Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼに関するアッセイ
本発明は、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性を検出するための細胞に基づくアッセイ、およびＣＭＴ活性の調節に有効な薬剤に関するスクリーニングアッセイを提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はタンパク質修飾、特にグリコシル化タンパク質、および特定のグリコシル化形態であるＣ−マンノシル化を触媒する酵素に関する。
【０００２】
［背景技術］
グリコシル化は最も多く、広範囲にわたるタンパク質修飾の一つであり、種々の生体内プロセスにおいて重要な役割を果たすという認識がますます高まっている。最近の例としてはＯ−フコシル化によるNotchシグナル伝達(Moloney, D.J. et al., 2000, Nature, 406: 369-375; Brueckner, K. et al., 2000, Nature, 406: 411-415)、およびタンパク質折りたたみの質的制御におけるグルコシル化の機能(Ellgaard, L. & Helenius, A., 2001, Curr. Opin. Cell Biol., 13: 431-437)がある。その結果、現在では、複合糖質代謝の欠陥がヒトにおいて種々の病態と関連していることが分かっている。例えば、ＩＩ型白血球接着不全症はＧＤＰ−フコース輸送における分子欠陥によって引き起こされることが示されている(Luhn, K. et al., 2001, Nat. Genet., 28: 69-72)。
【０００３】
タンパク質のグリコシル化のうち最もよく研究されている形態であるＮ−およびＯ−グリコシル化は、約４０年来知られている。これらの場合、グリカンはそれぞれアミノ酸側鎖のアミド基またはヒドロキシル基を介してタンパク質と結合している。グリコシラーゼに関するin vitroアッセイが文献に記載されている(EP 0272603、EP 1260591、Hendershot et al., 2002, Analytical Biochemistry 307: 273-279参照)。
【０００４】
Hofsteengeおよび共同研究者は、ヒトＲＮアーゼ２においてα−マンノピラノシル残基と、トリプトファンのＣ−２原子との結合を含む新規なタンパク質−炭水化物結合を報告している(Hofsteenge, J. et al., 1994, Biochemistry, 33: 13524-13530; de Beer, T. et al., 1995, Biochemistry, 34: 11785-11789)。この複合糖質は典型的なＮ−またはＯ−グリコシド結合を含まず、Ｃ−Ｃ結合を含む。この修飾反応はミクロソームのＣ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）により触媒され、このＣ−マンノシルトランスフェラーゼは糖供与体としてドリコールリン酸マンノース（ＤＰＭ）を用い、タンパク質アクセプターのＴｒｐ−ｘ−ｘ−Ｔｒｐ（ＷＸＸＷ）配列を認識する(Doucey, M.-A. et al., 1998, Mol. Biol. Cell, 9: 291-300; Krieg, J. et al., 1998, Mol. Biol. Cell, 9: 301-309)。
【０００５】
現在、種々の機能を果たす１１の異なるタンパク質に由来する４９のＣ−マンノシル化トリプトファンが確認されている（総説としてはFurmanek, A. & Hofsteenge, J., 2000, Acta Biochim. Pol., 47: 781-789参照）。これらのうち、ヒトプロパージンは、その２０のトリプトファンのうち１５がＣ−マンノシル化されていることから特殊な位置にある(Hartmann, S. & Hofsteenge, J., 2000, J. Biol. Chem., 275: 28569-28574)。プロパージンは血漿に存在する５０ｋＤａのタンパク質であり、微生物に対する宿主の第一線の防御である補体系の正のレギュレーターである。その３つの活性化経路は、Ｃ３からＣ３ｂへの変換をもたらす工程に収束するタンパク質分解カスケードからなっている。代替経路のヘテロ二量体Ｃ３変換酵素、Ｃ３ｂＢｂの急速な不活性化は、プロパージンとの複合体の形成により妨げられる。産生されたＣ３ｂはさらなるＣ３ｂの形成に関与するので、プロパージンにより安定化される正のフィードバック ループが存在する。次に、後続反応が補体系の実際の分解成分である膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成をもたらす。この複合体は６つの異なるサブユニットからなり、そのうち５つはまた、複数のトリプトファン残基でＣ−マンノシル化もされている(Hofsteenge, J. et al., 1999, J. Biol. Chem., 274: 32786-32794)。
【０００６】
放射性標識したＤＰＭ、肝臓ミクロソーム、およびＣＭＴ認識部位（ＷＸＸＷ）を含有する合成ペプチドを用いたin vitro ＣＭＴアッセイが記載されている。クロロホルム／メタノールで反応生成物を抽出した後、水相においてＣ−マンノシル化ペプチドが放射性標識の存在によって検出される(Doucey, M.-A. et al., 1998)。このアッセイは有用ではあるが、アッセイの間およびその後の単離の間の両方のペプチドの安定性、正しい細胞コンパートメントへのペプチドの送達、分析のために修飾された材料が微量しか単離されない、また、細胞間または細胞種間による変動などの技術的な問題があって、全般的にアッセイの再現性に問題があることから、その適用は限られている。従って、ＣＭＴならびにその活性のモジュレーターの同定を可能とするハイスループット形式に従うアッセイ、特に細胞に基づくアッセイの必要がなおあり、本発明はその必要を満たすものである。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性をアッセイする方法であって、ｉ）好ましくは細胞内において、ＣＭＴおよびＣＭＴ基質を準備する工程（例えば、膜貫通ドメインとの融合タンパク質として）、ｉｉ）該ＣＭＴ基質に対する該ＣＭＴの作用によりＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の形成を誘導し得る条件を提供する工程、ｉｉｉ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を固定化する工程（例えば、細胞表面結合タンパク質としての発現によって）、およびｉｖ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を検出する工程を含む方法を提供する。これらの方法はＣＭＴ活性を調節する薬剤をスクリーニングするのに特に有用である。
【０００８】
よって、本発明のもう一つの局面では、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の調節において有効な薬剤を同定する方法を提供する。その方法は、ｉ）ＣＭＴを含む細胞を薬剤と接触させる工程、ｉｉ）ＣＭＴ活性を検出する工程、およびｉｉｉ）該薬剤が存在しない場合と比べ、薬剤により誘導されるＣＭＴ活性の調節を検出する工程を含む。ＣＭＴ活性の可能性のあるインヒビターならびにアクチベーターを、これらの方法を用いて同定することができる。
【０００９】
好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法は細胞に基づく方法であり、細胞において細胞表面結合ＣＭＴ基質が発現され、細胞表面において、例えばプロテアーゼにより切断した後に細胞表面から遊離した、前記基質のＣ−マンノシル化を検出する。本発明のこの局面では、Ｃ−マンノシル化基質は通常、融合タンパク質として存在する。このＣ−マンノシル化基質を、抗体、検出可能な標識またはタグなどの種々の手段を用いて検出することができる。
【００１０】
モジュレーターがＤＰＭ合成を調節することで望ましくない作用を持たないことを確認するため、より好ましい実施形態では、ＤＰＭ合成が影響を受けていないことを示すＧＰＩアンカータンパク質（例えば、ＣＤ５９）などの検出可能なマーカーが検出される。
【００１１】
これらのスクリーニング法によって同定された薬剤も提供される。
【００１２】
また、このような方法を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いて、とらえにくいＣＭＴ遺伝子を同定することもできる。このような核酸の存在下でＣ−マンノシル化基質が欠如していることは、ＣＭＴに特異的な阻害配列が存在することを示し、次にこれをデータベース検索およびＣＭＴ遺伝子の同定に用いることができる。
【００１３】
［発明の詳しい説明］
ＣＭＴ活性アッセイ
Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の同定は、その精製に多大な努力が費やされてきたにもかかわらず、依然として分かりにくいままである。本発明は、ＣＭＴの同定および特性決定の助けとなる、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を検出する高感度アッセイを提供し、また、その酵素活性を調節する薬剤をスクリーニングする手段を提供する。
【００１４】
その最も広い局面において、本発明は、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性をアッセイする方法であって、ｉ）ＣＭＴおよびＣＭＴ基質を準備する工程、ｉｉ）ＣＭＴ基質に対するＣＭＴの作用によりＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の形成を誘導し得る条件を提供する工程、ｉｉｉ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を固定化する工程、およびｉｖ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を検出する工程を含む方法を提供する。
【００１５】
昆虫、線虫、両生類、鳥類および哺乳類をはじめとする種々の細胞におけるＣＭＴ活性の発現が研究され、科学文献で考察されている。これらの細胞および組織供給源またはまだ発見されていない他のものはいずれも、ＣＭＴの供給源として用いられ得る。いくつかの目的では、ＣＭＴはしばしばＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの細胞系から得られる。
【００１６】
本発明の一つの局面では、ＣＭＴ活性は細胞抽出液の調製後in vitroでアッセイする。細胞抽出液の調製方法は当技術分野で周知である。（例えば、Scopes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition, Springer-Verlag, N.Y.参照）。また、肝臓ミクロソームも既報のようなＣＭＴの供給源として使用できる(Doucey, M.-A. et al., 1998)。あるいは、細胞抽出液は、単に細胞サンプルを溶解してＣＭＴを放出することにより、さらなるサンプル調製なく調製することも可能である。
【００１７】
ＣＭＴの起源にかかわらず、ＣＭＴサンプル（またはそのアリコート）を、ＣＭＴ基質を含む反応混合物中、その基質のＣ−マンノシル化を可能とする条件下でアッセイする。in vitroアッセイでは、これは３７℃にて生理的ｐＨのバッファー中で反応混合物をインキュベートすることを意味する。好ましくは、さらに以下に記載するように、ＣＭＴ基質とＣＭＴを含む細胞において反応を行う。各場合において選択された特定のＣＭＴ基質は、試験するＣＭＴ活性のタイプまたは起源、あるいは用いる検出方法のタイプによっても異なるが、通常には、コンセンサス配列ＷＸＸＷを含むペプチドまたはポリペプチドである。
【００１８】
ＣＭＴ基質を、固相（細胞表面を含む）または固相マトリックスへのＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の固定化を可能とするように設計する。このＣＭＴ基質を、酵素ＣＭＴがサンプル（または細胞）に存在する場合にＣ−マンノシル化が検出され得るように固相支持体に固定化する。固定化は検出が損なわれない限りいずれの様式で達成されてもよく、従って、ＣＭＴ基質の定方向結合が通常必要となる。このような定方向結合は、タンパク質末端と支持体上の反応基への特異的化学反応、タグと特異的に結合する受容体により捕捉され得るタンパク質の末端へのタグの結合（例えば、ＧＳＴ−抗体、ビオチン−ストレプトアビジン、ビオチン−アビジン、抗体−エピトープ相互作用が受容体−タグ対として使用できる）をはじめとする、当技術分野で既知の種々の方法によって達成することができ、あるいは例えば特異的抗体または化学反応を用い、Ｃ−マンノシル化部位を固定化のために使用することもできる。
【００１９】
固相支持体は例えば、マルチウェルプレート、ゲル、マトリックス、ビーズ、メンブランまたはチューブであってよく、限定されるものではないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリエチレン、ポリカーボネート、およびガラスをはじめとする種々の材料からなってよい。直径約１μｍ〜約５ｍｍのポリスチレンビーズ；例えばポリスチレンまたはポリ塩化ビニル製のプレートまたはマイクロタイタープレートのウェル；ガラスビーズ；磁気粒子；多糖類は、例えば抗体でコーティングできる表面の例である。当業者に周知のように他の固定様式も使用できるが、抗体は通常、水性媒体からの吸着により固相マトリックスへ固定される。固相表面にコーティングする抗体の量は、接触溶液中の抗体濃度を調整することにより変えることができる。好ましい実施形態では、固相支持体はリポソームまたは細胞によって提供されるような膜または表面であり得る。
【００２０】
よって、本発明の好ましい実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイとして行い、これに関しては細胞の表面で発現させるためのＣＭＴ基質を含む融合タンパク質中に膜貫通ドメインを含むのが有利である。従って、融合タンパク質の一部として発現されるこの膜貫通ドメインは、細胞表面に融合タンパク質を固定化する「タグ」として構想され得る。膜貫通ドメインは、コンピューターを用いたハイドロパシープロットによるなどして同定できる疎水性領域を含み、ペプチドの細胞膜への固定を可能とする。膜貫通ドメインはいずれの起源のものであってもよく、以下ではアミノペプチダーゼＮ膜貫通ドメインを用いて例示する。以下の実施例１は、ＣＭＴ活性アッセイにおいてＣ−マンノシル化されて膜結合ＣＭＴ基質を生じるＣＭＴ基質を発現する構築物を用いて本発明を例示するものである。
【００２１】
この構築物は、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現される、細胞質テールを含むＮ末端ドメイン、Ｎ末端からＣ末端の順にヒトアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）の膜貫通領域および主鎖領域の後に、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、トロンビン切断部位およびＣＭＴ基質、ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）、またはその複数コピーを有する融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、複数コピーのＣＭＴ基質の存在は、例えばリポーターが固定化され、検出される場合、またはアクチベーターが発見できるようにＣＭＴを基質で飽和させるのが望ましい場合に特に望ましい。当業者に明らかなように、この融合タンパク質のデザインのバリエーションは本発明の範囲内である。いくつかの実施形態では、細胞膜への固定が望まれない場合は、タンパク質を培地へ分泌させるシグナル配列をさらに含むポリペプチド発現カセットを使用することもできる。
【００２２】
もう１つの実施形態では、ＣＭＴ基質はリポーター分子と結合させることができる。リポーター分子（すなわち、シグナル生成分子）は検出可能な変化をもたらし得るいずれの分子であってもよい。このようなリポーター分子としては、蛍光部分（例えば、蛍光タンパク質または化学蛍光標識）、放射活性部分、リン光性部分、抗原、リポーター酵素などが挙げられる。好ましくは、リポーター分子は、その活性が検出可能な変化をもたらすリポーター酵素である。このようなリポーター酵素としては、β-ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼおよびウレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の方法の用いられるリポーター分子を選択する上では、リポーター分子が、サンプル中に存在するいずれかのプロテアーゼ活性による不活性化をはじめ、サンプル中のいずれの薬剤によっても不活性化を受けないことが不可欠である。適当なリポーター分子の選択は当業者ならば容易に明らかとなろう。
【００２４】
他の好ましい特性を有するタグ、リポーター、またはポリペプチドもしくはペプチドとＣＭＴ基質の結合は、（ｉ）ＣＭＴ基質がＣＭＴによって認識され、そして（ｉｉ）定方向固定化が損なわれない限り、当技術分野で既知のいずれかの手段（またはまだ発見されていない手段）によって達成することができる。従って、結合は化学反応により、融合タンパク質の合成の際にタグ（例えば、ビオチン）を組み込むことにより、または当技術分野で周知のように、例えば膜固定Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質の細胞外提示を可能とする組換え法を用いるなどの連続合成により達成することができる。
【００２５】
融合タンパク質は、最も一般には組換え手段によって生産され、ここで、この発現構築物は、例えば受動的インターナリゼーションによる、界面活性剤またはブドウ球菌アルファトキシンを用いるマイクロポレーションによる、リポソーム（例えば、市販のリポフェクタミン（商標）、リポフェクチン（商標）、リポフェクトエース（商標））の使用による、バイオリスティックを用いるリン酸カルシウムを介したインターナリゼーションによる、またはエレクトロポレーションによるなど、当技術分野で既知の方法を用いて目的の細胞へ導入することができる。標的ＤＮＡが細胞にインターナライズされた後、サンプルをインキュベートして基質の合成およびＣＭＴによるそのＣ−マンノシル化を可能とする。
【００２６】
従って、インキュベーション後、Ｃ−マンノシル化基質は細胞抽出液中か、培地中か（この場合、基質は分泌型である）、または細胞表面上かのいずれかに回収される。Ｃ−マンノシル化基質の検出は、基質を固相支持体へ固定化するのに用いる方法により、ある程度統制される。例えば、基質が固相マトリックスに固定化されている場合には、固定化がＣ−マンノシル化部分を介している場合（例えば、Ｃ−マンノシル化基質に特異的な抗体を用いる場合）には、唯一、リポーター分子を用いる検出が可能である。Ｃ−マンノシル化以外の部分を介した固定化には、例えばＣ−マンノシル化基質に特異的な抗体を用いてＣ−マンノシル化残基を検出する必要がある。このような抗体は非Ｃ−マンノシル化形態を認識しない。
【００２７】
細胞表面で示されるＣ−マンノシル化基質を、特定の抗体、例えば特定の標識抗体を用いて認識することができ、以下の実施例１に記載されるようにＦＡＣＳ分析を用いて同定することができる。あるいは、ＣＭＴ基質を含む融合タンパク質が、ＣＭＴ基質をフランキングする１以上のプロテアーゼ切断部位をさらに含む場合には、以下の実施例２に記載されるように、そのＣＭＴ基質を単離することができ、質量分析によりＣ−マンノシル化を同定することができる。よって、例えば、バッファーまたは細胞中に存在する３Ｈ−マンノースを用いるなど、抗体または標識部分を用い、ＣＭＴ基質のＣ−マンノシル化を検出するための多くのバリエーションが存在することは当業者に明らかである。さらに、これらのアッセイはロボットおよび自動化プロセスを用いるハイスループット技術に容易に従うことは明らかである。これらの方法はＣＭＴ活性を調節する薬剤のスクリーニングに特に有用である。
【００２８】
［スクリーニングアッセイ］
本発明のもう一つの局面では、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の調節に有効な薬剤を同定する方法が提供される。これらの方法は、ｉ）細胞内のＣＭＴ（またはその機能的同等物）を薬剤と接触させる工程、ｉｉ）ＣＭＴ活性を検出する工程、およびｉｉｉ）該薬剤が存在しない場合と比べ、薬剤により誘導されるＣＭＴ活性の調節を検出する工程を含む。ＣＭＴ活性の可能性のあるインヒビターならびにアクチベーターを、これらの方法を用いて同定することができる。従って、アクチベーターおよびインヒビターは本明細書ではまとめてモジュレーターと呼び、好ましくはＣＭＴ活性に直接影響を及ぼす（すなわち、ＤＰＭ経路を阻害しない）。
【００２９】
ＣＭＴの機能的同等物または誘導体の例としては、ＣＭＴが置換、化学的、酵素的またはその他の適当な手段によって天然アミノ酸以外の部分で共有結合的に修飾されている分子が挙げられる。共通の構造的特徴を保持する誘導体としては、ＣＭＴの断片、特に触媒活性を維持する断片であり得る。好ましくは、断片は少なくとも５０、少なくとも１００以上のアミノ酸長である。ＣＭＴの誘導体はまた、ＣＭＴの少なくとも１つの特徴、好ましくは触媒活性を維持するためにその必要がある、アミノ酸欠失、付加または置換を含み得るその突然変異体を含む。従って、保存的アミノ酸置換は、末端切断であり得るが、ＣＭＴの性質を実質的に変更することなく行われ得る。さらに、欠失および置換を、本発明のスクリーニング方法において、特にＣＭＴ触媒活性の増強または他の何らかの望ましい特性の提供に用いられるＣＭＴの断片に対して行ってもよい。
【００３０】
本発明のスクリーニングアッセイにおいては上記のＣＭＴ活性アッセイのいずれを用いてもよい。ＣＭＴ遺伝子の発現を調節する、ならびにその酵素活性を調節する薬剤が本発明のアッセイを用いて同定される。ある好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法は細胞に基づく方法であり、細胞において細胞表面結合ＣＭＴ基質が発現され、例えば、細胞表面において、またはプロテアーゼによる切断後に細胞表面から遊離される基質のＣ−マンノシル化が検出される。本発明のこの局面では、Ｃ−マンノシル化基質は通常には融合タンパク質として存在する。Ｃ−マンノシル化基質は、抗体、検出可能な標識またはタグなどの種々の手段を用いて検出できる。
【００３１】
モジュレーターがドリコールリン酸マンノース（ＤＰＭ）合成を調節することで望ましくない作用を持たないことを確認するため、より好ましい実施形態では、ＤＰＭ合成が影響を受けていないことを示すグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質（例えば、ＣＤ５９）などの検出可能なマーカーが検出される。ＣＤ５９は種々の細胞の表面に存在する１０３アミノ酸のタンパク質である。これはＧＰＩアンカーの手段により膜に固定される。このタンパク質はＣ９と会合して、そのＣ５ｂ−８への組み込みを妨げることで補体系の膜侵襲複合体の形成を阻害する。これは補体を介した溶解から細胞を保護する(Morgan, B.P. & Harris, C.L., 1999, Complement regulatory proteins, Academic Press, San Diego)。しかしながら、本発明のこの局面では、ＣＤ５９は単にＤＰＭ合成のマーカーとしての機能を果たすに過ぎない。他の好適なマーカーも当業者には明らかである。ＣＤ５９合成（または同様のＧＰＩアンカー）が低下すれば、本発明の方法はそれによりＧＰＩアンカー合成酵素のモジュレーターの存在を示し、これがまた、ＧＰＩの欠損がしばしば重篤な疾病と関連しているという有用な情報を提供する。よって、本発明の方法はまた、ＧＰＩアンカー合成酵素のモジュレーターの同定のためにも使用できる。
【００３２】
このスクリーニング系は好ましくは、小分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、ファージディスプレーライブラリーまたは天然物ライブラリーに存在し得る薬剤をスクリーニングするために使用される。薬剤は、例えば抗生物質または抗体など、無機または有機物であり得る。投与が容易なため、薬剤は好ましくは小分子である。
【００３３】
薬剤はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどの核酸であってもよい。このような薬剤は、Ｃ−マンノシル化基質の減少が、用いた核酸がＣＭＴ発現を阻害することを示し、ＣＭＴコード配列の同定の候補となる可能性があることから、ＣＭＴのコード配列の同定に特に有用である。核酸データベースを検索すれば１以上の候補（またはそれらの相補鎖）を含む配列が同定され、それによりＣＭＴ基質のＣ−マンノシル化において機能的に重要な遺伝子を発見する助けとなる。
【００３４】
本発明によれば、薬剤のスクリーニングに有用なキットも提供され、本質的にスクリーニングに有用なＣＭＴまたはその機能的同等物と使用説明書を含む。通常、このＣＭＴは１以上のＣＭＴ基質、（好ましくは本明細書に記載の膜結合融合タンパク質）、ＣＭＴ活性を検出するための手段および少なくとも１つの薬剤（推定薬剤）とともに提供される。
【００３５】
本発明のキットに用いられるＣＭＴは、例えば溶液、懸濁液または凍結乾燥したタンパク質の形で提供されてもよいし、あるいは、所望によりin situ発現系においてＣＭＴまたはその機能的同等物の生産を可能とする核酸配列の形で提供されてもよい。
【００３６】
また、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の調節に有効な薬剤を同定する方法も提供され、該方法は（ａ）ＣＭＴ遺伝子を含む非ヒト野生型または遺伝子操作動物を提供する工程、（ｂ）その非ヒト動物に薬剤を投与する工程、および（ｃ）該薬剤が存在しない場合に比べ、ＣＭＴ活性が影響を受けたかどうかを判定する工程を含む。
【００３７】
また、本発明のスクリーニング方法によって同定された薬剤も提供される。本発明の薬剤は、前記の技術を用いてスクリーニングすることにより同定され、確立された手順に従って天然供給源から抽出することにより、または特に低分子量の化学薬剤の場合には合成によって調製され得る。タンパク系薬剤は、例えばバキュロウイルス系などの組換え発現系、または細菌系での発現により調製することができる。タンパク系薬剤は主としてＣＭＴの機能に対する研究に有用であるが、それらは治療用途も持ち得る。
【００３８】
一方、低分子量薬剤は好ましくは確立された手順に従う化学合成によって生産される。それらは主として治療薬として指示される。低分子量薬剤および有機薬剤は一般に、ＣＭＴ活性に依存する疾病または状態の処置に用いられる薬剤として有用であり得る。ＣＭＴ活性のモジュレーターは研究ツールとして、また種々の臨床の場で有用であり、従って、ＣＭＴ活性の調節が望ましい場合であればいつでも使用することができる。例えば、補体系の種々の成分がＣ−マンノシル化されていることが示されており、ＣＭＴインヒビターを種々の病理または治療状況下で補体系を操作するために使用できる。例えば、補体の活性化は臓器移植後の移植片拒絶反応(Bos, I.G., et al., 2002, Transfus. Med. Rev., 16: 251-264)、または虚血心筋の再潅流傷害(Monsinjon, T. et al., 2001, Fundam. Clin. Pharmacol., 15: 293-306)に関連づけられている。このような阻害は、著しくＣ−マンノシル化されていることが示されているプロパージンおよびＭＡＣのような補体の必須成分を不活性化することにより達成することができる。
【００３９】
同様に、細胞外マトリックスタンパク質（トロンボスポンジ−１および−２）、軸索誘導タンパク質、Ｆ−スポンジン、Ｍ−スポンジン、ＳＣＯ−スポンジン、セマフォリンＦおよびＧ、ＲＮアーゼ２、血管形成に関与するタンパク質（例えば、脳特異的アンジオゲニンインヒビターＢＡＩ−１、−２および−３）、メタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、アグレカナーゼ、ＧＯＮ−１、プロコラーゲンＩ Ｎ−プロテイナーゼ、ラクニン(lacunin)、ＴＲＡＰ、およびサイトカイン受容体（例えば、エリスロポエチン、成長ホルモン、プロラクチン、インターロイキン−２、−３、−４、−５、−６、−７、−９、−１１、−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、毛様体神経栄養因子、トロンボポエチン(thrombopoieitin)、カルシトニンおよびレプチンの受容体）のＣ−マンノシル化も、所望の作用を達成するために調節できる。よって、ＣＭＴ活性のモジュレーターは細胞増殖、シグナル伝達、神経再生および神経変性、血管形成、アポトーシス、免疫炎症、細胞輸送、タンパク質合成および輸送、ならびに寄生体−宿主相互作用の調節に有用である。
【００４０】
ＣＭＴ モジュレーター（アクチベーターまたはインヒビター）は、そのモジュレーターの厳密な性質に応じて常法に従って処方され得、通常には生物学的に許容される担体とともにモジュレーターまたはその前駆体を含む。種々の治療法を考慮する上で、そのような治療法はＣＭＴを発現することが実証されている組織にターゲッティングすることができると解される。
【００４１】
罹患細胞および組織へのこのモジュレーターの送達は、適当なパッケージングまたは投与系を用いて達成することができる。例えば、このモジュレーターは、治療用として医薬投与に許容される薬剤とともに処方され、所望の生理作用をもたらすよう、許容される経路によって被験体に送達することができる。有効量とは、所望の生理作用をもたらす量である。
【００４２】
本発明はまた、ＣＭＴ活性に依存する疾病または状態の治療処置または予防処置のための薬剤の製造のための、ＣＭＴ活性の特異的インヒビターも提供する。
【００４３】
［実施例］
これらの実施例は例示を目的として記載するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。アッセイのデザインおよび検出におけるバリエーションは、当業者には明らかである。
【００４４】
本開示および実施例に明示されてはいないが言及される分子遺伝学、タンパク質およびペプチドの生化学ならびに免疫学の方法は科学文献で報告されており、当業者に周知のものである。例えば、遺伝子操作の標準的な方法は、本質的にSambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989に記載されているようにして行われる。
【００４５】
実施例１：細胞に基づくＣＭＴ活性に関するアッセイ
本発明者らはＣＭＴ活性の効率的アッセイを考慮した細胞に基づく系をデザイン、構築および特性決定した。この系はここでは、修飾された場合に特異的抗体によって認識され得るＣ−マンノシル化モチーフを含む表面結合マーカータンパク質を用いて例示する。
【００４６】
ｃＤＮＡ構築物
可溶型ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ
ＰＣＲを用いて、そのＣ末端に、トロンビン切断部位とＣ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の基質であるＡＷＡＫＷＡを含む、分泌型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ、Schistosoma japonicum製）をコードする構築物を作製した。好酸球由来神経毒由来のシグナル配列（ＥＤＮ；太字で示されている）を有するフォワードプライマー
【化１】
（配列番号２）(Newton, D.L. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 26739-26745)を、ｐＧＥＸ−２Ｔ(Pharmacia)のＧＳＴのＮ末端にアニーリングし、ＣＭＴ基質部位ＡＷＡＫＷＡ（配列番号１）をコードするリバースプライマー 5'-ATATGAATTCTCAGTCAGTCAAGCCCATTTAGCCCAAGCGGATCCACGCGGAACC-3'（配列番号３）をｐＧＥＸ−２ＴのＧＳＴのＣ末端のトロンビン配列にアニーリングした。このＰＣＲ産物を、ｐＳＭＣｉのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉ部位にサブクローニングし(Asselbergs, F.A. & Grand, P., 1993, Anal. Biochem., 209: 327-331)、ｐＳＭＣｉ−ｓｓＥＤＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＫＷＡ（配列番号１）を得た。縮重プライマーを用いた部位特異的突然変異誘発によりいくつかの異なるＣＭＴ基質を作製した。これらの構築物のうちの１つがタンパク質ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）をコードしており、これはＨＥＫ−２９３細胞内で発現された後、ＣＭＴにより効率的にＣ−マンノシル化（９０％）されることが分かり、修飾特異的抗体α５−１０(Krieg, J. et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 26687-26692)により認識された。この構築物を、このＣＭＴ基質の膜結合型をコードするｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）を作製するための鋳型として用いた。
【００４７】
細胞表面結合ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ
ヒトアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）のＮ末端膜アンカードメインをコードするｃＤＮＡを、Ｓｐｅ Ｉ制限部位を介してＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）をコードするｃＤＮＡと連結し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を用いて哺乳類発現ベクターｐＳＭＣｉへサブクローニングすることにより、細胞表面型のＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）を作製した。
【００４８】
ヒトアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ，２０４ｂｐ）の細胞質領域、膜貫通領域および主鎖領域を含む融合タンパク質のＮ末端部分を、フォワードプライマー
【化２】
（配列番号４）およびリバースプライマー
【化３】
（配列番号５）を用いて、鋳型ｐＴＥＪ４−ヒトＡＰＮ(Vogel, L.K. et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 2794-2797)からのＰＣＲによりクローニングした。このフォワードプライマーは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位（下線）とＫｏｚａｋ配列（太字）を含む。タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位（２１ｂｐ、太字）をリバースプライマーを介して導入し、それにＳｐｅ Ｉ制限部位（下線）が続いている。
【００４９】
融合タンパク質のＣ末端部分はＧＳＴを含み、その後にトロンビン切断部位およびＣＭＴ基質部位ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）が続いていた。Ｓｐｅ Ｉ制限部位（下線）を含むフォワードプライマー5'-GACTAGTTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3'（配列番号６）およびリバースプライマー5'-GCTCTAGAGAATTCCTATCAAGCCCACTGAGCCCAAGCGGAT-3'（配列番号７）を用いるＰＣＲにより、ｐＳＭＣｉ−ｓｓＥＤＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ ｃＤＮＡに由来する６９９ｂｐの断片が得られた。このリバースプライマーはＡＷＡＱＷＡ基質、停止シグナルおよびＥｃｏＲＩ制限部位（下線）を含んでいた。
【００５０】
ＰＣＲ産物をＱｉａＥｘＩＩ(Qiagen)を用いてゲル精製し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を介してｐＳＭＣｉ哺乳類発現ベクターに連結した。形質転換後、制限エンドヌクレアーゼで切断してクローンを選択し、その挿入部を両方向とも完全に配列決定した。この構築物をｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）と呼ぶ。
【００５１】
ｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）由来の挿入部を切り出し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を介してｐｃＤＮＡ３．１に連結した。得られた構築物ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）を用い、ネオマイシンの存在下で形質転換体を選択することにより安定細胞系統を確立した。ｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）挿入部のｃＤＮＡ配列（９２４ｂｐ）を以下に示す。
ATGGCCAAGGGCTTCTATATTTCCAAGTCCCTGGGCATCCTGGGGATCCTCCTGGGCGTGGCAGCCGTGTGCACAATCATCGCACTGTCAGTGGTGTACTCCCAGGAGAAGAACAAGAACGCCAACAGCTCCCCCGTGGCCTCCACCACCCCGTCCGCCTCAGCCACCACCAACCCCGCCTCGGCCACCACCTTGGACCAAAGTGAGAATTTGTATTTTCAGGGTACTAGTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCGCTTGGGCTCAGTGGGCT（配列番号８）
【００５２】
このｃＤＮＡによってコードされる翻訳配列（３０８ａａ）は
MAKGFYISKSLGILGILLGVAAVCTIIALSVVYSQEKNKNANSSPVASTTPSASATTNPASATTLDQSENLYFQGTSSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSAWAQWA（配列番号９）である。
【００５３】
これらの翻訳配列で、KSLGILGILLGVAAVCTIIALSVVYSQ（配列番号９のアミノ酸９〜３５）はＡＰＮの膜貫通領域であり、EKNKNANSSPVASTTPSASATTNPASATTLDQS（配列番号９のアミノ酸３６〜６８）はＡＰＮの主鎖ドメインであり、ENLYFQG（配列番号９のアミノ酸６９〜７５）はＴＥＶ切断部位であり、LVPRGS（配列番号９のアミノ酸２９７〜３０２）はトロンビン切断部位であり、また、AWAQWA（配列番号９のアミノ酸３０３〜３０８）はＣＭＴ基質である。
【００５４】
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）およびベビーハムスター腎細胞（Ｐｙ−ＢＨＫ）は１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで維持し、リポフェクタミン(Invitrogen)を用い、ｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）ｃＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの前日、細胞を２．５×１０６細胞／１００ｍｍディッシュに播種した。ＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造業者の説明書に従って調製した。各ディッシュにつき、８ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１(Invitrogen)に１０μｇのプラスミドＤＮＡおよび５０μｌのリポフェクタミンを加えた。７時間後、２０％ＦＣＳを添加した同量のＤＭＥＭを加え、一晩インキュベートした。翌朝、トランスフェクト細胞を新鮮培地でインキュベートし、さらに４８時間インキュベートした後、ＰＢＳ−０．０５％ＥＤＴＡ中に回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーにより分析するか、またはＴＥＶプロテアーゼで消化してＧＳＴ−融合タンパク質を回収した。細胞をｐｃＤＮＡ３．１−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）およびｐｃＤＮＡ３．１／ＨｙｇｒｏＣＤ５９で同時トランスフェクトし、ネオマイシンとハイグロマイシンを含有する培地でクローンを選択することにより、細胞表面でＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）とＣＤ５９を発現する安定細胞系統を作製した。
【００５５】
フローサイトメトリー
細胞表面タンパク質発現を検出するためのウサギ抗ＧＳＴ(Sigma)か、マンノシル化ＣＭＴ基質を同定するためのウサギα５−１０抗体かいずれかで細胞を標識した。発明者らはこれまでに、α５−１０抗体がマンノシル化型のＣＭＴ基質に特異的であり、修飾されていないタンパク質は認識しないことを実証している(Krieg, J. et al., 1997)。細胞を４０μｍのストレイナー(Falcon)で濾過し、計数し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＮ３、５％正常ヤギ血清）中に１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。氷上で３０分インキュベーションした後、１００μｌの細胞を、ブロッキングバッファー中に５μｇ／ｍｌに希釈した１００μｌの一次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄バッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＮ３）で洗浄した後、それらをブロッキングバッファー中に１：２００希釈した１００μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch)とともに４℃で３０分間インキュベートした。染色された細胞を洗浄し、５００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁させ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒにて、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。陰性対照は、正常ウサギＩｇＧでプローブしたトランスフェクト細胞、または特定の抗体とともにインキュベートした非トランスフェクト細胞からなった。この抗ＧＳＴ抗体は、約５０％の細胞がそれらの表面上でＧＳＴ−ＣＭＴ基質融合タンパク質を発現したことを示した。このタンパク質の大部分は、α５−１０抗体での染色によって示されるように、Ｃ−マンノシル化されていた。陰性対照は低いバックグラウンド染色を示した。このように、細胞表面で発現されたＣＭＴ基質のＣ−マンノシル化が初めて確立され、細胞に基づくアッセイの簡単な形式が提供された。
【００５６】
実施例２：細胞に基づくＣＭＴ活性に関するアッセイ
この系はここでは、タンパク質化学分析によって認識され得るＣ−マンノシル化モチーフを含む表面結合マーカータンパク質を用いて例示する。その方法論は、タンパク質化学分析が上記で用いたフローサイトメトリーに取って代わるか、または補足すること以外は、本質的に実施例１に記載した通りである。
【００５７】
タンパク質化学分析
発現したＣＭＴ基質をトランスフェクト細胞から精製し、ＬＣ−ＭＳにより、本質的に次のようにしてＣ−マンノシル化ペプチドの存在に関して分析した。約５×１０７細胞をｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）ｃＤＮＡでトランスフェクトし、上記のように回収した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞ペレットを最終量５００μｌのＴＥＶバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。１００単位のＴＥＶプロテアーゼ(Invitrogen)を加え、１６℃で７時間穏やかに混合した。ＦＡＣＳ分析によれば、インキュベーション５分後に、７０％を超えるＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡタンパク質（配列番号１）が細胞表面から遊離したことが示された。
【００５８】
細胞をペレットとし、上清を遠心分離によりさらに明澄化した。この上清を、１０％ＦＣＳおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（１ｍｌ ４０％ＤＭＳＯ、６０％エタノール中、５ｍｇのベンズアミジン、１ｍｇのペプスタチンＡ、１ｍｇのロイペプチン、１ｍｇのアンチペイン、１ｍｇのアンチキモトリプシン、２０ｍｇのＰＭＳＦを含有する５００倍保存溶液２０μｌ）を含有するＤＭＥＭ１０ｍｌで希釈し、回転機上、４℃で一晩、グルタチオン−アガロースビーズ(Amersham Pharmacia)とともにインキュベートした。このサンプルをＢｉｏＲａｄカラムに移し、ビーズを３ｍｌのバッファーＡ（５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴを含有するＰＢＳ）、次いで３ｍｌのバッファーＢ（２５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ）で洗浄し、３ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の最終洗浄を行った。次に、洗浄したビーズを２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ 還元型グルタチオン、２ｍＭ ＤＴＴ中、３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。このカラムをＭｉｃｒｏｃｏｎ ＵｌｔｒａＦｒｅｅ ｔｕｂｅ上に置き、３分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。溶出したＧＳＴ融合タンパク質を含む濾液をさらにＣ４カラムを用いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。このカラムを溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸ＴＦＡ）で平衡化し、２０％溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮ）で洗浄し、３０分にわたり溶媒Ｂの直線的配を用いて溶出させた。このタンパク質を２１４ｎｍでモニタリングした。ＣＭＴ基質ペプチドを、トロンビンでの切断によりＧＳＴ融合タンパク質から遊離した。乾燥させたタンパク質のピーク（約１０μｇ）を５μｌの９Ｍ尿素に溶解した後、４３μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および２μｌ（４単位）のトロンビンを添加し、室温で１時間インキュベートした。ペプチドの分析は、０．０５％ＴＦＡ、２％ＣＨ３ＣＮで平衡化したＣ１８カラムを用いてＬＣ−ＭＳにより行い、３０分にわたり２０〜８０％の溶媒Ｂ（０．０４５％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮ）の直線勾配を用いて展開した。このＨＰＬＣを、ＡＰＩ３００質量分光光度計のインターフェースと接続した。ＧＳＡ（マンノース）ＷＡＱＷＡ（１０３８Ｄａ；配列番号９のアミノ酸３０４〜３０８）およびＧＳＡＷＡＱＷＡ（８７６Ｄａ；配列番号９のアミノ酸３０１〜３０８）に関して期待された質量のペプチドが認められた。
【００５９】
この実施例はＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質と修飾されていない同等物の質量を確認することにより本発明を例示するものであるが、当業者には、他の方法が、例えば検出可能な標識または抗体を用い、細胞表面から遊離した修飾ＣＭＴ基質の存在を確認するためのハイスループット形式のために容易に考案できることが明らかである。
【００６０】
実施例３：細胞に基づくＣＭＴ活性に関するアッセイ
この実施例では、細胞基質からＣＭＴ基質を遊離させるためにプロテアーゼを用いる代わりに、分泌型のＣＭＴ基質が用いられる。ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）融合タンパク質は、実施例１に記載のｐＳＭＣｉ−ｓｓＥＤＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）でトランスフェクトされた細胞のコンディショニング培地から得られた。このコンディショニング培地を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ｐｌｕｓ−８０チューブ(Millipore)を用いる限外濾過により３５倍に濃縮した。ＧＳＴ融合タンパク質の精製、およびその後のペプチドの遊離は実施例２に記載のように行った。
【００６１】
実施例４：細胞に基づくＣＭＴインヒビターに関するスクリーニング
ＣＭＴインヒビターとしての薬剤の効率的なスクリーニングのためには、実施例１に記載のアッセイを用いることができる。阻害剤は、細胞への抗体の結合が存在しない、または低下していることによって検出できる。さらに、Ｃ−マンノシル化はＤＰＭを必要とする。グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含む、ＣＤ５９などの第２のリポーター分子を所望により含めてもよく、これはＤＰＭ合成経路のインヒビターを排除する陽性マーカーとして機能する。
【００６２】
要するに、ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＷＡＱＷＡ、また所望によりＣＤ５９を安定発現するヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を、約２０％のコンフルエンシーで３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種する。試験薬剤または試験薬剤の組合せをＤＭＳＯ中の保存液として最終濃度１ｍＭ〜１０ｍＭまで、または当業者には明らかなように、他の好適な濃度または溶媒を加えることができる。薬剤を添加した後、細胞を約９０％のコンフルエンシーまで増殖させ、洗浄し、ＡＰＣで蛍光標識されたα５−１０抗体、およびＦＩＴＣ標識でされた抗ＣＤ５９抗体で染色する。抗体の結合２１００ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ装置(Perkin Elmer)で測定する。非処理対照に比べてα５−１０の結合が低下したが、抗ＣＤ５９の結合には作用しない薬剤がＣＭＴ活性の可能性のある特異的インヒビターであり、すなわち、それらはさらなる細胞機能を有するドリコールリン酸マンノース（ＤＰＭ）合成経路には影響を及ぼさない。
【００６３】
実施例５：細胞に基づくＣＭＴインヒビターに関する
ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＷＡＱＷＡとＣＤ５９を安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載のようにＴＥＶプロテアーゼで処理する。プロテアーゼを洗い流した後、細胞を約５０％のコンフルエンシーで３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種する。ＤＭＳＯ中の保存液として最終濃度１ｍＭ〜１０ｍＭまで加え、１８時間および３６時間インキュベーションを続ける。抗体の結合およびインヒビターの確認については、実施例４に記載のようにアッセイする。
【配列表】
【０００１】
本発明はタンパク質修飾、特にグリコシル化タンパク質、および特定のグリコシル化形態であるＣ−マンノシル化を触媒する酵素に関する。
【０００２】
［背景技術］
グリコシル化は最も多く、広範囲にわたるタンパク質修飾の一つであり、種々の生体内プロセスにおいて重要な役割を果たすという認識がますます高まっている。最近の例としてはＯ−フコシル化によるNotchシグナル伝達(Moloney, D.J. et al., 2000, Nature, 406: 369-375; Brueckner, K. et al., 2000, Nature, 406: 411-415)、およびタンパク質折りたたみの質的制御におけるグルコシル化の機能(Ellgaard, L. & Helenius, A., 2001, Curr. Opin. Cell Biol., 13: 431-437)がある。その結果、現在では、複合糖質代謝の欠陥がヒトにおいて種々の病態と関連していることが分かっている。例えば、ＩＩ型白血球接着不全症はＧＤＰ−フコース輸送における分子欠陥によって引き起こされることが示されている(Luhn, K. et al., 2001, Nat. Genet., 28: 69-72)。
【０００３】
タンパク質のグリコシル化のうち最もよく研究されている形態であるＮ−およびＯ−グリコシル化は、約４０年来知られている。これらの場合、グリカンはそれぞれアミノ酸側鎖のアミド基またはヒドロキシル基を介してタンパク質と結合している。グリコシラーゼに関するin vitroアッセイが文献に記載されている(EP 0272603、EP 1260591、Hendershot et al., 2002, Analytical Biochemistry 307: 273-279参照)。
【０００４】
Hofsteengeおよび共同研究者は、ヒトＲＮアーゼ２においてα−マンノピラノシル残基と、トリプトファンのＣ−２原子との結合を含む新規なタンパク質−炭水化物結合を報告している(Hofsteenge, J. et al., 1994, Biochemistry, 33: 13524-13530; de Beer, T. et al., 1995, Biochemistry, 34: 11785-11789)。この複合糖質は典型的なＮ−またはＯ−グリコシド結合を含まず、Ｃ−Ｃ結合を含む。この修飾反応はミクロソームのＣ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）により触媒され、このＣ−マンノシルトランスフェラーゼは糖供与体としてドリコールリン酸マンノース（ＤＰＭ）を用い、タンパク質アクセプターのＴｒｐ−ｘ−ｘ−Ｔｒｐ（ＷＸＸＷ）配列を認識する(Doucey, M.-A. et al., 1998, Mol. Biol. Cell, 9: 291-300; Krieg, J. et al., 1998, Mol. Biol. Cell, 9: 301-309)。
【０００５】
現在、種々の機能を果たす１１の異なるタンパク質に由来する４９のＣ−マンノシル化トリプトファンが確認されている（総説としてはFurmanek, A. & Hofsteenge, J., 2000, Acta Biochim. Pol., 47: 781-789参照）。これらのうち、ヒトプロパージンは、その２０のトリプトファンのうち１５がＣ−マンノシル化されていることから特殊な位置にある(Hartmann, S. & Hofsteenge, J., 2000, J. Biol. Chem., 275: 28569-28574)。プロパージンは血漿に存在する５０ｋＤａのタンパク質であり、微生物に対する宿主の第一線の防御である補体系の正のレギュレーターである。その３つの活性化経路は、Ｃ３からＣ３ｂへの変換をもたらす工程に収束するタンパク質分解カスケードからなっている。代替経路のヘテロ二量体Ｃ３変換酵素、Ｃ３ｂＢｂの急速な不活性化は、プロパージンとの複合体の形成により妨げられる。産生されたＣ３ｂはさらなるＣ３ｂの形成に関与するので、プロパージンにより安定化される正のフィードバック ループが存在する。次に、後続反応が補体系の実際の分解成分である膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成をもたらす。この複合体は６つの異なるサブユニットからなり、そのうち５つはまた、複数のトリプトファン残基でＣ−マンノシル化もされている(Hofsteenge, J. et al., 1999, J. Biol. Chem., 274: 32786-32794)。
【０００６】
放射性標識したＤＰＭ、肝臓ミクロソーム、およびＣＭＴ認識部位（ＷＸＸＷ）を含有する合成ペプチドを用いたin vitro ＣＭＴアッセイが記載されている。クロロホルム／メタノールで反応生成物を抽出した後、水相においてＣ−マンノシル化ペプチドが放射性標識の存在によって検出される(Doucey, M.-A. et al., 1998)。このアッセイは有用ではあるが、アッセイの間およびその後の単離の間の両方のペプチドの安定性、正しい細胞コンパートメントへのペプチドの送達、分析のために修飾された材料が微量しか単離されない、また、細胞間または細胞種間による変動などの技術的な問題があって、全般的にアッセイの再現性に問題があることから、その適用は限られている。従って、ＣＭＴならびにその活性のモジュレーターの同定を可能とするハイスループット形式に従うアッセイ、特に細胞に基づくアッセイの必要がなおあり、本発明はその必要を満たすものである。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性をアッセイする方法であって、ｉ）好ましくは細胞内において、ＣＭＴおよびＣＭＴ基質を準備する工程（例えば、膜貫通ドメインとの融合タンパク質として）、ｉｉ）該ＣＭＴ基質に対する該ＣＭＴの作用によりＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の形成を誘導し得る条件を提供する工程、ｉｉｉ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を固定化する工程（例えば、細胞表面結合タンパク質としての発現によって）、およびｉｖ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を検出する工程を含む方法を提供する。これらの方法はＣＭＴ活性を調節する薬剤をスクリーニングするのに特に有用である。
【０００８】
よって、本発明のもう一つの局面では、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の調節において有効な薬剤を同定する方法を提供する。その方法は、ｉ）ＣＭＴを含む細胞を薬剤と接触させる工程、ｉｉ）ＣＭＴ活性を検出する工程、およびｉｉｉ）該薬剤が存在しない場合と比べ、薬剤により誘導されるＣＭＴ活性の調節を検出する工程を含む。ＣＭＴ活性の可能性のあるインヒビターならびにアクチベーターを、これらの方法を用いて同定することができる。
【０００９】
好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法は細胞に基づく方法であり、細胞において細胞表面結合ＣＭＴ基質が発現され、細胞表面において、例えばプロテアーゼにより切断した後に細胞表面から遊離した、前記基質のＣ−マンノシル化を検出する。本発明のこの局面では、Ｃ−マンノシル化基質は通常、融合タンパク質として存在する。このＣ−マンノシル化基質を、抗体、検出可能な標識またはタグなどの種々の手段を用いて検出することができる。
【００１０】
モジュレーターがＤＰＭ合成を調節することで望ましくない作用を持たないことを確認するため、より好ましい実施形態では、ＤＰＭ合成が影響を受けていないことを示すＧＰＩアンカータンパク質（例えば、ＣＤ５９）などの検出可能なマーカーが検出される。
【００１１】
これらのスクリーニング法によって同定された薬剤も提供される。
【００１２】
また、このような方法を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いて、とらえにくいＣＭＴ遺伝子を同定することもできる。このような核酸の存在下でＣ−マンノシル化基質が欠如していることは、ＣＭＴに特異的な阻害配列が存在することを示し、次にこれをデータベース検索およびＣＭＴ遺伝子の同定に用いることができる。
【００１３】
［発明の詳しい説明］
ＣＭＴ活性アッセイ
Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の同定は、その精製に多大な努力が費やされてきたにもかかわらず、依然として分かりにくいままである。本発明は、ＣＭＴの同定および特性決定の助けとなる、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を検出する高感度アッセイを提供し、また、その酵素活性を調節する薬剤をスクリーニングする手段を提供する。
【００１４】
その最も広い局面において、本発明は、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性をアッセイする方法であって、ｉ）ＣＭＴおよびＣＭＴ基質を準備する工程、ｉｉ）ＣＭＴ基質に対するＣＭＴの作用によりＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の形成を誘導し得る条件を提供する工程、ｉｉｉ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を固定化する工程、およびｉｖ）Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を検出する工程を含む方法を提供する。
【００１５】
昆虫、線虫、両生類、鳥類および哺乳類をはじめとする種々の細胞におけるＣＭＴ活性の発現が研究され、科学文献で考察されている。これらの細胞および組織供給源またはまだ発見されていない他のものはいずれも、ＣＭＴの供給源として用いられ得る。いくつかの目的では、ＣＭＴはしばしばＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの細胞系から得られる。
【００１６】
本発明の一つの局面では、ＣＭＴ活性は細胞抽出液の調製後in vitroでアッセイする。細胞抽出液の調製方法は当技術分野で周知である。（例えば、Scopes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition, Springer-Verlag, N.Y.参照）。また、肝臓ミクロソームも既報のようなＣＭＴの供給源として使用できる(Doucey, M.-A. et al., 1998)。あるいは、細胞抽出液は、単に細胞サンプルを溶解してＣＭＴを放出することにより、さらなるサンプル調製なく調製することも可能である。
【００１７】
ＣＭＴの起源にかかわらず、ＣＭＴサンプル（またはそのアリコート）を、ＣＭＴ基質を含む反応混合物中、その基質のＣ−マンノシル化を可能とする条件下でアッセイする。in vitroアッセイでは、これは３７℃にて生理的ｐＨのバッファー中で反応混合物をインキュベートすることを意味する。好ましくは、さらに以下に記載するように、ＣＭＴ基質とＣＭＴを含む細胞において反応を行う。各場合において選択された特定のＣＭＴ基質は、試験するＣＭＴ活性のタイプまたは起源、あるいは用いる検出方法のタイプによっても異なるが、通常には、コンセンサス配列ＷＸＸＷを含むペプチドまたはポリペプチドである。
【００１８】
ＣＭＴ基質を、固相（細胞表面を含む）または固相マトリックスへのＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の固定化を可能とするように設計する。このＣＭＴ基質を、酵素ＣＭＴがサンプル（または細胞）に存在する場合にＣ−マンノシル化が検出され得るように固相支持体に固定化する。固定化は検出が損なわれない限りいずれの様式で達成されてもよく、従って、ＣＭＴ基質の定方向結合が通常必要となる。このような定方向結合は、タンパク質末端と支持体上の反応基への特異的化学反応、タグと特異的に結合する受容体により捕捉され得るタンパク質の末端へのタグの結合（例えば、ＧＳＴ−抗体、ビオチン−ストレプトアビジン、ビオチン−アビジン、抗体−エピトープ相互作用が受容体−タグ対として使用できる）をはじめとする、当技術分野で既知の種々の方法によって達成することができ、あるいは例えば特異的抗体または化学反応を用い、Ｃ−マンノシル化部位を固定化のために使用することもできる。
【００１９】
固相支持体は例えば、マルチウェルプレート、ゲル、マトリックス、ビーズ、メンブランまたはチューブであってよく、限定されるものではないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリエチレン、ポリカーボネート、およびガラスをはじめとする種々の材料からなってよい。直径約１μｍ〜約５ｍｍのポリスチレンビーズ；例えばポリスチレンまたはポリ塩化ビニル製のプレートまたはマイクロタイタープレートのウェル；ガラスビーズ；磁気粒子；多糖類は、例えば抗体でコーティングできる表面の例である。当業者に周知のように他の固定様式も使用できるが、抗体は通常、水性媒体からの吸着により固相マトリックスへ固定される。固相表面にコーティングする抗体の量は、接触溶液中の抗体濃度を調整することにより変えることができる。好ましい実施形態では、固相支持体はリポソームまたは細胞によって提供されるような膜または表面であり得る。
【００２０】
よって、本発明の好ましい実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイとして行い、これに関しては細胞の表面で発現させるためのＣＭＴ基質を含む融合タンパク質中に膜貫通ドメインを含むのが有利である。従って、融合タンパク質の一部として発現されるこの膜貫通ドメインは、細胞表面に融合タンパク質を固定化する「タグ」として構想され得る。膜貫通ドメインは、コンピューターを用いたハイドロパシープロットによるなどして同定できる疎水性領域を含み、ペプチドの細胞膜への固定を可能とする。膜貫通ドメインはいずれの起源のものであってもよく、以下ではアミノペプチダーゼＮ膜貫通ドメインを用いて例示する。以下の実施例１は、ＣＭＴ活性アッセイにおいてＣ−マンノシル化されて膜結合ＣＭＴ基質を生じるＣＭＴ基質を発現する構築物を用いて本発明を例示するものである。
【００２１】
この構築物は、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現される、細胞質テールを含むＮ末端ドメイン、Ｎ末端からＣ末端の順にヒトアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）の膜貫通領域および主鎖領域の後に、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、トロンビン切断部位およびＣＭＴ基質、ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）、またはその複数コピーを有する融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、複数コピーのＣＭＴ基質の存在は、例えばリポーターが固定化され、検出される場合、またはアクチベーターが発見できるようにＣＭＴを基質で飽和させるのが望ましい場合に特に望ましい。当業者に明らかなように、この融合タンパク質のデザインのバリエーションは本発明の範囲内である。いくつかの実施形態では、細胞膜への固定が望まれない場合は、タンパク質を培地へ分泌させるシグナル配列をさらに含むポリペプチド発現カセットを使用することもできる。
【００２２】
もう１つの実施形態では、ＣＭＴ基質はリポーター分子と結合させることができる。リポーター分子（すなわち、シグナル生成分子）は検出可能な変化をもたらし得るいずれの分子であってもよい。このようなリポーター分子としては、蛍光部分（例えば、蛍光タンパク質または化学蛍光標識）、放射活性部分、リン光性部分、抗原、リポーター酵素などが挙げられる。好ましくは、リポーター分子は、その活性が検出可能な変化をもたらすリポーター酵素である。このようなリポーター酵素としては、β-ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼおよびウレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の方法の用いられるリポーター分子を選択する上では、リポーター分子が、サンプル中に存在するいずれかのプロテアーゼ活性による不活性化をはじめ、サンプル中のいずれの薬剤によっても不活性化を受けないことが不可欠である。適当なリポーター分子の選択は当業者ならば容易に明らかとなろう。
【００２４】
他の好ましい特性を有するタグ、リポーター、またはポリペプチドもしくはペプチドとＣＭＴ基質の結合は、（ｉ）ＣＭＴ基質がＣＭＴによって認識され、そして（ｉｉ）定方向固定化が損なわれない限り、当技術分野で既知のいずれかの手段（またはまだ発見されていない手段）によって達成することができる。従って、結合は化学反応により、融合タンパク質の合成の際にタグ（例えば、ビオチン）を組み込むことにより、または当技術分野で周知のように、例えば膜固定Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質の細胞外提示を可能とする組換え法を用いるなどの連続合成により達成することができる。
【００２５】
融合タンパク質は、最も一般には組換え手段によって生産され、ここで、この発現構築物は、例えば受動的インターナリゼーションによる、界面活性剤またはブドウ球菌アルファトキシンを用いるマイクロポレーションによる、リポソーム（例えば、市販のリポフェクタミン（商標）、リポフェクチン（商標）、リポフェクトエース（商標））の使用による、バイオリスティックを用いるリン酸カルシウムを介したインターナリゼーションによる、またはエレクトロポレーションによるなど、当技術分野で既知の方法を用いて目的の細胞へ導入することができる。標的ＤＮＡが細胞にインターナライズされた後、サンプルをインキュベートして基質の合成およびＣＭＴによるそのＣ−マンノシル化を可能とする。
【００２６】
従って、インキュベーション後、Ｃ−マンノシル化基質は細胞抽出液中か、培地中か（この場合、基質は分泌型である）、または細胞表面上かのいずれかに回収される。Ｃ−マンノシル化基質の検出は、基質を固相支持体へ固定化するのに用いる方法により、ある程度統制される。例えば、基質が固相マトリックスに固定化されている場合には、固定化がＣ−マンノシル化部分を介している場合（例えば、Ｃ−マンノシル化基質に特異的な抗体を用いる場合）には、唯一、リポーター分子を用いる検出が可能である。Ｃ−マンノシル化以外の部分を介した固定化には、例えばＣ−マンノシル化基質に特異的な抗体を用いてＣ−マンノシル化残基を検出する必要がある。このような抗体は非Ｃ−マンノシル化形態を認識しない。
【００２７】
細胞表面で示されるＣ−マンノシル化基質を、特定の抗体、例えば特定の標識抗体を用いて認識することができ、以下の実施例１に記載されるようにＦＡＣＳ分析を用いて同定することができる。あるいは、ＣＭＴ基質を含む融合タンパク質が、ＣＭＴ基質をフランキングする１以上のプロテアーゼ切断部位をさらに含む場合には、以下の実施例２に記載されるように、そのＣＭＴ基質を単離することができ、質量分析によりＣ−マンノシル化を同定することができる。よって、例えば、バッファーまたは細胞中に存在する３Ｈ−マンノースを用いるなど、抗体または標識部分を用い、ＣＭＴ基質のＣ−マンノシル化を検出するための多くのバリエーションが存在することは当業者に明らかである。さらに、これらのアッセイはロボットおよび自動化プロセスを用いるハイスループット技術に容易に従うことは明らかである。これらの方法はＣＭＴ活性を調節する薬剤のスクリーニングに特に有用である。
【００２８】
［スクリーニングアッセイ］
本発明のもう一つの局面では、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の調節に有効な薬剤を同定する方法が提供される。これらの方法は、ｉ）細胞内のＣＭＴ（またはその機能的同等物）を薬剤と接触させる工程、ｉｉ）ＣＭＴ活性を検出する工程、およびｉｉｉ）該薬剤が存在しない場合と比べ、薬剤により誘導されるＣＭＴ活性の調節を検出する工程を含む。ＣＭＴ活性の可能性のあるインヒビターならびにアクチベーターを、これらの方法を用いて同定することができる。従って、アクチベーターおよびインヒビターは本明細書ではまとめてモジュレーターと呼び、好ましくはＣＭＴ活性に直接影響を及ぼす（すなわち、ＤＰＭ経路を阻害しない）。
【００２９】
ＣＭＴの機能的同等物または誘導体の例としては、ＣＭＴが置換、化学的、酵素的またはその他の適当な手段によって天然アミノ酸以外の部分で共有結合的に修飾されている分子が挙げられる。共通の構造的特徴を保持する誘導体としては、ＣＭＴの断片、特に触媒活性を維持する断片であり得る。好ましくは、断片は少なくとも５０、少なくとも１００以上のアミノ酸長である。ＣＭＴの誘導体はまた、ＣＭＴの少なくとも１つの特徴、好ましくは触媒活性を維持するためにその必要がある、アミノ酸欠失、付加または置換を含み得るその突然変異体を含む。従って、保存的アミノ酸置換は、末端切断であり得るが、ＣＭＴの性質を実質的に変更することなく行われ得る。さらに、欠失および置換を、本発明のスクリーニング方法において、特にＣＭＴ触媒活性の増強または他の何らかの望ましい特性の提供に用いられるＣＭＴの断片に対して行ってもよい。
【００３０】
本発明のスクリーニングアッセイにおいては上記のＣＭＴ活性アッセイのいずれを用いてもよい。ＣＭＴ遺伝子の発現を調節する、ならびにその酵素活性を調節する薬剤が本発明のアッセイを用いて同定される。ある好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法は細胞に基づく方法であり、細胞において細胞表面結合ＣＭＴ基質が発現され、例えば、細胞表面において、またはプロテアーゼによる切断後に細胞表面から遊離される基質のＣ−マンノシル化が検出される。本発明のこの局面では、Ｃ−マンノシル化基質は通常には融合タンパク質として存在する。Ｃ−マンノシル化基質は、抗体、検出可能な標識またはタグなどの種々の手段を用いて検出できる。
【００３１】
モジュレーターがドリコールリン酸マンノース（ＤＰＭ）合成を調節することで望ましくない作用を持たないことを確認するため、より好ましい実施形態では、ＤＰＭ合成が影響を受けていないことを示すグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質（例えば、ＣＤ５９）などの検出可能なマーカーが検出される。ＣＤ５９は種々の細胞の表面に存在する１０３アミノ酸のタンパク質である。これはＧＰＩアンカーの手段により膜に固定される。このタンパク質はＣ９と会合して、そのＣ５ｂ−８への組み込みを妨げることで補体系の膜侵襲複合体の形成を阻害する。これは補体を介した溶解から細胞を保護する(Morgan, B.P. & Harris, C.L., 1999, Complement regulatory proteins, Academic Press, San Diego)。しかしながら、本発明のこの局面では、ＣＤ５９は単にＤＰＭ合成のマーカーとしての機能を果たすに過ぎない。他の好適なマーカーも当業者には明らかである。ＣＤ５９合成（または同様のＧＰＩアンカー）が低下すれば、本発明の方法はそれによりＧＰＩアンカー合成酵素のモジュレーターの存在を示し、これがまた、ＧＰＩの欠損がしばしば重篤な疾病と関連しているという有用な情報を提供する。よって、本発明の方法はまた、ＧＰＩアンカー合成酵素のモジュレーターの同定のためにも使用できる。
【００３２】
このスクリーニング系は好ましくは、小分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、ファージディスプレーライブラリーまたは天然物ライブラリーに存在し得る薬剤をスクリーニングするために使用される。薬剤は、例えば抗生物質または抗体など、無機または有機物であり得る。投与が容易なため、薬剤は好ましくは小分子である。
【００３３】
薬剤はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどの核酸であってもよい。このような薬剤は、Ｃ−マンノシル化基質の減少が、用いた核酸がＣＭＴ発現を阻害することを示し、ＣＭＴコード配列の同定の候補となる可能性があることから、ＣＭＴのコード配列の同定に特に有用である。核酸データベースを検索すれば１以上の候補（またはそれらの相補鎖）を含む配列が同定され、それによりＣＭＴ基質のＣ−マンノシル化において機能的に重要な遺伝子を発見する助けとなる。
【００３４】
本発明によれば、薬剤のスクリーニングに有用なキットも提供され、本質的にスクリーニングに有用なＣＭＴまたはその機能的同等物と使用説明書を含む。通常、このＣＭＴは１以上のＣＭＴ基質、（好ましくは本明細書に記載の膜結合融合タンパク質）、ＣＭＴ活性を検出するための手段および少なくとも１つの薬剤（推定薬剤）とともに提供される。
【００３５】
本発明のキットに用いられるＣＭＴは、例えば溶液、懸濁液または凍結乾燥したタンパク質の形で提供されてもよいし、あるいは、所望によりin situ発現系においてＣＭＴまたはその機能的同等物の生産を可能とする核酸配列の形で提供されてもよい。
【００３６】
また、Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の調節に有効な薬剤を同定する方法も提供され、該方法は（ａ）ＣＭＴ遺伝子を含む非ヒト野生型または遺伝子操作動物を提供する工程、（ｂ）その非ヒト動物に薬剤を投与する工程、および（ｃ）該薬剤が存在しない場合に比べ、ＣＭＴ活性が影響を受けたかどうかを判定する工程を含む。
【００３７】
また、本発明のスクリーニング方法によって同定された薬剤も提供される。本発明の薬剤は、前記の技術を用いてスクリーニングすることにより同定され、確立された手順に従って天然供給源から抽出することにより、または特に低分子量の化学薬剤の場合には合成によって調製され得る。タンパク系薬剤は、例えばバキュロウイルス系などの組換え発現系、または細菌系での発現により調製することができる。タンパク系薬剤は主としてＣＭＴの機能に対する研究に有用であるが、それらは治療用途も持ち得る。
【００３８】
一方、低分子量薬剤は好ましくは確立された手順に従う化学合成によって生産される。それらは主として治療薬として指示される。低分子量薬剤および有機薬剤は一般に、ＣＭＴ活性に依存する疾病または状態の処置に用いられる薬剤として有用であり得る。ＣＭＴ活性のモジュレーターは研究ツールとして、また種々の臨床の場で有用であり、従って、ＣＭＴ活性の調節が望ましい場合であればいつでも使用することができる。例えば、補体系の種々の成分がＣ−マンノシル化されていることが示されており、ＣＭＴインヒビターを種々の病理または治療状況下で補体系を操作するために使用できる。例えば、補体の活性化は臓器移植後の移植片拒絶反応(Bos, I.G., et al., 2002, Transfus. Med. Rev., 16: 251-264)、または虚血心筋の再潅流傷害(Monsinjon, T. et al., 2001, Fundam. Clin. Pharmacol., 15: 293-306)に関連づけられている。このような阻害は、著しくＣ−マンノシル化されていることが示されているプロパージンおよびＭＡＣのような補体の必須成分を不活性化することにより達成することができる。
【００３９】
同様に、細胞外マトリックスタンパク質（トロンボスポンジ−１および−２）、軸索誘導タンパク質、Ｆ−スポンジン、Ｍ−スポンジン、ＳＣＯ−スポンジン、セマフォリンＦおよびＧ、ＲＮアーゼ２、血管形成に関与するタンパク質（例えば、脳特異的アンジオゲニンインヒビターＢＡＩ−１、−２および−３）、メタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、アグレカナーゼ、ＧＯＮ−１、プロコラーゲンＩ Ｎ−プロテイナーゼ、ラクニン(lacunin)、ＴＲＡＰ、およびサイトカイン受容体（例えば、エリスロポエチン、成長ホルモン、プロラクチン、インターロイキン−２、−３、−４、−５、−６、−７、−９、−１１、−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、毛様体神経栄養因子、トロンボポエチン(thrombopoieitin)、カルシトニンおよびレプチンの受容体）のＣ−マンノシル化も、所望の作用を達成するために調節できる。よって、ＣＭＴ活性のモジュレーターは細胞増殖、シグナル伝達、神経再生および神経変性、血管形成、アポトーシス、免疫炎症、細胞輸送、タンパク質合成および輸送、ならびに寄生体−宿主相互作用の調節に有用である。
【００４０】
ＣＭＴ モジュレーター（アクチベーターまたはインヒビター）は、そのモジュレーターの厳密な性質に応じて常法に従って処方され得、通常には生物学的に許容される担体とともにモジュレーターまたはその前駆体を含む。種々の治療法を考慮する上で、そのような治療法はＣＭＴを発現することが実証されている組織にターゲッティングすることができると解される。
【００４１】
罹患細胞および組織へのこのモジュレーターの送達は、適当なパッケージングまたは投与系を用いて達成することができる。例えば、このモジュレーターは、治療用として医薬投与に許容される薬剤とともに処方され、所望の生理作用をもたらすよう、許容される経路によって被験体に送達することができる。有効量とは、所望の生理作用をもたらす量である。
【００４２】
本発明はまた、ＣＭＴ活性に依存する疾病または状態の治療処置または予防処置のための薬剤の製造のための、ＣＭＴ活性の特異的インヒビターも提供する。
【００４３】
［実施例］
これらの実施例は例示を目的として記載するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。アッセイのデザインおよび検出におけるバリエーションは、当業者には明らかである。
【００４４】
本開示および実施例に明示されてはいないが言及される分子遺伝学、タンパク質およびペプチドの生化学ならびに免疫学の方法は科学文献で報告されており、当業者に周知のものである。例えば、遺伝子操作の標準的な方法は、本質的にSambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989に記載されているようにして行われる。
【００４５】
実施例１：細胞に基づくＣＭＴ活性に関するアッセイ
本発明者らはＣＭＴ活性の効率的アッセイを考慮した細胞に基づく系をデザイン、構築および特性決定した。この系はここでは、修飾された場合に特異的抗体によって認識され得るＣ−マンノシル化モチーフを含む表面結合マーカータンパク質を用いて例示する。
【００４６】
ｃＤＮＡ構築物
可溶型ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ
ＰＣＲを用いて、そのＣ末端に、トロンビン切断部位とＣ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）の基質であるＡＷＡＫＷＡを含む、分泌型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ、Schistosoma japonicum製）をコードする構築物を作製した。好酸球由来神経毒由来のシグナル配列（ＥＤＮ；太字で示されている）を有するフォワードプライマー
【化１】
（配列番号２）(Newton, D.L. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 26739-26745)を、ｐＧＥＸ−２Ｔ(Pharmacia)のＧＳＴのＮ末端にアニーリングし、ＣＭＴ基質部位ＡＷＡＫＷＡ（配列番号１）をコードするリバースプライマー 5'-ATATGAATTCTCAGTCAGTCAAGCCCATTTAGCCCAAGCGGATCCACGCGGAACC-3'（配列番号３）をｐＧＥＸ−２ＴのＧＳＴのＣ末端のトロンビン配列にアニーリングした。このＰＣＲ産物を、ｐＳＭＣｉのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉ部位にサブクローニングし(Asselbergs, F.A. & Grand, P., 1993, Anal. Biochem., 209: 327-331)、ｐＳＭＣｉ−ｓｓＥＤＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＫＷＡ（配列番号１）を得た。縮重プライマーを用いた部位特異的突然変異誘発によりいくつかの異なるＣＭＴ基質を作製した。これらの構築物のうちの１つがタンパク質ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）をコードしており、これはＨＥＫ−２９３細胞内で発現された後、ＣＭＴにより効率的にＣ−マンノシル化（９０％）されることが分かり、修飾特異的抗体α５−１０(Krieg, J. et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 26687-26692)により認識された。この構築物を、このＣＭＴ基質の膜結合型をコードするｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）を作製するための鋳型として用いた。
【００４７】
細胞表面結合ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ
ヒトアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）のＮ末端膜アンカードメインをコードするｃＤＮＡを、Ｓｐｅ Ｉ制限部位を介してＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）をコードするｃＤＮＡと連結し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を用いて哺乳類発現ベクターｐＳＭＣｉへサブクローニングすることにより、細胞表面型のＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）を作製した。
【００４８】
ヒトアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ，２０４ｂｐ）の細胞質領域、膜貫通領域および主鎖領域を含む融合タンパク質のＮ末端部分を、フォワードプライマー
【化２】
（配列番号４）およびリバースプライマー
【化３】
（配列番号５）を用いて、鋳型ｐＴＥＪ４−ヒトＡＰＮ(Vogel, L.K. et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 2794-2797)からのＰＣＲによりクローニングした。このフォワードプライマーは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位（下線）とＫｏｚａｋ配列（太字）を含む。タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位（２１ｂｐ、太字）をリバースプライマーを介して導入し、それにＳｐｅ Ｉ制限部位（下線）が続いている。
【００４９】
融合タンパク質のＣ末端部分はＧＳＴを含み、その後にトロンビン切断部位およびＣＭＴ基質部位ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）が続いていた。Ｓｐｅ Ｉ制限部位（下線）を含むフォワードプライマー5'-GACTAGTTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3'（配列番号６）およびリバースプライマー5'-GCTCTAGAGAATTCCTATCAAGCCCACTGAGCCCAAGCGGAT-3'（配列番号７）を用いるＰＣＲにより、ｐＳＭＣｉ−ｓｓＥＤＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ ｃＤＮＡに由来する６９９ｂｐの断片が得られた。このリバースプライマーはＡＷＡＱＷＡ基質、停止シグナルおよびＥｃｏＲＩ制限部位（下線）を含んでいた。
【００５０】
ＰＣＲ産物をＱｉａＥｘＩＩ(Qiagen)を用いてゲル精製し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を介してｐＳＭＣｉ哺乳類発現ベクターに連結した。形質転換後、制限エンドヌクレアーゼで切断してクローンを選択し、その挿入部を両方向とも完全に配列決定した。この構築物をｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）と呼ぶ。
【００５１】
ｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）由来の挿入部を切り出し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を介してｐｃＤＮＡ３．１に連結した。得られた構築物ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）を用い、ネオマイシンの存在下で形質転換体を選択することにより安定細胞系統を確立した。ｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）挿入部のｃＤＮＡ配列（９２４ｂｐ）を以下に示す。
ATGGCCAAGGGCTTCTATATTTCCAAGTCCCTGGGCATCCTGGGGATCCTCCTGGGCGTGGCAGCCGTGTGCACAATCATCGCACTGTCAGTGGTGTACTCCCAGGAGAAGAACAAGAACGCCAACAGCTCCCCCGTGGCCTCCACCACCCCGTCCGCCTCAGCCACCACCAACCCCGCCTCGGCCACCACCTTGGACCAAAGTGAGAATTTGTATTTTCAGGGTACTAGTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCGCTTGGGCTCAGTGGGCT（配列番号８）
【００５２】
このｃＤＮＡによってコードされる翻訳配列（３０８ａａ）は
MAKGFYISKSLGILGILLGVAAVCTIIALSVVYSQEKNKNANSSPVASTTPSASATTNPASATTLDQSENLYFQGTSSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSAWAQWA（配列番号９）である。
【００５３】
これらの翻訳配列で、KSLGILGILLGVAAVCTIIALSVVYSQ（配列番号９のアミノ酸９〜３５）はＡＰＮの膜貫通領域であり、EKNKNANSSPVASTTPSASATTNPASATTLDQS（配列番号９のアミノ酸３６〜６８）はＡＰＮの主鎖ドメインであり、ENLYFQG（配列番号９のアミノ酸６９〜７５）はＴＥＶ切断部位であり、LVPRGS（配列番号９のアミノ酸２９７〜３０２）はトロンビン切断部位であり、また、AWAQWA（配列番号９のアミノ酸３０３〜３０８）はＣＭＴ基質である。
【００５４】
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）およびベビーハムスター腎細胞（Ｐｙ−ＢＨＫ）は１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで維持し、リポフェクタミン(Invitrogen)を用い、ｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）ｃＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの前日、細胞を２．５×１０６細胞／１００ｍｍディッシュに播種した。ＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造業者の説明書に従って調製した。各ディッシュにつき、８ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１(Invitrogen)に１０μｇのプラスミドＤＮＡおよび５０μｌのリポフェクタミンを加えた。７時間後、２０％ＦＣＳを添加した同量のＤＭＥＭを加え、一晩インキュベートした。翌朝、トランスフェクト細胞を新鮮培地でインキュベートし、さらに４８時間インキュベートした後、ＰＢＳ−０．０５％ＥＤＴＡ中に回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーにより分析するか、またはＴＥＶプロテアーゼで消化してＧＳＴ−融合タンパク質を回収した。細胞をｐｃＤＮＡ３．１−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）およびｐｃＤＮＡ３．１／ＨｙｇｒｏＣＤ５９で同時トランスフェクトし、ネオマイシンとハイグロマイシンを含有する培地でクローンを選択することにより、細胞表面でＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）とＣＤ５９を発現する安定細胞系統を作製した。
【００５５】
フローサイトメトリー
細胞表面タンパク質発現を検出するためのウサギ抗ＧＳＴ(Sigma)か、マンノシル化ＣＭＴ基質を同定するためのウサギα５−１０抗体かいずれかで細胞を標識した。発明者らはこれまでに、α５−１０抗体がマンノシル化型のＣＭＴ基質に特異的であり、修飾されていないタンパク質は認識しないことを実証している(Krieg, J. et al., 1997)。細胞を４０μｍのストレイナー(Falcon)で濾過し、計数し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＮ３、５％正常ヤギ血清）中に１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。氷上で３０分インキュベーションした後、１００μｌの細胞を、ブロッキングバッファー中に５μｇ／ｍｌに希釈した１００μｌの一次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄バッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＮ３）で洗浄した後、それらをブロッキングバッファー中に１：２００希釈した１００μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch)とともに４℃で３０分間インキュベートした。染色された細胞を洗浄し、５００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁させ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒにて、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。陰性対照は、正常ウサギＩｇＧでプローブしたトランスフェクト細胞、または特定の抗体とともにインキュベートした非トランスフェクト細胞からなった。この抗ＧＳＴ抗体は、約５０％の細胞がそれらの表面上でＧＳＴ−ＣＭＴ基質融合タンパク質を発現したことを示した。このタンパク質の大部分は、α５−１０抗体での染色によって示されるように、Ｃ−マンノシル化されていた。陰性対照は低いバックグラウンド染色を示した。このように、細胞表面で発現されたＣＭＴ基質のＣ−マンノシル化が初めて確立され、細胞に基づくアッセイの簡単な形式が提供された。
【００５６】
実施例２：細胞に基づくＣＭＴ活性に関するアッセイ
この系はここでは、タンパク質化学分析によって認識され得るＣ−マンノシル化モチーフを含む表面結合マーカータンパク質を用いて例示する。その方法論は、タンパク質化学分析が上記で用いたフローサイトメトリーに取って代わるか、または補足すること以外は、本質的に実施例１に記載した通りである。
【００５７】
タンパク質化学分析
発現したＣＭＴ基質をトランスフェクト細胞から精製し、ＬＣ−ＭＳにより、本質的に次のようにしてＣ−マンノシル化ペプチドの存在に関して分析した。約５×１０７細胞をｐＳＭＣｉ−ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）ｃＤＮＡでトランスフェクトし、上記のように回収した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞ペレットを最終量５００μｌのＴＥＶバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。１００単位のＴＥＶプロテアーゼ(Invitrogen)を加え、１６℃で７時間穏やかに混合した。ＦＡＣＳ分析によれば、インキュベーション５分後に、７０％を超えるＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡタンパク質（配列番号１）が細胞表面から遊離したことが示された。
【００５８】
細胞をペレットとし、上清を遠心分離によりさらに明澄化した。この上清を、１０％ＦＣＳおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（１ｍｌ ４０％ＤＭＳＯ、６０％エタノール中、５ｍｇのベンズアミジン、１ｍｇのペプスタチンＡ、１ｍｇのロイペプチン、１ｍｇのアンチペイン、１ｍｇのアンチキモトリプシン、２０ｍｇのＰＭＳＦを含有する５００倍保存溶液２０μｌ）を含有するＤＭＥＭ１０ｍｌで希釈し、回転機上、４℃で一晩、グルタチオン−アガロースビーズ(Amersham Pharmacia)とともにインキュベートした。このサンプルをＢｉｏＲａｄカラムに移し、ビーズを３ｍｌのバッファーＡ（５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴを含有するＰＢＳ）、次いで３ｍｌのバッファーＢ（２５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ）で洗浄し、３ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の最終洗浄を行った。次に、洗浄したビーズを２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ 還元型グルタチオン、２ｍＭ ＤＴＴ中、３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。このカラムをＭｉｃｒｏｃｏｎ ＵｌｔｒａＦｒｅｅ ｔｕｂｅ上に置き、３分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。溶出したＧＳＴ融合タンパク質を含む濾液をさらにＣ４カラムを用いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。このカラムを溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸ＴＦＡ）で平衡化し、２０％溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮ）で洗浄し、３０分にわたり溶媒Ｂの直線的配を用いて溶出させた。このタンパク質を２１４ｎｍでモニタリングした。ＣＭＴ基質ペプチドを、トロンビンでの切断によりＧＳＴ融合タンパク質から遊離した。乾燥させたタンパク質のピーク（約１０μｇ）を５μｌの９Ｍ尿素に溶解した後、４３μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および２μｌ（４単位）のトロンビンを添加し、室温で１時間インキュベートした。ペプチドの分析は、０．０５％ＴＦＡ、２％ＣＨ３ＣＮで平衡化したＣ１８カラムを用いてＬＣ−ＭＳにより行い、３０分にわたり２０〜８０％の溶媒Ｂ（０．０４５％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮ）の直線勾配を用いて展開した。このＨＰＬＣを、ＡＰＩ３００質量分光光度計のインターフェースと接続した。ＧＳＡ（マンノース）ＷＡＱＷＡ（１０３８Ｄａ；配列番号９のアミノ酸３０４〜３０８）およびＧＳＡＷＡＱＷＡ（８７６Ｄａ；配列番号９のアミノ酸３０１〜３０８）に関して期待された質量のペプチドが認められた。
【００５９】
この実施例はＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質と修飾されていない同等物の質量を確認することにより本発明を例示するものであるが、当業者には、他の方法が、例えば検出可能な標識または抗体を用い、細胞表面から遊離した修飾ＣＭＴ基質の存在を確認するためのハイスループット形式のために容易に考案できることが明らかである。
【００６０】
実施例３：細胞に基づくＣＭＴ活性に関するアッセイ
この実施例では、細胞基質からＣＭＴ基質を遊離させるためにプロテアーゼを用いる代わりに、分泌型のＣＭＴ基質が用いられる。ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）融合タンパク質は、実施例１に記載のｐＳＭＣｉ−ｓｓＥＤＮ−ＧＳＴ−ＡＷＡＱＷＡ（配列番号１）でトランスフェクトされた細胞のコンディショニング培地から得られた。このコンディショニング培地を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ｐｌｕｓ−８０チューブ(Millipore)を用いる限外濾過により３５倍に濃縮した。ＧＳＴ融合タンパク質の精製、およびその後のペプチドの遊離は実施例２に記載のように行った。
【００６１】
実施例４：細胞に基づくＣＭＴインヒビターに関するスクリーニング
ＣＭＴインヒビターとしての薬剤の効率的なスクリーニングのためには、実施例１に記載のアッセイを用いることができる。阻害剤は、細胞への抗体の結合が存在しない、または低下していることによって検出できる。さらに、Ｃ−マンノシル化はＤＰＭを必要とする。グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含む、ＣＤ５９などの第２のリポーター分子を所望により含めてもよく、これはＤＰＭ合成経路のインヒビターを排除する陽性マーカーとして機能する。
【００６２】
要するに、ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＷＡＱＷＡ、また所望によりＣＤ５９を安定発現するヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を、約２０％のコンフルエンシーで３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種する。試験薬剤または試験薬剤の組合せをＤＭＳＯ中の保存液として最終濃度１ｍＭ〜１０ｍＭまで、または当業者には明らかなように、他の好適な濃度または溶媒を加えることができる。薬剤を添加した後、細胞を約９０％のコンフルエンシーまで増殖させ、洗浄し、ＡＰＣで蛍光標識されたα５−１０抗体、およびＦＩＴＣ標識でされた抗ＣＤ５９抗体で染色する。抗体の結合２１００ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ装置(Perkin Elmer)で測定する。非処理対照に比べてα５−１０の結合が低下したが、抗ＣＤ５９の結合には作用しない薬剤がＣＭＴ活性の可能性のある特異的インヒビターであり、すなわち、それらはさらなる細胞機能を有するドリコールリン酸マンノース（ＤＰＭ）合成経路には影響を及ぼさない。
【００６３】
実施例５：細胞に基づくＣＭＴインヒビターに関する
ＡＰＮ−ＧＳＴ−ＷＡＱＷＡとＣＤ５９を安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載のようにＴＥＶプロテアーゼで処理する。プロテアーゼを洗い流した後、細胞を約５０％のコンフルエンシーで３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種する。ＤＭＳＯ中の保存液として最終濃度１ｍＭ〜１０ｍＭまで加え、１８時間および３６時間インキュベーションを続ける。抗体の結合およびインヒビターの確認については、実施例４に記載のようにアッセイする。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性をアッセイする方法であって、
ｉ）ＣＭＴと融合タンパク質を含む細胞を準備する工程（該融合タンパク質はＣＭＴ基質と膜貫通ドメインを含む）、
ｉｉ）該細胞において該ＣＭＴ基質に対する該ＣＭＴの作用によりＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の形成を誘導し得る条件を提供する工程、および
ｉｉｉ）該細胞表面上で該Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
該基質の該Ｃ−マンノシル化が抗体を用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該抗体がＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質に特異的である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該基質の該Ｃ−マンノシル化が標識を用いて検出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該融合タンパク質をプロテアーゼで切断することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性の調節に有効な薬剤を同定する方法であって、推定薬剤の存在下において請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法の工程を行い、かつＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の量の増加または減少を検出する段階を含む方法。
【請求項７】
Ｃ−マンノシル化の量の低下が達成され、該調節がＣＭＴ活性の阻害である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｃ−マンノシル化の量の増加が達成され、該調節がＣＭＴ活性の活性化である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＧＰＩアンカーの存在を検出することをさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項によって同定された薬剤。
【請求項１】
Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性をアッセイする方法であって、
ｉ）ＣＭＴと融合タンパク質を含む細胞を準備する工程（該融合タンパク質はＣＭＴ基質と膜貫通ドメインを含む）、
ｉｉ）該細胞において該ＣＭＴ基質に対する該ＣＭＴの作用によりＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の形成を誘導し得る条件を提供する工程、および
ｉｉｉ）該細胞表面上で該Ｃ−マンノシル化ＣＭＴ基質を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
該基質の該Ｃ−マンノシル化が抗体を用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該抗体がＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質に特異的である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該基質の該Ｃ−マンノシル化が標識を用いて検出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該融合タンパク質をプロテアーゼで切断することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｃ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）活性の調節に有効な薬剤を同定する方法であって、推定薬剤の存在下において請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法の工程を行い、かつＣ−マンノシル化ＣＭＴ基質の量の増加または減少を検出する段階を含む方法。
【請求項７】
Ｃ−マンノシル化の量の低下が達成され、該調節がＣＭＴ活性の阻害である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｃ−マンノシル化の量の増加が達成され、該調節がＣＭＴ活性の活性化である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＧＰＩアンカーの存在を検出することをさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項によって同定された薬剤。
【公表番号】特表２００６−５０１８３３（Ｐ２００６−５０１８３３Ａ）
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４２４６１（Ｐ２００４−５４２４６１）
【出願日】平成１５年１０月８日（２００３．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１１３９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３３７１２
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５０２４０７３３６）ノバルティス・フォルシュングスシュティフトゥング・ツヴァイクニーダーラッスング・フリードリッヒ・ミーシェー・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｗｅｉｇｎｉｅｄｅｒｌａｓｓｕｎｇ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月８日（２００３．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１１３９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３３７１２
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５０２４０７３３６）ノバルティス・フォルシュングスシュティフトゥング・ツヴァイクニーダーラッスング・フリードリッヒ・ミーシェー・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｗｅｉｇｎｉｅｄｅｒｌａｓｓｕｎｇ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【Ｆターム（参考）】
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