖という、より早期のステージを示している。
【００８３】
【表２】
【００８４】
実施例３：ＢＭＰ−２および合成ペプチドの相互作用を決定するための表面プラズモン共鳴
方法：ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ間の結合の相互作用を、Biacom X 装置(Biacore,Piscataway, NJ)を利用しての表面プラズモン共鳴を使用して特徴づけた。この手順のためのバッファーおよびチップは、Biacoreより入手した。ｒｈＢＭＰ−２は、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に、１ｍｇ/ｍｌ濃度で透析した。次にこの材料を、製造元により提供された試薬および手順を使用してＣＭ−５センサーチップに付着させた。移動相(running)バッファーは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０とした。ペプチドは、１×１０−５から１×１０−４Ｍの範囲の濃度で、移動相バッファー中に溶解させた。５から５０μｌ/分の流速、２０から１００μｌの注入容積を利用した。再生溶液は、１０μＭ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０とした。
【００８５】
結果：ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ間の相互作用を決定するための表面プラズモン共鳴の研究の結果を、図９に示す。
【００８６】
図９は、ｒｈＢＭＰ−２（チップに固定）および１×１０−５から１×１０−４Ｍの範囲の濃度の環状化ＢＢＰの相互作用に関する、表面プラズモン共鳴のセンサグラムである。相互作用に関する解離定数（ＫＤ）推定値は、３×１０−５Ｍであった。ＢＢＰを、β−メルカプトエタノールで予めの還元により開環した場合は、有意な結合は起こらなかった。
【００８７】
実施例４：保持時間の研究：ＢＢＰおよびｒｈＢＭＰ−２
方法：標識したｒｈＢＭＰ−２を、ＢＢＰまたはビヒクルと混合し、コラーゲンスポンジに含浸させた。このスポンジを、げっ歯類の筋肉の窪みの中に埋め込んだ。特定の時間（１、３および７日）でインプラントを除去し、残留しているＢＭＰの量を決定した。４頭の動物を各群に使用した。
【００８８】
結果：ＢＢＰはｒｈＢＭＰ−２の保持を、約２つの因子により増大させた。図１０は、ＢＢＰの存在下または不在下における１、３および７日にわたるｒｈＢＭＰ−２の保持のパーセントを示す棒ブラフである。
【００８９】
考察：インプラント部位でのＢＭＰの保持の増大は、ＢＭＰの有効性を改善し、そしてまた同じ治療結果に必要な量を低減すると思われる。
【００９０】
明細書には本発明の特定の態様を記載しているが、当業者が、本発明の概念から離れることなく本発明のバリエーションを考案することは可能である。
【００９１】
実施例５：ヒトＢＢＰのin vivo活性
方法：実施例５の方法を利用して、８頭のマウスにおけるｈＢＢＰの活性を、後四半身の異所性骨形成のアッセイ法において、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（コントロール）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス０．０５ｍｇのヒトＢＢＰ（ｈＢＢＰ）を使用して検査した。４週後、動物を屠殺し、後四半身を切除した。Ｘ線およびＤＥＸＡ分析を行った。
【００９２】
結果：ｈＢＢＰを、ｒｈＢＭＰ−２との組み合わせにおいて検査した。
【００９３】
挿入した時に、ＢＭＰを伴うｈＢＢＰは、ＢＭＰ単独より多量の石灰化の誘導を得た。
【００９４】
【表３】
【００９５】
実施例６：関連動物モデルにおけるＢＭＰへの代替え（または）補助としての、脊椎固定におけるＢＢＰの効果
ラット後側脊椎固定モデルを使用して、癒合におけるＢＢＰの効果を調べた。
【００９６】
方法：３群の６頭Lewisラットに、各々以下の薬剤：ＢＢＰ（５００μｇ）（１群）；ＢＢＰ（５００μｇ）＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（２群）；コラーゲン＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（３群）、を含有するコラーゲンスポンジの挿入による、椎骨Ｌ４−Ｌ５での後側方横突起間脊椎固定術を行った。結果を、剥皮のみ（０％癒合）および高用量のｒｈＢＭＰ−２（３μｇ）（１００％癒合）の組織学的コントロールと比較した。すべてのラットは、２、４、６、および８週に術後のＸ線撮影を行った。脊椎の触診を、８週の屠殺時に行った。骨の形成は、Ｈ＆Ｅ染色した組織学的切片において評価した。
【００９７】
結果：８週で、癒合ラットは：１群（ＢＢＰのみ）では１４％；２群（ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ）では８０％；そして３群（コラーゲン＋低用量ＢＭＰ）では４０％であった。この値は、ヒストリカルネガティブコントロールを０％とし、ヒストリカルポジティブコントロールを１００％として比較している。
【００９８】
【表４】
【００９９】
考察：３群（コラーゲン＋低用量ＢＭＰ）とは対照的に、２群（ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ）におけるより高い癒合速度は、脊椎固定を達成するために、より低用量のＢＭＰの使用を可能にすることができるというＢＭＰにおける補助的効果を、ＢＢＰが有することを示唆する。これらの有望な結果を確立するために、より多数の被験者によるさらなる研究が必要である。
【０１００】
実施例７：動物脊椎固定モデルでの、ＢＭＰにおける結合ペプチドの補助的効果
脊椎固定におけるＢＢＰの、ＢＭＰに対する代替えまたは補助としての効果を、関連動物モデルにおいて調べる。
【０１０１】
方法：５群の５０頭Lewisラットに、各々以下の薬剤：ＢＢＰ（５００μｇ）（１群）；ＢＢＰ（１０００μｇ）（２群）；コラーゲン＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（３群）；ＢＢＰ（５００μｇ）＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（４群）；およびＢＢＰ（１０００μｇ）＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（５群）の植込みによる、椎骨Ｌ４−Ｌ５での後側方横突起間脊椎固定術を行った。コントロール群として、ネガティブ群（剥皮）およびポジティブコントロール群（コラーゲン＋３μｇのＢＭＰ）を含めた。
【０１０２】
すべてのラットは、２、４、６、および８週に術後のＸ線撮影を行った。８週の屠殺後に脊椎の触診を行った。骨の形成は、Ｈ＆Ｅ染色した組織学的切片において評価した。
【０１０３】
結果：８週での触診により、１群および２群（低用量および高用量のＢＢＰのみ）では０％癒合、３群では４０％癒合、そして５群（ＢＢＰ１０００μｇ＋低用量ＢＭＰ）では９０％癒合を明らかにした。３群および５群の差異は、ほぼ統計学的有意差であった（ｐ＝０．０５６）。すべてのわれわれのこれまでの研究において、ネガティブ群としての背景コントロール群（剥皮のみ）は０％癒合という結果を示し、一方ポジティブコントロール群（ＢＭＰ十分容量）による癒合比率は１００％であった。Ｘ線写真による癒合の比率は、第４週、および第６週では３群より５群において有意により高い（ｐ＜０．０５）が、第８週ではほぼ有意であった（ｐ＝０．０５６）。組織学的分析は、３群と比較した場合、４群および５群において、より成熟したより厚い骨量を明らかにした。
【０１０４】
考察：コラーゲン＋低用量ＢＭＰに比して、ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰによるより高い癒合比率は、将来的には脊椎固定のための低用量のＢＭＰの使用をおそらく可能にする、ＢＭＰにおけるＢＢＰの補助的効果を示していると言ってよい。
【０１０５】
実施例８：動物の脊椎固定モデルでの、ＢＭＰにおける結合ペプチドの補助的効果
ｒｈＢＭＰ−２に誘導される骨の治癒における、骨の形態形成タンパク質結合ペプチド（ＢＢＰ）の効果を検査するための、脊椎固定のラットモデルを利用しての前向きの８週介入の試み。
【０１０６】
本研究の目的は、ｒｈＢＭＰ−２の担体として使用するコラーゲンスポンジへのＢＢＰの付加が、満足な臨床結果を達成するために必要なｒｈＢＭＰ−２の量を低減するかどうかを決定することである。ＢＢＰは、ＢＭＰ−２の効果を増大するための補助として有効であり、癒合を提供するために必要なタンパク質の用量の低減を可能にした。
【０１０７】
方法：Ｌ４−Ｌ５での後側方横突起間脊椎固定術を、５つの治療群の各Lewisラットで行い、コラーゲンスポンジ（５×５×１３ｍｍ）を手術部位に埋め込んだ。
【０１０８】
各スポンジは無菌のミクロチューブ内に置き、水中ＢＢＰ（５００μｇまたは１０００μｇ）の懸濁液、または無菌水のみのいずれかを含ませた。スポンジを、組織培養フード内で一晩放置して空気乾燥させた後、−７０℃で１時間置き、一晩凍結乾燥した。チューブ（凍結乾燥を可能にするため、最上部に小さな穴がある）をオートクレーブの窪みに置き、封入した。次に材料をクロロホルムの蒸気に少なくとも４時間暴露させて無菌化した。手術の直前にポーチを開き、チューブからスポンジを取り出し、デザインされた量のｒｈＢＭＰ−２または水を含有する第２のチューブに入れた。スポンジは溶液を完全に吸収することができた。
【０１０９】
ラットのＬ４−Ｌ５の後側方横突起間脊椎固定術は、我々の実験室１３−１７では、十分に確立された手順である。手短には、動物をイソフルランで麻酔し、手術部位を剪毛し、Betadyneおよびアルコールで準備した。３ｃｍの長軸方向の正中切開を皮膚およびＬ４−Ｌ５上の皮下組織を通して腰背筋膜まで加えた。次に２つの別個の２ｃｍの長軸方向の傍正中切開を、Ｌ４−Ｌ５の両側の脊柱起立筋に加えた。Ｌ４−Ｌ５の横突起を露出させ、軟組織を取り除き、高速のバールで皮質を剥離した。この部位を生理食塩水で洗浄し、治療検査材料を置いた。背腰筋膜を、４−０ Prolene (Ethicon, Somerville, NJ)で閉じた。皮膚を４−０ Proleneで閉じ、細心の術後ケアを施した。
【０１１０】
ＢＢＰの２つの用量（５００μｇおよび１０００μｇ）を、”低用量”（１μｇ）のｒｈＢＭＰ−２を伴う場合、または伴わない場合で検査し、結果を低用量（１μｇ）のｒｈＢＭＰ−２と比較した。これらはコントロール群に対して比較した。癒合は、放射線学的、組織学的、および触診の検査により評価した。動物は術後８週で屠殺した。
【０１１１】
手術の結果は、放射線学的に、組織学的に、および触診により評価した。前後方向のＸ線写真は、スモールパーツＸ線キャビネット(Faxitron, Wheeling, IL)を使用して、各動物について２、４、６および８週に得た。Ｘ線写真は、３名の独立した観察者により、以下の標準化スケール：０：癒合なし；１：骨形成の存在を伴う不完全な癒合；そして２：完全な癒合を利用して評価した。３名の観察者のスコアを加算し、合計５または６を、“癒合した”とみなした。脊椎の触診は、８週の屠殺時に行った。ヒトにおける癒合を決定するためのゴールドスタンダードをシミュレートするため、癒合物の検査および触診を死後行った。癒合したレベルは、Adson鉗子を用いて触診し、隣接する非癒合のレベルと比較した。各検体は、３名の独立した観察者により癒合、または非癒合として類別した。３名の観察者の誰れかが脊椎を非癒合と類別した場合は、その脊椎は“非癒合”とみなした。触診の後、検体は標準的な１０％脱灰溶液ＨＣｌ（CaI- Ex, Fisher Scientific, Fairlawn, NJ）を使用して脱灰し、水道水の流水で洗浄した後、７５％エタノールに移した。矢状切片を横突起の高さで注意深く切り出した。検体をパラフィン中に包埋し、各検体の切片を得た。これらの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。それらを、独立した観察者により癒合および非癒合として評価した。
【０１１２】
“癒合した”と判定された各群中の被験者の比率を、ＳＰＳＳソフトウェアを使用してのフィッシャーの正確確立検定（Fisher's exact test）を用いて、逐次的２群比較にて比較した。０．０５より小さいまたは等しいｐ値を、統計学的有意と設定した。
【０１１３】
結果：放射線学は、低用量ＢＭＰ−２（１μｇ）のみと比較した場合に、１０００μｇ ＢＢＰ＋１μｇ ＢＭＰ−２の組み合わせによる有意により早期の癒合を明らかにした（ｐ＜０．０５）。８週での触診および組織学は、ほぼ有意な差異（ｐ＝０．０５７）での、同じ組み合わせによるより高い癒合比率を明らかにした。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
放射線学的検査の結果を表５に示す。表５は、５または６のスコアを有し、それ故４回の各タイムポイント（２、４、６および８週）関して“癒合した”と判定された、各群中の被験者の比率を表す。表からわかるように、低用量および高用量のＢＢＰ群の動物はいずれも、いかなるタイプポイントでも癒合を発達させていなかった。低用量ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ−２群は、ＢＭＰ−２低用量のみの群より、第６および８週で、より高い癒合比率を有し、この差異は第６週に関しては有意であった（ｐ＜０．０５）が、８週では有意でなかった（ｐ＝０．１７０）。他方、ＢＢＰ高用量＋ＢＭＰ−２低用量群は、ＢＭＰ−２低用量のみの群を比較した場合、第４、６および８週のタイプポイントで、有意により高い癒合比率を有した（各タイムポイントに関してｐ＜０．０５）（図１５および１６）。
【０１１７】
表６は、３名の独立した臨床評価者により“癒合した”と判定された、各群の被験者の比率を示す。非常に重要な比較は、ＢＭＰ−２低用量群 対 ＢＢＰ低用量＋ＢＭＰ−２低用量群、およびＢＢＰ高用量＋ＢＭＰ−２低用量群、間のものであった。触診により評価した癒合比率は、ＢＭＰ−２低用量群と比較した場合、双方の組み合わせの群ともより高かった（図１５および１６）。しかしこの差異は有意ではなく、一方ＢＢＰ高用量＋ＢＭＰ−２低用量群と、ＢＢＰ低用量群との比較に関しては、有意の傾向が認められた（ｐ＝０．０５７）。低用量ＢＭＰ−２群の癒合した検体と比較した場合、組み合わせ群の癒合した検体では、癒合物の厚さはより厚い傾向があり、骨の成熟度はより成熟している傾向が認められた（図１７および１８）。図１７は、ＢＢＰおよびｒｈＢＭＰ−２の組み合わせの治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片であるが、皮質の成熟した骨を伴うＬ４およびＬ５の横突起間の厚い癒合物を示す。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４×）。図１８は、低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）による治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片であるが、骨部分を架橋する成熟した皮質を架橋する未成熟な骨を示す。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４×）。
【０１１８】
表６はまた、独立した組織学者により癒合したと判定された、各群の被験者の比率を示す。結果は、第８週の触診および放射線学双方の結果とも類似の癒合比率を実証することを確証した。低用量ＢＭＰ−２群の癒合した検体と比較した場合、組み合わせ群の癒合した検体において、癒合物の厚さはより厚い傾向があり、骨の成熟度はより成熟している傾向が認められた（図１７および１８）。
【０１１９】
特定の成長因子結合薬、例えばＢＢＰは、固定術で使用する担体中に配合して、ＢＭＰの投与量を減少させ、用量に関連する可能性が最も高い副作用をおそらく減少させることができる。このことはまたコストを低下させ、臨床結果を改善するものと思われる。
【０１２０】
Ｘ線写真の結果は、同じ量のタンパク質の単独での使用と比較した場合、高用量ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ−２の組み合わせによる、有意により高いそしてより早期の癒合比率を実証した。組織学および触診の検査は、ほぼ有意な差異を伴う第８週でのこのより高い癒合比率を確証した。この脊椎固定モデルは癒合が困難であり、堅固な関節固定を誘導するための特定の骨誘導能力を有する材料を必要とすることに注目することは重要である。同様に、５００μｇまたは１０００μｇのいずれか単独の使用では、脊椎モデルに癒合を提供しなかったが、筋肉の窪みモデルの５００μｇＢＢＰの埋め込みにより異所性異栄養性石灰化の形成が認められた。組織学的検査において筆者らは、ＢＭＰ−２のみの群と比較した場合、組み合わせ群によるより成熟した骨癒合物を観察した（図１７および１８）。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１２月２２日に提出された米国仮特許出願６０/８７６，８２１号からの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
成長因子はin vivo またはin vitroにおいて、定義された細胞集団の成長および分化に影響を及ぼす、ペプチドを含む物質である。正常な骨の形成は発育中に起こり、骨のリモデリングは成体期に起こり、そして骨の修復は骨格の完全性を保存するために起こる。骨の形成、リモデリングおよび修復は、破骨細胞による骨の再吸収、および骨芽細胞による骨の形成を伴う。細胞の分化ならびに骨芽細胞および破骨細胞の活性は、成長因子により制御される。このように細胞の分化および再吸収のバランス間へのあらゆる干渉が、骨の恒常性、骨の形成および修復に影響し得る。
【０００３】
骨芽細胞は骨髄間質細胞(marrow stromal cells)（間葉系幹細胞としても知られている）のプールから送達される。ＭＳＣは多様な組織中に存在するが、骨髄間質中に豊富に存在する。ＭＳＣは多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞、および脂肪細胞を含む軟骨形成性または骨形成性の細胞に分化することができる。
【０００４】
脱灰骨マトリックス（demineralized bone matrix、ＤＢＭ）による異所性骨形成の誘導が記述された（Urist, M.R.:Bone:Formation by autoinduction（骨：自己誘導による形成）. Science 150:893-899, 1965; Urist, et al., Purification of bovine morphogenetic protein by hydroxyapatite chromatography（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるウシ骨形成タンパク質の精製）. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :371-375, 1984; Urist, M. R. Emerging concepts of bone morphogenet-protein（骨形成タンパク質の新興概念）. Fundamentals of Bone Growth: Methodology and Applications, Boston CR. C. Press, pp. 189-198, 1991.）さらに部分的に精製されたタンパク質画分である骨形成タンパク質/非コラーゲン性タンパク質(bone morphogenic protein/non-collagenous protein)（“ＢＭＰ/ＮＣＰ”または“ＢＭＰ”群）の特性について記述された。（Urist, et al. Methods of Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and Polypeptide Fragments（骨形成タンパク質およびポリペプチドフラグメントの調製法およびバイオアッセイ法）. Methods in Enzymology. Vol. 146. New York, Academic Press, pp. 294-312, 1987; Urist, et al., Hydroxyapatite affinity, electroelution, and radioimmunoassay for identification of human and bovine bone morphogenetic proteins and polypeptides（ヒトおよびウシの骨形成タンパク質およびポリペプチドの同定のためのヒドロキシアパタイトアフィニティー、電気泳動による溶出、およびラジオイムノアッセイ）. Development and Diseases of Cartilage and Bone Matrix. New York, Alan R, Liss, Inc., pp. 149-176, 1987.）
ＢＭＰ/ＮＣＰは均一なレベルまでは精製されていないが、他の研究者らは類似の出発材料を使用して、いくつかのリコンビナント“ＢＭＰ群”をクローン化している。しかしこれら分子のいくつかは、骨形成活性をほとんどまたは全く持っていない。“ＢＭＰ群”およびその他の骨形成性因子は、臨床適用にて使用するために研究されてきた。しかしＢＭＰ−７（ＯＰ−１としても知られている）の最小の有効投与量を使用するコストが、例えば臨床での使用の限定要因となってきた。それ故、有効かつ入手可能な組成物および方法が骨に関する臨床適用のために求められている。
【０００５】
骨の治癒を増強するためのアジュバント療法は、整形外科の多くの側面において重要であるが、迅速かつ徹底的な骨形成が重大な意味を持つ脊椎固定に関しては特に重要である。現在利用可能な最も有用な薬剤として、骨成長因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ群）を含む。これらのタンパク質は、未分化の中胚葉系細胞での内軟骨性骨形成の反復発生を誘導する。しかしそれらの有用性は、費用により、そして局所的有害作用、例えば脊椎固定術に今日使用される用量に付随する望ましくない異所性骨形成、および炎症反応により限定されている。
【０００６】
さらに、より長い癒合に使用される場合の、高用量のＢＭＰ群の潜在的な全身性有害作用は十分には決定されていない。それ故、より安全で、より安価な、そしてより効果的なアジュバント剤を提供するため、いくつかの戦略が開発されている。
【０００７】
脊椎固定のための骨の発生装置としてのＢＭＰ-２の使用は、ますます注目されるようになってきている。最近の研究は、全脊柱管を通して前方固定術および後方固定術の双方についてＢＭＰ−２を効率的に使用してよいことを示した。しかしＢＭＰ−２が非常に高価であること、ならびに報告されている局所的副作用、例えば望ましくない骨形成、および前頚部固定術後の危険な首の腫脹が、脊椎固定術へのその広範な使用の妨げとなってきた。現在、ＢＭＰ−２の有効性を増大させると同時に、その用量を減少し副作用をコントロールすることに、焦点がシフトしてきている。主な限定課題は、持続的な生物学的に適当な濃度のＢＭＰ−２を癒合ベッドの側部に提供する、よりよい送達システムの必要性である。ＢＭＰ群は非常に短い生物学的半減期、すなわち完全な骨形成性応答を刺激するために必要とされる数日または数週間というよりむしろ、通常数分または数時間というオーダーを有するため、送達は持続される必要がある。例えばｒＢＭＰ−２は、わずか数時間の半減期を有すると記述されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、成長因子、例えばｒｈＢＭＰ−２と貪欲に結合するＢＭＰ結合ペプチド（ＢＢＰ）と名付けられた環状ペプチドに関する。ＢＢＰは、ｒｈＢＭＰ−２が骨の形成を誘導する速度および程度を増大させる。ＢＢＰは、他の骨成長因子の滞留率を増大させることによりこれを達成する。しかしＢＢＰは単独では軟骨形成細胞、骨形成細胞、および骨芽細胞の石灰化を誘導する。ＢＢＰを含む組成物および物質、ＢＢＰに対する抗体、ならびにＢＢＰを使用する方法は、骨に関する適用において有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様において本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を高め、そして/または骨の修復を高めるための薬剤を用いての治療法を含んでよい。
【００１０】
１つの態様において本発明は、骨を誘導する物質、例えばＢＭＰの滞留時間を増大するための方法およびデバイスを含む。１つの態様において本発明は、骨を誘導する物質、例えばＢＭＰの速度および骨形成活性全体を増大するための方法およびデバイスを含む。さらに１つの態様において本発明は、骨を誘導する物質による骨形成および石灰化の効果に必要な時間を短縮するための方法およびデバイスを含む。
【００１１】
本発明の１つの適用において本方法は、骨の局所的な修復を誘導するため、または骨に関連する障害、例えば骨粗鬆症を治療するために適用してよい。本発明の１つの態様においてＢＢＰは、膜性骨の癒合（例えば脊椎固定）または内軟骨性骨の癒合におけるその他の骨成長因子の効果を誘導するために使用してよい。
【００１２】
１つの態様において本発明は、薬剤を保有するインプラント、または骨の形成もしくは修復を誘導するための多能性細胞もしくは分化した細胞を植え付けたインプラントを含んでよい。本発明はまた、骨の形成または骨の修復が所望される部位での、物質または分化した細胞の投与を含んでよい。
【００１３】
本発明は、少なくともＢＢＰ単独で、または軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞の石灰化を高めるその他の成長因子との組み合わせにおいて、有利である。さらに本発明は少なくとも、ＢＢＰが骨形成性を高めて、より速くより広範囲に骨形成を起こさせ、そのことがＢＭＰによる治療の臨床速度および有効性を改善し、そして用量を低減し、それ故にＢＭＰ単独治療のコストおよび副作用を低減する点で、有利である。
【００１４】
これらならびにその他の目的、特色および利点は、以下の説明のための態様および付記した図面の詳細な記載のまとめから今明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは各々、ウシＢＢＰの（１）アミノ酸配列、および（２）核酸配列である。図１Ｂは、シスタチン相同領域、ＢＭＰ−２相同領域、およびＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメインを示す、ウシＢＭＰ結合タンパク質（“ＢＢＰ”）の部分的なアミノ酸配列である。
【図２】図２は、ヒトＢＭＰ−２、およびウシＳＰＰ−２４のＢＭＰ−２相同領域のアミノ酸配列アラインメントである；（ｉ、同一；ｃ、保存的置換；ｓｃ、半保存的置換）。
【図３】図３は、ウシフェチュインおよびヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ（上）、ならびにヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩおよびウシＳＰＰ−２４（ＢＢＰに対応する）のＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメイン（下）のアミノ酸配列アラインメントである；（ｉ、同一；ｃ、保存的置換；ｓｃ、半保存的置換）。
【図４】図４は、アテロコラーゲン中の５００μｇのＢＢＰ（上）、またはアテロコラーゲン単独（下）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。
【図５】図５は、アテロコラーゲン中の５００μｇのＢＢＰの埋め込み後２１日のマウス筋肉の組織学的切片である。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率１００Ｘ。）
【図６】図６は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。
【図７】図７は、５μｇのＢＭＰ−２（左）、または５μｇのＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後、９日（上）および１２日（下）のマウス後四半身のＸ線写真である。
【図８】図８は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（Ａ）、および５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００μｇのＢＢＰ（Ｂ）の埋め込み後９日の、マウス後四半身の組織学的切片である。
【図９】図９は、ｒｈＢＭＰ−２（チップに固定）および１×１０−５Ｍから１×１０−４Ｍの範囲の濃度での環状化ＢＢＰの相互作用に関する、表面プラズモン共鳴のセンサグラムである。
【図１０】図１０は、ＢＢＰの存在下または不在下における１、３、および７日にわたるｒｈＢＭＰ−２保持のパーセントを示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、特異的ＳＳＰ−２４/ＢＢＰ抗体が産生されるアミノ酸配列を含む。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の例示としての方法の流れ図を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明の例示としての方法の流れ図を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の２つの態様を図示したものである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本発明の２つの態様を図示したものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、様々な種におけるＢＰＰに関するアミノ酸配列（上から順に各々配列番号１１、１および１２−１９）を示すチャートである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、様々な種におけるＢＰＰに関する核酸配列（上から順に各々配列番号２０−２８）のリストである。
【図１５】図１５は、ＢＢＰ高用量（１０００μｇ）＋ｒｈＢＭＰ−２低用量（１μｇ）の投与によるＬ４−Ｌ５で癒合したラット脊椎の前後方向のＸ線写真である。
【図１６】図１６は、ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）治療の投与による右側の偽関節炎（および）左側Ｌ４−Ｌ５の癒合を示す、ラット脊椎の前側−後側のＸ線写真である。
【図１７】図１７は、ＢＢＰおよびｒｈＢＭＰ−２の組み合わせの治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片である。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４Ｘ。）
【図１８】図１８は、低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）による治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片である。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４Ｘ。）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の１つの態様は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。ウシ由来アミノ酸配列番号：１はＢＢＰと命名されており、配列番号：２は、ＢＢＰをコードするウシ核酸配列に対応する。
【００１７】
本発明の１つの態様は、ヒトＢＢＰの配列である、配列番号１２のアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。配列番号２１は、ヒトＢＢＰをコードするヒト核酸配列に対応する。
【００１８】
ＢＢＰは、公知の２４ｋＤ分泌型リン酸化タンパク質（24 kD secreted phosphoprotein、“ＳＰＰ−２４”）の１８．５ｋＤフラグメントに由来する、１９アミノ酸、２．１ｋＤペプチドである。ＳＰＰ−２４は、配列番号：２により表される。ＳＰＰ-２４は、ＢＭＰ−２に誘導される骨形成を著しく阻害する。ＢＢＰは、ＳＰＰ−２４のシスタチン様ドメインを含有する。ＢＢＰは、少なくとも肝臓および骨（少なくとも脱灰皮質骨および骨膜を含む）において発現される。
【００１９】
ＢＢＰアミノ酸配列は、プロテアーゼインヒビターのシスタチンファミリーのメンバーであるフェチュインの、ＴＧＦ−β/ＢＭＰ結合領域に類似する。ＢＢＰは、ＫＤ ×１０−５ＭでｒｈＢＭＰ−２（リコンビナントヒトＢＭＰ−２）に貪欲に結合する。ＢＢＰはまた、ＢＭＰ−２に類似する結合ドメインを有するその他の分子、例えば他のＴＧＦ−βタンパク質（ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、ＢＭＰ−９、およびＴＧＦ−βを含むがこれに限定されない）とも結合し、それらの保持率および/または活性にも同様に影響を与えと思われる。例えばＢＭＰ−４およびＢＭＰ−２間には高度の程度の配列類似性（約９０％）がある。加えて様々な骨誘導性のＢＭＰ群（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、およびＢＭＰ−９）が、同じ受容体に（アフィニティーに多少の変動はあるが）結合することが実証された。それ故、配列および結合の類似性を考慮すると、これらの付加的なＢＭＰ群との結合が予想される。本発明において有用な付加的な成長因子として：ＧＤＦ５、およびその他のＢＭＰ群、例えばＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９を含んでよい。
【００２０】
ＢＢＰは単独では、脊椎動物の軟骨形成性および骨形成性の前駆細胞の石灰化を誘導する。ＢＢＰは、ｒｈＢＭＰ−２が誘導する骨の形成の速度および程度の増大を増大させる。驚くことにin vivoにおいてＢＭＰ−２と組み合わせたＢＢＰは、ＢＭＰ−２単独の効果と比較して、より少量のｒｈＢＭＰ−２を用いて、より速くそしてより広範囲に起こる骨形成を引き起こす。この結果は、上に考察したようにＢＭＰ−２による骨の形成を阻害するＳＳＰ−２の役割を考慮すると、予想外であった。
【００２１】
例えば、マウス筋肉中にＢＢＰを単独で埋め込んだ場合、ＢＢＰは異栄養性石灰化を誘導する。“マウスの後四半身”モデルまたは“筋肉の窪み”モデルの、修復時の骨形成または異所性骨形成におけるプロセスは、内軟骨性骨形成を要約するものである。最初のステップは軟骨の産生であり、これが骨に置き換わる。同じプロセスは、発育中の内軟骨性骨形成時に起こるが、一方ある種の膜性骨形成は、軟骨という中間体を経ずに直接起こる。
【００２２】
本発明の１つの態様において、ＢＢＰのフラグメントが、哺乳類の細胞におけるＢＭＰ−２による骨形成の程度もしくは速度を増大する、あるいは脊椎動物の細胞、または特に哺乳類の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞における石灰化の程度もしくは速度を増大するのであれば、そのフラグメントを包含するペプチドは、同様に有用であると思われる。
【００２３】
配列番号１のアミノ酸の修飾を有するＢＢＰの形もまた、本発明において有用である。例えば種間で保存されたＢＢＰのアミノ酸配列、欠失または挿入による修飾、保存的または半保存的置換による修飾は、修飾されたアミノ酸配列がＢＭＰ−２またはその他のＴＧＦ−β相同分子の滞留時間および/または活性を増大する限りにおいて、主張したＢＢＰに包括的に含まれることを意図する。ＢＢＰは、β−プリーツシート−ターン−シートプリーツシート分子のモチーフ（“Ｂ−Ｔ−Ｂ”）である。成長因子が結合するアミノ酸残基は、Ｔ−部分に属すると、現在考えられている。それ故、Ｔ−部分におけるアミノ酸の置換は、Ｂ領域における置換より大きくＢＢＰの活性に影響を及ぼすと思われる。
【００２４】
上のようにＢＢＰは、成長因子が埋め込み部位に留まっている時間量（“滞留時間”）を増大する、および/またはＢＭＰ−２もしくはその他のＴＧＦ−β相同分子の全体的な活性を増大することにより、ＢＭＰ−２のような成長因子の効果を増大すると考えられる。例えばＢＭＰ単独では、埋め込み部位から急速に除去されるが、一方ＢＢＰと共にＢＭＰを埋め込むと、滞留時間を増大することが示された。滞留時間の増大は、例えば：１）成長因子の半減期を増大するＢＢＰ群の能力（例えばタンパク質分解の速度を低減することによる）、および/または２）投与部位からの成長因子の拡散速度の低下、に起因すると思われる。
【００２５】
本発明の１つの態様は、ＢＢＰに関する哺乳類の共通配列である、配列番号１１の配列：Ｃ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｖ−Ｘ−Ｙ−Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｖ Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｃを有するペプチドを包含する。図１４Ａは、ウシ（配列番号１；核酸配列は配列番号２で示す）、ヒト（配列番号１２；核酸配列は配列番号２１で示す（９位はＡまたはＶのいずれかである））、ブタ（配列番号１３；核酸配列は配列番号２２で示す）、ヒツジ（配列番号１４；核酸配列は配列番号２３で示す）、ラット（配列番号１５；核酸配列は配列番号２４に示す）、およびマウス（配列番号１６；核酸配列は配列番号２５で示す）のＢＢＰにわたる、アミノ酸配列の相同性を示す。図１４Ａはまた、ニワトリ（配列番号１７；核酸配列は配列番号２６で示す）、サケ（配列番号１８；核酸配列は配列番号２７で示す）、およびマス（配列番号１９；核酸配列は配列番号２８で示す）における高度に保存された領域を示す。
【００２６】
図１４Ａにおいて“Ｘ”および“Ｙ”は、各々半保存的または保存的であると理解されるアミノ酸の置換を表示するために使用する。保存的置換は同じグループから選択されるアミノ酸を含み、半保存的置換は、ＢＭＰ−２結合ドメインまたはＢＢＰの機能に影響を与えないと考えられる置換を含む。例えば６位の置換は、ヒト、ラットおよびヒツジ間で保存的であるが、いくつかのその他の種では半保存的である。というのは異なる種でその位置で報告されたアミノ酸は：ＱおよびＥ（ブタ、ラットおよびマウスのＢＢＰではＱ、ニワトリではＥ）であるからである。ＫおよびＲは双方とも塩基性アミノ酸と分類されるが、Ｑは非電荷の極性アミノ酸と分類され、それ故置換は保存的ではない。しかしＢＢＰの機能は影響を受けないと考えられるため、置換は半保存的である。半保存的置換はまた９、１０、１１および１６位にも見出される。９位では、アミノ酸Ａがウシ、ヒト、ブタおよびヒツジのＢＢＰにおいて、それに比してＫがラットおよびマウスのＢＢＰにおいて見出される。１０位では、アミノ酸Ｅがウシ、ブタ、およびヒツジのＢＢＰに関して報告されており、ヒトＢＢＰはその位置にＱを含有し、ラットおよびマウスのＢＢＰはアミノ酸Ｇを含有する。１１位では、アミノ酸Ｑがウシ、ヒト、ラットおよびマウスにおいて見出され、一方Ｋが、ブタＢＢＰに関して、そしてＲがヒツジＢＢＰに関して報告されている。１６位では、Ｗが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラットおよびマウスのＢＢＰにおいて見出されており、一方ヒトＢＢＰはＨを含有する。１３および１４位でも、他の種とは対照的にラット/ヒト間で反保存的な置換が存在する。
【００２７】
保存的置換の例は、７位に見出される。この位置では異なる種において異なる疎水性アミノ酸が、すなわちウシ、ヒツジ、ラット、およびマウスのＢＢＰではＭが、それに比してヒトＢＢＰではＶが、そしてブタＢＢＰではＩが観察される。Ｍ、Ｖ、およびＩはすべて疎水性アミノ酸であるため、この置換は保存的であると考察される。他の保存的置換は、１７および１８位にある。２つの疎水性アミノ酸、ＡおよびＶが１７位で見出されている。１８位では、２つの塩基性アミノ酸、ＲおよびＨが見出されている。
【００２８】
本発明の１つの態様は、脊椎動物の細胞、またはより特定すれば哺乳類の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞における石灰化の程度または速度を増大するＢＢＰ、を含む組成物であってよい。さらに本発明は、ＢＭＰ−２、およびＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスの１つによる骨形成の、程度または速度を増大させるＢＢＰを含んでいてよい。さらに当該組成物は付加的にまたは代替え的に、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７を別々にまたはそれらの混合物を含むがこれに限定されない、他のＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含んでよい。
【００２９】
１つの態様において本発明は、治療有効投与量のＢＢＰを単独で、または成長因子、例えばＢＭＰまたはＤＢＭと組み合わせて含む、脊椎動物における骨形成の速度または程度の誘導において使用するための医薬剤を含んでよい。本発明はさらに、脊椎動物における石灰化の速度または程度の誘導において使用するための、ＢＢＰを包含するペプチドを含む医薬剤を含んでよい。
【００３０】
１つの態様において、ＢＢＰ、またはＢＢＰおよび１つもしくはそれより多くの他の成長因子との組み合わせは、骨の形成および/またはインプラントの統合が所望される部位での埋め込みのために、基材または担体、例えばコラーゲンスポンジまたは整形外科用のインプラントもしくは人工関節の上またはそれらの中にセットしてよい。
【００３１】
ＢＢＰに関する投与。ＢＢＰに関するいくつかの投与を、その薬理学的（生物学的活性）特性から示唆する。例えばＢＢＰは単独で、または他のＴＧＦ−βファミリーのメンバー、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７、もしくは脱灰骨マトリックスと組み合わせて、骨の形成を誘導する、骨の恒常性を維持する、および/または骨の修復を高めるための、臨床または研究の方法において使用してよい。ＢＢＰは、発育時または恒常性の骨の障害（例えば骨粗鬆症）、骨の傷害（例えば扁平（例えば膜性）骨および長管（例えば内軟骨性）骨の骨折治癒、癒合不全骨折）を治療するため、および再建手術のために、単独でまたは組み合わせて使用してよい。本発明はまた、歯周炎、歯周部の再生の治療、歯のインプラントの再建のための歯槽堤増大術、癒合不全骨折の治療、膝関節/股関節の修復術または置換術部位において使用してもよい。
【００３２】
一例として、ＢＭＰは脊椎固定を提供する上で有効であることが実証されているが、例えば、特に頚椎における炎症および異所性骨形成を引き起こす有害な副作用により、広範な使用は限定される。１つの態様において、ＢＢＰをより低用量のＢＭＰと組み合わせて使用して、その効能を保ち、投与部位でのその保持性を高めてよい。本明細書において考察するように、ＢＢＰは、リコンビナントヒトＢＭＰ−２を含むＢＭＰと結合することが実証されているが、in vitro およびin vivoにおいて７日間までというｒｈＢＭＰ−２の２倍の保持性を可能にした。
【００３３】
骨の恒常性を維持する方法、またはその能力のある化合物の臨床指数は、少なくともＤＥＸＡスキャンにより評価した場合の、体全体の異なる部位での骨密度の改善により証明される。骨折治癒における高められた骨の形成は、選択された時間間隔での骨折部位の標準的なＸ線によりルーチンに評価できる。上の指数を決定するためのより高度な技術、例えば定量的ＣＴスキャンまたは定量的な組織学的方法（例えば組織を処理、染色し、顕微鏡下で調べ、骨を画像分析により定義および測定する）を使用してもよい。さらに骨密度、骨領域、骨塩量、異所性骨の形成、およびＸ線検査での組織の不透過性の増加、アルカリホスファターゼ活性の発現、カルシウムの取り込み、ミネラル化、またはオステオカルシンｍＲＮＡの発現の測定を使用して、ＢＢＰの石灰化および/または骨形成性の効果を観察してもよい。
【００３４】
本発明はまた破骨細胞の骨再吸収を阻害する薬剤の使用を含んでよい。破骨細胞の骨再吸収（の阻害）を達成するために本発明において有用であると思われる薬剤として、ビスホスホネート製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニン、およびビタミンＤ/カルシウム補給剤を含むが、これに限定されない。本発明はまた、骨芽細胞の骨の形成を誘導する薬剤の使用を含んでよい。本発明に有用であると思われる薬剤として、ＰＴＨ、フッ化ナトリウム、ならびに成長因子、例えばインスリン用成長因子ＩおよびＩＩを含むが、これに限定されない。
【００３５】
ＢＢＰ単独の石灰化効果、またはＢＭＰと組み合わせての骨形成効果を示すために使用したin vivoモデルは、他の化合物の類似のふるまいを実証する上で、以前に使用されている。特にin vivoモデルはまた以前に化合物、例えばＢＭＰおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のin vivoの骨形成効果の予測に成功することを可能にした。具体的には、ラット大腿骨を使用する動物モデル、すなわち異所性骨形成モデルにおいてＢＢＰの骨形成効果が実証された。それ故これらの類似の知見に基づき、ＢＢＰは、ヒトにおいてin vivoでの骨形成効果を有すると予測される。これらのin vivoモデルにおいて化合物の骨形成効果を実証することが、in vivoのヒトにおけるそれらの効果を実証する試み前に必要である。
【００３６】
治療有効量。本発明において有用なＢＢＰまたはＴＧＦ−βファミリーのメンバーの治療有効量は、上に述べたように石灰化または骨形成性を高める薬剤の能力により測定した場合に、患者におけるポジティブな臨床効果または細胞における所望の効果を有する量である。各薬剤の治療有効量は、所望の臨床効果を達成し、同時にネガティブな副作用を最小とするように調節することができる。薬剤の投与量は、個々の投与計画、および特定の患者に適当な用量レベルを決定する時に、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢および体重、患者が受けているその他の薬物療法、ならびに担当医により通常考えられるその他の因子に依存して、個々の患者のために選択してよい。
【００３７】
本発明は、少なくとも骨形成の所定の速度または程度を誘導するために必要なＢＭＰ−２の投与量を、ＢＭＰ−２をＢＢＰと組み合わせた時には低減してよいという点において、有利であり、我々には予想外なことでもある。ＢＭＰは投与によってはコストがかさむ可能性があるため、この点は、少なくとも治療のコストを低減する上で有利である。さらに、ＢＭＰを組み合わせて治療することにより、ＢＭＰ（またはその他の骨成長因子）の治療の用量レベルを低減することは、例えば首の軟組織内の炎症、または異所性骨形成を含む、使用するＢＭＰの量に関連する副作用もまた、低減するものと思われる。このように外来の成長因子の保持を増大させるための、骨成長因子の結合剤としてのＢＢＰの使用は、治癒を達成するために必要な成長因子の量を低減することにより、成長因子の使用のネガティブな側面を克服する一助とすることができる。
【００３８】
投与剤形。投与剤形中に含まれる薬剤の治療有効量は、選択する薬剤のタイプおよび投与経路を考慮することにより選択してよい。投与剤形は、医薬分野の当業者に公知であるように、患者への投与の促進のためのアジュバント、および医薬的に受容可能な担体を含む、その他の不活性成分と組み合わせて、薬剤を含んでよい。
【００３９】
ＢＢＰの治療用剤形化は（請求項がＢＢＰの修飾またはフラグメントを含むことを意図する場合）、凍結乾燥したケークまたは水溶液の剤形中に、所望の程度の純度を有するＢＢＰを、所望の生理学的に受容可能な担体、賦形剤または安定剤と共に混合することにより、貯蔵用に調製してよい。受容可能な担体、賦形剤または安定剤は、利用する投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、バッファー、例えばリン酸、クエン酸およびその他の有機酸の塩；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン、を含む。その他の成分として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、およびその他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；ならびに/または非イオン性界面活性剤、例えばTween（ツイーン）、Pluronic（プルロニック）もしくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む。
【００４０】
投与剤形は、例えば皮下（例えば徐放性カプセルで）、静脈内、腹腔内、筋肉内、骨格周囲または骨格内用の調製物にて提供してよい。いずれか１つの薬剤、または薬剤の組み合わせを、投与剤形中に含んでよい。あるいは薬剤を組み合わせは、別々の剤形にて患者に投与してもよい。薬剤の組み合わせは、患者が治療のための少なくとも２つの薬剤に暴露されるような時間内に、同時に投与してよい。
【００４１】
付加的な薬剤。本発明は、ＢＢＰとは独立してまたは相乗的に作用して、石灰化および骨形成を高める付加的な薬剤を伴う治療を含んでよい。例えばＢＢＰは、ＢＭＰ、ビスホスホネート製剤、ホルモン療法治療薬、例えばエストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニン、およびビタミンＤ/カルシウム補給剤、ＰＴＨ（例えばForteo もしくはテリパラチド、EIi Lilly）、フッ化ナトリウム、ならびに骨にポジティブな効果を有する成長因子、例えばインスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、およびＴＧＦ−βと共に、組み合わせてよい。当業者は、標準的な治療投与量のパラメータを使用して、各治療に受容される投与量を決定する、またはＢＢＰの効果が第二の薬剤、例えばＢＭＰ群と相乗的である場合には低減した投与量を決定することができる。
【００４２】
ＢＢＰは、基材に含まれるＢＭＰ−２の滞留時間を少なくとも増大することにより、ＢＭＰ−２に作用すると今のところ考えられる。本発明の１つの態様は、一定量のＴＧＦ−β相同分子を第一および第二の選択された位置に投与することを含む、ＴＧＦ−β相同分子の滞留時間を高めるＢＢＰの能力を検出する方法である。さらに、選択された量のＢＢＰを第１の選択された位置に投与し、そして選択された時間間隔の後に第１および第２の位置のＴＧＦ−β相同分子の量を最終的に検出し；そして第１および第２の位置のＴＧＦ−β相同分子の量の間の差異を算出する。
【００４３】
１つの態様において本発明は、哺乳類細胞中のＢＭＰ−２およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーの１つ、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスによる骨形成、の程度または速度を増大させるＢＢＰの投与を含む、脊椎動物の組織における骨形成の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４４】
１つの態様において本発明は、ＢＢＰの投与を含む、脊椎動物の組織、またはより具体的には脊椎動物の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞の、石灰化を誘導する方法を含んでよい。
【００４５】
１つの態様において本発明は、患者の、骨形成の所望の位置の近位の位置に、軟骨形成性または骨形成性の前駆細胞を投与すること；さらにＢＢＰを投与すること、そしてＴＧＦ−βファミリーのメンバーの１つ、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスを投与することを含む、脊椎動物の組織における骨形成の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４６】
１つの態様において本発明は、患者の、石灰化の所望の位置の近位の位置に、骨形成性細胞を投与すること、そしてさらにＢＢＰを投与することを含む、脊椎動物の組織における石灰化の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４７】
１つの態様において本発明は、細胞の骨形成を誘導するために、脊椎動物の未分化の間葉系幹細胞を、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの１つ、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスで処置すること、さらに、間葉系幹細胞をＢＢＰで処置すること；そして脊椎動物の間葉系幹細胞を、患者の、骨形成の所望の位置の近位の位置に投与すること、を含む、脊椎動物における骨形成の速度または程度を高める方法を含んでよい。
【００４８】
例えば、哺乳類の細胞、例えば間葉系幹細胞は、患者または細胞ドナーから採集することができる。この細胞は、骨の形成または修復が所望される位置（例えば骨の成長が必要とされる骨折部位もしくはインプラント部位）、またはＢＢＰおよび/もしくはＢＭＰで最初に処置した位置に注入してよい。その後この細胞は、患者に、全身、または石灰化（または）骨形成が所望される選択された部位のいずれかに、再投与してよい。加えて患者には、骨形成または石灰化を達成する少なくとも１つの付加的な薬剤で、局所的にまたは全身に処置してよい。
【００４９】
図１２ＡおよびＢは、本発明の例示としての方法の流れ図を示すが、そのステップはあらゆる順序で行ってよい。
【００５０】
本発明の１つの態様は、固体支持体上に固定化したＢＢＰを包含する製品を含んでよい。固体支持体はさらに、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、例えばＢＭＰ−２または脱灰骨マトリックスを含んでよい。
【００５１】
本発明の１つの態様は、少なくともインプラントの表面がＢＢＰを含む基材を含む、in vivoで使用するためのインプラントを含んでよい。インプラントはさらに、ＭＳＣ、軟骨細胞または骨芽細胞の前駆細胞を含んでよい。さらにインプラントは、例えばピン、ネジ、プレート、または人工関節の形に成形してよい。
【００５２】
例えば図１３Ａ＆Ｂは、本発明の２つの態様を示す。図１３Ａにおいて本発明は、表面（２０１）を有する基材を包含する、体内で使用するためのインプラントまたは移植片（２００）を含んでよく、その場合少なくともインプラントの表面は、周辺の組織における石灰化または骨形成を誘導するための十分量のＢＢＰ（２０３）を含む。インプラントは、間葉系幹細胞、ＢＢＰを発現する軟骨形成性細胞もしくは骨形成性細胞、および/またはＢＭＰ−２、脱灰骨マトリックス、もしくはコラーゲン培養物を含んでよい。インプラントはまた、ピン、ネジ、プレート、または人工関節の形であってよく、骨の除去、骨折、またはその他の骨傷害の部位（２０４）の形成または修復を刺激することにより、骨折を固定化し、骨の形成を高め、または人工関節のインプラントを安定化するために使用する骨（２０２）の近位に、または骨に接触して設置してよい。
【００５３】
図１３Ｂに示したように本発明はまた、in vitroの適用（例えばコラーゲンまたは軟骨細胞の培養において）、または骨（２０２）の近位にもしくは接触しての、少なくともＢＢＰを含有する組成物またはＢＢＰ発現細胞（２０６）のin vivo の投与、すなわち骨形成および/または石灰化が所望される骨除去、骨折またはその他の骨傷害の部位（２０４）でのインプラント（２００）、を含んでよい。ＢＢＰ組成物は、その他の薬剤、例えばＢＭＰ−２、脱灰骨マトリックス、またはコラーゲン培養物と組み合わせて投与してよい。
【００５４】
例えば、ヒトにおける骨に関連する障害を治療するための幹細胞の使用についてもまた、検討されてきた。健常な個体由来の骨芽細胞前駆体の幹細胞の、疾患の個体への注入は、これらの患者における骨密度を改善することが示された。細胞はＢＭＰおよびＢＢＰを用いて前処理してもよいし、またはそれらと共に同時に投与してもよい。
【００５５】
１つの態様において本発明は、ＢＢＰのあらゆる部分、またはＢＢＰ前駆体であるＳＳＰ−２４のＢＢＰ部分への選択的結合を有する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含んでよい。
【００５６】
ＢＢＰまたはそのフラグメントは、免疫原性ポリペプチドに（例えばリコンビナントの発現またはin vitroでの共有結合の方法により）融合させてよく、今度はこれを使用して、ＢＢＰに対する抗体を作成するために動物を免疫してよい。抗体は免疫された動物の血清から回収する。あるいは従来の様式で免疫された動物由来の細胞から、モノクローナル抗体を調製してもよい。固定化した抗体は、ＢＢＰの検出または精製において特に有用である。
【００５７】
ウサギのポリクローナル抗体を作成した特定のペプチド配列の２つの例として以下を含む：（１）ＢＢＰ前駆体であるウシおよびヒトのＳＳＰ−２４の双方と反応する、ペプチド配列“ＩＱＥＴＴＣＲＲＥＳＥＡＤＰＡＴＣＤＦＱＲＧＹＨＶＰＶＡＶＣＲＳＴＶＲＭＳＡＥＱＶ”（図１１−配列番号３）に対する抗体。この抗体は、上に示した合成ペプチドで免疫したウサギにおいて作成した。さらに（２）配列“ＣＧＥＰＬＹＥＰＳＲＥＭＲＲＮ”（図１１−配列番号４）に対して作成した抗体。この抗体もまた、示した配列に対応する合成ポリペプチドで免疫したウサギにおいて作成した。この２つ目の抗体は、ウシＳＳＰ−２４と反応する。Ｎ末端のシステインは、ネイティブＳＳＰ−２４配列の部分ではない；しかし好ましくは、このペプチドがアフィニティークロマトグラフィー用のクロマトグラフ樹脂に結合することを可能にするために含める。付加的なペプチド配列を、ＢＢＰとの特異的な結合のために同定してもよく、この配列を、ＢＢＰとの選択的結合を有する抗体を作成するために選択してよいが、ＢＢＰの結合、例えばＢＭＰ−２、またはその他のＴＧＦ−βファミリーのメンバーと結合するＢＢＰの領域（配列番号３および４を含む）を妨げないものとする。これらの特定のペプチド配列を使用して、モノクローナル抗体を作成することができ、この調製法は当該技術分野において公知である。
【００５８】
上の配列、マウス、ヒトおよびラットのゲノムにおける対応する配列、または免疫原性配列のあらゆる誘導体に対する抗体もまた、本発明において有用である。これらの抗体は、少なくともそれらが高い特異性を持ってＢＢＰアミノ酸配列を認識するという限りにおいて有用である。そのような抗体が、他の分子と相互作用するペプチド上の位置に結合する場合、その抗体はまた、ＢＢＰと他の分子とのタンパク質特異的な相互作用を阻害するという点で有用であると思われる。軟骨形成または骨形成の速度または程度が修飾されると思われる状況におけるＢＢＰ活性の阻害。
【００５９】
本発明の１つの態様において、ＢＢＰに対して特異的な抗体は、脊椎動物の細胞におけるＢＭＰ−２による骨形成の程度もしくは速度を減少させる、あるいは脊椎動物の細胞における、またはより具体的には哺乳類の軟骨形成性もしくは骨形成性の前駆細胞における石灰化の程度もしくは速度を減少させる上で、有用であると思われる。
【００６０】
本発明の１つの態様はまた、サンプル（細胞培養液、組織サンプル、ペプチド画分、Westernブロットを含むがこれに限定されない）をＢＢＰ選択的抗体に暴露させ、ＳＳＰ−２４/ＢＢＰおよびＢＢＰ抗体の複合体を可視化することを含む、サンプル中のＳＳＰ−２４/ＢＢＰの存在を検出するために、ＢＢＰ選択的抗体を使用する方法を含む。
【００６１】
本発明の１つの態様においてＢＢＰ抗体は、リコンビナント細胞培養液または天然の原料からのＢＢＰのアフィニティーによる精製に使用してよい。他の成長因子と検出可能な交差反応をしないＢＢＰ抗体を使用して、これらの他のファミリーメンバーからＢＢＰを精製することができる。
【００６２】
１つの態様において本発明は、ＢＢＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列、または上述の修飾されたアミノ酸配列に対応する修飾された配列を包含する、核酸コンストラクトを含んでよい。
【００６３】
本発明はまた、ＢＢＰ、または前駆体のＳＳＰ−２４をコードする核酸配列に、操作可能なように連結した発現ベクターを含んでよい。さらにＢＢＰ、またはその前駆体であるＳＳＰ−２４をホスト細胞中にコードする核酸コンストラクトを導入することにより、形質転換体を得てもよい。
【００６４】
本発明の実践は、ＢＢＰ、および哺乳類またはウイルスの発現ベクター中に操作可能なように連結されたプロモーターをコードする配列を包含する、オリゴヌクレオチドコンストラクトの使用を含んでよい。発現ベクターおよびクローニングベクターは、そのベクターが１つまたはそれより多くの選択されたホスト細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターがホストの染色体とは独立して複製することを可能にするものであり、複製の原型または自発的に複製する配列を含む。そのようなクローニングベクターは、当業者に周知されている。発現ベクターはクローニングベクターと異なり、ホスト有機体により認識され、ＢＢＰ核酸に操作可能なように連結された、誘導可能なまたは構成的なプロモーターを含有してよい。核酸は、それが別の核酸配列との機能的関連性の中に置かれている場合、操作可能なように連結してよい。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがあるポリペプチドに分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドに関するＤＮＡに操作可能なように連結する。
【００６５】
本発明の１つの態様はまた、相補的なＢＢＰ ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列にサンプルを暴露させ、ハイブリッドの複合体を可視化することを含む、ＢＢＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対して相補的で、特異的な結合を有するＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列を使用して、サンプル（細胞培養液、組織サンプル、核酸画分、またはSouthern もしくは Northernブロットを含むがこれに限定されない）中のＢＢＰ ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を各々検出する方法を含んでよい。
【実施例】
【００６６】
実施例１：非コラーゲン性骨タンパク質（ＮＰＣ）群の抽出および分離
方法：ＮＣＰ群は、脱脂、脱灰したヒト皮質骨粉末より、４Ｍ ＧｕＨＣＩ、０．５Ｍ ＣａＣＩ２、２ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、０．１ｍＭ ベンズアミジンＨＣＩ、および２ｍＭ ＮａＮ３を用いて、１８時間、６℃で抽出した。残渣のコラーゲンおよびクエン酸可溶性ＮＣＰは、２５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ３．１に対する６℃、２４時間の透析により抽出した。残渣を遠心（１０，０００×ｇ、６℃、３０分間）によりペレット化し、１：１（ｖ/ｖ）クロロホルム：メタノールを用いて、２４時間、２３℃で脱脂し、濾過により集め、２２℃で乾燥させた。この材料を４Ｍ ＧｕＨＣＩ中に再懸濁し、４Ｍ ＧｕＨＣＩ、０．２％（ｖ/ｖ）Triton Ｘ−１００、１００ｍＭ Tris−ＨＣＩ、ｐＨ７．２に、２４時間、６℃で透析した後、水に透析し、１０，０００×ｇ、３０分間、６℃で遠心した。ペレットを凍結乾燥し、その後ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離した。
【００６７】
クロマトグラフィーは、ＣＨＴ−１０セラミックヒドロキシアパタイトカラム (BioRad, Hercules, CA)を用いて、BioLogicクロマトグラフィーワークステーションを使用して行った。ウシＢＭＰ/ＮＣＰは６Ｍ 尿素、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中に溶解させた。サンプルをヒドロキシアパタイトカラムにのせ、非結合画分を集めた。結合したタンパク質は、カラム容積の５倍量の直線濃度勾配で、リン酸ナトリウムの濃度を３００ｍＭまで増加して溶出させた。カラムを流している間、５ｍｌの分画で集めた。１８０ｍＭ リン酸塩で分離された分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりさらに分離した。１８．５のＭｒに対応するバンドを切り出し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）による配列分析を行った。
【００６８】
結果：配列の同定および分析：ヒドロキシアパタイトから１８０ｍＭ リン酸塩で溶出されたｂＢＭＰ/ＮＣＰの分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、１８．５ｋＤのＭｒの材料を、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ分析した。この材料の主要なタンパク質成分は、そのタンパク質の複数領域と同一な配列を有する６つのペプチドに基づき、ＳＰＰ−２４のフラグメントであると決定した。(Hu, et al., Isolation and molecular cloning of a novel bone phosphoprotein related in sequence to the cystatin family of thiol protease inhibitors(チオールプロテアーゼインヒビターのシスタチンファミリーと配列の関連する、新規骨リン酸化タンパク質の単離および分子のクローニング). J. Biol. Chem. 270:431-436, 1995.)これらのペプチドの配列を表１に示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
この配列のＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースによる分析から、以前に記載されているシスタチン様ドメインであることが明らかになったが、他の配列の骨代謝との関連性への類似性は認められなかった（Hu, et al.）。しかし他の研究から、他のシスタチン様タンパク質は、骨代謝に一役を担うタンパク質と相互作用することが知られている。具体的にはシスタチンファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−β受容体との類似性の基づいて、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ−２との結合特性を有する。（(Brown, et al., Friends and relations of the cystatin superfamily- new members and their evolution（シスタチンスーパーファミリーの新規メンバーの仲間および関連性−新規メンバーおよびそれらの進化）.: Protein Sci. 6:5-12, 1997； Demetriou, et al., Fetuin/α 2-HS glycoprotein is a transforming growth factor-β type Il receptor mimic and cytokine antagonist（フェチュイン/α２−ＨＳ糖タンパク質は、トランスフォーミング成長因子−βＩＩ型受容体の擬態およびサイトカインアンタゴニストである）. J. Biol. Chem. 271:12755- 12761 , 1996.）しかしフェチュインはＢＭＰの活性と拮抗する（Hu, et al.）。それ故ＳＰＰ−２４のシスタチン様領域、およびフェチュインのシスタチン様ドメインの手作業による比較を行った。
【００７１】
図１Ｂは、ウシＳＳＰ−２４、ＢＭＰ−２相同領域、およびＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同領域の部分的なアミノ酸配列である。下線のアミノ酸は、質量分析により存在することが確認された。(GenBank アクセション番号Ｕ０８０１８； Hu, et al.)
興味ある２つの領域が、ＳＳＰ−２４のシスタチン様領域において同定された。１つの領域は、ＢＭＰ−２と類似するある配列を有し、一方他の領域は、フェチュインのＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメインとの類似性を有していた。これら２つの領域を含有するＳＳＰ−２４の配列の部分を図１Ｂに示す。
【００７２】
ヒトＢＭＰ−２およびヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩに対する、興味ある２つの領域の比較を図２および３に示す。図２は、ヒトＢＭＰ−２、およびウシＳＳＰ−２４のＢＭＰ−２相同領域の、アミノ酸配列アラインメントである。図３は、ウシフェチュインおよびヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ（上）、ならびにヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩおよびウシＳＰＰ−２４のＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメイン（ＢＢＰに対応する）（下）のアミノ酸配列アラインメントである。ＳＰＰ−２４、フェチュイン、ヒトＢＭＰ−２、およびヒトＴＧＦ−βＩＩ受容体の配列のアラインメントは、T-Coffeeプログラムを使用して行った。(Notredame, et al, T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments（複数の配列アラインメントのための新規方法）. J. Molecular Biol. 302:205-217, 2000.)これら２つの領域に対応する合成ペプチドを、以下に記載するように得、化学的分析およびin vivo分析を行った。
【００７３】
実施例２：ＢＢＰのin vivo活性
方法：材料の骨形成活性は、８から１０週齢のオスSwiss-Weberマウス(Taconic Farms, Germantown, NY)を使用して検査した。アッセイの前に、ＢＢＰを可溶化し、２ｍｇのアテロコラーゲン中に凍結乾燥した。乾燥した材料を＃５ゼラチンカプセル内に入れ、クロロホルム蒸気への暴露により無菌化した。アッセイを行うため、小動物麻酔機(VetEquip, Pleasanton, CA)に通して、２ ｌ/分の酸素中に送達した１％イソフルランを使用して麻酔した。動物は手術用ボードに固定し、後四半身全体の被毛を剪毛した。皮膚を７０％エタノールで清浄にし、後四半身に隣接する脊椎上に正中切開を加えた。はさみでの鈍的切開を使用して、片側の四頭筋を露出させた。はさみの先で筋肉中に小さ窪み嚢を作り、検査材料を含有する＃５カプセルを窪みの中に挿入した。その後皮膚を、３つの１１ｍｍ Michelサージカルクリップで閉じ、動物をモニタリングのためケージに戻した。
【００７４】
２１日後動物を屠殺し、後四半身を切除した。検体の放射線学的検査は、スモールパーツＸ線キャビネット(Faxitron, Wheeling, IL)を使用して行った。骨形成の定量化のため、骨領域、および異所性骨形成部位を包括的に含む興味ある領域の骨塩量（ＢＭＣ）を、PIXImus2 小動物デンシトメーター(GE Lunar, Madison, Wl)を使用して決定した。次に検体を緩衝化ホルマリン中に入れ、組織学的検査のためのルーチンの処理を行った。
【００７５】
様々な量のｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰを組み合わせ、インプラント用に調製した。以下の量のすべての可能な組み合わせを、パイロット試験で使用した。ｒｈＢＭＰ−２：０μｇ、０．０５μｇ、０．５μｇ、５μｇ、および５０μｇ；ＢＢＰ：０μｇ、５０μｇ、およびμｇ、５００ｍｇ。５μｇのｒｈＢＭＰ−２のサンプル量が、信頼できる分析のための多すぎもせず少なすぎもしない異所性骨の量を一貫して産生したため、この量をより広範なその後の研究に使用した。
【００７６】
結果：ＢＢＰを、単独でまたはｒｆＢＭＰ−２と組み合わせて検査した。
【００７７】
図４は、アテロコラーゲン中５００μｇのＢＢＰ（上）、またはアテロコラーゲン単独（下）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。ＢＢＰを単独で担体と共に埋め込んだ場合、ＢＢＰは石灰化を誘導した。
【００７８】
図５は、アテロコラーゲン中５００μｇのＢＢＰの埋め込み後２１日の、マウスの筋肉の組織学的切片である。筋肉内脂肪組織に主に付随する異栄養性石灰化に注目のこと。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率１００Ｘ。）
ＴＧＦ−β受容体ＩＩと類似の配列をもつＢＢＰ ５００μｇを、５μｇのｒｈＢＭＰ−２と共に埋め込んだところ、形成された異所性骨の量は、デンシトメトリーにより測定した場合、同量のｒｈＢＭＰ−２単独を埋め込んだ動物において形成された骨の量より一貫して多かった。
【００７９】
図６は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後２１日の、マウス後四半身のＸ線写真である。ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ双方を含有するサンプルに付随する、増加した乳濁度に注目のこと。
【００８０】
さらに、ペプチドおよびｒｈＢＭＰ−２の双方を含有するインプラントは、ＢＭＰ−２単独のインプラントより早期に、検出可能な軟骨および骨を産生した。
【００８１】
図７は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み後、９日（上）および１２日（下）のマウス後四半身のＸ線写真である。ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ双方を含有する第９日のサンプルからは、サンプル内に石灰化の出現が認められるが、ＢＭＰ−２単独を含有するサンプルにはないことに注目のこと。
【００８２】
図８は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（Ａ）、および５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス５００μｇのＢＢＰ（Ｂ）の埋め込み後９日の、マウス後四半身の組織学的切片である。ＢＭＰ＋ＢＢＰ検体における豊富な軟骨に注目のこと、一方ＢＭＰ単独の検体は炎症および中胚葉細胞の増殖という、より早期のステージを示している。
【００８３】
【表２】
【００８４】
実施例３：ＢＭＰ−２および合成ペプチドの相互作用を決定するための表面プラズモン共鳴
方法：ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ間の結合の相互作用を、Biacom X 装置(Biacore,Piscataway, NJ)を利用しての表面プラズモン共鳴を使用して特徴づけた。この手順のためのバッファーおよびチップは、Biacoreより入手した。ｒｈＢＭＰ−２は、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に、１ｍｇ/ｍｌ濃度で透析した。次にこの材料を、製造元により提供された試薬および手順を使用してＣＭ−５センサーチップに付着させた。移動相(running)バッファーは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０とした。ペプチドは、１×１０−５から１×１０−４Ｍの範囲の濃度で、移動相バッファー中に溶解させた。５から５０μｌ/分の流速、２０から１００μｌの注入容積を利用した。再生溶液は、１０μＭ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０とした。
【００８５】
結果：ｒｈＢＭＰ−２およびＢＢＰ間の相互作用を決定するための表面プラズモン共鳴の研究の結果を、図９に示す。
【００８６】
図９は、ｒｈＢＭＰ−２（チップに固定）および１×１０−５から１×１０−４Ｍの範囲の濃度の環状化ＢＢＰの相互作用に関する、表面プラズモン共鳴のセンサグラムである。相互作用に関する解離定数（ＫＤ）推定値は、３×１０−５Ｍであった。ＢＢＰを、β−メルカプトエタノールで予めの還元により開環した場合は、有意な結合は起こらなかった。
【００８７】
実施例４：保持時間の研究：ＢＢＰおよびｒｈＢＭＰ−２
方法：標識したｒｈＢＭＰ−２を、ＢＢＰまたはビヒクルと混合し、コラーゲンスポンジに含浸させた。このスポンジを、げっ歯類の筋肉の窪みの中に埋め込んだ。特定の時間（１、３および７日）でインプラントを除去し、残留しているＢＭＰの量を決定した。４頭の動物を各群に使用した。
【００８８】
結果：ＢＢＰはｒｈＢＭＰ−２の保持を、約２つの因子により増大させた。図１０は、ＢＢＰの存在下または不在下における１、３および７日にわたるｒｈＢＭＰ−２の保持のパーセントを示す棒ブラフである。
【００８９】
考察：インプラント部位でのＢＭＰの保持の増大は、ＢＭＰの有効性を改善し、そしてまた同じ治療結果に必要な量を低減すると思われる。
【００９０】
明細書には本発明の特定の態様を記載しているが、当業者が、本発明の概念から離れることなく本発明のバリエーションを考案することは可能である。
【００９１】
実施例５：ヒトＢＢＰのin vivo活性
方法：実施例５の方法を利用して、８頭のマウスにおけるｈＢＢＰの活性を、後四半身の異所性骨形成のアッセイ法において、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（コントロール）、または５μｇのｒｈＢＭＰ−２プラス０．０５ｍｇのヒトＢＢＰ（ｈＢＢＰ）を使用して検査した。４週後、動物を屠殺し、後四半身を切除した。Ｘ線およびＤＥＸＡ分析を行った。
【００９２】
結果：ｈＢＢＰを、ｒｈＢＭＰ−２との組み合わせにおいて検査した。
【００９３】
挿入した時に、ＢＭＰを伴うｈＢＢＰは、ＢＭＰ単独より多量の石灰化の誘導を得た。
【００９４】
【表３】
【００９５】
実施例６：関連動物モデルにおけるＢＭＰへの代替え（または）補助としての、脊椎固定におけるＢＢＰの効果
ラット後側脊椎固定モデルを使用して、癒合におけるＢＢＰの効果を調べた。
【００９６】
方法：３群の６頭Lewisラットに、各々以下の薬剤：ＢＢＰ（５００μｇ）（１群）；ＢＢＰ（５００μｇ）＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（２群）；コラーゲン＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（３群）、を含有するコラーゲンスポンジの挿入による、椎骨Ｌ４−Ｌ５での後側方横突起間脊椎固定術を行った。結果を、剥皮のみ（０％癒合）および高用量のｒｈＢＭＰ−２（３μｇ）（１００％癒合）の組織学的コントロールと比較した。すべてのラットは、２、４、６、および８週に術後のＸ線撮影を行った。脊椎の触診を、８週の屠殺時に行った。骨の形成は、Ｈ＆Ｅ染色した組織学的切片において評価した。
【００９７】
結果：８週で、癒合ラットは：１群（ＢＢＰのみ）では１４％；２群（ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ）では８０％；そして３群（コラーゲン＋低用量ＢＭＰ）では４０％であった。この値は、ヒストリカルネガティブコントロールを０％とし、ヒストリカルポジティブコントロールを１００％として比較している。
【００９８】
【表４】
【００９９】
考察：３群（コラーゲン＋低用量ＢＭＰ）とは対照的に、２群（ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ）におけるより高い癒合速度は、脊椎固定を達成するために、より低用量のＢＭＰの使用を可能にすることができるというＢＭＰにおける補助的効果を、ＢＢＰが有することを示唆する。これらの有望な結果を確立するために、より多数の被験者によるさらなる研究が必要である。
【０１００】
実施例７：動物脊椎固定モデルでの、ＢＭＰにおける結合ペプチドの補助的効果
脊椎固定におけるＢＢＰの、ＢＭＰに対する代替えまたは補助としての効果を、関連動物モデルにおいて調べる。
【０１０１】
方法：５群の５０頭Lewisラットに、各々以下の薬剤：ＢＢＰ（５００μｇ）（１群）；ＢＢＰ（１０００μｇ）（２群）；コラーゲン＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（３群）；ＢＢＰ（５００μｇ）＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（４群）；およびＢＢＰ（１０００μｇ）＋低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）（５群）の植込みによる、椎骨Ｌ４−Ｌ５での後側方横突起間脊椎固定術を行った。コントロール群として、ネガティブ群（剥皮）およびポジティブコントロール群（コラーゲン＋３μｇのＢＭＰ）を含めた。
【０１０２】
すべてのラットは、２、４、６、および８週に術後のＸ線撮影を行った。８週の屠殺後に脊椎の触診を行った。骨の形成は、Ｈ＆Ｅ染色した組織学的切片において評価した。
【０１０３】
結果：８週での触診により、１群および２群（低用量および高用量のＢＢＰのみ）では０％癒合、３群では４０％癒合、そして５群（ＢＢＰ１０００μｇ＋低用量ＢＭＰ）では９０％癒合を明らかにした。３群および５群の差異は、ほぼ統計学的有意差であった（ｐ＝０．０５６）。すべてのわれわれのこれまでの研究において、ネガティブ群としての背景コントロール群（剥皮のみ）は０％癒合という結果を示し、一方ポジティブコントロール群（ＢＭＰ十分容量）による癒合比率は１００％であった。Ｘ線写真による癒合の比率は、第４週、および第６週では３群より５群において有意により高い（ｐ＜０．０５）が、第８週ではほぼ有意であった（ｐ＝０．０５６）。組織学的分析は、３群と比較した場合、４群および５群において、より成熟したより厚い骨量を明らかにした。
【０１０４】
考察：コラーゲン＋低用量ＢＭＰに比して、ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰによるより高い癒合比率は、将来的には脊椎固定のための低用量のＢＭＰの使用をおそらく可能にする、ＢＭＰにおけるＢＢＰの補助的効果を示していると言ってよい。
【０１０５】
実施例８：動物の脊椎固定モデルでの、ＢＭＰにおける結合ペプチドの補助的効果
ｒｈＢＭＰ−２に誘導される骨の治癒における、骨の形態形成タンパク質結合ペプチド（ＢＢＰ）の効果を検査するための、脊椎固定のラットモデルを利用しての前向きの８週介入の試み。
【０１０６】
本研究の目的は、ｒｈＢＭＰ−２の担体として使用するコラーゲンスポンジへのＢＢＰの付加が、満足な臨床結果を達成するために必要なｒｈＢＭＰ−２の量を低減するかどうかを決定することである。ＢＢＰは、ＢＭＰ−２の効果を増大するための補助として有効であり、癒合を提供するために必要なタンパク質の用量の低減を可能にした。
【０１０７】
方法：Ｌ４−Ｌ５での後側方横突起間脊椎固定術を、５つの治療群の各Lewisラットで行い、コラーゲンスポンジ（５×５×１３ｍｍ）を手術部位に埋め込んだ。
【０１０８】
各スポンジは無菌のミクロチューブ内に置き、水中ＢＢＰ（５００μｇまたは１０００μｇ）の懸濁液、または無菌水のみのいずれかを含ませた。スポンジを、組織培養フード内で一晩放置して空気乾燥させた後、−７０℃で１時間置き、一晩凍結乾燥した。チューブ（凍結乾燥を可能にするため、最上部に小さな穴がある）をオートクレーブの窪みに置き、封入した。次に材料をクロロホルムの蒸気に少なくとも４時間暴露させて無菌化した。手術の直前にポーチを開き、チューブからスポンジを取り出し、デザインされた量のｒｈＢＭＰ−２または水を含有する第２のチューブに入れた。スポンジは溶液を完全に吸収することができた。
【０１０９】
ラットのＬ４−Ｌ５の後側方横突起間脊椎固定術は、我々の実験室１３−１７では、十分に確立された手順である。手短には、動物をイソフルランで麻酔し、手術部位を剪毛し、Betadyneおよびアルコールで準備した。３ｃｍの長軸方向の正中切開を皮膚およびＬ４−Ｌ５上の皮下組織を通して腰背筋膜まで加えた。次に２つの別個の２ｃｍの長軸方向の傍正中切開を、Ｌ４−Ｌ５の両側の脊柱起立筋に加えた。Ｌ４−Ｌ５の横突起を露出させ、軟組織を取り除き、高速のバールで皮質を剥離した。この部位を生理食塩水で洗浄し、治療検査材料を置いた。背腰筋膜を、４−０ Prolene (Ethicon, Somerville, NJ)で閉じた。皮膚を４−０ Proleneで閉じ、細心の術後ケアを施した。
【０１１０】
ＢＢＰの２つの用量（５００μｇおよび１０００μｇ）を、”低用量”（１μｇ）のｒｈＢＭＰ−２を伴う場合、または伴わない場合で検査し、結果を低用量（１μｇ）のｒｈＢＭＰ−２と比較した。これらはコントロール群に対して比較した。癒合は、放射線学的、組織学的、および触診の検査により評価した。動物は術後８週で屠殺した。
【０１１１】
手術の結果は、放射線学的に、組織学的に、および触診により評価した。前後方向のＸ線写真は、スモールパーツＸ線キャビネット(Faxitron, Wheeling, IL)を使用して、各動物について２、４、６および８週に得た。Ｘ線写真は、３名の独立した観察者により、以下の標準化スケール：０：癒合なし；１：骨形成の存在を伴う不完全な癒合；そして２：完全な癒合を利用して評価した。３名の観察者のスコアを加算し、合計５または６を、“癒合した”とみなした。脊椎の触診は、８週の屠殺時に行った。ヒトにおける癒合を決定するためのゴールドスタンダードをシミュレートするため、癒合物の検査および触診を死後行った。癒合したレベルは、Adson鉗子を用いて触診し、隣接する非癒合のレベルと比較した。各検体は、３名の独立した観察者により癒合、または非癒合として類別した。３名の観察者の誰れかが脊椎を非癒合と類別した場合は、その脊椎は“非癒合”とみなした。触診の後、検体は標準的な１０％脱灰溶液ＨＣｌ（CaI- Ex, Fisher Scientific, Fairlawn, NJ）を使用して脱灰し、水道水の流水で洗浄した後、７５％エタノールに移した。矢状切片を横突起の高さで注意深く切り出した。検体をパラフィン中に包埋し、各検体の切片を得た。これらの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。それらを、独立した観察者により癒合および非癒合として評価した。
【０１１２】
“癒合した”と判定された各群中の被験者の比率を、ＳＰＳＳソフトウェアを使用してのフィッシャーの正確確立検定（Fisher's exact test）を用いて、逐次的２群比較にて比較した。０．０５より小さいまたは等しいｐ値を、統計学的有意と設定した。
【０１１３】
結果：放射線学は、低用量ＢＭＰ−２（１μｇ）のみと比較した場合に、１０００μｇ ＢＢＰ＋１μｇ ＢＭＰ−２の組み合わせによる有意により早期の癒合を明らかにした（ｐ＜０．０５）。８週での触診および組織学は、ほぼ有意な差異（ｐ＝０．０５７）での、同じ組み合わせによるより高い癒合比率を明らかにした。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
放射線学的検査の結果を表５に示す。表５は、５または６のスコアを有し、それ故４回の各タイムポイント（２、４、６および８週）関して“癒合した”と判定された、各群中の被験者の比率を表す。表からわかるように、低用量および高用量のＢＢＰ群の動物はいずれも、いかなるタイプポイントでも癒合を発達させていなかった。低用量ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ−２群は、ＢＭＰ−２低用量のみの群より、第６および８週で、より高い癒合比率を有し、この差異は第６週に関しては有意であった（ｐ＜０．０５）が、８週では有意でなかった（ｐ＝０．１７０）。他方、ＢＢＰ高用量＋ＢＭＰ−２低用量群は、ＢＭＰ−２低用量のみの群を比較した場合、第４、６および８週のタイプポイントで、有意により高い癒合比率を有した（各タイムポイントに関してｐ＜０．０５）（図１５および１６）。
【０１１７】
表６は、３名の独立した臨床評価者により“癒合した”と判定された、各群の被験者の比率を示す。非常に重要な比較は、ＢＭＰ−２低用量群 対 ＢＢＰ低用量＋ＢＭＰ−２低用量群、およびＢＢＰ高用量＋ＢＭＰ−２低用量群、間のものであった。触診により評価した癒合比率は、ＢＭＰ−２低用量群と比較した場合、双方の組み合わせの群ともより高かった（図１５および１６）。しかしこの差異は有意ではなく、一方ＢＢＰ高用量＋ＢＭＰ−２低用量群と、ＢＢＰ低用量群との比較に関しては、有意の傾向が認められた（ｐ＝０．０５７）。低用量ＢＭＰ−２群の癒合した検体と比較した場合、組み合わせ群の癒合した検体では、癒合物の厚さはより厚い傾向があり、骨の成熟度はより成熟している傾向が認められた（図１７および１８）。図１７は、ＢＢＰおよびｒｈＢＭＰ−２の組み合わせの治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片であるが、皮質の成熟した骨を伴うＬ４およびＬ５の横突起間の厚い癒合物を示す。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４×）。図１８は、低用量ｒｈＢＭＰ−２（１μｇ）による治療後８週の、ラット脊椎領域の組織学的切片であるが、骨部分を架橋する成熟した皮質を架橋する未成熟な骨を示す。（Ｈ＆Ｅ染色。オリジナルの拡大率８．４×）。
【０１１８】
表６はまた、独立した組織学者により癒合したと判定された、各群の被験者の比率を示す。結果は、第８週の触診および放射線学双方の結果とも類似の癒合比率を実証することを確証した。低用量ＢＭＰ−２群の癒合した検体と比較した場合、組み合わせ群の癒合した検体において、癒合物の厚さはより厚い傾向があり、骨の成熟度はより成熟している傾向が認められた（図１７および１８）。
【０１１９】
特定の成長因子結合薬、例えばＢＢＰは、固定術で使用する担体中に配合して、ＢＭＰの投与量を減少させ、用量に関連する可能性が最も高い副作用をおそらく減少させることができる。このことはまたコストを低下させ、臨床結果を改善するものと思われる。
【０１２０】
Ｘ線写真の結果は、同じ量のタンパク質の単独での使用と比較した場合、高用量ＢＢＰ＋低用量ＢＭＰ−２の組み合わせによる、有意により高いそしてより早期の癒合比率を実証した。組織学および触診の検査は、ほぼ有意な差異を伴う第８週でのこのより高い癒合比率を確証した。この脊椎固定モデルは癒合が困難であり、堅固な関節固定を誘導するための特定の骨誘導能力を有する材料を必要とすることに注目することは重要である。同様に、５００μｇまたは１０００μｇのいずれか単独の使用では、脊椎モデルに癒合を提供しなかったが、筋肉の窪みモデルの５００μｇＢＢＰの埋め込みにより異所性異栄養性石灰化の形成が認められた。組織学的検査において筆者らは、ＢＭＰ−２のみの群と比較した場合、組み合わせ群によるより成熟した骨癒合物を観察した（図１７および１８）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の組織における骨の形成速度を増大する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項２】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
骨の形成が骨形成性として測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
骨の形成が石灰化により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
脊椎動物の骨の癒合速度を増大する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の癒合を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項１０】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
脊椎動物の骨の癒合速度を誘導する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項１６】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
脊椎動物の骨の癒合速度を誘導する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項２２】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
膜性骨の癒合速度を誘導する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、膜性骨の近位の組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項２８】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号１１を包含する、骨の形成を増大するための単離されたポリペプチドであって、ここでポリペプチドが少なくとも１つの骨成長因子の滞留時間を増大させる、前記ポリペプチド。
【請求項３４】
ペプチドが配列番号１の配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ペプチドが配列番号１２の配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
配列番号１１を包含する、骨の形成を増大するためのポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ここでポリペプチドが少なくとも１つの骨成長因子の滞留時間を増大させる、前記核酸。
【請求項３７】
核酸が配列番号２の配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
核酸が配列番号２１の配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
骨の形成において使用するための組成物であって、以下：
配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および
一定用量の少なくとも１つの成長因子、
を包含し、ここで組成物が、同じ用量の少なくとも１つの成長因子単独に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記組成物。
【請求項４０】
ペプチドが配列番号１の配列を有する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ペプチドが配列番号１２の配列を有する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項１】
脊椎動物の組織における骨の形成速度を増大する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項２】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
骨の形成が骨形成性として測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
骨の形成が石灰化により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
脊椎動物の骨の癒合速度を増大する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の癒合を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項１０】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
脊椎動物の骨の癒合速度を誘導する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項１６】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
脊椎動物の骨の癒合速度を誘導する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項２２】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
膜性骨の癒合速度を誘導する方法であって、配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および一定用量の少なくとも１つの骨成長因子を、膜性骨の近位の組織に投与することを包含し、ここで当該組み合わせが、同じ用量の少なくとも１つの骨成長因子単独による治療に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記方法。
【請求項２８】
骨成長因子が、ペプチドと結合することで、組織での成長因子の保持率が増大される、分子または化合物の群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
骨成長因子がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ペプチドが配列番号１の配列を有し、そして骨成長因子がＢＭＰである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ペプチドが配列番号１２の配列を有し、そして骨成長因子がｈＢＭＰである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号１１を包含する、骨の形成を増大するための単離されたポリペプチドであって、ここでポリペプチドが少なくとも１つの骨成長因子の滞留時間を増大させる、前記ポリペプチド。
【請求項３４】
ペプチドが配列番号１の配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ペプチドが配列番号１２の配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
配列番号１１を包含する、骨の形成を増大するためのポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ここでポリペプチドが少なくとも１つの骨成長因子の滞留時間を増大させる、前記核酸。
【請求項３７】
核酸が配列番号２の配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
核酸が配列番号２１の配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
骨の形成において使用するための組成物であって、以下：
配列番号１１の配列を有するペプチドまたはそのフラグメント、および
一定用量の少なくとも１つの成長因子、
を包含し、ここで組成物が、同じ用量の少なくとも１つの成長因子単独に比して、より速い速度の骨の形成を結果的にもたらす、前記組成物。
【請求項４０】
ペプチドが配列番号１の配列を有する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ペプチドが配列番号１２の配列を有する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
骨成長因子が、以下：ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＧＤＦ５、および脱灰骨マトリックスから成る群より選択される、請求項３９に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１０−５１３５３５（Ｐ２０１０−５１３５３５Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４２９６９（Ｐ２００９−５４２９６９）
【出願日】平成１９年１２月２６日（２００７．１２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７９４００
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【出願人】（５０７１７４９８３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２６日（２００７．１２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７９４００
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【出願人】（５０７１７４９８３）
【Ｆターム（参考）】
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