ＢＯＤの測定法
【課題】真核微生物を用いて感度良くBODを測定する方法を提供する。
【解決手段】真核微生物により有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、有機物質を含有する溶液中の有機物質量を検出または定量するBODの測定法において、真核微生物が有機物質を代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型の親水性メディエーターを電極により検出または定量する。
【解決手段】真核微生物により有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、有機物質を含有する溶液中の有機物質量を検出または定量するBODの測定法において、真核微生物が有機物質を代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型の親水性メディエーターを電極により検出または定量する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、BODの測定法に関する。更に詳しくは、真核微生物を用いたBODの測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
河川や産業排水の水質管理に重要な項目として、BOD(生物化学的酸素要求量)があり、国際的な有機性水質汚濁の指標とされている。有機化合物に起因する水質汚濁は、好気性微生物による酸化反応で減少、消去され、その有機物質濃度に対応して溶存酸素が消費されるため、この消費された酸素量を計測することで、水質汚濁が明らかになるのである。したがって、BODは有機化合物濃度を酸素量により間接的に表したものである。
【０００３】
BOD測定法としては、種々の方法が提案されている。例えば特許文献１には、トリコスポロン属の酵母を溶存酸素電極の表面に固定して、酵母が河川や排水中に含まれる有機汚濁物質を資化することで消費された溶存酸素の濃度を酸素電極で測定する方法が提案されている。この方法によれば、河川や排水中に含まれるさまざまな有機物質の総量を有機汚濁物質としてまとめて測定ができる特徴があるものの、測定溶液中にごく僅かしか溶存しない酸素の濃度を高感度に測定する必要があることから、測定システムが必然的に大きくなってしまうなどの問題点があり、試験室や工場などの屋内に限らず、現場での計測も必要となるBODの測定には向かない場合があった。また測定システム上、溶存酸素の非常に低い廃液にあっては正確な値を測定することが難しいという限界もあった。
【特許文献１】特公昭６１−７２５８号公報
【０００４】
かかる問題に対して、溶存酸素量が低い場合にあってもBODの正確な測定を可能とするメディエーターを用いたBOD測定法が開発された。かかる測定法は、溶存酸素に比べて液体中の溶解濃度が高い電子の濃度を指標とした電気化学(電極)測定型であり、BODの正確な測定および測定装置の小型化を可能とするといった画期的なものであった。
【特許文献２】特開平０７−１６７８２４号公報
【０００５】
しかるに、かかる測定法は微生物が有機物質を代謝することによる電子伝達系の電子の移動を検知するものであるため、呼吸鎖の電子伝達がミトコンドリア内で行われる真核微生物を用いた場合には、測定感度に乏しいとされ、原核微生物を利用した測定法が数多く提案されているにとどまるのが現状である。しかしながら、原核微生物は培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題があり、種々の測定法に応用し、実用化する場合の障壁となっており、真核微生物を用いたメディエーター型のBOD測定法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、真核微生物を用いて感度良くBODを測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる本発明の目的は、真核微生物により有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、有機物質を含有する溶液中の有機物質量を検出または定量するBODの測定法において、真核微生物が有機物質を代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型の親水性メディエーターを電極により検出または定量するBODの測定法によって達成される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題がある原核微生物を用いることなくBODを測定することができるとともに、その測定感度に関しても、従来提案されていた真核微生物を用いたBOD測定法と比較して、1〜350μlといった少量の試料を用いた場合であっても、数倍程度高感度となるといったすぐれた効果を奏する。さらに、脂溶性メディエーターをジメチルスルホキシドに溶解されて用いた場合には、測定感度の向上およびバックの減少を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
真核微生物としては、有機物質を代謝することにより電子伝達系に電子の移動が起こるものであればよく、従来技術により分離・培養可能な微生物であれば特に制限なく用いることができ、取扱い容易といった観点からは、酵母、例えばSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneum、Trichosporon fermentans、Trichosporon brassicae、Candida属、Aspergillus属などが挙げられ、好ましくはパン酵母として周知のSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneumなどが用いられる。Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セルビジエ)は、市販品をそのまま用いることができる。ここで、使用する微生物は生菌の状態、好ましくは対数増殖期の状態で用いることもできるし、実用性を考慮し、何らかの方法により保存が可能な形態、例えば死菌などの状態で用いることもできる。生菌を用いる場合、反応時における菌体の濃度は、OD600＝0.1以上、好ましくは0.5〜20程度、さらに好ましくは1.5〜5程度で用いられる。
【００１０】
酸化型の脂溶性メディエーターとしては、メナジオン(2-メチル-1,4-ナフトキノン)、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、ユビキノン、ハイドロキノン、2,6-ジクロロベンゾキノン、2-メチルベンゾキノン、2,5-ジヒドロキシベンゾキノン、2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンなどのキノン類、2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミン、N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンなどのベンゾアミン類が用いられ、好ましくはメナジオン、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミン、N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンが用いられる。ここで脂溶性メディエーターは、好ましくはジメチルスルホキシドに溶解される。メナジオンをDMSOに溶解して用いる場合には、反応液中のメナジオン濃度が20〜1000μM、好ましくは100〜400μMとなるように用いられる。メナジオンが、これ以上の濃度で用いられると、電極の再利用が困難になり、一方これ以下の濃度で用いられると有機物に対する応答が低下する。また、DMSOは反応液中に3％以下、好ましくは1％以下となるように用いられる。DMSOがこれ以上の割合で反応液中に添加されると、センサー応答値が低くなるため好ましくない。
【００１１】
酸化型の親水性メディエーターとしては、リボフラビン、L-アスコルビン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド、ニコチンアデニンジヌクレオチド、ルミクロム、グルタチオン、パーオキシダーゼ、チトクロムC、フェレドキシン等の生体酸化還元物質またはその誘導体、ヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウム、カルボキシメチル化フェロセン、DCIP、1-M-PMS、9-ジメチルアミノベンゾ-α-フェナゾキソニウムクロライド、Fe-EDTA、Mn-EDTA、Zn-EDTA、メソスルフェート、メチルビオローゲン、デュロヒドロキノン、フェロセンカルボン酸、フェナジンメトスルフェートなどが用いられ、好ましくはヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウム、カルボキシメチル化フェロセン、DCIP、1-M-PMS、9-ジメチルアミノベンゾ-α-フェナゾキソニウムクロライドが、さらに好ましくはヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウム、カルボキシメチル化フェロセンが用いられる。
【００１２】
酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターとは、還元型となった脂溶性メディエーターによって酸化型の親水性メディエーターから還元型の親水性メディエーターが生成されるような組合せで用いられ、これらの濃度は、一般にそれぞれ40nM以上、好ましくは50nM〜500mM、さらに好ましくは100nM〜50mM程度で用いられる。このように酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを組み合わせて用いることにより、1〜350μlといった少量の試料を用いてのBODの測定が可能となるといった優れた効果を奏する。
【００１３】
以上の真核微生物およびメディエーターに加えて、本発明方法においてはスーパーオキシドジスムターゼ(EC 1.15.1.1)を用いることが好ましい。スーパーオキシドジスムターゼは、超酸化物不均化酵素ともよばれ、スーパーオキシドアニオンラジカルの不均化反応を触媒する働きを有するため、酸素ラジカルから酸素および過酸化水素を生成し、本方法での測定感度をアップさせることができる。
【００１４】
BODの測定は、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターの存在下、好ましくはさらにスーパーオキシドジスムターゼの存在下において、真核微生物により溶液中の有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより行われる。ここで、有機物質の代謝中における菌体の活性を良好に保つため、反応層内には少なくとも10mM程度以上のリン酸イオンが含まれることが望ましい。これは、10mMリン酸緩衝液(phosphate buffer; PBは Na2HPO4・12H2O 3.58gまたはNaH2PO4・2H2O 1.56gをそれぞれ純水に溶解して、各溶液を1lとし、両者を混ぜ合わせてpH 7.0に調整し、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したもの、あるいは1倍のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffer saline；PBSはNaCl 8g、Na2HPO4・12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2gを純水に溶解してpH 7.0に調整した後、全量を純水で1lとし、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したものなど、好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。ここで、10mM程度のリン酸イオンが含まれることで、試料液のpHの影響を緩衝する作用も奏する。また、後述するBODセンサーを利用する場合、これを再利用するといった観点からは、反応液中に界面活性剤、例えばTriton-Xが、反応液中好ましくは0.00001〜0.1％、さらに好ましくは0.0001〜0.01％程度添加される。これにより、測定回数が増すにつれてセンサーの応答値が大きく減少するといった不具合を解消することができる。
【００１５】
代謝活性は、溶液中に生成する還元型の親水性メディエーターを、少なくとも作用極および対極を有する電極を溶液中に浸漬した後、作用極および対極との間に電位差を負荷した際に両電極間に流れる電流を測定することによって算出される。
【００１６】
測定に際しては、予め電極上に真核微生物、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーター、好ましくはさらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させておき、これに有機物質を含有する溶液を添加することにより、有機物質量の測定を可能とするBODセンサーを用いることもできる。かかるセンサーとしては、例えば基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極を設け、作用極上および／またはその付近に真核微生物、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーター、好ましくはさらにスーパーオキシドジスムターゼを配したセンサーなどが挙げられる。このようなセンサーとしては、例えばセラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリエステル等)などの絶縁性基板にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等から形成された各電極が形成され、作用極上および／またはその付近に架橋法、共有結合法、イオン結合法等により微生物等を固定したものなどが用いられる。
【００１７】
このようなセンサーとして、好ましくは底部絶縁性基板上にスペーサーを介して、底部絶縁性基板側の表面に少なくとも作用極および対極の２電極を設けた上部絶縁性基板を配し、さらに好ましくは作用極上および／またはその周辺部にメディエーター層または微生物−メディエーター混合物層を配したものが用いられる。かかるセンサーは、一般的なセンサーとは異なり、試料液面と接するようにあるいは試料液中に浸漬するように電極が存在しているため、試料液中に存在する粒子状物質、例えば砂利などが電極表面に堆積することによる測定値への影響を排除しうるといった効果を奏する。さらに、センサーの反応層内に撹拌石を入れ、センサー下方に撹拌システムを設けることで、反応溶液を連続的に撹拌することができるため、反応効率の向上及び繰り返し再現性の向上が期待できる。また、測定時に撹拌を止めることで、正確な電気化学測定ができる。
【００１８】
電流値の測定は、有機物質を含有する溶液と微生物等を反応させた後、正確に0〜60分まで、好ましくは0.5〜30.5分までの経時的な電流値の変化を、例えば北斗電工社製品SHV−100、BAS社製品CHI-1202などの電気化学アナライザーを使用し、電気化学測定法、例えばクロノアンペロメトリー法などを用いて、電極間に負荷した電位に対する生成した還元型メディエーターによる応答を確認することにより行われる。電極間に負荷する電位は、特に限定されないが、生成される過酸化水素も併せて測定することを目的とする場合には、0.7〜1.1V、好ましくは0.8〜1.0Vが選択される。
【００１９】
電極端子は、測定装置に接続され、電極間に生じた電気的な値を測定する。この測定装置には、電極における電気的な値を計測する計測部と、計測された値を表示する表示部が備えられる。この計測部における計測方法としては、上述した如くクロノアンペロメトリー法などを用いることができる。
【００２０】
また、この装置には計測値を保存するためのメモリーを備えることもできる。さらに、測定値を遠隔的に管理する場合には、計測部に計測データを送信する無線手段、好ましくは非接触型ICカードまたは短距離無線通信(例えば、ブルートゥース；登録商標)などの無線手段を搭載することもできる。
【実施例】
【００２１】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００２２】
実施例１
凍結乾燥されたパン酵母菌体(日清製粉製品)をスパーテルで極少量取り、18mm径×180mmの試験管に入れたYPD液体培地(酵母エキス10g、ポリペプトン20g、グルコース20gを純水に溶解して全量を1,000mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)2mlに接種し、シリコ栓で蓋をして28℃、180rpm、好気条件下で18時間振とう培養を行った。次いで、YPD寒天培地(酵母エキス2g、ポリペプトン4g、グルコース4g、寒天4gを純水に溶解して全量を200mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)を、クリーンベンチ内でシャーレに約20mlずつ入れ、恒温器(アーンスト・ハンセン商会製品BARNSTEAD/THERMOLYNE LAB-LINE 120-5JPN)内で乾燥させたものに、乾燥酵母から培養を行った酵母液を白金耳で網目模様に接種し、28℃で二晩前培養を行った。
【００２３】
YPD寒天培地上のコロニーから菌体を白金耳でYPD液体培地2mlに接種し、28℃、180rpm、好気条件下で13〜14時間振とう培養を行い、さらに500ml容量の坂口フラスコ中で、YPD液体培地50mlに最終濃度が0.5％となるよう前培養液を接種し、シリコ栓で蓋をして、28℃、120rpm、好気条件下で9〜10時間本培養を行った。細胞の増殖相は、対数増殖期(OD600=0.9以上)に達していた。
【００２４】
本培養液全量を遠沈管に移した後、4℃、3000rpmの条件下で3分間の遠心分離を行い、集菌を行った。集菌後、0.9%生理食塩水で3回洗浄を行った後、ペレット状の酵母を25mlの0.9%生理食塩水で懸濁し、50ml遠沈管内で2時間エアレーションを行い、再び洗浄操作を三回繰り返した。洗浄後、最終菌体濃度がOD600=15〜75.7となるように0.9%生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて菌体懸濁液(酵母液)を調製した。
【００２５】
センサーチップ内に、調製されたOD600=15の酵母液30μl、フェリシアン化カリウム(和光純薬工業製品)158mgをpH7.0のPBS緩衝液2mlに溶解した0.24Mフェリシアン化カリウム50μl、LB培地(酵母エキス0.25g、ポリペプトン0.5g、NaCl 0.25gを純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でpH7.0に調整した後、全量を純水で50mlにして、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)60μlおよびメナジオン(MP Biomedicals社製品)3.5mgを純水40μlおよびエタノール960μlの混合溶液(96%エタノール)に溶解した20mMメナジオン1.5μlに反応液総量が300μlとなるようにPBS緩衝液を加えてピペットマンを用いて十分に撹拌後、電位を0.9Vに設定し、0.5分後、5.5分後、15.5分後および30.5分後における電流値の測定が北斗電工社製品SHV−100を用いて行われた。
【００２６】
ここで、センサーとしては、図１に示される形状の外寸法40×18×4.5mm、反応槽寸法10×12.5×4.5mm(反応槽内容積562.5mm3)であるセンサーチップが用いられた。具体的には、厚さ188μmの透明なポリエチレンチレフタレートを、図２ I)に示されるような35mm×18mmの本体および16mm×6.0mmの支持部１１となるように打ち抜き、底部絶縁性基板１０を作製した。この底部絶縁性基板上に、II)に示されるように厚さ1mmで10mm×12.5mmのスペース１３を有する、底部絶縁性基板と同一外形の下部スペーサー１２をアクリル系接着剤(日東製品 No.5000N)を用いて接着した。下部スペーサー上には、厚さ25μmの接着剤層が設けられ、上部絶縁性基板１４をさらに接着した。この上部絶縁性基板は、底部絶縁性基板と同じ厚さの同素材を用い、III)に示されるように、40mm×18mmの本体、21mm×6.0mmの支持部１１および3mmの間隔を空けて8mm×3mmのくし状基板部を有する10mm×12.5mmのスペース１３を形成したものであり、この底部絶縁性基板側の表面上には、2本のくし状基板部分に、7.5mm×2mmの導電体１５ 2本を、また支持部においては、21mm×2.6mmの2本の導電体１５を0.6mmの間隔を空けて、厚さ10μmのカーボンインクをスクリーン印刷法により形成した。上部絶縁性基板上には、下部スペーサーと同一素材で同一形状の上部スペーサー 3枚を接着剤を用いて貼り合わせた。このようにして作製されたバイオセンサの反応スペース内容積は、上述の如く約560mm3であった。
【００２７】
比較例１
実施例１において、メナジオンが用いられなかった。
【００２８】
比較例２
実施例１において、フェリシアン化カリウムが用いられなかった。
【００２９】
以上の実施例１および比較例１〜２で得られた結果は、図１に示される。図１に示されるように、メディエーターとしてフェリシアン化カリウムを単独で用いた場合には、LB培地中に含まれる有機物質を代謝することによる代謝活性を経時的な変化として確認することができないものの、フェリシアン化カリウムとともにメナジオンが用いられた場合には、反応時間が経過するに従って、応答値が高くなることが示され、LB培地中に含まれる有機物質を代謝することによる代謝活性を経時的な変化として確認することが可能であった。
【００３０】
実施例２
センサーチップ内に、調製されたOD600=15の酵母液50μl、0.05% Triton-X 100 10μl、0.24Mフェリシアン化カリウム83μl、LB培地100μlおよびエタノールに溶解した20mMメナジオン2.5μlに反応液総量が500μlとなるようにPBS緩衝液を加えてピペットマンを用いて十分に撹拌後、0.5分後、5.5分後、15.5分後および30.5分後における電流値の測定が実施例１と同様に行われた。なお、センサーとしては実施例１で用いられたセンサーにおいて、下部スペーサーを３枚に、また上部スペーサーを１枚に変更したものが用いられた。
【００３１】
実施例３
実施例２において、LB培地として純水を用いて7/10濃度としたものが同量用いられた。
【００３２】
実施例４
実施例２において、LB培地として純水を用いて4/10濃度としたものが同量用いられた。
【００３３】
実施例５
実施例２において、LB培地として純水を用いて1/10濃度としたものが同量用いられた。
【００３４】
実施例６
実施例２において、LB培地として純水を用いて1/20濃度としたものが同量用いられた。
【００３５】
実施例７
実施例２において、LB培地が用いられなかった。
【００３６】
実施例８
実施例２において、さらにSuperoxide Dismutase Solution(和光純薬工業製品)4500UをPBS緩衝液450μlに溶解したSOD溶液5μlが用いられた。
【００３７】
以上の実施例２〜８で得られた結果は、図２に示される。図２に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、応答値(出力電流値)により測定できることが示された。また、さらにSuperoxide Dismutaseを用いることで、応答値を大幅に増強できることが示された。
【００３８】
実施例９
実施例１と同様に酵母の培養・洗浄が行われ、最終菌体濃度がOD600=45となるように0.9%生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて酵母液を調製した。また、センサーとしては実施例２で用いられたセンサーが、チップの下に微小な撹拌機(アズワン社製、セルスターCC-303)を配置させた上で用いられた。
【００３９】
センサーチップ内に、調製された酵母液25μl、10倍PBS緩衝液で調製した0.48Mフェリシアン化カリウム41.5μl、測定試料液350μl、0.05%(w/v)Triton-X 100 5μl、エタノールに溶解した20mMメナジオン5μl、純水48.5μlを混合した混合液500μlを加え、撹拌石による撹拌を15分間行い、電気化学測定器(BAS社製、CHI-1202)を使用したクロノアンペロメトリー法により電位を0.9Vに設定し、電流値の測定が行われた。測定は各標準溶液につき３回行った。
【００４０】
測定試料として、実河川水が用いられた。実河川水は、東京都八王子市を流れる湯殿川（東橋、平成18年8月30日9時40分、天候：曇、気温：29.5℃、湿度81.1%）から採水したものを使用した。現場において採水を調べたところ、水温24.8℃、pH7.2、溶存酸素8.8mg O2/l、CODMn 6mg O2/l、導電率0.24mS/cm、塩濃度0%であり、実河川水のCODMn値が極めて低いことから、測定試料液としては、実河川水とGGA標準溶液を9:1の割合で混合したものが用いられた。GGA標準溶液としては、1,500mg O2/l GGA溶液、750mg O2/l GGA溶液および0mg O2/l GGA溶液(純水)の３種類を使用した。測定は各試料液について３回ずつ行われた。
【００４１】
得られた電流値について、同センサーを用いて予め作成された検量線に基づきBODの算出が行われた。ここで、検量線の作成試料液としてはグルコース15.0mg、グルタミン酸15.0mgを純水10.0mlに溶解し、細孔が0.22μmのメンブランフィルターにより滅菌した、BOD値が2,200mg O2/lを示すグルコース・グルタミン酸(GGA)標準溶液を純水で10倍に希釈して調製した220mg O2/l標準溶液および、GGAを含まない0mg O2/l標準溶液が用いられた。
【００４２】
算出結果を、図５に示す。図５には、同測定試料液についてBOD5法(JIS K 0102準拠)を用いて測定した結果と本発明のセンサーを用いて3回測定した結果を対応させて、センサー応答値の平均値をプロットとして、また標準偏差の値をエラーバーとして示している。実河川水に純水を加えた試料液についての明確なセンサー応答は得られなかったものの、センサー法とBOD5法の相関はきわめて良好であることがわかった（y＝0.922x-6.71、r＝0.998）。この結果は、本発明のセンサーを用いて実淡水の測定ができる可能性を示唆している。
【００４３】
実施例１０
実施例９において、実試料液として海水が用いられ、検量線の作成試料液および測定試料液には純水の代わりに人工海水(2.65% NaCl, 0.326% MgCl2, 0.207% MgSO4, 0.136% CaSO4, 0.0714% KCl)が用いられた。実海水は東京都江東区お台場(平成18年8月31日18時30分、天候：晴、気温：27.1℃、湿度61.2%)から採水したものを使用した。現場において採水を調べたところ、水温25.4℃、pH8.0、溶存酸素7.58mg O2/l、CODMn 7.5mg O2/l、導電率29.6mS/cm、塩濃度3.28%であった。
【００４４】
得られた結果を図６に示す。図６には、同測定試料液についてBOD5法を用いて測定した結果と本発明のセンサーを用いて1回測定した結果を対応して示している。実施例９と同様に、センサー法とBOD5法の相関が得られることが示された（y＝1.24x-31.9、r＝0.989）。また、センサー法では、9:1の割合で実海水に人工海水を加えた試料液に対するセンサー応答はBOD5法と比べ高い応答を示した。一方、実海水に150mg O2/l GGAとなるように調製した試料液に対して得られたBOD5法の結果は、150mg O2/lよりも低い値を示したが、センサー法とBOD5法の相関は得られることがわかった。従って、実施例９と同様に本発明のセンサーを用いて実海水の測定ができる可能性が示唆された。
【００４５】
実施例１１
実施例９において、メナジオンを溶解させる溶媒としてジメチススルホキシド(DMSO)が用いられ、測定試料として純水が用いられた場合の電流値が測定された。得られた結果は、メナジオン溶媒としてエタノールを用いた場合とともに表１に示される。メナジオンを溶解させるための溶媒をエタノールからDMSOに変えることで、0ppmと220ppmに対するセンサー応答に、より大きな差を得ることが示され、DMSOの使用により、エタノールと比べ、ベースラインが低く、より正確なセンサー応答を得ることが出来ることが示された。
【００４６】
実施例１２
実施例１と同様に酵母の培養・洗浄が行われ、最終菌体濃度がOD600=75.7となるように0.9%生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて酵母液を調製した。また、センサーとしては実施例２で用いられたセンサーが、チップの下に微小な撹拌機(アズワン社製、セルスターCC-303)を配置させた上で用いられた。
【００４７】
センサーチップ内に、混合試薬液として純水305μl、0.05%(w/v)Triton-X 100を5μl、pH 7.0の100mMPB緩衝液50μl、純水に溶解した0.4Mフェリシアン化カリウム50μl、DMSOに溶解した20mMメナジオン5μlおよび2200mg O2/l GGA標準液35μlを撹拌石による撹拌で混合し、最後に反応の開始剤として、上記酵母液50μlを混合液の中へ加え、チップ内の反応液の体積を500μlとした。撹拌条件下で反応を正確に10分間行い、電気化学測定器(CHI-1202)を使用したクロノアンペロメトリー法により電位を0.9Vに設定し、反応時と同じ撹拌条件下で電流値の測定が行われた。測定は各標準溶液につき3回行われた。
【００４８】
実施例１３
実施例12において、またPBの代わりにpH7.0の10倍PBSが同量用いられた。
【００４９】
以上の実施例12〜13で得られた結果は表２に示される。この表に示されるように、PBSと比べ、塩ストレスの少ないPBのほうがGGAに対して高い応答が得られた。
【００５０】
実施例１４
実施例12において、純水量が40μlに、フェリシアン化カリウムとしてpH 7.0の10mMPB緩衝液に溶解した0.4Mフェリシアン化カリウム同量が、GGA標準液として濃度が0、5.5、11、22、55、110または220mg O2/lのもの350μlが、また酵母液としてOD600=71.8のものにそれぞれ変更されて用いられて測定が行われた。
【００５１】
以上の実施例14で得られた結果は図７に示される。この図に示されるように、GGA標準液の濃度の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、電極応答値により測定できることが示された。ここで、各標準溶液を3回測定して得た検出の上限は220mg O2/l GGA、下限は5.5mg O2/l GGA、変動係数(CV値)は0.86％(0mg O2/l GGA)、0.48％(5.5mg O2/l GGA)、2.22％(11mg O2/l GGA)、0.52％(22mg O2/l GGA)、2.70％(55mg O2/l GGA)、2.00％(110mg O2/l GGA)、0.72％(220mg O2/l GGA)であり、その平均値は1.36%、相関係数はr＝0.995であった。以上より、GGAに対しては極めて広い範囲で正の相関を示す応答が得られることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例で用いられたセンサーチップの正面図である。
【図２】実施例で用いられたセンサーチップの構成を示す図である。
【図３】メナジオンの有無による応答性を示すグラフである。
【図４】各LB培地濃度に対する応答性を示すグラフである。
【図５】GGA標準液を添加して調製した実河川水を使用し、センサー法およびBOD5法で測定した結果を対応させて示す図である。
【図６】人工海水で調製したGGA標準液を添加して調製した実海水を使用し、センサー法およびBOD5法で測定した結果を対応させて示す図である。
【図７】GGA標準液による応答性を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５３】
１ センサーチップ
２ 反応槽
３ 電極
４ 端子
１０ 底部絶縁性基板
１１ 支持部
１２ 下部スペーサー
１３ スペース
１４ 上部絶縁性基板
１５ 導電体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、BODの測定法に関する。更に詳しくは、真核微生物を用いたBODの測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
河川や産業排水の水質管理に重要な項目として、BOD(生物化学的酸素要求量)があり、国際的な有機性水質汚濁の指標とされている。有機化合物に起因する水質汚濁は、好気性微生物による酸化反応で減少、消去され、その有機物質濃度に対応して溶存酸素が消費されるため、この消費された酸素量を計測することで、水質汚濁が明らかになるのである。したがって、BODは有機化合物濃度を酸素量により間接的に表したものである。
【０００３】
BOD測定法としては、種々の方法が提案されている。例えば特許文献１には、トリコスポロン属の酵母を溶存酸素電極の表面に固定して、酵母が河川や排水中に含まれる有機汚濁物質を資化することで消費された溶存酸素の濃度を酸素電極で測定する方法が提案されている。この方法によれば、河川や排水中に含まれるさまざまな有機物質の総量を有機汚濁物質としてまとめて測定ができる特徴があるものの、測定溶液中にごく僅かしか溶存しない酸素の濃度を高感度に測定する必要があることから、測定システムが必然的に大きくなってしまうなどの問題点があり、試験室や工場などの屋内に限らず、現場での計測も必要となるBODの測定には向かない場合があった。また測定システム上、溶存酸素の非常に低い廃液にあっては正確な値を測定することが難しいという限界もあった。
【特許文献１】特公昭６１−７２５８号公報
【０００４】
かかる問題に対して、溶存酸素量が低い場合にあってもBODの正確な測定を可能とするメディエーターを用いたBOD測定法が開発された。かかる測定法は、溶存酸素に比べて液体中の溶解濃度が高い電子の濃度を指標とした電気化学(電極)測定型であり、BODの正確な測定および測定装置の小型化を可能とするといった画期的なものであった。
【特許文献２】特開平０７−１６７８２４号公報
【０００５】
しかるに、かかる測定法は微生物が有機物質を代謝することによる電子伝達系の電子の移動を検知するものであるため、呼吸鎖の電子伝達がミトコンドリア内で行われる真核微生物を用いた場合には、測定感度に乏しいとされ、原核微生物を利用した測定法が数多く提案されているにとどまるのが現状である。しかしながら、原核微生物は培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題があり、種々の測定法に応用し、実用化する場合の障壁となっており、真核微生物を用いたメディエーター型のBOD測定法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、真核微生物を用いて感度良くBODを測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる本発明の目的は、真核微生物により有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、有機物質を含有する溶液中の有機物質量を検出または定量するBODの測定法において、真核微生物が有機物質を代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型の親水性メディエーターを電極により検出または定量するBODの測定法によって達成される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題がある原核微生物を用いることなくBODを測定することができるとともに、その測定感度に関しても、従来提案されていた真核微生物を用いたBOD測定法と比較して、1〜350μlといった少量の試料を用いた場合であっても、数倍程度高感度となるといったすぐれた効果を奏する。さらに、脂溶性メディエーターをジメチルスルホキシドに溶解されて用いた場合には、測定感度の向上およびバックの減少を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
真核微生物としては、有機物質を代謝することにより電子伝達系に電子の移動が起こるものであればよく、従来技術により分離・培養可能な微生物であれば特に制限なく用いることができ、取扱い容易といった観点からは、酵母、例えばSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneum、Trichosporon fermentans、Trichosporon brassicae、Candida属、Aspergillus属などが挙げられ、好ましくはパン酵母として周知のSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneumなどが用いられる。Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セルビジエ)は、市販品をそのまま用いることができる。ここで、使用する微生物は生菌の状態、好ましくは対数増殖期の状態で用いることもできるし、実用性を考慮し、何らかの方法により保存が可能な形態、例えば死菌などの状態で用いることもできる。生菌を用いる場合、反応時における菌体の濃度は、OD600＝0.1以上、好ましくは0.5〜20程度、さらに好ましくは1.5〜5程度で用いられる。
【００１０】
酸化型の脂溶性メディエーターとしては、メナジオン(2-メチル-1,4-ナフトキノン)、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、ユビキノン、ハイドロキノン、2,6-ジクロロベンゾキノン、2-メチルベンゾキノン、2,5-ジヒドロキシベンゾキノン、2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンなどのキノン類、2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミン、N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンなどのベンゾアミン類が用いられ、好ましくはメナジオン、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミン、N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンが用いられる。ここで脂溶性メディエーターは、好ましくはジメチルスルホキシドに溶解される。メナジオンをDMSOに溶解して用いる場合には、反応液中のメナジオン濃度が20〜1000μM、好ましくは100〜400μMとなるように用いられる。メナジオンが、これ以上の濃度で用いられると、電極の再利用が困難になり、一方これ以下の濃度で用いられると有機物に対する応答が低下する。また、DMSOは反応液中に3％以下、好ましくは1％以下となるように用いられる。DMSOがこれ以上の割合で反応液中に添加されると、センサー応答値が低くなるため好ましくない。
【００１１】
酸化型の親水性メディエーターとしては、リボフラビン、L-アスコルビン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド、ニコチンアデニンジヌクレオチド、ルミクロム、グルタチオン、パーオキシダーゼ、チトクロムC、フェレドキシン等の生体酸化還元物質またはその誘導体、ヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウム、カルボキシメチル化フェロセン、DCIP、1-M-PMS、9-ジメチルアミノベンゾ-α-フェナゾキソニウムクロライド、Fe-EDTA、Mn-EDTA、Zn-EDTA、メソスルフェート、メチルビオローゲン、デュロヒドロキノン、フェロセンカルボン酸、フェナジンメトスルフェートなどが用いられ、好ましくはヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウム、カルボキシメチル化フェロセン、DCIP、1-M-PMS、9-ジメチルアミノベンゾ-α-フェナゾキソニウムクロライドが、さらに好ましくはヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウム、カルボキシメチル化フェロセンが用いられる。
【００１２】
酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターとは、還元型となった脂溶性メディエーターによって酸化型の親水性メディエーターから還元型の親水性メディエーターが生成されるような組合せで用いられ、これらの濃度は、一般にそれぞれ40nM以上、好ましくは50nM〜500mM、さらに好ましくは100nM〜50mM程度で用いられる。このように酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを組み合わせて用いることにより、1〜350μlといった少量の試料を用いてのBODの測定が可能となるといった優れた効果を奏する。
【００１３】
以上の真核微生物およびメディエーターに加えて、本発明方法においてはスーパーオキシドジスムターゼ(EC 1.15.1.1)を用いることが好ましい。スーパーオキシドジスムターゼは、超酸化物不均化酵素ともよばれ、スーパーオキシドアニオンラジカルの不均化反応を触媒する働きを有するため、酸素ラジカルから酸素および過酸化水素を生成し、本方法での測定感度をアップさせることができる。
【００１４】
BODの測定は、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターの存在下、好ましくはさらにスーパーオキシドジスムターゼの存在下において、真核微生物により溶液中の有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより行われる。ここで、有機物質の代謝中における菌体の活性を良好に保つため、反応層内には少なくとも10mM程度以上のリン酸イオンが含まれることが望ましい。これは、10mMリン酸緩衝液(phosphate buffer; PBは Na2HPO4・12H2O 3.58gまたはNaH2PO4・2H2O 1.56gをそれぞれ純水に溶解して、各溶液を1lとし、両者を混ぜ合わせてpH 7.0に調整し、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したもの、あるいは1倍のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffer saline；PBSはNaCl 8g、Na2HPO4・12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2gを純水に溶解してpH 7.0に調整した後、全量を純水で1lとし、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したものなど、好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。ここで、10mM程度のリン酸イオンが含まれることで、試料液のpHの影響を緩衝する作用も奏する。また、後述するBODセンサーを利用する場合、これを再利用するといった観点からは、反応液中に界面活性剤、例えばTriton-Xが、反応液中好ましくは0.00001〜0.1％、さらに好ましくは0.0001〜0.01％程度添加される。これにより、測定回数が増すにつれてセンサーの応答値が大きく減少するといった不具合を解消することができる。
【００１５】
代謝活性は、溶液中に生成する還元型の親水性メディエーターを、少なくとも作用極および対極を有する電極を溶液中に浸漬した後、作用極および対極との間に電位差を負荷した際に両電極間に流れる電流を測定することによって算出される。
【００１６】
測定に際しては、予め電極上に真核微生物、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーター、好ましくはさらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させておき、これに有機物質を含有する溶液を添加することにより、有機物質量の測定を可能とするBODセンサーを用いることもできる。かかるセンサーとしては、例えば基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極を設け、作用極上および／またはその付近に真核微生物、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーター、好ましくはさらにスーパーオキシドジスムターゼを配したセンサーなどが挙げられる。このようなセンサーとしては、例えばセラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリエステル等)などの絶縁性基板にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等から形成された各電極が形成され、作用極上および／またはその付近に架橋法、共有結合法、イオン結合法等により微生物等を固定したものなどが用いられる。
【００１７】
このようなセンサーとして、好ましくは底部絶縁性基板上にスペーサーを介して、底部絶縁性基板側の表面に少なくとも作用極および対極の２電極を設けた上部絶縁性基板を配し、さらに好ましくは作用極上および／またはその周辺部にメディエーター層または微生物−メディエーター混合物層を配したものが用いられる。かかるセンサーは、一般的なセンサーとは異なり、試料液面と接するようにあるいは試料液中に浸漬するように電極が存在しているため、試料液中に存在する粒子状物質、例えば砂利などが電極表面に堆積することによる測定値への影響を排除しうるといった効果を奏する。さらに、センサーの反応層内に撹拌石を入れ、センサー下方に撹拌システムを設けることで、反応溶液を連続的に撹拌することができるため、反応効率の向上及び繰り返し再現性の向上が期待できる。また、測定時に撹拌を止めることで、正確な電気化学測定ができる。
【００１８】
電流値の測定は、有機物質を含有する溶液と微生物等を反応させた後、正確に0〜60分まで、好ましくは0.5〜30.5分までの経時的な電流値の変化を、例えば北斗電工社製品SHV−100、BAS社製品CHI-1202などの電気化学アナライザーを使用し、電気化学測定法、例えばクロノアンペロメトリー法などを用いて、電極間に負荷した電位に対する生成した還元型メディエーターによる応答を確認することにより行われる。電極間に負荷する電位は、特に限定されないが、生成される過酸化水素も併せて測定することを目的とする場合には、0.7〜1.1V、好ましくは0.8〜1.0Vが選択される。
【００１９】
電極端子は、測定装置に接続され、電極間に生じた電気的な値を測定する。この測定装置には、電極における電気的な値を計測する計測部と、計測された値を表示する表示部が備えられる。この計測部における計測方法としては、上述した如くクロノアンペロメトリー法などを用いることができる。
【００２０】
また、この装置には計測値を保存するためのメモリーを備えることもできる。さらに、測定値を遠隔的に管理する場合には、計測部に計測データを送信する無線手段、好ましくは非接触型ICカードまたは短距離無線通信(例えば、ブルートゥース；登録商標)などの無線手段を搭載することもできる。
【実施例】
【００２１】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００２２】
実施例１
凍結乾燥されたパン酵母菌体(日清製粉製品)をスパーテルで極少量取り、18mm径×180mmの試験管に入れたYPD液体培地(酵母エキス10g、ポリペプトン20g、グルコース20gを純水に溶解して全量を1,000mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)2mlに接種し、シリコ栓で蓋をして28℃、180rpm、好気条件下で18時間振とう培養を行った。次いで、YPD寒天培地(酵母エキス2g、ポリペプトン4g、グルコース4g、寒天4gを純水に溶解して全量を200mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)を、クリーンベンチ内でシャーレに約20mlずつ入れ、恒温器(アーンスト・ハンセン商会製品BARNSTEAD/THERMOLYNE LAB-LINE 120-5JPN)内で乾燥させたものに、乾燥酵母から培養を行った酵母液を白金耳で網目模様に接種し、28℃で二晩前培養を行った。
【００２３】
YPD寒天培地上のコロニーから菌体を白金耳でYPD液体培地2mlに接種し、28℃、180rpm、好気条件下で13〜14時間振とう培養を行い、さらに500ml容量の坂口フラスコ中で、YPD液体培地50mlに最終濃度が0.5％となるよう前培養液を接種し、シリコ栓で蓋をして、28℃、120rpm、好気条件下で9〜10時間本培養を行った。細胞の増殖相は、対数増殖期(OD600=0.9以上)に達していた。
【００２４】
本培養液全量を遠沈管に移した後、4℃、3000rpmの条件下で3分間の遠心分離を行い、集菌を行った。集菌後、0.9%生理食塩水で3回洗浄を行った後、ペレット状の酵母を25mlの0.9%生理食塩水で懸濁し、50ml遠沈管内で2時間エアレーションを行い、再び洗浄操作を三回繰り返した。洗浄後、最終菌体濃度がOD600=15〜75.7となるように0.9%生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて菌体懸濁液(酵母液)を調製した。
【００２５】
センサーチップ内に、調製されたOD600=15の酵母液30μl、フェリシアン化カリウム(和光純薬工業製品)158mgをpH7.0のPBS緩衝液2mlに溶解した0.24Mフェリシアン化カリウム50μl、LB培地(酵母エキス0.25g、ポリペプトン0.5g、NaCl 0.25gを純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でpH7.0に調整した後、全量を純水で50mlにして、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)60μlおよびメナジオン(MP Biomedicals社製品)3.5mgを純水40μlおよびエタノール960μlの混合溶液(96%エタノール)に溶解した20mMメナジオン1.5μlに反応液総量が300μlとなるようにPBS緩衝液を加えてピペットマンを用いて十分に撹拌後、電位を0.9Vに設定し、0.5分後、5.5分後、15.5分後および30.5分後における電流値の測定が北斗電工社製品SHV−100を用いて行われた。
【００２６】
ここで、センサーとしては、図１に示される形状の外寸法40×18×4.5mm、反応槽寸法10×12.5×4.5mm(反応槽内容積562.5mm3)であるセンサーチップが用いられた。具体的には、厚さ188μmの透明なポリエチレンチレフタレートを、図２ I)に示されるような35mm×18mmの本体および16mm×6.0mmの支持部１１となるように打ち抜き、底部絶縁性基板１０を作製した。この底部絶縁性基板上に、II)に示されるように厚さ1mmで10mm×12.5mmのスペース１３を有する、底部絶縁性基板と同一外形の下部スペーサー１２をアクリル系接着剤(日東製品 No.5000N)を用いて接着した。下部スペーサー上には、厚さ25μmの接着剤層が設けられ、上部絶縁性基板１４をさらに接着した。この上部絶縁性基板は、底部絶縁性基板と同じ厚さの同素材を用い、III)に示されるように、40mm×18mmの本体、21mm×6.0mmの支持部１１および3mmの間隔を空けて8mm×3mmのくし状基板部を有する10mm×12.5mmのスペース１３を形成したものであり、この底部絶縁性基板側の表面上には、2本のくし状基板部分に、7.5mm×2mmの導電体１５ 2本を、また支持部においては、21mm×2.6mmの2本の導電体１５を0.6mmの間隔を空けて、厚さ10μmのカーボンインクをスクリーン印刷法により形成した。上部絶縁性基板上には、下部スペーサーと同一素材で同一形状の上部スペーサー 3枚を接着剤を用いて貼り合わせた。このようにして作製されたバイオセンサの反応スペース内容積は、上述の如く約560mm3であった。
【００２７】
比較例１
実施例１において、メナジオンが用いられなかった。
【００２８】
比較例２
実施例１において、フェリシアン化カリウムが用いられなかった。
【００２９】
以上の実施例１および比較例１〜２で得られた結果は、図１に示される。図１に示されるように、メディエーターとしてフェリシアン化カリウムを単独で用いた場合には、LB培地中に含まれる有機物質を代謝することによる代謝活性を経時的な変化として確認することができないものの、フェリシアン化カリウムとともにメナジオンが用いられた場合には、反応時間が経過するに従って、応答値が高くなることが示され、LB培地中に含まれる有機物質を代謝することによる代謝活性を経時的な変化として確認することが可能であった。
【００３０】
実施例２
センサーチップ内に、調製されたOD600=15の酵母液50μl、0.05% Triton-X 100 10μl、0.24Mフェリシアン化カリウム83μl、LB培地100μlおよびエタノールに溶解した20mMメナジオン2.5μlに反応液総量が500μlとなるようにPBS緩衝液を加えてピペットマンを用いて十分に撹拌後、0.5分後、5.5分後、15.5分後および30.5分後における電流値の測定が実施例１と同様に行われた。なお、センサーとしては実施例１で用いられたセンサーにおいて、下部スペーサーを３枚に、また上部スペーサーを１枚に変更したものが用いられた。
【００３１】
実施例３
実施例２において、LB培地として純水を用いて7/10濃度としたものが同量用いられた。
【００３２】
実施例４
実施例２において、LB培地として純水を用いて4/10濃度としたものが同量用いられた。
【００３３】
実施例５
実施例２において、LB培地として純水を用いて1/10濃度としたものが同量用いられた。
【００３４】
実施例６
実施例２において、LB培地として純水を用いて1/20濃度としたものが同量用いられた。
【００３５】
実施例７
実施例２において、LB培地が用いられなかった。
【００３６】
実施例８
実施例２において、さらにSuperoxide Dismutase Solution(和光純薬工業製品)4500UをPBS緩衝液450μlに溶解したSOD溶液5μlが用いられた。
【００３７】
以上の実施例２〜８で得られた結果は、図２に示される。図２に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、応答値(出力電流値)により測定できることが示された。また、さらにSuperoxide Dismutaseを用いることで、応答値を大幅に増強できることが示された。
【００３８】
実施例９
実施例１と同様に酵母の培養・洗浄が行われ、最終菌体濃度がOD600=45となるように0.9%生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて酵母液を調製した。また、センサーとしては実施例２で用いられたセンサーが、チップの下に微小な撹拌機(アズワン社製、セルスターCC-303)を配置させた上で用いられた。
【００３９】
センサーチップ内に、調製された酵母液25μl、10倍PBS緩衝液で調製した0.48Mフェリシアン化カリウム41.5μl、測定試料液350μl、0.05%(w/v)Triton-X 100 5μl、エタノールに溶解した20mMメナジオン5μl、純水48.5μlを混合した混合液500μlを加え、撹拌石による撹拌を15分間行い、電気化学測定器(BAS社製、CHI-1202)を使用したクロノアンペロメトリー法により電位を0.9Vに設定し、電流値の測定が行われた。測定は各標準溶液につき３回行った。
【００４０】
測定試料として、実河川水が用いられた。実河川水は、東京都八王子市を流れる湯殿川（東橋、平成18年8月30日9時40分、天候：曇、気温：29.5℃、湿度81.1%）から採水したものを使用した。現場において採水を調べたところ、水温24.8℃、pH7.2、溶存酸素8.8mg O2/l、CODMn 6mg O2/l、導電率0.24mS/cm、塩濃度0%であり、実河川水のCODMn値が極めて低いことから、測定試料液としては、実河川水とGGA標準溶液を9:1の割合で混合したものが用いられた。GGA標準溶液としては、1,500mg O2/l GGA溶液、750mg O2/l GGA溶液および0mg O2/l GGA溶液(純水)の３種類を使用した。測定は各試料液について３回ずつ行われた。
【００４１】
得られた電流値について、同センサーを用いて予め作成された検量線に基づきBODの算出が行われた。ここで、検量線の作成試料液としてはグルコース15.0mg、グルタミン酸15.0mgを純水10.0mlに溶解し、細孔が0.22μmのメンブランフィルターにより滅菌した、BOD値が2,200mg O2/lを示すグルコース・グルタミン酸(GGA)標準溶液を純水で10倍に希釈して調製した220mg O2/l標準溶液および、GGAを含まない0mg O2/l標準溶液が用いられた。
【００４２】
算出結果を、図５に示す。図５には、同測定試料液についてBOD5法(JIS K 0102準拠)を用いて測定した結果と本発明のセンサーを用いて3回測定した結果を対応させて、センサー応答値の平均値をプロットとして、また標準偏差の値をエラーバーとして示している。実河川水に純水を加えた試料液についての明確なセンサー応答は得られなかったものの、センサー法とBOD5法の相関はきわめて良好であることがわかった（y＝0.922x-6.71、r＝0.998）。この結果は、本発明のセンサーを用いて実淡水の測定ができる可能性を示唆している。
【００４３】
実施例１０
実施例９において、実試料液として海水が用いられ、検量線の作成試料液および測定試料液には純水の代わりに人工海水(2.65% NaCl, 0.326% MgCl2, 0.207% MgSO4, 0.136% CaSO4, 0.0714% KCl)が用いられた。実海水は東京都江東区お台場(平成18年8月31日18時30分、天候：晴、気温：27.1℃、湿度61.2%)から採水したものを使用した。現場において採水を調べたところ、水温25.4℃、pH8.0、溶存酸素7.58mg O2/l、CODMn 7.5mg O2/l、導電率29.6mS/cm、塩濃度3.28%であった。
【００４４】
得られた結果を図６に示す。図６には、同測定試料液についてBOD5法を用いて測定した結果と本発明のセンサーを用いて1回測定した結果を対応して示している。実施例９と同様に、センサー法とBOD5法の相関が得られることが示された（y＝1.24x-31.9、r＝0.989）。また、センサー法では、9:1の割合で実海水に人工海水を加えた試料液に対するセンサー応答はBOD5法と比べ高い応答を示した。一方、実海水に150mg O2/l GGAとなるように調製した試料液に対して得られたBOD5法の結果は、150mg O2/lよりも低い値を示したが、センサー法とBOD5法の相関は得られることがわかった。従って、実施例９と同様に本発明のセンサーを用いて実海水の測定ができる可能性が示唆された。
【００４５】
実施例１１
実施例９において、メナジオンを溶解させる溶媒としてジメチススルホキシド(DMSO)が用いられ、測定試料として純水が用いられた場合の電流値が測定された。得られた結果は、メナジオン溶媒としてエタノールを用いた場合とともに表１に示される。メナジオンを溶解させるための溶媒をエタノールからDMSOに変えることで、0ppmと220ppmに対するセンサー応答に、より大きな差を得ることが示され、DMSOの使用により、エタノールと比べ、ベースラインが低く、より正確なセンサー応答を得ることが出来ることが示された。
【００４６】
実施例１２
実施例１と同様に酵母の培養・洗浄が行われ、最終菌体濃度がOD600=75.7となるように0.9%生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて酵母液を調製した。また、センサーとしては実施例２で用いられたセンサーが、チップの下に微小な撹拌機(アズワン社製、セルスターCC-303)を配置させた上で用いられた。
【００４７】
センサーチップ内に、混合試薬液として純水305μl、0.05%(w/v)Triton-X 100を5μl、pH 7.0の100mMPB緩衝液50μl、純水に溶解した0.4Mフェリシアン化カリウム50μl、DMSOに溶解した20mMメナジオン5μlおよび2200mg O2/l GGA標準液35μlを撹拌石による撹拌で混合し、最後に反応の開始剤として、上記酵母液50μlを混合液の中へ加え、チップ内の反応液の体積を500μlとした。撹拌条件下で反応を正確に10分間行い、電気化学測定器(CHI-1202)を使用したクロノアンペロメトリー法により電位を0.9Vに設定し、反応時と同じ撹拌条件下で電流値の測定が行われた。測定は各標準溶液につき3回行われた。
【００４８】
実施例１３
実施例12において、またPBの代わりにpH7.0の10倍PBSが同量用いられた。
【００４９】
以上の実施例12〜13で得られた結果は表２に示される。この表に示されるように、PBSと比べ、塩ストレスの少ないPBのほうがGGAに対して高い応答が得られた。
【００５０】
実施例１４
実施例12において、純水量が40μlに、フェリシアン化カリウムとしてpH 7.0の10mMPB緩衝液に溶解した0.4Mフェリシアン化カリウム同量が、GGA標準液として濃度が0、5.5、11、22、55、110または220mg O2/lのもの350μlが、また酵母液としてOD600=71.8のものにそれぞれ変更されて用いられて測定が行われた。
【００５１】
以上の実施例14で得られた結果は図７に示される。この図に示されるように、GGA標準液の濃度の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、電極応答値により測定できることが示された。ここで、各標準溶液を3回測定して得た検出の上限は220mg O2/l GGA、下限は5.5mg O2/l GGA、変動係数(CV値)は0.86％(0mg O2/l GGA)、0.48％(5.5mg O2/l GGA)、2.22％(11mg O2/l GGA)、0.52％(22mg O2/l GGA)、2.70％(55mg O2/l GGA)、2.00％(110mg O2/l GGA)、0.72％(220mg O2/l GGA)であり、その平均値は1.36%、相関係数はr＝0.995であった。以上より、GGAに対しては極めて広い範囲で正の相関を示す応答が得られることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例で用いられたセンサーチップの正面図である。
【図２】実施例で用いられたセンサーチップの構成を示す図である。
【図３】メナジオンの有無による応答性を示すグラフである。
【図４】各LB培地濃度に対する応答性を示すグラフである。
【図５】GGA標準液を添加して調製した実河川水を使用し、センサー法およびBOD5法で測定した結果を対応させて示す図である。
【図６】人工海水で調製したGGA標準液を添加して調製した実海水を使用し、センサー法およびBOD5法で測定した結果を対応させて示す図である。
【図７】GGA標準液による応答性を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５３】
１ センサーチップ
２ 反応槽
３ 電極
４ 端子
１０ 底部絶縁性基板
１１ 支持部
１２ 下部スペーサー
１３ スペース
１４ 上部絶縁性基板
１５ 導電体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核微生物により有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、有機物質を含有する溶液中の有機物質量を検出または定量するBODの測定法において、
真核微生物が有機物質を代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型の親水性メディエーターを電極により検出または定量することを特徴とするBODの測定法。
【請求項２】
真核微生物の有機物質の代謝が、10mM以上のリン酸イオン存在下で行われる請求項１記載のBODの測定法。
【請求項３】
酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターに加えて、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させることを特徴とする請求項１記載のBODの測定法。
【請求項４】
真核微生物が酵母である請求項１記載のBODの測定法。
【請求項５】
脂溶性メディエーターがジメチルスルホキシドに溶解されて用いられる請求項１記載のBODの測定法。
【請求項６】
酸化型の脂溶性メディエーターが、キノン類またはベンゾアミン類である請求項１記載のBODの測定法。
【請求項７】
キノン類が、2-メチル-1,4-ナフトキノン、ベンゾキノンまたは1,2-ナフトキノンである請求項６記載のBODの測定法。
【請求項８】
ベンゾアミン類が、2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミンまたはN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンである請求項６記載のBODの測定法。
【請求項９】
酸化型の親水性メディエーターが、ヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウムまたはカルボキシメチル化フェロセンである請求項１記載のBODの測定法。
【請求項１０】
電極上に、真核微生物、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、これに有機物質を含有する溶液を添加することにより、有機物質の検出または定量が行われるBODセンサー。
【請求項１１】
電極上に、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させた請求項１０記載のBODセンサー。
【請求項１２】
底部絶縁性基板上にスペーサーを介して、底部絶縁性基板側の表面に少なくとも作用極および対極の２電極を設けた上部絶縁性基板を配してなる請求項１０または１１記載のBODセンサー。
【請求項１】
真核微生物により有機物質を代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、有機物質を含有する溶液中の有機物質量を検出または定量するBODの測定法において、
真核微生物が有機物質を代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型の親水性メディエーターを電極により検出または定量することを特徴とするBODの測定法。
【請求項２】
真核微生物の有機物質の代謝が、10mM以上のリン酸イオン存在下で行われる請求項１記載のBODの測定法。
【請求項３】
酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターに加えて、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させることを特徴とする請求項１記載のBODの測定法。
【請求項４】
真核微生物が酵母である請求項１記載のBODの測定法。
【請求項５】
脂溶性メディエーターがジメチルスルホキシドに溶解されて用いられる請求項１記載のBODの測定法。
【請求項６】
酸化型の脂溶性メディエーターが、キノン類またはベンゾアミン類である請求項１記載のBODの測定法。
【請求項７】
キノン類が、2-メチル-1,4-ナフトキノン、ベンゾキノンまたは1,2-ナフトキノンである請求項６記載のBODの測定法。
【請求項８】
ベンゾアミン類が、2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミンまたはN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンである請求項６記載のBODの測定法。
【請求項９】
酸化型の親水性メディエーターが、ヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウムまたはカルボキシメチル化フェロセンである請求項１記載のBODの測定法。
【請求項１０】
電極上に、真核微生物、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、これに有機物質を含有する溶液を添加することにより、有機物質の検出または定量が行われるBODセンサー。
【請求項１１】
電極上に、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させた請求項１０記載のBODセンサー。
【請求項１２】
底部絶縁性基板上にスペーサーを介して、底部絶縁性基板側の表面に少なくとも作用極および対極の２電極を設けた上部絶縁性基板を配してなる請求項１０または１１記載のBODセンサー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−９６４１５（Ｐ２００８−９６４１５Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１０４９（Ｐ２００７−２１０４９）
【出願日】平成１９年１月３１日（２００７．１．３１）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月３１日（２００７．１．３１）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]