Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法
【課題】本発明は、ＨＣＶ増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＨＣＶの阻害剤・治療剤またはＨＣＶの増殖促進効果を有する薬剤の検出および探索を可能とする検査方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することを特徴とする検査方法による。ＨＣＶが、コアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）を含み、該ＨＣＶのＲＮＡゲノムが、コアタンパク質をコードする配列の上流にＰｏｌＩプロモーター配列、下流にＰｏｌＩターミネーター配列を配置させてなる感染性ＨＣＶレプリコンゲノムによる。
【解決手段】ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することを特徴とする検査方法による。ＨＣＶが、コアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）を含み、該ＨＣＶのＲＮＡゲノムが、コアタンパク質をコードする配列の上流にＰｏｌＩプロモーター配列、下流にＰｏｌＩターミネーター配列を配置させてなる感染性ＨＣＶレプリコンゲノムによる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＣ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法に関する。より正確には、ＨＣＶの感染から、複製、ＨＣＶタンパク質の翻訳、成熟、修飾、組立て、さらにウイルス放出にいたるＨＣＶ増殖のいずれかのステップに影響を及ぼす各種物質の探索を可能とするアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：hepatitis C virus）は、一本鎖ＲＮＡウイルスで、フラビウイルス科ヘパシウイルス属に属する。 ＨＣＶ１〜６までの６種の遺伝子型に分類される。さらにそれらの遺伝子型がいくつかのサブタイプに分類される(Hepatology, 10, p1321-1324 (1994); Hepatology, 42, p962-973 (2005))。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている(Science, 244, p359-362 (1989); J. Med. Virol., p334-339 (1992); J. Gen Virol., 73, p673-679 (1992); Hepatology, 16, 293-299 (1992))。
【０００３】
ＨＣＶは、約９．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡをゲノムとする。ゲノムの両端に存在する非翻訳領域は二次構造にとみ、５’末端には通常のｍＲＮＡで観察されるキャップ構造がなく、そのかわりにキャップ非依存的にｒＲＮＡがＲＮＡの翻訳を開始可能なＩＲＥＳ(Internal Robosomal Entry Site)が存在する。ウイルスＲＮＡから約3000アミノ酸からなる巨大な前駆体タンパク質が翻訳され、宿主細胞由来のタンパク質分解酵素によりウイルスの粒子を構成するコアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）に、また粒子には取り込まれないが、複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）は、ＮＳ２とＮＳ３が有するタンパク質分解酵素によって各タンパク質に切断される。
【０００４】
ＨＡＡＲＴ(Highly active antiretroviral therapy)の導入によって、エイズ患者の予後が大幅に改善された結果、わが国を含む先進国では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）感染者においてもエイズ以外の病因で死亡するケースが急増している。特に共感染したＨＣＶによる肝障害・肝不全の合併が死因の重要な部分をしめるようになっている。特に、非加熱凝固因子製剤によるＨＩＶ感染者では、ＨＩＶとＨＣＶの共感染は９７％にもおよび、ＨＣＶ感染症の治療はポストＨＡＡＲＴ時代の医療課題として重要なものとなっている。現在、ＨＣＶ感染症に対して、インターフェロンとリバビリン（Ribavirin (1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide)）の併用療法が一般的であるが、患者全体の５０％にしか有効ではなく、また、血球減少症・溶血性貧血など重篤な副作用をおこすことが知られている。
【０００５】
これまではＨＣＶにはウイルス培養系と実験用の感染小動物が存在しないことがＨＣＶの基礎研究の妨げになってきた。KolyhalovらはＨＣＶと同じフラビウイルス科に属するKunjinウイルスのレプリコンシステムを報告した（非特許文献１）。このシステムはKunjinウイルスの構造領域を取り除き、3'utrをＥＭＣＶのＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたものであり、この遺伝子構築から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、KunjinウイルスＲＮＡの持続的な複製とタンパク質発現が観察されるという実験系であった。そして、1999年、LohamannらによりＨＣＶのレプリコンシステムが報告された（非特許文献２）。このシステムはＨＣＶの構造領域の一部（ＮＳ２）を取り除き、その部分にＥＭＣＶのＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子を挿入したものである。この構造物を鋳型として試験管内でＲＮＡを合成し、Ｈｕｈ７細胞に導入した後にネオマイシン選択培地で選択培養し、この遺伝子構造から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、複製したＨＣＶレプリコンＲＮＡからネオマイシン耐性遺伝子が発現され、その遺伝子の働きでレプリコンが複製している細胞のみが生存可能となり、増殖したコロニーを形成する。レプリコン複製細胞では、ＨＣＶレプリコンＲＮＡが非常に高レベルで複製しており、複製しているＲＮＡや発現しているＨＣＶタンパク質を持続して安定して検出することができる。
【０００６】
しかし、それまではレプリコンとして増殖が報告されたＨＣＶ株は、全て遺伝子型１の株であった。さらにこれらの株は培養細胞内での増殖時にその複製効率を増強する適応変異を持ち、その適応変異の多くは患者血清から分離されたＨＣＶ株では認められない変異であった。また、その適応範囲を感染性クローンに導入し、そのＲＮＡをチンパンジーの肝臓に接種したところ、感染性が失われていることが明らかとなった。
【０００７】
遺伝子型が異なるＨＣＶでは、コードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されており、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶのサブゲノムレプリコンを含むＨＣＶ複製系のみを用いて様々なタイプのＨＣＶに効果を及ぼす抗ＨＣＶ薬を開発することは特に難しいと考えられる。したがって、数多くの遺伝子型のＨＣＶのレプリコンを作製して、ＨＣＶ複製機構、および抗ＨＣＶ薬の研究を行う必要があると考えられる。
【０００８】
その後、他の遺伝子型のＨＣＶ株の遺伝子を用いたＨＣＶレプリコンが各種報告されている。特に感染性クローンのＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するＨＣＶレプリコンについて報告がある（非特許文献３、４、特許文献１）。しかし、従来のレプリコンシステムでは、ＨＣＶ感染後の後期過程に作用する阻害剤であれば検出することが可能であったが、増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＨＣＶの阻害剤・治療剤を検出するには不十分であり、新たなアッセイ方法が望まれていた。
【非特許文献１】J. Virol., 71, 1497-1505 (1997)
【非特許文献２】Science 285, p.110-113 (1999)
【非特許文献３】Nature Medicine 11, Number 7, July p.791-796 (2005)
【非特許文献４】ウイルス第５５巻第２号 pp.287-296 (2005)
【特許文献１】国際公開WO2005/028652号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＨＣＶ増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＨＣＶの阻害剤・治療剤またはＨＣＶの増殖促進効果を有する薬剤の検出および探索を可能とする検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することを特徴とするＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法を見出し、本発明を完成した。感染性ＨＣＶは、感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから得られる感染性ＨＣＶレプリコンによる。
【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することを特徴とするＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法。
２．以下の工程を含む、ＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法：
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞を播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培地に加える工程；
３）さらに感染性ＨＣＶを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、ＨＣＶを測定する工程。
３．ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が、Ｈｕｈ７．５．１細胞である前項１または２に記載のアッセイ方法。
４．感染性ＨＣＶが、コアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）を含み、該ＨＣＶのＲＮＡゲノムが、コアタンパク質をコードする配列の上流にプロモーター配列を配置させてなる感染性ＨＣＶレプリコンゲノムである前項１〜３のいずれか１に記載のアッセイ方法。
５．感染性ＨＣＶレプリコンゲノムに配置されたプロモーターが、ＰｏｌＩプロモーターまたはＴ７プロモーターである前項４に記載のアッセイ方法。
６．感染性ＨＣＶレプリコンゲノムが、ＮＳ５タンパク質をコードする遺伝子領域の下流にターミネーターを配置させてなる前項４または５に記載のアッセイ方法。
７．ＨＣＶの測定が、ＨＣＶコアタンパク質量を測定する前項１〜６のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法によると、ＨＣＶの複製またはＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質を探索し、検出することができる。これにより、本発明のアッセイ方法は、化合物ライブラリーから新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤をスクリーニングするための試験系として利用することができ、ＨＣＶ増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とする新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤のスクリーニングを可能とする。本発明のアッセイ方法により、例えば表１に記載のＨＣＶ阻害剤をスクリーニングすることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．感染性ＨＣＶ
本発明において、感染性ＨＣＶとは文字通り感染性を有するＨＣＶをいう。本発明の感染性ＨＣＶは、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞において自律複製能を有していれば、ＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型１〜６の６タイプのいずれであっても良く、さらにそれらの各タイプがいくつかのサブタイプのいずれのタイプであっても良い。さらには、一般的な遺伝子型の分類ではなく、劇症肝炎患者から分離したＨＣＶであっても良い。
【００１４】
本明細書において劇症肝炎患者から分離したＨＣＶとは、いわゆる当業者が劇症肝炎と定義しうる症状を呈した患者から分離したＨＣＶを意味する。本発明において、劇症肝炎患者由来のＨＣＶは、天然由来ＨＣＶのＲＮＡゲノムのみならず、天然由来ＨＣＶのＲＮＡゲノム配列に人為的な改変を加えたＲＮＡゲノムを有するウイルスであっても良い。劇症株のＨＣＶの具体例としては、ＪＦＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号）、ならびにＪＦＨ−２．１株およびＪＦＨ−２．２株等のウイルスが挙げられる。
【００１５】
ＨＣＶのＲＮＡゲノムは、５’非翻訳領域（5'NTRまたは5'UTR）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、および３’非翻訳領域（3'NTRまたは3'UTR）からなる。その構造領域には、コアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、などのＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域にはＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４タンパク質、およびＮＳ５などの非構造タンパク質がコードされている。
【００１６】
本発明の感染性ＨＣＶは、細胞培養を用いてアッセイを可能とするために、ＨＣＶのＲＮＡゲノムを改変して作製されたＨＣＶ遺伝子から調製されたものであることが好ましい。このように改変されて作製されたＨＣＶを、本明細書において「感染性ＨＣＶレプリコン」といい、改変して作製されたゲノムを「感染性ＨＣＶレプリコンゲノム」ともいう。
【００１７】
本発明の感染性ＨＣＶレプリコンは、少なくともコアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）を含み、該ＨＣＶを構成するゲノム、すなわち感染性ＨＣＶレプリコンゲノムは、コアタンパク質をコードする配列の上流に、プロモーター配列を配置させてなる（図１参照）。
【００１８】
上記プロモーター配列は、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞においてＨＣＶが自律複製能を発揮しうるように配置されていれば良く、特に限定されないが、例えばＰｏｌＩプロモーター配列またはＴ７プロモーター配列が挙げられ、特に好適にはＰｏｌＩプロモーター配列が挙げられる。
【００１９】
本発明に係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの一つの実施形態は、上記配列のほか、例えばＮＳタンパク質をコードする配列の下流に、ターミネーター配列を配置させていても良い。具体的には、ＰｏｌＩターミネーター配列またはＴ７ターミネーター配列が挙げられる。さらには、コアタンパク質をコードする配列の上流に、１つのＩＲＥＳ配列を含んでも良く、これにさらに１つの選択マーカー遺伝子やリポーター遺伝子を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ゼオシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ゼオシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ゼオシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し、本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
上記の選択マーカー遺伝子およびリポーター遺伝子は、本発明の感染性ＨＣＶレプリコンゲノム中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ、等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、およびＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
【００２３】
また本発明に係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムには、さらにリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムは、５’側のレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、または外来遺伝子と、それより３’側のＩＲＥＳ配列、および各ＮＳタンパク質をコードする配列とを連結するように挿入し、リボザイムの自己切断活性により両者が切断されて分離するようにすることができる。
【００２４】
本発明に係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、ＨＣＶのＲＮＡゲノム上のウイルスタンパク質をコードする配列および外来遺伝子等が、レプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。それらの配列のうち、タンパク質をコードする配列は、ＨＣＶのＮＳタンパク質をコードする配列から翻訳されるポリタンパク質とともに、融合タンパク質として発現させた後で、プロテアーゼによって各タンパク質へと分離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
【００２５】
２．感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの作製
本発明の感染性ＨＣＶレプリコンに係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムは、いわゆる当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００２６】
３．感染性ＨＣＶレプリコンの作製
本発明の感染性ＨＣＶレプリコンは、上記作製した感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを、細胞に導入することにより作製することができる。感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを導入する細胞は、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が好適である。より感度の高いアッセイを行うためには、Ｈｕｈ７．５．１細胞(PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005))が特に好適である。該ＲＮＡゲノムの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
【００２７】
細胞への感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの導入に際し、目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にして感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの量を変化させたい場合には、目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
【００２８】
感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの細胞へ導入し、ＨＣＶを作製するに際し、ＨＣＶゲノム全体を発現しうる発現ベクターを用いることができる。具体的には、本発明の感染性ＨＣＶのＲＮＡゲノム全長ｃＤＮＡを含む配列を、プラスミドに挿入する。例えば、劇症肝炎の患者から分離したＨＣＶ株からＪＦＨ−２．１株およびＪＦＨ−２．２株のクローンを非特許文献２に記載の方法で作製し、例えばＰｏｌＩプロモーター配列とターミネーター配列の合成ＤＮＡをそれぞれのクローンの５’および３’端に付加し、プラスミドｐＵＣ１９プラスミドに挿入することができる。
【００２９】
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子を含有する感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを用いる場合は、該ゲノムが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、該ゲノムの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。
【００３０】
一例として、感染性ＨＣＶレプリコンゲノムにゼオシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、その該ゲノムを用いて細胞内導入処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１６〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにゼオシンやネオマイシン等の抗生物質を０．０５〜３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、その後、週に２〜４回程度培地を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０〜４０日間、より好ましくは１４〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、該ＲＮＡゲノムが導入され、持続的に複製されている細胞を、コロニーとして選択することができる。形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。
【００３１】
樹立した細胞クローンについては、導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから該細胞クローン中で複製されている該ゲノムの検出、導入された該ゲノム中の選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、およびＨＣＶタンパク質の発現の確認を行って、実際に目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
【００３２】
導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから該細胞クローン中で複製された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよい。例えば、細胞クローンから抽出したトータルＲＮＡについて、導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
【００３３】
また導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの宿主ゲノムＤＮＡへの組込みは、例えばＨＣＶタンパク質の発現を検出することによって、確認することができる。
【００３４】
ＨＣＶタンパク質の発現は、例えば、導入されたレプリコンゲノムから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞クローンから抽出したタンパク質と反応させることによって検出することができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には、例えば、細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、またはＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞クローンから抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、感染性ＨＣＶ由来のレプリコンゲノムが持続的に複製してＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
【００３５】
以上のようにして、目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを持続的に複製していることが確認された細胞クローン（レプリコン複製細胞クローン）を得ることができる。また本発明においては、このレプリコン複製細胞から、例えばＲＮＡを抽出し、その中からレプリコンＲＮＡを電気泳動法により分離する等の当業者には公知の任意の方法により、レプリコンＲＮＡを取得することができる。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。レプリコン複製細胞からのＨＣＶタンパク質の製造は、当業者であれば常法に従って行うことができる。具体的には、例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞および培地を含む）から常法によりタンパク質を取得することができる。
【００３６】
目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを再導入して感染性ＨＣＶを培養上清中に回収するための細胞としては、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が好適である。より感度の高いアッセイを行うために、Ｈｕｈ７．５．１細胞(PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005))が特に好適である。感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。
【００３７】
４．本発明のアッセイ方法
本発明に係るＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイは、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および本発明の感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することにより行うことができる。
より具体的には、以下のようにして行うことができる。
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞を、播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培地に加える工程；
３）さらに感染性ＨＣＶを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、ＨＣＶを測定する工程。
【００３８】
上記アッセイ方法について、さらに詳しく説明する。
１）上記ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞は、本発明のアッセイ方法をより感度良く行うために、Ｈｕｈ７．５．１細胞(PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005))を用いるのが特に好適である。なお、使用する細胞は、継代数が第４３回目までのものが好ましい。該細胞を、該細胞培養用培地に懸濁し、アッセイ用容器、例えば９６穴のマイクロプレートに播種することができる。
２）試験検体としては、ＨＣＶの複製を促進または抑制する物質を探索するために候補として挙げられる物質であれば、高分子化合物であっても低分子化合物であっても良い。または、天然物、天然物誘導体であっても良いし、放射菌等の培養抽出物であっても良い。試験検体の濃度は、適宜選択することができる。
３）さらに本発明の感染性ＨＣＶを播種することで、試験検体と感染性ＨＣＶを含む複製細胞を培養し、得られる培養物中の感染性ＨＣＶを検出することができる。感染性ＨＣＶは、上述に従い作製することができる。
４）感染性ＨＣＶを細胞中で培養するために、３〜１０日間、好ましくは４〜７日間、より好ましくは５〜６日間、３７±１℃で加温することができる。
５）上記培養後、培養上清を採取し、ＨＣＶを測定することにより本発明のアッセイを行うことができる。ＨＣＶの測定は、ＨＣＶの複製の促進または抑制を確認しうる方法であれば良く、特に限定されるものではないが、例えば市販のキットを用いてＨＣＶコアタンパクの産生量をＥＬＩＳＡ法などにより確認することができる。
【００３９】
さらに、上記のアッセイ方法に加えて、試験検体のＨＣＶの複製の促進または抑制に及ぼす影響をより確実に確認するために、非特異作用を排除するために、並行して細胞毒性試験を行っても良い。このようなアッセイ方法は、ＨＣＶ感染阻害剤、例えばＨＣＶ治療剤や診断剤等を評価するためのスクリーニング方法に利用することができる。具体的には、以下のような例が挙げられる。
【００４０】
（１）ＨＣＶの増殖を抑制する物質の探索
ＨＣＶの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的または間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００４１】
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザインまたはハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば、単離精製された酵素）等が挙げられる。
【００４２】
（３）抗ＨＣＶ剤などの薬剤等に対する耐性獲得能の評価および該耐性に関わる変異の同定を行うことができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１）アッセイ方法
１）感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの作製
PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005)に記載の方法に従い、ＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター／ターミネーター系を利用したＪＦＨ１株（ゲノタイプ ２ａ）のｃＤＮＡ発現プラスミド導入細胞株（Huh7.5.1/JFH1 ゼオシン耐性細胞）を用いて、図１に示す感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから感染性ＨＣＶを作製した。ＨＣＶストック液は、分注した後、−８０℃で保存した。
【００４５】
２）アッセイ方法
Ｈｕｈ７・５・１細胞（継代数が第４３回目までのものを使用）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に1×104cells/100μl/ウェルとなるように懸濁したものを９６ウェルのマイクロプレートに播種し、１日培養後に培地を交換した。この細胞に、各試験化合物を検体として５μＭとなるように添加した。１５分間静置した後に、上記１）により得た感染性ＨＣＶ（ＨＣＶコアタンパク質量として、約0.2fmol/ウェル）をＨｕｈ７・５・１細胞に播種して感染させ、３７℃、５％CO2にて５〜６日間培養した。培養後、上清中のＨＣＶコアタンパク質量をオーソＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストにより定量し、各化合物のＨＣＶ増殖阻害効果を評価した。
【００４６】
（実験例１）ＨＣＶ阻害効果および細胞毒性試験結果
Enamine社（ナミキ商事）が保有する化合物について、実施例２の方法に従い、アッセイを行った。ＨＣＶ増殖抑制因子の陽性対照物としてＩＦＮ−α（最終濃度１００〜２００Units／ｍｌ）、陰性対照として溶媒として用いたＤＭＳＯとした。テトラゾリウム塩WST-8の生成したホルマザンの吸光度を直接測定するＷＳＴ法により、Ｈｕｈ７・５・１細胞に対する細胞毒性試験を行った。特に代表的な化合物４種類の結果を表１に示した。
【００４７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法によると、ＨＣＶの複製またはＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質を探索し、検出することができる。これにより、本発明のアッセイ方法は、化合物ライブラリーから新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤をスクリーニングするための試験系として利用することができ、ＨＣＶ増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とする新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤をスクリーニングを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムおよび発現プラスミドの構造を示す図である。
【図２】本発明のアッセイ方法を示す図である。
【符号の説明】
【００５０】
ａ（図２） スクリーニングしようとする試験検体。例えば低分子化合物ライブラリーおよび他の試験検体（５μＭ）
ｂ（図２） Huh7.5.1/pHH-JFH1 ゼオシン耐性細胞の培養上清
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＣ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法に関する。より正確には、ＨＣＶの感染から、複製、ＨＣＶタンパク質の翻訳、成熟、修飾、組立て、さらにウイルス放出にいたるＨＣＶ増殖のいずれかのステップに影響を及ぼす各種物質の探索を可能とするアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：hepatitis C virus）は、一本鎖ＲＮＡウイルスで、フラビウイルス科ヘパシウイルス属に属する。 ＨＣＶ１〜６までの６種の遺伝子型に分類される。さらにそれらの遺伝子型がいくつかのサブタイプに分類される(Hepatology, 10, p1321-1324 (1994); Hepatology, 42, p962-973 (2005))。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている(Science, 244, p359-362 (1989); J. Med. Virol., p334-339 (1992); J. Gen Virol., 73, p673-679 (1992); Hepatology, 16, 293-299 (1992))。
【０００３】
ＨＣＶは、約９．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡをゲノムとする。ゲノムの両端に存在する非翻訳領域は二次構造にとみ、５’末端には通常のｍＲＮＡで観察されるキャップ構造がなく、そのかわりにキャップ非依存的にｒＲＮＡがＲＮＡの翻訳を開始可能なＩＲＥＳ(Internal Robosomal Entry Site)が存在する。ウイルスＲＮＡから約3000アミノ酸からなる巨大な前駆体タンパク質が翻訳され、宿主細胞由来のタンパク質分解酵素によりウイルスの粒子を構成するコアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）に、また粒子には取り込まれないが、複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）は、ＮＳ２とＮＳ３が有するタンパク質分解酵素によって各タンパク質に切断される。
【０００４】
ＨＡＡＲＴ(Highly active antiretroviral therapy)の導入によって、エイズ患者の予後が大幅に改善された結果、わが国を含む先進国では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）感染者においてもエイズ以外の病因で死亡するケースが急増している。特に共感染したＨＣＶによる肝障害・肝不全の合併が死因の重要な部分をしめるようになっている。特に、非加熱凝固因子製剤によるＨＩＶ感染者では、ＨＩＶとＨＣＶの共感染は９７％にもおよび、ＨＣＶ感染症の治療はポストＨＡＡＲＴ時代の医療課題として重要なものとなっている。現在、ＨＣＶ感染症に対して、インターフェロンとリバビリン（Ribavirin (1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide)）の併用療法が一般的であるが、患者全体の５０％にしか有効ではなく、また、血球減少症・溶血性貧血など重篤な副作用をおこすことが知られている。
【０００５】
これまではＨＣＶにはウイルス培養系と実験用の感染小動物が存在しないことがＨＣＶの基礎研究の妨げになってきた。KolyhalovらはＨＣＶと同じフラビウイルス科に属するKunjinウイルスのレプリコンシステムを報告した（非特許文献１）。このシステムはKunjinウイルスの構造領域を取り除き、3'utrをＥＭＣＶのＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたものであり、この遺伝子構築から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、KunjinウイルスＲＮＡの持続的な複製とタンパク質発現が観察されるという実験系であった。そして、1999年、LohamannらによりＨＣＶのレプリコンシステムが報告された（非特許文献２）。このシステムはＨＣＶの構造領域の一部（ＮＳ２）を取り除き、その部分にＥＭＣＶのＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子を挿入したものである。この構造物を鋳型として試験管内でＲＮＡを合成し、Ｈｕｈ７細胞に導入した後にネオマイシン選択培地で選択培養し、この遺伝子構造から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、複製したＨＣＶレプリコンＲＮＡからネオマイシン耐性遺伝子が発現され、その遺伝子の働きでレプリコンが複製している細胞のみが生存可能となり、増殖したコロニーを形成する。レプリコン複製細胞では、ＨＣＶレプリコンＲＮＡが非常に高レベルで複製しており、複製しているＲＮＡや発現しているＨＣＶタンパク質を持続して安定して検出することができる。
【０００６】
しかし、それまではレプリコンとして増殖が報告されたＨＣＶ株は、全て遺伝子型１の株であった。さらにこれらの株は培養細胞内での増殖時にその複製効率を増強する適応変異を持ち、その適応変異の多くは患者血清から分離されたＨＣＶ株では認められない変異であった。また、その適応範囲を感染性クローンに導入し、そのＲＮＡをチンパンジーの肝臓に接種したところ、感染性が失われていることが明らかとなった。
【０００７】
遺伝子型が異なるＨＣＶでは、コードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されており、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶのサブゲノムレプリコンを含むＨＣＶ複製系のみを用いて様々なタイプのＨＣＶに効果を及ぼす抗ＨＣＶ薬を開発することは特に難しいと考えられる。したがって、数多くの遺伝子型のＨＣＶのレプリコンを作製して、ＨＣＶ複製機構、および抗ＨＣＶ薬の研究を行う必要があると考えられる。
【０００８】
その後、他の遺伝子型のＨＣＶ株の遺伝子を用いたＨＣＶレプリコンが各種報告されている。特に感染性クローンのＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するＨＣＶレプリコンについて報告がある（非特許文献３、４、特許文献１）。しかし、従来のレプリコンシステムでは、ＨＣＶ感染後の後期過程に作用する阻害剤であれば検出することが可能であったが、増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＨＣＶの阻害剤・治療剤を検出するには不十分であり、新たなアッセイ方法が望まれていた。
【非特許文献１】J. Virol., 71, 1497-1505 (1997)
【非特許文献２】Science 285, p.110-113 (1999)
【非特許文献３】Nature Medicine 11, Number 7, July p.791-796 (2005)
【非特許文献４】ウイルス第５５巻第２号 pp.287-296 (2005)
【特許文献１】国際公開WO2005/028652号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＨＣＶ増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＨＣＶの阻害剤・治療剤またはＨＣＶの増殖促進効果を有する薬剤の検出および探索を可能とする検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することを特徴とするＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法を見出し、本発明を完成した。感染性ＨＣＶは、感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから得られる感染性ＨＣＶレプリコンによる。
【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することを特徴とするＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法。
２．以下の工程を含む、ＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法：
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞を播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培地に加える工程；
３）さらに感染性ＨＣＶを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、ＨＣＶを測定する工程。
３．ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が、Ｈｕｈ７．５．１細胞である前項１または２に記載のアッセイ方法。
４．感染性ＨＣＶが、コアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）を含み、該ＨＣＶのＲＮＡゲノムが、コアタンパク質をコードする配列の上流にプロモーター配列を配置させてなる感染性ＨＣＶレプリコンゲノムである前項１〜３のいずれか１に記載のアッセイ方法。
５．感染性ＨＣＶレプリコンゲノムに配置されたプロモーターが、ＰｏｌＩプロモーターまたはＴ７プロモーターである前項４に記載のアッセイ方法。
６．感染性ＨＣＶレプリコンゲノムが、ＮＳ５タンパク質をコードする遺伝子領域の下流にターミネーターを配置させてなる前項４または５に記載のアッセイ方法。
７．ＨＣＶの測定が、ＨＣＶコアタンパク質量を測定する前項１〜６のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法によると、ＨＣＶの複製またはＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質を探索し、検出することができる。これにより、本発明のアッセイ方法は、化合物ライブラリーから新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤をスクリーニングするための試験系として利用することができ、ＨＣＶ増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とする新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤のスクリーニングを可能とする。本発明のアッセイ方法により、例えば表１に記載のＨＣＶ阻害剤をスクリーニングすることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．感染性ＨＣＶ
本発明において、感染性ＨＣＶとは文字通り感染性を有するＨＣＶをいう。本発明の感染性ＨＣＶは、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞において自律複製能を有していれば、ＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型１〜６の６タイプのいずれであっても良く、さらにそれらの各タイプがいくつかのサブタイプのいずれのタイプであっても良い。さらには、一般的な遺伝子型の分類ではなく、劇症肝炎患者から分離したＨＣＶであっても良い。
【００１４】
本明細書において劇症肝炎患者から分離したＨＣＶとは、いわゆる当業者が劇症肝炎と定義しうる症状を呈した患者から分離したＨＣＶを意味する。本発明において、劇症肝炎患者由来のＨＣＶは、天然由来ＨＣＶのＲＮＡゲノムのみならず、天然由来ＨＣＶのＲＮＡゲノム配列に人為的な改変を加えたＲＮＡゲノムを有するウイルスであっても良い。劇症株のＨＣＶの具体例としては、ＪＦＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号）、ならびにＪＦＨ−２．１株およびＪＦＨ−２．２株等のウイルスが挙げられる。
【００１５】
ＨＣＶのＲＮＡゲノムは、５’非翻訳領域（5'NTRまたは5'UTR）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、および３’非翻訳領域（3'NTRまたは3'UTR）からなる。その構造領域には、コアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、などのＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域にはＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４タンパク質、およびＮＳ５などの非構造タンパク質がコードされている。
【００１６】
本発明の感染性ＨＣＶは、細胞培養を用いてアッセイを可能とするために、ＨＣＶのＲＮＡゲノムを改変して作製されたＨＣＶ遺伝子から調製されたものであることが好ましい。このように改変されて作製されたＨＣＶを、本明細書において「感染性ＨＣＶレプリコン」といい、改変して作製されたゲノムを「感染性ＨＣＶレプリコンゲノム」ともいう。
【００１７】
本発明の感染性ＨＣＶレプリコンは、少なくともコアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）を含み、該ＨＣＶを構成するゲノム、すなわち感染性ＨＣＶレプリコンゲノムは、コアタンパク質をコードする配列の上流に、プロモーター配列を配置させてなる（図１参照）。
【００１８】
上記プロモーター配列は、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞においてＨＣＶが自律複製能を発揮しうるように配置されていれば良く、特に限定されないが、例えばＰｏｌＩプロモーター配列またはＴ７プロモーター配列が挙げられ、特に好適にはＰｏｌＩプロモーター配列が挙げられる。
【００１９】
本発明に係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの一つの実施形態は、上記配列のほか、例えばＮＳタンパク質をコードする配列の下流に、ターミネーター配列を配置させていても良い。具体的には、ＰｏｌＩターミネーター配列またはＴ７ターミネーター配列が挙げられる。さらには、コアタンパク質をコードする配列の上流に、１つのＩＲＥＳ配列を含んでも良く、これにさらに１つの選択マーカー遺伝子やリポーター遺伝子を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ゼオシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ゼオシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ゼオシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し、本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
上記の選択マーカー遺伝子およびリポーター遺伝子は、本発明の感染性ＨＣＶレプリコンゲノム中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ、等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、およびＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
【００２３】
また本発明に係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムには、さらにリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムは、５’側のレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、または外来遺伝子と、それより３’側のＩＲＥＳ配列、および各ＮＳタンパク質をコードする配列とを連結するように挿入し、リボザイムの自己切断活性により両者が切断されて分離するようにすることができる。
【００２４】
本発明に係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、ＨＣＶのＲＮＡゲノム上のウイルスタンパク質をコードする配列および外来遺伝子等が、レプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。それらの配列のうち、タンパク質をコードする配列は、ＨＣＶのＮＳタンパク質をコードする配列から翻訳されるポリタンパク質とともに、融合タンパク質として発現させた後で、プロテアーゼによって各タンパク質へと分離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
【００２５】
２．感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの作製
本発明の感染性ＨＣＶレプリコンに係る感染性ＨＣＶレプリコンゲノムは、いわゆる当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００２６】
３．感染性ＨＣＶレプリコンの作製
本発明の感染性ＨＣＶレプリコンは、上記作製した感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを、細胞に導入することにより作製することができる。感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを導入する細胞は、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が好適である。より感度の高いアッセイを行うためには、Ｈｕｈ７．５．１細胞(PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005))が特に好適である。該ＲＮＡゲノムの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
【００２７】
細胞への感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの導入に際し、目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にして感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの量を変化させたい場合には、目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
【００２８】
感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの細胞へ導入し、ＨＣＶを作製するに際し、ＨＣＶゲノム全体を発現しうる発現ベクターを用いることができる。具体的には、本発明の感染性ＨＣＶのＲＮＡゲノム全長ｃＤＮＡを含む配列を、プラスミドに挿入する。例えば、劇症肝炎の患者から分離したＨＣＶ株からＪＦＨ−２．１株およびＪＦＨ−２．２株のクローンを非特許文献２に記載の方法で作製し、例えばＰｏｌＩプロモーター配列とターミネーター配列の合成ＤＮＡをそれぞれのクローンの５’および３’端に付加し、プラスミドｐＵＣ１９プラスミドに挿入することができる。
【００２９】
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子を含有する感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを用いる場合は、該ゲノムが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、該ゲノムの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。
【００３０】
一例として、感染性ＨＣＶレプリコンゲノムにゼオシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、その該ゲノムを用いて細胞内導入処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１６〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにゼオシンやネオマイシン等の抗生物質を０．０５〜３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、その後、週に２〜４回程度培地を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０〜４０日間、より好ましくは１４〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、該ＲＮＡゲノムが導入され、持続的に複製されている細胞を、コロニーとして選択することができる。形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。
【００３１】
樹立した細胞クローンについては、導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから該細胞クローン中で複製されている該ゲノムの検出、導入された該ゲノム中の選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、およびＨＣＶタンパク質の発現の確認を行って、実際に目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
【００３２】
導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから該細胞クローン中で複製された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよい。例えば、細胞クローンから抽出したトータルＲＮＡについて、導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
【００３３】
また導入された感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの宿主ゲノムＤＮＡへの組込みは、例えばＨＣＶタンパク質の発現を検出することによって、確認することができる。
【００３４】
ＨＣＶタンパク質の発現は、例えば、導入されたレプリコンゲノムから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞クローンから抽出したタンパク質と反応させることによって検出することができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には、例えば、細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、またはＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞クローンから抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、感染性ＨＣＶ由来のレプリコンゲノムが持続的に複製してＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
【００３５】
以上のようにして、目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを持続的に複製していることが確認された細胞クローン（レプリコン複製細胞クローン）を得ることができる。また本発明においては、このレプリコン複製細胞から、例えばＲＮＡを抽出し、その中からレプリコンＲＮＡを電気泳動法により分離する等の当業者には公知の任意の方法により、レプリコンＲＮＡを取得することができる。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。レプリコン複製細胞からのＨＣＶタンパク質の製造は、当業者であれば常法に従って行うことができる。具体的には、例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞および培地を含む）から常法によりタンパク質を取得することができる。
【００３６】
目的の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムを再導入して感染性ＨＣＶを培養上清中に回収するための細胞としては、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が好適である。より感度の高いアッセイを行うために、Ｈｕｈ７．５．１細胞(PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005))が特に好適である。感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。
【００３７】
４．本発明のアッセイ方法
本発明に係るＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイは、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および本発明の感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することにより行うことができる。
より具体的には、以下のようにして行うことができる。
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞を、播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培地に加える工程；
３）さらに感染性ＨＣＶを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、ＨＣＶを測定する工程。
【００３８】
上記アッセイ方法について、さらに詳しく説明する。
１）上記ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞は、本発明のアッセイ方法をより感度良く行うために、Ｈｕｈ７．５．１細胞(PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005))を用いるのが特に好適である。なお、使用する細胞は、継代数が第４３回目までのものが好ましい。該細胞を、該細胞培養用培地に懸濁し、アッセイ用容器、例えば９６穴のマイクロプレートに播種することができる。
２）試験検体としては、ＨＣＶの複製を促進または抑制する物質を探索するために候補として挙げられる物質であれば、高分子化合物であっても低分子化合物であっても良い。または、天然物、天然物誘導体であっても良いし、放射菌等の培養抽出物であっても良い。試験検体の濃度は、適宜選択することができる。
３）さらに本発明の感染性ＨＣＶを播種することで、試験検体と感染性ＨＣＶを含む複製細胞を培養し、得られる培養物中の感染性ＨＣＶを検出することができる。感染性ＨＣＶは、上述に従い作製することができる。
４）感染性ＨＣＶを細胞中で培養するために、３〜１０日間、好ましくは４〜７日間、より好ましくは５〜６日間、３７±１℃で加温することができる。
５）上記培養後、培養上清を採取し、ＨＣＶを測定することにより本発明のアッセイを行うことができる。ＨＣＶの測定は、ＨＣＶの複製の促進または抑制を確認しうる方法であれば良く、特に限定されるものではないが、例えば市販のキットを用いてＨＣＶコアタンパクの産生量をＥＬＩＳＡ法などにより確認することができる。
【００３９】
さらに、上記のアッセイ方法に加えて、試験検体のＨＣＶの複製の促進または抑制に及ぼす影響をより確実に確認するために、非特異作用を排除するために、並行して細胞毒性試験を行っても良い。このようなアッセイ方法は、ＨＣＶ感染阻害剤、例えばＨＣＶ治療剤や診断剤等を評価するためのスクリーニング方法に利用することができる。具体的には、以下のような例が挙げられる。
【００４０】
（１）ＨＣＶの増殖を抑制する物質の探索
ＨＣＶの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的または間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００４１】
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザインまたはハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば、単離精製された酵素）等が挙げられる。
【００４２】
（３）抗ＨＣＶ剤などの薬剤等に対する耐性獲得能の評価および該耐性に関わる変異の同定を行うことができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１）アッセイ方法
１）感染性ＨＣＶレプリコンゲノムの作製
PNAS, Vol.102, no.26 p9294-9299 (2005)に記載の方法に従い、ＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター／ターミネーター系を利用したＪＦＨ１株（ゲノタイプ ２ａ）のｃＤＮＡ発現プラスミド導入細胞株（Huh7.5.1/JFH1 ゼオシン耐性細胞）を用いて、図１に示す感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから感染性ＨＣＶを作製した。ＨＣＶストック液は、分注した後、−８０℃で保存した。
【００４５】
２）アッセイ方法
Ｈｕｈ７・５・１細胞（継代数が第４３回目までのものを使用）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に1×104cells/100μl/ウェルとなるように懸濁したものを９６ウェルのマイクロプレートに播種し、１日培養後に培地を交換した。この細胞に、各試験化合物を検体として５μＭとなるように添加した。１５分間静置した後に、上記１）により得た感染性ＨＣＶ（ＨＣＶコアタンパク質量として、約0.2fmol/ウェル）をＨｕｈ７・５・１細胞に播種して感染させ、３７℃、５％CO2にて５〜６日間培養した。培養後、上清中のＨＣＶコアタンパク質量をオーソＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストにより定量し、各化合物のＨＣＶ増殖阻害効果を評価した。
【００４６】
（実験例１）ＨＣＶ阻害効果および細胞毒性試験結果
Enamine社（ナミキ商事）が保有する化合物について、実施例２の方法に従い、アッセイを行った。ＨＣＶ増殖抑制因子の陽性対照物としてＩＦＮ−α（最終濃度１００〜２００Units／ｍｌ）、陰性対照として溶媒として用いたＤＭＳＯとした。テトラゾリウム塩WST-8の生成したホルマザンの吸光度を直接測定するＷＳＴ法により、Ｈｕｈ７・５・１細胞に対する細胞毒性試験を行った。特に代表的な化合物４種類の結果を表１に示した。
【００４７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のＨＣＶ阻害剤を検出するためのアッセイ方法によると、ＨＣＶの複製またはＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質を探索し、検出することができる。これにより、本発明のアッセイ方法は、化合物ライブラリーから新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤をスクリーニングするための試験系として利用することができ、ＨＣＶ増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とする新たなＨＣＶの阻害剤・治療剤をスクリーニングを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の感染性ＨＣＶレプリコンゲノムおよび発現プラスミドの構造を示す図である。
【図２】本発明のアッセイ方法を示す図である。
【符号の説明】
【００５０】
ａ（図２） スクリーニングしようとする試験検体。例えば低分子化合物ライブラリーおよび他の試験検体（５μＭ）
ｂ（図２） Huh7.5.1/pHH-JFH1 ゼオシン耐性細胞の培養上清
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性Ｃ型肝炎ウイルスを接触させたのち、Ｃ型肝炎ウイルスを測定することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法：
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞を播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培地に加える工程；
３）さらに感染性Ｃ型肝炎ウイルスを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを測定する工程。
【請求項３】
ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が、Ｈｕｈ７．５．１細胞である請求項１または２に記載のアッセイ方法。
【請求項４】
感染性Ｃ型肝炎ウイルスが、コアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）を含み、該Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムが、コアタンパク質をコードする配列の上流にプロモーター配列を配置させてなる感染性Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンゲノムである請求項１〜３のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
感染性Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンゲノムに配置されたプロモーター配列が、ＰｏｌＩプロモーターまたはＴ７プロモーターの配列である請求項４に記載のアッセイ方法。
【請求項６】
感染性Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンゲノムが、ＮＳ５タンパク質をコードする遺伝子領域の下流にターミネーター配列を配置させてなる請求項４または５に記載のアッセイ方法。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルスの測定が、Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質量を測定する請求項１〜６のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【請求項１】
ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体および感染性Ｃ型肝炎ウイルスを接触させたのち、Ｃ型肝炎ウイルスを測定することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法：
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞を播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培地に加える工程；
３）さらに感染性Ｃ型肝炎ウイルスを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを測定する工程。
【請求項３】
ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞が、Ｈｕｈ７．５．１細胞である請求項１または２に記載のアッセイ方法。
【請求項４】
感染性Ｃ型肝炎ウイルスが、コアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）ならびに複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）を含み、該Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムが、コアタンパク質をコードする配列の上流にプロモーター配列を配置させてなる感染性Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンゲノムである請求項１〜３のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
感染性Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンゲノムに配置されたプロモーター配列が、ＰｏｌＩプロモーターまたはＴ７プロモーターの配列である請求項４に記載のアッセイ方法。
【請求項６】
感染性Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンゲノムが、ＮＳ５タンパク質をコードする遺伝子領域の下流にターミネーター配列を配置させてなる請求項４または５に記載のアッセイ方法。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルスの測定が、Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質量を測定する請求項１〜６のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【図２】
【図１】
【図１】
【公開番号】特開２００８−１６１０８０（Ｐ２００８−１６１０８０Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３５１８０９（Ｐ２００６−３５１８０９）
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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