Ｃ末端のペプチドの識別に基づいたタンパク質の試料を分析するための方法
本発明は、それらのＣ−末端のペプチドの単離及び分析に基づいた一つの又はより多くの試料におけるタンパク質を識別するための方法に関係する。単離されたペプチドは、質量分析法によって精製された及び分析されたものである。親のタンパク質の識別は、追加的な物理化学的なパラメーターとの組み合わせでＣ−末端のペプチドの質量に基づいたものである。本発明は、さらに、Ｃ末端のペプチドの質量及びそれらの一つの又はより多くの物理化学的な性質を含むコンピューター内の開裂させられたタンパク質のＣ−末端のペプチドの注釈が付けられたデータベースに関係する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開裂されたタンパク質の混合物からのペプチドの選択的な単離を可能にする、質量分析を使用するタンパク質の試料の同時の分析のための方法に関係する。本発明は、さらに、質量分析のデータのペプチド及びデータ分析を精製するための技術に関係する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析（ＭＳ）を使用するタンパク質を識別するための異なる方法は、この数十年間にわたって徐々に発展してきたものである。いわゆるフィンガープリント法において、タンパク質は、単離されると共にペプチドのフラグメントへと開裂させられる。開裂させられたタンパク質のコンピューター内のデータベースと発生させられたペプチドの質量を比較することによって、さらなる配列の決定無しに親のタンパク質を識別することは、可能なことである。
【０００３】
しかしながら、それは、一つの単一の実験において、ショットガン・アプローチを使用することで、試料に存在する異なるタンパク質を研究することを目指す。ペプチドの試料の複雑さを低減することは、しばしば、内部のシステインを含有するペプチドを選択的に単離することによって行われる。システインが、あらゆるタンパク質に現れるものではないので、代案のストラテジーが、発生させられたペプチドの混合物からＮ末端又はＣ末端のペプチドを特異的に単離するために開発されてきたものである。この方式では、あらゆるタンパク質は、一つのペプチドによって表現される。Ｃ末端のペプチドの単離に基づいた方法の例は、例．米国特許第６，１５６，５２７号明細書（Ｓｃｈｍｉｄｔ）（特許文献１）及び米国特許出願公開第２００２／０１０６７００号明細書（Ｆｏｏｔｅ）（特許文献２）に記載される。このアプローチは、同じタンパク質に由来する異なるペプチドを識別することに基づいたものである、古典的なフィンガープリントを可能にするものではない。にもかかわらず、ＭＳ／ＭＳペプチドの配列決定を行う必要があることなく、ペプチド（及びその結果としてそれの親のタンパク質）を積極的に識別することができるものであることは、好都合なものであるであろう。
【０００４】
米国特許第６，８４６，６７９号明細書（Ｓｃｈｍｉｄｔ）（特許文献３）は、Ｃ末端のペプチドを選択すると共にＣ末端のペプチドのデータベースとこれらのペプチドの質量を比較するための方法を開示する。この特許の例は、ペプチドの約４５％のみについての、約１８００個のＣ末端のＬｙｓ−Ｃのペプチドのセットについて、質量は、疑う余地無しに、Ｌｙｓ−Ｃのペプチドのコンピューター内の発生させられたデータベースにおける単一のペプチドと相関させることができることを示す。
【０００５】
米国特許出願公開第２００５／００９２９１０号明細書（特許文献４）は、ＭＳにおけるペプチドの質量が、ペプチドの別の物理化学的な性質のみならず、決定されるところの方法を開示する。この方法は、同じ質量を有するペプチド間で弁別することを可能にする。しかしながら、完全な試料が分析されるという事実を考慮に入れて、このようなペプチドを単一の親のタンパク質に帰することができないように、同じ質量及び同じ物理化学的な性質の両方を有するものである莫大な数の異なるペプチドは、なおも発生させられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，１５６，５２７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／０１０６７００号明細書
【特許文献３】米国特許第６，８４６，６７９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／００９２９１０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それに応じて、残るものは、複合体のタンパク質の試料を、ＭＳ／ＭＳにおいて発生させられたペプチドの配列決定の必要性無しにＭＳによって分析することができる、高いスループットの方法についてのさらなる要望である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、タンパク質の開裂並びにそれらからのＣ末端のペプチドの単離及び分析に基づいた、複合体のタンパク質の混合物に存在するタンパク質を包含するものである、タンパク質を分析するための方法に関係する。本発明の方法において、単離されたＣ末端のペプチドは、一つの又はより多くのペプチドの精製ステップに及びＭＳ分析にかけられる。精製の間に又は後に、それの質量以外の精製されたペプチドの物理化学的な性質は、収集される。精製されたＣ末端のペプチドの質量は、ＭＳによって決定される。ペプチドは、Ｃ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの物理化学的な特性の両方を組み合わせるものであるデータベースとの比較に基づいて識別される。特定の実施形態において、２、３、４、５、又は１０までの追加的な物理化学的な特性は、データベースに注釈を付けるために使用される。本発明の方法は、ＭＳ／ＭＳにおける新規の配列の決定についての必要性無しに高い確度で、Ｃ末端のペプチド（及び、それに応じて、それらの対応する親のタンパク質）の積極的な識別を可能にする。
【０００９】
Ｃ末端のペプチドが選択されるところの手順の利点は、各々のタンパク質が、分析されるものである試料の複雑さにおける強い低減に至るものである、タンパク分解性の開裂の後における単一のペプチドのみ、及び、これらのペプチドの情報を含有する対応するデータベース、によって表現されるというものである。
【００１０】
提示された手順の別の利点は、全てのタンパク質のＣ末端のペプチドが、（人間、マウス及びラットのような、しかし、ショウジョウバエ、線虫及び酵母のような、より低級な生体もまた）それらのゲノムが配列決定されてしまってあるところの生体について知られたものであるというものである。これらのペプチドの正確な分子量を、予言することができるが、それは、測定された質量に特異的な信号の根底にあるペプチドの識別を支持することが期待される。これは、＞５００，０００の程度の分解能及び＜１ｐｐｍの質量の確度を達成することができるものである、ＦＴ−ＩＲと同様の現行で利用可能な高性能の質量分析の技術について特に真実である。
【００１１】
加えて、期待されたＣ末端のペプチドの本性が、ゲノムの配列のコンピューター内の分析から知られると、合成のタンパク質のライブラリーが、発生させられると共に、調製のプロセスの間における各々のペプチドの正確な特性（例．異なるクロマトグラフィーの材料における保持時間、ＥＳＩ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおける挙動）を、決定すると共に複合体のタンパク質の混合物から識別されたペプチドと比較することができる。これは、正しいタンパク質の識別における信頼性を顕著に改善する。
【００１２】
さらに本発明の利点は、Ｃ末端のペプチドが、（プロテオミクスにおける一般的な修飾であると共に質量分析によってタンパク質の下流の分析を乱すものではないところのアルキル化及びアセチル化は別として）当該発明の方法に修飾されない状態にとどまるというものである。従って、気体の相へとペプチドを蒸発させるためのイオン化するプロセスとの干渉は、ありそうもないことである。
【００１３】
与えられた方法の別の利点は、既存のスプライスバリアントの少なくとも一部分、すなわち、タンパク質のＮ末端の側で起こるものを、本発明のアプローチによって扱うことができるというものであるが、それにおいては、あまり可変なものではないＣ末端は、単離されると共に識別される。
【００１４】
当該発明の特定の及び好適な態様は、付随する独立の及び従属の請求項において設定される。従属の請求項の特徴は、適当なものとして及び請求項に明示的に設定されたものとしてだけでなく独立の請求項のいずれの特徴とも及び他の従属の請求項の特徴と組み合わせられることがある。
【００１５】
本発明の第一の態様は、タンパク質の試料におけるタンパク質を識別するための方法を提供する。これらの方法は、典型的には、
ａ）タンパク質の試料におけるタンパク質のカルボキシル基を修飾すること、
ｂ）開裂剤でペプチドへとタンパク質の試料におけるタンパク質を開裂させること、
ｃ）開裂させられたペプチドから、Ｃ末端のペプチドを単離すること、それによってＮ末端の及び内部のペプチドを取り除くこと、
ｄ）精製されたＣ末端のペプチドを得るように、一つの又はより多くのペプチド精製ステップに単離されたＣ末端のペプチドをかけること、
ｅ）精製されたＣ末端のペプチドの、質量以外の、少なくとも一つの物理化学的な性質を決定すること又は計算すること、
ｆ）ＭＳにおけるＣ末端のペプチドの質量を決定すること、
ｇ）精製されたＣ末端のペプチドの親のタンパク質を識別するように、開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの物理化学的な性質を含むデータベースと精製されたＣ末端のペプチドの質量及び少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること、
：のステップを含む。
【００１６】
当該発明の方法の一つの実施形態に従って、ステップ（ｇ）は、精製されたＣ末端のペプチドの各々について、精製されたＣ末端のペプチドに対応する質量を備えたデータベースにおける一つの又はより多くのＣ末端のペプチドを識別すること、及び、一つと比べてより多いペプチドが、一つの精製されたＣ末端のペプチドに対応するものとしてデータベースにおいて識別されるとき、データベースにおける対応するＣ末端のペプチドを積極的に識別するように、データベースにおいて識別された一つと比べてより多いペプチドのものと、精製されたＣ末端のペプチドの少なくとも一つの他の物理化学的なパラメーターを比較すること、を含む。
【００１７】
当該発明のこの態様の方法の一つの実施形態に従って、タンパク質の試料は、スピーシーズからものであると共に、データベースは、開裂剤によって発生させられたそのスピーシーズの全てのＣ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの他の物理化学的な性質を含む。
【００１８】
本発明の方法の特定の実施形態は、それによってタンパク質が、二つの又はより多くの試料において同時に識別されるところの方法を包含すると共に、その方法は、それに応じて、後に続く追加的な特徴：
− 試料の各々について異なる、差異的な標識付けの試薬のセットの一つで、ステップ（ａ）における修飾を行うこと、
− ステップ（ｄ）に先立ち、二つの又はより多くの試料を貯留することの追加的なステップ、
− ステップ（ｇ）に先立ち、試料を識別するように、単離されたペプチドの標識の本性を識別すること、その試料にペプチドが由来すること、及び、
− ステップ（ｇ）において、Ｃ末端のペプチドを識別するように、開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及びそれらの少なくとも一つの他の物理化学的な性質を含むデータベースと精製されたＣ末端のペプチドの質量及び少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること
を含む。
【００１９】
当該発明の方法の特定の実施形態に従って、少なくとも一つの物理化学的な性質は、一つの又はより多くのペプチド精製ステップの間に決定される。
【００２０】
当該発明の方法の特定の実施形態に従って、少なくとも一つの物理化学的な性質は、ｐＩ、逆相クロマトグラフィーの間における保持時間、並びに、２８０及び２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収の比の群より選択される。
【００２１】
当該発明の方法の特定の実施形態において、ステップ（ａ）における修飾は、第一級アミンとのカルボジイミド反応を使用することで行われる。
【００２２】
ステップ（ｃ）におけるＣ末端のペプチドの単離は、第一級アミン基を担持する修飾されたビオチンとのカルボジイミドで媒介された反応を介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させることのステップを含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、
ａ）第一級アミンとカルボジイミドを介して試料における（無処置の）タンパク質のカルボキシル基を反応させること、
ｂ）ペプチドへと開裂剤で（無処置の）タンパク質を開裂させること、
ｃ）第一級アミンの基を担持するアフィニティータグとカルボジイミドを介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させること、
ｄ）アフィニティーマトリックスへタグが付けられたペプチドを結び付けること、及び、結び付けられてないペプチド（結び付けられてないペプチドはタグが付けられてないペプチドである）を収集すること、それによって（ｂ）の下で得られたペプチドから、Ｎ末端の及び内部のペプチドからのＣ末端のペプチドを単離すること
：のステップを含むタンパク質の試料からＣ末端のペプチドを単離するための方法を提供する。
【００２４】
当該発明のこの態様の方法の特定の実施形態に従って、アフィニティータグは、ビオチンである。
【００２５】
本発明のなお別の態様は、開裂剤によってコンピューター内で開裂された生体のタンパク質のＣ末端のペプチドのデータベースに関係するが、それにおいて各々のペプチドは、タンパク質の識別子、アミノ酸組成、質量及び一つの又はより多くの他の物理化学的な性質によって特徴付けられる。
【００２６】
特定の実施形態において、データベースにおけるＣ末端のペプチドの一つの又はより多くの他の物理化学的な性質は、逆相クロマトグラフィーにおける計算された保持時間、与えられたｐＨにおける正味の電荷、及び、Ｃ末端のペプチドの等電点からなる群より選択される。
【００２７】
特定の実施形態において、データベースは、コンピューター内で開裂させられたヒトの生体のタンパク質のデータベースである。
【００２８】
さらなる特定の実施形態において、データベースは、トリプシンであるところの開裂剤でのタンパク質の開裂することに基づいたものである。
【００２９】
特定の実施形態において、データベースにおけるペプチドは、それによって一つの開裂位置がはずされるところの開裂剤での不完全な開裂から結果として生じるＣ末端のペプチドを包含する。
【００３０】
本発明のなおさらなる態様は、タンパク質の識別についての上に記載された方法におけるデータベースの使用に関係する。
【００３１】
本発明のなおさらなる態様は、それらのＣ末端のペプチドに基づいた一つの又はより多くの試料におけるタンパク質を識別するためのデバイス（１００）を提供するが、そのデバイスは、それが、少なくとも一つの試料源（１０１）、少なくとも一つの対応する修飾する薬剤／標識源（１０３）を備えた、修飾／標識付けのユニット（１０２）、開裂ユニット（１０４）、Ｃ末端のペプチド単離ユニット（１０５）、精製されたペプチドの一つの又はより多くの物理化学的な性質を決定する及び／又は登録するための分析ユニット（１０７）を備えたペプチド分離ユニット（１０６）、質量分析計ユニット（１０８）、読み出しユニット（１１０）へ接続された制御回路部品及びデータ分析ユニット（１０９）を含むという点で特徴付けられるものである。より具体的に、本発明のデバイスは、Ｃ末端のペプチドの物理化学的な性質で注釈が付けられた開裂剤を使用することでコンピューター内において開裂させられたタンパク質の全てのＣ末端のペプチドの質量を含むデータベース（１１１）への接続を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、具体的に実施形態に従って、Ｃ末端のペプチドの単離のための方法、１：タンパク質の変性；２：タンパク質のアルキル化；３：タンパク質のアセチル化；４：カルボキシル基のＥＤＣ活性化；５：第一級アミンとのＥＤＣで活性化されたカルボキシル基の反応；６：Ｎ末端のもの（ａ）、内部のもの（ｂ）、及びＣ末端のペプチド（ｃ）へのタンパク質の開裂；７：精製ユニットへのＮ末端の及び内部のペプチドの遊離のカルボキシル基のライゲーション；８：溶液（ｃ）に残されるものである、Ｃ末端のペプチドのアフィニティー分離、を示す。
【図２】図２は、本発明の具体的な実施形態に従って、分子１におけるカルボキシル基と分子２における第一級アミンの基との間におけるカルボジイミドで媒介された反応を示す。
【図３】図３は、本発明の特定の実施形態に従って、カルボキシル基とのカルボジイミドで媒介された反応に適切な第一級アミンの基で修飾されたビオチンの構造を示す。
【図４】図４は、本発明の特定の実施形態に従って、二つの試料源（１０１）、対応する修飾する薬剤／標識源（１０３）を備えた、修飾／標識付けのユニット（１０２）、開裂ユニット（１０４）、Ｃ末端のペプチド単離ユニット（１０５）、ペプチド分離ユニット（１０６）、質量分析計ユニット（１０８）、並びに、読み出しユニット（１１０）へ接続された制御回路部品及びデータ分析ユニット（１０９）を含む２個のタンパク質の試料のＣ末端のペプチドを単離する及び分析するためのデバイス（１００）を示す。分離ユニット（１０６）は、二つの連続的にリンクされた分離システム（１１０６）及び（２１０６）を含む。質量分析計素子（１０８）は、ペプチドの同位体の形態を分離するものであるユニットを含む。ユニット１０７は、（１０６）において精製されたペプチドの物理化学的な性質を決定する及び／又は登録するための分析ユニットである。ユニット１１１は、Ｃ末端のペプチドの注釈が付けられたデータベースである。（点線は、実験的な及びコンピューター内のデータの獲得を示唆する）。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の上記の及び他の特性、特徴、及び利点は、一例として、当該発明の原理を図示するものである、付随する図面と併せて考慮された、後に続く詳細な説明から明らかなものになることになる。この記載は、当該発明の範囲を限定することなく、例のみの目的で与えられる。以下に引用された参照図は、添付された図面を指す。
【００３４】
異なる図において、同じ符号は、同じ又は類似の要素を指す。
【００３５】
本発明を、特定の実施形態に関して、及び、ある一定の図面を参照して、記載することにするが、しかし、当該発明は、それらに限定されるものではなく、請求項によってのみ限定される。請求項におけるいずれの符号も、その範囲を限定するものとして解釈されないものとする。記載された図面は、単に概略的なものであると共に限定しないものである。図面において、要素のいくつかのサイズは、誇張されると共に図示の目的のために一定の縮尺で描かれないことがある。用語“を含む”が、本記述及び請求項において使用される場合には、それは、他の要素又はステップを排除するものではない。単数の名詞を指すとき不定冠詞又は定冠詞、例．“ある”又は“その”が使用される場合には、これは、他に何かが具体的に述べられない限り、複数のその名詞を包含する。
【００３６】
さらには、記述における及び請求項における用語、第一の、第二の、第三の、及び同様のものが、類似の要素の間で区別するために、及び、必ずしも順次の又は経時的な順序を記述するためにではなく、使用される。そのように使用された用語が、適当な状況の下で交換可能なものであること、及び、ここに記載された発明の実施形態が、ここに記載された又は図示されたもの以外のシーケンスにおいて動作の可能なものであることは、理解されることである。
【００３７】
後に続く用語又は定義は、単に当該発明の理解において援助するために提供される。指定されない限り、これらの定義は、当業者によって理解されたものと比べてより少ない範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００３８】
ここに使用されたような、用語“ペプチド”又は“タンパク質”は、ペプチド結合を介して接続された複数の天然の又は修飾されたアミノ酸を指す。ポリペプチドの長さは、２個から数千個のアミノ酸まで変動することができる（このように用語は、また、一般的にオリゴペプチドと称されるものをも包含する）。この範囲内に含まれるものは、
グリコシル化、ホスホリル化、など、のような生体内の翻訳後の修飾によって修飾されるものである一つの又はより多くのアミノ酸を含む、及び／又は、タンパク質を修飾する薬剤（例．アルキル化する薬剤）で試験管内において修飾されてしまってあるものである一つの又はより多くのアミノ酸を含む、ポリペプチドである。
【００３９】
ここに使用されたような用語“ポリペプチドのフラグメント”又は“ペプチド”は、タンパク質又はポリペプチドの酵素的な開裂の後で得られたアミノ酸配列を指すために使用される。ポリペプチドのフラグメント又はペプチドは、サイズ又は本性において限定されるものではない。
【００４０】
用語“内部の”、“Ｎ末端の”、及び“Ｃ末端の”は、ペプチドを指すとき、タンパク質又はポリペプチドにおけるペプチドの対応する場所を指すために、ここにおいて使用される。例えば、タンパク質ＮＨ２−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２−Ｒ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ４−ＣＯＯＨ（それにおいてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）無しの平凡な長さのペプチドの配列である）のトリプシンの開裂において、Ｎ末端のペプチドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｋ−ＣＯＯＨである、内部のペプチドは、ＮＨ２−Ｘ２−Ｒ−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−Ｘ３−Ｋ−ＣＯＯＨである、と共に、Ｃ末端のペプチドは、ＮＨ２−Ｘ４−ＣＯＯＨである。
【００４１】
用語“親のタンパク質”は、開裂されたペプチドが誘導されるところの開裂されてないタンパク質を指す。
【００４２】
ここにおいて使用されるような用語“タンパク質の開裂”は、ポリペプチドにおける二つのアミノ酸の間に結合させられたペプチドの加水分解を指す。生理学的なプロセスの事情において、タンパク質の開裂は、“酵素的な加水分解”、“タンパク分解性のプロセシング”、及び“タンパク質の成熟”ともまた称される。それに応じて、用語“開裂剤”は、ポリペプチド又はペプチドにおける二つのアミノ酸の間におけるペプチド結合を加水分解することが可能な化合物を指す。
【００４３】
ここにおいて使用されたような用語“フラグメンテーション”は、一つの又はより多くの化学的な結合の切断及び例．タンデム質量分析（ＭＳ）又はＭＳ／ＭＳ分析における衝突で誘発させられた解離（ＣＩＤ）によって、得られたような分子の一つの又はより多くの部分のその後の解放を指す。ある一定の実施形態において、結合は、ペプチド結合であるが、しかし、それは、それに限定されるものではない。
【００４４】
本発明における用語“質量”は、質量対電荷の比（ｍ／ｚ）を指す。略語ｍ／ｚは、イオンの質量数をそれの電荷の数によって形成された無次元の量を表記するために使用される。“モノアイソトピック質量”は、最も豊富な同位体のみを含有するイオンの質量を指す。“平均の質量”は、各々の元素についての原子量を使用することで計算された与えられた経験的な式の粒子又は分子の質量を指す。
【００４５】
ここにおいて使用されたような用語“標識”は、化合物又は分子を指すが、それを、ペプチド又はポリペプチドへ共有結合的に連結させる又はそれの中に組み込むことができると共に、それは、それえの特定の性質に基づいて、質量分析のような、光学的な又は他の手段によって検出可能なものである。標識を、ペプチド又はポリペプチドへ共有結合的に結び付けることができる場合には、これは、標識付けの試薬に存在するものである、タンパク質／ペプチドの反応性の基によって保証される。用語標識が、当技術において一般に使用される一方で、（例．タンパク質又はペプチドへ結び付けられたもののような）このようなもののような標識と、官能基へ結び付くことが可能な、標識付けの試薬（ペプチド又はタンパク質との結び付きに先立つ標識を含む分子）との間に差別を作ることができる。本発明は、蛍光性の又は同位体の標識のような、異なるタイプの標識の使用を予見する。
【００４６】
ここにおいて使用されたような用語“同位体の標識”は、同じ化学式を有するが、しかし、ＭＳでの質量における差異に帰着する、一つの又はより多くの原子の存在する同位体の数及び／又はタイプにおいて相互に異なる、標識のセットを指す。このように、異なる同位体の標識で標識付けされた同一のペプチドを、質量における差異に基づいてＭＳにおいてこのようなものとして差別化することができる。
【００４７】
ここにおいて使用されたような用語“タンパク質／ペプチドの反応性の基”（ＰＲＧ）は、アミノ酸へのこのような化合物の（非共有結合的な又は共有結合的な）結び付きに帰着するタンパク質又はペプチドのアミノ酸における官能基と反応することが可能なものである化合物における化学的な機能を指す。
【００４８】
ここにおいて使用されたような用語“官能基”は、化合物へ結び付く（一般には、共有結合的に結び付く）ために使用することができるものであるアミノ酸における化学的な機能を指す。官能基は、アミノ酸の側鎖に又はポリペプチド若しくはペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に存在するものであることができる。その用語は、ペプチド又はポリペプチドに天然に存在するものであるところの官能基及び例．タンパク質を修飾する薬剤を使用する化学的な反応を介して導入されたものの両方を包括する。
【００４９】
本発明は、対応するＣ末端のペプチドの質量の決定に、及び必要なものであるとすれば、このＣ末端のペプチドの他の物理化学的なパラメーターに、基づいて親のタンパク質を識別することの方法を記載する。
【００５０】
本発明の方法及びツールは、同時の分析が関心のあるものであるところの試料のセットの分析において特に関心のあるものである。試料のこのようなセットは、異なる時点で取得された患者からの試料、疾患の異なる臨床的なバージョンの試料、異なる患者の試料、などであることができるが、しかし、それらに限定されるものではない。本発明は、このように、疾患の進行のマーカーを識別するための、差異的な診断のための、及びその上、生化学的な又は生理学的なアッセイにおける多重分析のための、方法及びツールを提供する。
【００５１】
本発明の方法及びツールは、タンパク質の試料の分析に関係する。ここにおいて使用されたような用語‘試料’は、必然的に、当該発明の方法の行うことに先立ついずれの加工するステップをも包含する又は排除することが意図されたものではない。試料は、粗い加工されてない試料、抽出されたタンパク質のフラクション、精製されたタンパク質のフラクション、などであることができる。一つの実施形態に従って、タンパク質の試料は、豊富なタンパク質の免疫抑制によって予備処理される。
【００５２】
本発明の方法での分析に適切なものであるタンパク質の試料は、ウイルス性の、原核生物の、細菌性の、真核生物の、カビの、酵母の、植物性の、無脊椎動物の、脊椎動物の、ほ乳類の、及びヒトの起源の試料を包含する。試料は、線虫、ショウジョウバエ、若しくはマウスの胚のホモジェネートのような全体的な生体であることができるか、又は、生体の組織若しくは器官であることができる。試料の調製は、調査された生体、組織、又は器官に依存することで異なるが、しかし、標準的な手順は、通常、利用可能なもの及び専門家に知られたものである。ほ乳類の及びヒトのタンパク質の試料に関して、それは、培養された細胞、レーザーでマイクロ切開された細胞、体の組織、体液、又は関心のある他の関連性のある試料の単離をカバーする。試料におけるタンパク質の分画に関して、細胞の溶解は、細胞の分画及びタンパク質の精製における第一のステップである。物理的な、酵素的な、及び洗浄剤に基づいた方法を包含するものである、多数の技術は、細胞の崩壊に利用可能なものである。歴史的には、物理的な溶解は、細胞の崩壊についての選抜の方法でありつづけてきた；（均質化、浸透圧性の溶解、超音波の細胞の崩壊）しかしながら、それは、しばしば、高価な、厄介な設備を要求すると共に（窮屈な均質化の乳棒と比較された余裕のあるもののような）装置における変動性のせいで繰り返すことが時々困難なものであるプロトコルを伴う。近年において、洗浄剤に基づいた溶解は、使用の簡単さ、低い費用、及び効率的なプロトコルのおかげで非常にポピュラーになってきたものである。
【００５３】
ほ乳類の細胞は、原形質の膜、細胞外の環境から細胞の内容物を分離する障壁を形成するものであるタンパク質−脂質の二層、を有する。原形質の膜を含む脂質は、閉じられた二分子のシートを形成することに自発的に関連するものである親水性の及び疎水性の部位を有するものである、両親媒性のものである。膜のタンパク質は、疎水性のコアにまたがる一つの又はより多くのドメインによって適所に保持された、脂質の二層に埋め込まれたものである。加えて、周辺のタンパク質は、一体の膜のタンパク質との又は極性の脂質の頭部基との相互作用を通じて二層の内側の又は外側の表面を結び付ける。脂質及びタンパク質の内容物の本性は、細胞のタイプと共に変動する。明らかに、細胞の崩壊のために選抜された技術は、物理的な又は洗浄剤に基づいたもののいずれであっても、検査されるものである細胞又は組織の起源及びそれらの外側の層を崩壊させる際の固有の簡単さ又は困難さを考慮に入れなければならない。加えて、その方法は、加工されるものである材料の量及び意図された下流の用途と適合性のものでなければならない。
【００５４】
特定の実施形態において、タンパク質の抽出物は、（細胞外のタンパク質、膜のタンパク質、細胞基質のタンパク質、核のタンパク質、ミトコンドリアのタンパク質のような）異なる区画から由来された細胞のタンパク質の予備分画をもまた包含する。他の予備分画の方法は、等電点、電荷、及び分子量のような物理的な性質においてタンパク質を分離する。
【００５５】
特定の実施形態に従って、試料は、適当な薬剤（例．グアニジニウム＝クロリド、尿素、酸（例．０．１％トリフルオロ酸）、塩基（例．５０％ピリジン）、及びイオン性の又は非イオン性の洗浄剤）を使用することで、試薬又はタンパク分解酵素への最適化されたアクセスのためにタンパク質を変性させるように、修飾又は開裂に先立ち予備処理される。
【００５６】
本発明の方法は、このように、自由選択で、試料の予備処理を含むが、それを、上に列挙した試料の調製方法の一つの又はより多くのものを含む予備処理のステップにおいて行うことができる。それに応じて、本発明の方法に適切なデバイスは、自由選択で、試料の調製に適切な一つの又はより多くのデバイス、例．音波処理デバイス、クロマトグラフィーシステム（アフィニティー、ゲル濾過）、限外濾過ユニット、遠心分離機、緩衝剤、酵素、洗浄剤、など…のための送り出しシステムを備えた温度制御された反応バイアルを含む試料の調製ユニットを含む。
【００５７】
当該発明の方法を、比較の分析のための一つの単一の試料へ又は二つの若しくはより多くの試料へ適用することができるが、それによって、これらの試料におけるＣ末端のペプチドには、異なる試料に由来する同じペプチドを弁別することができるものである標識が提供される。二つの又はより多くの試料が、同時に分析される場合には、試料の貯留は、貯留することが個々の試料の差異的な標識付けの後で起こるとの条件で（以下に詳述することにするもののような）方法において異なる時点で起こることができる。
【００５８】
本発明の方法の一つのステップにおいて、それは、当該発明の方法の大部分の実施形態において第一のステップであるが、試料におけるタンパク質のＣ末端並びにＡｓｐ及びＧｌｕの側鎖は、修飾される。
【００５９】
適切なカルボキシル基を修飾する薬剤は、例えば、カルボキシルのエステル（例えば、メタノール又は他のより低級な脂肪族の又は脂環式のアルコール、ジアゾメタン、メチル＝ヨージド、Ｍｅ３ＳｉＣＨＮ２、Ｍｅ２Ｃ（ＯＭｅ）２、ＣＨ３ＯＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ３ＳＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃｌ、ＰｈＣＨ２ＯＣＨ２Ｃｌ、Ｍｅ３ＳｉＣｌ、Ｅｔ３ＳｉＣｌ、及びＭｅ２ＰｈＳｉＣｌ）、アミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、Ｍｅ２ＮＨ、ピロリドン、ピペリジン）、及びヒドラジド誘導体（例えば、フェニルヒドラジド）誘導体の形成に至るものである化合物である。カルボキシルのエステル誘導体の発生は、適切な求核試薬での置き換え（displacement）が後に続けられた良好な脱離基でのカルボキシラートの活性化又はハロゲン化アルキル若しくはスルホナートにおけるカルボキシラートの求核試薬の置き換えを伴うことがある。ある一定の実施形態において、修飾する試薬は、メチル＝ヨージドである。他の実施形態において、カルボキシル基の修飾は、適切な保護する試薬との反応に先立つ（例．１−エチル−３−［３−ジメチルアミノ−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）での）カルボジイミド活性化を伴う。例えば、カルボジイミドで活性化されたカルボキシル基との反応に適切な保護する試薬は、脂肪族のアミン（ＮＨ２−Ｒ）である。一つの実施形態において、脂肪族のアミンは、メチルアミン又はエチルアミンである。
【００６０】
特定の実施形態において、またシステインは、例．アルキル化によって、修飾される、及び／又は、リシンは、例．アセチル化によって、修飾される。リシンの修飾を、トリプシンの特異性を調整するために、又は、さらに詳細に説明されるように、リシンのアミンの基における標識付けを回避するために、することができる。
【００６１】
本発明の方法の別のステップにおいて、それが、一般に、上述した修飾のステップの後に続くステップであるが、試料におけるカルボキシルで修飾されたタンパク質は、開裂剤によって開裂される。
【００６２】
以下に詳述されるように、本発明の方法における試料の最終的な分析は、質量分析（ＭＳ）を使用することで行われる。最適な結果は、長さにおいて約５０個までのアミノ酸のペプチドを使用することでＭＳにおいて得られる。またペプチドの分離のためにも、大部分のクロマトグラフィーシステムは、タンパク質についてのものと比べてペプチドについてより高い分解能を有する。それに応じて、本発明の方法は、開裂ステップを包含するが、それによって大きいタンパク質は、Ｎ末端の、Ｃ末端の、及び内部のペプチドまで低減される。
【００６３】
本発明の方法におけるタンパク質の開裂を、化学的な及び酵素的な方法の両方を使用することで行うことができる。
【００６４】
化学的な開裂の方法は、ＢＮＰＳ−スカトール［２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチルインドール］、ＣＮＢｒ、ギ酸、ヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）、及びヨードソ安息香酸、並びに、ＮＴＣＢ＋Ｎｉ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）のような、しかしそれらに限定されるものではない、開裂剤の使用を包含する。
【００６５】
酵素的な開裂の方法は、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチターゼ、Ａｒｇ−Ｃエンドペプチターゼ、Ｃａｓｐａｓｅ １、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０、キモトリプシン、クロストリペイン、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、グルタミルエンドペプチターゼ、グランザイム Ｂ、ＬｙｓＣリシルエンドペプチターゼ、ペプシン、プロリン−エンドペプチターゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌のペプチターゼＩ、サーモリシン・トロンビン、トリプシンのような、しかしそれらに限定されるものではない、酵素的な開裂剤での消化を包含する。定温放置の時間、酵素／基質の比、ｐＨ、及び緩衝剤のようなパラメーターは、ある一定のプロテアーゼの特異性に影響を及ぼすことができる。
【００６６】
本発明の目的のために、典型的には開裂の方法及び／又は薬剤は、選抜されるが、それらは、特異的なものであると共に高い効能を有する。さらに詳細に説明されるように、本発明の方法は、典型的には、コンピューター内の開裂のデータとの経験的な開裂のデータの比較に頼る。従って、試料の理論的な開裂のパターンが、実験のデータと可能な限り多く調和することは、重要性を有することである。例えば、メチオニンのＣ末端で開裂させるためのＣＮＢｒの使用は、また、トリプトファンのＣ末端での開裂に帰着することができる。芳香族のアミノ酸のＣ末端で優先的に開裂させるものであるキモトリプシンは、また、定温放置の時間及び試料における酵素の濃度に依存するが、他の疎水性のアミノ酸のＣ末端で開裂させることになる。
【００６７】
また、発生させられたペプチドの平均のサイズは、重要性を持つものである。ペプチドがより短ければ短いほど、異なるタンパク質からのペプチドが同じ質量を有すると共に同じ配列さえも有することになると共に精製及び分析の方法における同一の方式で挙動することになるところの機会が、より大きい。それに応じて、試料の本性及び複雑さに依存するが；あまり一般的に起こるものではない開裂のサイトを備えた酵素は、好適なものであることがある。
【００６８】
特定の実施形態に従って、本発明の方法における開裂のステップは、それの高い特異性及び効率の考慮に入れて、トリプシンで行われる。あるいは、Ｌｙｓ及びＡｒｇの両方における開裂が、短過ぎるペプチドに帰着する場合には、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（アルギニンに特異的なもの）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（リシンに特異的なもの）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ（Ａｓｐ／Ｇｌｕに特異的なもの）のような他の酵素を、使用することができる。あるいは、リシンの側鎖は、アルギニン残基（及びホモアルギニンへと修飾されると共にトリプシンについての基質になるものであるシステイン）にトリプシンの開裂を制限するためのアセチル化によって修飾される。
【００６９】
本発明の方法のさらなるステップにおいて、試料の複雑さは、Ｃ末端のペプチドを単離することによって低減される。
【００７０】
上に記載された開裂のステップにおけるペプチドへのタンパク質の開裂は、試料に潜在的に存在するものである高い数のタンパク質は、いっそうはるかにより高い数のペプチドに転換されるという不都合を有するが、それらは、原則として、試料に存在するものであるタンパク質の全て及びそこで起こってしまった潜在的なタンパク質のプロセシングを識別するために分析されることを全て必要とする。この方式において、同じタンパク質の多数のペプチドが、分析される際に、冗長な情報が、得られる。ペプチドの試料の複雑さを低減するための異なる方法を、記載してある。たとえば、システインを含むペプチドのみを、還元された（reduced）システインのチオール基に対して反応性のものであると共に標識付けされたシステインを含むペプチドを単離するためのタグを担持するものである標識付けの試薬を使用することで、単離することができる。しかしながら、いくつかのタンパク質は、他のものが一つと比べてより多いシステインを有する一方で、全くシステインを有するものではない。このように、システインの標識付けは、制限された程度までのみ、情報を失うことなくタンパク質当たり一つのペプチドまで試料の複雑さを低減することができる。
【００７１】
本発明に従って、タンパク質当たり一つのペプチドまでの一つの又はより多くの試料の複雑さの低減は、開裂されたタンパク質の混合物からＣ末端のペプチドを選択することによって、達成される。Ｃ末端のペプチドの選択は、ある一定の利点を有する。Ｎ末端は、Ｃ末端と比べて生体内のタンパク分解性のプロセシングをより被りがちなものであるが、それは、どのＮ末端のペプチドが、開裂させられたタンパク質の試料に存在するものであることになるかを予言することを困難なものとする。加えて、Ｎ末端の多数の異なる修飾は、生体内のものか又はアセチル化、ホルミル化、及びピログルタミン酸への修飾によるもののようなタンパク質の試料の操作の結果としてのものかのいずれかで存在する。Ｎ末端のメチオニンプロセシング（“Ｎ−終端規則”）についての予言の方法にもかかわらず、それは、必ずしも常に、タンパク質の本物のＮ末端のアミノ酸を予言するものではない。さらには、Ｎ末端は、しばしば、（経膜的な輸送配列についてのもののような）シグナル配列を含有するが、それらは、保存されると共にＮ末端のペプチドの配列をＣ末端のものと比べてあまり情報を与えるものではないものとする。また、代替のスプライシングのおかげでタンパク質の配列における差異は、Ｃ末端の部分におけるものと比べてタンパク質のＮ末端の部分でより頻繁に起こる。
【００７２】
それに応じて、本発明の方法は、試料における開裂させられたタンパク質のＣ末端のペプチドを選択するステップを含む。修飾されたタンパク質の開裂の際に、元来のタンパク質のカルボキシル基が、開裂に先立つ修飾ステップにおいて修飾された一方で、そのタンパク質のＮ末端のペプチド及び全ての内部のペプチドは、新しいカルボキシル基を得る。新しく発生させられたカルボキシル基は、カルボキシル基を通じてマトリックスへ直接的にこれらのペプチドを結び付けることによってか又はアフィニティーマトリックスにおけるアフィニティータグが付けられたペプチドの単離によって後に続けられたアフィニティー標識とカルボキシル基を反応させることによってかのいずれかで、混合物からのＮ末端の及び内部のペプチドの取り除きに使用される。Ｃ末端のペプチドを単離するための方法は、例えば、米国特許第６，１５６，５２７号明細書（Ｓｃｈｍｉｄｔ）、米国特許出願公開第２００６／１３４７２４号明細書（Ｆｉｓｃｈｅｒ）、及び米国特許出願公開第２００２／０１０６７００号明細書（Ｆｏｏｔｅ）において記載される。Ｎ末端のペプチド及び内部のペプチドを、修飾されたＣ末端のペプチドとの電荷における差異を活用するものである、イオン交換体においてカルボキシル基を介して可逆的に結び付けることができる。あるいは、Ｎ末端の及び内部のペプチドは、上に本発明のカルボキシル修飾ステップ（第一の方法のステップ）の文脈に記載したもののようなカルボキシルの反応性の基で官能化されたマトリックスへ結び付けられる。本発明の方法におけるＣ末端のペプチドの単離の別の代替の実施形態は、Ｎ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基へのアフィニティータグの共有結合的な又は非供給結合的な結び付きを伴う。適切なアフィニティータグは、ｄ−ビオチン又は構造的に修飾されたビオチンに基づいた試薬、１，２−ジオール類、ジニトロフェニルのようなハプテン、又は、ヘキサヒスチジンのような遷移金属に結び付くものであるリガンド、又はグルタチオンを包含するが、それらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明の方法の特定の実施形態において、試薬のカルボジイミドＥＤＣは、内部の及びＮ末端のペプチドのカルボキシル基と（例えば図３に描かれたもののような）ＮＨ２基を含むビオチン分子を反応させるために使用される。
【００７４】
本発明の方法のさらなるステップにおいて、一つの試料又は二つの若しくはより多くの貯留された試料の単離されたＣ末端のペプチドは、一つの又はより多くのペプチドの分離技術にかけられる。
【００７５】
適切な分離技術は、それは、多重のフラクションへの複雑なペプチドの試料の分離を可能にするが、当業者に知られたものであると共に、等電位のフォーカシング、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、イオン対逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、…などを包含するが、しかし、それらに限定されるものではない。原則として適切なものであるとはいえ、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、２次元のゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーのような技術は、本発明の方法において単離されたものであると、一般に限定された長さのＣ末端のペプチドの分離にあまり適当なものではない。
【００７６】
逆走（ＲＰ）−ＨＰＬＣ及び２次元液体クロマトグラフィーを包含する、液体クロマトグラフィーによってペプチド消化物を分離するための数個の技術を記載してきた。タンパク分解性の消化から得られたペプチド試料について、２Ｄ−ＬＣアプローチは、自動化及びスループットに関してまた顕著な利点を提供するものである、分離に特に適切なものである。また毛細管の電気泳動（ＣＥ）は、ペプチドの分離に適切な方法である。
【００７７】
２Ｄ−ＬＣは、一般に、一連のサイクルで動作させられた、逆相カラムと直結で結合させられたイオン交換カラム（通常では、強い陽イオン交換，ＳＣＸ）を使用する。各々のサイクルにおいて、塩の濃度は、逆相システムへとそれらのイオンの電荷に従ってペプチドを溶出させる為には、イオン交換カラムにおいて増加させられる。ここにおいて、ペプチドは、例．ＣＨ３ＣＮでの勾配によって、疎水性に分離される。
【００７８】
多数のパラメーターは、分解能に、及び、その後に、ＬＣ−ＭＳによって表示することができるものであるタンパク質の数に、影響する。通常では、一次元目の分離技術（ＳＣＸ）と二次元目のＲＰ−ＨＰＬＣ分離のアプローチの間の‘直結の’構成は、試料の分画のためにセットアップされる。イオン交換クロマトグラフィーを、塩の濃度を増加させると共に階段状の溶出によって、又は、塩の勾配によって、行うことができる。典型的には、ＳＣＸは、ＳＣＸクロマトグラフィーの間における疎水性の相互作用を最小にするために、例．３０％までのアセトニトリル、の存在下で行われる。例．Ｃ１８カラムにおける、逆相クロマトグラフィーに先立ち、アセトニトリルのような有機溶媒は、取り除かれるか、又は、例．蒸発によって、強く低減される。
【００７９】
上に詳述したように、本発明の方法を、個々の試料のいずれかで行うことができるか、又は、異なるプロセシングステップによって、より詳しくは、上に記載されたペプチドの分離の方法によって、導入された変動性を回避するための二つの若しくはより多くのタンパク質の試料の同時の分析において使用することができる。異なる試料に由来する同一のペプチドの間で弁別するために、異なる選択肢は、予見される。
【００８０】
本発明の方法の第一の実施形態に従って、当該発明の第一のステップにおける無処置のタンパク質のカルボキシル基の修飾は、検出可能な標識とタンパク質のカルボキシ末端を反応させることによって、差異的な標識付けのステップとして使用される。一度異なる試料のタンパク質の差異的な標識付けが行われると、試料を、貯留することができると共に、さらなるプロセシングが、貯留された試料で起こる。あるいは、試料を、個々に加工すると共に分析に先立ち貯留することができる。しかしながら、二つの又はより多くの開裂させられた差異的な標識付けされたタンパク質の試料の比較のプロテオーム解析において、試料は、理想的には、ペプチド分離技術によって導入された試料の間の変動性を制限するための手順において可能な限り早く貯留される。その次に、同じペプチドの差異的に標識付けされたバージョンは、異なる試料の間の個々のペプチドの濃度を正確に比較するためにＭＳにおいて一緒に分析される。
【００８１】
異なる標識を、同じアミノ酸配列を備えたペプチドを弁別するために使用することができる。しかしながら、分離及びＭＳ分析の後で対応するペプチドの識別を容易にする為に及び複雑なデータベースを発生させる必要があることを回避する為には、差異的に標識付けられたペプチドが、ＭＳにおいて差異的な信号を発生させる一方で、クロマトグラフィーの分離システムにおいて類似して挙動することになるように、化学的な構造において同一なものである標識を使用することは、関心のあることである。
【００８２】
本発明の方法の特定の実施形態において、異なるタンパク質の試料は、同位体の標識で標識付けされる。同位体の標識は、同位体で標識付けされた同一のペプチドが、タンパク質の精製システムにおいて本質的に同一に挙動するが、しかし、ＭＳにおいて差異的に挙動するように、同一の化学的な構造を有する。
【００８３】
適切な同位体の標識付けの薬剤の例は、Ｃｙｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，９９４−９９９及び米国特許第６，８５２，５４４号明細書に記載されたようないわゆるＩＣＡＴ試薬の標識を包含する。現在では、二つの異なる標識付けの試薬は、商業的に入手可能なものであるが、それらは、ＳＨに反応性のものであると共にビオチンアフィニティータグを含有する。米国特許第６，８５２，５４４号明細書は、同位体の標識付けする基に連結された、ＣＯＯＨに反応性の基の組み合わせを開示するが、それらは、ＣＯＯＨ末端において開裂させられてないタンパク質を標識付けすることに適切なものである。ビオチンタグのようなアフィニティータグは、本発明において必要とされるものではない。ペプチドの選択は、Ｎ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基で行われる。
【００８４】
あるいは、タンパク質の試料の差異的な標識付けを、修飾ステップと付随して保証することができる。この実施形態に従って、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、又は３４Ｓのような一つの又はより多くの同位体を含む、上に記載されたようなカルボキシル基の修飾に使用された試薬は、また、同位体の標識付けに適切なものである。例は、メチルアミン及びメチルアミン−（ｄ３）又はエチルアミン及びエチルアミン−（ｄ５）を包含する。
【００８５】
さらなる実施形態に従って、本発明の方法におけるタンパク質の試料の差異的な標識付けは、開裂の際に発生させられたＣ末端のペプチドの新しく発生させられたアミノ末端における標識付けとして行われる。（内部の）リシンにおける同時の標識付けを回避するために、タンパク質を、例．開裂に先立ち無水酢酸のようなアルキル化剤で、修飾することができる。この実施形態に従って、試料の差異的な標識付けは、開裂のステップの後で、及び、自由選択でＣ末端のペプチドの単離の後で、行われる。
【００８６】
Ｎ末端の標識付けに適切なものである標識付けの基は、２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニルアミノ−２−フェニルアセトニトリル［ＢＯＣ−ＯＮ］−（ｄ０）若しくは−（ｄ９）、アセチル＝クロリド−（ｄ０）若しくは−（ｄ３）、ベンゾイル＝クロリド−（ｄ０）若しくは（ｄ５）、又は無水酢酸−（ｄ０）若しくは−（ｄ６）を包含する。
【００８７】
米国特許第６，８５２，５４４号明細書に開示された等しく全てのＮＨ２に反応性のＩＣＡＴ標識付け試薬は、アフィニティー標識と共に、しかし通常では、それ無しに、いずれかであるが、本発明において単離されたＣ末端のペプチドの同位体の標識付けに適切なものである。
【００８８】
Ｃ末端のペプチドのＮ末端の標識付けを、それが、Ｎ末端の及び内部のペプチドのＣ末端に基づいたものである、精製と干渉するものではないので、Ｃ末端のペプチドの単離の前に又は後に行うことができる。しかしながら、標識付けが、単離に先立ち行われるとき、カルボキシル基は、標識付けの試薬に存在するものではないことがある。
【００８９】
本発明の方法は、ペプチドのデータベースのものとペプチドの物理化学的な特性についてのデータを比較することに基づいたものである識別ステップを含む。
【００９０】
それに応じて、本発明の方法の一つの又はより多くの分離ステップで得られた各々のペプチドのフラクションについて、例．クロマトグラフィーの間における、一つの又はより多くの分離ステップにおけるペプチドの挙動に関係する、データは、収集されると共に記憶される。このようなデータは、たとえば、精製が行われたところのｐＨ、ペプチドが逆相カラムから溶出するところの有機溶媒の百分率、ペプチドがイオン交換マトリックスから溶出するところの与えられたｐＨでの塩の濃度、与えられたｐＨでのある一定の樹脂へのペプチドの結び付き（又は結び付き無し）、などを包含する。
【００９１】
加えて又は代わりに、さらなるデータを、本発明の方法においてペプチドの分離及び精製のステップから必ずしも直接的に得られないものである、各々のペプチドについて収集することができる。それに応じて、各々のペプチドについて、単離されたペプチドのフラクションを、精製の間に決定されないものである性質を決定するためのアッセイを行うために記憶することができる。このようなアッセイは、例えば、溶解度の決定、水／有機溶媒のシステムにおける分配係数、特異的なアミノ酸の側基（例．−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２）の検出を包含するが、しかし、それらに限定されるものではない。
【００９２】
本発明のさらなるステップにおいて、上に記載したように単離されてしまったものであるＣ末端のペプチドのフラクションは、質量分析によって分析される。二つの又はより多くの試料が、同時に分析される場合には、ペプチドのフラクションは、差異的に標識付けされるものである、同一のＣ末端のペプチドを潜在的に含有することになる。あるいは、関連性のあるタンパク質が、試料の一つのもの又はより多くのものにおいてタンパク分解性の生体内のプロセシングをうけてしまってある場合には、同じ親のタンパク質に対応するＣ末端のペプチドは、ＭＳにおいて別個に分析されるものである異なるフラクションにおいて溶出することがある。
【００９３】
ＭＳのスペクトルにおける試料に存在するものである親のタンパク質に対応するＣ末端のペプチドの識別は、高分解能の質量分析計の高い質量の確度によって達成される。分光法による質量の測定は、気相への分析物のイオン化によって行われる。イオン化された分子の質量対電荷比（ｍ／ｚ）は、決定されると共に、各々の個々のｍ／ｚの値についてのイオンの数は、計数される。このように、ＭＳスペクトルにおける各々の特徴は、二つの値、ｍ／ｚ及び検出されたイオンの数についての尺度、によって定義される。
【００９４】
本発明の方法のさらなるステップにおいて、Ｃ末端のペプチドの実験的な決定された質量は、データベースにおいてコンピューター内で発生させられたペプチドの質量と比較される。
【００９５】
ペプチドの質量は、それのアミノ酸組成物と相関させられる。しかしながら質量だけに基づいて、ペプチドを積極的に識別することは、必ずしも常に可能なことではない。たとえば、質量だけは、同じアミノ酸組成物をしかし異なる配列（Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５対Ａ５−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４）を有するペプチドの間で弁別することを可能にするものではないことになる。さらには、ある一定の質量は、異なる配列を有するペプチドのセットに対応することができる。例えば、より長い側鎖を備えたアミノ酸を備えた短いペプチドは、より短い側鎖を備えたアミノ酸を有するものであるより長いペプチドと同じ質量を有することができる。
【００９６】
選択が、開裂させられたタンパク質のペプチドについて行われないとき、トリプシンのペプチドの質量は、ある一定の生体のプロテオームのコンピューター内の消化物の質量の全てと相関させられる。
【００９７】
本発明において記載されたようなＣ末端のペプチドの単離を使用することで、タンパク質の試料から得られたペプチドの数は、強く低減される。それに応じて、コンピューター内のトリプシンのペプチドのデータベースは、Ｃ末端のペプチド（いわゆるＣ末端のデータベース）のみを含有することを必要とする。
【００９８】
既存のタンパク質及び配列のデータベースを、いずれの生体のプロテオームにも対応するデータベースを発生させるための基礎として使用することができる。生体の今まで増加するリストについて、完全なゲノム、及びそれから推論されたプロテオームは、知られたものである（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ）。このように、コンピューター内のペプチドのデータベースを、発生させることができるが、それにおいては、タンパク質の開裂及びペプチドの単離は、シミュレーションされる。開裂剤の効率に依存するものであるが、データベースは、ペプチドを含有することができるが、それにおいては、開裂は、不完全なものである。
【００９９】
本発明の事情に適切なＣ末端のデータベースにおいて、各々の項目は、親のタンパク質の名前及び対応するＣ末端のペプチドの質量を包含する。各々の項目について、またアミノ酸組成物は、天然の翻訳後の修飾（例．セリン、スレオニン、及びチロシンにおけるホスホリル化）、試料の処理（例．アスパラギン及びグルタミンのアミド分解）、又は、タンパク質の修飾／標識付け及びＣ末端のペプチドの単離の間に導入された修飾によって引き起こされた質量の差異を計算するために、重要なものである。各々のタンパク分解性の酵素について、修飾されてないＣ末端のペプチドの質量を含む単一の主たるデータベースは、開裂の前に及び後に導入された修飾のタイプに依存するものであるが、質量を再計算するために使用される。加えて、潜在的な翻訳後の修飾は、それが、存在するものであることがあること又は存在しないものであることがあるが、データベースにおいてペプチドの質量を計算することによって、また考慮に入れられる。加えて、標識の使用が、予見される場合には、ペプチドの各々の質量における標識の影響を、組み込むことができる。
【０１００】
にもかかわらず、インフルエンザのタンパク質の小さいセットについて米国特許第６，８４６，６７９号明細書に示されたように、実験的なＣ末端のペプチドの質量は、対応するＣ末端のデータベースにおける異なるペプチドに対応することができる。このように、このようなデータベースは、そのペプチドの質量についてのみＣ末端のペプチドの親のタンパク質を識別するために必ずしも十分に情報を与えるものではない。それに応じて、本発明は、ｍ／ｚの比のだけでなく長さ（アミノ酸の数）、アミノ酸配列、重量、疎水性、等電点、などのような追加的な特性を包含するものに基づいたＣ末端のペプチドの識別を提供する。
【０１０１】
当該発明の特定の実施形態に従って、Ｃ末端のペプチドのデータベースは、特異的な開裂剤のプロテオームに対応すると共に、これは、与えられたスピーシーズについて、試料の起源に対応するものである。このようなペプチドのデータベースは、また、注釈が付けられたスプライスの変異体を包含する。本発明の方法に使用されたコンピューター内のペプチドのデータベースは、アミノ酸における長さ、アミノ酸配列、分子量、疎水性、等電点、などと同様のＣ末端のペプチドの計算された特性を包含する。
【０１０２】
上に示唆したように、生体内の源から来るタンパク質が、しばしば、例．アセチル基、ホルミル基、又はピログルタミン酸残基を通じて、翻訳後に修飾されることは、考慮に入れられる必要があるが、それらの全ては、質量スペクトルにおける決定されたｍ／ｚにおいて影響を有することになる。それに応じて、本発明の一つの実施形態において、合成のＣ末端のペプチドは、コンピューター内の計算されたペプチドの特性を有効にするための参照標準として使用される。
【０１０３】
合成のペプチドのライブラリーからの情報は、質量分析のペプチドのピークの本性の識別を容易にするために使用されるが、それによって自由選択で新規の配列決定を未然に防ぐものである。識別は、コンピューター内のペプチドのライブラリーに記憶された利用可能な情報と比較されたＨＰＬＣの保持時間、等電点、及び質量の特異的なｍ／ｚの値と同様に測定された特性に基づいたものであることになる。
【０１０４】
Ｃ末端のペプチドのｍ／ｚのデータとの組み合わせで親のタンパク質の積極的な識別を可能にするものである、異なるタイプの物理化学的なデータは、考慮される。
【０１０５】
予見されたデータの一つのタイプは、等電点、異なるｐＨの値における正味の電荷、ＲＰ ＨＰＬＣにおける保持時間、２１４及び２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収、与えられたｐＨ及び塩の濃度、疎水性、並びに親水性でイオン交換カラムから溶出する傾向のような、配列の情報から予言されるものである及び／又はペプチド精製ステップ及びＭＳの間に測定することができるものであるデータである。
【０１０６】
疎水性を、例えば、Ｂｕｌｌ ａｎｄ Ｂｒｅｅｓｅ（１９７４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６１，６６５−６７０のアルゴリズムによって計算することができる。等電点を、例えば、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌについて計算することができる。逆相カラムにおける保持時間は、例えば、Ｋｒｏｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３，９０８−９１９の方法に従って予言される。
【０１０７】
上に示唆したように、本発明の事情において使用されたデータベースは、加えて又は代わりに、溶解度、水／有機溶媒の二相の系にわたる分配、タンパク質に反応性の基（ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ）の検出のためのアッセイ［イオン化ポテンシャル、双極子モーメント、水素結合する能力、及び気相におけるイオンの移動度］についてのデータのような、しかし、それらに限定されるものではない、追加的な実験で得られた及びペプチドの精製から必ずしも直接的に誘導されたものではないデータを含む。
【０１０８】
それに応じて、注釈が付けられたＣ末端のデータベースとの比較に基づいた識別を提供するものである本発明の方法は、増加させられた確度を備えた対応する親のタンパク質の識別を可能にする。
【０１０９】
自由選択で、本発明の事情において使用されたＣ末端のペプチドのデータベースは、親のタンパク質を識別することをさらに助けるものである、親のタンパク質の表現のパターンについての情報などをさらに含む。親のタンパク質が、それらの末端のペプチドからのものを除いてアミノ酸配列において異なる場合には、注釈が付けられたＣ末端のペプチドのデータベースにおける対応する項目は、同一の質量及び同一の物理化学的な性質を備えたＣ末端のペプチドを示唆することになる。にもかかわらず、生体の発達の間における親のタンパク質の可能性のある差異的な表現又は組織の特異的な表現における詳細を伴ったものの項目のさらなる注釈付けは、単離されたＣ末端のペプチドへの正しい親のタンパク質の帰属を可能にすることができる。実に、タンパク質の試料の源に依存することで、異なる可能性のある親のタンパク質、その表現が試料のものと調和するもの、から選択することは、可能性のあるものであることがある。
【０１１０】
本発明の方法において、各々のペプチドについて、注釈が付けられたＣ末端のペプチドのデータベースと比較された質量は、計算される。それに応じて、単離されたペプチドの測定された質量に対応するものである計算された質量を有するものであるそれらの項目は、選択される。ＭＳ装置及び試料のタイプに依存するものであるが、モノアイソトピック質量との又は平均の質量との比較は、行われる。
【０１１１】
モノアイソトピック質量が、使用されるとき、典型的には０．１質量単位の測定の誤差は、データベースから項目を選択するために包含される。平均の質量が、使用されるとき、典型的には１Ｄａの測定の誤差は、データベースから項目を選択するために包含される。測定された質量が、データベースにおけるただ一つの項目と対応するとき、親のタンパク質は、直ちに識別される。
【０１１２】
測定された質量が、データベースにおいて一つと比べてより多い項目に対応するとき、全てのこれらの項目は、部分集合として選択される。さらなる識別は、データベースにおける項目の部分集合についてのものとの単離されたペプチドの物理化学的なパラメーターの比較に基づいて行われる。典型的には、ペプチドの精製ステップから直接的に誘導することができるものであるそれらの物理化学的なパラメーターは、最初に考慮される。特定の実施形態に従って、少なくとも三つの物理化学的な特性は、考慮されると共に識別は、“最良適合”分析に基づいて行われる。一つの追加的なパラメーターが考慮されるとき、たいてい選抜されるものであるパラメーターは、同じ質量を備えたＣ末端のペプチドのデータベースにおけるペプチドのセット内のそのパラメーターのパワーを弁別することに依存する。例えば、Ｃ末端のペプチドのデータベースにおけるペプチドが、異なる量の芳香族のアミノ酸を有するとすれば、２１４及び２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を、選択の判定基準として使用することができる。別の例において、同じｍ／ｚの比を備えたデータベースにおける３個のペプチドのセットにおいて、これらの全てが、同じ正味の電荷を有するが、しかし、電荷の分布が、異なるものである（例．一つのペプチドが、帯電したアミノ酸を有するものではないが、別のものが、一つのＡｒｇ及び一つのＡｓｐを有すると共に別のものが二つのＡｒｇ及び二つのＡｓｐを有する）とすれば、イオン交換における挙動を、データベースの部分集合における一つの具体的なペプチドと単離されたペプチドを相関させるための判定基準として使用することができる。
【０１１３】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を実行することに適切なデバイス及び機器を提供する。
【０１１４】
ＭＳ分析に先立ち、本発明の方法は、多くのタンパク質のプロセシングのステップ（タンパク質の修飾、タンパク質の開裂）並びに単離及び精製のステップ（Ｃ末端のペプチドの単離、単離されたペプチドの分離）を含む。それに応じて、本発明の方法を実行することに適切なデバイスは、試薬（修飾剤、開裂剤）の対応する源並びに分離及び単離ユニット（典型的には、クロマトグラフィーユニット）を備えた、適当な反応チャンバーを含む。個々のＣ末端のペプチドの適当な分離が、しばしば、配列の分離技術を要求すると、本発明の方法を行うことに適切なデバイスは、自由選択で、毛細管電気泳動（ＣＥ）の機器、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣの機器、及び／又は、２次元の液体クロマトグラフィー機器、…などのような、しかし、それらに限定されるものではない、電気泳動の機器、クロマトグラフィーの機器のような、二つの又はより多くの適切な分離機器を含有する又はそれらに接続される。
【０１１５】
本発明の方法の本質的な特徴は、単離されたＣ末端のペプチドの質量の決定である。それに応じて、本発明の方法を行うためのデバイスは、質量分析の機器を含む。典型的な質量分析の機器は、３つの構成部品、関心のある分子を気化させる為のイオン源、イオン化された分子の質量対電荷の比（ｍ／ｚ）の尺度を決定するものである、質量分析器、及び、各々の個々のｍ／ｚの値についてイオンの数を登録すると共に計数するものであるセンサーからなる。ＭＳスペクトルにおける各々の特徴は、機器の検出器に到達したものである、二つの値、ｍ／ｚ及びイオンの数についての尺度、によって定義される。
【０１１６】
分光計における質量分析のためのタンパク質又はペプチドのイオン化は、通常では、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又はマトリックスで補助されたレーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）によって行われる。ＥＳＩプロセスの間に、分析物は、溶液の外で直接的にイオン化されると共に、従って、ＥＳＩは、しばしば直接的に、液体クロマトグラフィーの分離ツール（例．逆相ＨＰＬＣ）へ結合させられる。ＭＡＬＤＩは、プロセスをより有効なものとするために桂皮酸と同様の、レーザーエネルギーを吸収するものである小さい有機分子と混合させられた乾燥した試料を、レーザーパルスを介して、気化させる。
【０１１７】
質量分析器は、質量分析計の鍵となる構成部品である；重要なパラメーターは、感度、分解能、及び質量の確度である。あるものは、プロテオミクスにおいて現行で使用された五つの基本的なタイプの質量分析計である。これらは、イオントラップ、タイムオブフライト（ＴＯＦ）、四重極子、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、及び、フーリエ変換イオンサイクロトロン（ＦＴＩＲ−ＭＳ）分析器を包含する。タンデムＭＳ又はＭＳ／ＭＳを、（例．ＬＴＱ−ＦＴＩＣＲ、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｑ−ＴＯＦ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、トリプル四重極型の及びハイブリッドトリプルの四重極子／線形のイオントラップ（ＱＴＲＡＰ）のような全てのハイブリッド機器で）時間内に（イオントラップ）及び適所で行うことができる。
【０１１８】
当該発明の特定の実施形態は、少なくとも二つの試料の源（１０１）、対応する修飾剤／標識源（１０３）を備えた、修飾／標識付けユニット（１０２）、開裂ユニット（１０４）、Ｃ末端のペプチドの単離ユニット（１０５）、ペプチド分離ユニット（１０６）、質量分析計ユニット（１０８）、並びに、読み出しユニット（１１０）に接続された、制御回路及びデータ分析ユニット（１０９）、を含む、Ｃ末端のペプチドのタンパク質の試料を単離すると共に分析するためのデバイス（１００）に関係する。デバイスを、開裂させるステップに先立ち（貯留された試料は、開裂ユニットに入る）又は開裂させるステップの後で（試料は、個々に開裂ユニットを通過する）試料の貯留を保証するように構成することができる。特定の実施形態において、分離ユニット（１０６）は、二つの連続的に連結された分離システム（１１０６）及び（２１０６）を含むが、それにおいては、第一の分離システム（１１０６）は、例．陽イオン交換クロマトグラフィーシステム及び分離システムであると共に、第二の分離システム（２１０６）は、典型的には、ＨＰＬＣ逆相システムである。質量分析計の素子（１０８）は、ペプチドの同位体の形態を分離するものである、ユニットからなる。
【０１１９】
当該発明のデバイスの特定の実施形態は、分析ユニット（１０７）をさらに含むが、それにおいては、精製されたペプチドの一つの又はより多くの物理化学的な性質は、決定される及び／又は登録される。ペプチドの実験的な質量並びに精製の間に得られた及び分析ユニットにおいて自由選択で得られたそれの物理化学的な性質におけるデータは、（図４において点線によって示唆された）Ｃ末端のペプチドの注釈が付けられたデータベース（１１１）と比較される。
【実施例１】
【０１２０】
例
例１：Ｃ末端のペプチドの単離
Ｃ末端のペプチドの単離のフリーチャートは、図１に概略が描かれる。
【０１２１】
タンパク質の抽出物は、標準的な方法を使用することで組織から単離される。システインの側鎖は、アルキル化されると共に、Ｎ末端におけるアミン及びリシンの側鎖は、アセチル化される。次のステップにおいて、（グルタミン酸及びアスパラギン酸における反応性のカルボキシル基のみならず）Ｃ末端のアミノ酸の遊離のカルボキシル基は、Ｇｒａｂａｒｅｋ＆Ｇｅｒｇｅｌｙ（１９９０）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５，１３１−１３５に記載されたような方法に従った１−エチル−３−［３−ジメチルアミノ−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）によって活性化される。
【０１２２】
ＥＤＣは、アミンに反応性のＯ−アシルイソウレアの中間体を形成するものである、タンパク質（図２における分子１）におけるカルボキシル基と反応する。この中間体は、安定なアミン結合によって結ばれた二つの分子の共役体を生ずるものである、ＮＨ−Ｒ（図２における分子２）におけるアミンと反応することがある。しかしながら、中間体は、また、それを水性の溶液において不安定なもの及び短寿命のものとするものである、加水分解を受けやすいものである。スルホ−ＮＨＳ（５ｍＭ）の追加は、それをアミンに反応性のスルホ−ＮＨＳエステルへと転換することによってアミンに反応性の中間体を安定化させるが、このようにＥＤＣに媒介されたカップリング反応の効率を増加させるものである。アミンに反応性のスルホ−ＮＨＳエステルの中間体は、二つのステップの架橋する手順を許容するために十分な安定性を有するが、それは、一つのタンパク質におけるカルボキシル基が変えられてないままであることを可能にする。ＥＤＣで活性化されたＣＯＯＨ基は、アミノ基を含有する分子，ＮＨ２−Ｒにカップリングさせられる。ＮＨ２−Ｒは、分子であることができるが、それは、この点順の間に正の電荷を簡単に引き寄せることによってＣ末端のペプチドのイオン化のプロセスを改善する。他方においては、反応性の分子は、いずれのさらなるカルボキシル基をも含有するものであってはならない。本例においては、ＮＨ２−Ｒは、同位体で標識付けすることができるものであるエチルアミンである。
【０１２３】
その後、タンパク質の試料は、ペプチドの混合物を発生させるためにトリプシンで酵素的に消化される。
【０１２４】
Ｃ末端のペプチドが、上述した反応によって、修飾されたカルボキシル基を有する一方、消化物におけるＮ末端の及び内部のペプチドは、遊離のＣ末端のアミノ酸を含有する。
【０１２５】
内部の及びＮ末端のペプチドの遊離のＣ末端のカルボキシル基は、ビオチンのアフィニティークロマトグラフィーを介して単離される。このステップは、内部の及びＮ末端のペプチドの分離に至ると共に、溶液にＣ末端のペプチドを放置する。反応は、上に記載されたカルボジイミドで媒介された反応によって行われるが、それにおいては、Ｒ−ＮＨ２は、図３に示されたような修飾されたビオチンである。
【０１２６】
ペプチドの消化物のＣ末端のペプチドを除く全てのペプチドは、これらのペプチドの選択的なアフィニティーの欠乏によって溶液から取り除かれる。溶液にあるものである非常にＣ末端のペプチドは、質量分析法の分析が後に続けられた（多）次元の液体クロマトグラフィーによってさらに分取される。
【０１２７】
例２：類似の質量でのペプチドの識別
本例は、追加的なパラメーターを備えたペプチドの質量データを補充することの必要性を示す。Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅにおけるＳｃａｎ Ｐｒｏｓｉｔｅ）におけるモチーフサーチから、可能性のある臨床的な関連性のあるヒトのタンパク質の８個のアミノ酸のＣ末端のトリプシンのペプチド、すなわち、Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ ２の配列ＳＦＰＮＩＧＳＬ［ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１］を、選抜した。
【０１２８】
ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１（８３３．９４）の計算された平均の質量を、理論的な値の１Ｄａにおけるものの内で計算された質量を備えたＰｒｏｆｏｕｎｄ（ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ）のペプチドで識別するために使用した。これを、部分的な開裂の無いことを可能にするものであるヒトのタンパク質のコンピューター内のトリプシンの消化を行うこと及びＣ末端のものであるところの多くのペプチドを選択することによってした（表１を参照のこと）。
【０１２９】
表１：関係付けられた質量を備えたＣ末端のペプチドの質量及び物理化学的なパラメーター
【０１３０】
【表１】
１，３）平均の質量及びｐＩは、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌで計算される
４）芳香族のアミノ酸の数
５）疎水性のアミノ酸の数
６）親水性のアミノ酸の数
７）逆相におけるペプチドの保持時間は、（パラメーターａ＝１０及びＢ＝０．４８を備えた）ｈｔｔｐ：／／ｈｓ２．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｃａ／ＳＳＲＣａｌｃ／ＳＳＲＣａｌｃ．ｈｔｍｌに計算される
典型的には、ペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣの組み合わせによって分離される。塩の濃度が増加させられるところのイオン交換カラムを使用することで、ペプチドは、それらの等電点に従って溶出する。上記のペプチドのｐＩに基づいて、それらは、三つのフラクション（ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：４及びＥＱ ＩＤ．ＮＯ：５）として溶出することになるが、それにおいては、緩衝剤のｐＨに最も近いｐＩを備えたペプチドは、最初に溶出することになる。逆相クロマトグラフィーの際に、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２は、それらが、異なる量の親水性の及び疎水性のアミノ酸を有するので、異なる位置で溶出することになる。ＲＰ−ＨＰＬＣにおけるタンパク質の検出に典型的には使用されるものである２８０ｎｍ及び２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づいてＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２からＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：４からＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：３を弁別することは、また非常に簡単なことである。ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２及び３を備えたペプチドは、それらが、２８０ｎｍでＵＶ光をほとんど吸収するものではないことになると、簡単に認識される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開裂されたタンパク質の混合物からのペプチドの選択的な単離を可能にする、質量分析を使用するタンパク質の試料の同時の分析のための方法に関係する。本発明は、さらに、質量分析のデータのペプチド及びデータ分析を精製するための技術に関係する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析（ＭＳ）を使用するタンパク質を識別するための異なる方法は、この数十年間にわたって徐々に発展してきたものである。いわゆるフィンガープリント法において、タンパク質は、単離されると共にペプチドのフラグメントへと開裂させられる。開裂させられたタンパク質のコンピューター内のデータベースと発生させられたペプチドの質量を比較することによって、さらなる配列の決定無しに親のタンパク質を識別することは、可能なことである。
【０００３】
しかしながら、それは、一つの単一の実験において、ショットガン・アプローチを使用することで、試料に存在する異なるタンパク質を研究することを目指す。ペプチドの試料の複雑さを低減することは、しばしば、内部のシステインを含有するペプチドを選択的に単離することによって行われる。システインが、あらゆるタンパク質に現れるものではないので、代案のストラテジーが、発生させられたペプチドの混合物からＮ末端又はＣ末端のペプチドを特異的に単離するために開発されてきたものである。この方式では、あらゆるタンパク質は、一つのペプチドによって表現される。Ｃ末端のペプチドの単離に基づいた方法の例は、例．米国特許第６，１５６，５２７号明細書（Ｓｃｈｍｉｄｔ）（特許文献１）及び米国特許出願公開第２００２／０１０６７００号明細書（Ｆｏｏｔｅ）（特許文献２）に記載される。このアプローチは、同じタンパク質に由来する異なるペプチドを識別することに基づいたものである、古典的なフィンガープリントを可能にするものではない。にもかかわらず、ＭＳ／ＭＳペプチドの配列決定を行う必要があることなく、ペプチド（及びその結果としてそれの親のタンパク質）を積極的に識別することができるものであることは、好都合なものであるであろう。
【０００４】
米国特許第６，８４６，６７９号明細書（Ｓｃｈｍｉｄｔ）（特許文献３）は、Ｃ末端のペプチドを選択すると共にＣ末端のペプチドのデータベースとこれらのペプチドの質量を比較するための方法を開示する。この特許の例は、ペプチドの約４５％のみについての、約１８００個のＣ末端のＬｙｓ−Ｃのペプチドのセットについて、質量は、疑う余地無しに、Ｌｙｓ−Ｃのペプチドのコンピューター内の発生させられたデータベースにおける単一のペプチドと相関させることができることを示す。
【０００５】
米国特許出願公開第２００５／００９２９１０号明細書（特許文献４）は、ＭＳにおけるペプチドの質量が、ペプチドの別の物理化学的な性質のみならず、決定されるところの方法を開示する。この方法は、同じ質量を有するペプチド間で弁別することを可能にする。しかしながら、完全な試料が分析されるという事実を考慮に入れて、このようなペプチドを単一の親のタンパク質に帰することができないように、同じ質量及び同じ物理化学的な性質の両方を有するものである莫大な数の異なるペプチドは、なおも発生させられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，１５６，５２７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／０１０６７００号明細書
【特許文献３】米国特許第６，８４６，６７９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／００９２９１０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それに応じて、残るものは、複合体のタンパク質の試料を、ＭＳ／ＭＳにおいて発生させられたペプチドの配列決定の必要性無しにＭＳによって分析することができる、高いスループットの方法についてのさらなる要望である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、タンパク質の開裂並びにそれらからのＣ末端のペプチドの単離及び分析に基づいた、複合体のタンパク質の混合物に存在するタンパク質を包含するものである、タンパク質を分析するための方法に関係する。本発明の方法において、単離されたＣ末端のペプチドは、一つの又はより多くのペプチドの精製ステップに及びＭＳ分析にかけられる。精製の間に又は後に、それの質量以外の精製されたペプチドの物理化学的な性質は、収集される。精製されたＣ末端のペプチドの質量は、ＭＳによって決定される。ペプチドは、Ｃ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの物理化学的な特性の両方を組み合わせるものであるデータベースとの比較に基づいて識別される。特定の実施形態において、２、３、４、５、又は１０までの追加的な物理化学的な特性は、データベースに注釈を付けるために使用される。本発明の方法は、ＭＳ／ＭＳにおける新規の配列の決定についての必要性無しに高い確度で、Ｃ末端のペプチド（及び、それに応じて、それらの対応する親のタンパク質）の積極的な識別を可能にする。
【０００９】
Ｃ末端のペプチドが選択されるところの手順の利点は、各々のタンパク質が、分析されるものである試料の複雑さにおける強い低減に至るものである、タンパク分解性の開裂の後における単一のペプチドのみ、及び、これらのペプチドの情報を含有する対応するデータベース、によって表現されるというものである。
【００１０】
提示された手順の別の利点は、全てのタンパク質のＣ末端のペプチドが、（人間、マウス及びラットのような、しかし、ショウジョウバエ、線虫及び酵母のような、より低級な生体もまた）それらのゲノムが配列決定されてしまってあるところの生体について知られたものであるというものである。これらのペプチドの正確な分子量を、予言することができるが、それは、測定された質量に特異的な信号の根底にあるペプチドの識別を支持することが期待される。これは、＞５００，０００の程度の分解能及び＜１ｐｐｍの質量の確度を達成することができるものである、ＦＴ−ＩＲと同様の現行で利用可能な高性能の質量分析の技術について特に真実である。
【００１１】
加えて、期待されたＣ末端のペプチドの本性が、ゲノムの配列のコンピューター内の分析から知られると、合成のタンパク質のライブラリーが、発生させられると共に、調製のプロセスの間における各々のペプチドの正確な特性（例．異なるクロマトグラフィーの材料における保持時間、ＥＳＩ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおける挙動）を、決定すると共に複合体のタンパク質の混合物から識別されたペプチドと比較することができる。これは、正しいタンパク質の識別における信頼性を顕著に改善する。
【００１２】
さらに本発明の利点は、Ｃ末端のペプチドが、（プロテオミクスにおける一般的な修飾であると共に質量分析によってタンパク質の下流の分析を乱すものではないところのアルキル化及びアセチル化は別として）当該発明の方法に修飾されない状態にとどまるというものである。従って、気体の相へとペプチドを蒸発させるためのイオン化するプロセスとの干渉は、ありそうもないことである。
【００１３】
与えられた方法の別の利点は、既存のスプライスバリアントの少なくとも一部分、すなわち、タンパク質のＮ末端の側で起こるものを、本発明のアプローチによって扱うことができるというものであるが、それにおいては、あまり可変なものではないＣ末端は、単離されると共に識別される。
【００１４】
当該発明の特定の及び好適な態様は、付随する独立の及び従属の請求項において設定される。従属の請求項の特徴は、適当なものとして及び請求項に明示的に設定されたものとしてだけでなく独立の請求項のいずれの特徴とも及び他の従属の請求項の特徴と組み合わせられることがある。
【００１５】
本発明の第一の態様は、タンパク質の試料におけるタンパク質を識別するための方法を提供する。これらの方法は、典型的には、
ａ）タンパク質の試料におけるタンパク質のカルボキシル基を修飾すること、
ｂ）開裂剤でペプチドへとタンパク質の試料におけるタンパク質を開裂させること、
ｃ）開裂させられたペプチドから、Ｃ末端のペプチドを単離すること、それによってＮ末端の及び内部のペプチドを取り除くこと、
ｄ）精製されたＣ末端のペプチドを得るように、一つの又はより多くのペプチド精製ステップに単離されたＣ末端のペプチドをかけること、
ｅ）精製されたＣ末端のペプチドの、質量以外の、少なくとも一つの物理化学的な性質を決定すること又は計算すること、
ｆ）ＭＳにおけるＣ末端のペプチドの質量を決定すること、
ｇ）精製されたＣ末端のペプチドの親のタンパク質を識別するように、開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの物理化学的な性質を含むデータベースと精製されたＣ末端のペプチドの質量及び少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること、
：のステップを含む。
【００１６】
当該発明の方法の一つの実施形態に従って、ステップ（ｇ）は、精製されたＣ末端のペプチドの各々について、精製されたＣ末端のペプチドに対応する質量を備えたデータベースにおける一つの又はより多くのＣ末端のペプチドを識別すること、及び、一つと比べてより多いペプチドが、一つの精製されたＣ末端のペプチドに対応するものとしてデータベースにおいて識別されるとき、データベースにおける対応するＣ末端のペプチドを積極的に識別するように、データベースにおいて識別された一つと比べてより多いペプチドのものと、精製されたＣ末端のペプチドの少なくとも一つの他の物理化学的なパラメーターを比較すること、を含む。
【００１７】
当該発明のこの態様の方法の一つの実施形態に従って、タンパク質の試料は、スピーシーズからものであると共に、データベースは、開裂剤によって発生させられたそのスピーシーズの全てのＣ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの他の物理化学的な性質を含む。
【００１８】
本発明の方法の特定の実施形態は、それによってタンパク質が、二つの又はより多くの試料において同時に識別されるところの方法を包含すると共に、その方法は、それに応じて、後に続く追加的な特徴：
− 試料の各々について異なる、差異的な標識付けの試薬のセットの一つで、ステップ（ａ）における修飾を行うこと、
− ステップ（ｄ）に先立ち、二つの又はより多くの試料を貯留することの追加的なステップ、
− ステップ（ｇ）に先立ち、試料を識別するように、単離されたペプチドの標識の本性を識別すること、その試料にペプチドが由来すること、及び、
− ステップ（ｇ）において、Ｃ末端のペプチドを識別するように、開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及びそれらの少なくとも一つの他の物理化学的な性質を含むデータベースと精製されたＣ末端のペプチドの質量及び少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること
を含む。
【００１９】
当該発明の方法の特定の実施形態に従って、少なくとも一つの物理化学的な性質は、一つの又はより多くのペプチド精製ステップの間に決定される。
【００２０】
当該発明の方法の特定の実施形態に従って、少なくとも一つの物理化学的な性質は、ｐＩ、逆相クロマトグラフィーの間における保持時間、並びに、２８０及び２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収の比の群より選択される。
【００２１】
当該発明の方法の特定の実施形態において、ステップ（ａ）における修飾は、第一級アミンとのカルボジイミド反応を使用することで行われる。
【００２２】
ステップ（ｃ）におけるＣ末端のペプチドの単離は、第一級アミン基を担持する修飾されたビオチンとのカルボジイミドで媒介された反応を介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させることのステップを含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、
ａ）第一級アミンとカルボジイミドを介して試料における（無処置の）タンパク質のカルボキシル基を反応させること、
ｂ）ペプチドへと開裂剤で（無処置の）タンパク質を開裂させること、
ｃ）第一級アミンの基を担持するアフィニティータグとカルボジイミドを介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させること、
ｄ）アフィニティーマトリックスへタグが付けられたペプチドを結び付けること、及び、結び付けられてないペプチド（結び付けられてないペプチドはタグが付けられてないペプチドである）を収集すること、それによって（ｂ）の下で得られたペプチドから、Ｎ末端の及び内部のペプチドからのＣ末端のペプチドを単離すること
：のステップを含むタンパク質の試料からＣ末端のペプチドを単離するための方法を提供する。
【００２４】
当該発明のこの態様の方法の特定の実施形態に従って、アフィニティータグは、ビオチンである。
【００２５】
本発明のなお別の態様は、開裂剤によってコンピューター内で開裂された生体のタンパク質のＣ末端のペプチドのデータベースに関係するが、それにおいて各々のペプチドは、タンパク質の識別子、アミノ酸組成、質量及び一つの又はより多くの他の物理化学的な性質によって特徴付けられる。
【００２６】
特定の実施形態において、データベースにおけるＣ末端のペプチドの一つの又はより多くの他の物理化学的な性質は、逆相クロマトグラフィーにおける計算された保持時間、与えられたｐＨにおける正味の電荷、及び、Ｃ末端のペプチドの等電点からなる群より選択される。
【００２７】
特定の実施形態において、データベースは、コンピューター内で開裂させられたヒトの生体のタンパク質のデータベースである。
【００２８】
さらなる特定の実施形態において、データベースは、トリプシンであるところの開裂剤でのタンパク質の開裂することに基づいたものである。
【００２９】
特定の実施形態において、データベースにおけるペプチドは、それによって一つの開裂位置がはずされるところの開裂剤での不完全な開裂から結果として生じるＣ末端のペプチドを包含する。
【００３０】
本発明のなおさらなる態様は、タンパク質の識別についての上に記載された方法におけるデータベースの使用に関係する。
【００３１】
本発明のなおさらなる態様は、それらのＣ末端のペプチドに基づいた一つの又はより多くの試料におけるタンパク質を識別するためのデバイス（１００）を提供するが、そのデバイスは、それが、少なくとも一つの試料源（１０１）、少なくとも一つの対応する修飾する薬剤／標識源（１０３）を備えた、修飾／標識付けのユニット（１０２）、開裂ユニット（１０４）、Ｃ末端のペプチド単離ユニット（１０５）、精製されたペプチドの一つの又はより多くの物理化学的な性質を決定する及び／又は登録するための分析ユニット（１０７）を備えたペプチド分離ユニット（１０６）、質量分析計ユニット（１０８）、読み出しユニット（１１０）へ接続された制御回路部品及びデータ分析ユニット（１０９）を含むという点で特徴付けられるものである。より具体的に、本発明のデバイスは、Ｃ末端のペプチドの物理化学的な性質で注釈が付けられた開裂剤を使用することでコンピューター内において開裂させられたタンパク質の全てのＣ末端のペプチドの質量を含むデータベース（１１１）への接続を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、具体的に実施形態に従って、Ｃ末端のペプチドの単離のための方法、１：タンパク質の変性；２：タンパク質のアルキル化；３：タンパク質のアセチル化；４：カルボキシル基のＥＤＣ活性化；５：第一級アミンとのＥＤＣで活性化されたカルボキシル基の反応；６：Ｎ末端のもの（ａ）、内部のもの（ｂ）、及びＣ末端のペプチド（ｃ）へのタンパク質の開裂；７：精製ユニットへのＮ末端の及び内部のペプチドの遊離のカルボキシル基のライゲーション；８：溶液（ｃ）に残されるものである、Ｃ末端のペプチドのアフィニティー分離、を示す。
【図２】図２は、本発明の具体的な実施形態に従って、分子１におけるカルボキシル基と分子２における第一級アミンの基との間におけるカルボジイミドで媒介された反応を示す。
【図３】図３は、本発明の特定の実施形態に従って、カルボキシル基とのカルボジイミドで媒介された反応に適切な第一級アミンの基で修飾されたビオチンの構造を示す。
【図４】図４は、本発明の特定の実施形態に従って、二つの試料源（１０１）、対応する修飾する薬剤／標識源（１０３）を備えた、修飾／標識付けのユニット（１０２）、開裂ユニット（１０４）、Ｃ末端のペプチド単離ユニット（１０５）、ペプチド分離ユニット（１０６）、質量分析計ユニット（１０８）、並びに、読み出しユニット（１１０）へ接続された制御回路部品及びデータ分析ユニット（１０９）を含む２個のタンパク質の試料のＣ末端のペプチドを単離する及び分析するためのデバイス（１００）を示す。分離ユニット（１０６）は、二つの連続的にリンクされた分離システム（１１０６）及び（２１０６）を含む。質量分析計素子（１０８）は、ペプチドの同位体の形態を分離するものであるユニットを含む。ユニット１０７は、（１０６）において精製されたペプチドの物理化学的な性質を決定する及び／又は登録するための分析ユニットである。ユニット１１１は、Ｃ末端のペプチドの注釈が付けられたデータベースである。（点線は、実験的な及びコンピューター内のデータの獲得を示唆する）。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の上記の及び他の特性、特徴、及び利点は、一例として、当該発明の原理を図示するものである、付随する図面と併せて考慮された、後に続く詳細な説明から明らかなものになることになる。この記載は、当該発明の範囲を限定することなく、例のみの目的で与えられる。以下に引用された参照図は、添付された図面を指す。
【００３４】
異なる図において、同じ符号は、同じ又は類似の要素を指す。
【００３５】
本発明を、特定の実施形態に関して、及び、ある一定の図面を参照して、記載することにするが、しかし、当該発明は、それらに限定されるものではなく、請求項によってのみ限定される。請求項におけるいずれの符号も、その範囲を限定するものとして解釈されないものとする。記載された図面は、単に概略的なものであると共に限定しないものである。図面において、要素のいくつかのサイズは、誇張されると共に図示の目的のために一定の縮尺で描かれないことがある。用語“を含む”が、本記述及び請求項において使用される場合には、それは、他の要素又はステップを排除するものではない。単数の名詞を指すとき不定冠詞又は定冠詞、例．“ある”又は“その”が使用される場合には、これは、他に何かが具体的に述べられない限り、複数のその名詞を包含する。
【００３６】
さらには、記述における及び請求項における用語、第一の、第二の、第三の、及び同様のものが、類似の要素の間で区別するために、及び、必ずしも順次の又は経時的な順序を記述するためにではなく、使用される。そのように使用された用語が、適当な状況の下で交換可能なものであること、及び、ここに記載された発明の実施形態が、ここに記載された又は図示されたもの以外のシーケンスにおいて動作の可能なものであることは、理解されることである。
【００３７】
後に続く用語又は定義は、単に当該発明の理解において援助するために提供される。指定されない限り、これらの定義は、当業者によって理解されたものと比べてより少ない範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００３８】
ここに使用されたような、用語“ペプチド”又は“タンパク質”は、ペプチド結合を介して接続された複数の天然の又は修飾されたアミノ酸を指す。ポリペプチドの長さは、２個から数千個のアミノ酸まで変動することができる（このように用語は、また、一般的にオリゴペプチドと称されるものをも包含する）。この範囲内に含まれるものは、
グリコシル化、ホスホリル化、など、のような生体内の翻訳後の修飾によって修飾されるものである一つの又はより多くのアミノ酸を含む、及び／又は、タンパク質を修飾する薬剤（例．アルキル化する薬剤）で試験管内において修飾されてしまってあるものである一つの又はより多くのアミノ酸を含む、ポリペプチドである。
【００３９】
ここに使用されたような用語“ポリペプチドのフラグメント”又は“ペプチド”は、タンパク質又はポリペプチドの酵素的な開裂の後で得られたアミノ酸配列を指すために使用される。ポリペプチドのフラグメント又はペプチドは、サイズ又は本性において限定されるものではない。
【００４０】
用語“内部の”、“Ｎ末端の”、及び“Ｃ末端の”は、ペプチドを指すとき、タンパク質又はポリペプチドにおけるペプチドの対応する場所を指すために、ここにおいて使用される。例えば、タンパク質ＮＨ２−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２−Ｒ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ４−ＣＯＯＨ（それにおいてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）無しの平凡な長さのペプチドの配列である）のトリプシンの開裂において、Ｎ末端のペプチドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｋ−ＣＯＯＨである、内部のペプチドは、ＮＨ２−Ｘ２−Ｒ−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−Ｘ３−Ｋ−ＣＯＯＨである、と共に、Ｃ末端のペプチドは、ＮＨ２−Ｘ４−ＣＯＯＨである。
【００４１】
用語“親のタンパク質”は、開裂されたペプチドが誘導されるところの開裂されてないタンパク質を指す。
【００４２】
ここにおいて使用されるような用語“タンパク質の開裂”は、ポリペプチドにおける二つのアミノ酸の間に結合させられたペプチドの加水分解を指す。生理学的なプロセスの事情において、タンパク質の開裂は、“酵素的な加水分解”、“タンパク分解性のプロセシング”、及び“タンパク質の成熟”ともまた称される。それに応じて、用語“開裂剤”は、ポリペプチド又はペプチドにおける二つのアミノ酸の間におけるペプチド結合を加水分解することが可能な化合物を指す。
【００４３】
ここにおいて使用されたような用語“フラグメンテーション”は、一つの又はより多くの化学的な結合の切断及び例．タンデム質量分析（ＭＳ）又はＭＳ／ＭＳ分析における衝突で誘発させられた解離（ＣＩＤ）によって、得られたような分子の一つの又はより多くの部分のその後の解放を指す。ある一定の実施形態において、結合は、ペプチド結合であるが、しかし、それは、それに限定されるものではない。
【００４４】
本発明における用語“質量”は、質量対電荷の比（ｍ／ｚ）を指す。略語ｍ／ｚは、イオンの質量数をそれの電荷の数によって形成された無次元の量を表記するために使用される。“モノアイソトピック質量”は、最も豊富な同位体のみを含有するイオンの質量を指す。“平均の質量”は、各々の元素についての原子量を使用することで計算された与えられた経験的な式の粒子又は分子の質量を指す。
【００４５】
ここにおいて使用されたような用語“標識”は、化合物又は分子を指すが、それを、ペプチド又はポリペプチドへ共有結合的に連結させる又はそれの中に組み込むことができると共に、それは、それえの特定の性質に基づいて、質量分析のような、光学的な又は他の手段によって検出可能なものである。標識を、ペプチド又はポリペプチドへ共有結合的に結び付けることができる場合には、これは、標識付けの試薬に存在するものである、タンパク質／ペプチドの反応性の基によって保証される。用語標識が、当技術において一般に使用される一方で、（例．タンパク質又はペプチドへ結び付けられたもののような）このようなもののような標識と、官能基へ結び付くことが可能な、標識付けの試薬（ペプチド又はタンパク質との結び付きに先立つ標識を含む分子）との間に差別を作ることができる。本発明は、蛍光性の又は同位体の標識のような、異なるタイプの標識の使用を予見する。
【００４６】
ここにおいて使用されたような用語“同位体の標識”は、同じ化学式を有するが、しかし、ＭＳでの質量における差異に帰着する、一つの又はより多くの原子の存在する同位体の数及び／又はタイプにおいて相互に異なる、標識のセットを指す。このように、異なる同位体の標識で標識付けされた同一のペプチドを、質量における差異に基づいてＭＳにおいてこのようなものとして差別化することができる。
【００４７】
ここにおいて使用されたような用語“タンパク質／ペプチドの反応性の基”（ＰＲＧ）は、アミノ酸へのこのような化合物の（非共有結合的な又は共有結合的な）結び付きに帰着するタンパク質又はペプチドのアミノ酸における官能基と反応することが可能なものである化合物における化学的な機能を指す。
【００４８】
ここにおいて使用されたような用語“官能基”は、化合物へ結び付く（一般には、共有結合的に結び付く）ために使用することができるものであるアミノ酸における化学的な機能を指す。官能基は、アミノ酸の側鎖に又はポリペプチド若しくはペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に存在するものであることができる。その用語は、ペプチド又はポリペプチドに天然に存在するものであるところの官能基及び例．タンパク質を修飾する薬剤を使用する化学的な反応を介して導入されたものの両方を包括する。
【００４９】
本発明は、対応するＣ末端のペプチドの質量の決定に、及び必要なものであるとすれば、このＣ末端のペプチドの他の物理化学的なパラメーターに、基づいて親のタンパク質を識別することの方法を記載する。
【００５０】
本発明の方法及びツールは、同時の分析が関心のあるものであるところの試料のセットの分析において特に関心のあるものである。試料のこのようなセットは、異なる時点で取得された患者からの試料、疾患の異なる臨床的なバージョンの試料、異なる患者の試料、などであることができるが、しかし、それらに限定されるものではない。本発明は、このように、疾患の進行のマーカーを識別するための、差異的な診断のための、及びその上、生化学的な又は生理学的なアッセイにおける多重分析のための、方法及びツールを提供する。
【００５１】
本発明の方法及びツールは、タンパク質の試料の分析に関係する。ここにおいて使用されたような用語‘試料’は、必然的に、当該発明の方法の行うことに先立ついずれの加工するステップをも包含する又は排除することが意図されたものではない。試料は、粗い加工されてない試料、抽出されたタンパク質のフラクション、精製されたタンパク質のフラクション、などであることができる。一つの実施形態に従って、タンパク質の試料は、豊富なタンパク質の免疫抑制によって予備処理される。
【００５２】
本発明の方法での分析に適切なものであるタンパク質の試料は、ウイルス性の、原核生物の、細菌性の、真核生物の、カビの、酵母の、植物性の、無脊椎動物の、脊椎動物の、ほ乳類の、及びヒトの起源の試料を包含する。試料は、線虫、ショウジョウバエ、若しくはマウスの胚のホモジェネートのような全体的な生体であることができるか、又は、生体の組織若しくは器官であることができる。試料の調製は、調査された生体、組織、又は器官に依存することで異なるが、しかし、標準的な手順は、通常、利用可能なもの及び専門家に知られたものである。ほ乳類の及びヒトのタンパク質の試料に関して、それは、培養された細胞、レーザーでマイクロ切開された細胞、体の組織、体液、又は関心のある他の関連性のある試料の単離をカバーする。試料におけるタンパク質の分画に関して、細胞の溶解は、細胞の分画及びタンパク質の精製における第一のステップである。物理的な、酵素的な、及び洗浄剤に基づいた方法を包含するものである、多数の技術は、細胞の崩壊に利用可能なものである。歴史的には、物理的な溶解は、細胞の崩壊についての選抜の方法でありつづけてきた；（均質化、浸透圧性の溶解、超音波の細胞の崩壊）しかしながら、それは、しばしば、高価な、厄介な設備を要求すると共に（窮屈な均質化の乳棒と比較された余裕のあるもののような）装置における変動性のせいで繰り返すことが時々困難なものであるプロトコルを伴う。近年において、洗浄剤に基づいた溶解は、使用の簡単さ、低い費用、及び効率的なプロトコルのおかげで非常にポピュラーになってきたものである。
【００５３】
ほ乳類の細胞は、原形質の膜、細胞外の環境から細胞の内容物を分離する障壁を形成するものであるタンパク質−脂質の二層、を有する。原形質の膜を含む脂質は、閉じられた二分子のシートを形成することに自発的に関連するものである親水性の及び疎水性の部位を有するものである、両親媒性のものである。膜のタンパク質は、疎水性のコアにまたがる一つの又はより多くのドメインによって適所に保持された、脂質の二層に埋め込まれたものである。加えて、周辺のタンパク質は、一体の膜のタンパク質との又は極性の脂質の頭部基との相互作用を通じて二層の内側の又は外側の表面を結び付ける。脂質及びタンパク質の内容物の本性は、細胞のタイプと共に変動する。明らかに、細胞の崩壊のために選抜された技術は、物理的な又は洗浄剤に基づいたもののいずれであっても、検査されるものである細胞又は組織の起源及びそれらの外側の層を崩壊させる際の固有の簡単さ又は困難さを考慮に入れなければならない。加えて、その方法は、加工されるものである材料の量及び意図された下流の用途と適合性のものでなければならない。
【００５４】
特定の実施形態において、タンパク質の抽出物は、（細胞外のタンパク質、膜のタンパク質、細胞基質のタンパク質、核のタンパク質、ミトコンドリアのタンパク質のような）異なる区画から由来された細胞のタンパク質の予備分画をもまた包含する。他の予備分画の方法は、等電点、電荷、及び分子量のような物理的な性質においてタンパク質を分離する。
【００５５】
特定の実施形態に従って、試料は、適当な薬剤（例．グアニジニウム＝クロリド、尿素、酸（例．０．１％トリフルオロ酸）、塩基（例．５０％ピリジン）、及びイオン性の又は非イオン性の洗浄剤）を使用することで、試薬又はタンパク分解酵素への最適化されたアクセスのためにタンパク質を変性させるように、修飾又は開裂に先立ち予備処理される。
【００５６】
本発明の方法は、このように、自由選択で、試料の予備処理を含むが、それを、上に列挙した試料の調製方法の一つの又はより多くのものを含む予備処理のステップにおいて行うことができる。それに応じて、本発明の方法に適切なデバイスは、自由選択で、試料の調製に適切な一つの又はより多くのデバイス、例．音波処理デバイス、クロマトグラフィーシステム（アフィニティー、ゲル濾過）、限外濾過ユニット、遠心分離機、緩衝剤、酵素、洗浄剤、など…のための送り出しシステムを備えた温度制御された反応バイアルを含む試料の調製ユニットを含む。
【００５７】
当該発明の方法を、比較の分析のための一つの単一の試料へ又は二つの若しくはより多くの試料へ適用することができるが、それによって、これらの試料におけるＣ末端のペプチドには、異なる試料に由来する同じペプチドを弁別することができるものである標識が提供される。二つの又はより多くの試料が、同時に分析される場合には、試料の貯留は、貯留することが個々の試料の差異的な標識付けの後で起こるとの条件で（以下に詳述することにするもののような）方法において異なる時点で起こることができる。
【００５８】
本発明の方法の一つのステップにおいて、それは、当該発明の方法の大部分の実施形態において第一のステップであるが、試料におけるタンパク質のＣ末端並びにＡｓｐ及びＧｌｕの側鎖は、修飾される。
【００５９】
適切なカルボキシル基を修飾する薬剤は、例えば、カルボキシルのエステル（例えば、メタノール又は他のより低級な脂肪族の又は脂環式のアルコール、ジアゾメタン、メチル＝ヨージド、Ｍｅ３ＳｉＣＨＮ２、Ｍｅ２Ｃ（ＯＭｅ）２、ＣＨ３ＯＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ３ＳＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃｌ、ＰｈＣＨ２ＯＣＨ２Ｃｌ、Ｍｅ３ＳｉＣｌ、Ｅｔ３ＳｉＣｌ、及びＭｅ２ＰｈＳｉＣｌ）、アミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、Ｍｅ２ＮＨ、ピロリドン、ピペリジン）、及びヒドラジド誘導体（例えば、フェニルヒドラジド）誘導体の形成に至るものである化合物である。カルボキシルのエステル誘導体の発生は、適切な求核試薬での置き換え（displacement）が後に続けられた良好な脱離基でのカルボキシラートの活性化又はハロゲン化アルキル若しくはスルホナートにおけるカルボキシラートの求核試薬の置き換えを伴うことがある。ある一定の実施形態において、修飾する試薬は、メチル＝ヨージドである。他の実施形態において、カルボキシル基の修飾は、適切な保護する試薬との反応に先立つ（例．１−エチル−３−［３−ジメチルアミノ−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）での）カルボジイミド活性化を伴う。例えば、カルボジイミドで活性化されたカルボキシル基との反応に適切な保護する試薬は、脂肪族のアミン（ＮＨ２−Ｒ）である。一つの実施形態において、脂肪族のアミンは、メチルアミン又はエチルアミンである。
【００６０】
特定の実施形態において、またシステインは、例．アルキル化によって、修飾される、及び／又は、リシンは、例．アセチル化によって、修飾される。リシンの修飾を、トリプシンの特異性を調整するために、又は、さらに詳細に説明されるように、リシンのアミンの基における標識付けを回避するために、することができる。
【００６１】
本発明の方法の別のステップにおいて、それが、一般に、上述した修飾のステップの後に続くステップであるが、試料におけるカルボキシルで修飾されたタンパク質は、開裂剤によって開裂される。
【００６２】
以下に詳述されるように、本発明の方法における試料の最終的な分析は、質量分析（ＭＳ）を使用することで行われる。最適な結果は、長さにおいて約５０個までのアミノ酸のペプチドを使用することでＭＳにおいて得られる。またペプチドの分離のためにも、大部分のクロマトグラフィーシステムは、タンパク質についてのものと比べてペプチドについてより高い分解能を有する。それに応じて、本発明の方法は、開裂ステップを包含するが、それによって大きいタンパク質は、Ｎ末端の、Ｃ末端の、及び内部のペプチドまで低減される。
【００６３】
本発明の方法におけるタンパク質の開裂を、化学的な及び酵素的な方法の両方を使用することで行うことができる。
【００６４】
化学的な開裂の方法は、ＢＮＰＳ−スカトール［２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチルインドール］、ＣＮＢｒ、ギ酸、ヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）、及びヨードソ安息香酸、並びに、ＮＴＣＢ＋Ｎｉ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）のような、しかしそれらに限定されるものではない、開裂剤の使用を包含する。
【００６５】
酵素的な開裂の方法は、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチターゼ、Ａｒｇ−Ｃエンドペプチターゼ、Ｃａｓｐａｓｅ １、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０、キモトリプシン、クロストリペイン、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、グルタミルエンドペプチターゼ、グランザイム Ｂ、ＬｙｓＣリシルエンドペプチターゼ、ペプシン、プロリン−エンドペプチターゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌のペプチターゼＩ、サーモリシン・トロンビン、トリプシンのような、しかしそれらに限定されるものではない、酵素的な開裂剤での消化を包含する。定温放置の時間、酵素／基質の比、ｐＨ、及び緩衝剤のようなパラメーターは、ある一定のプロテアーゼの特異性に影響を及ぼすことができる。
【００６６】
本発明の目的のために、典型的には開裂の方法及び／又は薬剤は、選抜されるが、それらは、特異的なものであると共に高い効能を有する。さらに詳細に説明されるように、本発明の方法は、典型的には、コンピューター内の開裂のデータとの経験的な開裂のデータの比較に頼る。従って、試料の理論的な開裂のパターンが、実験のデータと可能な限り多く調和することは、重要性を有することである。例えば、メチオニンのＣ末端で開裂させるためのＣＮＢｒの使用は、また、トリプトファンのＣ末端での開裂に帰着することができる。芳香族のアミノ酸のＣ末端で優先的に開裂させるものであるキモトリプシンは、また、定温放置の時間及び試料における酵素の濃度に依存するが、他の疎水性のアミノ酸のＣ末端で開裂させることになる。
【００６７】
また、発生させられたペプチドの平均のサイズは、重要性を持つものである。ペプチドがより短ければ短いほど、異なるタンパク質からのペプチドが同じ質量を有すると共に同じ配列さえも有することになると共に精製及び分析の方法における同一の方式で挙動することになるところの機会が、より大きい。それに応じて、試料の本性及び複雑さに依存するが；あまり一般的に起こるものではない開裂のサイトを備えた酵素は、好適なものであることがある。
【００６８】
特定の実施形態に従って、本発明の方法における開裂のステップは、それの高い特異性及び効率の考慮に入れて、トリプシンで行われる。あるいは、Ｌｙｓ及びＡｒｇの両方における開裂が、短過ぎるペプチドに帰着する場合には、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（アルギニンに特異的なもの）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（リシンに特異的なもの）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ（Ａｓｐ／Ｇｌｕに特異的なもの）のような他の酵素を、使用することができる。あるいは、リシンの側鎖は、アルギニン残基（及びホモアルギニンへと修飾されると共にトリプシンについての基質になるものであるシステイン）にトリプシンの開裂を制限するためのアセチル化によって修飾される。
【００６９】
本発明の方法のさらなるステップにおいて、試料の複雑さは、Ｃ末端のペプチドを単離することによって低減される。
【００７０】
上に記載された開裂のステップにおけるペプチドへのタンパク質の開裂は、試料に潜在的に存在するものである高い数のタンパク質は、いっそうはるかにより高い数のペプチドに転換されるという不都合を有するが、それらは、原則として、試料に存在するものであるタンパク質の全て及びそこで起こってしまった潜在的なタンパク質のプロセシングを識別するために分析されることを全て必要とする。この方式において、同じタンパク質の多数のペプチドが、分析される際に、冗長な情報が、得られる。ペプチドの試料の複雑さを低減するための異なる方法を、記載してある。たとえば、システインを含むペプチドのみを、還元された（reduced）システインのチオール基に対して反応性のものであると共に標識付けされたシステインを含むペプチドを単離するためのタグを担持するものである標識付けの試薬を使用することで、単離することができる。しかしながら、いくつかのタンパク質は、他のものが一つと比べてより多いシステインを有する一方で、全くシステインを有するものではない。このように、システインの標識付けは、制限された程度までのみ、情報を失うことなくタンパク質当たり一つのペプチドまで試料の複雑さを低減することができる。
【００７１】
本発明に従って、タンパク質当たり一つのペプチドまでの一つの又はより多くの試料の複雑さの低減は、開裂されたタンパク質の混合物からＣ末端のペプチドを選択することによって、達成される。Ｃ末端のペプチドの選択は、ある一定の利点を有する。Ｎ末端は、Ｃ末端と比べて生体内のタンパク分解性のプロセシングをより被りがちなものであるが、それは、どのＮ末端のペプチドが、開裂させられたタンパク質の試料に存在するものであることになるかを予言することを困難なものとする。加えて、Ｎ末端の多数の異なる修飾は、生体内のものか又はアセチル化、ホルミル化、及びピログルタミン酸への修飾によるもののようなタンパク質の試料の操作の結果としてのものかのいずれかで存在する。Ｎ末端のメチオニンプロセシング（“Ｎ−終端規則”）についての予言の方法にもかかわらず、それは、必ずしも常に、タンパク質の本物のＮ末端のアミノ酸を予言するものではない。さらには、Ｎ末端は、しばしば、（経膜的な輸送配列についてのもののような）シグナル配列を含有するが、それらは、保存されると共にＮ末端のペプチドの配列をＣ末端のものと比べてあまり情報を与えるものではないものとする。また、代替のスプライシングのおかげでタンパク質の配列における差異は、Ｃ末端の部分におけるものと比べてタンパク質のＮ末端の部分でより頻繁に起こる。
【００７２】
それに応じて、本発明の方法は、試料における開裂させられたタンパク質のＣ末端のペプチドを選択するステップを含む。修飾されたタンパク質の開裂の際に、元来のタンパク質のカルボキシル基が、開裂に先立つ修飾ステップにおいて修飾された一方で、そのタンパク質のＮ末端のペプチド及び全ての内部のペプチドは、新しいカルボキシル基を得る。新しく発生させられたカルボキシル基は、カルボキシル基を通じてマトリックスへ直接的にこれらのペプチドを結び付けることによってか又はアフィニティーマトリックスにおけるアフィニティータグが付けられたペプチドの単離によって後に続けられたアフィニティー標識とカルボキシル基を反応させることによってかのいずれかで、混合物からのＮ末端の及び内部のペプチドの取り除きに使用される。Ｃ末端のペプチドを単離するための方法は、例えば、米国特許第６，１５６，５２７号明細書（Ｓｃｈｍｉｄｔ）、米国特許出願公開第２００６／１３４７２４号明細書（Ｆｉｓｃｈｅｒ）、及び米国特許出願公開第２００２／０１０６７００号明細書（Ｆｏｏｔｅ）において記載される。Ｎ末端のペプチド及び内部のペプチドを、修飾されたＣ末端のペプチドとの電荷における差異を活用するものである、イオン交換体においてカルボキシル基を介して可逆的に結び付けることができる。あるいは、Ｎ末端の及び内部のペプチドは、上に本発明のカルボキシル修飾ステップ（第一の方法のステップ）の文脈に記載したもののようなカルボキシルの反応性の基で官能化されたマトリックスへ結び付けられる。本発明の方法におけるＣ末端のペプチドの単離の別の代替の実施形態は、Ｎ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基へのアフィニティータグの共有結合的な又は非供給結合的な結び付きを伴う。適切なアフィニティータグは、ｄ−ビオチン又は構造的に修飾されたビオチンに基づいた試薬、１，２−ジオール類、ジニトロフェニルのようなハプテン、又は、ヘキサヒスチジンのような遷移金属に結び付くものであるリガンド、又はグルタチオンを包含するが、それらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明の方法の特定の実施形態において、試薬のカルボジイミドＥＤＣは、内部の及びＮ末端のペプチドのカルボキシル基と（例えば図３に描かれたもののような）ＮＨ２基を含むビオチン分子を反応させるために使用される。
【００７４】
本発明の方法のさらなるステップにおいて、一つの試料又は二つの若しくはより多くの貯留された試料の単離されたＣ末端のペプチドは、一つの又はより多くのペプチドの分離技術にかけられる。
【００７５】
適切な分離技術は、それは、多重のフラクションへの複雑なペプチドの試料の分離を可能にするが、当業者に知られたものであると共に、等電位のフォーカシング、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、イオン対逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、…などを包含するが、しかし、それらに限定されるものではない。原則として適切なものであるとはいえ、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、２次元のゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーのような技術は、本発明の方法において単離されたものであると、一般に限定された長さのＣ末端のペプチドの分離にあまり適当なものではない。
【００７６】
逆走（ＲＰ）−ＨＰＬＣ及び２次元液体クロマトグラフィーを包含する、液体クロマトグラフィーによってペプチド消化物を分離するための数個の技術を記載してきた。タンパク分解性の消化から得られたペプチド試料について、２Ｄ−ＬＣアプローチは、自動化及びスループットに関してまた顕著な利点を提供するものである、分離に特に適切なものである。また毛細管の電気泳動（ＣＥ）は、ペプチドの分離に適切な方法である。
【００７７】
２Ｄ−ＬＣは、一般に、一連のサイクルで動作させられた、逆相カラムと直結で結合させられたイオン交換カラム（通常では、強い陽イオン交換，ＳＣＸ）を使用する。各々のサイクルにおいて、塩の濃度は、逆相システムへとそれらのイオンの電荷に従ってペプチドを溶出させる為には、イオン交換カラムにおいて増加させられる。ここにおいて、ペプチドは、例．ＣＨ３ＣＮでの勾配によって、疎水性に分離される。
【００７８】
多数のパラメーターは、分解能に、及び、その後に、ＬＣ−ＭＳによって表示することができるものであるタンパク質の数に、影響する。通常では、一次元目の分離技術（ＳＣＸ）と二次元目のＲＰ−ＨＰＬＣ分離のアプローチの間の‘直結の’構成は、試料の分画のためにセットアップされる。イオン交換クロマトグラフィーを、塩の濃度を増加させると共に階段状の溶出によって、又は、塩の勾配によって、行うことができる。典型的には、ＳＣＸは、ＳＣＸクロマトグラフィーの間における疎水性の相互作用を最小にするために、例．３０％までのアセトニトリル、の存在下で行われる。例．Ｃ１８カラムにおける、逆相クロマトグラフィーに先立ち、アセトニトリルのような有機溶媒は、取り除かれるか、又は、例．蒸発によって、強く低減される。
【００７９】
上に詳述したように、本発明の方法を、個々の試料のいずれかで行うことができるか、又は、異なるプロセシングステップによって、より詳しくは、上に記載されたペプチドの分離の方法によって、導入された変動性を回避するための二つの若しくはより多くのタンパク質の試料の同時の分析において使用することができる。異なる試料に由来する同一のペプチドの間で弁別するために、異なる選択肢は、予見される。
【００８０】
本発明の方法の第一の実施形態に従って、当該発明の第一のステップにおける無処置のタンパク質のカルボキシル基の修飾は、検出可能な標識とタンパク質のカルボキシ末端を反応させることによって、差異的な標識付けのステップとして使用される。一度異なる試料のタンパク質の差異的な標識付けが行われると、試料を、貯留することができると共に、さらなるプロセシングが、貯留された試料で起こる。あるいは、試料を、個々に加工すると共に分析に先立ち貯留することができる。しかしながら、二つの又はより多くの開裂させられた差異的な標識付けされたタンパク質の試料の比較のプロテオーム解析において、試料は、理想的には、ペプチド分離技術によって導入された試料の間の変動性を制限するための手順において可能な限り早く貯留される。その次に、同じペプチドの差異的に標識付けされたバージョンは、異なる試料の間の個々のペプチドの濃度を正確に比較するためにＭＳにおいて一緒に分析される。
【００８１】
異なる標識を、同じアミノ酸配列を備えたペプチドを弁別するために使用することができる。しかしながら、分離及びＭＳ分析の後で対応するペプチドの識別を容易にする為に及び複雑なデータベースを発生させる必要があることを回避する為には、差異的に標識付けられたペプチドが、ＭＳにおいて差異的な信号を発生させる一方で、クロマトグラフィーの分離システムにおいて類似して挙動することになるように、化学的な構造において同一なものである標識を使用することは、関心のあることである。
【００８２】
本発明の方法の特定の実施形態において、異なるタンパク質の試料は、同位体の標識で標識付けされる。同位体の標識は、同位体で標識付けされた同一のペプチドが、タンパク質の精製システムにおいて本質的に同一に挙動するが、しかし、ＭＳにおいて差異的に挙動するように、同一の化学的な構造を有する。
【００８３】
適切な同位体の標識付けの薬剤の例は、Ｃｙｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，９９４−９９９及び米国特許第６，８５２，５４４号明細書に記載されたようないわゆるＩＣＡＴ試薬の標識を包含する。現在では、二つの異なる標識付けの試薬は、商業的に入手可能なものであるが、それらは、ＳＨに反応性のものであると共にビオチンアフィニティータグを含有する。米国特許第６，８５２，５４４号明細書は、同位体の標識付けする基に連結された、ＣＯＯＨに反応性の基の組み合わせを開示するが、それらは、ＣＯＯＨ末端において開裂させられてないタンパク質を標識付けすることに適切なものである。ビオチンタグのようなアフィニティータグは、本発明において必要とされるものではない。ペプチドの選択は、Ｎ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基で行われる。
【００８４】
あるいは、タンパク質の試料の差異的な標識付けを、修飾ステップと付随して保証することができる。この実施形態に従って、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、又は３４Ｓのような一つの又はより多くの同位体を含む、上に記載されたようなカルボキシル基の修飾に使用された試薬は、また、同位体の標識付けに適切なものである。例は、メチルアミン及びメチルアミン−（ｄ３）又はエチルアミン及びエチルアミン−（ｄ５）を包含する。
【００８５】
さらなる実施形態に従って、本発明の方法におけるタンパク質の試料の差異的な標識付けは、開裂の際に発生させられたＣ末端のペプチドの新しく発生させられたアミノ末端における標識付けとして行われる。（内部の）リシンにおける同時の標識付けを回避するために、タンパク質を、例．開裂に先立ち無水酢酸のようなアルキル化剤で、修飾することができる。この実施形態に従って、試料の差異的な標識付けは、開裂のステップの後で、及び、自由選択でＣ末端のペプチドの単離の後で、行われる。
【００８６】
Ｎ末端の標識付けに適切なものである標識付けの基は、２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニルアミノ−２−フェニルアセトニトリル［ＢＯＣ−ＯＮ］−（ｄ０）若しくは−（ｄ９）、アセチル＝クロリド−（ｄ０）若しくは−（ｄ３）、ベンゾイル＝クロリド−（ｄ０）若しくは（ｄ５）、又は無水酢酸−（ｄ０）若しくは−（ｄ６）を包含する。
【００８７】
米国特許第６，８５２，５４４号明細書に開示された等しく全てのＮＨ２に反応性のＩＣＡＴ標識付け試薬は、アフィニティー標識と共に、しかし通常では、それ無しに、いずれかであるが、本発明において単離されたＣ末端のペプチドの同位体の標識付けに適切なものである。
【００８８】
Ｃ末端のペプチドのＮ末端の標識付けを、それが、Ｎ末端の及び内部のペプチドのＣ末端に基づいたものである、精製と干渉するものではないので、Ｃ末端のペプチドの単離の前に又は後に行うことができる。しかしながら、標識付けが、単離に先立ち行われるとき、カルボキシル基は、標識付けの試薬に存在するものではないことがある。
【００８９】
本発明の方法は、ペプチドのデータベースのものとペプチドの物理化学的な特性についてのデータを比較することに基づいたものである識別ステップを含む。
【００９０】
それに応じて、本発明の方法の一つの又はより多くの分離ステップで得られた各々のペプチドのフラクションについて、例．クロマトグラフィーの間における、一つの又はより多くの分離ステップにおけるペプチドの挙動に関係する、データは、収集されると共に記憶される。このようなデータは、たとえば、精製が行われたところのｐＨ、ペプチドが逆相カラムから溶出するところの有機溶媒の百分率、ペプチドがイオン交換マトリックスから溶出するところの与えられたｐＨでの塩の濃度、与えられたｐＨでのある一定の樹脂へのペプチドの結び付き（又は結び付き無し）、などを包含する。
【００９１】
加えて又は代わりに、さらなるデータを、本発明の方法においてペプチドの分離及び精製のステップから必ずしも直接的に得られないものである、各々のペプチドについて収集することができる。それに応じて、各々のペプチドについて、単離されたペプチドのフラクションを、精製の間に決定されないものである性質を決定するためのアッセイを行うために記憶することができる。このようなアッセイは、例えば、溶解度の決定、水／有機溶媒のシステムにおける分配係数、特異的なアミノ酸の側基（例．−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２）の検出を包含するが、しかし、それらに限定されるものではない。
【００９２】
本発明のさらなるステップにおいて、上に記載したように単離されてしまったものであるＣ末端のペプチドのフラクションは、質量分析によって分析される。二つの又はより多くの試料が、同時に分析される場合には、ペプチドのフラクションは、差異的に標識付けされるものである、同一のＣ末端のペプチドを潜在的に含有することになる。あるいは、関連性のあるタンパク質が、試料の一つのもの又はより多くのものにおいてタンパク分解性の生体内のプロセシングをうけてしまってある場合には、同じ親のタンパク質に対応するＣ末端のペプチドは、ＭＳにおいて別個に分析されるものである異なるフラクションにおいて溶出することがある。
【００９３】
ＭＳのスペクトルにおける試料に存在するものである親のタンパク質に対応するＣ末端のペプチドの識別は、高分解能の質量分析計の高い質量の確度によって達成される。分光法による質量の測定は、気相への分析物のイオン化によって行われる。イオン化された分子の質量対電荷比（ｍ／ｚ）は、決定されると共に、各々の個々のｍ／ｚの値についてのイオンの数は、計数される。このように、ＭＳスペクトルにおける各々の特徴は、二つの値、ｍ／ｚ及び検出されたイオンの数についての尺度、によって定義される。
【００９４】
本発明の方法のさらなるステップにおいて、Ｃ末端のペプチドの実験的な決定された質量は、データベースにおいてコンピューター内で発生させられたペプチドの質量と比較される。
【００９５】
ペプチドの質量は、それのアミノ酸組成物と相関させられる。しかしながら質量だけに基づいて、ペプチドを積極的に識別することは、必ずしも常に可能なことではない。たとえば、質量だけは、同じアミノ酸組成物をしかし異なる配列（Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５対Ａ５−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４）を有するペプチドの間で弁別することを可能にするものではないことになる。さらには、ある一定の質量は、異なる配列を有するペプチドのセットに対応することができる。例えば、より長い側鎖を備えたアミノ酸を備えた短いペプチドは、より短い側鎖を備えたアミノ酸を有するものであるより長いペプチドと同じ質量を有することができる。
【００９６】
選択が、開裂させられたタンパク質のペプチドについて行われないとき、トリプシンのペプチドの質量は、ある一定の生体のプロテオームのコンピューター内の消化物の質量の全てと相関させられる。
【００９７】
本発明において記載されたようなＣ末端のペプチドの単離を使用することで、タンパク質の試料から得られたペプチドの数は、強く低減される。それに応じて、コンピューター内のトリプシンのペプチドのデータベースは、Ｃ末端のペプチド（いわゆるＣ末端のデータベース）のみを含有することを必要とする。
【００９８】
既存のタンパク質及び配列のデータベースを、いずれの生体のプロテオームにも対応するデータベースを発生させるための基礎として使用することができる。生体の今まで増加するリストについて、完全なゲノム、及びそれから推論されたプロテオームは、知られたものである（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ）。このように、コンピューター内のペプチドのデータベースを、発生させることができるが、それにおいては、タンパク質の開裂及びペプチドの単離は、シミュレーションされる。開裂剤の効率に依存するものであるが、データベースは、ペプチドを含有することができるが、それにおいては、開裂は、不完全なものである。
【００９９】
本発明の事情に適切なＣ末端のデータベースにおいて、各々の項目は、親のタンパク質の名前及び対応するＣ末端のペプチドの質量を包含する。各々の項目について、またアミノ酸組成物は、天然の翻訳後の修飾（例．セリン、スレオニン、及びチロシンにおけるホスホリル化）、試料の処理（例．アスパラギン及びグルタミンのアミド分解）、又は、タンパク質の修飾／標識付け及びＣ末端のペプチドの単離の間に導入された修飾によって引き起こされた質量の差異を計算するために、重要なものである。各々のタンパク分解性の酵素について、修飾されてないＣ末端のペプチドの質量を含む単一の主たるデータベースは、開裂の前に及び後に導入された修飾のタイプに依存するものであるが、質量を再計算するために使用される。加えて、潜在的な翻訳後の修飾は、それが、存在するものであることがあること又は存在しないものであることがあるが、データベースにおいてペプチドの質量を計算することによって、また考慮に入れられる。加えて、標識の使用が、予見される場合には、ペプチドの各々の質量における標識の影響を、組み込むことができる。
【０１００】
にもかかわらず、インフルエンザのタンパク質の小さいセットについて米国特許第６，８４６，６７９号明細書に示されたように、実験的なＣ末端のペプチドの質量は、対応するＣ末端のデータベースにおける異なるペプチドに対応することができる。このように、このようなデータベースは、そのペプチドの質量についてのみＣ末端のペプチドの親のタンパク質を識別するために必ずしも十分に情報を与えるものではない。それに応じて、本発明は、ｍ／ｚの比のだけでなく長さ（アミノ酸の数）、アミノ酸配列、重量、疎水性、等電点、などのような追加的な特性を包含するものに基づいたＣ末端のペプチドの識別を提供する。
【０１０１】
当該発明の特定の実施形態に従って、Ｃ末端のペプチドのデータベースは、特異的な開裂剤のプロテオームに対応すると共に、これは、与えられたスピーシーズについて、試料の起源に対応するものである。このようなペプチドのデータベースは、また、注釈が付けられたスプライスの変異体を包含する。本発明の方法に使用されたコンピューター内のペプチドのデータベースは、アミノ酸における長さ、アミノ酸配列、分子量、疎水性、等電点、などと同様のＣ末端のペプチドの計算された特性を包含する。
【０１０２】
上に示唆したように、生体内の源から来るタンパク質が、しばしば、例．アセチル基、ホルミル基、又はピログルタミン酸残基を通じて、翻訳後に修飾されることは、考慮に入れられる必要があるが、それらの全ては、質量スペクトルにおける決定されたｍ／ｚにおいて影響を有することになる。それに応じて、本発明の一つの実施形態において、合成のＣ末端のペプチドは、コンピューター内の計算されたペプチドの特性を有効にするための参照標準として使用される。
【０１０３】
合成のペプチドのライブラリーからの情報は、質量分析のペプチドのピークの本性の識別を容易にするために使用されるが、それによって自由選択で新規の配列決定を未然に防ぐものである。識別は、コンピューター内のペプチドのライブラリーに記憶された利用可能な情報と比較されたＨＰＬＣの保持時間、等電点、及び質量の特異的なｍ／ｚの値と同様に測定された特性に基づいたものであることになる。
【０１０４】
Ｃ末端のペプチドのｍ／ｚのデータとの組み合わせで親のタンパク質の積極的な識別を可能にするものである、異なるタイプの物理化学的なデータは、考慮される。
【０１０５】
予見されたデータの一つのタイプは、等電点、異なるｐＨの値における正味の電荷、ＲＰ ＨＰＬＣにおける保持時間、２１４及び２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収、与えられたｐＨ及び塩の濃度、疎水性、並びに親水性でイオン交換カラムから溶出する傾向のような、配列の情報から予言されるものである及び／又はペプチド精製ステップ及びＭＳの間に測定することができるものであるデータである。
【０１０６】
疎水性を、例えば、Ｂｕｌｌ ａｎｄ Ｂｒｅｅｓｅ（１９７４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６１，６６５−６７０のアルゴリズムによって計算することができる。等電点を、例えば、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌについて計算することができる。逆相カラムにおける保持時間は、例えば、Ｋｒｏｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３，９０８−９１９の方法に従って予言される。
【０１０７】
上に示唆したように、本発明の事情において使用されたデータベースは、加えて又は代わりに、溶解度、水／有機溶媒の二相の系にわたる分配、タンパク質に反応性の基（ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ）の検出のためのアッセイ［イオン化ポテンシャル、双極子モーメント、水素結合する能力、及び気相におけるイオンの移動度］についてのデータのような、しかし、それらに限定されるものではない、追加的な実験で得られた及びペプチドの精製から必ずしも直接的に誘導されたものではないデータを含む。
【０１０８】
それに応じて、注釈が付けられたＣ末端のデータベースとの比較に基づいた識別を提供するものである本発明の方法は、増加させられた確度を備えた対応する親のタンパク質の識別を可能にする。
【０１０９】
自由選択で、本発明の事情において使用されたＣ末端のペプチドのデータベースは、親のタンパク質を識別することをさらに助けるものである、親のタンパク質の表現のパターンについての情報などをさらに含む。親のタンパク質が、それらの末端のペプチドからのものを除いてアミノ酸配列において異なる場合には、注釈が付けられたＣ末端のペプチドのデータベースにおける対応する項目は、同一の質量及び同一の物理化学的な性質を備えたＣ末端のペプチドを示唆することになる。にもかかわらず、生体の発達の間における親のタンパク質の可能性のある差異的な表現又は組織の特異的な表現における詳細を伴ったものの項目のさらなる注釈付けは、単離されたＣ末端のペプチドへの正しい親のタンパク質の帰属を可能にすることができる。実に、タンパク質の試料の源に依存することで、異なる可能性のある親のタンパク質、その表現が試料のものと調和するもの、から選択することは、可能性のあるものであることがある。
【０１１０】
本発明の方法において、各々のペプチドについて、注釈が付けられたＣ末端のペプチドのデータベースと比較された質量は、計算される。それに応じて、単離されたペプチドの測定された質量に対応するものである計算された質量を有するものであるそれらの項目は、選択される。ＭＳ装置及び試料のタイプに依存するものであるが、モノアイソトピック質量との又は平均の質量との比較は、行われる。
【０１１１】
モノアイソトピック質量が、使用されるとき、典型的には０．１質量単位の測定の誤差は、データベースから項目を選択するために包含される。平均の質量が、使用されるとき、典型的には１Ｄａの測定の誤差は、データベースから項目を選択するために包含される。測定された質量が、データベースにおけるただ一つの項目と対応するとき、親のタンパク質は、直ちに識別される。
【０１１２】
測定された質量が、データベースにおいて一つと比べてより多い項目に対応するとき、全てのこれらの項目は、部分集合として選択される。さらなる識別は、データベースにおける項目の部分集合についてのものとの単離されたペプチドの物理化学的なパラメーターの比較に基づいて行われる。典型的には、ペプチドの精製ステップから直接的に誘導することができるものであるそれらの物理化学的なパラメーターは、最初に考慮される。特定の実施形態に従って、少なくとも三つの物理化学的な特性は、考慮されると共に識別は、“最良適合”分析に基づいて行われる。一つの追加的なパラメーターが考慮されるとき、たいてい選抜されるものであるパラメーターは、同じ質量を備えたＣ末端のペプチドのデータベースにおけるペプチドのセット内のそのパラメーターのパワーを弁別することに依存する。例えば、Ｃ末端のペプチドのデータベースにおけるペプチドが、異なる量の芳香族のアミノ酸を有するとすれば、２１４及び２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を、選択の判定基準として使用することができる。別の例において、同じｍ／ｚの比を備えたデータベースにおける３個のペプチドのセットにおいて、これらの全てが、同じ正味の電荷を有するが、しかし、電荷の分布が、異なるものである（例．一つのペプチドが、帯電したアミノ酸を有するものではないが、別のものが、一つのＡｒｇ及び一つのＡｓｐを有すると共に別のものが二つのＡｒｇ及び二つのＡｓｐを有する）とすれば、イオン交換における挙動を、データベースの部分集合における一つの具体的なペプチドと単離されたペプチドを相関させるための判定基準として使用することができる。
【０１１３】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を実行することに適切なデバイス及び機器を提供する。
【０１１４】
ＭＳ分析に先立ち、本発明の方法は、多くのタンパク質のプロセシングのステップ（タンパク質の修飾、タンパク質の開裂）並びに単離及び精製のステップ（Ｃ末端のペプチドの単離、単離されたペプチドの分離）を含む。それに応じて、本発明の方法を実行することに適切なデバイスは、試薬（修飾剤、開裂剤）の対応する源並びに分離及び単離ユニット（典型的には、クロマトグラフィーユニット）を備えた、適当な反応チャンバーを含む。個々のＣ末端のペプチドの適当な分離が、しばしば、配列の分離技術を要求すると、本発明の方法を行うことに適切なデバイスは、自由選択で、毛細管電気泳動（ＣＥ）の機器、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣの機器、及び／又は、２次元の液体クロマトグラフィー機器、…などのような、しかし、それらに限定されるものではない、電気泳動の機器、クロマトグラフィーの機器のような、二つの又はより多くの適切な分離機器を含有する又はそれらに接続される。
【０１１５】
本発明の方法の本質的な特徴は、単離されたＣ末端のペプチドの質量の決定である。それに応じて、本発明の方法を行うためのデバイスは、質量分析の機器を含む。典型的な質量分析の機器は、３つの構成部品、関心のある分子を気化させる為のイオン源、イオン化された分子の質量対電荷の比（ｍ／ｚ）の尺度を決定するものである、質量分析器、及び、各々の個々のｍ／ｚの値についてイオンの数を登録すると共に計数するものであるセンサーからなる。ＭＳスペクトルにおける各々の特徴は、機器の検出器に到達したものである、二つの値、ｍ／ｚ及びイオンの数についての尺度、によって定義される。
【０１１６】
分光計における質量分析のためのタンパク質又はペプチドのイオン化は、通常では、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又はマトリックスで補助されたレーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）によって行われる。ＥＳＩプロセスの間に、分析物は、溶液の外で直接的にイオン化されると共に、従って、ＥＳＩは、しばしば直接的に、液体クロマトグラフィーの分離ツール（例．逆相ＨＰＬＣ）へ結合させられる。ＭＡＬＤＩは、プロセスをより有効なものとするために桂皮酸と同様の、レーザーエネルギーを吸収するものである小さい有機分子と混合させられた乾燥した試料を、レーザーパルスを介して、気化させる。
【０１１７】
質量分析器は、質量分析計の鍵となる構成部品である；重要なパラメーターは、感度、分解能、及び質量の確度である。あるものは、プロテオミクスにおいて現行で使用された五つの基本的なタイプの質量分析計である。これらは、イオントラップ、タイムオブフライト（ＴＯＦ）、四重極子、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、及び、フーリエ変換イオンサイクロトロン（ＦＴＩＲ−ＭＳ）分析器を包含する。タンデムＭＳ又はＭＳ／ＭＳを、（例．ＬＴＱ−ＦＴＩＣＲ、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｑ−ＴＯＦ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、トリプル四重極型の及びハイブリッドトリプルの四重極子／線形のイオントラップ（ＱＴＲＡＰ）のような全てのハイブリッド機器で）時間内に（イオントラップ）及び適所で行うことができる。
【０１１８】
当該発明の特定の実施形態は、少なくとも二つの試料の源（１０１）、対応する修飾剤／標識源（１０３）を備えた、修飾／標識付けユニット（１０２）、開裂ユニット（１０４）、Ｃ末端のペプチドの単離ユニット（１０５）、ペプチド分離ユニット（１０６）、質量分析計ユニット（１０８）、並びに、読み出しユニット（１１０）に接続された、制御回路及びデータ分析ユニット（１０９）、を含む、Ｃ末端のペプチドのタンパク質の試料を単離すると共に分析するためのデバイス（１００）に関係する。デバイスを、開裂させるステップに先立ち（貯留された試料は、開裂ユニットに入る）又は開裂させるステップの後で（試料は、個々に開裂ユニットを通過する）試料の貯留を保証するように構成することができる。特定の実施形態において、分離ユニット（１０６）は、二つの連続的に連結された分離システム（１１０６）及び（２１０６）を含むが、それにおいては、第一の分離システム（１１０６）は、例．陽イオン交換クロマトグラフィーシステム及び分離システムであると共に、第二の分離システム（２１０６）は、典型的には、ＨＰＬＣ逆相システムである。質量分析計の素子（１０８）は、ペプチドの同位体の形態を分離するものである、ユニットからなる。
【０１１９】
当該発明のデバイスの特定の実施形態は、分析ユニット（１０７）をさらに含むが、それにおいては、精製されたペプチドの一つの又はより多くの物理化学的な性質は、決定される及び／又は登録される。ペプチドの実験的な質量並びに精製の間に得られた及び分析ユニットにおいて自由選択で得られたそれの物理化学的な性質におけるデータは、（図４において点線によって示唆された）Ｃ末端のペプチドの注釈が付けられたデータベース（１１１）と比較される。
【実施例１】
【０１２０】
例
例１：Ｃ末端のペプチドの単離
Ｃ末端のペプチドの単離のフリーチャートは、図１に概略が描かれる。
【０１２１】
タンパク質の抽出物は、標準的な方法を使用することで組織から単離される。システインの側鎖は、アルキル化されると共に、Ｎ末端におけるアミン及びリシンの側鎖は、アセチル化される。次のステップにおいて、（グルタミン酸及びアスパラギン酸における反応性のカルボキシル基のみならず）Ｃ末端のアミノ酸の遊離のカルボキシル基は、Ｇｒａｂａｒｅｋ＆Ｇｅｒｇｅｌｙ（１９９０）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５，１３１−１３５に記載されたような方法に従った１−エチル−３−［３−ジメチルアミノ−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）によって活性化される。
【０１２２】
ＥＤＣは、アミンに反応性のＯ−アシルイソウレアの中間体を形成するものである、タンパク質（図２における分子１）におけるカルボキシル基と反応する。この中間体は、安定なアミン結合によって結ばれた二つの分子の共役体を生ずるものである、ＮＨ−Ｒ（図２における分子２）におけるアミンと反応することがある。しかしながら、中間体は、また、それを水性の溶液において不安定なもの及び短寿命のものとするものである、加水分解を受けやすいものである。スルホ−ＮＨＳ（５ｍＭ）の追加は、それをアミンに反応性のスルホ−ＮＨＳエステルへと転換することによってアミンに反応性の中間体を安定化させるが、このようにＥＤＣに媒介されたカップリング反応の効率を増加させるものである。アミンに反応性のスルホ−ＮＨＳエステルの中間体は、二つのステップの架橋する手順を許容するために十分な安定性を有するが、それは、一つのタンパク質におけるカルボキシル基が変えられてないままであることを可能にする。ＥＤＣで活性化されたＣＯＯＨ基は、アミノ基を含有する分子，ＮＨ２−Ｒにカップリングさせられる。ＮＨ２−Ｒは、分子であることができるが、それは、この点順の間に正の電荷を簡単に引き寄せることによってＣ末端のペプチドのイオン化のプロセスを改善する。他方においては、反応性の分子は、いずれのさらなるカルボキシル基をも含有するものであってはならない。本例においては、ＮＨ２−Ｒは、同位体で標識付けすることができるものであるエチルアミンである。
【０１２３】
その後、タンパク質の試料は、ペプチドの混合物を発生させるためにトリプシンで酵素的に消化される。
【０１２４】
Ｃ末端のペプチドが、上述した反応によって、修飾されたカルボキシル基を有する一方、消化物におけるＮ末端の及び内部のペプチドは、遊離のＣ末端のアミノ酸を含有する。
【０１２５】
内部の及びＮ末端のペプチドの遊離のＣ末端のカルボキシル基は、ビオチンのアフィニティークロマトグラフィーを介して単離される。このステップは、内部の及びＮ末端のペプチドの分離に至ると共に、溶液にＣ末端のペプチドを放置する。反応は、上に記載されたカルボジイミドで媒介された反応によって行われるが、それにおいては、Ｒ−ＮＨ２は、図３に示されたような修飾されたビオチンである。
【０１２６】
ペプチドの消化物のＣ末端のペプチドを除く全てのペプチドは、これらのペプチドの選択的なアフィニティーの欠乏によって溶液から取り除かれる。溶液にあるものである非常にＣ末端のペプチドは、質量分析法の分析が後に続けられた（多）次元の液体クロマトグラフィーによってさらに分取される。
【０１２７】
例２：類似の質量でのペプチドの識別
本例は、追加的なパラメーターを備えたペプチドの質量データを補充することの必要性を示す。Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅにおけるＳｃａｎ Ｐｒｏｓｉｔｅ）におけるモチーフサーチから、可能性のある臨床的な関連性のあるヒトのタンパク質の８個のアミノ酸のＣ末端のトリプシンのペプチド、すなわち、Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ ２の配列ＳＦＰＮＩＧＳＬ［ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１］を、選抜した。
【０１２８】
ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１（８３３．９４）の計算された平均の質量を、理論的な値の１Ｄａにおけるものの内で計算された質量を備えたＰｒｏｆｏｕｎｄ（ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ）のペプチドで識別するために使用した。これを、部分的な開裂の無いことを可能にするものであるヒトのタンパク質のコンピューター内のトリプシンの消化を行うこと及びＣ末端のものであるところの多くのペプチドを選択することによってした（表１を参照のこと）。
【０１２９】
表１：関係付けられた質量を備えたＣ末端のペプチドの質量及び物理化学的なパラメーター
【０１３０】
【表１】
１，３）平均の質量及びｐＩは、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌで計算される
４）芳香族のアミノ酸の数
５）疎水性のアミノ酸の数
６）親水性のアミノ酸の数
７）逆相におけるペプチドの保持時間は、（パラメーターａ＝１０及びＢ＝０．４８を備えた）ｈｔｔｐ：／／ｈｓ２．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｃａ／ＳＳＲＣａｌｃ／ＳＳＲＣａｌｃ．ｈｔｍｌに計算される
典型的には、ペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣの組み合わせによって分離される。塩の濃度が増加させられるところのイオン交換カラムを使用することで、ペプチドは、それらの等電点に従って溶出する。上記のペプチドのｐＩに基づいて、それらは、三つのフラクション（ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：４及びＥＱ ＩＤ．ＮＯ：５）として溶出することになるが、それにおいては、緩衝剤のｐＨに最も近いｐＩを備えたペプチドは、最初に溶出することになる。逆相クロマトグラフィーの際に、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２は、それらが、異なる量の親水性の及び疎水性のアミノ酸を有するので、異なる位置で溶出することになる。ＲＰ−ＨＰＬＣにおけるタンパク質の検出に典型的には使用されるものである２８０ｎｍ及び２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づいてＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２からＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：４からＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：３を弁別することは、また非常に簡単なことである。ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：２及び３を備えたペプチドは、それらが、２８０ｎｍでＵＶ光をほとんど吸収するものではないことになると、簡単に認識される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の試料におけるタンパク質を識別するための方法であって、
ａ）前記タンパク質の試料における前記タンパク質のカルボキシル基を修飾すること、
ｂ）開裂剤で前記タンパク質の試料における前記タンパク質をペプチドへと開裂させること、
ｃ）前記ペプチドから、Ｎ末端の及び内部のペプチドからのＣ末端のペプチドを単離すること、
ｄ）精製されたＣ末端のペプチドを得るように、一つの又はより多くのペプチドの精製ステップに前記単離されたＣ末端のペプチドをかけること、
ｅ）前記精製されたＣ末端のペプチドの、質量以外の、少なくとも一つの物理化学的な性質を決定すること又は計算すること、
ｆ）ＭＳにおいて精製されたＣ末端のペプチドの質量を決定すること、
ｇ）前記精製されたＣ末端のペプチドの親のタンパク質を識別するように、前記開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの物理化学的な性質を含むデータベースと前記精製されたＣ末端のペプチドの前記質量及び前記少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること
：のステップを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
ステップ（ｇ）は、前記精製されたＣ末端のペプチドの各々について、前記精製されたＣ末端のペプチドに対応する質量を備えたデータベースにおいて一つの又はより多くのＣ末端のペプチドを識別すること、及び、
一つと比べてより多いペプチドが、一つの精製されたＣ末端のペプチドについて識別されるとき、前記データベースにおいて識別された前記一つと比べてより多いペプチドと前記精製されたＣ末端のペプチドの物理化学的なパラメーターを比較すること
を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記タンパク質の試料は、スピーシーズからのものであると共に、
前記データベースは、前記開裂剤によって発生させられたそのスピーシーズの全てのＣ末端のペプチドの質量及び物理化学的な性質を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記タンパク質は、二つの又はより多くの試料において同時に識別されると共に、
前記方法は、
− ステップ（ａ）において、差異的な標識付けの試薬のセットで修飾を行うこと
− ステップ（ｄ）に先立ち、二つの又はより多くの試料を貯留することの追加的なステップ、
− ステップ（ｆ）に先立ち、前記試料を識別するように標識の本性を識別すること、前記ペプチドが、前記試料に由来すること、
− ステップ（ｇ）において、前記Ｃ末端のペプチドを識別するように、前記開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及び物理化学的な性質を含むデータベースと前記精製されたＣ末端のペプチドの前記質量及び前記少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること
を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記少なくとも一つの物理化学的な性質は、前記一つの又はより多くのペプチドの精製ステップの間に決定される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記少なくとも一つの物理化学的な性質は、ｐＩ、逆相クロマトグラフィーの間の保持時間、並びに、２８０ｎｍ及び２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収の比の群より選択される、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
ステップ（ａ）における修飾は、第一級アミンとのカルボジイミド反応を使用することで行われる、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
ステップ（ｃ）におけるＣ末端のペプチドの単離は、第一級アミンの基を担持する修飾されたビオチンとのカルボジイミドで媒介された反応を介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させることのステップを含む、方法。
【請求項９】
タンパク質の試料からＣ末端のペプチドを単離するための方法であって、
ａ）第一級アミンとカルボジイミドを介して無処置のタンパク質のカルボキシル基を反応させること、
ｂ）開裂剤で前記無処置のタンパク質をペプチドへと開裂させること、
ｃ）第一級アミンの基を担持するアフィニティータグとカルボジイミドを介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させること、
ｄ）親和性マトリックスへ前記タグが付けられたペプチドを結び付けること及び結び付けられてないペプチドを収集すること、前記結び付けられてないペプチドが、タグが付けられてないペプチドであること、それによって（ｂ）の下で得られた前記ペプチドから、前記Ｎ末端の及び内部のペプチドからの前記Ｃ末端のペプチドを単離すること
：のステップを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
前記アフィニティータグは、ビオチンである、方法。
【請求項１１】
開裂剤によってコンピューター内で開裂させられた、生体のタンパク質のＣ末端のペプチドのデータベースにおいて、
各々のペプチドは、
− タンパク質の識別子、
− アミノ酸組成、
− 質量、及び
− 一つの又はより多くの物理化学的な性質
によって特徴付けられる、データベース。
【請求項１２】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
の前記Ｃ末端のペプチドの前記一つの又はより多くの物理化学的な性質は、逆相クロマトグラフィーにおける計算された保持時間、与えられたｐＨにおける正味の電荷、及び前記Ｃ末端のペプチドの等電点からなる群より選択される、データベース。
【請求項１３】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
前記生体は、ヒトである、データベース。
【請求項１４】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
前記開裂剤は、トリプシンである、データベース。
【請求項１５】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
前記タンパク質は、前記開裂剤での不完全な開裂から結果として生じるＣ末端のペプチドを含むと共に、それによって一つの開裂位置が、はずされる、
データベース。
【請求項１６】
タンパク質の識別のための請求項１１に記載のデータベースの使用。
【請求項１７】
一つの又はより多くの試料におけるタンパク質をそれらのＣ末端のペプチドに基づいて識別するためのデバイスであって、
前記デバイスは、少なくとも一つの試料源、少なくとも一つの対応する修飾する薬剤／標識源を備えた、修飾／標識付けのユニット、開裂ユニット、Ｃ末端のペプチドの単離ユニット、ペプチドの分離ユニット、精製されたペプチドの一つの又はより多くの物理化学的な性質を決定する及び／又は登録するための分析ユニット、質量分析計ユニット、制御回路部品及びデータ分析ユニット、及び、前記Ｃ末端のペプチドの物理化学的な性質で注釈が付けられた開裂剤を使用することでコンピューター内において開裂されたタンパク質の全てのＣ末端のペプチドの質量を含むデータベースへの接続を含む、デバイス。
【請求項１】
タンパク質の試料におけるタンパク質を識別するための方法であって、
ａ）前記タンパク質の試料における前記タンパク質のカルボキシル基を修飾すること、
ｂ）開裂剤で前記タンパク質の試料における前記タンパク質をペプチドへと開裂させること、
ｃ）前記ペプチドから、Ｎ末端の及び内部のペプチドからのＣ末端のペプチドを単離すること、
ｄ）精製されたＣ末端のペプチドを得るように、一つの又はより多くのペプチドの精製ステップに前記単離されたＣ末端のペプチドをかけること、
ｅ）前記精製されたＣ末端のペプチドの、質量以外の、少なくとも一つの物理化学的な性質を決定すること又は計算すること、
ｆ）ＭＳにおいて精製されたＣ末端のペプチドの質量を決定すること、
ｇ）前記精製されたＣ末端のペプチドの親のタンパク質を識別するように、前記開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及び一つの又はより多くの物理化学的な性質を含むデータベースと前記精製されたＣ末端のペプチドの前記質量及び前記少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること
：のステップを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
ステップ（ｇ）は、前記精製されたＣ末端のペプチドの各々について、前記精製されたＣ末端のペプチドに対応する質量を備えたデータベースにおいて一つの又はより多くのＣ末端のペプチドを識別すること、及び、
一つと比べてより多いペプチドが、一つの精製されたＣ末端のペプチドについて識別されるとき、前記データベースにおいて識別された前記一つと比べてより多いペプチドと前記精製されたＣ末端のペプチドの物理化学的なパラメーターを比較すること
を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記タンパク質の試料は、スピーシーズからのものであると共に、
前記データベースは、前記開裂剤によって発生させられたそのスピーシーズの全てのＣ末端のペプチドの質量及び物理化学的な性質を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記タンパク質は、二つの又はより多くの試料において同時に識別されると共に、
前記方法は、
− ステップ（ａ）において、差異的な標識付けの試薬のセットで修飾を行うこと
− ステップ（ｄ）に先立ち、二つの又はより多くの試料を貯留することの追加的なステップ、
− ステップ（ｆ）に先立ち、前記試料を識別するように標識の本性を識別すること、前記ペプチドが、前記試料に由来すること、
− ステップ（ｇ）において、前記Ｃ末端のペプチドを識別するように、前記開裂剤によって発生させられた全てのＣ末端のペプチドの質量及び物理化学的な性質を含むデータベースと前記精製されたＣ末端のペプチドの前記質量及び前記少なくとも一つの他の物理化学的な性質を比較すること
を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記少なくとも一つの物理化学的な性質は、前記一つの又はより多くのペプチドの精製ステップの間に決定される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記少なくとも一つの物理化学的な性質は、ｐＩ、逆相クロマトグラフィーの間の保持時間、並びに、２８０ｎｍ及び２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収の比の群より選択される、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
ステップ（ａ）における修飾は、第一級アミンとのカルボジイミド反応を使用することで行われる、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
ステップ（ｃ）におけるＣ末端のペプチドの単離は、第一級アミンの基を担持する修飾されたビオチンとのカルボジイミドで媒介された反応を介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させることのステップを含む、方法。
【請求項９】
タンパク質の試料からＣ末端のペプチドを単離するための方法であって、
ａ）第一級アミンとカルボジイミドを介して無処置のタンパク質のカルボキシル基を反応させること、
ｂ）開裂剤で前記無処置のタンパク質をペプチドへと開裂させること、
ｃ）第一級アミンの基を担持するアフィニティータグとカルボジイミドを介してＮ末端の及び内部のペプチドのカルボキシル基を反応させること、
ｄ）親和性マトリックスへ前記タグが付けられたペプチドを結び付けること及び結び付けられてないペプチドを収集すること、前記結び付けられてないペプチドが、タグが付けられてないペプチドであること、それによって（ｂ）の下で得られた前記ペプチドから、前記Ｎ末端の及び内部のペプチドからの前記Ｃ末端のペプチドを単離すること
：のステップを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
前記アフィニティータグは、ビオチンである、方法。
【請求項１１】
開裂剤によってコンピューター内で開裂させられた、生体のタンパク質のＣ末端のペプチドのデータベースにおいて、
各々のペプチドは、
− タンパク質の識別子、
− アミノ酸組成、
− 質量、及び
− 一つの又はより多くの物理化学的な性質
によって特徴付けられる、データベース。
【請求項１２】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
の前記Ｃ末端のペプチドの前記一つの又はより多くの物理化学的な性質は、逆相クロマトグラフィーにおける計算された保持時間、与えられたｐＨにおける正味の電荷、及び前記Ｃ末端のペプチドの等電点からなる群より選択される、データベース。
【請求項１３】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
前記生体は、ヒトである、データベース。
【請求項１４】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
前記開裂剤は、トリプシンである、データベース。
【請求項１５】
請求項１１に記載のデータベースにおいて、
前記タンパク質は、前記開裂剤での不完全な開裂から結果として生じるＣ末端のペプチドを含むと共に、それによって一つの開裂位置が、はずされる、
データベース。
【請求項１６】
タンパク質の識別のための請求項１１に記載のデータベースの使用。
【請求項１７】
一つの又はより多くの試料におけるタンパク質をそれらのＣ末端のペプチドに基づいて識別するためのデバイスであって、
前記デバイスは、少なくとも一つの試料源、少なくとも一つの対応する修飾する薬剤／標識源を備えた、修飾／標識付けのユニット、開裂ユニット、Ｃ末端のペプチドの単離ユニット、ペプチドの分離ユニット、精製されたペプチドの一つの又はより多くの物理化学的な性質を決定する及び／又は登録するための分析ユニット、質量分析計ユニット、制御回路部品及びデータ分析ユニット、及び、前記Ｃ末端のペプチドの物理化学的な性質で注釈が付けられた開裂剤を使用することでコンピューター内において開裂されたタンパク質の全てのＣ末端のペプチドの質量を含むデータベースへの接続を含む、デバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５０３８５２（Ｐ２０１０−５０３８５２Ａ）
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７９３２（Ｐ２００９−５２７９３２）
【出願日】平成１９年９月３日（２００７．９．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０５３５４１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３２２３５
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５９００００２４８）コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ (12,071)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月３日（２００７．９．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０５３５４１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３２２３５
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５９００００２４８）コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ (12,071)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]