キメラ抗体を含めて、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）抗原タンパク質に特異的な組換え抗体を提供する。組換え抗体は、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合し、したがって、例えば、ＨＣＶ検出用診断試薬として、及び／又はＨＣＶ検出アッセイにおける標準化試薬若しくは正の対照試薬としての使用に適切である。組換え抗体は、ＨＣＶ感染症の治療又は予防に使用することもできる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、組換え抗体の分野に関し、特に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するキメラ抗体を含めた組換え抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、現在、輸血後非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の主因とされている。ＨＣＶは、フラビウイルス及びペスチウイルスと類似点を有する一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり（Ｍｉｌｌｅｒ ＲＨ ａｎｄ Ｐｕｒｃｅｌｌ ＲＨ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． （１９９１） ８７， ２０５７； Ｗｅｉｎｅｒ ＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９０） １８０， ８４２）、全世界に分布する。ＨＣＶは、約３０００個のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする約１０，０００ヌクレオチドのプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。ポリタンパク質は、細胞及びウイルスプロテアーゼによって成熟構造及び非構造タンパク質に同時翻訳及び翻訳後処理される。構造タンパク質としては、コアタンパク質、エンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２などが挙げられる。非構造タンパク質としては、ＮＳ２−３自己プロテアーゼ、ＮＳ３セリンプロテアーゼ、ＮＳ３のカルボキシ末端２／３中のＮＴＰａｓｅ／ＲＮＡヘリカーゼドメイン、ＮＳ４Ａポリペプチド、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。ＨＣＶゲノムは、不均質であり、６つの主要な遺伝子型（１−６）に分類され、そのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列は、ゲノム全体にわたって約３０％変動する（Ｎｅｖｉｌｌｅ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３５： ３０６２−３０７０（１９９７）参照）。
【０００３】
ＨＣＶ感染は、現在、ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの直接検出によって、又は（一般に、ＨＣＶ構造コアタンパク質又は非構造ＮＳ３タンパク質に対する）抗ＨＣＶ抗体の検出によって、診断される。より最近では、ＨＣＶ抗原アッセイが開発され、抗体を検出するよりも速く試料中のＨＣＶコアタンパク質抗原を検出することができることを示した。研究によれば、最初のウイルス血症性出血から最初のＨＣＶ抗原陽性出血までの平均時間は２．０日と推定され、最初のＨＣＶ抗体陽性出血までの平均時間は５０．８日と推定される（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， （２０００） ４０， １１９８−１２０２）。
【０００４】
抗ＨＣＶ抗体を用いた現在利用可能なＨＣＶ試験キットは、モノクローナル抗体を使用する。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近年ますます重要な市販試薬となってきており（Ｓｍｉｔｈ， Ｋ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．， ５７： ９１２−９１７（２００４）参照）、特に診断学及び治療学の領域では、ｍＡｂが示す極めて高度な定方向性結合がその成功に寄与している。
【０００５】
組換えＤＮＡ技術における最近の進歩によって、ｍＡｂをコードする配列をクローン化し、抗体又は抗体断片を組換えタンパク質として発現させることが可能になった。組換え抗体は、元のハイブリドーマよりも組換え構築物からより一貫して、より確実に製造できることが多い。組換えＤＮＡ技術によって、所望の非ヒトｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変領域とヒト定常領域を組み合わせて、キメラ抗体を作製することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び同６，３３１，４１５号参照）。キメラ抗体は、元の非ヒトモノクローナル抗体の特異性及び親和性を保持するが、治療投与したときにヒト抗ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）反応が低下し、ヒト免疫グロブリンを測定する既存の診断アッセイ形式においても反応し得る。
【０００６】
ＨＣＶに対するモノクローナル及び組換え抗体は、記述されている。例えば、米国特許第５，５９５，８６８号、同７，０４９，０６０号及び米国特許出願公開第２００３／０１４８３３３号は、ＨＣＶコアタンパク質に対するモノクローナル抗体を記載し、米国特許出願公開第２００４／０２０８８８７号は、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を記載し、米国特許第５，３０８，７５０号及び同７，０９１，３２４号は、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を記載し、米国特許第５，７５３，４３０号は、ＨＣＶコアタンパク質、ＮＳ３タンパク質及びＮＳ４タンパク質に対するモノクローナル抗体を記載する。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なヒト組換え抗体、特にヒト抗体由来のＦａｂ断片は、米国特許出願公開第２００４／０２１４９９４号に記載されている。ＨＣＶの超可変領域１（ＨＶＲ１）に対するキメラ抗体は記述されている（Ｌｉ， Ｃ． ａｎｄ Ａｌｌａｉｎ， Ｊ−Ｐ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ８６： １７０９−１７１６（２００５））。ＨＶＲ１は、Ｅ２タンパク質のＮ末端における２７個の残基からなる高度変異領域である。
【０００７】
「異種」キメラ抗体を免疫測定法の品質管理試薬又は較正用物質として使用することは記述されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒ．Ｇ．， Ａｎｎ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ．， ４８： ４７３−４７７（１９９０）； Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒ．Ｇ．， Ａｎｎ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ．， ４９： ２４２−２４８（１９９１）； Ｎａｅｓｓ， Ｌ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９６： ４１−４９； Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９９： ５４５−５５０（１９９７））。本明細書では異種とは、キメラ抗体が、抗体検出アッセイに用いられる抗原とは無関係な抗原に結合することを指す。ヒト抗体を測定するアッセイ及びキットにおける較正用物質又は正の対照としての、同じ又は「相同」抗原に結合する組換えマウス−ヒトキメラ抗体、特にトキソプラズマ ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）に対する組換えマウス−ヒトキメラ抗体の使用も記述されている（米国特許第６，０１５，６６２号及びＨａｃｋｅｔｔ， Ｊ． Ｊｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３６： １２７７−１２８４））。
【０００８】
さらに、多くのＨＣＶ免疫測定法は、ＨＣＶ感染患者の血液試料を使用して、ＨＣＶ感受性パネルを調製する。感受性パネルなどの品質管理試薬は、特定のエピトープに対する抗体の存在に関してスクリーニングされたヒト血しょう／血清である。しかし、ヒト血清／血しょうの使用は、高まった法規制上の問題、高力価及び特異性を有する大容量を供給する困難さ、ロット間変動、特性分析に関する限界、並びにコストを含めて、幾つかの重大な欠点を有する。
【０００９】
この背景情報は、出願人が考える公知情報を本発明に関連し得るようにする目的で提供するものである。前述の情報のいずれかが本発明に対する従来技術を構成することを必ずしも認めるものではなく、構成すると解釈すべきでもない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，８１６，５６７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３３１，４１５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５９５，８６８号明細書
【特許文献４】米国特許第７，０４９，０６０号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１４８３３３号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００４／０２０８８８７号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３０８，７５０号明細書
【特許文献８】米国特許第７，０９１，３２４号明細書
【特許文献９】米国特許第５，７５３，４３０号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００４／０２１４９９４号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，０１５，６６２号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ ＲＨ ａｎｄ Ｐｕｒｃｅｌｌ ＲＨ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． （１９９１） ８７， ２０５７
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒ ＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９０） １８０， ８４２
【非特許文献３】Ｎｅｖｉｌｌｅ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３５： ３０６２−３０７０（１９９７）
【非特許文献４】Ｃｏｕｒｏｕｃｅ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， （２０００） ４０， １１９８−１２０２
【非特許文献５】Ｓｍｉｔｈ， Ｋ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．， ５７： ９１２−９１７（２００４）
【非特許文献６】Ｌｉ， Ｃ． ａｎｄ Ａｌｌａｉｎ， Ｊ−Ｐ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ８６： １７０９−１７１６（２００５）
【非特許文献７】Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒ．Ｇ．， Ａｎｎ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ．， ４８： ４７３−４７７（１９９０）
【非特許文献８】Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒ．Ｇ．， Ａｎｎ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ．， ４９： ２４２−２４８（１９９１）
【非特許文献９】Ｎａｅｓｓ， Ｌ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９６： ４１−４９
【非特許文献１０】Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９９： ５４５−５５０（１９９７）
【非特許文献１１】Ｈａｃｋｅｔｔ， Ｊ． Ｊｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３６： １２７７−１２８４）
【発明の概要】
【００１２】
本発明の一目的は、キメラ抗体を含めて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する組換え抗体、及びその使用を提供することである。本発明の一態様によれば、キメラ抗体を含めて、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能である１種類以上の組換え抗体を含む、免疫診断試薬を提供する。キメラ抗体を含めた１種類以上の組換え抗体は、ＨＣＶコアタンパク質に特異的な組換え抗体、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的な組換え抗体、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的な組換え抗体、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的な組換え抗体、及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的な組換え抗体からなる群から選択してもよい。
【００１３】
本発明の別の一態様によれば、キメラ抗体を含めて、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合する組換え抗体を提供する。該診断関連領域は、ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質からなる群から選択してもよい。
【００１４】
本発明の別の一態様によれば、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するキメラ抗体を発現する能力のある細胞系を提供する。該細胞系は、ＨＣＶコアＣＨＯ ２０１−６０３−４８６−３３３、ＨＣＶコアＣＨＯ １４−１５３−２２９ｓｃ１５２、ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１、ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３及びＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５からなる群から選択してもよい。Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を発現する細胞系も提供する。該細胞系は、抗ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５、抗ＨＣＶコア１４−１５３−４６２、抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７、抗ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４及び抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７からなる群から選択してもよい。
【００１５】
本発明の別の一態様によれば、組換えキメラ抗体を含めて、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能である１種類以上の組換え抗体を含んでもよい免疫診断試薬を感受性パネルとして使用することを含む、ＨＣＶ抗体検出アッセイを標準化する方法を提供する。かかるパネルにおいては、１種類以上の組換え抗体を、ＨＣＶコアタンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）からなる群から選択してもよい。
【００１６】
本発明の別の一態様によれば、ＨＣＶ抗原を含む疑いのある試料などの試験試料を、組換えキメラ抗体を含めて、その各々がＨＣＶ抗原に特異的に結合可能である１種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬と接触させることを含む、ＨＣＶ抗原の存在を検出する方法を提供する。接触は、組換え抗体：抗原複合体の形成を可能にする条件下で行ってもよい。また、方法は、形成された任意の組換え抗体：抗原複合体を検出することを含んでもよい。
【００１７】
本発明の別の一態様によれば、ＨＣＶに対する抗体を含む疑いのある試料などの試験試料を、ＨＣＶ抗体に特異的な１種類以上の抗原と接触させることを含む、ＨＣＶ抗体の存在を検出する方法を提供する。この接触は、抗原：抗体複合体の形成を可能にする条件下で行ってもよく、また、方法は、抗原：抗体複合体を検出することを含んでもよい。さらに、方法は、組換えキメラ抗体を含めて、１種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬を使用することを含んでもよく、抗体の各々は、例えば、正の対照又は標準化試薬として、方法に使用される抗原の１種類に特異的に結合可能である。
【００１８】
本発明の別の一態様によれば、組換えキメラ抗体を含めて、その各々がＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能である１種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬を含む、ＨＣＶ検出用診断キットを提供する。かかるキットにおいては、１種類以上の組換え抗体を、ＨＣＶコアタンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）、及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的な組換え抗体（例えば、キメラ抗体）からなる群から選択してもよい。
【００１９】
本発明の更に別の一態様によれば、ＨＣＶタンパク質エピトープに特異的に結合する抗体によって結合される、ＨＣＶタンパク質エピトープ内のアミノ酸残基を特定する方法を提供する。方法は、（ａ）宿主細胞（すなわち、酵母細胞）の表面に提示された一連のペプチドを含む酵母ディスプレイライブラリーを得る段階であって、ペプチドがエピトープのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、エピトープの個々のアミノ酸がアラニンで順次置換されている段階、（ｂ）酵母ディスプレイライブラリーを、エピトープに特異的に結合可能である抗体と、抗体とエピトープの結合を可能にする条件下で接触させる段階、及び（ｃ）段階（ｂ）において前記抗体によって結合されない、酵母細胞上に提示されたペプチドを特定する段階を含んでもよく、抗体結合の欠如によって、酵母によって提示されたペプチドが、エピトープ中の前記抗体によって結合されるアミノ酸位置にアラニン残基を含むことが示される。
【００２０】
本発明のこれら及び別の特徴、態様、目的及び実施形態は、以下の詳細な説明によってより明白になるはずである。かかる特徴、態様、目的及び実施形態の例示である添付図面を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態において抗ＨＣＶコアキメラ抗体（ＨＣＶコア２０１−６０３−４８６−３３３）の調製に用いられる発現プラスミドのプラスミドマップを示す図である。
【図２】図２のＡ−Ｄは、抗ＨＣＶコアキメラ抗体（ＨＣＶコア２０１−６０３−４８６−３３３）の軽鎖及び重鎖可変領域の本発明の一実施形態における核酸及びアミノ酸配列を示す図であり、下線は、それぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。Ａ：Ｖ_Ｈ核酸配列（配列番号７）、Ｂ：Ｖ_Ｌ核酸配列（配列番号８）、Ｃ：Ｖ_Ｈアミノ酸配列（配列番号１）及びＤ：Ｖ_Ｌアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】本発明の一実施形態において抗ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１）の調製に用いられる発現プラスミドのプラスミドマップを示す図である。
【図４】図４のＡ−Ｄは、抗ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１）の軽鎖及び重鎖可変領域の本発明の一実施形態における核酸及びアミノ酸配列を示す図であり、下線は、それぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。Ａ：Ｖ_Ｈ核酸配列（配列番号１５）、Ｂ：Ｖ_Ｌ核酸配列（配列番号１６）、Ｃ：Ｖ_Ｈアミノ酸配列（配列番号９）及びＤ：Ｖ_Ｌアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５】本発明の一実施形態において抗ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３）の調製に用いられる発現プラスミドのプラスミドマップを示す図である。
【図６】図６のＡ−Ｄは、抗ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３）の軽鎖及び重鎖可変領域の本発明の一実施形態における核酸及びアミノ酸配列を示す図であり、下線は、それぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。Ａ：Ｖ_Ｈ核酸配列（配列番号２３）、Ｂ：Ｖ_Ｌ核酸配列（配列番号２４）、Ｃ：Ｖ_Ｈアミノ酸配列（配列番号１７）及びＤ：Ｖ_Ｌアミノ酸配列（配列番号１８）。
【図７】本発明の一実施形態において抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５）の調製に用いられる発現プラスミドのプラスミドマップを示す図である。
【図８】図８のＡ−Ｄは、抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５）の軽鎖及び重鎖可変領域の本発明の一実施形態における核酸及びアミノ酸配列を示す図であり、下線は、それぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。Ａ：Ｖ_Ｈ核酸配列（配列番号３１）、Ｂ：Ｖ_Ｌ核酸配列（配列番号３２）、Ｃ：Ｖ_Ｈアミノ酸配列（配列番号２５）及びＤ：Ｖ_Ｌアミノ酸配列（配列番号２６）。
【図９】図９のＡ−Ｄは、本発明の一実施形態においてコア、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５キメラ抗体によって結合されるエピトープを示す図である。Ａは、抗ＨＣＶコアキメラ抗体（ＨＣＶコア２０１−６０３−４８６−３３３）によって結合されるエピトープ（配列番号３４）を示し、Ｂは、抗ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１）によって結合されるエピトープ（配列番号３５）を示し、Ｃは、抗ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３）によって結合されるエピトープ（配列番号３６）を示し、Ｄは、抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体（ＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５）によって結合されるエピトープ（配列番号３７）を示し、それぞれのキメラ抗体によって結合される特異的残基には下線が引かれ、付番されている。
【図１０】抗ＨＣＶコアキメラ抗体（「コア」、ＨＣＶコア２０１−６０３−４８６−３３３）、抗ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体（「ＮＳ３」、ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１）、抗ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体（「ＮＳ４」、ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３）及び抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体（「ＮＳ５」、ＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５）についての３週齢培養物のＨＰＬＣ分析によって評価した典型的な研究開発規模での平均キメラ抗体産生を示すグラフである（すなわち生細胞は約２０−１０％であった。）。
【図１１】図１１のＡ−Ｄは、抗ＨＣＶコアキメラ抗体（ＨＣＶコア１４−１５３−２２９ｓｃ１５２）の軽鎖及び重鎖可変領域の本発明の一実施形態における核酸及びアミノ酸配列を示す図であり、下線は、それぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。Ａ：Ｖ_Ｈ核酸配列（配列番号４０）、Ｂ：Ｖ_Ｌ核酸配列（配列番号４１）、Ｃ：Ｖ_Ｈアミノ酸配列（配列番号３８）及びＤ：Ｖ_Ｌアミノ酸配列（配列番号３９）。
【図１２】本発明の一実施形態において抗ＨＣＶコアキメラ抗体（ＨＣＶコア１４−１５３−２２９ｓｃ１５２）の調製に用いられる発現プラスミドのプラスミドマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、とりわけ、キメラ抗体を含めて、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）抗原タンパク質に特異的な組換え抗体を提供する。本発明の一実施形態によれば、キメラ抗体を含めた組換え抗体は、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合し、したがって、例えば、ＨＣＶ検出用診断試薬として、及び／又はＨＣＶ検出アッセイにおける標準化試薬若しくは正の対照試薬としての使用に適切である。
【００２３】
したがって、本発明は、キメラ抗体を含めて、１種類以上の組換え抗体を含み、各抗体がＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能である、免疫診断試薬も規定する。組換え抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片などであり得る。別の一実施形態においては、免疫診断試薬は、キメラ抗体を含めて、２種類以上の組換え抗体を含む。免疫診断試薬に使用される抗体は、免疫診断試薬が複数のＨＣＶ抗原を検出可能であるように、異なるＨＣＶ抗原タンパク質に各々特異的であってもよい。免疫診断試薬は、ＨＣＶコアタンパク質に特異的な組換え抗体、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的な組換え抗体、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的な組換え抗体、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的な組換え抗体、及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的な組換え抗体からなる群から選択される、ＨＣＶタンパク質に特異的な１種類以上又は２種類以上の組換え抗体を含んでもよい。
【００２４】
一実施形態においては、本発明は、例えばヒト血清の代わりに、ＨＣＶ検出アッセイにおける標準化試薬としての免疫診断試薬の使用を規定する。これに関連して、免疫診断試薬を使用して、例えば、現在及び将来のＨＣＶ抗原検出アッセイの性能を評価し、標準化してもよい。
【００２５】
別の一実施形態においては、本発明は、さらに、ＨＣＶ感染症の治療又は予防における組換え抗体の使用を規定する。
【００２６】
本発明のこれら及び追加の実施形態、特徴、態様、説明図及び実施例を以下の項で更に記述する。特に断らない限り、本明細書において使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００２７】
定義
本明細書では「組換え抗体」又は「複数の組換え抗体」という用語は、組換え技術によって１種類以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を適切な発現ベクターにクローニングすること、及び続いて適切な宿主細胞中で抗体を発現することを含む１つ以上の段階によって調製された抗体を指す。したがって、この用語は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片を含めた抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全又は部分ヒト化）、抗体断片から形成される多重特異性又は多価構造、及び二機能性抗体である、組換え産生された抗体を含むが、これらだけに限定されない。
【００２８】
本明細書では「抗体断片」又は「複数の抗体断片」という用語は、完全抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む、完全抗体の一部を指し、該一部は、完全抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｈ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、二重特異性抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１個の軽鎖可変ドメインしか含まない単鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３個のＣＤＲを含む単鎖ポリペプチド、１個の重鎖可変領域しか含まない単鎖ポリペプチド、及び重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む単鎖ポリペプチドが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００２９】
本明細書では「キメラ抗体」（又は「ｃＡｂ」）という用語は、一宿主種由来の抗体定常領域の少なくとも一部と結合した別の宿主種由来の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の全部又は一部を含むポリペプチドを指す。
【００３０】
本明細書では「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体の改変された可変領域を含むポリペプチドを指し、可変領域の一部は、非ヒト種由来の対応する配列で置換されており、改変された可変領域は、ヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に結合している。一実施形態においては、可変領域の一部は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の全部又は一部である。この用語は、ハイブリッド抗体が所望の生物活性（すなわち、ＨＣＶ抗原タンパク質に特異的に結合する能力）を示す限り、起源の種、タンパク質タイプ、免疫グロブリンクラス又はサブクラスの指定にかかわらず、非ヒト抗体の可変領域又は１個以上のＣＤＲを異種タンパク質と接合することによって産生されるハイブリッド抗体も含む。
【００３１】
本明細書では「二機能性抗体」という用語は、一抗原性部位に対して特異性を有する第１の腕と、異なる抗原性部位に対して特異性を有する第２の腕とを含む抗体を指す。すなわち、二機能性抗体は二重特異性を有する。
【００３２】
本明細書では、ＨＣＶタンパク質の領域に関連した「診断関連」という用語は、単独で、又はＨＣＶの別の診断関連領域と組み合わせて、それを検出することによって、６つの主要なＨＣＶ遺伝子型（例えば、Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．、同書）の少なくとも３つを検出することが可能になる、タンパク質の領域を指す。診断関連領域の例としては、当分野で公知の免疫優性領域、及び本明細書に記載の領域などの領域が挙げられる。
【００３３】
本明細書では「エピトープ」、「複数のエピトープ」又は「目的エピトープ」という用語は、認識され、その特異的結合相手の相補的部位に結合可能である、任意の分子上の部位を指す。該分子と特異的結合相手は、特異的結合対の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、（糖脂質、糖タンパク質、リポ多糖など、ただしこれらだけに限定されない）炭水化物抗原又は多糖であり得、その特異的結合相手は、抗体であり得るが、これだけに限定されない。典型的には、エピトープは、より大きい抗原性断片（すなわち、抗体に結合可能な領域又は断片）内に含まれ、特異的結合相手に接触することが知られている正確な残基を指す。抗原性断片は、１個を超えるエピトープを含み得る。
【００３４】
本明細書では、特異的結合対（例えば、抗原と抗体）のメンバー間の相互作用に関連した「特異的」又は「特異性」とは、相互作用の選択的反応性を指す。「に特異的に結合する」という句及びその類似用語は、ＨＣＶタンパク質に特異的に結合するが、別の実体には特異的に結合しない抗体の能力を指す。ＨＣＶタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片は、例えば、診断的免疫測定法（例えば、放射性免疫測定法（「ＲＩＡ」）及び酵素結合免疫吸着検定法（「ＥＬＩＳＡ」）（例えば、Ｐａｕｌ， ｅｄ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ３３２−３３６ページ（１９８９）参照）、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子間相互作用解析、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な手段（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ））、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、又は当業者に公知の他の技術によって、特定することができる。
【００３５】
本明細書では「平衡解離定数」又は「Ｋ_Ｄ」という用語は、区別なく使用され、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）を会合速度定数（ｋ_ｏｎ）で除算して得られる値を指す。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すのに用いられる。これらの定数を決定する方法は、当分野で周知である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）又はＫｉｎＥｘＡ（登録商標）アッセイを使用することができる。
【００３６】
本明細書に記載のように、免疫測定法は、例えば、較正用物質、対照及び感受性パネルを含めて、ただしこれらだけに限定されない、「品質管理試薬」を含む。「較正用物質」又は「標準」は、典型的には、抗体濃度の内挿のための較正（標準）曲線を設定するために（例えば、１種類以上又は複数）使用される。単一の較正用物質は、正／負のカットオフ付近で使用してもよい。複数の較正用物質（すなわち、１種類を超える較正用物質、又は可変量の較正用物質）は、「感受性パネルを含むように組み合わせて使用することができる。「正の対照」は、アッセイ性能特性を確立するために使用され、試薬（例えば、抗原）の完全性の有用な指標である。
【００３７】
本明細書では、核酸又はアミノ酸配列に関連した「実質的に同一」という用語は、例えば下記方法を用いて、最適に整列させたときに、核酸又はアミノ酸配列が、定義された第２の核酸又はアミノ酸配列（すなわち、「基準配列」）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列相同性を有することを示す。「実質的同一性」は、完全長配列、エピトープ又は免疫原性ペプチド、機能ドメイン、コード及び／又は制御配列、エキソン、イントロン、プロモーター、ゲノム配列などの配列の種々のタイプ及び長さを指すのに使用することができる。２個のアミノ酸又は核酸配列間の同一パーセントは、当業者の技術範囲内の種々の方法で、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメント（Ｓｍｉｔｈ， Ｔ．Ｆ． ａｎｄ Ｍ．Ｓ． Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４７： １９５−７）、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ （１９７９） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ．Ｏ．， Ｅｄ ｐｐ３５３−３５８に組み込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， ４８２−４８９（１９８１））、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｗ． Ｇｉｓｈ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３−１０）並びにＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ及びＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含めたその変形物などの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、決定することができる。また、当業者は、比較する配列の長さ全体にわたって最大のアラインメントを得るのに必要なアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定する適切なパラメータを決定することができる。一般に、アミノ酸配列の場合、比較配列の長さは、少なくとも約１０アミノ酸である。当業者は、実際の長さが比較する配列の全長に依存し、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、若しくは少なくとも約３５０アミノ酸であり得、又はアミノ酸配列の完全長であり得ることを理解されたい。核酸の場合、比較配列の長さは、一般に、少なくとも約２５ヌクレオチドであるが、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、若しくは少なくとも約１０００ヌクレオチドでもよく、又は核酸配列の完全長でもよい。
【００３８】
「に対応している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」又は「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」という用語は、核酸配列が基準核酸配列の全部又は一部と同一であることを示す。「に相補的」という用語は、本明細書では、核酸配列が基準核酸配列の相補鎖の全部又は一部と同一であることを示すのに用いる。例として、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は、基準配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、基準配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【００３９】
別段の記載がない限り、すべての核酸配列を５’から３’方向に記述し、すべてのアミノ酸配列をアミノからカルボキシ末端方向に記述する。
【００４０】
本明細書では、「約」という用語は、示した値から約ａ＋／−１０％の変動を指す。かかる変動は、具体的に言及したか否かにかかわらず、本明細書に示す任意の所与の値に常に含まれることを理解されたい。
【００４１】
１． 免疫診断試薬
本発明の免疫診断試薬は、組換えキメラ抗体を含めて、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合する１種類以上の組換え抗体を含む。したがって、一実施形態においては、本発明によって提供される免疫診断試薬は、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能である単一のキメラ抗体を含む。別の実施形態においては、免疫診断試薬は、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域（例えば、同じ領域又は異なる領域）に各々特異的に結合可能である複数のキメラ抗体を含む。複数のキメラ抗体の１種類以上は、同じＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能であり得る。或いは、複数のキメラ抗体の各々は、異なるＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合し得る。
【００４２】
本発明の一実施形態においては、免疫診断試薬は、複数のＨＣＶ抗原を検出可能であり、異なるＨＣＶ抗原タンパク質に各々特異的に結合可能である２種類以上の組換え抗体を含んでもよい。更なる一実施形態においては、免疫診断試薬は、異なるＨＣＶ抗原タンパク質に各々特異的に結合可能である３種類以上の組換え抗体を含んでもよい。別の一実施形態においては、免疫診断試薬は、異なるＨＣＶ抗原タンパク質に各々特異的に結合可能である４種類以上の組換え抗体を含んでもよい。
【００４３】
免疫診断試薬に含まれる組換え抗体は、例えば、検出目的で、固体支持体上に固定するために、安定性の改善及び／又は薬物動態学的諸性質の改善のために、改変されてもよく、又は当分野で公知の手段などの別の手段によって改変されてもよい。
【００４４】
２． ＨＣＶ抗原及びその診断関連領域
ＨＣＶは、３０１１個のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする約１０，０００ヌクレオチドのプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。ポリタンパク質は、細胞及びウイルスプロテアーゼによって成熟構造及び非構造タンパク質に同時翻訳及び翻訳後処理される。構造タンパク質としては、コアタンパク質（ポリタンパク質のアミノ酸１から１９２）、エンベロープ糖タンパク質Ｅ１（ポリタンパク質のアミノ酸１９３から３８４）及びＥ２（ポリタンパク質のアミノ酸３８５から７４７）などが挙げられる。非構造（ＮＳ）タンパク質２−５Ｂとしては、ＮＳ２−３自己プロテアーゼ（ポリタンパク質のアミノ酸８１１から１０２７）、ＮＳ３セリンプロテアーゼ（ポリタンパク質のアミノ酸１０２８から１６５８）、ＮＳ３のカルボキシ末端２／３中のＮＴＰａｓｅ／ＲＮＡヘリカーゼドメイン、ＮＳ４Ａポリペプチド（ポリタンパク質のアミノ酸１６５９から１７１２）、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５Ａタンパク質（それぞれ、ポリタンパク質のアミノ酸１７１３から１９７３及びアミノ酸１９７４から２４２１）、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ポリタンパク質のアミノ酸２４２２から３０１１）などが挙げられる。
【００４５】
これらのタンパク質のうちの多数のタンパク質の診断関連領域が決定された。コアタンパク質の場合、例えばアミノ酸１−１５０によって規定された領域、及びアミノ酸２から１２０、アミノ酸１０から５３、アミノ酸１から５０などのそのサブ領域は、診断に関連すると判断された。ＮＳ３タンパク質の場合、例えばアミノ酸１１９２から１４５７によって規定された領域は、診断に関連すると判断された。ＮＳ４タンパク質の場合、例えばアミノ酸１９２０から１９３５及びアミノ酸１６７６から１９３１によって規定された領域、及びアミノ酸１６９６−１９３１、アミノ酸１６９４から１７３５などのそのサブ領域は、診断に関連すると判断された。ＮＳ５の場合、例えばアミノ酸２０５４から２９９５によって規定された領域、及びアミノ酸２１８８から２４８１、アミノ酸２２１２から２３１３などのそのサブ領域（Ｄｏｕ， Ｘ−Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （２００２） ４０： ６１−６７）は、診断に関連すると判断された。それぞれアミノ酸３０３−３２０及びアミノ酸４０５−４４４によって定義されたＥ１及びＥ２領域は、診断に関連すると判断された。別の例としては、アミノ酸１１９２から１９３１によって規定された領域（にわたるＮＳ３及びＮＳ４）、アミノ酸１５６９から１９３１によって規定された領域（にわたるＮＳ３及びＮＳ４）及びアミノ酸１９３２から２１９１によって規定された領域（にわたるＮＳ４及びＮＳ５）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００４６】
３． 組換え抗体
本発明の組換え抗体は、ＨＣＶ抗原タンパク質に特異的に結合可能である未変性抗体のＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌドメインに由来する抗原結合領域を含む。組換え抗体は、例えば、組換え産生されたモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片から形成される多重特異性若しくは多価構造、又は二機能性抗体であり得る。
【００４７】
一実施形態においては、組換え抗体は、マウスモノクローナル抗体の特異性及び親和性を保持するキメラ抗体であって、ヒト免疫グロブリンを測定する免疫測定法形式で反応するキメラ抗体であってもよい。マウス−ヒトキメラ抗体は、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４及び／又はＮＳ５抗原に対するものであってもよい。かかるキメラ抗体は、Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥＩＡ（Ｂｅａｄ）用ＨＣＶアッセイ、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及びＰＲＩＳＭ（登録商標）プラットホームを含めて、ただしこれらだけに限定されない既存の免疫測定法形式で反応してもよい。
【００４８】
組換え抗体に含まれる抗原結合領域は、未変性抗体由来のＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ配列全体を含み得、又は１種類以上の別の抗体由来の配列と一緒にＣＤＲなどのその１個以上の部分を含み得る。一実施形態においては、組換え抗体は、未変性抗体の完全長Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を含む。
【００４９】
抗原結合領域が由来する未変性抗体は、一般に脊椎動物抗体である。例えば、未変性抗体は、げっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラット）抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウシ抗体、ウマ抗体、ブタ抗体、類人猿（例えば、チンパンジー）抗体又はヒト抗体であり得る。抗体源は、主に利便性に基づく。一実施形態においては、未変性抗体は非ヒト抗体である。
【００５０】
組換え抗体は、同じ未変性抗体又は異なる抗体に由来する１個以上の定常領域、例えば、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及び／又はＣ_Ｈ４領域も含み得る。定常領域は、上記の種を含めて、ただしこれらだけに限定されない幾つかの脊椎動物種の１種から得られる抗体に由来し得る。本発明の一実施形態においては、組換え抗体は、少なくとも１個の定常領域を含む。別の一実施形態においては、組換え抗体は、ヒト抗体に由来する１個以上の定常領域を含む。本発明の特定の一実施形態においては、組換え抗体は、ヒト抗体の定常領域に結合した非ヒト抗体の可変領域を含む。
【００５１】
組換え抗体に含まれる定常領域は、１つ以上の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプに由来し得る。例えば、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域の場合、定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２又はＩｇＥ定常領域の１個以上に由来し得る。定常領域が、ＩｇＧ軽鎖に由来する領域を含むとき、この領域はカッパ鎖又はラムダ鎖に由来し得る。組換え抗体は、１つを超えるクラス又はアイソタイプに由来する配列を含み得る。組換え抗体の所望の機能を最適化する特定の定常ドメインの選択は、当分野の通常の技術の範囲内である。本発明の一実施形態においては、組換え抗体は、ＩｇＧに由来する１個以上の定常ドメインを含む。別の一実施形態においては、組換え抗体は、ＩｇＧ定常ドメインの重鎖と軽鎖の両方に由来する領域を含む。
【００５２】
本発明の一実施形態においては、抗原結合領域は、ＨＣＶ抗原タンパク質の診断関連領域内のエピトープに特異的に結合する未変性抗体に由来する。ＨＣＶタンパク質の診断関連領域の非限定的例は上述した。別の一実施形態においては、抗原結合領域は、コアタンパク質のアミノ酸１−１５０によって規定された領域、ＮＳ３タンパク質のアミノ酸１１９２から１４５７によって規定された領域、ＮＳ４タンパク質のアミノ酸１９２０から１９３５若しくはアミノ酸１６７６から１９３１によって規定された領域、又はＮＳ５タンパク質のアミノ酸２０５４から２９９５によって規定された領域内のエピトープに特異的に結合する未変性抗体に由来する。更なる一実施形態においては、抗原結合領域は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−５０によって規定されたコアタンパク質の領域内、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２−１４５７によって規定されたＮＳ３タンパク質の領域内、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１６７６−１９３１によって規定されたＮＳ４タンパク質の領域内、又はＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９３２−２１９１若しくはアミノ酸２１８８−２４８１によって規定されたＮＳ５タンパク質の領域内のエピトープに特異的に結合する未変性抗体に由来する。別の一実施形態においては、抗原結合領域は、配列番号３３（ＧＧＶＹＬ）若しくは配列番号３４（ＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲ）で表されるコアタンパク質の領域、配列番号３５（ＡＫＡＶＤＦＶＰＶＥＳＬＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰ）で表されるＮＳ３タンパク質の領域、配列番号３６（ＰＡＩＩＰＤＲＥＶＬＹＲＥＦＤＥＭＥＥＣＳＱ）で表されるＮＳ４タンパク質の領域、又は配列番号３７（ＡＥＳＹＳＳＭＰＰＬＥＧＥＰＧＤＰＤＬＳＤＧＳＷＳＴＶ）で表されるＮＳ５タンパク質の領域に特異的に結合する未変性抗体に由来する。
【００５３】
本発明の特定の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号１、２、９、１０、１７、１８、２５、２６、３８及び３９のいずれか１つで表されるＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列の全部又は一部と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む（表１参照）。別の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。特定の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号４２、４３及び４４で表されるＣＤＲ、配列番号４５、４６及び４７で表されるＣＤＲ、配列番号４８、４９及び５０で表されるＣＤＲ、配列番号５１、５２及び５３で表されるＣＤＲ、配列番号５４、５５及び５６で表されるＣＤＲ、配列番号５７、５８及び５９で表されるＣＤＲ、配列番号６０、４３及び６１で表されるＣＤＲ、配列番号６２、５８及び６３で表されるＣＤＲ、配列番号６４、６５及び６６で表されるＣＤＲ、又は配列番号６７、４６及び６８で表されるＣＤＲの１個以上と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む（表１参照）。
【００５４】
【表１】


【００５５】
本発明の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号７、８、１５、１６、２３、２４、３１、３２、４０又は４１のいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列の全部又は一部と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む（表２参照）。別の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）をコードする核酸配列を含む。特定の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号６９、７０及び７１の１つ以上、配列番号７２、７３及び７４の１つ以上、配列番号７５、７６及び７７の１つ以上、配列番号７８、７９及び８０の１つ以上、配列番号８１、８２及び８３の１つ以上、配列番号８４、８５及び８６の１つ以上、配列番号８７、７０及び８８の１つ以上、配列番号８９、８５及び９０の１つ以上、配列番号９１、９２及び９３の１つ以上、又は配列番号９４、７３及び９５の１つ以上によってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む（表２参照）。
【００５６】
本発明の別の特定の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号７、８、１５、１６、２３、２４、３１、３２、４０又は４１のいずれか１つで表される配列の全部又は一部と実質的に同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。更なる特定の一実施形態においては、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号６９、７０及び７１で表される配列、配列番号７２、７３及び７４で表される配列、配列番号７５、７６及び７７で表される配列、配列番号７８、７９及び８０で表される配列、配列番号８１、８２及び８３で表される配列、配列番号８４、８５及び８６で表される配列、配列番号８７、７０及び８８で表される配列、配列番号８９、８５及び９０で表される配列、配列番号９１、９２及び９３で表される配列、又は配列番号９４、７３及び９５で表される配列と実質的に同一である核酸配列によってコードされるＣＤＲを含む。
【００５７】
【表２】




【００５８】
組換え抗体のアミノ酸配列は、親配列に正確に対応する必要がなく、すなわち「変種配列」であり得る。例えば、組換え抗体に含まれるドメインに応じて、該当する場合には、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｈ４の１個以上を、その部位の残基が親（又は基準）配列に対応しないように、１個以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によって変異誘発することができる。しかし、当業者は、かかる変異が大規模ではなく、組換え抗体とその標的ＨＣＶタンパク質との結合に劇的に影響しないことを理解されたい。本発明によれば、組換え抗体が変種配列を含むときには、変種配列は基準配列と少なくとも約７０％同一である。一実施形態においては、変種配列は、基準配列と少なくとも約７５％同一である。別の実施形態においては、変種配列は、基準配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％同一である。特定の一実施形態においては、基準配列は、配列番号１、２、９、１０、１７、１８、２５、２６、３８及び３９のいずれか１つで表される配列に対応する。別の一実施形態においては、基準配列は、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７及び６８のいずれか１つで表される配列に対応する。
【００５９】
一般に、組換え抗体が、１個以上のアミノ酸置換を含む変種配列を含むときには、該アミノ酸置換は「保存的」置換である。保存的置換は、１個のアミノ酸残基が類似の側鎖特性を有する別の残基で置換されるものである。当分野で公知のように、２０種類の天然アミノ酸は、その側鎖の物理化学的性質に応じて分類することができる。適切な分類は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン（極性無電荷側鎖）、アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）、並びにリシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）を含む。別のアミノ酸分類は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、アミノ酸が、同じ分類の別のアミノ酸で置換される。
【００６０】
したがって、本発明は、別の実施形態においては、本明細書に開示する新規組換え抗体配列に対応する単離ポリペプチドを更に提供する。単離ポリペプチドは、ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質からなる群から選択されるＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合する組換え（例えば、キメラ）抗体の一部を含んでもよい。一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号１、９、１７、２５及び３８のいずれか１つ以上で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む。別の一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号４２、４３及び４４で表される配列の１個以上、配列番号４８、４９及び５０で表される配列の１個以上、配列番号５４、５５及び５６で表される配列の１個以上、配列番号６０、４３及び６１で表される配列の１個以上、及び／又は配列番号６４、６５及び６６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域を含む。別の一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号２、１０、１８、２６及び３９のいずれか１つ以上で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。更に別の一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号４５、４６及び４７で表される配列の１個以上、配列番号５１、５２及び５３で表される配列の１個以上、配列番号５７、５８及び５９で表される配列の１個以上、配列番号６２、５８及び６３で表される配列の１個以上、及び／又は配列番号６７、４６及び６８で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。
【００６１】
更に別の一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号７、１５、２３、３１及び４０のいずれか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む。更に別の一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号６９、７０及び７１によってコードされる配列の１個以上、配列番号７５、７６及び７７によってコードされる配列の１個以上、配列番号８１、８２及び８３によってコードされる配列の１個以上、配列番号８７、７０及び８８によってコードされる配列の１個以上、及び／又は配列番号９１、９２及び９３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域を含む。別の一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号８、１６、２４、３２及び４１のいずれか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む。更に別の一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号８９、８５及び９０によってコードされる配列、配列番号８４、８５及び８６によってコードされる配列、配列番号７２、７３及び７４によってコードされる配列、配列番号７８、７９及び８０によってコードされる配列、及び／又は配列番号９４、７３及び９５によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。
【００６２】
同様に、可変領域をコードする核酸配列は、親の基準配列に正確に対応する必要がなく、遺伝コードの縮重のために変化し得、及び／又は上述した変種アミノ酸配列をコードするように変化し得る。したがって、本発明の一実施形態においては、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、基準配列と少なくとも約７０％同一である。別の一実施形態においては、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、基準配列と少なくとも約７５％同一である。別の実施形態においては、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、基準配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％同一である。特定の一実施形態においては、基準配列は、配列番号７、８、１５、１６、２３、２４、３１、３２、４０又は４１のいずれか１つで表される配列に対応する。別の一実施形態においては、基準配列は、配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４及び９５のいずれか１つで表される配列に対応する。
【００６３】
したがって、本発明は、別の実施形態においては、本明細書に開示する（キメラ抗体配列を含めた）新規組換え抗体配列をコードする単離ポリヌクレオチドを更に提供する。単離ポリヌクレオチドは、ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質からなる群から選択されるＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合する組換え（例えば、キメラ）抗体の一部をコードしてもよい。一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号１、９、１７、２５及び３８のいずれか１つ以上で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする。別の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号４２、４３及び４４で表される配列の１個以上、配列番号４８、４９及び５０で表される配列の１個以上、配列番号５４、５５及び５６で表される配列の１個以上、配列番号６０、４３及び６１で表される配列の１個以上、及び／又は配列番号６４、６５及び６６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域をコードする。別の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号２、１０、１８、２６及び３９のいずれか１つ以上で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域をコードする。更に別の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号４５、４６及び４７で表される配列の１個以上、配列番号５１、５２及び５３で表される配列の１個以上、配列番号５７、５８及び５９で表される配列の１個以上、配列番号６２、５８及び６３で表される配列の１個以上、及び／又は配列番号６７、４６及び６８で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域をコードする。
【００６４】
更に別の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号７、１５、２３、３１及び４０のいずれか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする。更に別の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号６９、７０及び７１によってコードされる配列の１個以上、配列番号７５、７６及び７７によってコードされる配列の１個以上、配列番号８１、８２及び８３によってコードされる配列の１個以上、配列番号８７、７０及び８８によってコードされる配列の１個以上、及び／又は配列番号９１、９２及び９３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域をコードする。別の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号８、１６、２４、３２及び４１のいずれか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする。更に別の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号８９、８５及び９０によってコードされる配列、配列番号８４、８５及び８６によってコードされる配列、配列番号７２、７３及び７４によってコードされる配列、配列番号７８、７９及び８０によってコードされる配列、及び／又は配列番号９４、７３及び９５によってコードされる配列の１個以上のうちの１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域をコードする。
【００６５】
一実施形態においては、ヒト免疫系に曝露されたときに抗体の免疫原性を解消又は低減するために、抗体は、ヒトＴ細胞に対する潜在的エピトープである抗体の非ヒト部分中の１個以上のアミノ酸を変異させることによって、ヒトに対する免疫原性が未変性抗体よりも低下するように更に改変することができる。適切な変異としては、例えば、１個以上のアミノ酸の置換、欠失及び挿入が挙げられる。
【００６６】
一実施形態においては、本発明の組換え抗体は、適切な固相上に固定するために更に改変することができる。固定化は、固相との共有結合性又は非共有結合性（例えば、イオン、疎水性など）付着によって実施することができる。適切な改変は、当分野で公知であり、組換え抗体に含まれるアミノ酸配列の１個のＣ末端又はＮ末端に官能基又は化学部分を付加して、組換え抗体と固体支持体の架橋又は付着を促進することを含む。例示的な改変としては、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）、Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）などの官能基の付加、又はアミノ酸配列のＮ若しくはＣ末端への１個以上のシステイン残基の付加が挙げられる。別の架橋試薬が当分野で公知であり、多数市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのカタログ参照）。例としては、１，６−ジアミノヘキサンなどのジアミン；グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、エチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシナート）などのビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ヘキサメチレンジイソシアナートなどのジイソシアナート；１，４ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン；スクシニルジサリチラートなどのジカルボン酸；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６７】
別の改変としては、Ｎｉ^２＋誘導体化表面との結合を可能にするヒスチジン残基、ジスルフィド架橋形成又はＳｕｌｆｏｌｉｎｋ（商標）アガロースとの結合を可能にするシステイン残基など、Ｎ又はＣ末端における１個以上のアミノ酸の付加が挙げられる。或いは、抗体は、組換え抗体を固体支持体から最適に離隔するために、Ｎ末端又はＣ末端に１個以上の化学スペーサーを含むように改変することができる。使用することができるスペーサーとしては、６−アミノヘキサン酸、１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノエタン、及びポリグリシン配列などの１から５個のアミノ酸の短鎖アミノ酸配列などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６８】
別の一実施形態においては、組換え抗体は、組換え抗体を固相上に固定するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、チログロブリンなどの担体タンパク質と複合化されていてもよい。
【００６９】
別の一実施形態においては、本発明は、検出可能標識を組み込むための組換え抗体の改変を規定する。本発明による検出可能標識は、好ましくは、直接的又は間接的に検出することができる分子又は部分であり、検出可能標識と組換え抗体の複合化が抗体とその標的ＨＣＶタンパク質の特異的結合と好ましくは干渉しないように選択される。抗体を標識する方法は、当分野で周知であり、例えば、ＳＡＭＳＡ（Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物）など、組換え抗体を検出可能標識と連結する二官能性架橋剤の使用を含む。当分野で公知の架橋試薬、上記と類似の架橋試薬などの別の架橋試薬も同様に使用することができる。
【００７０】
本発明の組換え抗体と一緒に使用される検出可能標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光団、化学発光団（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子など、直接検出することができる標識が挙げられる。検出可能標識は、それ自体検出可能であり、又は１種類以上の追加の化合物と反応して検出可能生成物を生成することができる。したがって、当業者は、本発明の直接検出可能な標識が、基質、誘発試薬、光など、標識の検出を可能にする追加の成分を必要とし得ることを理解されたい。検出可能標識の例としては、色素原、（例えば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ、^１４Ｃなどの）放射性同位体、（フルオレセイン、ローダミン、ルテニウムトリスビピリジル、ランタニドキレート誘導体などの）蛍光化合物、（例えば、アクリジニウム、ルミノールなどの）化学発光化合物、可視又は蛍光粒子、核酸、錯化剤、（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、ルシフェラーゼなどの）酵素などの触媒が挙げられるが、これらだけに限定されない。酵素を使用する場合には、例えば、発色基質、蛍光発生基質又は発光性（ｌｕｍｏｇｅｎｉｃ）基質の添加は、検出可能信号の発生を好ましくはもたらす。時間分解蛍光法、内部反射蛍光、ラマン分光法などの別の検出系も有用であり得る。
【００７１】
本発明は、間接的に検出される標識の使用も規定する。間接的に検出可能な標識は、典型的には、「親和性対」、すなわち、対の第１のメンバーが本発明の組換え抗体に結合し、対の第２のメンバーが第１のメンバーに特異的に結合する２種類の分子の使用を要する。対の２つのメンバーの結合は、典型的には、本質的に化学的又は物理的である。かかる結合対の例としては、抗原と抗体、アビジン／ストレプトアビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子／基質と酵素などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７２】
４． 組換え抗体の調製
本発明の組換え抗体は、例えば、ヒト、又はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、類人猿、ニワトリなどの非ヒト動物によって産生されたモノクローナル抗体に由来する抗原結合ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ配列、又はその一部）を含み得る。或いは、所望の結合活性を有する抗原結合ドメインは、ラムダファージ中で発現されるコンビナトリアルライブラリーを用いて、バクテリオファージ、細菌若しくは酵母の表面で選択することができ、又は別の生物系（例えば、レトロウイルス又はポリソーム）若しくは非生物系上で標準技術を用いて表示することによってスクリーニングすることができる（例えば、Ｍａｒｋｓ， Ｊ．Ｄ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２： ５８１−５９７（１９９１）； Ｂａｒｂａｓ， Ｃ．Ｆ．ＩＩＩ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ４４５７−４４６１（１９９２）参照）。ライブラリーは、免疫若しくは非免疫宿主から単離された未変性抗原結合ドメイン、合成若しくは半合成抗原結合ドメイン、又は改変抗原結合ドメインで構成され得る。
【００７３】
本発明の一実施形態においては、組換え抗体は、目的ＨＣＶタンパク質に結合するモノクローナル抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。所望の抗原に対してモノクローナル抗体を産生させる方法は、当分野で周知である。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法を用いて作製することができる。一般にハイブリドーマ法では、マウス、又はハムスター、マカクザルなどの別の適切な宿主動物を、複数の部位における抗原及び担体及び／又はアジュバントの複数の皮下又は腹腔内注射によって免疫する。２週間後、動物を追加免疫し、約７から１４日間後に動物から採血し、血清の抗抗原力価（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｇｅｎ ｔｉｔｅｒ）を評価する。力価が横ばい状態になるまで、動物を追加免疫することができる。
【００７４】
マウスひ細胞を抽出し、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２６６： ５５０（１９７７）参照）。適切な骨髄腫細胞系は、当分野で公知であり、（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能な）ＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫よう並びに（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能な）ＳＰ−２、ＳＰ２／０及びＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来する系などのネズミ骨髄腫系が挙げられるが、これらだけに限定されない。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系もヒトモノクローナル抗体産生用に記述された（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３： ３００１（１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。こうして調製されたハイブリドーマ細胞を、非融合親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１種類以上の物質を好ましくは含む適切な培地に蒔き、増殖させることができる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【００７５】
次いで、かかる選択によって得られるハイブリドーマ細胞を、例えば、免疫沈降、又は放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって評価して、初期免疫化に用いられるＨＣＶ抗原に結合可能である抗体を分泌するクローンを特定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７： ２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって求めてもよい。
【００７６】
所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを限界希釈手順、例えば、Ｗａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０： ２２５−２３２（１９８１））によって記述された手順によってサブクローニングし、標準方法（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、同書参照）によって増殖させることができる。この目的に適切な培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。或いは、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫ようとして生体内で増殖させることができる。
【００７７】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水又は血清から単離してもよい。
【００７８】
本発明の一実施形態においては、組換え抗体は、ＨＣＶタンパク質の診断関連領域に由来するＨＣＶ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。別の一実施形態においては、組換え抗体は、ＨＣＶコア、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５タンパク質の診断関連領域に由来するＨＣＶ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。更なる一実施形態においては、組換え抗体は、（ａ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−１５０によって規定されたコアタンパク質の領域、（ｂ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２から１４５７によって規定されたＮＳ３タンパク質の領域、（ｃ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２０から１９３５若しくはアミノ酸１６７６から１９３１によって規定されたＮＳ４タンパク質の領域、又は（ｄ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０５４から２９９５によって規定されたＮＳ５タンパク質の領域の全部又は断片を含むＨＣＶ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。別の一実施形態においては、組換え抗体は、（ａ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−５０によって規定されたコアタンパク質の領域、（ｂ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２−１４５７によって規定されたＮＳ３タンパク質の領域、（ｃ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１６９６−１９３１によって規定されたＮＳ４タンパク質の領域、及び／又は（ｄ）アミノ酸１９３２から２１９１若しくはアミノ酸２１８８から２４８１によって規定されたＮＳ５タンパク質の領域の全部又は断片（例えば、１個以上のエピトープを含む断片）を含むＨＣＶ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。更なる一実施形態においては、組換え抗体は、配列番号３３、３４、３５、３６又は３７のいずれか１つで表される配列と実質的に同一である配列を含むＨＣＶ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。
【００７９】
更なる一実施形態においては、組換え抗体は、（ａ）配列番号１００で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、（ｂ）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、及び（ｃ）配列番号１０２で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープからなる群から選択されるＨＣＶコアタンパク質由来のエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。更に別の一実施形態においては、組換え抗体は、（ａ）配列番号１０３で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、（ｂ）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、及び（ｃ）配列番号１０５で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープからなる群から選択されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質由来のエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。更に別の一実施形態においては、組換え抗体は、（ａ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、（ｂ）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、及び（ｃ）配列番号１０８で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープからなる群から選択されるＨＣＶ ＮＳ４タンパク質由来のエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。別の一実施形態においては、組換え抗体は、（ａ）配列番号１０９で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、（ｂ）配列番号１１０で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープ、及び（ｃ）配列番号１１１で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープからなる群から選択されるＨＣＶ ＮＳ５タンパク質由来のエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。
【００８０】
モノクローナル抗体は、抗ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５、抗ＨＣＶコア１４−１５３−４６２、抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７、抗ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４及び抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７からなる群から選択される細胞系によって発現されてもよい。
【００８１】
モノクローナル抗体を調製した後、モノクローナル抗体又はその可変領域をコードするＤＮＡは、標準技術、例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖若しくは可変領域をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、又は保存領域に対するプライマー（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能なｉｇＧプライマーセット）を用いた、モノクローナル抗体をコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって、容易に単離することができる。
【００８２】
単離後、ＤＮＡは、組換えモノクローナル抗体を産生するために、例えば、適切な発現ベクターにクローニングし、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３）、骨髄腫細胞などの適切な宿主細胞に導入することができる。一実施形態においては、本発明の抗ＨＣＶマウス−ヒトキメラ抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系中で産生されてもよく、これは、商業用途に十分な量で抗体を産生することができる点で有利である。好ましくは、ほ乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞系及びＨＥＫ ２９３細胞系である。別の好ましい宿主細胞は、Ｂ３．２細胞系（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、又は（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能な）別のジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞系である。
【００８３】
或いは、モノクローナル抗体又はその可変領域をコードするＤＮＡを使用して、当分野で公知の標準方法によって、キメラ抗体、ヒト化抗体及び抗体断片を産生することができる。
【００８４】
例えば、キメラモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、異なる宿主種に由来する抗体重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子を含むほ乳動物発現ベクターにクローニングすることによって産生することができる。安定に組み込まれる、又は染色体外因子として存在する、多数の真核生物抗体発現ベクターが記述され、当業者に知られている。一般に、抗体発現ベクターは、重鎖定常領域をコードする遺伝子及び／又は軽鎖定常領域をコードする遺伝子と、上流のエンハンサーエレメントと、適切なプロモーターとを含むプラスミドである。例えば、ヒト定常領域の場合、ベクターは、ヒトＩｇＧ１（ヒトＣγ１）及びヒトカッパ定常領域（ヒトＣκ）遺伝子並びに免疫グロブリンＨ鎖エンハンサーエレメントを含み得る。ベクターは、細菌複製開始点及び選択マーカーも含み得る。選択マーカーを任意選択で含むと、当分野で公知のように、規定の増殖条件下で選択及び増幅が可能になり、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子は、メトトレキサートを用いたほ乳動物細胞における選択及び増幅を規定する。市販ほ乳動物発現ベクターから出発する抗体発現に適切な構成は、熟練技術者が容易に達成することができる。組換え抗体発現ベクターの代表例を図１、３、５、７及び１２に示す。
【００８５】
適切な宿主細胞に発現構築物を導入すると、明確な特異性の完全なキメラ抗体が生成する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ６８５１−６８５５（１９８４）参照）。重鎖及び軽鎖コード配列は、別々のプラスミドで個々に、又は同じベクターで一緒に、宿主細胞に導入することができる。
【００８６】
利用するベクター系に応じて、多数の異なる不死化細胞系が適切な宿主として働き得る。この不死化細胞系としては、骨髄腫（例えば、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ハイブリドーマ（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）、リンパ腫、昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられるが、これらだけに限定されない。発現構築物は、リン酸カルシウム沈殿、原形質体融合、リポフェクション、レトロウイルス由来のシャトルベクター、及び電気穿孔法を含めて、ただしこれらだけに限定されない当分野で公知の種々の技術を用いて、宿主細胞に導入することができる。
【００８７】
キメラ抗体及び抗体断片は、バキュロウイルス、酵母、（Ｅ．コリなどの）細菌、及びウサギ網状赤血球溶解物などのインビトロでの無細胞系を含めて、ただしこれらだけに限定されない別の発現系で産生することもできる。
【００８８】
組換え抗体は、例えば、クロスフローろ過、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、これらの組合せなどの標準免疫グロブリン精製手順によって、宿主細胞から単離することができる。
【００８９】
或いは、抗体断片は、従来の酵素法によって精製抗体調製物から産生することができ、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、完全抗体のペプシン切断によって産生することができ、Ｆａｂ断片は、完全抗体をパパインで短時間消化することによって産生することができる。
【００９０】
少なくとも２種類の抗原に対して特異性を有する組換え二重特異性及び異種複合（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体断片は、完全長抗体又は（Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体断片などの）抗体断片として調製することができる。２価を超える抗体断片（例えば、３価以上の抗体断片）も企図される。二重特異性抗体、異種複合抗体及び多価抗体は、当業者に公知の標準方法によって調製することができる。
【００９１】
５． 組換え抗体の試験
標的ＨＣＶ抗原に特異的に結合する組換え抗体の能力は、標準免疫学的技術によって評価することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）。例えば、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）又は酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）によって。本発明の一実施形態においては、組換え抗体は、抗原結合ドメインが由来するモノクローナル抗体と実質的に同じ特異性を示す。
【００９２】
組換え抗体も、標準技術によって平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定することによって、標的ＨＣＶ抗原に対するその結合親和性を試験することができる。本発明の一実施形態においては、組換え抗体（例えば、キメラ抗体）は、約１μＭ未満のＫ_Ｄを有する。別の一実施形態においては、組換え抗体（例えば、キメラ抗体）は、約１００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する。更に別の一実施形態においては、組換え抗体は、ＨＣＶタンパク質エピトープに特異的に結合するキメラ抗体であってもよく、前記キメラ抗体は、以下からなる群から選択される。
【００９３】
（ａ）（例えば、実施例９に記載のように）約０．１ｎＭから約１．０ｎＭ、場合によっては約０．４ｎＭ、約０．５、ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ又は約０．８ｎＭの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を有するＨＣＶコアキメラ抗体、
（ｂ）（例えば、実施例１０に記載のように）約１０．０ｎＭから約１００．０ｎＭ、場合によっては約５０ｎＭ、約５６ｎＭ、約６２ｎＭ、約６８ｎＭ又は約７４ｎＭの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を有するＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体、
（ｃ）（例えば、実施例１１に記載のように）約０．１ｎＭから約１．０ｎＭ、場合によっては約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ又は約０．６ｎＭの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を有するＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体、
（ｄ）（例えば、実施例１２に記載のように）約１．０ｎＭから約１０．０ｎＭ、場合によっては約８．４ｎＭ、約８．６ｎＭ、約８．８ｎＭ又は約９．０ｎＭの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を有するＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体。
【００９４】
別の標準試験を抗体に対して実施することもでき、例えば、キメラ抗体などの抗体のｐＩ値を実施例１３に記載のように得ることができる。一実施形態においては、ＨＣＶタンパク質エピトープに特異的に結合する本発明によるキメラ抗体は、約７．８から約９．０のｐＩ値を各々含んでもよい。別の一実施形態においては、キメラ抗体は、（ａ）約８．８から約９．２、場合によっては約９．０のｐＩ値を有するＨＣＶコアキメラ抗体、（ｂ）約８．５から約９．０のｐＩ値を有するＨＣＶ ＮＳ３抗体、（ｃ）約７．８から約８．７のｐＩ値を有するＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体、及び（ｄ）約８．０から約８．９のｐＩ値を有するＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体からなる群から選択される。
【００９５】
組換え抗体（例えば、キメラ抗体）をエピトープマッピング手順に供して、組換え抗体が結合する標的抗原領域を特定してもよい。エピトープマッピングの種々の方法は当分野で公知であり（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）、例えば、ファージ及び酵母ディスプレイ法が挙げられる。ファージ及び酵母ディスプレイ法は、抗体結合に関与する標的抗原の残基をより正確に位置づけるために、ランダム変異導入技術と組み合わせることもできる（例えば、Ｃｈａｏ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １０： ５３９−５０（２００４）参照）。
【００９６】
本発明の一実施形態においては、組換え抗体が結合する標的抗原の残基は、アラニン置換変異（ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｌａｎｉｎｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）と酵母ディスプレイを組み合わせた技術によって特定される。この手順の非限定的例を下記実施例の項に記載する。この技術は、一般に、各々が抗原の標的領域であり、この領域の個々のアミノ酸がアラニンで順次置換されたペプチドをコードする一連のオリゴヌクレオチドの調製を含む。抗原の標的領域は、初期免疫化において親モノクローナル抗体を調製するのに用いられた抗原から、又は酵母若しくはファージディスプレイを用いた予備的「低分解能」スクリーニングから、決定される。抗原の野生型バージョンを対照として使用する。各オリゴヌクレオチドを適切な酵母ディスプレイベクターにクローニングし、各アラニン変異体をＥ．コリなどの適切な宿主に転換する。プラスミドＤＮＡを抽出し、配列決定し、クローンを配列決定に基づいて選択する。酵母ディスプレイベクターは当分野で公知であり、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能なｐＹＤ１）。
【００９７】
次いで、選択されたクローンをサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）細胞、例えば、ＥＢＹ１００細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に転換し、個々の酵母クローンを培養し、ペプチド発現を誘導する。細胞表面でアラニン変異体を発現する誘導された酵母細胞を組換え抗体と一緒に温置し、結合した抗体を従来の方法によって、例えば標識二次抗体を用いて、検出する。次いで、組換え抗体に結合することができないアラニン変異体の特定に基づいて、標的抗原領域中の重要な残基を決定することができる。抗体結合活性の低下は、変異体が、組換え抗体に対するエピトープの一部を形成する位置にアラニン残基を含むことを示す。
【００９８】
６． 組換え抗体の使用
本発明の組換え抗体は、例えば、伝統的な血しょう又は血清の代わりに、ＨＣＶ抗体の検出用アッセイ又はキットにおいて、ＨＣＶ検出用診断試薬として、及び／又は標準化試薬、正の対照試薬若しくは較正用物質試薬としての使用に適切である。標準化試薬は、例えば、抗体濃度の内挿のための検量線を設定するために使用することができる。正の対照は、アッセイ性能特性を設定するために、及び／又はアッセイに使用する抗原の完全性を定量及びモニターするために、使用することができる。本発明は、各組換え抗体が異なるＨＣＶ抗原に特異的に結合可能である複数の組換え抗体の標準化抗体感受性パネルとしての使用も規定する。かかる感受性パネルは、例えば、ＨＣＶ抗体検出キットの品質管理のための伝統的な血しょう又は血清の代わりに、アッセイ性能特性を設定するために、及び／又はアッセイに使用する抗原の完全性を定量及びモニターするために、使用することができる。本発明は、ＨＣＶ感染症の治療又は予防における組換え抗体の使用も企図する。
【００９９】
したがって、本発明の一実施形態は、各々がＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能である１種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬を規定する。
【０１００】
本発明の一実施形態においては、免疫診断試薬は、異なるＨＣＶ抗原を各々検出可能である複数（例えば、２種類以上）の組換え抗体を含む。
【０１０１】
免疫診断試薬は、免疫診断試薬が含む組換え抗体を適切に選択することによって、特定の最終用途に合わせることができ、したがって免疫診断試薬を幾つかの既存のＨＣＶ検出アッセイ形式及びキットに適合させることができる。このようにして用途に合わせて作製される免疫診断試薬は、ＨＣＶ感染症のある段階の検出に対して試薬を最適化することもできる。例えば、ＨＣＶコア及びＮＳ３タンパク質、場合によってはＨＣＶ Ｅ２タンパク質に対する組換え抗体を含む免疫診断試薬は、例えば血液製剤のスクリーニングに特に重要であり得る早期ＨＣＶ感染症の検出を可能にする。したがって、本発明の一実施形態は、早期ＨＣＶ感染症の検出に、及び／又は早期ＨＣＶ感染症用キット及びアッセイの標準化に適切である、ＨＣＶコアタンパク質に特異的な組換え抗体と、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的な組換え抗体とを含み、場合によってはＥ２タンパク質に特異的な組換え抗体、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的な組換え抗体、及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的な組換え抗体のうち１つ以上を更に含んでもよい、免疫診断試薬を規定する。
【０１０２】
本発明の一実施形態においては、免疫診断試薬に含まれる各抗体は、その標的抗原に対して、実質的に同一のアッセイ条件下でヒト血清起源の対照の反応性よりも高い又は同等の反応性を示す。
【０１０３】
本発明は、さらに、異なるＨＣＶ抗原タンパク質に各々特異的に結合可能である複数の組換え抗体を含む免疫診断試薬を感受性パネルとして用いたＨＣＶ抗体検出アッセイを標準化する方法を規定する。
【０１０４】
本発明は、さらに、ＨＣＶ抗原を含む疑いのある試験試料を、ＨＣＶ抗原に各々特異的に結合可能である１種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬と、組換え抗体：抗原複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、及び形成された任意の組換え抗体：抗原複合体を検出することを含む、ＨＣＶ抗原の存在を検出する方法を規定する。
【０１０５】
本発明は、ＨＣＶ抗体を含む疑いのある試験試料を、ＨＣＶ抗体に特異的な１種類以上の抗原と、抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、抗原：抗体複合体を検出すること、及び方法に使用される抗原の１種類に各々特異的に結合可能である１種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬を正の対照又は標準化試薬として使用することを含む、ＨＣＶ抗体の存在を検出する方法も包含する。
【０１０６】
本発明の免疫診断試薬は、ヒト、及びＨＣＶ感染に感受性があり、ＨＣＶ感染に対して抗体応答を生じ得る別の脊椎動物種において、ＨＣＶ応答をモニターするアッセイ及びキットを用いた使用に適切である。したがって、免疫診断試薬は、ヒトの医用及び獣医学用途を有する。
【０１０７】
本発明の別の一態様は、それぞれＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５タンパク質に特異的である抗体の可変領域のアミノ酸及び対応する核酸配列を提供する。これらの配列は、当分野で公知である別の組換え抗体の生成に有用であり、ヒト又はヒト化抗体のライブラリー又はバンクに含まれる可変領域など、ヒト又はヒト化抗体のかなり相同である可変領域の特定に有用である。
【０１０８】
本発明は、新規組換え抗体をインビトロで生成するための、ファージディスプレイ技術、細菌及び酵母細胞表面ディスプレイ技術などの定方向分子進化技術における、本明細書に記載の組換え抗体及び可変領域の使用も包含する（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３： ５６４（１９９３）、及びＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２： ６２４（１９９１）参照）。
【０１０９】
本発明の免疫診断試薬、例えばキメラ抗体は、例えば実施例１４に記載のように、市販プラットホームの免疫測定法に使用してもよい。例えば、本明細書に記載のように調製される４種類のキメラ抗体（ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５）は、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及びＥＩＡ（Ｂｅａｄ）プラットホームの種々のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＨＣＶ血液スクリーニングアッセイに使用することができ、別の市販及び／又はインビトロ診断アッセイに品質管理試薬（例えば、感受性パネル、較正用物質及び正の対照）として使用することもできる。
【０１１０】
７． 組換え抗体を含む組成物
上述したように、本発明の組換え抗体は、診断及び／又は治療に使用することができる。したがって、本発明の一態様は、１種類以上の組換え抗体と適切な担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む、診断及び薬剤組成物も規定する。適切な担体、希釈剤及び／又は賦形剤は、当分野で周知である。したがって、医薬品製造用の１種類以上の本発明の組換え抗体の使用も提供する。薬剤組成物の調製のために、担体、希釈剤及び賦形剤は薬学的に許容されるものである。必要に応じて、アジュバント又は他の活性成分を薬剤組成物に含めることができる。
【０１１１】
動物に投与する場合、薬剤組成物は、種々の経路による投与用に処方することができる。例えば、組成物は、経口、局所、直腸若しくは非経口投与、又は吸入若しくは噴霧投与用に処方することができる。本明細書では非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、鞘内、胸骨内注射又は注入技術を含む。上述したように、かかる薬剤組成物は、ヒトを含めた動物における種々の症状の治療に使用される。
【０１１２】
薬剤組成物は、好ましくは、本発明の組換え抗体の治療有効量を含む。本明細書では「治療有効量」という用語は、目的の疾患若しくは症状の治療、改善若しくは予防に必要な治療薬の量を指し、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療薬の量を指す。抗体の場合、治療有効量は、例えば、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長目において、初期に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、かかる情報を使用して、ヒトを含めて、治療すべき動物における投与の有用な用量及び経路を決定することができる。
【０１１３】
異なる投与経路に適切な種々の診断組成物及び薬剤組成物、並びに薬剤組成物の調製方法は当分野で公知であり、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（以前は”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”）； Ｇｅｎｎａｒｏ， Ａ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ（２０００）に記載されている。
【０１１４】
８． 組換え抗体を含むキット
本発明は、さらに、１種類以上の本発明の組換え抗体を含む治療、診断及び品質管理キットを規定する。
【０１１５】
ａ． 診断及び品質管理キット
本発明の一態様は、ＨＣＶ検出用診断キットを提供する。キットは、１種類以上の本発明の組換え抗体を含む。組換え抗体は、ＨＣＶ抗原の捕捉及び／又は検出に使用するために、又は抗原：抗体複合体の検出用二次抗体として使用するために、検出試薬としてキット中に用意することができる。或いは、組換え抗体は、正の対照試薬、標準化試薬、較正試薬又は感受性パネルとしてキット中に用意することができる。種々の実施形態においては、診断キットは、ＨＣＶ抗原の検出用試薬、又はＨＣＶ抗体の検出用試薬を更に含み得る。一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ抗体に特異的な１種類以上の抗原を含めた、ＨＣＶ抗体の検出用試薬と、キットに含まれる１種類以上の抗原の１つに各々特異的に結合可能である１種類以上の本発明の組換え抗体を含む正の対照又は標準化試薬とを含む、診断キットを提供する。
【０１１６】
上述したように、本発明の免疫診断試薬、例えばキメラ抗体、並びにアッセイ、キット及びキット成分自体は、市販プラットホームでの使用に対して最適化されていてもよい（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬのＰｒｉｓｍ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及びＥＩＡ（Ｂｅａｄ）プラットホームで使用されるＨＣＶ血液スクリーニングアッセイなどの免疫測定法、並びに他の市販及び／又はインビトロ診断アッセイ）。さらに、アッセイ、キット及びキット成分は、別の形式で、例えば、電気化学的若しくは別の手持ち型又は診療現場（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）でのアッセイシステムに使用することができる。本発明は、例えば、ＴｎＩ、ＣＫＭＢ及びＢＮＰを含めた幾つかの心臓マーカーに対してサンドイッチ免疫測定法を実施する市販Ａｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）電気化学的免疫測定システムに適用可能である。免疫センサー、及び使い捨て試験装置におけるその操作方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号、同２００４００１８５７７号、同２００５００５４０７８号及び同２００６０１６０１６４号に記載されている。電気化学的免疫センサー及び別のタイプの免疫センサーの製造の別の背景は、やはり参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，０６３，０８１号に記載されている。
【０１１７】
免疫診断試薬及び別のキット成分は、品質管理試薬（例えば、感受性パネル、較正用物質及び正の対照）として使用してもよい。品質管理試薬の調製は、当分野で周知であり、例えば種々の免疫診断製品挿入シートに記載されている。ＨＣＶ感受性パネルメンバーは、例えば、本発明によるキメラ抗体の既知量を適切なアッセイ緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤）に添加（ｓｐｉｋｅ）することによって、「低」から「高」の範囲のＨＣＶ抗体の既知量を含む可変量を調製してもよい。これらの感受性パネルメンバーは、アッセイ性能特性を設定するのに使用してもよく、さらに、免疫測定法キット試薬の完全性、及びアッセイの標準化の有用な指標であってもよい。
【０１１８】
別の一実施形態においては、本発明は、アッセイ性能特性を評価する、及び／又はアッセイに用いられる抗原の完全性を定量及びモニターする感受性パネルとして使用するための１種類以上の本発明の組換え抗体を含む、品質管理キットを規定する。
【０１１９】
キットに備えられた組換え抗体は、蛍光団、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能標識を組み入れることができ、又はキットは、組換え抗体を標識する試薬、若しくは組換え抗体を検出する試薬を含むことができる。組換え抗体は、別々の容器で提供することができ、又は適切なアッセイ形式、例えばマイクロタイタープレートに前もって分配することができる。
【０１２０】
キットは、診断アッセイを実施するのに必要な別の試薬を含んでもよく、又は緩衝剤、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬など、品質管理評価を容易にするのに必要な別の試薬を含んでもよい。緩衝剤、試験試料の単離及び／又は処理のための溶液などの別の成分を、キットに含めることもできる。キットは、１種類以上の対照を更に含むことができる。キットの成分の１個以上は、凍結乾燥させることができ、キットは、凍結乾燥成分の再構成に適切である試薬を更に含むことができる。
【０１２１】
キットの種々の成分は、適切な容器で提供される。上述したように、容器の１個以上をマイクロタイタープレートとすることができる。必要に応じて、キットは、反応器、混合容器、及び試薬又は試験試料の調製を容易にする他の成分を含んでもよい。キットは、シリンジ、ピペット、ピンセット、正確に計ったスプーンなど、試験試料を得るのを助ける１個以上の器具を含んでもよい。
【０１２２】
キットは、紙形式、又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な形式で提供することができる使用説明書を含んでもよい。
【０１２３】
ｂ． 治療キット
本発明は、本発明の組換え抗体の１種類以上、又はＨＣＶ感染症の治療若しくは予防に用いられる組換え抗体の１種類以上を含む薬剤組成物を含む、治療キット又はパックを更に規定する。キットの個々の成分は、別々の容器に包装することができ、適用可能なときには、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知を添付することができ、この通知は、ヒト又は動物投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を示す。キットは、本発明の組換え抗体と併用される１種類以上の別の治療薬を更に含んでもよい。キットは、組換え抗体及び／又は追加の治療薬の使用方法又は投与計画を概説する説明書又は指示書を含んでもよい。
【０１２４】
キットの１個以上の成分を溶液、例えば水溶液又は無菌水溶液として提供するときには、容器手段自体を吸入器、シリンジ、ピペット、点眼器又は別の同様の装置とすることができ、容器から溶液を対象に投与することができ、又はキットの別の成分に適用し、混合することができる。
【０１２５】
キットの成分は、乾燥又は凍結乾燥体として提供することもでき、キットは、凍結乾燥成分の再構成に適切な溶媒を更に含むことができる。容器の数又はタイプと無関係に、本発明のキットは、患者への組成物の投与を助ける器具を含むこともできる。かかる器具は、吸入器、シリンジ、ピペット、ピンセット、正確に計ったスプーン、点眼器、又は類似の医学的に認可された送達ビヒクルであり得る。
【０１２６】
本明細書に記載の発明をより理解するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、本発明の説明のための実施形態を記述するものであって、本発明の範囲を限定するものでは決してないことを理解されたい。
【０１２７】
実施例
【実施例１】
【０１２８】
Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質に特異的なヒト−マウスキメラ抗体の調製＃１
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５を、Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２６６： ５５０（１９７７）に記載のＰＥＧ媒介性融合技術を用いて作製した。手短に述べると、ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを、（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−５０に対応する）ｐλコアとして知られる精製ＨＣＶ組換えコア抗原で免疫した。動物追加免疫投薬計画はフロイントアジュバント系を利用し、抗ＨＣＶ力価が確認されるまで、ＨＣＶ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で血清試料をモニターした。ＥＩＡの場合、コアアミノ酸１−１５０（及びＮＳ３アミノ酸１１９２−１４５７）を含むＨＣＶ組換えコア抗原を、９６ウェルＥＩＡプレートに室温で少なくとも１時間塗布し、次いで２％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝剤で１時間ブロックした。被覆ウェルにマウス血清試料を添加し、プレートを室温で少なくとも１時間温置した。温置後、プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と一緒に約１時間温置した。プレートをＯ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を用いて現像し、４９２ｎｍの光学濃度で読んだ。
【０１２９】
次いで、マウスひ臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫と融合させ、１０％ウシ胎児血清を含み、ＨＡＴが補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ）中で３７℃で培養した。ハイブリドーマの抗ＨＣＶ反応性をＥＩＡによって１０−１４日後に試験した。抗ＨＣＶモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを標準単細胞希釈技術によってクローン化し、続いてクローンの反応性をＥＩＡによって試験した。陽性培養物を、１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中で増殖させ、次いで液体窒素中で長期貯蔵するために凍結保存剤中で凍結させた。
【０１３０】
（「ＨＣＶ ２０１−６０３−１９５」としても知られる）ネズミハイブリドーママウスひ臓細胞系抗ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年１１月２１日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−８０２７のもとに寄託した。
【０１３１】
ｍＲＮＡの単離、並びにマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の特定
上述したように得られた抗ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５ハイブリドーマ細胞系をハイブリドーマ無血清培地（ＨＳＦＭ）中で培養して、約５×１０^６個の細胞をｍＲＮＡ精製用に得た。ポリＡ＋ｍＲＮＡを細胞から単離し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を製造者の指示に従って用いて精製した。
【０１３２】
次いで、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ（登録商標）セット（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応に精製ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた。各Ｍｕ Ｉｇ Ｖ_Ｈ ５’−Ａプライマー、Ｍｕ Ｉｇ Ｖ_Ｈ ５’−Ｂプライマー、Ｍｕ Ｉｇ Ｖ_Ｈ ５’−Ｃプライマー、Ｍｕ Ｉｇ Ｖ_Ｈ ５’−Ｄプライマー、Ｍｕ Ｉｇ Ｖ_Ｈ ５’−Ｅプライマー及びＭｕ Ｉｇ Ｖ_Ｈ ５’−ＦプライマーをＶ_Ｈ ＲＴ−ＰＣＲ反応用Ｍｕ ＩｇＧ Ｖ_Ｈ ３’−２プライマーと個々に組み合わせた。各Ｍｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ５’−Ａプライマー、Ｍｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ５’−Ｂプライマー、Ｍｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ５’−Ｃプライマー、Ｍｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ５’−Ｄプライマー、Ｍｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ５’−Ｅプライマー、Ｍｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ５’−Ｆプライマー及びＭｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ５’−ＧプライマーをＶ_Ｌ ＲＴ−ＰＣＲ反応用Ｍｕ ＩｇカッパＶ_Ｌ ３’−ｌプライマーと個々に組み合わせた。各ＲＴ−ＰＣＲ反応を２×反応緩衝剤（ｄＮＴＰ）、各５’と３’プライマー対及びＲＴ−Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）２．５単位中で実施した。ｃＤＮＡ合成及び予備変性を５０℃３０分間１サイクル及び９４℃２分間１サイクルで実施し、続いて変性９４℃１分間、アニーリング５０℃１分間及び伸長６８℃２分間、更に最終伸長７２℃６分間を含むＰＣＲ反応を実施した。合計４５サイクルを実施した。
【０１３３】
陽性ＰＣＲ産物は、ＢとＣの重鎖（Ｈ）プライマーセット（ＶＨ−Ｂ、ＶＨ−Ｃ）及びＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇの軽鎖（Ｌ）プライマーセット（ＶＬ−Ａ、ＶＬ−Ｂ、ＶＬ−Ｅ、ＶＬ−Ｆ、ＶＬ−Ｇ）から認められた。すべての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ ＴＯＰＯ ２．１ ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングし、Ｅ．コリＤＨ５αに転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を製造者の指示に従って用いてプラスミドＤＮＡをＥ．コリ細胞から抽出し、各ＰＣＲ産物についてＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入をＥｃｏＲ Ｉ消化によって確認した。Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入断片の各々の最終ＴＡクローンを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（商標）ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、軽鎖可変又は重鎖可変領域の配列アラインメントによって選択した。手短に述べると、各ＴＡクローンをＬＢブロス中で終夜振とうしながら３７℃で増殖させた。各クローン由来のプラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製し、Ｍ１３順方向及び逆方向プライマー並びにＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって配列決定した。配列をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅソフトウェアに入力し、整列させた。完全に整列した、すなわち変異、挿入又は欠失のない配列を正しいクローンと考え、更なる発生用に選択した。配列結果によって、ＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号１がハイブリドーマ細胞系からの（配列番号２で示すポリペプチドをコードする）正しいＶ_Ｌ配列（配列番号８）を含むことを確認し、ＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１が（配列番号１で示すポリペプチドをコードする）正しいＶ_Ｈ配列（配列番号７）を含むことを確認した（図２Ａ−Ｄ参照）。
【０１３４】
ｐＢＯＳベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子のクローニング
ｐＢＯＳベクターは当分野で公知であり、例えば、（これらのベクター及びベクター自体の使用に関するその教示を参照により本明細書に組み入れる）米国特許出願公開第２００５／０２２７２８９号に記載されている。
【０１３５】
ＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号１をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｌ配列のクローンを作製するように１対のＰＣＲプライマー、すなわち、配列
５’−ＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴ−３’［配列番号３］
を含むＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｌ ５’末端プライマーと配列
５’−ＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴ−３’［配列番号４］
を含むＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｌ ３’末端プライマーを設計した。
【０１３６】
５’末端プライマー（配列番号３）は、部分的カッパシグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマー（配列番号４）はＢｓｉＷ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。また、ＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｈ配列のクローンを作製するように１対のプライマー、すなわち、配列
５’−ＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴ−３’［配列番号５］
を含むＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｈ ５’末端プライマーと配列
５’−ＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴ−３’［配列番号６］
を含むＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｈ ３’末端プライマーを設計した。
【０１３７】
このプライマー対の場合、５’末端プライマー（配列番号５）は部分的重鎖シグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマー（配列番号６）はＳａｌ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。
【０１３８】
５’末端及び３’末端プライマーの各々１５ｐｍｏｌ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１．２５単位、並びにＴＡクローンプラスミドＤＮＡ １００ｎｇを用いて、ＰＣＲを２×Ｐｆｘ増幅緩衝剤中で実施した。ＰＣＲを９４℃１５秒間、続いて６８℃１分間の３０サイクル実施した。
【０１３９】
上記プライマー対、並びにそれぞれＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号１及びＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１をテンプレートとして用いたＰＣＲによって、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ配列を独立に増幅した。Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ ＰＣＲ産物を制限酵素によってそれぞれＮｒｕ Ｉ／ＢｓｉＷ Ｉ及びＮｒｕ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ消化により切り取り、次いで（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｋベクター又は（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｇベクターにクローニングし、Ｅ．コリＤＨ５αに転換した。ｐＢＯＳ−ｈｃｋベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製開始点、ＳＶ４０複製開始点、ＥＦ−１ａプロモーター、カッパシグナルペプチド及びヒトカッパ遺伝子（ｈｃｋ）を含む。ｐＢＯＳ−ｈｃｇベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製開始点、ＳＶ４０複製開始点、ＥＦ−１ａプロモーター、重鎖シグナルペプチド及びヒト定常ＩｇＧ遺伝子（ｈｃｇ１，２，非ａ）を含む。
【０１４０】
転換されたＥ．コリクローンをＬＢブロス中で終夜振とうしながら３７℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって個々のクローンから精製し、続いてＢｉｇｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって配列決定した。（Ｖ_Ｌ配列を含む）プラスミドｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｌ−Ｔ９及び（Ｖ_Ｈ配列を含む）ｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｈ−Ｔ４を配列決定によって選択した。それぞれのｐＢＯＳクローンを確認した後、ｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｌ−Ｔ９プラスミド又はｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｈ−Ｔ４プラスミドを含む別々のＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製して、ｐＢＯＳクローンを保存した。
【０１４１】
キメラ抗体機能試験
ｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｌ−Ｔ９及びｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｈ−Ｔ４プラスミドＤＮＡを、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ−ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ＣＡ）を用いて標準技術によって調製した。次いで、こうして得られた高純度プラスミドＤＮＡをＣＯＳ ７Ｌ細胞に電気穿孔法（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって一過性導入した。移入されたＣＯＳ ７Ｌ細胞を５％ＣＯ_２恒温器中で３７℃で３日間温置し、次いで遠心分離によって４０００ｒｐｍで２０分間回収し、上清を収集した。ろ過し、標準プロテインＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）親和性精製後、精製抗ＨＣＶコアキメラ抗体を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によって評価して、ＨＣＶコア抗原との反応性を確認した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト（「ＧＡＨ」）ＩｇＧ抗体を検出抗体として用い、キメラ抗体濃度を変えて、ＥＩＡを上述したように実施した。ＥＩＡの結果によれば、一過性発現から得られるＨＣＶコアキメラ抗体は、ＨＣＶコア抗原に対して反応性であった。
【０１４２】
安定な発現ベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のクローニング
ｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｌ−Ｔ９及びｐＢＯＳ ２０１−６０３−１９５−Ｈ−Ｔ４クローンを用いて、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。まず、それぞれのベクター中のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列に隣接するＳｒｆ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ制限酵素切断部位を用いて、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の各々をベクターから切り出した。切り出した配列をゲル精製し、次いで（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＶベクター又は（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＪＶベクターにクローニングした。ｐＪＶスタッファープラスミドは、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）から得られ、ＳＶ４０プロモーター、ネズミＤＨＦＲ遺伝子、ＣＭＶエンハンサー、アデノウイルス主要後期（ＡＭＬ）プロモーター及びラムダスタッファーを含む。（やはりＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡから得られる）ｐＢＶスタッファープラスミドは、ＣＭＶエンハンサー、アデノウイルス主要後期（ＡＭＬ）プロモーター及びラムダスタッファーを含む。
【０１４３】
ｐＢＶ及びｐＪＶクローンをＳｒｆ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ制限酵素消化によってスクリーニングして、正しい挿入断片を含むクローンを特定した。正しいｐＢＶ及びｐＪＶクローンを特定した後、各プラスミドをＡｓｃ Ｉ及びＰａｃ Ｉで消化することによって、（ｐＢＶ由来の）重鎖遺伝子及び（ｐＪＶ由来の）軽鎖遺伝子を１つのプラスミドにクローニングした。軽鎖遺伝子プラスミド（ｐＪＶ）の場合、Ｐａｃ Ｉ／Ａｓｃ Ｉ消化によって、２個の明確なバンドが４．８Ｋｂ及び１．５ｋｂに生成した。重鎖遺伝子プラスミド（ｐＢＶ）の場合、Ｐａｃ Ｉ／Ａｓｃ Ｉ消化によって、２個の明確なバンドが４．６ｋｂ及び１．２ｋｂに生成した。ｐＪＶプラスミド由来の４．８ｋｂ ＤＮＡ断片及びｐＢＶ由来の４．６ｋｂ ＤＮＡ断片をゲル精製し、連結して、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の配列を含むｐＢＪプラスミドを形成させた。形質転換後、最終ｐＢＪクローンのｐＢＪ ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５をＳｒｆ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化によるスクリーニングに基づいて選択して、ｐＢＪ ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５がＶ_ＨとＶ_Ｌの両方の配列を含むことを確認した。こうして得られたＨＣＶコアキメラ抗体の最終ｐＢＪクローン（ｐＢＪ ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５）のプラスミドマップを図１に示す。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子配列を図２Ａ−Ｂに示す（それぞれ配列番号７及び８）。ｐＢＪ ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５クローンを含むＥ．コリ細胞バンクを作製した。
【０１４４】
安定なＣＨＯ細胞系の樹立及びＨＣＶコアキメラ抗体の発現
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ、Ｂ３．２、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）細胞系を、以下に示す移入及び安定なキメラ抗体発現に使用した。ＣＨＯ細胞を培養し、標準的リン酸カルシウム媒介性移入によってｐＢＪ ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５プラスミドを移入した。移入されたＨＣＶコアＣＨＯ細胞を数週間培養後、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター選別機を用いて９６ウェルプレートに単細胞クローニングした。ＣＨＯクローンが５０％を超える培養密度に増殖した後、上清を抗原特異的ＥＩＡによって試験して、ＣＨＯクローンの性能をランク付けした。ＥＩＡを、種々の濃度のキメラ抗体を用いて上述したように実施した。ＥＩＡで最高シグナルを与えた１６種類のＣＨＯクローンを増殖させ、再評価した。次いで、クローンＣＨＯ ２０１−６０３−４８６を含めて、１０種類のＣＨＯクローンをＥＩＡアッセイで得られた最高シグナルに基づいて選択し、ＣＤ ＣＨＯ無血清組織培地に切り換えた（ｗｅａｎ）。フローサイトメーターを用いたもう１回の単細胞サブクローニング後、キメラ抗体の産生、及び液体窒素中での長期貯蔵用の細胞バンクの開発のために、ＨＣＶコアＣＨＯクローン２０１−６０３−４８６−３３３を増殖させた。標準プロテインＡ（ＰＯＲＯＳ Ａ５０、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）精製手順、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ脱塩カラム精製によって、キメラ抗体をこの細胞系から精製した。
【０１４５】
ＨＣＶコアＣＨＯ ２０１−６０３−４８６−３３３細胞系をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年５月２日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−７５７０のもとに寄託した。
【実施例２】
【０１４６】
Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質に特異的なヒト−マウスキメラ抗体の調製
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７を、コア抗原の代わりにＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣＤとして知られる精製ＨＣＶ組換えＮＳ３抗原を用いて、実施例１に記載のように作製した。ＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣＤ組換え抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２−１４５７＋１６７６−１９３１に対応する。動物免疫化投薬計画は、フロイントアジュバント系中の１回の追加免疫２００μｇと２週間後の食塩水中の融合前追加免疫を利用した。
【０１４７】
（「ＨＣＶ １７−９０３−１２７」としても知られる）ネズミハイブリドーママウスひ臓細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年１１月２１日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−８０２３のもとに寄託した。
【０１４８】
ｍＲＮＡの単離、並びにマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の特定
ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５ハイブリドーマ細胞系に関して実施例１に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７並びにＲＴ−ＰＣＲによって得られたマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列からｍＲＮＡを単離した。陽性ＰＣＲ産物は、ＡとＦの重鎖（Ｈ）プライマーセット（ＶＨ−Ａ、ＶＨ−Ｆ）及びＢ、Ｃ及びＧの軽鎖（Ｌ）プライマーセット（ＶＬ−Ｂ、ＶＬ−Ｃ、ＶＬ−Ｇ）から認められた。すべての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ ＴＯＰＯ ２．１ ＴＡベクターにクローニングし、Ｅ．コリに転換した。コロニーＰＣＲ反応によってクローン挿入断片を確認した。手短に述べると、Ｍ１３順方向及びＭ１３逆方向プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにテンプレートとして煮沸したＥ．コリコロニーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、変性９４℃１分間、アニーリング５０℃１分間及び伸長７２℃２分間、更に最終伸長７２℃６分間を合計３０サイクル含んだ。正しいサイズのＰＣＲ産物を産生するクローンをＬＢブロス中で増殖させた。各プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製し、Ｍ１３順方向及び逆方向プライマーとＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。
【０１４９】
最終ＴＡクローンを、実施例１に記載のように配列アラインメントによって選択した。配列結果によって、ＶＬ−Ｇクローンが正しいＶ_Ｌ配列（配列番号１０で示されるポリペプチドをコードする配列番号１６）を含み、ＶＨ−Ａ及びＦクローンが正しいＶ_Ｈ配列（配列番号９で示されるポリペプチドをコードする配列番号１５）を含むことが確認された（図４Ａ−Ｄも参照）。
【０１５０】
ｐＢＯＳベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子のクローニング
ＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号５をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｌ配列のクローンを作製するように１対のＰＣＲプライマー、すなわち、配列
５’−ＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣ−３’［配列番号１１］
を含むＨＣＶ ＮＳ３抗体Ｖ_Ｌ ５’末端プライマーと配列
５’−ＧＣＧＣＡＴＧＣＧＴＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣ−３’［配列番号１２］
を含むＨＣＶ ＮＳ３抗体Ｖ_Ｌ ３’末端プライマーを設計した。
【０１５１】
５’末端プライマーは、部分的カッパシグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＢｓｉＷ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。また、ＶＨ ＴＡクローン番号２をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｈ配列のクローンを作製するように１対のプライマー、すなわち、配列
５’−ＧＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧ ＧＧＧＧＡＧＧＣ−３’［配列番号１３］
を含むＨＣＶ ＮＳ３抗体Ｖ_Ｈ ５’末端プライマーと配列
５’−ＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣ−３’［配列番号１４］
を含むＨＣＶ ＮＳ３抗体Ｖ_Ｈ ３’末端プライマーを設計した。
【０１５２】
このプライマー対の場合、５’末端プライマーは部分的重鎖シグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＳａｌ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。
【０１５３】
上記プライマー対、並びにそれぞれＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号５及びＶＨ ＴＡクローン番号２をテンプレートとして用いたＰＣＲによって、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ配列を独立に増幅した。５’末端及び３’末端プライマーの各々２０ｐｍｏｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）１単位、並びにテンプレートとして細菌コロニー２μｌを用いて、ＰＣＲを１×ＰＣＲ増幅緩衝剤中で実施した。ＰＣＲを９４℃３０秒間及び５５℃３０秒間、続いて７２℃１分間の３０サイクル実施した。
【０１５４】
Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ ＰＣＲ産物を、実施例１に記載のように、制限酵素によってそれぞれＮｒｕ Ｉ／ＢｓｉＷ Ｉ及びＮｒｕ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ消化により切り取り、次いで（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｋベクター又は（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｇベクターにクローニングした。実施例１に記載のように、（Ｖ_Ｌ配列を含む）プラスミドｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｌ及び（Ｖ_Ｈ配列を含む）ｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｈを配列決定によって選択した。それぞれのｐＢＯＳクローンを確認した後、ｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｌ−Ｔ３プラスミド又はｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｈ−Ｔ２プラスミドを含む別々のＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製して、ｐＢＯＳクローンを保存した。
【０１５５】
キメラ抗体機能試験
実施例１に記載のように、ｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｌ−Ｔ３及びｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｈ−Ｔ２プラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ ７Ｌ細胞に一過性導入した。実施例１に記載のように、移入されたＣＯＳ ７Ｌ細胞から抗ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体を調製し、ＥＩＡによって評価してＨＣＶ ＮＳ３抗原との反応性を確認した。実施例１に記載のように、コア抗原の代わりにＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣＤ ＨＣＶ ＮＳ３抗原を用いてＥＩＡを実施した。ＥＩＡの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、ＨＣＶ ＮＳ３抗原に対して反応性であった。
【０１５６】
安定な発現ベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のクローニング
ｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｌ−Ｔ３及びｐＢＯＳ １７−９０３−１２７−Ｈ−Ｔ２クローンを用いて、実施例１に記載のように、配列を（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＶベクター又は（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＪＶベクターにまずクローニングし、続いてＰａｃ Ｉ／Ａｓｃ Ｉ制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の配列を含むｐＢＪプラスミドｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。ｐＢＪクローンをＳｒｆ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化によってスクリーニングして、ｐＢＪクローンが両方の配列を含むことを確認した。ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体の最終ｐＢＪクローン（ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７）のプラスミドマップを図３に示す。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子配列を図４に示す（それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６）。ＨＣＶ ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７クローンを含むＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０１５７】
安定なＣＨＯ細胞系の樹立及びＨＣＶキメラ抗体の発現
実施例１に記載のように、ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例１に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。９６ウェルプレートを抗原特異的ＥＩＡによって試験し、クローン番号１３２を更なる発生用に選択した。ＥＩＡを上述したように実施した。ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１３２ ＣＨＯ細胞クローンを培養し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター選別機を用いて単細胞を９６ウェルプレートに選別した。ＣＨＯサブクローン番号１７１を選択して、ＣＤ−ＣＨＯ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に切り換えた。キメラ抗体の産生、及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンク（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）の開発のために、最終ＣＨＯ細胞系（ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１）を増殖させた。実施例１に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインＡ精製手順によってこの細胞系から精製した。
【０１５８】
ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１細胞系をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年５月２日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−７５７３のもとに寄託した。
【実施例３】
【０１５９】
Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ４タンパク質に特異的なヒト−マウスキメラ抗体の調製
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４を、コア抗原の代わりにＣＫＳ−Ｃ１００として知られる精製ＨＣＶ組換えＮＳ４抗原を用いて、実施例１に記載のように作製した。ＣＫＳ−Ｃ１００組換え抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１６７６−１９３１に対応する。動物追加免疫投薬計画はフロイントアジュバント系を使用し、抗ＨＣＶ力価が確認されるまでＨＣＶ ＥＩＡで血清試料をモニターした。実施例１に記載のように、コア抗原の代わりにＣＫＳ−Ｃ１００ ＨＣＶ ＮＳ４抗原を用いてＥＩＡを実施した。マウスひ臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫と融合させ、２０％ウシ胎児血清を含み、ＨＡＴが補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）中で３７℃で培養した。ハイブリドーマの抗ＨＣＶ反応性をＥＩＡによって１０−１４日後に試験した。抗ＨＣＶモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを単細胞希釈技術によってクローン化し、続いてクローンの反応性をＥＩＡによって試験した。陽性培養物を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させ、液体窒素中で長期貯蔵するために凍結保存剤中で凍結させた。
【０１６０】
（「ＨＣＶ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４」としても知られる）ネズミハイブリドーママウスひ臓細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年１１月２１日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−８０２１のもとに寄託した。
【０１６１】
ｍＲＮＡの単離、並びにマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の特定
ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５ハイブリドーマ細胞系に関して実施例１に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４並びにＲＴ−ＰＣＲによって得られたマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列からｍＲＮＡを単離した。陽性ＰＣＲ産物は、Ｃの重鎖（Ｈ）プライマーセット（ＶＨ−Ｃ）及びＢ、Ｃ及びＧの軽鎖（Ｌ）プライマーセット（ＶＬ−Ｂ、ＶＬ−Ｃ、ＶＬ−Ｇ）から認められた。すべての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ ＴＯＰＯ ２．１ ＴＡベクターにクローニングし、Ｅ．コリＤＨ５αに転換した。プラスミドＤＮＡをＥ．コリ細胞から抽出し、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入断片をＥｃｏＲ Ｉ消化によって各ＰＣＲ産物について確認した。最終ＴＡクローンを、実施例１に記載のように配列アラインメントによって選択した。配列結果によって、ＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号５が正しいＶ_Ｌ配列（配列番号１８で示されるポリペプチドをコードする配列番号２４）を含み、ＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１６が正しいＶ_Ｈ配列（配列番号１７で示されるポリペプチドをコードする配列番号２３）を含むことが確認された（図６Ａ−Ｄも参照）。
【０１６２】
ｐＢＯＳベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のクローニング
ＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号５をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｌ配列のクローンを作製するように１対のＰＣＲプライマー、すなわち、配列
５’−ＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣ−３’［配列番号１９］
を含むＨＣＶ ＮＳ４抗体Ｖ_Ｌ ５’末端プライマーと配列
５’−ＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ−３’［配列番号２０］
を含むＨＣＶ ＮＳ４抗体Ｖ_Ｌ ３’末端プライマーを設計した。
【０１６３】
５’末端プライマーは、部分的カッパシグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＢｓｉＷ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。また、ＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１６をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｈ配列のクローンを作製するように１対のプライマー、すなわち、配列
５’−ＴＡＣＴＴＣＧＣＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ−３’［配列番号２１］
を含むＨＣＶ ＮＳ４抗体Ｖ_Ｈ ５’末端プライマーと配列
５’−ＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴ−３’［配列番号２２］
を含むＨＣＶ ＮＳ４抗体Ｖ_Ｈ ３’末端プライマーを設計した。
【０１６４】
このプライマー対の場合、５’末端プライマーは部分的重鎖シグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＳａｌ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。
【０１６５】
上記プライマー対、並びにそれぞれＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号５及びＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１６をテンプレートとして用いたＰＣＲによって、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ配列を独立に増幅した。５’末端及び３’末端プライマーの各々１５ｐｍｏｌ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）１．２５単位、並びにテンプレートとしてＴＡクローンプラスミドＤＮＡ １００ｎｇを用いて、ＰＣＲを２×Ｐｆｘ増幅緩衝剤中で実施した。ＰＣＲを９４℃１５秒間、続いて６８℃１分間の３０サイクル実施した。
【０１６６】
Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ ＰＣＲ産物を、実施例１に記載のように、制限酵素によってそれぞれＮｒｕ Ｉ／ＢｓｉＷ Ｉ及びＮｒｕ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ消化により切り取り、次いで（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｋベクター又は（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｇベクターにクローニングした。（Ｖ_Ｌ配列を含む）プラスミドｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｌ−Ｔ４及び（Ｖ_Ｈ配列を含む）ｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｈ−Ｔ２を配列決定によって選択した。それぞれのｐＢＯＳクローンを確認した後、ｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｌ−Ｔ４プラスミド又はｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｈ−Ｔ２プラスミドを含む別々のＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製して、ｐＢＯＳクローンを保存した。
【０１６７】
キメラ抗体機能試験
実施例１に記載のように、ｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｌ−Ｔ４及びｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｈ−Ｔ２プラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ ７Ｌ細胞に一過性導入した。実施例１に記載のように、移入されたＣＯＳ ７Ｌ細胞から抗ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体を調製し、ＥＩＡによって評価してＨＣＶ ＮＳ４抗原（Ｃ１００ Ａｇ）との反応性を確認した。ＥＩＡを上述したように実施した。ＥＩＡの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、ＨＣＶ ＮＳ４抗原に対して反応性であった。
【０１６８】
安定な発現ベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のクローニング
ｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｌ−Ｔ４及びｐＢＯＳ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４−Ｈ−Ｔ２クローンを用いて、実施例１に記載のように、配列を（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＶベクター又は（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＪＶベクターにまずクローニングし、続いてＰａｃ Ｉ／Ａｓｃ Ｉ制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の配列を含むｐＢＪプラスミドｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。ｐＢＪクローンをＳｒｆ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化によってスクリーニングして、ｐＢＪクローンが両方の配列を含むことを確認した。ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体の最終ｐＢＪクローン（ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４）のプラスミドマップを図５に示す。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子配列を図６Ａ−Ｂに示す（それぞれ、配列番号２３及び配列番号２４）。ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４クローンを含むＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０１６９】
安定なＣＨＯ細胞系の樹立及びＨＣＶキメラ抗体の発現
実施例１に記載のように、ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例１に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。ＣＨＯクローンが５０％を超える培養密度に増殖した後、上清を抗原特異的ＥＩＡによって試験して、ＣＨＯクローンの性能をランク付けした。ＥＩＡを上述したように実施した。最高シグナルを示した１６種類のＣＨＯクローンを増殖させ、抗原特異的ＥＩＡによって再評価した。６種類のＣＨＯクローンを選択して、ＣＤ ＣＨＯ無血清組織培地に切り換えた。精製キメラ抗体の産生及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンクの開発のために、ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯクローン＃２０３を増殖させた。実施例１に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインＡ精製手順によってこの細胞系から精製した。
【０１７０】
ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３細胞系をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年５月２日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−７５６９のもとに寄託した。
【実施例４】
【０１７１】
Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５タンパク質に特異的なヒト−マウスキメラ抗体の調製
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７を、ＣＫＳ ＥＦとして知られるＨＣＶ組換え抗原を用いて実施例１に記載のように作製した。ＣＫＳ−ＥＦ組換え抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９３２−２１９１＋２１８８−２４８１に対応する。ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを、フロイントアジュバント系を用いた精製ＨＣＶ組換え抗原（ＣＫＳ−ＥＦ）２００μｇによって１回免疫した。３匹のマウスを３日間融合前追加免疫した後、ひ臓を採取した。
【０１７２】
（「ＨＣＶ ４８−３１１−３８７」としても知られる）ネズミハイブリドーママウスひ臓細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年１１月２１日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−８０２２のもとに寄託した。
【０１７３】
ｍＲＮＡの単離、並びにマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の特定
ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５ハイブリドーマ細胞系に関して実施例１に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７並びにＲＴ−ＰＣＲによって得られたマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列からｍＲＮＡを単離した。陽性ＰＣＲ産物は、Ｃの重鎖（Ｈ）プライマーセット（ＶＨ−Ｃ）及びＢ、Ｃ及びＧの軽鎖（Ｌ）プライマーセット（ＶＬ−Ｂ、ＶＬ−Ｃ、ＶＬ−Ｇ）から認められた。すべての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ ＴＯＰＯ ２．１ ＴＡベクターにクローニングし、Ｅ．コリＤＨ５αに転換した。プラスミドＤＮＡをＥ．コリ細胞から抽出し、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入断片をＥｃｏＲ Ｉ消化によって各ＰＣＲ産物について確認した。最終ＴＡクローンを、実施例１に記載のように配列アラインメントによって選択した。配列結果によって、ＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号８が正しいＶ_Ｌ配列（配列番号２６で示されるポリペプチドをコードする配列番号３２）を含み、ＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１３が正しいＶ_Ｈ配列（配列番号２５で示されるポリペプチドをコードする配列番号３１）を含むことが確認された（図８Ａ−Ｄも参照）。
【０１７４】
ｐＢＯＳベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のクローニング
ＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号８をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｌ配列のクローンを作製するように１対のＰＣＲプライマー、すなわち、配列
５’−ＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＴ−３’［配列番号２７］
を含むＨＣＶ ＮＳ５抗体Ｖ_Ｌ ５’末端プライマーと配列
５’−ＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴ−３’［配列番号２８］
を含むＨＣＶ ＮＳ５抗体Ｖ_Ｌ ３’末端プライマーを設計した。
【０１７５】
５’末端プライマーは、部分的カッパシグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＢｓｉＷ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。また、ＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１３をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｈ配列のクローンを作製するように１対のプライマー、すなわち、配列
５’−ＴＡＣＴＴＣＧＣＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’［配列番号２９］
を含むＨＣＶ ＮＳ５抗体Ｖ_Ｈ ５’末端プライマーと配列
５’−ＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧ−３’［配列番号３０］
を含むＨＣＶ ＮＳ５抗体Ｖ_Ｈ ３’末端プライマーを設計した。
【０１７６】
このプライマー対の場合、５’末端プライマーは部分的重鎖シグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＳａｌ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。
【０１７７】
上記プライマー対、並びにそれぞれＶＬ−Ｇ ＴＡクローン番号５及びＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１６をテンプレートとして用いたＰＣＲによって、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ配列を独立に増幅した。５’末端及び３’末端プライマーの各々１５ｐｍｏｌ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）１．２５単位、並びにテンプレートとしてＴＡクローンプラスミドＤＮＡ １００ｎｇを用いて、ＰＣＲを２×Ｐｆｘ増幅緩衝剤中で実施した。ＰＣＲは、９４℃１５秒間、続いて６８℃１分間の３０サイクルから成った。
【０１７８】
Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ ＰＣＲ産物を、実施例１に記載のように、制限酵素によってそれぞれＮｒｕ Ｉ／ＢｓｉＷ Ｉ及びＮｒｕ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ消化により切り取り、次いで（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｋベクター又は（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｇベクターにクローニングした。（Ｖ_Ｌ配列を含む）プラスミドｐＢＯＳ ４８−３１１−３８７−Ｌ−Ｔ４及び（Ｖ_Ｈ配列を含む）４８−３１１−３８７−Ｈ−Ｔ２を配列決定によって選択した。それぞれのｐＢＯＳクローンを確認した後、ｐＢＯＳ ４８−３１１−３８７−Ｌ−Ｔ４プラスミド又はｐＢＯＳ ４８−３１１−３８７−Ｈ−Ｔ２プラスミドを含む別々のＥ．コリ細胞バンクを作製して、ｐＢＯＳクローンを保存した。
【０１７９】
キメラ抗体機能試験
実施例１に記載のように、ｐＢＯＳ ４８−３１１−３８７−Ｌ−Ｔ４及びｐＢＯＳ ４８−３１１−３８７−Ｈ−Ｔ２プラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ ７Ｌ細胞に一過性導入した。実施例１に記載のように、移入されたＣＯＳ ７Ｌ細胞から抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体を調製し、ＥＩＡによって評価してＨＣＶ ＮＳ５抗原（ＳＯＤ−ＮＳ５；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）との反応性を確認した。実施例１に記載のように、コア抗原の代わりにＣＫＳ ＥＦ ＨＣＶ ＮＳ５抗原を用いてＥＩＡを実施した。ＥＩＡの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、ＨＣＶ ＮＳ５抗原に対して反応性であった。
【０１８０】
安定な発現ベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のクローニング
ｐＢＯＳ ４８−３１１−３８７−Ｌ−Ｔ４及びｐＢＯＳ ４８−３１１−３８７−Ｈ−Ｔ２クローンを用いて、実施例１に記載のように、配列を（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＶベクター又は（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＪＶベクターにまずクローニングし、続いてＰａｃ Ｉ／Ａｓｃ Ｉ制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の配列を含むｐＢＪプラスミドｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。ｐＢＪクローンをＳｒｆ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化によってスクリーニングして、ｐＢＪクローンが両方の配列を含むことを確認した。ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体の最終ｐＢＪクローン（ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７）のプラスミドマップを図７に示す。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子配列を図８Ａ−Ｂに示す（それぞれ配列番号３１及び３２）。ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７クローンを含むＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０１８１】
安定なＣＨＯ細胞系の樹立及びＨＣＶキメラ抗体の発現
実施例１に記載のように、ｐＢＪ ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例１に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。ＣＨＯクローンが５０％を超える培養密度に増殖した後、上清を抗原特異的ＥＩＡによって試験して、ＣＨＯクローンの性能をランク付けした。ＥＩＡを上述したように実施した。最高シグナルを示した６種類のＣＨＯクローンを増殖させ、抗原特異的ＥＩＡによって再評価した。４種類のＣＨＯクローンをＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフロー選別機を用いて単細胞クローニング用に選択した。コンフルエントな成長が明白になった後、培養物をＥＩＡによってスクリーニングして、ＣＨＯ ４８−３１１−２７１と命名されたクローンを含めて、無血清培地に切り換える５種類のクローンを選択した。１回の最終サブクローニングによって、細胞バンク目的でＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯクローン４８−３１１−２７１−４５５を選択した。キメラ抗体の産生及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンクの開発のために、細胞系を増殖させた。実施例１に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインＡ精製手順によってこの細胞系から精製した。
【０１８２】
ＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５細胞系をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年５月２日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−７５７２のもとに寄託した。
【実施例５】
【０１８３】
ＨＣＶコアキメラモノクローナル抗体のエピトープマッピング
実施例１に記載の抗ＨＣＶコアマウスモノクローナル抗体の結合部位を、アミノ酸３２−３６（ＧＧＶＹＬ、配列番号３３）を含むＨＣＶコアタンパク質領域に合成ペプチドを用いて位置づけた。手短に述べると、合成短鎖ペプチドを用いてＥＩＡプレートのウェルを被覆し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝剤でブロックした。抗ＨＣＶコアマウスモノクローナル抗体をＥＩＡプレートに添加し、少なくとも１時間温置した。次いで、ＥＩＡプレートを洗浄し、ヤギ抗マウス（「ＧＡＭ」）ＨＲＰ標識抗体と一緒に更に１時間温置した。プレートを洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を用いて現像し、４９２ｎｍの光学濃度で読んだ。
【０１８４】
続いて、アラニンスキャンニングと酵母ディスプレイ技術の組合せを精密エピトープマッピングに使用した。手短に述べると、各々がコア抗原の２７−３９領域（ＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲ、配列番号３４）であるペプチドであって、この領域の個々のアミノ酸がアラニンで順次置換されたペプチドをコードする１組の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、アラニン変異体のライブラリーを構築した。野生型コア２７−３９断片を対照として用いた。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．から入手可能なベクターｐＹＤ１に基づく）酵母ディスプレイベクター（ｐＹＤ４１）のＮｃｏ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ制限酵素部位にクローニングした。次いで、各ＨＣＶコアアラニン変異体をＥ．コリに転換し、プラスミドＤＮＡを抽出し、配列決定した。最終クローンの選択は、配列決定に基づいた。選択したクローンをＥＢＹ１００サッカロミセス セレビシエ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に転換した。個々の酵母クローンを培養し、ＨＣＶコアペプチド発現を誘導した。誘導した酵母細胞をＨＣＶコアキメラ抗体及び二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）と一緒に温置し、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）によって分析して、抗体結合活性の低下したアラニン変異体を求めた。抗体結合活性の低下は、変異体が、キメラ抗体に対するエピトープの一部を形成する位置にアラニンを含むことを示した。データによれば、（図９Ａに示すように）ＨＣＶコア抗原位置２９（Ｇｌｎ）、３１（Ｖａｌ）、３２（Ｇｌｙ）、３３（Ｇｌｙ）、３６（Ｌｅｕ）がＨＣＶコアキメラ抗体の結合部位である。
【０１８５】
これらの結果によって、配列ＱＩＶＧＧＶＹＬ（配列番号１００）で表されるこの領域が、ＨＣＶコアキメラ抗体と結合するエピトープを含むことが確認される。これらの結果によって、ＨＣＶコアキメラ抗体と結合するためには、配列ＱＸＶＧＧＸＸＬ（式中、Ｘは任意のアミノ酸（配列番号１０１）であり、又はＸはＡｌａ若しくはＧｌｙ（配列番号１０２）である。）のように、他の残基は変化し得ても、これらの抗原性残基は不変でなければならないことが確認される。
【実施例６】
【０１８６】
ＨＣＶ ＮＳ３キメラモノクローナル抗体のエピトープマッピング
ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７によって産生されるＨＣＶ ＮＳ３マウスモノクローナル抗体は、アミノ酸１１９２−１４５７（２６５ａａ）にわたるＨＣＶ ＮＳ３抗原の領域に対して産生された。ＮＳ３キメラ抗体がこの領域内で結合するエピトープを位置づけるために、１２対のＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築することによって２６５ａａ領域を１２個の重複断片に分解した。具体的には、これらのオリゴヌクレオチドは、以下の断片であった：１１９０−１２１６、１２１２−１２３９、１２３５−１２５７、１２５１−１２７２、１２７３−１３０１、１２９７−１３２３、１３２１−１３４７、１３４１−１３６７、１３６４−１３８７、１３８８−１４１４、１４１１−１４３８及び１４３４−１４５９。ＤＮＡオリゴヌクレオチド対をアニールし、酵母ディスプレイベクター（ｐＹＤ４１）のＮｃｏ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ制限酵素部位にクローニングした。ＨＣＶ ＮＳ３ベクターの各々をＥ．コリに転換し、プラスミドＤＮＡを抽出し、配列決定した。最終クローンの選択は、配列決定に基づいた。選択したクローンをＥＢＹ１００サッカロミセス セレビシエ細胞に転換した。個々の酵母クローンを培養し、ＨＣＶ ＮＳ３ペプチド発現を誘導した。誘導した酵母細胞をＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体及び二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ヤギ抗ヒトＩｇＧ）と一緒に温置し、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）によって分析して、キメラ抗体に対して正の結合を示す、したがってエピトープの位置を示す、断片を決定した。データによれば、ＨＣＶ ＮＳ３断片１１９０−１２１６（ＡＫＡＶＤＦＶＰＶＥＳＬＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰ、配列番号３５）のみが正の結合を示した。
【０１８７】
次いで、アラニンスキャンニング及び酵母ディスプレイ技術を精密エピトープマッピングに使用した。コア抗原に対して実施例５に概説したように、１１９０−１２１６領域であるアラニン変異体のライブラリーを、１組の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて構築した。野生型ＮＳ３ １１９０−１２１６断片を対照として用いた。酵母ディスプレイを実施例５に記載のように実施し、誘導した酵母細胞をＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体及び二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ヤギ抗ヒトＩｇＧ）と一緒に温置し、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）によって分析して、抗体結合活性の低下したアラニン変異体を求めた。データによれば、（図９Ｂに示すように）ＨＣＶ ＮＳ３抗原位置１１９４（Ａｓｐ）、１１９５（Ｐｈｅ）、１１９６（Ｖａｌ）、１１９７（Ｐｒｏ）、１１９９（Ｇｌｕ）、１２０１（Ｌｅｕ）、１２０２（Ｇｌｕ）及び１２０５（Ｍｅｔ）がＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体の結合部位である。
【０１８８】
これらの結果によって、配列ＤＦＶＰＶＥＳＬＥＴＴＭ（配列番号１０３）で表されるこの領域が、ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体と結合するエピトープを含むことが確認される。これらの結果によって、ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体と結合するためには、配列ＤＦＶＰＸＥＸＬＥＸＸＭ（式中、Ｘは任意のアミノ酸（配列番号１０４）であり、又はＸはＡｌａ若しくはＧｌｙ（配列番号１０５）である。）のように、他の残基は変化し得ても、これらの抗原性残基は不変でなければならないことが確認される。
【実施例７】
【０１８９】
ＨＣＶ ＮＳ４キメラモノクローナル抗体のエピトープマッピング
実施例５及び６に概説したように、ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３細胞系によって産生されたＨＣＶ ＮＳ４キメラモノクローナル抗体を、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び標準酵母ディスプレイ技術を用いて、アミノ酸１６９２−１７１３（ＰＡＩＩＰＤＲＥＶＬＹＲＥＦＤＥＭＥＥＣＳＱ、配列番号３６）で表されるＨＣＶ ＮＳ４抗原の領域に位置づけた。次いで、アラニンスキャンニング及び酵母ディスプレイ技術を精密エピトープマッピングに使用した。コア抗原に対して実施例５に概説したように、１６９２−１７１３領域であるアラニン変異体のライブラリーを、１組の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて構築した。野生型ＮＳ４ １６９２−１７１３断片を対照として用いた。酵母ディスプレイを実施例５に記載のように実施し、誘導した酵母細胞をＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体及び二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ヤギ抗ヒトＩｇＧ）と一緒に温置し、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）によって分析して、抗体結合活性の低下したアラニン変異体を求めた。データによれば、（図９Ｃに示すように）ＨＣＶ ＮＳ４抗原位置１７０１（Ｌｅｕ）、１７０２（Ｔｙｒ）、１７０４（Ｇｌｙ）、１７０５（Ｐｈｅ）、１７０６（Ａｓｐ）がＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体の結合部位である。
【０１９０】
これらの結果によって、配列ＬＹＲＥＦＤ（配列番号１０６）で表されるこの領域が、ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体と結合するエピトープを含むことが確認される。これらの結果によって、ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体と結合するためには、配列ＬＹＸＥＦＤ（式中、Ｘは任意のアミノ酸（配列番号１０７）であり、又はＸはＡｌａ若しくはＧｌｙ（配列番号１０８）である。）のように、他の残基は変化し得ても、これらの抗原性残基は不変でなければならないことが確認される。
【実施例８】
【０１９１】
ＨＣＶ ＮＳ５キメラモノクローナル抗体のエピトープマッピング
ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７によって産生されるＨＣＶ ＮＳ５マウスモノクローナル抗体は、アミノ酸２０５４−２４８１（４２８ａａ）領域にわたるＨＣＶ ＮＳ５抗原の領域に対して産生された。ＮＳ５キメラ抗体がこの領域内で結合するエピトープを位置づけるために、１８対のＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築することによって４２８ａａ領域を１８個の重複断片に分解した。具体的には、これらのオリゴヌクレオチドは以下の断片であった：２０４８−２０７６、２０７５−２１０１、２０９８−２１２４、２１２０−２１４６、２１４４−２１７７、２１６９−２１９６、２１９３−２２２１、２２２０−２２４７、２２４５−２２７２、２２７１−２２９６、２２９２−２３１８、２３１３−２３３９、２３３６−２３６３、２３６０−２３８６、２３８２−２４０８、２４０８−２４３６、２４３５−２４６２及び２４５７−２４８６。これらの１８対のオリゴヌクレオチド及びＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体を利用したエピトープマッピングを実施例６に記載のように実施した。データによれば、ＨＣＶ ＮＳ５断片２３８２−２４０８（２３８２−ＡＥＳＹＳＳＭＰＰＬＥＧＥＰＧＤＰＤＬＳＤＧＳＷＳＴＶ−２４０８、配列番号３７）のみが正の結合を示した。
【０１９２】
次いで、アラニンスキャンニング及び酵母ディスプレイ技術を精密エピトープマッピングに使用した。コア抗原に対して実施例５に概説したように、２３８２−２４０８領域であるアラニン変異体のライブラリーを、１組の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて構築した。野生型ＮＳ５ ２３８２−２４０８断片を対照として用いた。酵母ディスプレイを実施例５に記載のように実施し、誘導した酵母細胞をＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体及び二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ヤギ抗ヒトＩｇＧ）と一緒に温置し、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）によって分析して、抗体結合活性の低下したアラニン変異体を求めた。データによれば、（図９Ｄに示すように）ＨＣＶ ＮＳ５抗原位置２３９０（Ｐｒｏ）、２３９１（Ｌｅｕ）、２３９２（Ｇｌｕ）、２３９３（Ｇｌｙ）、２３９４（Ｇｌｕ）、２３９５（Ｐｒｏ）、２３９７（Ａｓｐ）、２３９８（Ｐｒｏ）及び２４００（Ｌｅｕ）がＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体の結合部位である。
【０１９３】
これらの結果によって、配列ＰＬＥＧＥＰＧＤＰＤＬ（配列番号１０９）で表されるこの領域が、ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体と結合するエピトープを含むことが確認される。これらの結果によって、ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体と結合するためには、配列ＰＬＥＧＥＰＸＤＰＸＬ（式中、Ｘは任意のアミノ酸（配列番号１１０）であり、又はＸはＡｌａ若しくはＧｌｙ（配列番号１１１）である。）のように、他の残基は変化し得ても、これらの抗原性残基は不変でなければならないことが確認される。
【実施例９】
【０１９４】
ＨＣＶコアキメラモノクローナル抗体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定
実施例５から得られる野生型ＨＣＶ ２７−３９コア断片を含む酵母細胞を培養し、細胞表面のエピトープの発現を誘導した。誘導した酵母細胞を種々の濃度のＨＣＶコアキメラ抗体（１００ｎＭ、３３ｎＭ、１１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．１４ｎＭ及び０ｎＭ）と一緒に温置した。次いで、結合したＨＣＶコアキメラ抗体を、Ａｌｅｘａ ６３３蛍光団と複合化されたヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて標準フローサイトメトリー分析によって検出した。ＨＣＶコアキメラ抗体の各濃度における平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、蛍光団の励起後に、適切なレーザー及び検出光学を備えたフローサイトメーターによって測定した。
【０１９５】
ＭＦＩと［Ａｇ］をプロットし、最適曲線を決定することによって、見かけの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算し、それによってＫ_Ｄを求めた。最適曲線は、式：Ｆｂｋｇ＋Ｆｓａｔ×［抗原］／（Ｋ_Ｄ＋［抗原］）（式中、Ｆｂｋｇ：バックグラウンドシグナル及びＦｓａｔ：最大シグナル）によって定義されることが知られている。その結果、ＨＣＶコアキメラ抗体のＫ_Ｄは約０．７ｎＭであった。
【実施例１０】
【０１９６】
ＨＣＶ ＮＳ３キメラモノクローナル抗体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定
ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、（実施例６から得られる）野生型ＨＣＶ １１９０−１２１６ ＮＳ３断片を含む酵母細胞及び種々の濃度のＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体（３３ｎＭ、１１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．１４ｎＭ及び０ｎＭ）を用いて、実施例９に記載のように測定した。その結果、ＨＣＶ ＮＳ３キメラ抗体のＫ_Ｄは約６８ｎＭであった。
【実施例１１】
【０１９７】
ＨＣＶ ＮＳ４キメラモノクローナル抗体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定
ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、（実施例７から得られる）野生型ＨＣＶ １６９２−１７１３ ＮＳ４断片を含む酵母細胞及び種々の濃度のＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体（１００ｎＭ、３３ｎＭ、１１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．１４ｎＭ及び０ｎＭ）を用いて、実施例９に記載のように測定した。その結果、ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体のＫ_Ｄは約０．５ｎＭであった。
【実施例１２】
【０１９８】
ＨＣＶ ＮＳ５キメラモノクローナル抗体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定
ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、（実施例８から得られる）野生型ＨＣＶ ２３８２−２４０８ ＮＳ５断片を含む酵母細胞及び種々の濃度のＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体（１００ｎＭ、３３ｎＭ、１１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．１４ｎＭ及び０ｎＭ）を用いて、実施例９に記載のように測定した。その結果、ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体のＫ_Ｄは約８．８ｎＭであった。
【実施例１３】
【０１９９】
ＨＣＶキメラ抗体及びＨＣＶキメラ抗体を分泌するＣＨＯ系の特性分析
実施例１−４で調製したＨＣＶコアＣＨＯ ２０１−６０３−４８６−３３３、ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１、ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３及びＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯクローン４８−３１１−２７１−４５５細胞系を、細胞の生存、安定な抗体産生による細胞系の安定性、及びマイコプラズマ試験による外来性媒介物（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）のないことを含めて、製造性について分析した。細胞系の単クローン性についても試験した。キメラ抗体を等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって特徴づけた。
【０２００】
その結果、すべての細胞系が＞９０％クローンであり、外来性媒介物を含まなかった。＞３週間にわたるキメラ抗体産生の分析によって、すべての細胞系が、培養において安定な又は高いキメラ抗体産生を有することが示された。３週齢培養物のＨＰＬＣ分析によって評価した、最終Ｒ＆Ｄ規模（すなわち、生細胞は２０−１０％であった。）の平均キメラ抗体産生を図１０に示す。
【０２０１】
すべてのＨＣＶキメラ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を還元条件下で実施した。各キメラ抗体約３ｕｇを還元剤を含むローディングバッファーと混合し、１０分間煮沸し、次いで１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、８０ボルトで１．５時間泳動させた。６６．２ｋＤから４５ｋＤの重鎖が移動するはずであり、３１ｋＤから２１．５ｋＤの軽鎖が移動するはずであった。ＨＣＶキメラ抗体のすべてが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、抗体重鎖及び軽鎖に対応する２本の明確に区別できるバンドを示した。
【０２０２】
ＨＣＶキメラ抗体を更に特徴づけるために、全４種類のＨＣＶキメラ抗体について等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動を実施した。ＩＥＦは、タンパク質をその実効電荷に応じて分離する技術である。所与のｐＨにおいて、タンパク質の実効電荷は、その正電荷と負電荷の相対数に依存する。タンパク質上の正電荷が負電荷と等しいｐＨは、タンパク質の等電点（ｐＩ）を規定する。４種類のＨＣＶキメラ抗体のＩＥＦプロファイルによれば、ＨＣＶキメラ抗体のｐＩ値は７．８から９．０であった。具体的には、ＨＣＶコアキメラ抗体のｐＩは約９．０であり、ＨＣＶ ＮＳ３抗体のｐＩは８．５から９．０であり、ＨＣＶ ＮＳ４キメラ抗体のｐＩは７．８から８．７であり、ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体のｐＩは８．０から８．９であった。
【０２０３】
ＨＣＶコアキメラ抗体を、Ｔｏｓｏｈａａｓ ３０００カラムを備えたＷａｔｅｒｓシステムを用いたゲル浸透高速液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）によっても分析した。ＧＰＣ−ＨＰＬＣは、タンパク質又はポリペプチドの純度及びその凝集状態を分子サイズ及び形状に基づくクロマトグラフィー分離によって測定するのに用いられる標準技術である。アルブミン、キメラ抗体及びゲルろ過標準の各々３回の１０ｕｇの注射に基づいて、各キメラ抗体ロットの最終平均純度を計算した。ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１ロットの純度は９７％であった。ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３ロットの純度は５８％であった。ＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５ロットの純度は９０％であり、ＨＣＶコアＣＨＯ ２０１−６０３−４８６−３３３ロットの純度は８８％であった。
【実施例１４】
【０２０４】
標準ＨＣＶ検出アッセイにおけるＨＣＶキメラ抗体の抗原反応性
実施例１−４に記載のように調製した４種類のキメラ抗体（ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５）を、Ｐｒｉｓｍ、ＡｘＳＹＭ、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ及びＥＩＡ（Ｂｅａｄ）プラットホームのＡｂｂｏｔｔ ＨＣＶ血液スクリーニングアッセイによって試験した。Ｐｒｉｓｍプラットホームアッセイは、抗体検出にＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びコア抗原を使用するのに対して、ＡｘＳＹＭ、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ及びＥＩＡ（Ｂｅａｄ）プラットホームアッセイは抗体検出にＮＳ３、ＮＳ４及びコア抗原を使用する。すべてのプラットホームで、抗原は、現在、ヒトドナーから提供されるエピトープ反応性血しょう／血清試料を用いて適格とされる。
【０２０５】
Ａｂｂｏｔｔ ＨＣＶ ＥＩＡは、ヒト血清、血しょう又は死体血清中のＣ型肝炎抗体（抗ＨＣＶ）の定性的検出のためのインビトロ酵素免疫測定法である。ヒト試料を試料希釈剤で希釈し、組換えＨＣＶ抗原で被覆されたポリスチレンビーズと一緒に温置する。抗体が試料中に存在する場合、患者試料中の免疫グロブリンは、ビーズに塗布された抗原に結合する。ビーズを洗浄して非結合材料を除去した後、Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を用いて、ヒト免疫グロブリンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体を含有する溶液と一緒にビーズ−抗原−抗体複合体を温置し、４９２ｎｍの発色強度を読むことによって、ビーズに結合したままのヒト免疫グロブリンを検出する。最終試料／カットオフ（Ｓ／Ｃｏ）を計算する。カットオフを以下のように計算する。
【０２０６】
カットオフ値＝ＮＣｘ＋（０．２５）ＰＣｘ （式中、ＮＣｘ（負の平均吸光度）＝全吸光度／複製数、及びＰＣｘ（正の平均の計算値）＝全吸光度／複製数）
【０２０７】
吸光度値が０．００５以上カットオフ未満である試料を陰性とみなす。吸光度値がカットオフ値以上である試料を初期反応性とみなす。Ａｂｂｏｔｔ ＨＣＶ ＥＩＡ ２．０アッセイキットを用いてこの手順に従うと、表３に示すように、抗ＨＣＶコア、ＮＳ３及びＮＳ４キメラ抗体はすべて反応性であった。抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体は、アッセイに含まれるＨＣＶ ＮＳ５組換え抗原がないので、陰性である。
【０２０８】
Ａｂｂｏｔｔ ＡＸＳＹＭ抗ＨＣＶアッセイは、ヒト血清又は血しょう中のＨＣＶ組換えタンパク質に対する抗ＨＣＶ ＩｇＧの定性的検出用微粒子免疫測定法（ＭＥＩＡ）である。アッセイの実施に用いられるＡｘＳＹＭシステムは、２種類の指標較正用物質複製（Ｉｎｄｅｘ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）の平均率からカットオフ率を計算し、結果を保存する。カットオフ率（ＣＯ）は、ＡｘＳＹＭ抗ＨＣＶ指標較正用物質平均率に０．１２を掛けて求められる。
【０２０９】
試料は、Ｓ／ＣＯ値が１．２１以上である場合に反応性とみなされる。Ｓ／ＣＯ値が０．８から１．２０である試料は「灰色域」試料とみなされ、Ｓ／ＣＯ値が０．７９未満である試料は非反応性とみなされる。Ａｂｂｏｔｔ ＨＣＶ ＡｘＳＹＭ抗ＨＣＶアッセイ添付文書に記載のプロトコルに従うと、抗ＨＣＶコア、ＮＳ３及びＮＳ４キメラ抗体は、表３に示すように反応性であった。また、抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体は、アッセイに含まれるＨＣＶ ＮＳ５組換え抗原がないので、陰性であった。
【０２１０】
Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ抗ＨＣＶアッセイは、ヒト血清及び血しょう中の抗ＨＣＶ抗体の定性的検出用の化学発光微粒子免疫測定法（ＣＭＩＡ）である。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ抗ＨＣＶアッセイは、試料中の抗体に結合する、微粒子表面に塗布された組換えＨＣＶ抗原を使用する。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ抗ＨＣＶ最終反応では、結合したアクリジニル化複合体を使用して、化学発光シグナルを発生する。アッセイの実施に用いられるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉシステムは、３種類の抗ＨＣＶ較正用物質１複製の平均化学発光シグナルからカットオフＲＬＵを計算し、結果を保存する。カットオフＲＬＵは、抗ＨＣＶ較正用物質１平均ＲＬＵに０．０７４を掛けて求められる。次いで、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉシステムは、各試料及び対照に対する試料ＲＬＵとカットオフＲＬＵの比（Ｓ／ＣＯ）に基づく結果を計算する。
【０２１１】
試料は、Ｓ／ＣＯ値が１．００以上である場合に反応性とみなされる。Ｓ／ＣＯ値が０．８から０．９９である試料は「灰色域」試料とみなされ、Ｓ／ＣＯ値が０．７９未満である試料は非反応性とみなされる。Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ抗ＨＣＶアッセイ添付文書に記載のプロトコルに従うと、抗ＨＣＶコア、ＮＳ３及びＮＳ４キメラ抗体は、表３に示すように反応性である。抗ＨＣＶ ＮＳ５キメラ抗体は、アッセイに含まれるＨＣＶ ＮＳ５組換え抗原がないので、陰性であった。
【０２１２】
Ａｂｂｏｔｔ Ｐｒｉｓｍ ＨＣＶアッセイは、ヒト血清及び血しょう中の抗ＨＣＶ抗体の定性的検出用の化学発光微粒子免疫測定法である。カットオフ値を以下のように計算する。
【０２１３】
カットオフ値＝負の平均較正用物質正味カウント＋０．５５×正の平均較正用物質正味カウント
【０２１４】
試料は、Ｓ／ＣＯ値がカットオフ値以上である場合に初期反応性とみなされる。Ａｂｂｏｔｔ Ｐｒｉｓｍ ＨＣＶアッセイ添付文書に記載のプロトコルに従うと、抗ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５キメラ抗体すべては、表３に示すように反応性であった。
【０２１５】
【表３】


【０２１６】
その結果、Ａｂｂｏｔｔ ＡｘＳＹＭ、ＥＩＡ、Ｐｒｉｓｍ及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴプラットホーム上で、ＨＣＶキメラ抗体は、抗原に対してヒト由来の対照以上の反応性を示す。表３において、抗ＮＳ５キメラ抗体は、ＥＩＡ、ＡｘＳＹＭ及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴアッセイで反応しないが、これは、ＮＳ５抗原がビーズ／微粒子に塗布されていないためにすぎない。
【実施例１５】
【０２１７】
Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質に特異的なヒト−マウスキメラ抗体の調製＃２
第２の抗コアキメラ抗体ＨＣＶコアＣＨＯ １４−１５３−２２９ｓｃ１５２をハイブリドーマ１４−１５３−４６２から調製した。（「ＨＣＶ １４−１５３−４６２」としても知られる）ネズミハイブリドーママウスひ臓細胞系抗ＨＣＶコア１４−１５３−４６２をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年１１月２１日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−８０２８のもとに寄託した。
【０２１８】
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶコア１４−１５３−４６２を、コアＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣＤ抗原の代わりにｐＬ−コアとして知られる精製ＨＣＶ組換えコア抗原を用いて、実施例１に記載のように作製した。ｐＬ−コア組換え抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−１５０に対応する。動物免疫化投薬計画は、フロイントアジュバント系中の１回の追加免疫２００μｇと２週間後の食塩水中の融合前追加免疫を利用した。
【０２１９】
ｍＲＮＡの単離、並びにマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の特定
ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５ハイブリドーマ細胞系に関して実施例１に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗ＨＣＶコア１４−１５３−４６２並びにＲＴ−ＰＣＲによって得られたマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列からｍＲＮＡを単離した。陽性ＰＣＲ産物は、Ｃの重鎖（Ｈ）プライマーセット（ＶＨ−Ｃ）及びＢ及びＣの軽鎖（Ｌ）プライマーセット（ＶＬ−Ｂ、ＶＬ−Ｃ）から認められた。すべての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ ＴＯＰＯ ２．１ ＴＡベクターにクローニングし、Ｅ．コリに転換した。コロニーＰＣＲ反応によってクローン挿入断片を確認した。手短に述べると、Ｍ１３順方向及びＭ１３逆方向プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにテンプレートとして煮沸したＥ．コリコロニーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、変性９４℃１分間、アニーリング５０℃１分間及び伸長７２℃２分間、更に最終伸長７２℃６分間を合計３０サイクル含んだ。正しいサイズのＰＣＲ産物を産生するクローンをＬＢブロス中で増殖させた。各プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製し、Ｍ１３順方向及び逆方向プライマーとＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。
【０２２０】
最終ＴＡクローンを、実施例１に記載のように配列アラインメントによって選択した。配列結果によって、ＶＬ−Ｂクローンが正しいＶ_Ｌ配列（配列番号３９で示されるポリペプチドをコードする配列番号４１）を含み、ＶＨ−Ｃクローンが正しいＶ_Ｈ配列（配列番号３８で示されるポリペプチドをコードする配列番号４０）を含むことが確認された（図１１Ａ−Ｄも参照）。
【０２２１】
ｐＢＯＳベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子のクローニング
ＶＬ−Ｂ ＴＡクローン番号５をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｌ配列のクローンを作製するように１対のＰＣＲプライマー、すなわち、ＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｌ ５’末端プライマー
５’−ＡＡＡＴＴＴＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣ−３’［配列番号９６］
とＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｌ ３’末端プライマー
５’−ＡＣＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴ−３’［配列番号９７］
を設計した。
【０２２２】
５’末端プライマーは、部分的カッパシグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＢｓｉＷ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。また、ＶＨ ＴＡクローン番号１をテンプレートとして用いて、マウスＶ_Ｈ配列のクローンを作製するように１対のプライマー、すなわち、ＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｈ ５’末端プライマー
５’−ＡＡＡＴＴＴＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’［配列番号９８］
とＨＣＶコア抗体Ｖ_Ｈ ３’末端プライマー
５’−ＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴ−３’［配列番号９９］．
を設計した。
【０２２３】
このプライマー対の場合、５’末端プライマーは部分的重鎖シグナル配列及びＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を含み、３’末端プライマーはＳａｌ Ｉ制限酵素切断部位を含んだ。
【０２２４】
上記プライマー対、並びにそれぞれＶＬ−Ｂ ＴＡクローン番号５及びＶＨ−Ｃ ＴＡクローン番号１をテンプレートとして用いたＰＣＲによって、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ配列を独立に増幅した。５’末端及び３’末端プライマーの各々２０ｐｍｏｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）１単位、並びにテンプレートとして細菌コロニー２μｌを用いて、ＰＣＲを１×ＰＣＲ増幅緩衝剤中で実施した。ＰＣＲを９４℃３０秒間及び５５℃３０秒間、続いて７２℃１分間の３０サイクル実施した。
【０２２５】
Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ ＰＣＲ産物を、実施例１に記載のように、制限酵素によってそれぞれＮｒｕ Ｉ／ＢｓｉＷ Ｉ及びＮｒｕ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ消化により切り取り、次いで（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｋベクター又は（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＯＳ−ｈｃｇベクターにクローニングした。実施例１に記載のように、（Ｖ_Ｌ配列を含む）プラスミドｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｌ及び（Ｖ_Ｈ配列を含む）ｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｈを配列決定によって選択した。それぞれのｐＢＯＳクローンを確認した後、ｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｌ−Ｔ０プラスミド又はｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｈ−Ｔ０プラスミドを含む別々のＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製して、ｐＢＯＳクローンを保存した。
【０２２６】
キメラ抗体機能試験
実施例１に記載のように、ｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｌ−Ｔ０及びｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｈ−Ｔ０プラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ ７Ｌ細胞に一過性導入した。実施例１に記載のように、移入されたＣＯＳ ７Ｌ細胞から抗ＨＣＶコアキメラ抗体を調製し、ＥＩＡによって評価してＨＣＶコア抗原との反応性を確認した。ＥＩＡを実施例１に記載のように実施した。ＥＩＡの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、ＨＣＶコア抗原に対して反応性であった。
【０２２７】
安定な発現ベクターへのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のクローニング
ｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｌ−Ｔ０及びｐＢＯＳ １４−１５３−４６２−Ｈ−Ｔ０クローンを用いて、実施例１に記載のように、配列を（Ｖ_Ｈ配列の場合）ｐＢＶベクター又は（Ｖ_Ｌ配列の場合）ｐＪＶベクターにまずクローニングし、続いてＰａｃ Ｉ／Ａｓｃ Ｉ制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の配列を含むｐＢＪプラスミドｐＢＪ ＨＣＶコア１４−１５３−４６２を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。ｐＢＪクローンをＳｒｆ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化によってスクリーニングして、ｐＢＪクローンが両方の配列を含むことを確認した。ＨＣＶコアキメラ抗体の最終ｐＢＪクローン（ｐＢＪ ＨＣＶコア１４−１５３−４６２）のプラスミドマップを図１２に示す。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子配列を図１１Ａ−Ｂに示す（それぞれ、配列番号４０及び配列番号４１）。ｐＢＪ １４−１５３−４６２−Ｔ４クローンを含むＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０２２８】
安定なＣＨＯ細胞系の樹立及びＨＣＶキメラ抗体の発現
実施例１に記載のように、ｐＢＪ １４−１５３−４６２−Ｔ４プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例１に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。９６ウェルプレートを抗原特異的ＥＩＡによって試験し、クローン番号２２９を更なる発生用に選択した。ＥＩＡを上述したように実施した。ＨＣＶコア１４−１５３−４６２ ＣＨＯ細胞クローンを培養し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター選別機を用いて単細胞を９６ウェルプレートに選別した。ＣＨＯサブクローン番号１５２を選択して、ＣＤ−ＣＨＯ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に切り換えた。キメラ抗体の産生、及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンクの開発のために、最終ＣＨＯ細胞系（ＨＣＶコア１４−１５３−２２９ｓｃ１５２）を増殖させた。実施例１に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインＡ精製手順によってこの細胞系から精製した。
【０２２９】
ＨＣＶコアＣＨＯ １４−１５３−２２９ｓｃ１５２細胞系をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに２００６年５月２日にＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−７５７１のもとに寄託した。
【０２３０】
すべての特許、公表された特許出願を含めた刊行物、及び本明細書で参照するデータベース登録事項の開示を、かかる個々の特許、刊行物及びデータベース登録事項が参照により組み入れられるように具体的かつ個々に示されたごとく、同じ程度に参照によりその全体を具体的に組み入れる。
【０２３１】
本発明をある特定の実施形態に関連して説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その種々の改変が当業者には明らかであるはずである。当業者に明らかであるかかる改変はすべて、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質の診断関連領域に特異的に結合する１種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬であって、前記１種類以上の組換え抗体がＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的なキメラ抗体、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体からなる群から選択される、免疫診断試薬。
【請求項２】
前記免疫診断試薬が、
（ａ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−１５０によって規定されたＨＣＶコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）アミノ酸１１９２から１４５７ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｃ）アミノ酸１９２０から１９３５又はアミノ酸１６７６から１９３１ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ４タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｄ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０５４から２９９５によって規定されたＨＣＶ ＮＳ５タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項１に記載の免疫診断試薬。
【請求項３】
前記免疫診断試薬が、
（ａ）配列番号３４で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｃ）配列番号３６で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｄ）配列番号３７で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項４】
前記免疫診断試薬が、
（ａ）配列番号１００で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１０２で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項５】
前記免疫診断試薬が、
（ａ）配列番号１０３で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１０５で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項６】
前記免疫診断試薬が、
（ａ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１０８で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項７】
前記免疫診断試薬が、
（ａ）配列番号１０９で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１１０で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１１１で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項８】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号３８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号４２、４３及び４４で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号４８、４９及び５０で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項９】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号３９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号４５、４６及び４７で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号５１、５２及び５３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１０】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号５４、５５及び５６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１１】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１０で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号５７、５８及び５９で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１２】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１７で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６０、４３及び６１で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１３】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号６２、５８及び６３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１４】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２５で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６４、６５及び６６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１５】
前記キメラ抗体が、
配列番号２６で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
配列番号６７、４６及び６８で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１６】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号７によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号４０によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号６９、７０及び７１によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号７５、７６及び７７によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１７】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号８によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号４１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号７２、７３及び７４によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号７８、７９及び８０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１８】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１５によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８１、８２及び８３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項１９】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１６によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８４、８５及び８６によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項２０】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２３によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８７、７０及び８８によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項２１】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２４によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８９、８５及び９０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項２２】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号３１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号９１、９２及び９３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項２３】
前記キメラ抗体が、
配列番号３２によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
配列番号９４、７３及び９５によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２に記載の免疫診断試薬。
【請求項２４】
前記免疫診断試薬が前記組換え抗体の２種類以上を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の免疫診断試薬。
【請求項２５】
前記免疫診断試薬が、検出試薬、標準化試薬及び正の対照試薬からなる群から選択される試薬である、請求項２４に記載の免疫診断試薬。
【請求項２６】
ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質からなる群から選択されるＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合する、キメラ抗体。
【請求項２７】
前記キメラ抗体が、
（ａ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−１５０によって規定されたＨＣＶコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）アミノ酸１１９２から１４５７ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｃ）アミノ酸１９２０から１９３５又はアミノ酸１６７６から１９３１ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ４タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｄ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０５４から２９９５によって規定されたＨＣＶ ＮＳ５タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２６に記載のキメラ抗体。
【請求項２８】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号３４で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｃ）配列番号３６で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｄ）配列番号３７で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２６に記載のキメラ抗体。
【請求項２９】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１００で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１０１で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１０２で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２６に記載のキメラ抗体。
【請求項３０】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１０３で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１０５で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２６に記載のキメラ抗体。
【請求項３１】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１０７で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１０８で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２６に記載のキメラ抗体。
【請求項３２】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１０９で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）配列番号１１０で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｃ）配列番号１１１で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２６に記載のキメラ抗体。
【請求項３３】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号３８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号４２、４３及び４４で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号４８、４９及び５０で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項３４】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号３９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号４５、４６及び４７で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号５１、５２及び５３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項３５】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号５４、５５及び５６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域。
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項３６】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１０で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号５７、５８及び５９で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項３７】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１７で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６０、４３及び６１で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項３８】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号６２、５８及び６３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項３９】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２５で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６４、６５及び６６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４０】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２６で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号６７、４６及び６８で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４１】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号７によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号４０によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号６９、７０及び７１によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号７５、７６及び７７によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４２】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号８によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号４１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号７２、７３及び７４によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号７８、７９及び８０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４３】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１５によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８１、８２及び８３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４４】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号１６によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８４、８５及び８６によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４５】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２３によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８７、７０及び８８によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４６】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号２４によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８９、８５及び９０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４７】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号３１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号９１、９２及び９３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４８】
前記キメラ抗体が、
（ａ）配列番号３２によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号９４、７３及び９５によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項２７に記載のキメラ抗体。
【請求項４９】
前記キメラ抗体が、ＨＣＶコアＣＨＯ ２０１−６０３−４８６−３３３、ＨＣＶコアＣＨＯ １４−１５３−２２９ｓｃ１５２、ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１、ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３及びＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５からなる群から選択される細胞系によって発現されるキメラ抗体と実質的に同一である、請求項２６から４８のいずれかに記載のキメラ抗体。
【請求項５０】
抗ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５、抗ＨＣＶコア１４−１５３−４６２、抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７、抗ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４及び抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７からなる群から選択される細胞系によって発現される、マウスモノクローナル抗体。
【請求項５１】
Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するキメラ抗体を発現する細胞系であって、ＨＣＶコアＣＨＯ ２０１−６０３−４８６−３３３、ＨＣＶコアＣＨＯ １４−１５３−２２９ｓｃ１５２、ＨＣＶ ＮＳ３ ＣＨＯ １７−９０３−１３２ｓｃ１７１、ＨＣＶ ＮＳ４ ＣＨＯ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４ｓｃ２０３及びＨＣＶ ＮＳ５ ＣＨＯ ４８−３１１−２７１−４５５からなる群から選択される、前記細胞系。
【請求項５２】
Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を発現する細胞系であって、抗ＨＣＶコア２０１−６０３−１９５、抗ＨＣＶコア１４−１５３−４６２、抗ＨＣＶ ＮＳ３ １７−９０３−１２７、抗ＨＣＶ ＮＳ４ Ｅ９９Ｈ６Ｃ３４及び抗ＨＣＶ ＮＳ５ ４８−３１１−３８７からなる群から選択される、前記細胞系。
【請求項５３】
請求項１から２５のいずれかに記載の免疫診断試薬を感受性パネルとして使用することを含む、ＨＣＶ抗体検出アッセイを標準化する方法。
【請求項５４】
ＨＣＶ抗原の存在を検出する方法であって、
（ａ）試験試料を得る段階、
（ｂ）前記試験試料を請求項１から２５のいずれかに記載の免疫診断試薬と、キメラ抗体：抗原複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、及び
（ｂ）前記ＨＣＶ抗原の存在を示すものとして、形成されたキメラ抗体：抗原複合体を検出する段階
を含む、方法。
【請求項５５】
ＨＣＶ抗体の存在を検出する方法であって、
（ａ）試験試料を得る段階、
（ｂ）前記試験試料をＨＣＶ抗体に特異的な１種類以上のＨＣＶ抗原と、抗原：抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、及び
（ｃ）前記ＨＣＶ抗原の存在を示すものとして、形成された抗原：抗体複合体を検出する段階
を含み、改善が、請求項１から２５のいずれかに記載の免疫診断試薬が前記方法において正の対照又は標準化試薬として用いられることを含む、方法。
【請求項５６】
請求項１から２５のいずれかの免疫診断試薬を含む、Ｃ型肝炎ウイルス検出用診断キット。
【請求項５７】
ＨＣＶタンパク質エピトープに特異的に結合する抗体によって結合される、ＨＣＶタンパク質エピトープ内のアミノ酸残基を特定する方法であって、
（ａ）宿主細胞（すなわち、酵母細胞）の表面に提示された一連のペプチドを含む酵母ディスプレイライブラリーを得る段階であって、酵母によって提示された前記一連のペプチドが、前記エピトープのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、前記エピトープの個々のアミノ酸はアラニンで順次置換されている段階、
（ｂ）前記酵母ディスプレイライブラリーを、前記エピトープに特異的に結合する抗体と、前記抗体と前記エピトープの結合を可能にする条件下で接触させる段階、及び
（ｃ）段階（ｂ）において前記抗体によって結合されない、酵母細胞上に提示されたペプチドを特定する段階
を含み、抗体結合の欠如によって、酵母によって提示されたペプチドが、エピトープ中の前記抗体によって結合されるアミノ酸位置にアラニン残基を含むことが示される、方法。
【請求項５８】
ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質からなる群から選択されるＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部を含む、単離ポリペプチド。
【請求項５９】
前記キメラ抗体が、
（ａ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−１５０によって規定されたＨＣＶコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）アミノ酸１１９２から１４５７ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｃ）アミノ酸１９２０から１９３５又はアミノ酸１６７６から１９３１ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ４タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｄ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０５４から２９９５によって規定されたＨＣＶ ＮＳ５タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項５８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６０】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号３８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号４２、４３及び４４で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号４８、４９及び５０で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号３９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号４５、４６及び４７で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号５１、５２及び５３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６２】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号５４、５５及び５６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６３】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１０で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号５７、５８及び５９で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６４】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１７で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６０、４３及び６１で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６５】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号６２、５８及び６３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６６】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２５で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６４、６５及び６６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６７】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２６で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号６７、４６及び６８で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６８】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号７によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号４０によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号６９、７０及び７１によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号７５、７６及び７７によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号８によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号４１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号７２、７３及び７４によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号７８、７９及び８０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７０】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１５によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８１、８２及び８３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７１】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１６によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８４、８５及び８６によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７２】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２３によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８７、７０及び８８によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７３】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２４によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８９、８５及び９０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号３１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号９１、９２及び９３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７５】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号３２によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号９４、７３及び９５によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む、請求項５９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７６】
ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質及びＨＣＶ ＮＳ５タンパク質からなる群から選択されるＨＣＶタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項７７】
前記キメラ抗体が、
（ａ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−１５０によって規定されたＨＣＶコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｂ）アミノ酸１１９２から１４５７ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なキメラ抗体、
（ｃ）アミノ酸１９２０から１９３５又はアミノ酸１６７６から１９３１ ＨＣＶポリタンパク質によって規定されたＨＣＶ ＮＳ４タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ４タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
（ｄ）ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０５４から２９９５によって規定されたＨＣＶ ＮＳ５タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、ＨＣＶ ＮＳ５タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項７６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号３８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号４２、４３及び４４で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号４８、４９及び５０で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号２で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号３９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号４５、４６及び４７で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号５１、５２及び５３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号９で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号５４、５５及び５６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１０で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号５７、５８及び５９で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１７で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６０、４３及び６１で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８３】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１８で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号６２、５８及び６３で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８４】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号２５で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号６４、６５及び６６で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号２６で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号６７、４６及び６８で表される配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号７によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｂ）配列番号４０によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、
（ｃ）配列番号６９、７０及び７１によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｄ）配列番号７５、７６及び７７によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号８によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｂ）配列番号４１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、
（ｃ）配列番号７２、７３及び７４によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｄ）配列番号７８、７９及び８０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１５によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８１、８２及び８３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８９】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１６によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８４、８５及び８６によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号２３によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号８７、７０及び８８によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９１】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号２４によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号８９、８５及び９０によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号３１によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、並びに
（ｂ）配列番号９１、９２及び９３によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号３２によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、並びに
（ｂ）配列番号９４、７３及び９５によってコードされる配列の１個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする、請求項７７に記載の単離ポリヌクレオチド。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【公表番号】特表２０１０−５１１４１０（Ｐ２０１０−５１１４１０Ａ）
【公表日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４０４５２（Ｐ２００９−５４０４５２）
【出願日】平成１９年１２月５日（２００７．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８６５１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７０７２７
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】