本発明は、ランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドを含むポリペプチドライブラリー及びそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸ライブラリーに関する。本発明はまた、ランダム化ポリペプチド及びポリペプチドライブラリーを生成するための方法に関する。本発明は、対象の標的分子に対する修飾ＣＴＬＤの特異的な結合に基づいて、ポリペプチド及び核酸のライブラリーをスクリーニングするための方法にさらに関する。本発明はまた、対象の標的分子に結合するようなライブラリーに由来するポリペプチドにも関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーであって、ＣＴＬＤループ領域は、ループ１〜４を含有するループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループ５を含有するループセグメントＢ（ＬＳＢ）を含み、且つ以下のスキーム：
（ａ）ループ１における少なくとも１つのアミノ酸の挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｂ）ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換及びループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｃ）ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｄ）ループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｅ）２つのループを組み合わせて単一のループにする修飾を含み、２つの組み合わせられたループがループ３及びループ４である、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｆ）ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｇ）ループ３における少なくとも５つのアミノ酸残基のランダム置換及びループ５内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるアミノ酸修飾；
（ｈ）ループ３における少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６つのアミノ酸の挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｉ）（１）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換並びに（２）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１つのアミノ酸挿入の混合物を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；並びに
（ｊ）ループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける少なくとも４つ以上のアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つ又はＣＴＬＤのループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ５におけるアミノ酸修飾
の１つによってランダム化される、上記コンビナトリアルポリペプチドライブラリー。
【請求項２】
ＣＴＬＤは、以下の二次構造：
（ａ）β１、α１、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順で連続して現われる、一方はβ１及びβ５から構成され、他方はβ２、β３、及びβ４から構成される２つの逆平行β−シートで配置する５つのβ−ストランド及び２つのα−ヘリックス；
（ｂ）少なくとも２つのジスルフィド架橋、α１とβ５をつなぐジスルフィド架橋及びβ３と、β４とβ５をつなぐポリペプチドセグメントをつなぐジスルフィド架橋；並びに
（ｃ）β２とβ３をつなぐループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びβ３とβ４をつなぐループセグメントＢ（ＬＳＢ）
を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
Ｃ末端方向に、ループ２のＣ末端に隣接して位置するアミノ酸のランダム置換をさらに含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
ＣＴＬＤは、ヒトテトラネクチン由来のものであり、アルギニン−１３０のランダム置換をさらに含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項５】
ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のものであり、リシン−１４８のアラニンへの置換をさらに含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項６】
アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、及びリシン−１４８のアラニンへの置換を含む、スキーム（ａ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項４に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項７】
アミノ酸修飾は、ループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む、スキーム（ｃ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項８】
アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入、及びループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換を含む、請求項７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項９】
アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入をさらに含む、スキーム（ｄ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１０】
アミノ酸修飾は、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む、請求項９に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１１】
アミノ酸修飾は、ループ３における３つのアミノ酸挿入を含む、請求項１０に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１２】
アミノ酸修飾は、ループ４における３つのアミノ酸挿入を含む、請求項１１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１３】
アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及びループ４における少なくとも４つのアミノ酸のランダム置換を含む、スキーム（ｅ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１４】
ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチンであり、アミノ酸修飾は、プロリン−１４４のランダム置換をさらに含む、請求項１３に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１５】
組み合わせられたループ３及びループ４のアミノ酸配列は、ＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号５７８）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸であり、配列番号５７８のアミノ酸配列は、単一のループ領域を形成する、請求項１４に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１６】
アミノ酸修飾は、ループ４における４つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、スキーム（ｆ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１７】
ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整するループ４領域の１つ又は複数のアミノ酸修飾をさらに含む、スキーム（ｇ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１８】
ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のものであり、ループ４に対する修飾は、リシン１４８のアラニンへの置換を含む、請求項１７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１９】
ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のものであり、アミノ酸修飾は、イソロイシン１４０のランダム置換を含む、スキーム（ｈ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２０】
ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整する、ループ４領域における１つ又は複数のアミノ酸修飾をさらに含む、請求項１９に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２１】
ループ４に対する修飾は、リシン１４８のアラニンへの置換を含む、請求項２０に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２２】
アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、（１）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換；（２）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１つのアミノ酸挿入；並びに（３）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも２つのアミノ酸挿入の混合物を含む、スキーム（ｉ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２３】
ＣＴＬＤは、ループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループの２つ、３つ、４つ、又は５つの任意の組み合わせにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む、請求項２に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリー。
【請求項２４】
アミノ酸修飾は、ＬＳＡ及びＬＳＢ以外のＣＴＬＤアミノ酸に対する修飾を含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２５】
ＣＴＬＤは、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤである、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２６】
ＣＴＬＤは、マウステトラネクチンのＣＴＬＤである、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２７】
ポリペプチドメンバーは、ＣＴＬＤのＮ末端伸長部分及びＣ末端伸長部分の少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２８】
Ｎ末端伸長部分及びＣ末端伸長部分の少なくとも１つは、エフェクター機能、酵素機能、さらなる結合機能、又は多量体形成機能を提供するポリペプチドを含む、請求項２７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２９】
Ｎ末端伸長部分及びＣ末端伸長部分の少なくとも１つは、天然Ｃ型レクチン様タンパク質又はＣ型レクチン又は機能的膜貫通ドメインを欠くＣ型レクチンの非ＣＴＬＤ部分を含む、請求項２７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３０】
タンパク質は、ＣＴＬＤを含む成分の多量体である、請求項２９に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３１】
請求項１に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリー。
【請求項３２】
ライブラリーの核酸分子は、ディスプレイ系において発現され、ディスプレイ系は、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を含む、請求項３１に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項３３】
ディスプレイ系は、ファージディスプレイ系；酵母ディスプレイ系；ウイルスディスプレイ系；細胞ベースのディスプレイ系；リボソーム連結ディスプレイ系；及びプラスミド連結ディスプレイ系から選択される、請求項３１に記載の核酸分子のライブラリーを含むディスプレイ系。
【請求項３４】
ＣＴＬＤのＬＳＡ領域における４つのループの少なくとも１つにおいて少なくとも１つのランダム突然変異を生成することによって、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかを引き起こすことを含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリーを生成するための方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのランダム突然変異は、オリゴヌクレオチド特異的ランダム化；ランダムな断片化によるＤＮＡシャフリング；ループシャフリング；ループウォーキング；又はエラープローンＰＣＲ突然変異誘発によって引き起こされる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
標的分子に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定する及び単離するための方法であって、
（ａ）請求項１に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供するステップ、
（ｂ）ポリペプチドと標的分子の間の結合を可能にする条件下でコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップ、並びに
（ｃ）標的分子に結合するポリペプチドを単離するステップを含む、上記方法。
【請求項３７】
方法は、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーをさらに含み、核酸のライブラリーは、ディスプレイ系において発現され、ディスプレイ系は、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
標的分子に特異的に結合することができるポリペプチドの同定及び単離のための方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドライブラリーをコードする核酸分子のライブラリーを提供するステップ、
（ｂ）ディスプレイ系において核酸分子のライブラリーを発現させて、１つ又は複数の配列位置のアミノ酸残基が、その異なるメンバーの間で異なるポリペプチド集合体を得るステップ、
（ｃ）ポリペプチドと標的分子の間の結合を可能にする条件下でポリペプチド集合体を前記標的分子と接触させるステップ、並びに
（ｄ）前記標的分子に結合することができるポリペプチドを単離するステップを含む、上記方法。
【請求項３９】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有するポリペプチドであって、ポリペプチドは、そのＣＴＬＤの自然の標的以外の標的に結合し、ＣＴＬＤのＣＴＬＤ骨格構造は、請求項１に記載のスキームのいずれかに従って修飾されている、上記ポリペプチド。
【請求項４０】
ヒトテトラネクチンのＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有し、ヒトテトラネクチンの自然の標的以外の標的に結合する、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ポリペプチドと標的分子の間の結合を可能にする条件下で請求項１に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップ並びに標的分子に結合するポリペプチドを単離するステップを含み、標的分子は、ＣＴＬＤの自然の標的ではない、請求項３９に記載のポリペプチドを生成するための方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】


【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【公表番号】特表２０１３−５０７１２３（Ｐ２０１３−５０７１２３Ａ）
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３３１４３（Ｐ２０１２−５３３１４３）
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３８０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４３８３４
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５０８２５３６２７）アナフォア　インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ａｎａｐｈｏｒｅ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】