ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むかまたは欠く修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼならびにその使用
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼ毒素に、ならびに百日咳の治療のための、および／またはボルデテラ感染に対する防御のための医薬組成物の製造におけるそれらの使用に関する。本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むボルデテラアデニレートシクラーゼの特異的断片、ならびに特にＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該細胞をターゲッティングするためのそれらの使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼ毒素に、ならびに百日咳の治療のためのおよび／またはボルデテラ感染に対する防御のための医薬組成物の製造におけるそれらの使用に関する。本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むボルデテラアデニレートシクラーゼの特異的断片に、ならびに特にＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ボルデテラ属は、4つの種、即ち百日咳菌Bordetella pertussis、パラ百日咳菌Bordetella parapertussis、気管支敗血症菌Bordetella bronchisepticaおよびボルデテラ・アビウムBordetella aviumを含む。
【０００３】
ボルデテラは、呼吸器感染に関与するグラム陰性球桿菌である。百日咳菌およびパラ百日咳菌は、厳密にヒト病原体である。気管支敗血症菌は、種々の哺乳類に対して、そしてより稀にヒトに対して病原性であり、そして百日咳菌およびパラ百日咳菌と相違して、宿主の外側で生存し得る。ボルデテラ・アビウムは、鳥類に対して病原性である。
【０００４】
ヒトに対して最も有毒な種は百日咳菌であり、これは気管支肺炎および吸気性音声により中断される発作性咳により特性化される百日咳、高度接触伝染性小児呼吸器疾患の病因学的作因である。
【０００５】
百日咳に対する予防接種は、不活性化全細菌の助けにより最も普通にこれまで実行されてきた。しかしながらこのようなワクチンは、有毒因子は細菌により分泌されるタンパク質により構成されており、細菌それ自体によって構成されてはいないという事実にかんがみて、常に毒性を欠くというわけではない。したがってタンパク質は、細菌の死亡後でさえ、重篤な病理学的作用を発揮し得る。
【０００６】
欧州特許EP 0 424 158号（Institut Pasteur）は、百日咳菌および気管支敗血症菌の両方に対する防御抗原としてのボルデテラアデニレートシクラーゼの使用を列挙する。
【０００７】
欧州特許EP 0 338 169号（Institut Pasteur）も、百日咳に対する防御抗原としてのパラ百日咳菌からの活性アデニレートシクラーゼ調製物の使用を記載する。
【０００８】
代替的戦略、例えばボルデテラの免疫原性解毒化毒素を用いた無細胞ワクチンの調製も開発されてきた。
【０００９】
解毒化百日咳菌毒素を基礎にしたワクチンの一例は、米国特許第6,040,427号（Locht等、2000）に記載されている。
【００１０】
百日咳菌により産生される種々の毒素の中で、アデニレートシクラーゼ（以後、ＣｙａＡという用語でも言及される）は、気道コロニー形成の早期の間の細菌の毒力戦略における重大な因子である（Goodwin and Weiss, 1990; Khelef et al., 1992）。毒素は、主に好中球およびマクロファージを中毒させて、食細胞無力を引き起こし、マクロファージアポトーシスを誘導することにより、病原体が宿主免疫監視機構を免れさせる（Confer and Eaton, 1982; Gueirard et al., 1998; Harvill et al., 1999; Khelef and Guiso, 1995; Khelef et al., 1993）。百日咳菌の病原性におけるＣｙａＡの役割は、マウス呼吸器モデルで明瞭に実証された。実際、ＣｙａＡの発現を欠く遺伝子修飾百日咳菌株は、肺病変を誘発し、致命的感染を引き起こすそれらの能力を減損された（Khelef et al., 1994; Weiss and Goodwin, 1989）。他方、ＣｙａＡは、マウスモデルにおいて、百日咳菌肺コロニー形成に対する防御免疫を誘導することが示された（Betsou et al., 1993; Betsou et al., 1995; Hormozi et al., 1999）。
【００１１】
ＣｙａＡは、4つの機能性ドメイン：アデニレートシクラーゼ活性（ＡＣ）ドメイン（残基１〜４００）、疎水性チャンネル形成ドメイン（残基５００〜７００）、カルシウム結合富グリシン／アスパラギン酸塩反復ドメイン（残基１０００〜１６００）および分泌シグナルを保有するＣ末端ドメイン（残基１６００〜１７０６）からなる1706アミノ酸残基長ポリペプチドである。ＣｙａＡは、真核生物細胞に侵入し、その触媒ドメインを細胞質中に転位し得るが、この場合、内因性カルモジュリンによる活性化時に、それはｃＡＭＰへのＡＴＰの転化を触媒する（Ladant and Ulmann, 1999）。細胞サイトゾル中のｃＡＭＰの蓄積は、この毒素の毒性作用に関与すると考えられる（Rogel et al., 1991）。この中毒の主要結果は、細胞アポトーシスならびに食細胞能力およびスーパーオキシド産生の変化である（Confer and Eaton, 1982; Khelef et al., 1993; Njamkepo et al., 2000; Pearson et al., 1987）。
【００１２】
百日咳菌アデニレートシクラーゼの全配列は、配列番号１で示される。
【００１３】
気管支敗血症菌アデニレートシクラーゼの全配列は、配列番号３で示される。
【００１４】
ＣｙａＡは、細胞サイトゾル中への触媒ドメインのデリバリーを可能にする転位特異的立体配座を獲得するためにカルシウムを要する（Rogel and Hanski, 1992; Rose et al., 1995）。主にＣｙａＡは不活性プロトキシンであるプロＣｙａＡとして産生され、これは、アシルトランスフェラーゼによる翻訳後修飾後に、ｃｙａＣ遺伝子の産物が活性毒素になる。この共有結合性翻訳後脂肪アシル化は、標的細胞膜を通しての毒素の転位およびその触媒性ＡＣドメインの送達のために、ならびに溶血性陽イオン選択的チャンネルの形成のために必要とされる。プロＣｙａＡのアシル化は、保存的ＲＴＸアシル化部位内に位置する2つの異なる位置Ｌｙｓ−９８３およびＬｙｓ−８６０で起こる（Barry et al., 1991; Hackett et al., 1994）。Ｌｙｓ−８６０のアシル化はＣｙａＡ活性に必要であるとは思われないが、しかしＬｙｓ−９８３のアシル化は重要であることが示されている（Basar et al., 2001）。
【００１５】
ＣｙａＡは、広範囲の細胞型、例えば膜輸送を欠く哺乳類赤血球に浸透する（Bellalou et al., 1990; Gray et al., 1999; Rogel and Hanski, 1992）。これに対比して、ＣｙａＡ毒性作用、例えば食作用能力の阻害およびアポトーシスの誘発は、主に免疫細胞、即ち好中球およびマクロファージに関して解明された（Confer and Eaton, 1982; Khelef et al., 1993）。さらにマウス呼吸器感染において、ＣｙａＡは肺胞マクロファージに対する特異的中毒を表示することが示された（Gueirard et al., 1998）。異種エピトープに固定された百日咳菌により産生された組換えアデニレートシクラーゼ毒素を含むワクチンは、特許公開WO 93/21324（Institut Pasteur, 1993）に記載されている。ＣｙａＡはαMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を介して標的細胞と特異的に結合する、ということが近年実証された。この結合は飽和可能で、抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体により完全に抑制された。ＣｙａＡはＣＤ１１ｂ+細胞に対して選択的細胞傷害性を示したが、このことは、ＣＤ１１ｂとのその相互作用が触媒ドメインの転移とその後のｃＡＭＰ増大および細胞死に必要とされることを示す。さらにＣｙａＡ細胞傷害性に対するＣＨＯ細胞の感受性は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ヘテロ二量体の発現時に劇的に増大された。さらに細胞中への触媒ドメイン転移に必要とされるＣａ2+イオンは、ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用にも断固として必要であった（Guermonprez et al., 2001）。ＣｙａＡと細胞との相互作用の重要性は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞に異種抗原を送達するためのベクターとしてＣｙａＡが用いられる系でさらに実証された。ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−ＣＤ１１ｂhighサブセットの樹状細胞だけが、実際、組換えＣｙａＡ中に挿入されたエピトープに対応するＭＨＣクラスＩペプチド複合体を表示し得た（Guermonprez et al., 2002）。
【００１６】
ＣＤ１１ｂタンパク質は、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）、ＭＡＣ−１（ＣＤ１１ｂ）およびｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ）を含む白血球接着分子であるβ2インテグリンの大ファミリーの一成員である。このファミリーの成員は、β鎖（ＣＤ１８）を有する必須のヘテロ二量体として発現されるそれらのα鎖により異なる（Arnaout, 1990）。補体３型受容体（ＣＲ３）としても既知であるＣＤ１１ｂは、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ＮＫ細胞、腹膜Ｂ−１細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット上で発現される（Arnaout, 1990; Bell et al., 1999）。それは白血球接着機能において重要な役割を演じ、補体被覆粒子の食作用を誘発する（Diamond and Springer, 1993）。ＣＤ１１ｂは、種々のリガンド、例えば細胞内接着分子ＩＣＡＭ−１、フィブリノーゲン、凝固因子Ｘおよび不活性化補体構成成分Ｃ３ｂ（ｉＣ３ｂ）を結合する（Altieri and Edgington, 1988; Beller et al., 1982; Diamond et al., 1990; Wright et al., 1988）。
【００１７】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣｙａＡの結合特性に基づいて、欧州特許出願EP 1188446号（Institut Pasteur）は、樹状細胞に対して当該分子、特に抗原をターゲッティングするための組換えボルデテラア属デニレートシクラーゼを含むタンパク質様ベクターを記載する。
【００１８】
本発明はここで、アミノ酸１１６６〜アミノ酸１２８１に及ぶアミノ酸配列（配列番号２）内に含まれる百日咳菌アデニレートシクラーゼの1つまたは数個の領域が毒素とＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との相互作用のために重要である、という発見を基礎にする。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣｙａＡの結合能力を提供するために必要なこの領域は、副領域として働くＣｙａＡの他の領域とさらに併合され得る。
【００１９】
この発見は、樹状細胞に対して当該分子をターゲッティングし得る効率的且つ万能な分子送達ベクターを調製する機会をもたらす。あるいは、アデニレートシクラーゼの同定されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの欠失は、ボルデテラ感染、特に百日咳菌感染に対する防御のための安全な無細胞ワクチンを設計するために有益に用いられ得る。
【００２０】
本発明は、感染細菌により産生されるネイティブアデニレートシクラーゼと細胞受容体との相互作用を遮断し得る中和抗体を生成するための同定されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの使用も提供する。
【発明の開示】
【００２１】
したがって、１つまたは複数のアミノ酸欠失、置換または挿入によりＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインにおいて修飾されるボルデテラアデニレートシクラーゼからなるタンパク質であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠くが、しかし野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼを認識する抗血清と特異的に反応性であるタンパク質を提供することは、本発明の一目的である。
【００２２】
本発明のタンパク質は、百日咳に対するワクチン中の有効成分として用いられ得る。したがってＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン内の突然変異（単数または複数）は、潜在的陰性作用、例えばトキソイドによるインテグリン嵌入時のシグナル伝達および／または補体受容体ＣＲ３としても役立つＣＤ１１ｂへの結合に関するＣｙａＡトキソイドとの競合のためのなんらかの機能的妨害から免疫細胞を保護する。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも10アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むペプチド結合により連結されるアミノ酸の一本鎖を指す。
【００２４】
「タンパク質」という用語は、本質的に１つまたは複数のポリペプチドからなる高分子を指す。
【００２５】
「ボルデテラアデニレートシクラーゼ」という用語は、本発明内では、ボルデテラ属において天然に合成され、そして肺における細菌コロニー形成の初期相に必須の主要病毒因子であるカルモジュリン依存性アデニレートシクラーゼを包含する。
【００２６】
好ましい一実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトにおける百日咳の作因である百日咳菌アデニレートシクラーゼの修飾により得られる。
【００２７】
百日咳菌では、アデニレートシクラーゼは1706個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号１）の形態で合成され、分泌される。カルモジュリン依存性触媒活性は、最初の400アミノ酸に存在し、このドメインは以後「Ｎ末端触媒ドメイン」と呼ばれる。上記のように、活性であるために、上記のアデニレートシクラーゼ毒素はｃｙａＣ遺伝子産物の同時発現により翻訳後修飾される場合、侵襲性且つ溶血性にされる。
【００２８】
本発明によれば、発現「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン」とは、以下のいずれかを指す：
ａ． 百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ百日咳菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン（配列番号２）、または
ｂ． 最良局所アラインメントを検索するためのアルゴリズムを用いて、ボルデテラ属のアデニレートシクラーゼの配列を百日咳菌のアデニレートシクラーゼの配列と一列に並べることにより同定した場合の、百日咳菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインに対応する上記ボルデテラ属のアデニレートシクラーゼのドメイン。
【００２９】
最良局所アラインメントを検索するためのアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al., 1990）である。
【００３０】
気管支敗血症菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインは、配列番号４により表される。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く」という表現は、本発明のタンパク質が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2発現細胞との結合に関して野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼと競合しないことを意味する。「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2」または「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８」とは、ボルデテラアデニレートシクラーゼの細胞受容体を指す（Guermonprez et al., 2001）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2発現細胞との組換え毒素の特異的結合を評価するための結合検定の例は、以下の実験の部で記載される。本発明のタンパク質は、野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼと比較した場合、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2に対して好ましくは50％未満の結合親和性を有する。最も好ましくは本発明のタンパク質は、10％未満、さらに好ましくは5％未満の検定結合親和性を有する。
【００３２】
本明細書中で以後用いる場合、「ＣＤ１１ｂ発現細胞」という用語は、それらの表面にＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2を発現する細胞に関する。特にこれらの細胞は、顆粒球／好中球、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｔ ＣＤ８＋およびＢ細胞のサブセット、ならびに骨髄系樹状細胞である。
【００３３】
本発明のタンパク質を提供するために、ボルデテラアデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインは、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換により修飾され、その結果生じたタンパク質はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く。
【００３４】
本発明の一実施形態では、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインはその中への一ペプチドの挿入により修飾される。例えば6〜12残基からなる配列が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインに挿入される。
【００３５】
特定の実施形態としては、6〜12個のアミノ酸を含有するペプチドの残基１１６６〜１１６７間または残基１２８１〜１２８２間（数字は野生型百日咳菌アデニレートシクラーゼ中のアミノ酸の位置を示す）挿入により修飾された百日咳菌アデニレートシクラーゼが挙げられる。これらの位置でのＦＬＡＧ配列のエピトープ挿入の例は、以下の実験の部に記載されており、以後、ＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧと呼ばれる。
【００３６】
あるいはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との結合に関与することが示される残基は、欠失されるかまたは非機能性残基により置き換えられ得る。
【００３７】
特定の一実施形態では、ボルデテラアデニレートシクラーゼは、百日咳菌アデニレートシクラーゼ中の残基１２０８から１２４３に及ぶ領域中の、または他のボルデテラアデニレートシクラーゼの対応する領域中の１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換により修飾される。
【００３８】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態としては、１つまたは複数のアミノ酸の欠失または非機能性アミノ酸によるそれらの交換を含有する百日咳菌アデニレートシクラーゼが挙げられる。
【００３９】
好ましい一実施形態では、ボルデテラアデニレートシクラーゼはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの完全欠失により修飾される。
【００４０】
本発明の別の特定の実施形態によれば、百日咳菌アデニレートシクラーゼは位置１２４５から位置１２７３に及ぶアミノ酸の欠失により修飾され、これらのアミノ酸は非機能性アミノ酸、例えば実験の部に例示されるようなオクタペプチドにより任意に交換される（本明細書中では以後、ＣｙａＡΔ１２４５−１２７３と呼ばれる）。
【００４１】
さらに本発明のタンパク質の生体における投与の完全な安全性を保証するために、触媒活性が除去されるよう、ボルデテラアデニレートシクラーゼは修飾される。本発明の一実施形態によれば、ボルデテラアデニレートシクラーゼはＮ末端触媒ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によりさらに修飾され、この場合、上記修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼは、野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼ触媒活性と比較した場合に、低減される触媒活性を有する。好ましくは触媒活性は野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼの触媒活性の10％未満を示し、さらに好ましくは非有意である。
【００４２】
Ｎ末端触媒ドメインにおける突然変異体の例は、当該技術分野で記載されている（例えばWO 93/21324, Institut Pasteurに）。
【００４３】
本発明のタンパク質の実施形態としては、Ｎ末端触媒ドメインの少なくともアミノ酸１〜３００を欠く、好ましくはアミノ酸１〜３７３を欠く修飾ボルデテラ属アデニレートシクラーゼが挙げられる。
【００４４】
あるいは、百日咳菌のアデニレートシクラーゼの残基１８８〜１９０間の、またはその他のボルデテラ属からのアデニレートシクラーゼ中の対応する残基のＡＴＰ結合部位中に、ジペプチド挿入が実行され得る。
【００４５】
ボルデテラアデニレートシクラーゼのアシル化がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合とその後の細胞中への毒素の転移に関与する、ということも本発明において示される。したがって本発明のタンパク質の好ましい一実施形態では、タンパク質はアシル化されない。特にボルデテラアデニレートシクラーゼは、翻訳後にアシル化されるアミノ酸においてさらに修飾される。これらのアミノ酸は、百日咳菌アデニレートシクラーゼのＬｙｓ−９８３およびＬｙｓ−８６０に対応する。
【００４６】
この特定の実施形態では、タンパク質はアデニレートシクラーゼ配列の位置９８３および／または８６０でアシル化されない。
別の実施形態では、本発明のタンパク質はアシル化される。
【００４７】
本発明のタンパク質は、好ましくは免疫原性、さらに実質的に非毒性タンパク質であり、即ち細胞受容体結合に関して、そして任意にアデニレートシクラーゼ活性において少なくとも欠陥があるが、しかし抗アデニレートシクラーゼ毒素抗体により依然として特異的に認識されるタンパク質である。
【００４８】
本発明は、上記のタンパク質を、製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物にも関する。
【００４９】
一実施形態によれば、上記組成物はヒトまたは動物における投与に適したワクチンである。ワクチンは、好ましくは百日咳に対する免疫を誘導し得る。このようなワクチンは、免疫防御および非毒性量の本発明のタンパク質を含む。したがって上記の組成物は、1つまたは数個の適切なプライミング・アジュバントをさらに含み得る。望ましくは本発明のタンパク質とともに投与されることが既知であるその他の抗原も、本発明のワクチンに包含され得る。このような付加的構成成分としては、ボルデテラのその他の既知の防御抗原、破傷風毒素および／またはジフテリア毒素が挙げられる。
【００５０】
当然の帰結として、本発明はさらに、ボルデテラ感染および／またはボルデテラ感染により引き起こされる疾患に関連した症候に対してヒトまたは動物を免疫感作するための方法であって、このようなヒトまたは動物に本発明のワクチンを投与することを包含する方法に関する。
【００５１】
本発明のワクチンの投与経路は、免疫防御量の本発明のタンパク質を宿主に送達する任意の適切な経路であり得る。しかしながらワクチンは、好ましくは筋肉内または皮下経路により非経口的に投与される。その他の投与経路、例えば経口投与またはその他の非経口的経路、即ち皮内、鼻内または静脈内による経路も、所望により用いられ得る。
【００５２】
本発明の別の態様は、百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための薬剤の調製における本発明のタンパク質の使用に関する。
【００５３】
当然の帰結として、本発明はさらに、ボルデテラ感染および／またはボルデテラ感染により引き起こされる疾患に関連した症候に対してヒトまたは動物を治療するための方法であって、このようなヒトまたは動物に本発明の薬剤を投与することを包含する方法に関する。
【００５４】
本発明の別の態様は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンと結合し得るポリペプチドであって、以下の：
ａ． 30〜500アミノ酸、好ましくは50〜300、さらに好ましくは50〜150アミノ酸を有するボルデテラアデニレートシクラーゼの断片であって、上記ボルデテラアデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むか、またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有するのに十分な上記野生型ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの断片を含む断片、
ｂ． 上記断片と少なくとも70％の同一性、好ましくは80％、さらに好ましくは90％の同一性を有する上記断片の変異体であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有する変異体
であるポリペプチドである。
【００５５】
ボルデテラアデニレートシクラーゼは、好ましくは百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支敗血症菌の中から選択され、さらに好ましくは百日咳菌である。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合するための適切な立体配座をとるものの中から選択される。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との最適結合に関与するボルデテラアデニレートシクラーゼのその他の副領域を含み得る。領域は、特に１４１６から１６４８に及ぶ領域中に含まれるアミノ酸配列を包含する。
【００５８】
好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの10〜50アミノ酸の１つまたは複数の断片からなるｂに記載されたような変異体である。例えば好ましい一実施形態では、上記ポリペプチドは、百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１２０８からアミノ酸１２４３に及ぶ百日咳菌アデニレートシクラーゼの領域の10〜50アミノ酸の断片を少なくとも含む。
【００５９】
同一性パーセンテージは、両配列がＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて一列に並べられた場合、野生型配列と同一である変異体配列のアミノ酸のパーセンテージに対応する。「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有する」という表現は、それが一列に並べられ得る野生型対応断片と比較した場合、変異体が少なくとも80％のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する結合親和性を、好ましくは少なくとも90％のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する結合親和性を保有する、ということを意味する。
【００６０】
好ましい一実施形態によれば、上記のポリペプチドは、ボルデテラ野生型アデニレートシクラーゼ、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼを認識する抗血清と特異的に反応性である。さらに好ましくは、上記ポリペプチドは、哺乳類に投与される場合、ボルデテラアデニレートシクラーゼを特異的に認識する抗体を産生し得る。
【００６１】
特定の一実施形態では、上記ポリペプチドは、百日咳菌アデニレートシクラーゼの断片である．別の特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、本質的に百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン、特に百日咳菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン（配列番号２）からなる。
【００６２】
その他の特定の実施形態では、上記ポリペプチドはさらに、ボルデテラアデニレートシクラーゼのアシル化ドメインおよび／または疎水性ドメインを含む。上記アシル化ドメインは、WO 93/21324に記載されたように、配列番号1の残基７００から残基１０００に及ぶ対応する領域に包含され、そしてＬｙｓ９８３および／またはＬｙｓ８６０を含む。疎水性ドメインは、配列番号１の残基５００から残基７００に及ぶ領域に対応する。
【００６３】
好ましくは上記ポリペプチドは、哺乳類にin vivoで投与される場合、有毒でない。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンの結合に関して野生型アデニレートシクラーゼと競合する。
したがって本発明は、百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するためのワクチンまたは医薬の製造における上記のようなポリペプチドの使用に関する。
【００６５】
特に方法は、ボルデテラ感染に対する防御抗体を生成するための本発明の上記ポリペプチドの使用に関する。
【００６６】
アデニレートシクラーゼは樹状細胞に対して異なる抗原をターゲッティングして、特に強力なＣＤ４＋、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成をもたらし得る効率的分子送達ベクターである、ということがすでに報告されている（EP1188446, Institut Pasteur）。
【００６７】
本発明はここで、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して特異的に当該分子をターゲッティングするためのベクターの調製における本発明のポリペプチドの使用に関する。
【００６８】
「特異的に」という用語は、本発明の情況内では、ポリペプチドが、当該分子のためのベクターとして用いられる場合、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの高結合親和性によりＣＤ１１ｂ発現細胞に選択的に向けられ、それにより他の細胞に関して選択的な方法で、上記細胞の表面または上記細胞内で当該分子をターゲッティングするための手段を提供することを意味する。
【００６９】
特に一実施形態では、上記分子またはペプチドのターゲッティングは、in vivoで有効である。その他の実施形態では、上記分子のターゲッティングは、in vitroまたはex vivoで有効である。「in vitro」とは、標的細胞がin vitroで培養される細胞である、ということを意味する。「ex vivo」とは、標的細胞が、生体から抽出された細胞であり、in vitroで培養され、そして生体中に再投与されるよう意図される細胞であることを意味する。
【００７０】
それにより本発明は、ある種の白血球、特に骨髄系樹状細胞、好中球またはマクロファージのターゲッティングを要する動物またはヒト宿主への投与に適した組成物の設計に適切な手段を提供する。
【００７１】
本発明は特に、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクターであって、上記当該分子に結合された上記のようなＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合し得るポリペプチドを含むベクターに関する。
【００７２】
本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をin vitroターゲッティングするための方法であって、以下の：
ａ． 生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞を提供し、
ｂ． 上記ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して上記ベクターをターゲッティングするための適切な条件下で本発明のベクターとともに上記ＣＤ１１ｂ発現細胞を培養する
ことを包含する方法にも関する。
【００７３】
本発明は、上記の方法により得られるような当該分子を含むＣＤ１１ｂ発現細胞も提供する。
【００７４】
本発明によれば、「当該分子」という表現は、任意の分子、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼの断片でない分子を指す。
【００７５】
当該分子は、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、プラスミドおよびコスミドの中からも選択され得る。それらは、ペプチドまたはポリペプチド、特に酵素、補酵素、受容体リガンド、ハプテン、抗原、抗体およびその断片の中からも選択され得る。当然の帰結として、当業者は、所望の用途によって適切な分子を選択する。
【００７６】
当該分子は、薬剤の有効成分、免疫毒素、酸化防止剤、抗生物質、増殖因子、細胞内ホルモン、サイトカイン、毒素、神経伝達物質、抗菌剤、特に抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗寄生生物剤または抗真菌剤、さらに一般的には任意の当該治療薬または予防薬の中から選択され得る。
【００７７】
特定の一実施形態によれば、当該分子は以下の：ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、多糖、オリゴ糖、核酸、脂質および化学物質からなる群の中で選択される。
【００７８】
特定の実施形態では、当該分子は異種抗原またはエピトープであり、「異種」という用語は、ベクターそれ自体の中に含まれるアデニレートシクラーゼ抗原決定因子以外の抗原またはエピトープを指す。
【００７９】
当該分子は、本発明のポリペプチドに結合されて、本発明のベクターを提供する。
本明細書中で用いる場合、「結合される」という用語は、当該分子とポリペプチドの物理的会合を可能にする任意の相互作用を意味する。好ましくは結合は、共有結合である。それは、直接共有結合または接合体を形成するための結合剤の使用による間接結合であり得る。化学結合法は、当該技術分野で周知である。化学結合は、例えばマレイミド、ペプチド、ジスルフィドまたはチオエーテル結合の中から選択され得る。例Ｎ−ピリジルスルホニル活性化スルフヒドリルを用いたジスルフィド結合が用いられ得る。
【００８０】
特定の一方法は、ポリペプチドにリンカーを付加することにあり、上記リンカーは、ジスルフィド結合のために容易に用いられ得る少なくとも１つのシステインからなる。別のアプローチは、ストレプタビジンへの関連する他の分子の結合を可能にするビオチニル部分を化学的に結合することからなる。
【００８１】
異なるシステイン残基とのジスルフィド結合により本発明のポリペプチドに多数の分子が化学結合され得るが、但し、結合はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との相互作用を妨げない。
ＣＤ１１ｂ発現細胞の機能的特性は、これらの特定細胞に対してターゲッティングする薬剤のためのタンパク質様ベクターの製造における本発明の上記ポリペプチドの使用をさらに限定する。この情況において、本発明の特定の一実施形態では、いわゆる当該分子は薬剤の有効成分である。上記有効成分は、本発明のポリペプチドに化学的または遺伝子的に結合され得る。有益には、当該分子は、アデニレートシクラーゼ毒素に結合されると、炎症応答に関与する細胞、例えば好中球の表面に特異的にターゲッティングされる抗炎症薬である。
【００８２】
ＣＤ１１ｂ発現細胞、そしてとくに骨髄系樹状細胞、好中球およびマクロファージは、免疫および生得的防御系の必須機能に、特に炎症および特異的免疫応答に関与し、本発明の好ましい実施形態では、本発明のベクターはＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞応答を初回刺激するようより特定的に設計され、上記応答は、ＣＤ１１ｂ発現細胞、特に骨髄系樹状細胞に対する当該分子のターゲッティングに引き続いて起こる。
【００８３】
この情況では、当該分子は好ましくはエピトープまたは抗原であるか、あるいはそれらを含む。さらに特定的には、当該分子は特に、以下の：例えばポリオウイルス抗原、ＨＩＶウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、エピトープ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、細菌性抗原、結核マイコバクテリア抗原からなる群から選択される抗原であり得る。
【００８４】
したがって本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して抗原またはエピトープをin vivoターゲッティングすることにより、あるいは抽出ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して抗原またはエピトープをex vivoターゲッティングして、その結果生じた細胞を上記患者に再投与することにより、患者におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞応答を初回刺激するための手段を提供する。
【００８５】
したがって本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して抗原またはエピトープをin vitroターゲッティングするための方法であって、以下の：
ａ． 生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞を提供し、
ｂ． 上記ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して上記ベクターをターゲッティングするための適切な条件下で当該分子として抗原またはエピトープを保有する本発明のベクターとともに上記ＣＤ１１ｂ発現細胞を培養する
ことを包含する方法に関する。
【００８６】
好ましくは生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞は、骨髄系樹状細胞である。
本発明は、上記の方法により得られる異種抗原またはエピトープを含むＣＤ１１ｂ発現細胞も提供する。
【００８７】
したがって本発明は、抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質であって、上記の方法により得られる異種抗原またはエピトープを含む効率的量のＣＤ１１ｂ発現細胞を製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含むことを特徴とする物質に関する。
【００８８】
本発明はさらに、抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質の調製における、上記の方法により得られるような上記高原またはエピトープを含むＣＤ１１ｂ発現細胞の使用に関する。
【００８９】
さらに特定的には、本発明は、抗原に対して患者を免疫感作するための方法であって、以下の：
ａ． 上記患者からＣＤ１１ｂ発現細胞を抽出し；
ｂ． 上記細胞に対して上記ベクターをターゲッティングするのに適した条件下で当該分子として抗原またはエピトープを保有する本発明のベクターとともに上記ＣＤ１１ｂ発現細胞をin vitro培養し；
ｃ． 上記ベクターを含む効率的量の上記細胞を上記患者に再投与して、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋応答を初回刺激して、それにより上記抗原に対して上記患者を免疫感作する
ことを包含する方法を提供する。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記ＣＤ１１ｂ発現細胞は骨髄系樹状細胞である。
したがって本発明は、当該分子としてエピトープまたは抗原を保有する本発明のベクターを、製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物にも関する。
【００９１】
一実施形態によれば、上記組成物は、ヒトまたは動物における投与に適したワクチンである。好ましくはワクチンは、ポリオウイルス、ＨＩＶまたはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに対する免疫を誘導し得る。もちろん、誘導される免疫型は、ベクターに保有される選定抗原によっている。別の実施形態では、ワクチンは百日咳に対する免疫を誘導し得る。
【００９２】
このようなワクチンは、免疫防御および非毒性量の本発明のベクターを含む。したがって上記組成物は、適切なプライミングアジュバントをさらに含み得る。
本発明はさらに、病原体感染に対してヒトまたは動物を免疫感作するための方法であって、免疫防御および非毒性量の本発明のベクターを含むワクチンをこのようなヒトまたは動物に投与することを包含する方法に関する。
【００９３】
本発明は、本発明のポリペプチド、タンパク質またはベクターを調製するための方法にも向けられる。特にそれらの手段は、以下のポリペプチドのうちの1つをコードする核酸を含む：
ａ． ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く本発明のタンパク質；
ｂ． ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンと結合し得る本発明のポリペプチド；あるいは
ｃ． ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクター。
【００９４】
特に本発明の核酸は、既知の技法を用いて、例えば遺伝子バンクから遺伝子を単離し、ｍＲＮＡ鋳型から、またはポリメラーゼ連鎖反応により、あるいは臨床的種の単離物から相補的またはｃＤＮＡを作製することにより、任意のボルデテラ菌株の野生型アデニレートシクラーゼをコードするＤＮＡから得られる。代替的には、野生型アデニレートシクラーゼをコードするＤＮＡは、標準ＤＮＡ合成技法により合成され得る。種々のボルデテラ菌株は、商業的保管所から公的に利用可能である。
【００９５】
ボルデテラアデニレートシクラーゼをコードする野生型ＤＮＡの修飾は、慣用的分子生物学技法を用いて、野生型ＤＮＡの遺伝子工学処理により生成され得る。
【００９６】
本発明の別の目的は、宿主細胞中のコードポリペプチドまたはタンパク質の発現に適した発現ベクター中でクローン化される本発明のポリペプチド、タンパク質またはベクターをコードする核酸により構成される組換え核酸に関する。任意に、組換えＤＮＡ分子は、アジュバントのような免疫刺激特性を有する、または本発明のポリペプチドを発現、し、精製しおよび／または処方するのに有用である担体ポリペプチドの付加的コード配列を含む。このコード配列は、本発明の分子をターゲッティングするためのポリペプチド、タンパク質またはベクターのコード配列とともにフレーム内に置かれ得る。
【００９７】
発現ベクターの選択は、もちろん、用いられる宿主によっている。
好ましくは上記発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミドまたはウイルスＤＮＡである。
【００９８】
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に関して欠損がある本発明のタンパク質；上記のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を結合し得るポリペプチド；あるいはＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクターの製造方法であって、対応する当該ポリペプチド、タンパク質またはベクターの発現のために適切な宿主細胞中に上記のような組換え核酸を組入れて；形質転換化組換え細胞を培養し、そして本発明の合成組換えポリペプチド、タンパク質またはベクターを回収する方法にも関する。
【００９９】
本発明の別の態様は、本発明の組換え核酸で形質転換され、したがって上記のような核酸または組換え核酸を含む宿主細胞である。一実施形態では、組換え核酸は、慣用的技法、例えば相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０１００】
本発明の好ましい宿主細胞としては、大腸菌種およびボルデテラ属に属するものが挙げられる。適切であり得るその他の宿主としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母およびその他の細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明は、本発明のポリペプチド、タンパク質、ベクターを用いた、あるいは本発明の組成物を用いた動物またはヒトの免疫感作により得られるポリクローナル血清も包含する。
【０１０２】
好ましい一実施形態では、ポリクローナル血清は、ボルデテラアデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン、好ましくはアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ百日咳菌アデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインからなるポリペプチドで動物またはヒトを免疫感作することにより得られる。
【０１０３】
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含む本発明のポリペプチドに対して特異的に向けられるモノクローナル抗体にも関する。
好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン中に存在するエピトープに対して、好ましくはアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ百日咳菌アデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン中に存在するエピトープに対して向けられる。
【０１０４】
好ましくは上記のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との野生型アデニレートシクラーゼの結合を遮断し得る。遮断は、野生型アデニレートシクラーゼ単独の能力と比較した場合の、上記ポリクローナル血清またはモノクローナル抗体と野生型アデニレートシクラーゼとの混合物のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を評価することにより検定され得る。
【０１０５】
特定の一実施形態では、上記薬剤はボルデテラ感染に対する受動免疫感作を提供する。
ヒト生物体において用いるために、本発明の抗体は、例えば抗体機能を有さないヒト免疫グロブリンの超可変部を上記の技法から得られるモノクローナル免疫グロブリンの超可変部と取り換えることにより、ヒト化され得る。
【０１０６】
例えば抗体をヒト化するための技法は、Waldmann T., June 1991, Science, vol. 252, p. 1657-1662; Winter G. et al, 1993, Immunology Today, vol. 14, No. 6, p. 243-246; Carter et al., May 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 4285-4289; Singer et al., 1 April 1993, Journal of Immunology, vol. 150, No. 7, p. 2844-2857により記載された。
【０１０７】
本発明は、ポリクローナル血清またはモノクローナル血清を、製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物にも関する。
【０１０８】
本発明は、百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における本発明のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体の使用にも関する。
【０１０９】
以下の実験の部は、（ｉ）ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用における翻訳後アシル化の役割、ならびに（ｉｉ）百日咳菌アデニレートシクラーゼ中のＣＤ１１ｂ相互作用ドメインを同定した結果を示す。
【実施例】
【０１１０】
実験の部
Ａ．材料および方法
Ａ．１ ＣｙａＡ由来タンパク質の産生、精製および修飾
宿主としての大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Stratagene, Amsterdam, Netherlands）において、標準プロトコール（Sambrook et al., 1989）に従って、ＤＮＡ操作を実施した。アシル化野生型プロＣｙａＡ（ｐＡＣＴ７）、アシル化野生型ＣｙａＡ（ｐＴ7ＣＡＣＴ１）、ならびに独特のシステイン残基およびＯＶＡエピトープをその触媒ドメイン中に保有する組換え解毒化ＣｙａＡ−Ｅ５−ＣｙｓＯＶＡ（ｐＣＡＣＴ−Ｅ５−ＣｙｓＯｖａ）をコードするプラスミドは、すでに記載されている（Gmira et al., 2001; Guermonprez et al., 2001; Osicka et al., 2000; Sebo et al., 1991）。ＣｙａＡ３７３−１７０６をコードするプラスミド（ｐＴＲＣｙａＡΔ１〜３７３）は、ｐＴＲＣＡＧの誘導体であって（Gmira et al., 2001）、この場合、毒素の触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列（ＮｄｅＩおよびＢｓｔＢＩ間の部位を構成）が欠失され、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎをコードする適切な合成二本鎖オリゴヌクレオチドに取り換えられた。
【０１１１】
ＣｙａＡ製造のためのプロトコールは、他所ですでに記載されている（Karimova et al., 1998）。全てのタンパク質が大腸菌ＢＬＲ株中で発現され（Novagen, Merck KG, Darmstadt, Germany）、そして二段階手法、例えばGuermonprez et al., 2000に記載されているようなＤＥＡＥ−セファロースおよびフェニル−セファロースクロマトグラフィーにより、封入体から95％より大きい均一性（ＳＤＳゲル分析により判定）に精製された。メーカーの使用説明書に従って、精製ＣｙａＡ−Ｅ5−ＣｙｓＯＶＡタンパク質を、スルフヒドリル試薬Ｎ−（６−（ビオチンアミド）ヘキシル）−３‘−（２’−ピリジルジチオ）プロピアミド（ビオチン−ＨＰＤＰ）（Pierce, Bezons, France）を用いてその独特のシステイン残基上に標識した。非反応ビオチン−ＨＰＤＰ試薬を除去するために、ＤＥＡＥ−セファロース上でビオチニル化ＣｙａＡを再精製した。Ladant et al., 1992に記載されたようにＣｙａＡ １−３８４を発現し、精製した。
【０１１２】
全長ＣｙａＡ毒素に関しては141 mM-1cm-1、ＣｙａＡ ３７３−１７０６に関しては113 mM-1cm-1、およびＣｙａＡ １−３８４に関しては28 mM-1cm-1の分子吸光係数を用いて、278 nmでの吸着から分光測光的に毒素濃度を確定した。
【０１１３】
前に限定されたＣｙａＡ分子に沿った許容挿入部位を用いて、ＣｙａＡ−ＦＬＡＧ分子を構築した（Osicka et al., 2000）。合成オクタペプチド挿入物Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysを個々の許容位置に保有した一組の17ＣｙａＡ構築物をわれわれは生成した（Sigma, Saint Quentin Fallavier, France）。これを達成するために、必要なリーディングフレーム中のＦＬＡＧエピトープをコードする3つの二本鎖合成オリゴヌクレオチド対（それぞれ、5’-GTACTGATTATAAAGATGACGATGACAAATCAC＋5’-GTACGTGATTTGTCAT CGTCATCTTTATAATCA、5’-GTACTTATCGATTATAAAGATGACGATGACAAA＋5’-GTACTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCGATAAおよび5’-GTACGTGGATTATAAA GATGACGATGACAAAGC＋5’-GTACGCTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCCAC）（配列番号５〜１０）を、ｃｙａＡ内に予め導入された独特のＢｓｒＧ Ｉ部位中に挿入した（Osicka et al., 2000）。正確な挿入をＤＮＡシーケンシングにより検査し、組換えＣｙａＡ分子を大腸菌中で発現し、精製した。前に記載されたように（Osicka et al., 2000）標的細胞としてヒツジ赤血球を用いて、選定ＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子の侵襲能力を特性化した。
【０１１４】
Ａ．２ 抗ＣｙａＡモノクローナル抗体の産生
ＣｙａＡ毒素（明礬中20 μg）を腹腔内的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを最初に免疫感作した。約2週間間隔で、明礬中のＣｙａＡ10 μgでマウスを3回、追加免疫した。免疫感作プロトコールの間中、マウスを採血し、ＥＬＩＳＡにより抗ＣｙａＡ抗体の存在に関してそれらの血清を試験した。有意の血清力価が検出されたら、最終追加免疫をこれらのマウスに投与し、3日後にそれらの脾臓細胞をＰ３×６３骨髄腫細胞（ATCC, Manassas, USA）と融合させた。ＥＬＩＳＡにより、ＣｙａＡ特異的モノクローナル抗体の産生に関して、生成ハイブリドーマをスクリーニングした。次に高産生性ハイブリドーマを選択し、単一細胞限界希釈によりクローン化し、その後、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて腹水症を作るために用いて、多量の抗ＣｙａＡモノクローナル抗体を生成した。メーカーの使用説明書に従って、Ｔ−ＧｅｌＴＭ精製キット（Pierce, Bezons, France）を用いて、腹水からモノクローナル抗体を精製した。Bio-Radタンパク質検定（Bio-Rad, Marnes la Coquette, France）を用いて、抗体の独活を測定した。これらのモノクローナル抗体の内野2つをこの試験に用いた：即ち、アミノ酸１〜１９０内に局在するエピトープと反応する抗体５Ｇ１２、ならびにアミノ酸１００６〜１７０６内に局在するエピトープと反応する抗体６Ｄ７。
【０１１５】
Ａ．３ 細胞および培養
ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞）、ヒトＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８（ＣＨＯ−ＣＤ１１ｃ）でトランスフェクトされた、またはベクター単独でトランスフェクト化された（ＣＨＯ細胞）チャイニーズハムスター卵巣細胞を、D. Golenbock氏（Boston University School of Medicine, Boston, MA）の御厚意により提供され、前に記載されたようにネオマイシンの存在下で培養した（Ingalls et al., 1998）。
【０１１６】
Ａ．４ 抗体
ヒトＣＤ１１ｂ（ＩＣＲＦ４４、マウスＩｇＧ１、κ）およびヒトＣＤ１１ｃ（Ｂ−Ｌｙ６、マウスＩｇＧ１、κ）に特異的なモノクローナル抗体を、BD Pharmingen（Le Pont de Claix, France）から購入した。
【０１１７】
Ａ．５ 結合検定
Guermonprez et al., 2001に記載されたように、検定を実施した。要するに、2×105細胞を、4.5 mg/mlグルコースを含有するＤＭＥＭ培地（Life Technologies, Cergy Pontoise, France）中の指示濃度のＣｙａＡ分子とともに、氷上で30分間、96ウエル培養プレート中で血清を伴わずにインキュベートした。洗浄後、抗ＣｙａＡ触媒ドメインＭａｂ（５Ｇ１２）または抗ＣｙａＡ反復ドメインＭａｂ（６Ｄ７）を25 μg/mlで付加した。いくつかの実験では、細胞を指示濃度のＣｙａＡ分子とともに氷上で30分間予備インキュベートした。次にＣｙａＡ−ビオチン（30 nM）、抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（2 μg/ml）または抗ＣＤ１１ｃ Ｍａｂ（2 μg/ml）（BD Pharmigen）を、毒素の連続存在下で、別々に付加した。
【０１１８】
洗浄し、上清を除去後に、細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Caltag, Le Perray en Yvelines, France）を用いて、またはストレプタビジン−ＰＥ（BD Pharmingen）を用いて1:300希釈で染色した。最終洗浄後、5 μg/mlのヨウ化プロピジウムの存在下で、ＦＡＣＳｔａｒTM（BDLPCF）上でのフローサイトメトリーにより、細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム排除を基礎にしたゲーティングにより、凝集および死細胞を取り去った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）から結合データを推定し、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡを伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として、あるいは結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表した。最大結合は、（競合体の非存在下でＣｙａＡまたは抗ＣＤ１１ｂとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（培地単独でインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）に対応する。試料結合は、（競合体の存在下でＣｙａＡまたは抗ＣＤ１１ｂとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（培地単独でインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）に対応する。
【０１１９】
Ａ．６ ｃＡＭＰ検定
本質的にGuermonprez et al., 2001に記載されたのと同様に、ＣｙａＡ毒素に曝露された細胞中に蓄積された環状ＡＭＰを実施した。要するに、5×105細胞を、ＤＭＥＭ＋グルコース中の指示濃度のＣｙａＡとともに、37℃で20分間、インキュベートした。洗浄後、細胞サイトゾル中に蓄積されたｃＡＭＰを、0.1 N ＨＣｌを用いた溶解により放出し、120℃で5分間煮沸した。0.1 N ＮａＯＨで中和後、ｃＡＭＰ−ＢＳＡ接合体で予め被覆しておいた微量滴定プレートに試料を付加して、次に抗ｃＡＭＰウサギ抗血清の適切な希釈液とともにインキュベートした。洗浄後、抗ｃＡＭＰ抗体が、アルカリ性ホスファターゼと結合した抗ウサギ抗体とともに明示された。既知のｃＡＭＰ濃度を付加することにより得られる標準曲線との比較から、各試料のｃＡＭＰ含量を確定した。
【０１２０】
Ａ．７ ＣｙａＡ侵襲性活性
Osicka et al., 2000に前に記載されたように、ＣｙａＡ分子の侵襲性活性を確定した。要するに、ヒツジ赤血球を毒素とともに30分間インキュベートし、赤血球中に転位され、細胞外付加トリプシンによる消化に対して防御されるＡＣ活性として、侵襲性活性を測定した。
【０１２１】
Ｂ．結果
Ｂ．１ ＣｙａＡはＣＤ１１ｂ+細胞と特異的に結合し、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂ結合を抑制する
ＣＤ１１ｂとのその相互作用におけるＣｙａＡの生物学的および構造的特性の役割を調べるために、2つの相補的検定；即ち結合検定および競合検定を開発した。結合検定は、ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現するトランスフェクト化ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞）を伴う、または偽トランスフェクト化ＣＨＯ細胞を伴うＣｙａＡ分子のインキュベーションと、その後の、触媒ドメインに特異的な抗ＣｙａＡモノクローナル抗体（５Ｇ１２）を用いた細胞会合毒素の検出にある。図１Ａに示したように、この検定を用いて、ＣＤ１１ｂ+細胞に関してＣｙａＡ結合を特異的に検出した。競合検定では、ＣｙａＡ−ビオチンと競合するそれらの能力、あるいはＣＤ１１ｂ+細胞との抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（Ｍａｂ）結合に関して、異なるＣｙａＡ分子（突然変異体または断片）を試験し得る。ここで、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を異なる濃度のＣｙａＡとともに、氷上で30分間、インキュベートした。次にＣｙａＡの連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチン（30 nM）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（2 μg/ml）を付加し、細胞とのそれらの結合をＦＡＣＳにより評価した。図１Ｂに示したように、ＣｙａＡは、用量依存的に、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂ結合をともに効率的に抑制した。ＣＨＯ細胞により発現されるその特異的受容体（ＣＤ１１ｃ）に関する別のリガンド（抗ＣＤ１１ｃ Ｍａｂ）とＣｙａＡは完全に競合できなかったため、この抑制作用はＣＤ１１ｂに特異的であった（図１Ｃ）。
【０１２２】
Ｂ．２ ＣｙａＡアシル化の欠如はＣＤ１１ｂ+細胞とのその結合に影響を及ぼす
ＣｙａＡはその侵襲性活性を実施し、そして溶血性膜チャンネルを形成するためには翻訳後パルミトイル化を必要とする、ということは十分に確立されているため、アシル化の欠如がＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ相互作用に影響を及ぼすか否かを、われわれは試験した。結合検定において、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、ＣｙａＡまたは非アシル化プロＣｙａＡとともにインキュベートした。抗ＣｙａＡ触媒ドメインＭａｂ（５Ｇ１２）を用いて、結合を評価した。図２Ａに示したように、低濃度では、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡおよびプロＣｙａＡ分子の両方の結合は、アシル化ＣｙａＡのわずかに効率的な結合と、かなり共通点があった。これは、細胞膜とのその相互作用増強、結合のためのＣｙａＡのより良好に適合された立体配座および／またはＣＤ１１ｂ受容体に対するＣｙａＡのより高い親和性のためであり得る。実際、ＣｙａＡ結合と比較して、プロＣｙａＡ結合は実質的により高いプロトキシン濃度で飽和に達した。この観察についての最も簡単な説明は、プロＣｙａＡがＣｙａＡより低親和性でＣＤ１１ｂ細胞と結合する、というものである。高ｐｕｒｏと貴信濃度では、プロＣｙａＡの凝集体および／またはオリゴマーは細胞と結合し、その結果として、より多量のプロＣｙａＡが抗体検出系により結合されることが見出される。これに対比して、対照ＣＨＯ細胞とのＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの極低結合が検出された（図2Ｂ）。
【０１２３】
Ｂ．３ アシル化はＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡの相互作用を安定化する
ＣＤ１１ｂ+細胞との毒素の相互作用におけるＣｙａＡアシル化の役割をさらに分析するために、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との結合に関してＣｙａＡと競合する非アシル化プロＣｙａＡの能力をわれわれは試験した。図３Ａに示したように、アシル化ＣｙａＡと比較した場合、非アシル化プロＣｙａＡは、ＣＤ１１ｂ+細胞との結合に関してビオチニル化ＣｙａＡと競合する能力の有意の低減を示した。抑制の欠如がＣＤ１１ｂとの非効率的相互作用のためであったか否かを確定するために、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との抗ＣＤ１１ｂ結合を遮断するプロＣｙａＡの能力を、われわれは評価した．実際、ＣｙａＡと比較して、プロＣｙａＡはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との抗ＣＤ１１ｂ結合を抑制できなかった（図３Ｂ）。
【０１２４】
ｃＡＭＰの超生理学的産生および細胞中毒がＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ相互作用の結果であるため、次に、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を用いて、これらの毒素機能がＣｙａＡアシル化によるものか否かを、われわれは分析した。予測どおり、アシル化毒素と対照的に、プロＣｙａＡはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞中のいかなるｃＡＭＰ増大も誘導せず（図４Ａ）、そしてこれらの細胞に及ぼす有意の細胞傷害性作用も示さなかった（図４Ｂ）。合わせて考えると、ＣｙａＡのアシル化はＣＤ１１ｂ+細胞との毒素の機能的相互作用のために必要であり、そしてＣＤ１１ｂとのプロＣｙａＡの結合はＣＤ１１ｂ発現細胞に及ぼす細胞傷害性作用を誘発するには不十分である、ということをこれらの結果は明らかに実証する。
【０１２５】
Ｂ．４ 触媒ドメインはＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用を必要としない
帰納的には、ＣｙａＡは個々の活性を保有する2つの主要とメインからなる。Ｎ末端ドメインは、アデニレートシクラーゼ活性を保有し（アミノ酸１〜４００）、一方、カルボキシ末端ヘモリシン部分（アミノ酸４００〜１７０６）は、標的細胞へのＡＣドメインの送達および百日咳菌の溶血活性に関与する。ＣＤ１１ｂ+細胞との結合におけるＣｙａＡの2つの機能性ドメインの役割を調べるために、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合する残基１〜３８４によりコードされる触媒ドメイン、ＣｙａＡ１〜３８４の、ならびに残基３７３〜１７０６によりコードされる溶血性部分ＣｙａＡ３７３〜１７０６の能力を、われわれは試験した。図５Ａに示したように、触媒ドメインはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制できなかったが、一方、ＣｙａＡ３７３〜１７０６は全長ＣｙａＡと同一結合抑制を示した。同様に触媒ドメインは、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂの結合も抑制できなかった（図５Ｂ）。さらに、触媒ドメインに特異的な抗ＣｙａＡ Ｍａｂ（５Ｇ１２）を用いた直接結合検定はＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞の表面とのＣｙａＡ１〜３８４のいかなる有意の会合も明示できなかったが、一方、ＣｙａＡの結合は容易に検出された（図６Ａ）。ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ３７３〜１７０６の直接結合は、ＣｙａＡの最初の200アミノ酸内に位置するエピトープを認識する５Ｇ１２Ｍａｂを用いて検出され得なかったが、しかし反復ドメインに特異的な別の抗ＣｙａＡ Ｍａｂ（６Ｄ７）を用いることにより、明らかに実証された（図６Ｃ）。さらにまたＣｙａＡまたはＣｙａＡ３７３〜１７０６の極弱結合のみが、ＣＤ１１ｂを欠くＣＨＯ細胞に関して６Ｄ７を用いて検出された（図６ＢおよびＤ）。要するに、これらの結果は、触媒ドメインがＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用を必要としないということを、そしてＣｙａＡ／ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインがＣｙａＡ３７３〜１７０６断片中に位置するということを明白に実証する。
【０１２６】
Ｂ．５ ＣＤ１１ｂと相互作用するＣｙａＡドメインはＣｙａＡ反復領域内に位置する
ＣＤ１１ｂと相互作用するＣｙａＡの領域を同定するために、競合検定で試験されたＣ末端領域ＣｙａＡ３７３〜１７０６の異なる亜断片（残基３７３〜１４９０または７００〜１７０６または７００〜１４９０または１００６〜１７０６）を、われわれは発現し、精製した。しかしながらこれらのポリペプチドのうち、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチンの結合と有意なように競合し得るものはない。これは、これらの単離断片が変更された立体配座を取る、という事実のためである。したがってＣｙａＡのＣＤ１１ｂ結合ドメインを配置するための突然変異アプローチを、われわれは用いた。材料および方法の抗で詳述したように、毒性ポリペプチド全体を通した種々の限定位置でのＦＬＡＧエピトープ（アミノ酸配列：DYKDDDDKの）の挿入により、17の異なる修飾ＣｙａＡ分子を構築した。ＣＤ１１ｂ結合ドメインのある位置での異種および高荷電ペプチドの挿入は、ＣＤ１１ｂと相互作用するその能力を崩壊し得る、とわれわれは仮定した。17のＦＬＡＧタグ化ＣｙａＡ分子を発現し、均質に精製して、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチンの結合を抑制する能力に関して試験した（2つの場合（ＣｙａＡΔ５１０〜５１５／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧ）、それぞれＣｙａＡのアミノ酸５１０〜５１５または１２４５〜１２７３を欠失し、挿入ＦＬＡＧエピトープに取り換えた、ということに留意）。図７に示したように、残基１１６６〜１２８１間に位置する3つの異なる部位でのＦＬＡＧエピトープの挿入は、ＣＤ１１ｂとの相互作用を全体的に阻止した。対応する修飾ＣｙａＡは、30 nM濃度で試験した場合、本質的にはＣＤ１１ｂ結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合できなかった。これに対比して、全ての他のＦＬＡＧタグ化組換えＣｙａＡはＣＤ１１ｂ+細胞との結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合し得たが、しかし種々の効率を有した。注目すべきは、タンパク質のカルボキシ末端近くに（即ち、位置１４１６、１６２３および１６４８）挿入されたＦＬＡＧエピトープを有する3つの組換えＣｙａＡ構築物もＣＤ１１ｂ結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合するそれらの能力も部分的に減損された。
【０１２７】
ＣＤ１１ｂと相互作用するＣｙａＡドメインをさらに特性化するために、無傷ＣｙａＡと同様に効率的にＣＤ１１ｂ+細胞を結合することが示された4つの他のＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子のほかに、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制することができなかった3つのＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子に焦点を合わせた．これらのＣｙａＡ分子を再び発現し、精製して均質に近づけ（図８Ａ）、ヒツジ赤血球膜（ＲＢＣ）に浸透する、そして外部に付加されたトリプシンに近づきがたい区画に触媒ドメインをデリバリーするそれらの能力を分析することにより、それらの細胞侵襲活性を調べた。図８Ｂに示したように、ＣｙａＡ１３８７／ＦＬＡＧを除いて、他の全ての試験されたＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子の侵襲活性は、ある程度までＦＬＡＧペプチドの挿入により影響を及ぼされた。赤血球に触媒ドメインを転位するＣｙａＡの能力を反映するＣｙａＡ５２４／ＦＬＡＧの侵襲性活性は、残基５２４でのＦＬＡＧペプチドの挿入により完全に除去された。しかしながらＲＢＣ中に浸透するその他のタンパク質、ＣｙａＡ４２４／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡ７２２／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧの、そして小程度にＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧタンパク質の能力は、共通点があった。
【０１２８】
ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合するこれらの分子の能力を、図９に示したように用量依存的方法で試験した。予測どおり、ＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧタンパク質は、240 nMという高い濃度でさえ、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制することができなかった。これに対比して、他の全てのＣｙａＡ／ＦＬＡＧ構築物は、無傷ＣｙａＡと同様に、用量依存的方法でＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制した。それゆえＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧによる結合の抑制の欠如は、ＲＢＣ上のこれらの構築物の侵襲性活性がＣＤ１１ｂ+細胞と非常に効率的に相互作用したＣｙａＡ４２４／ＦＬＡＧタンパク質の活性に匹敵したため、ＦＬＡＧ挿入により引き起こされる毒素の全般的立体配座崩壊に起因すると考えられなかった。
【０１２９】
要するにこれらの結果は、残基１１６６および１２８１により限定され、2つの保存ＲＴＸ反復ブロックを含むＣｙａＡＲＴＸ反復ドメインの部分（Osicka et al., 2000）は、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ相互作用のために重要であり、それはほとんどＣｙａＡの主要インテグリン結合ドメインを表す、という説得力のある証拠を提供する。
【０１３０】
Ｃ．考察
アデニレートシクラーゼ毒素（ＡＣＴまたはＣｙａＡ）の生物学的活性は、完全に共有結合的翻訳後脂肪アシル化によっている。保存Ｌｙｓ−９８３残基のアシル化の不存在下では、ＣｙａＡはその触媒ドメインを赤血球サイトゾルにデリバリーできず、溶血性チャンネルを形成できない（Barry et al., 1991; Basar et al., 2001 Hackett et al., 1994）。ＣｙａＡは、さまざまな種類の赤血球に検出可能効率で浸透することが示された。しかしながら、その主要標的細胞は、ＣｙａＡに特に感受性である骨髄性細胞、例えば好中球および肺マクロファージであり、ＣｙａＡへの曝露時に無力化され、アポトーシスに委ねられるということが実証された（Confer and Eaton, 1982; Khelef and Guiso, 1995; Khelef et al., 1993）。実際近年、毒素は特定の細胞受容体αMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を有し、これは免疫細胞、例えば好中球、マクロファージまたは樹状細胞上で専ら発現されるということ、そしてＣＤ１１ｂの発現はほとんどＣｙａＡに対するこれらの細胞の高感受性を説明する、ということをわれわれは示した（Guermonprez et al., 2001）。本試験において、ＣｙａＡアシル化はＣＤ１１ｂ+細胞とのその相互作用に主要な役割を演じる、ということを本発明者らは示した。実際、非アシル化プロＣｙａＡはＣｙａＡと同様に効率的にＣＤ１１ｂ+細胞と結合し得るが、しかしそれはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ+細胞との結合に関してアシル化ＣｙａＡと競合するのに不十分であり、これらの細胞との抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ結合を完全に遮断し得た．これは、依然としてＣＤ１１ｂと相互作用しながら、相互作用の性質、特にプロＣｙａＡ−ＣＤ１１ｂ複合体の親和性および／または安定性が成熟ＣｙａＡのＣＤ１１ｂ相互作用に関与するものとは有意に異なる、ということを示唆する。さらにプロＣｙａＡは依然としてＣＤ１１ｂ受容体と結合し得るが、しかしこの相互作用はプロトキシンの膜透過を可能にしない。それゆえ、それがｃＡＭＰへのＡＴＰの転化を触媒し得る細胞サイトゾルへの触媒ドメインのデリバリーに必要とされるＣｙａＡの転位に足る立体配座を付与するために、アシル化が必要とされ得る。
【０１３１】
機能的には、ＣｙａＡは2つの主要ドメインに分けられ得る：即ち、残基１〜４００間に位置するアデニレートシクラーゼ活性ドメインと、残基４００〜１７０６間に位置する溶血活性に関与するものである（Ladant and Ullmann, 1999）。標的細胞との毒素相互作用後、触媒ドメインは、赤血球の形質膜を横断して直接転位され得る。本データは、触媒ドメインがｃＡＭＰへのＡＴＰの転化を食倍することによりＣｙａＡの細胞傷害性活性に重要な役割を演じるが、しかしこのドメインはＣｙａＡがその受容体と結合するためには必要でない、ということを示す。これらの結果はさらに、ＣｙａＡ／ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインがヘモリシン部分に、さらに精確にはＣＤ１１ｂ+細胞との強力作用結合を有する構築物中のＦＬＡＧエピトープの挿入部位により表されるような残基１１６６〜１２８１を含む富グリシン−および富アスパルテートＲＴＸ反復領域の部分に位置する、ということを示す。特に2つのＲＴＸ反復ブロック間に差し挟まれ、残基１２０８〜１２４３を含む予測ループ構造（Osicka et al., 2000）は、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡの相互作用において重要な役割を演じ得た。ＣＤ１１ｂと、それぞれＣｙａＡ１１６６／ＦＬＧＡ、ＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３およびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧ構築物との相互作用の損失は、構造変化によるもので、ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡタンパク質の相互作用に特に関与する帰納的に不可欠なセグメントに選択的に影響を及ぼし得る。これは、ＣＤ１１ｂと結合できない3つの構築物全てが依然として赤血球上の代理検定系において実質的細胞侵襲性活性を示す（無傷ＣｙａＡの20％〜50％）ため、一見信頼できそうであるが、この場合、毒素活性はＣＤ１１ｂとの相互作用によらない。これは、位置１１６６、１２４５および１２８１でのＦＬＡＧ挿入がＣｙａＡの全体的構造を減損せず、むしろＣＤ１１ｂ+細胞と相互作用するそれらの構築物の能力を選択的に除去する、ということを示す。要するにこれらの結果は、ＣｙａＡの残基１１６６〜１２８１がαMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）との毒素相互作用に関与するインテグリン結合ドメインの必須部分を表す、ということを示唆する。
【０１３２】
この結論は、ＣｙａＡの最初の800残基内に挿入されたＦＬＡＧペプチドを有する全てのＣｙａＡ変異体がＣＤ１１ｂとの結合に関してビオチニル化無傷ＣｙａＡと完全に競合する、ということを示す結果により支持される。これに対比して、ＣＤ１１ｂ結合能力は、タンパク質ＣｙａＡ１４１６／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡ／ＦＬＡＧ１６２３およびＣｙａＡ／ＦＬＡＧ１６４８に関しても多少低減されたが、このことは、ＣｙａＡの副ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインが毒素のＲＴＸ反復部分のカルボキシ末端に向けて配置され得る、ということを示唆する。
【０１３３】
ＣｙａＡの主要ＣＤ１１ｂ結合モチーフとして領域１１６６〜１２８７を同定する本結果は、ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡの結合が厳密にカルシウム依存性であったという従来の観察に関する興味深い説明を提供する（Guermonprez et al., 2001）。ＲＴＸドメインはカルシウム結合に関与し、カルシウム結合時に主要構造再配列を受ける（Rose et al., 1995）ので、領域１１６６〜１２８７に存在するＣＤ１１ｂ結合モチーフはＲＴＸドメインのカルシウム結合立体配座においてのみ曝露され得る、と推測され得る。ＣｙａＡのアミノ酸領域１１６６〜１２８７内のここで同定されたＣＤ１１ｂ結合モチーフは、ＲＴＸ反復の第二および第三ブロック間に正確に局在される。このセグメントのαらせん構造がＣＤ１１ｂに関するドッキング部位の形成に関与する、と仮定し得る。
【０１３４】
ＣｙａＡは、百日咳のマウスモデルにおけるいくつかの受動的および能動的防御プロトコールに用いられてきた。抗ＣｙａＡ特異的抗体を用いた、または精製ＣｙａＡを用いた免疫感作は、百日咳菌による気道コロニー形成の時間経過を低減し、そして致死的鼻内感染に対してマウスを防御した（Guiso et al., 1989; Guiso et al., 1991）。さらにＣｙａＡに特異的な抗体は、百日咳菌に感染したヒト乳児の血清中に検出された（Arciniega et al., 1991; Guiso et al., 1993）。本結果は、ＣｙａＡ／ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインを欠くＣｙａＡ分子が百日咳菌感染に対する防御のための安全無細胞ワクチンとして製造するために設計され得る、ということを示唆する。このような分子の触媒活性は、ＣｙａＡの残基１８８および１８９間に位置するＡＴＰ結合部位内のジペプチド挿入により容易に不活性化され得る（Fayolle et al., 1996）が、一方、ＣＤ１１ｂ相互作用ドメイン内の欠失は、潜在的陰性作用、例えばトキソイドによるインテグリン嵌入時のシグナル伝達および／または補体受容体ＣＲ３としても役立つＣＤ１１ｂへの結合に関するＣｙａＡトキソイドとの競合のためのなんらかの機能的妨害から免疫細胞を保護し得る。
【０１３５】
要するに、本発明のデータは、ＣＤ１１ｂ+細胞とのその相互作用における、ならびにその後のこの相互作用により誘発される生物学的活性における、百日咳菌のアデニレートシクラーゼのアシル化の、および異なるドメインの役割に重要な新規の洞察を提供する。
【０１３６】
【化１】
【０１３７】
【化２】
【０１３８】
【化３】
【０１３９】
【化４】
【０１４０】
【化５】
【０１４１】
【化６】
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１． ＣｙａＡはＣＤ１１ｂ細胞と特異的に結合し、そしてこれらの細胞と結合するＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体をともに抑制する （Ａ）ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、指示濃度のＣｙａＡとともにインキュベートした。抗ＣｙａＡ Ｍａｂ（５Ｇ１２）を用いたＦＡＣＳにより、表面結合ＣｙａＡを検出した。結果は、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡを伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として表わされ、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。 （Ｂ）ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、指示濃度のＣｙａＡとともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡ−ビオチン（30 nM）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（2 μg/ml）を毒素の連続存在下で別々に付加して、ＦＡＣＳによりそれらの結合を測定した。 （Ｃ）指示濃度のＣｙａＡとともに予備インキュベーション後、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞またはＣＨＯ−ＣＤ１１ｃ細胞を、毒素の連続存在下で、それぞれ抗ＣＤ１１ｂまたは抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体とともにインキュベートした。次に、ＦＡＣＳにより抗体結合を確定した。 （Ｂ）および（Ｃ）に関しては、結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図２】図２． ＣＨＯトランスフェクト体へのＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの直接結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞（Ａ）またはＣＨＯ細胞（Ｂ）を指示濃度のＣｙａＡまたはプロＣｙａＡとともにインキュベートした。抗−ＣｙａＡ Ｍａｂ（５Ｇ１２）を用いて、表面結合ＣｙａＡを検出した。結果は、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡを伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として表わされ、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図３】図３． ＣｙａＡアシル化はＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との安定会合のために必要である ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を指示濃度のＣｙａＡまたはプロＣｙａＡとともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチン（Ａ）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（Ｂ）を付加した。ＦＡＣＳにより、表面結合ＣｙａＡ−ビオチンまたは抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂを測定した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図４】図４． ＣｙａＡアシル化はＣｙａＡ誘導性ｃＡＭＰ蓄積および細胞傷害性に必要である ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、37℃で20分間、指示濃度でのＣｙａＡまたはプロＣｙａＡとともにインキュベートした。次に細胞を溶解し、ｃＡＭＰを測定した（Ａ）。平行して、指示濃度のＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの存在下で37℃で4時間のＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞のインキュベーション後に培地中に放出されるラクテートデヒドロゲナーゼの量を測定することにより、毒性を確定した（Ｂ）。結果は、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図５】図５． 触媒ドメインはＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ相互作用のために必要でない ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を指示濃度のＣｙａＡ、ＣｙａＡ １−３８４またはＣｙａＡ ３７３−１７０６とともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡ−ビオチン（Ａ）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（Ｂ）とともに細胞をインキュベートした。ＦＡＣＳにより、ＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂの結合を測定した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図６】図６． ＣＤ１１ｂ細胞へのＣｙａＡ断片の直接結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞（Ａ、Ｃ）またはＣＨＯ細胞（Ｂ、Ｄ）を指示濃度のＣｙａＡ、ＣｙａＡ １−３８４およびＣｙａＡ ３７３−１７０６とともにインキュベートした。次に、触媒ドメインを認識する抗−ＣｙａＡ 5Ｇ１２ Ｍａｂ（Ａ）、または反復ドメインを認識する抗ＣｙａＡ ６Ｄ７ Ｍａｂ（Ｃ、Ｄ）を用いて、表面結合ＣｙａＡを検出した。結果は、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡまたはＣｙａＡ断片とともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡまたはＣｙａＡ断片を伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として表わされ、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図７】図７． ＣｙａＡ−ＦＬＡＧ突然変異体の存在下でのＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞をＣｙａＡまたはＣｙａＡ ＦＬＡＧ突然変異体（30 nM）とともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡまたはＣｙａＡ−ＦＬＡＧ分子の連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチンを付加した。ストレプタビジン−ＰＥを用いたＦＡＣＳにより、表面結合ＣｙａＡ−ビオチンを検出した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図８】図８． 精製ＣｙａＡ調製物のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析ならびに赤血球に及ぼすそれらの侵襲性活性 （Ａ）ＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子を野生型ＣｙａＡと一緒に、前に記載されたようにＤＥＡＥ−およびフェニルセファロースクロマトグラフィーにより尿素抽出物から精製した（Karimova et al., 1998）。クーマシーブルーで染色した7.5％アクリルアミドゲル上で、約3 μgの各タンパク質を分析した。（Ｂ）ヒツジ赤血球に及ぼすＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子の侵襲性活性。2 μgの種々のＣｙａＡタンパク質を5×108個の洗浄ヒツジ赤血球とともに30分間インキュベートし、細胞中に転位されたＡＣ活性の量を前に記載されたように確定した（Osicka et al., 2000）。値は、二重反復実験（ｎ＝6）で実施された3つの実験からの平均を表す。
【図９】図９． ＣｙａＡ−ＦＬＡＧ突然変異体の存在下でのＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、7.5 nM〜240 nMの範囲の種々の濃度でのＣｙａＡまたはＣｙａＡ ＦＬＡＧ突然変異体とともに予備インキュベートした。ＣｙａＡ分子の連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチンを付加し、表面結合ＣｙａＡ−ビオチンを明示した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼ毒素に、ならびに百日咳の治療のためのおよび／またはボルデテラ感染に対する防御のための医薬組成物の製造におけるそれらの使用に関する。本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むボルデテラアデニレートシクラーゼの特異的断片に、ならびに特にＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ボルデテラ属は、4つの種、即ち百日咳菌Bordetella pertussis、パラ百日咳菌Bordetella parapertussis、気管支敗血症菌Bordetella bronchisepticaおよびボルデテラ・アビウムBordetella aviumを含む。
【０００３】
ボルデテラは、呼吸器感染に関与するグラム陰性球桿菌である。百日咳菌およびパラ百日咳菌は、厳密にヒト病原体である。気管支敗血症菌は、種々の哺乳類に対して、そしてより稀にヒトに対して病原性であり、そして百日咳菌およびパラ百日咳菌と相違して、宿主の外側で生存し得る。ボルデテラ・アビウムは、鳥類に対して病原性である。
【０００４】
ヒトに対して最も有毒な種は百日咳菌であり、これは気管支肺炎および吸気性音声により中断される発作性咳により特性化される百日咳、高度接触伝染性小児呼吸器疾患の病因学的作因である。
【０００５】
百日咳に対する予防接種は、不活性化全細菌の助けにより最も普通にこれまで実行されてきた。しかしながらこのようなワクチンは、有毒因子は細菌により分泌されるタンパク質により構成されており、細菌それ自体によって構成されてはいないという事実にかんがみて、常に毒性を欠くというわけではない。したがってタンパク質は、細菌の死亡後でさえ、重篤な病理学的作用を発揮し得る。
【０００６】
欧州特許EP 0 424 158号（Institut Pasteur）は、百日咳菌および気管支敗血症菌の両方に対する防御抗原としてのボルデテラアデニレートシクラーゼの使用を列挙する。
【０００７】
欧州特許EP 0 338 169号（Institut Pasteur）も、百日咳に対する防御抗原としてのパラ百日咳菌からの活性アデニレートシクラーゼ調製物の使用を記載する。
【０００８】
代替的戦略、例えばボルデテラの免疫原性解毒化毒素を用いた無細胞ワクチンの調製も開発されてきた。
【０００９】
解毒化百日咳菌毒素を基礎にしたワクチンの一例は、米国特許第6,040,427号（Locht等、2000）に記載されている。
【００１０】
百日咳菌により産生される種々の毒素の中で、アデニレートシクラーゼ（以後、ＣｙａＡという用語でも言及される）は、気道コロニー形成の早期の間の細菌の毒力戦略における重大な因子である（Goodwin and Weiss, 1990; Khelef et al., 1992）。毒素は、主に好中球およびマクロファージを中毒させて、食細胞無力を引き起こし、マクロファージアポトーシスを誘導することにより、病原体が宿主免疫監視機構を免れさせる（Confer and Eaton, 1982; Gueirard et al., 1998; Harvill et al., 1999; Khelef and Guiso, 1995; Khelef et al., 1993）。百日咳菌の病原性におけるＣｙａＡの役割は、マウス呼吸器モデルで明瞭に実証された。実際、ＣｙａＡの発現を欠く遺伝子修飾百日咳菌株は、肺病変を誘発し、致命的感染を引き起こすそれらの能力を減損された（Khelef et al., 1994; Weiss and Goodwin, 1989）。他方、ＣｙａＡは、マウスモデルにおいて、百日咳菌肺コロニー形成に対する防御免疫を誘導することが示された（Betsou et al., 1993; Betsou et al., 1995; Hormozi et al., 1999）。
【００１１】
ＣｙａＡは、4つの機能性ドメイン：アデニレートシクラーゼ活性（ＡＣ）ドメイン（残基１〜４００）、疎水性チャンネル形成ドメイン（残基５００〜７００）、カルシウム結合富グリシン／アスパラギン酸塩反復ドメイン（残基１０００〜１６００）および分泌シグナルを保有するＣ末端ドメイン（残基１６００〜１７０６）からなる1706アミノ酸残基長ポリペプチドである。ＣｙａＡは、真核生物細胞に侵入し、その触媒ドメインを細胞質中に転位し得るが、この場合、内因性カルモジュリンによる活性化時に、それはｃＡＭＰへのＡＴＰの転化を触媒する（Ladant and Ulmann, 1999）。細胞サイトゾル中のｃＡＭＰの蓄積は、この毒素の毒性作用に関与すると考えられる（Rogel et al., 1991）。この中毒の主要結果は、細胞アポトーシスならびに食細胞能力およびスーパーオキシド産生の変化である（Confer and Eaton, 1982; Khelef et al., 1993; Njamkepo et al., 2000; Pearson et al., 1987）。
【００１２】
百日咳菌アデニレートシクラーゼの全配列は、配列番号１で示される。
【００１３】
気管支敗血症菌アデニレートシクラーゼの全配列は、配列番号３で示される。
【００１４】
ＣｙａＡは、細胞サイトゾル中への触媒ドメインのデリバリーを可能にする転位特異的立体配座を獲得するためにカルシウムを要する（Rogel and Hanski, 1992; Rose et al., 1995）。主にＣｙａＡは不活性プロトキシンであるプロＣｙａＡとして産生され、これは、アシルトランスフェラーゼによる翻訳後修飾後に、ｃｙａＣ遺伝子の産物が活性毒素になる。この共有結合性翻訳後脂肪アシル化は、標的細胞膜を通しての毒素の転位およびその触媒性ＡＣドメインの送達のために、ならびに溶血性陽イオン選択的チャンネルの形成のために必要とされる。プロＣｙａＡのアシル化は、保存的ＲＴＸアシル化部位内に位置する2つの異なる位置Ｌｙｓ−９８３およびＬｙｓ−８６０で起こる（Barry et al., 1991; Hackett et al., 1994）。Ｌｙｓ−８６０のアシル化はＣｙａＡ活性に必要であるとは思われないが、しかしＬｙｓ−９８３のアシル化は重要であることが示されている（Basar et al., 2001）。
【００１５】
ＣｙａＡは、広範囲の細胞型、例えば膜輸送を欠く哺乳類赤血球に浸透する（Bellalou et al., 1990; Gray et al., 1999; Rogel and Hanski, 1992）。これに対比して、ＣｙａＡ毒性作用、例えば食作用能力の阻害およびアポトーシスの誘発は、主に免疫細胞、即ち好中球およびマクロファージに関して解明された（Confer and Eaton, 1982; Khelef et al., 1993）。さらにマウス呼吸器感染において、ＣｙａＡは肺胞マクロファージに対する特異的中毒を表示することが示された（Gueirard et al., 1998）。異種エピトープに固定された百日咳菌により産生された組換えアデニレートシクラーゼ毒素を含むワクチンは、特許公開WO 93/21324（Institut Pasteur, 1993）に記載されている。ＣｙａＡはαMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を介して標的細胞と特異的に結合する、ということが近年実証された。この結合は飽和可能で、抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体により完全に抑制された。ＣｙａＡはＣＤ１１ｂ+細胞に対して選択的細胞傷害性を示したが、このことは、ＣＤ１１ｂとのその相互作用が触媒ドメインの転移とその後のｃＡＭＰ増大および細胞死に必要とされることを示す。さらにＣｙａＡ細胞傷害性に対するＣＨＯ細胞の感受性は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ヘテロ二量体の発現時に劇的に増大された。さらに細胞中への触媒ドメイン転移に必要とされるＣａ2+イオンは、ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用にも断固として必要であった（Guermonprez et al., 2001）。ＣｙａＡと細胞との相互作用の重要性は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞に異種抗原を送達するためのベクターとしてＣｙａＡが用いられる系でさらに実証された。ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−ＣＤ１１ｂhighサブセットの樹状細胞だけが、実際、組換えＣｙａＡ中に挿入されたエピトープに対応するＭＨＣクラスＩペプチド複合体を表示し得た（Guermonprez et al., 2002）。
【００１６】
ＣＤ１１ｂタンパク質は、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）、ＭＡＣ−１（ＣＤ１１ｂ）およびｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ）を含む白血球接着分子であるβ2インテグリンの大ファミリーの一成員である。このファミリーの成員は、β鎖（ＣＤ１８）を有する必須のヘテロ二量体として発現されるそれらのα鎖により異なる（Arnaout, 1990）。補体３型受容体（ＣＲ３）としても既知であるＣＤ１１ｂは、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ＮＫ細胞、腹膜Ｂ−１細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット上で発現される（Arnaout, 1990; Bell et al., 1999）。それは白血球接着機能において重要な役割を演じ、補体被覆粒子の食作用を誘発する（Diamond and Springer, 1993）。ＣＤ１１ｂは、種々のリガンド、例えば細胞内接着分子ＩＣＡＭ−１、フィブリノーゲン、凝固因子Ｘおよび不活性化補体構成成分Ｃ３ｂ（ｉＣ３ｂ）を結合する（Altieri and Edgington, 1988; Beller et al., 1982; Diamond et al., 1990; Wright et al., 1988）。
【００１７】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣｙａＡの結合特性に基づいて、欧州特許出願EP 1188446号（Institut Pasteur）は、樹状細胞に対して当該分子、特に抗原をターゲッティングするための組換えボルデテラア属デニレートシクラーゼを含むタンパク質様ベクターを記載する。
【００１８】
本発明はここで、アミノ酸１１６６〜アミノ酸１２８１に及ぶアミノ酸配列（配列番号２）内に含まれる百日咳菌アデニレートシクラーゼの1つまたは数個の領域が毒素とＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との相互作用のために重要である、という発見を基礎にする。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣｙａＡの結合能力を提供するために必要なこの領域は、副領域として働くＣｙａＡの他の領域とさらに併合され得る。
【００１９】
この発見は、樹状細胞に対して当該分子をターゲッティングし得る効率的且つ万能な分子送達ベクターを調製する機会をもたらす。あるいは、アデニレートシクラーゼの同定されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの欠失は、ボルデテラ感染、特に百日咳菌感染に対する防御のための安全な無細胞ワクチンを設計するために有益に用いられ得る。
【００２０】
本発明は、感染細菌により産生されるネイティブアデニレートシクラーゼと細胞受容体との相互作用を遮断し得る中和抗体を生成するための同定されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの使用も提供する。
【発明の開示】
【００２１】
したがって、１つまたは複数のアミノ酸欠失、置換または挿入によりＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインにおいて修飾されるボルデテラアデニレートシクラーゼからなるタンパク質であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠くが、しかし野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼを認識する抗血清と特異的に反応性であるタンパク質を提供することは、本発明の一目的である。
【００２２】
本発明のタンパク質は、百日咳に対するワクチン中の有効成分として用いられ得る。したがってＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン内の突然変異（単数または複数）は、潜在的陰性作用、例えばトキソイドによるインテグリン嵌入時のシグナル伝達および／または補体受容体ＣＲ３としても役立つＣＤ１１ｂへの結合に関するＣｙａＡトキソイドとの競合のためのなんらかの機能的妨害から免疫細胞を保護する。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも10アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むペプチド結合により連結されるアミノ酸の一本鎖を指す。
【００２４】
「タンパク質」という用語は、本質的に１つまたは複数のポリペプチドからなる高分子を指す。
【００２５】
「ボルデテラアデニレートシクラーゼ」という用語は、本発明内では、ボルデテラ属において天然に合成され、そして肺における細菌コロニー形成の初期相に必須の主要病毒因子であるカルモジュリン依存性アデニレートシクラーゼを包含する。
【００２６】
好ましい一実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトにおける百日咳の作因である百日咳菌アデニレートシクラーゼの修飾により得られる。
【００２７】
百日咳菌では、アデニレートシクラーゼは1706個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号１）の形態で合成され、分泌される。カルモジュリン依存性触媒活性は、最初の400アミノ酸に存在し、このドメインは以後「Ｎ末端触媒ドメイン」と呼ばれる。上記のように、活性であるために、上記のアデニレートシクラーゼ毒素はｃｙａＣ遺伝子産物の同時発現により翻訳後修飾される場合、侵襲性且つ溶血性にされる。
【００２８】
本発明によれば、発現「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン」とは、以下のいずれかを指す：
ａ． 百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ百日咳菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン（配列番号２）、または
ｂ． 最良局所アラインメントを検索するためのアルゴリズムを用いて、ボルデテラ属のアデニレートシクラーゼの配列を百日咳菌のアデニレートシクラーゼの配列と一列に並べることにより同定した場合の、百日咳菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインに対応する上記ボルデテラ属のアデニレートシクラーゼのドメイン。
【００２９】
最良局所アラインメントを検索するためのアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al., 1990）である。
【００３０】
気管支敗血症菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインは、配列番号４により表される。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く」という表現は、本発明のタンパク質が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2発現細胞との結合に関して野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼと競合しないことを意味する。「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2」または「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８」とは、ボルデテラアデニレートシクラーゼの細胞受容体を指す（Guermonprez et al., 2001）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2発現細胞との組換え毒素の特異的結合を評価するための結合検定の例は、以下の実験の部で記載される。本発明のタンパク質は、野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼと比較した場合、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2に対して好ましくは50％未満の結合親和性を有する。最も好ましくは本発明のタンパク質は、10％未満、さらに好ましくは5％未満の検定結合親和性を有する。
【００３２】
本明細書中で以後用いる場合、「ＣＤ１１ｂ発現細胞」という用語は、それらの表面にＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αmβ2を発現する細胞に関する。特にこれらの細胞は、顆粒球／好中球、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｔ ＣＤ８＋およびＢ細胞のサブセット、ならびに骨髄系樹状細胞である。
【００３３】
本発明のタンパク質を提供するために、ボルデテラアデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインは、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換により修飾され、その結果生じたタンパク質はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く。
【００３４】
本発明の一実施形態では、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインはその中への一ペプチドの挿入により修飾される。例えば6〜12残基からなる配列が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインに挿入される。
【００３５】
特定の実施形態としては、6〜12個のアミノ酸を含有するペプチドの残基１１６６〜１１６７間または残基１２８１〜１２８２間（数字は野生型百日咳菌アデニレートシクラーゼ中のアミノ酸の位置を示す）挿入により修飾された百日咳菌アデニレートシクラーゼが挙げられる。これらの位置でのＦＬＡＧ配列のエピトープ挿入の例は、以下の実験の部に記載されており、以後、ＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧと呼ばれる。
【００３６】
あるいはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との結合に関与することが示される残基は、欠失されるかまたは非機能性残基により置き換えられ得る。
【００３７】
特定の一実施形態では、ボルデテラアデニレートシクラーゼは、百日咳菌アデニレートシクラーゼ中の残基１２０８から１２４３に及ぶ領域中の、または他のボルデテラアデニレートシクラーゼの対応する領域中の１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換により修飾される。
【００３８】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態としては、１つまたは複数のアミノ酸の欠失または非機能性アミノ酸によるそれらの交換を含有する百日咳菌アデニレートシクラーゼが挙げられる。
【００３９】
好ましい一実施形態では、ボルデテラアデニレートシクラーゼはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの完全欠失により修飾される。
【００４０】
本発明の別の特定の実施形態によれば、百日咳菌アデニレートシクラーゼは位置１２４５から位置１２７３に及ぶアミノ酸の欠失により修飾され、これらのアミノ酸は非機能性アミノ酸、例えば実験の部に例示されるようなオクタペプチドにより任意に交換される（本明細書中では以後、ＣｙａＡΔ１２４５−１２７３と呼ばれる）。
【００４１】
さらに本発明のタンパク質の生体における投与の完全な安全性を保証するために、触媒活性が除去されるよう、ボルデテラアデニレートシクラーゼは修飾される。本発明の一実施形態によれば、ボルデテラアデニレートシクラーゼはＮ末端触媒ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によりさらに修飾され、この場合、上記修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼは、野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼ触媒活性と比較した場合に、低減される触媒活性を有する。好ましくは触媒活性は野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼの触媒活性の10％未満を示し、さらに好ましくは非有意である。
【００４２】
Ｎ末端触媒ドメインにおける突然変異体の例は、当該技術分野で記載されている（例えばWO 93/21324, Institut Pasteurに）。
【００４３】
本発明のタンパク質の実施形態としては、Ｎ末端触媒ドメインの少なくともアミノ酸１〜３００を欠く、好ましくはアミノ酸１〜３７３を欠く修飾ボルデテラ属アデニレートシクラーゼが挙げられる。
【００４４】
あるいは、百日咳菌のアデニレートシクラーゼの残基１８８〜１９０間の、またはその他のボルデテラ属からのアデニレートシクラーゼ中の対応する残基のＡＴＰ結合部位中に、ジペプチド挿入が実行され得る。
【００４５】
ボルデテラアデニレートシクラーゼのアシル化がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合とその後の細胞中への毒素の転移に関与する、ということも本発明において示される。したがって本発明のタンパク質の好ましい一実施形態では、タンパク質はアシル化されない。特にボルデテラアデニレートシクラーゼは、翻訳後にアシル化されるアミノ酸においてさらに修飾される。これらのアミノ酸は、百日咳菌アデニレートシクラーゼのＬｙｓ−９８３およびＬｙｓ−８６０に対応する。
【００４６】
この特定の実施形態では、タンパク質はアデニレートシクラーゼ配列の位置９８３および／または８６０でアシル化されない。
別の実施形態では、本発明のタンパク質はアシル化される。
【００４７】
本発明のタンパク質は、好ましくは免疫原性、さらに実質的に非毒性タンパク質であり、即ち細胞受容体結合に関して、そして任意にアデニレートシクラーゼ活性において少なくとも欠陥があるが、しかし抗アデニレートシクラーゼ毒素抗体により依然として特異的に認識されるタンパク質である。
【００４８】
本発明は、上記のタンパク質を、製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物にも関する。
【００４９】
一実施形態によれば、上記組成物はヒトまたは動物における投与に適したワクチンである。ワクチンは、好ましくは百日咳に対する免疫を誘導し得る。このようなワクチンは、免疫防御および非毒性量の本発明のタンパク質を含む。したがって上記の組成物は、1つまたは数個の適切なプライミング・アジュバントをさらに含み得る。望ましくは本発明のタンパク質とともに投与されることが既知であるその他の抗原も、本発明のワクチンに包含され得る。このような付加的構成成分としては、ボルデテラのその他の既知の防御抗原、破傷風毒素および／またはジフテリア毒素が挙げられる。
【００５０】
当然の帰結として、本発明はさらに、ボルデテラ感染および／またはボルデテラ感染により引き起こされる疾患に関連した症候に対してヒトまたは動物を免疫感作するための方法であって、このようなヒトまたは動物に本発明のワクチンを投与することを包含する方法に関する。
【００５１】
本発明のワクチンの投与経路は、免疫防御量の本発明のタンパク質を宿主に送達する任意の適切な経路であり得る。しかしながらワクチンは、好ましくは筋肉内または皮下経路により非経口的に投与される。その他の投与経路、例えば経口投与またはその他の非経口的経路、即ち皮内、鼻内または静脈内による経路も、所望により用いられ得る。
【００５２】
本発明の別の態様は、百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための薬剤の調製における本発明のタンパク質の使用に関する。
【００５３】
当然の帰結として、本発明はさらに、ボルデテラ感染および／またはボルデテラ感染により引き起こされる疾患に関連した症候に対してヒトまたは動物を治療するための方法であって、このようなヒトまたは動物に本発明の薬剤を投与することを包含する方法に関する。
【００５４】
本発明の別の態様は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンと結合し得るポリペプチドであって、以下の：
ａ． 30〜500アミノ酸、好ましくは50〜300、さらに好ましくは50〜150アミノ酸を有するボルデテラアデニレートシクラーゼの断片であって、上記ボルデテラアデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むか、またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有するのに十分な上記野生型ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの断片を含む断片、
ｂ． 上記断片と少なくとも70％の同一性、好ましくは80％、さらに好ましくは90％の同一性を有する上記断片の変異体であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有する変異体
であるポリペプチドである。
【００５５】
ボルデテラアデニレートシクラーゼは、好ましくは百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支敗血症菌の中から選択され、さらに好ましくは百日咳菌である。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合するための適切な立体配座をとるものの中から選択される。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との最適結合に関与するボルデテラアデニレートシクラーゼのその他の副領域を含み得る。領域は、特に１４１６から１６４８に及ぶ領域中に含まれるアミノ酸配列を包含する。
【００５８】
好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの10〜50アミノ酸の１つまたは複数の断片からなるｂに記載されたような変異体である。例えば好ましい一実施形態では、上記ポリペプチドは、百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１２０８からアミノ酸１２４３に及ぶ百日咳菌アデニレートシクラーゼの領域の10〜50アミノ酸の断片を少なくとも含む。
【００５９】
同一性パーセンテージは、両配列がＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて一列に並べられた場合、野生型配列と同一である変異体配列のアミノ酸のパーセンテージに対応する。「ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有する」という表現は、それが一列に並べられ得る野生型対応断片と比較した場合、変異体が少なくとも80％のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する結合親和性を、好ましくは少なくとも90％のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する結合親和性を保有する、ということを意味する。
【００６０】
好ましい一実施形態によれば、上記のポリペプチドは、ボルデテラ野生型アデニレートシクラーゼ、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼを認識する抗血清と特異的に反応性である。さらに好ましくは、上記ポリペプチドは、哺乳類に投与される場合、ボルデテラアデニレートシクラーゼを特異的に認識する抗体を産生し得る。
【００６１】
特定の一実施形態では、上記ポリペプチドは、百日咳菌アデニレートシクラーゼの断片である．別の特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、本質的に百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン、特に百日咳菌のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン（配列番号２）からなる。
【００６２】
その他の特定の実施形態では、上記ポリペプチドはさらに、ボルデテラアデニレートシクラーゼのアシル化ドメインおよび／または疎水性ドメインを含む。上記アシル化ドメインは、WO 93/21324に記載されたように、配列番号1の残基７００から残基１０００に及ぶ対応する領域に包含され、そしてＬｙｓ９８３および／またはＬｙｓ８６０を含む。疎水性ドメインは、配列番号１の残基５００から残基７００に及ぶ領域に対応する。
【００６３】
好ましくは上記ポリペプチドは、哺乳類にin vivoで投与される場合、有毒でない。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンの結合に関して野生型アデニレートシクラーゼと競合する。
したがって本発明は、百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するためのワクチンまたは医薬の製造における上記のようなポリペプチドの使用に関する。
【００６５】
特に方法は、ボルデテラ感染に対する防御抗体を生成するための本発明の上記ポリペプチドの使用に関する。
【００６６】
アデニレートシクラーゼは樹状細胞に対して異なる抗原をターゲッティングして、特に強力なＣＤ４＋、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成をもたらし得る効率的分子送達ベクターである、ということがすでに報告されている（EP1188446, Institut Pasteur）。
【００６７】
本発明はここで、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して特異的に当該分子をターゲッティングするためのベクターの調製における本発明のポリペプチドの使用に関する。
【００６８】
「特異的に」という用語は、本発明の情況内では、ポリペプチドが、当該分子のためのベクターとして用いられる場合、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの高結合親和性によりＣＤ１１ｂ発現細胞に選択的に向けられ、それにより他の細胞に関して選択的な方法で、上記細胞の表面または上記細胞内で当該分子をターゲッティングするための手段を提供することを意味する。
【００６９】
特に一実施形態では、上記分子またはペプチドのターゲッティングは、in vivoで有効である。その他の実施形態では、上記分子のターゲッティングは、in vitroまたはex vivoで有効である。「in vitro」とは、標的細胞がin vitroで培養される細胞である、ということを意味する。「ex vivo」とは、標的細胞が、生体から抽出された細胞であり、in vitroで培養され、そして生体中に再投与されるよう意図される細胞であることを意味する。
【００７０】
それにより本発明は、ある種の白血球、特に骨髄系樹状細胞、好中球またはマクロファージのターゲッティングを要する動物またはヒト宿主への投与に適した組成物の設計に適切な手段を提供する。
【００７１】
本発明は特に、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクターであって、上記当該分子に結合された上記のようなＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合し得るポリペプチドを含むベクターに関する。
【００７２】
本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をin vitroターゲッティングするための方法であって、以下の：
ａ． 生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞を提供し、
ｂ． 上記ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して上記ベクターをターゲッティングするための適切な条件下で本発明のベクターとともに上記ＣＤ１１ｂ発現細胞を培養する
ことを包含する方法にも関する。
【００７３】
本発明は、上記の方法により得られるような当該分子を含むＣＤ１１ｂ発現細胞も提供する。
【００７４】
本発明によれば、「当該分子」という表現は、任意の分子、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼの断片でない分子を指す。
【００７５】
当該分子は、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、プラスミドおよびコスミドの中からも選択され得る。それらは、ペプチドまたはポリペプチド、特に酵素、補酵素、受容体リガンド、ハプテン、抗原、抗体およびその断片の中からも選択され得る。当然の帰結として、当業者は、所望の用途によって適切な分子を選択する。
【００７６】
当該分子は、薬剤の有効成分、免疫毒素、酸化防止剤、抗生物質、増殖因子、細胞内ホルモン、サイトカイン、毒素、神経伝達物質、抗菌剤、特に抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗寄生生物剤または抗真菌剤、さらに一般的には任意の当該治療薬または予防薬の中から選択され得る。
【００７７】
特定の一実施形態によれば、当該分子は以下の：ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、多糖、オリゴ糖、核酸、脂質および化学物質からなる群の中で選択される。
【００７８】
特定の実施形態では、当該分子は異種抗原またはエピトープであり、「異種」という用語は、ベクターそれ自体の中に含まれるアデニレートシクラーゼ抗原決定因子以外の抗原またはエピトープを指す。
【００７９】
当該分子は、本発明のポリペプチドに結合されて、本発明のベクターを提供する。
本明細書中で用いる場合、「結合される」という用語は、当該分子とポリペプチドの物理的会合を可能にする任意の相互作用を意味する。好ましくは結合は、共有結合である。それは、直接共有結合または接合体を形成するための結合剤の使用による間接結合であり得る。化学結合法は、当該技術分野で周知である。化学結合は、例えばマレイミド、ペプチド、ジスルフィドまたはチオエーテル結合の中から選択され得る。例Ｎ−ピリジルスルホニル活性化スルフヒドリルを用いたジスルフィド結合が用いられ得る。
【００８０】
特定の一方法は、ポリペプチドにリンカーを付加することにあり、上記リンカーは、ジスルフィド結合のために容易に用いられ得る少なくとも１つのシステインからなる。別のアプローチは、ストレプタビジンへの関連する他の分子の結合を可能にするビオチニル部分を化学的に結合することからなる。
【００８１】
異なるシステイン残基とのジスルフィド結合により本発明のポリペプチドに多数の分子が化学結合され得るが、但し、結合はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との相互作用を妨げない。
ＣＤ１１ｂ発現細胞の機能的特性は、これらの特定細胞に対してターゲッティングする薬剤のためのタンパク質様ベクターの製造における本発明の上記ポリペプチドの使用をさらに限定する。この情況において、本発明の特定の一実施形態では、いわゆる当該分子は薬剤の有効成分である。上記有効成分は、本発明のポリペプチドに化学的または遺伝子的に結合され得る。有益には、当該分子は、アデニレートシクラーゼ毒素に結合されると、炎症応答に関与する細胞、例えば好中球の表面に特異的にターゲッティングされる抗炎症薬である。
【００８２】
ＣＤ１１ｂ発現細胞、そしてとくに骨髄系樹状細胞、好中球およびマクロファージは、免疫および生得的防御系の必須機能に、特に炎症および特異的免疫応答に関与し、本発明の好ましい実施形態では、本発明のベクターはＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞応答を初回刺激するようより特定的に設計され、上記応答は、ＣＤ１１ｂ発現細胞、特に骨髄系樹状細胞に対する当該分子のターゲッティングに引き続いて起こる。
【００８３】
この情況では、当該分子は好ましくはエピトープまたは抗原であるか、あるいはそれらを含む。さらに特定的には、当該分子は特に、以下の：例えばポリオウイルス抗原、ＨＩＶウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、エピトープ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、細菌性抗原、結核マイコバクテリア抗原からなる群から選択される抗原であり得る。
【００８４】
したがって本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して抗原またはエピトープをin vivoターゲッティングすることにより、あるいは抽出ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して抗原またはエピトープをex vivoターゲッティングして、その結果生じた細胞を上記患者に再投与することにより、患者におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞応答を初回刺激するための手段を提供する。
【００８５】
したがって本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して抗原またはエピトープをin vitroターゲッティングするための方法であって、以下の：
ａ． 生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞を提供し、
ｂ． 上記ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して上記ベクターをターゲッティングするための適切な条件下で当該分子として抗原またはエピトープを保有する本発明のベクターとともに上記ＣＤ１１ｂ発現細胞を培養する
ことを包含する方法に関する。
【００８６】
好ましくは生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞は、骨髄系樹状細胞である。
本発明は、上記の方法により得られる異種抗原またはエピトープを含むＣＤ１１ｂ発現細胞も提供する。
【００８７】
したがって本発明は、抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質であって、上記の方法により得られる異種抗原またはエピトープを含む効率的量のＣＤ１１ｂ発現細胞を製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含むことを特徴とする物質に関する。
【００８８】
本発明はさらに、抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質の調製における、上記の方法により得られるような上記高原またはエピトープを含むＣＤ１１ｂ発現細胞の使用に関する。
【００８９】
さらに特定的には、本発明は、抗原に対して患者を免疫感作するための方法であって、以下の：
ａ． 上記患者からＣＤ１１ｂ発現細胞を抽出し；
ｂ． 上記細胞に対して上記ベクターをターゲッティングするのに適した条件下で当該分子として抗原またはエピトープを保有する本発明のベクターとともに上記ＣＤ１１ｂ発現細胞をin vitro培養し；
ｃ． 上記ベクターを含む効率的量の上記細胞を上記患者に再投与して、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋応答を初回刺激して、それにより上記抗原に対して上記患者を免疫感作する
ことを包含する方法を提供する。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記ＣＤ１１ｂ発現細胞は骨髄系樹状細胞である。
したがって本発明は、当該分子としてエピトープまたは抗原を保有する本発明のベクターを、製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物にも関する。
【００９１】
一実施形態によれば、上記組成物は、ヒトまたは動物における投与に適したワクチンである。好ましくはワクチンは、ポリオウイルス、ＨＩＶまたはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに対する免疫を誘導し得る。もちろん、誘導される免疫型は、ベクターに保有される選定抗原によっている。別の実施形態では、ワクチンは百日咳に対する免疫を誘導し得る。
【００９２】
このようなワクチンは、免疫防御および非毒性量の本発明のベクターを含む。したがって上記組成物は、適切なプライミングアジュバントをさらに含み得る。
本発明はさらに、病原体感染に対してヒトまたは動物を免疫感作するための方法であって、免疫防御および非毒性量の本発明のベクターを含むワクチンをこのようなヒトまたは動物に投与することを包含する方法に関する。
【００９３】
本発明は、本発明のポリペプチド、タンパク質またはベクターを調製するための方法にも向けられる。特にそれらの手段は、以下のポリペプチドのうちの1つをコードする核酸を含む：
ａ． ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠く本発明のタンパク質；
ｂ． ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンと結合し得る本発明のポリペプチド；あるいは
ｃ． ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクター。
【００９４】
特に本発明の核酸は、既知の技法を用いて、例えば遺伝子バンクから遺伝子を単離し、ｍＲＮＡ鋳型から、またはポリメラーゼ連鎖反応により、あるいは臨床的種の単離物から相補的またはｃＤＮＡを作製することにより、任意のボルデテラ菌株の野生型アデニレートシクラーゼをコードするＤＮＡから得られる。代替的には、野生型アデニレートシクラーゼをコードするＤＮＡは、標準ＤＮＡ合成技法により合成され得る。種々のボルデテラ菌株は、商業的保管所から公的に利用可能である。
【００９５】
ボルデテラアデニレートシクラーゼをコードする野生型ＤＮＡの修飾は、慣用的分子生物学技法を用いて、野生型ＤＮＡの遺伝子工学処理により生成され得る。
【００９６】
本発明の別の目的は、宿主細胞中のコードポリペプチドまたはタンパク質の発現に適した発現ベクター中でクローン化される本発明のポリペプチド、タンパク質またはベクターをコードする核酸により構成される組換え核酸に関する。任意に、組換えＤＮＡ分子は、アジュバントのような免疫刺激特性を有する、または本発明のポリペプチドを発現、し、精製しおよび／または処方するのに有用である担体ポリペプチドの付加的コード配列を含む。このコード配列は、本発明の分子をターゲッティングするためのポリペプチド、タンパク質またはベクターのコード配列とともにフレーム内に置かれ得る。
【００９７】
発現ベクターの選択は、もちろん、用いられる宿主によっている。
好ましくは上記発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミドまたはウイルスＤＮＡである。
【００９８】
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に関して欠損がある本発明のタンパク質；上記のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を結合し得るポリペプチド；あるいはＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクターの製造方法であって、対応する当該ポリペプチド、タンパク質またはベクターの発現のために適切な宿主細胞中に上記のような組換え核酸を組入れて；形質転換化組換え細胞を培養し、そして本発明の合成組換えポリペプチド、タンパク質またはベクターを回収する方法にも関する。
【００９９】
本発明の別の態様は、本発明の組換え核酸で形質転換され、したがって上記のような核酸または組換え核酸を含む宿主細胞である。一実施形態では、組換え核酸は、慣用的技法、例えば相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０１００】
本発明の好ましい宿主細胞としては、大腸菌種およびボルデテラ属に属するものが挙げられる。適切であり得るその他の宿主としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母およびその他の細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明は、本発明のポリペプチド、タンパク質、ベクターを用いた、あるいは本発明の組成物を用いた動物またはヒトの免疫感作により得られるポリクローナル血清も包含する。
【０１０２】
好ましい一実施形態では、ポリクローナル血清は、ボルデテラアデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン、好ましくはアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ百日咳菌アデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインからなるポリペプチドで動物またはヒトを免疫感作することにより得られる。
【０１０３】
本発明は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含む本発明のポリペプチドに対して特異的に向けられるモノクローナル抗体にも関する。
好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン中に存在するエピトープに対して、好ましくはアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ百日咳菌アデニレートシクラーゼのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン中に存在するエピトープに対して向けられる。
【０１０４】
好ましくは上記のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との野生型アデニレートシクラーゼの結合を遮断し得る。遮断は、野生型アデニレートシクラーゼ単独の能力と比較した場合の、上記ポリクローナル血清またはモノクローナル抗体と野生型アデニレートシクラーゼとの混合物のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を評価することにより検定され得る。
【０１０５】
特定の一実施形態では、上記薬剤はボルデテラ感染に対する受動免疫感作を提供する。
ヒト生物体において用いるために、本発明の抗体は、例えば抗体機能を有さないヒト免疫グロブリンの超可変部を上記の技法から得られるモノクローナル免疫グロブリンの超可変部と取り換えることにより、ヒト化され得る。
【０１０６】
例えば抗体をヒト化するための技法は、Waldmann T., June 1991, Science, vol. 252, p. 1657-1662; Winter G. et al, 1993, Immunology Today, vol. 14, No. 6, p. 243-246; Carter et al., May 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 4285-4289; Singer et al., 1 April 1993, Journal of Immunology, vol. 150, No. 7, p. 2844-2857により記載された。
【０１０７】
本発明は、ポリクローナル血清またはモノクローナル血清を、製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物にも関する。
【０１０８】
本発明は、百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における本発明のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体の使用にも関する。
【０１０９】
以下の実験の部は、（ｉ）ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用における翻訳後アシル化の役割、ならびに（ｉｉ）百日咳菌アデニレートシクラーゼ中のＣＤ１１ｂ相互作用ドメインを同定した結果を示す。
【実施例】
【０１１０】
実験の部
Ａ．材料および方法
Ａ．１ ＣｙａＡ由来タンパク質の産生、精製および修飾
宿主としての大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Stratagene, Amsterdam, Netherlands）において、標準プロトコール（Sambrook et al., 1989）に従って、ＤＮＡ操作を実施した。アシル化野生型プロＣｙａＡ（ｐＡＣＴ７）、アシル化野生型ＣｙａＡ（ｐＴ7ＣＡＣＴ１）、ならびに独特のシステイン残基およびＯＶＡエピトープをその触媒ドメイン中に保有する組換え解毒化ＣｙａＡ−Ｅ５−ＣｙｓＯＶＡ（ｐＣＡＣＴ−Ｅ５−ＣｙｓＯｖａ）をコードするプラスミドは、すでに記載されている（Gmira et al., 2001; Guermonprez et al., 2001; Osicka et al., 2000; Sebo et al., 1991）。ＣｙａＡ３７３−１７０６をコードするプラスミド（ｐＴＲＣｙａＡΔ１〜３７３）は、ｐＴＲＣＡＧの誘導体であって（Gmira et al., 2001）、この場合、毒素の触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列（ＮｄｅＩおよびＢｓｔＢＩ間の部位を構成）が欠失され、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎをコードする適切な合成二本鎖オリゴヌクレオチドに取り換えられた。
【０１１１】
ＣｙａＡ製造のためのプロトコールは、他所ですでに記載されている（Karimova et al., 1998）。全てのタンパク質が大腸菌ＢＬＲ株中で発現され（Novagen, Merck KG, Darmstadt, Germany）、そして二段階手法、例えばGuermonprez et al., 2000に記載されているようなＤＥＡＥ−セファロースおよびフェニル−セファロースクロマトグラフィーにより、封入体から95％より大きい均一性（ＳＤＳゲル分析により判定）に精製された。メーカーの使用説明書に従って、精製ＣｙａＡ−Ｅ5−ＣｙｓＯＶＡタンパク質を、スルフヒドリル試薬Ｎ−（６−（ビオチンアミド）ヘキシル）−３‘−（２’−ピリジルジチオ）プロピアミド（ビオチン−ＨＰＤＰ）（Pierce, Bezons, France）を用いてその独特のシステイン残基上に標識した。非反応ビオチン−ＨＰＤＰ試薬を除去するために、ＤＥＡＥ−セファロース上でビオチニル化ＣｙａＡを再精製した。Ladant et al., 1992に記載されたようにＣｙａＡ １−３８４を発現し、精製した。
【０１１２】
全長ＣｙａＡ毒素に関しては141 mM-1cm-1、ＣｙａＡ ３７３−１７０６に関しては113 mM-1cm-1、およびＣｙａＡ １−３８４に関しては28 mM-1cm-1の分子吸光係数を用いて、278 nmでの吸着から分光測光的に毒素濃度を確定した。
【０１１３】
前に限定されたＣｙａＡ分子に沿った許容挿入部位を用いて、ＣｙａＡ−ＦＬＡＧ分子を構築した（Osicka et al., 2000）。合成オクタペプチド挿入物Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysを個々の許容位置に保有した一組の17ＣｙａＡ構築物をわれわれは生成した（Sigma, Saint Quentin Fallavier, France）。これを達成するために、必要なリーディングフレーム中のＦＬＡＧエピトープをコードする3つの二本鎖合成オリゴヌクレオチド対（それぞれ、5’-GTACTGATTATAAAGATGACGATGACAAATCAC＋5’-GTACGTGATTTGTCAT CGTCATCTTTATAATCA、5’-GTACTTATCGATTATAAAGATGACGATGACAAA＋5’-GTACTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCGATAAおよび5’-GTACGTGGATTATAAA GATGACGATGACAAAGC＋5’-GTACGCTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCCAC）（配列番号５〜１０）を、ｃｙａＡ内に予め導入された独特のＢｓｒＧ Ｉ部位中に挿入した（Osicka et al., 2000）。正確な挿入をＤＮＡシーケンシングにより検査し、組換えＣｙａＡ分子を大腸菌中で発現し、精製した。前に記載されたように（Osicka et al., 2000）標的細胞としてヒツジ赤血球を用いて、選定ＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子の侵襲能力を特性化した。
【０１１４】
Ａ．２ 抗ＣｙａＡモノクローナル抗体の産生
ＣｙａＡ毒素（明礬中20 μg）を腹腔内的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを最初に免疫感作した。約2週間間隔で、明礬中のＣｙａＡ10 μgでマウスを3回、追加免疫した。免疫感作プロトコールの間中、マウスを採血し、ＥＬＩＳＡにより抗ＣｙａＡ抗体の存在に関してそれらの血清を試験した。有意の血清力価が検出されたら、最終追加免疫をこれらのマウスに投与し、3日後にそれらの脾臓細胞をＰ３×６３骨髄腫細胞（ATCC, Manassas, USA）と融合させた。ＥＬＩＳＡにより、ＣｙａＡ特異的モノクローナル抗体の産生に関して、生成ハイブリドーマをスクリーニングした。次に高産生性ハイブリドーマを選択し、単一細胞限界希釈によりクローン化し、その後、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて腹水症を作るために用いて、多量の抗ＣｙａＡモノクローナル抗体を生成した。メーカーの使用説明書に従って、Ｔ−ＧｅｌＴＭ精製キット（Pierce, Bezons, France）を用いて、腹水からモノクローナル抗体を精製した。Bio-Radタンパク質検定（Bio-Rad, Marnes la Coquette, France）を用いて、抗体の独活を測定した。これらのモノクローナル抗体の内野2つをこの試験に用いた：即ち、アミノ酸１〜１９０内に局在するエピトープと反応する抗体５Ｇ１２、ならびにアミノ酸１００６〜１７０６内に局在するエピトープと反応する抗体６Ｄ７。
【０１１５】
Ａ．３ 細胞および培養
ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞）、ヒトＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８（ＣＨＯ−ＣＤ１１ｃ）でトランスフェクトされた、またはベクター単独でトランスフェクト化された（ＣＨＯ細胞）チャイニーズハムスター卵巣細胞を、D. Golenbock氏（Boston University School of Medicine, Boston, MA）の御厚意により提供され、前に記載されたようにネオマイシンの存在下で培養した（Ingalls et al., 1998）。
【０１１６】
Ａ．４ 抗体
ヒトＣＤ１１ｂ（ＩＣＲＦ４４、マウスＩｇＧ１、κ）およびヒトＣＤ１１ｃ（Ｂ−Ｌｙ６、マウスＩｇＧ１、κ）に特異的なモノクローナル抗体を、BD Pharmingen（Le Pont de Claix, France）から購入した。
【０１１７】
Ａ．５ 結合検定
Guermonprez et al., 2001に記載されたように、検定を実施した。要するに、2×105細胞を、4.5 mg/mlグルコースを含有するＤＭＥＭ培地（Life Technologies, Cergy Pontoise, France）中の指示濃度のＣｙａＡ分子とともに、氷上で30分間、96ウエル培養プレート中で血清を伴わずにインキュベートした。洗浄後、抗ＣｙａＡ触媒ドメインＭａｂ（５Ｇ１２）または抗ＣｙａＡ反復ドメインＭａｂ（６Ｄ７）を25 μg/mlで付加した。いくつかの実験では、細胞を指示濃度のＣｙａＡ分子とともに氷上で30分間予備インキュベートした。次にＣｙａＡ−ビオチン（30 nM）、抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（2 μg/ml）または抗ＣＤ１１ｃ Ｍａｂ（2 μg/ml）（BD Pharmigen）を、毒素の連続存在下で、別々に付加した。
【０１１８】
洗浄し、上清を除去後に、細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Caltag, Le Perray en Yvelines, France）を用いて、またはストレプタビジン−ＰＥ（BD Pharmingen）を用いて1:300希釈で染色した。最終洗浄後、5 μg/mlのヨウ化プロピジウムの存在下で、ＦＡＣＳｔａｒTM（BDLPCF）上でのフローサイトメトリーにより、細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム排除を基礎にしたゲーティングにより、凝集および死細胞を取り去った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）から結合データを推定し、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡを伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として、あるいは結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表した。最大結合は、（競合体の非存在下でＣｙａＡまたは抗ＣＤ１１ｂとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（培地単独でインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）に対応する。試料結合は、（競合体の存在下でＣｙａＡまたは抗ＣＤ１１ｂとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（培地単独でインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）に対応する。
【０１１９】
Ａ．６ ｃＡＭＰ検定
本質的にGuermonprez et al., 2001に記載されたのと同様に、ＣｙａＡ毒素に曝露された細胞中に蓄積された環状ＡＭＰを実施した。要するに、5×105細胞を、ＤＭＥＭ＋グルコース中の指示濃度のＣｙａＡとともに、37℃で20分間、インキュベートした。洗浄後、細胞サイトゾル中に蓄積されたｃＡＭＰを、0.1 N ＨＣｌを用いた溶解により放出し、120℃で5分間煮沸した。0.1 N ＮａＯＨで中和後、ｃＡＭＰ−ＢＳＡ接合体で予め被覆しておいた微量滴定プレートに試料を付加して、次に抗ｃＡＭＰウサギ抗血清の適切な希釈液とともにインキュベートした。洗浄後、抗ｃＡＭＰ抗体が、アルカリ性ホスファターゼと結合した抗ウサギ抗体とともに明示された。既知のｃＡＭＰ濃度を付加することにより得られる標準曲線との比較から、各試料のｃＡＭＰ含量を確定した。
【０１２０】
Ａ．７ ＣｙａＡ侵襲性活性
Osicka et al., 2000に前に記載されたように、ＣｙａＡ分子の侵襲性活性を確定した。要するに、ヒツジ赤血球を毒素とともに30分間インキュベートし、赤血球中に転位され、細胞外付加トリプシンによる消化に対して防御されるＡＣ活性として、侵襲性活性を測定した。
【０１２１】
Ｂ．結果
Ｂ．１ ＣｙａＡはＣＤ１１ｂ+細胞と特異的に結合し、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂ結合を抑制する
ＣＤ１１ｂとのその相互作用におけるＣｙａＡの生物学的および構造的特性の役割を調べるために、2つの相補的検定；即ち結合検定および競合検定を開発した。結合検定は、ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現するトランスフェクト化ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞）を伴う、または偽トランスフェクト化ＣＨＯ細胞を伴うＣｙａＡ分子のインキュベーションと、その後の、触媒ドメインに特異的な抗ＣｙａＡモノクローナル抗体（５Ｇ１２）を用いた細胞会合毒素の検出にある。図１Ａに示したように、この検定を用いて、ＣＤ１１ｂ+細胞に関してＣｙａＡ結合を特異的に検出した。競合検定では、ＣｙａＡ−ビオチンと競合するそれらの能力、あるいはＣＤ１１ｂ+細胞との抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（Ｍａｂ）結合に関して、異なるＣｙａＡ分子（突然変異体または断片）を試験し得る。ここで、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を異なる濃度のＣｙａＡとともに、氷上で30分間、インキュベートした。次にＣｙａＡの連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチン（30 nM）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（2 μg/ml）を付加し、細胞とのそれらの結合をＦＡＣＳにより評価した。図１Ｂに示したように、ＣｙａＡは、用量依存的に、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂ結合をともに効率的に抑制した。ＣＨＯ細胞により発現されるその特異的受容体（ＣＤ１１ｃ）に関する別のリガンド（抗ＣＤ１１ｃ Ｍａｂ）とＣｙａＡは完全に競合できなかったため、この抑制作用はＣＤ１１ｂに特異的であった（図１Ｃ）。
【０１２２】
Ｂ．２ ＣｙａＡアシル化の欠如はＣＤ１１ｂ+細胞とのその結合に影響を及ぼす
ＣｙａＡはその侵襲性活性を実施し、そして溶血性膜チャンネルを形成するためには翻訳後パルミトイル化を必要とする、ということは十分に確立されているため、アシル化の欠如がＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ相互作用に影響を及ぼすか否かを、われわれは試験した。結合検定において、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、ＣｙａＡまたは非アシル化プロＣｙａＡとともにインキュベートした。抗ＣｙａＡ触媒ドメインＭａｂ（５Ｇ１２）を用いて、結合を評価した。図２Ａに示したように、低濃度では、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡおよびプロＣｙａＡ分子の両方の結合は、アシル化ＣｙａＡのわずかに効率的な結合と、かなり共通点があった。これは、細胞膜とのその相互作用増強、結合のためのＣｙａＡのより良好に適合された立体配座および／またはＣＤ１１ｂ受容体に対するＣｙａＡのより高い親和性のためであり得る。実際、ＣｙａＡ結合と比較して、プロＣｙａＡ結合は実質的により高いプロトキシン濃度で飽和に達した。この観察についての最も簡単な説明は、プロＣｙａＡがＣｙａＡより低親和性でＣＤ１１ｂ細胞と結合する、というものである。高ｐｕｒｏと貴信濃度では、プロＣｙａＡの凝集体および／またはオリゴマーは細胞と結合し、その結果として、より多量のプロＣｙａＡが抗体検出系により結合されることが見出される。これに対比して、対照ＣＨＯ細胞とのＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの極低結合が検出された（図2Ｂ）。
【０１２３】
Ｂ．３ アシル化はＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡの相互作用を安定化する
ＣＤ１１ｂ+細胞との毒素の相互作用におけるＣｙａＡアシル化の役割をさらに分析するために、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との結合に関してＣｙａＡと競合する非アシル化プロＣｙａＡの能力をわれわれは試験した。図３Ａに示したように、アシル化ＣｙａＡと比較した場合、非アシル化プロＣｙａＡは、ＣＤ１１ｂ+細胞との結合に関してビオチニル化ＣｙａＡと競合する能力の有意の低減を示した。抑制の欠如がＣＤ１１ｂとの非効率的相互作用のためであったか否かを確定するために、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との抗ＣＤ１１ｂ結合を遮断するプロＣｙａＡの能力を、われわれは評価した．実際、ＣｙａＡと比較して、プロＣｙａＡはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との抗ＣＤ１１ｂ結合を抑制できなかった（図３Ｂ）。
【０１２４】
ｃＡＭＰの超生理学的産生および細胞中毒がＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ相互作用の結果であるため、次に、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を用いて、これらの毒素機能がＣｙａＡアシル化によるものか否かを、われわれは分析した。予測どおり、アシル化毒素と対照的に、プロＣｙａＡはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞中のいかなるｃＡＭＰ増大も誘導せず（図４Ａ）、そしてこれらの細胞に及ぼす有意の細胞傷害性作用も示さなかった（図４Ｂ）。合わせて考えると、ＣｙａＡのアシル化はＣＤ１１ｂ+細胞との毒素の機能的相互作用のために必要であり、そしてＣＤ１１ｂとのプロＣｙａＡの結合はＣＤ１１ｂ発現細胞に及ぼす細胞傷害性作用を誘発するには不十分である、ということをこれらの結果は明らかに実証する。
【０１２５】
Ｂ．４ 触媒ドメインはＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用を必要としない
帰納的には、ＣｙａＡは個々の活性を保有する2つの主要とメインからなる。Ｎ末端ドメインは、アデニレートシクラーゼ活性を保有し（アミノ酸１〜４００）、一方、カルボキシ末端ヘモリシン部分（アミノ酸４００〜１７０６）は、標的細胞へのＡＣドメインの送達および百日咳菌の溶血活性に関与する。ＣＤ１１ｂ+細胞との結合におけるＣｙａＡの2つの機能性ドメインの役割を調べるために、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合する残基１〜３８４によりコードされる触媒ドメイン、ＣｙａＡ１〜３８４の、ならびに残基３７３〜１７０６によりコードされる溶血性部分ＣｙａＡ３７３〜１７０６の能力を、われわれは試験した。図５Ａに示したように、触媒ドメインはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制できなかったが、一方、ＣｙａＡ３７３〜１７０６は全長ＣｙａＡと同一結合抑制を示した。同様に触媒ドメインは、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂの結合も抑制できなかった（図５Ｂ）。さらに、触媒ドメインに特異的な抗ＣｙａＡ Ｍａｂ（５Ｇ１２）を用いた直接結合検定はＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞の表面とのＣｙａＡ１〜３８４のいかなる有意の会合も明示できなかったが、一方、ＣｙａＡの結合は容易に検出された（図６Ａ）。ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ３７３〜１７０６の直接結合は、ＣｙａＡの最初の200アミノ酸内に位置するエピトープを認識する５Ｇ１２Ｍａｂを用いて検出され得なかったが、しかし反復ドメインに特異的な別の抗ＣｙａＡ Ｍａｂ（６Ｄ７）を用いることにより、明らかに実証された（図６Ｃ）。さらにまたＣｙａＡまたはＣｙａＡ３７３〜１７０６の極弱結合のみが、ＣＤ１１ｂを欠くＣＨＯ細胞に関して６Ｄ７を用いて検出された（図６ＢおよびＤ）。要するに、これらの結果は、触媒ドメインがＣＤ１１ｂとのＣｙａＡ相互作用を必要としないということを、そしてＣｙａＡ／ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインがＣｙａＡ３７３〜１７０６断片中に位置するということを明白に実証する。
【０１２６】
Ｂ．５ ＣＤ１１ｂと相互作用するＣｙａＡドメインはＣｙａＡ反復領域内に位置する
ＣＤ１１ｂと相互作用するＣｙａＡの領域を同定するために、競合検定で試験されたＣ末端領域ＣｙａＡ３７３〜１７０６の異なる亜断片（残基３７３〜１４９０または７００〜１７０６または７００〜１４９０または１００６〜１７０６）を、われわれは発現し、精製した。しかしながらこれらのポリペプチドのうち、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチンの結合と有意なように競合し得るものはない。これは、これらの単離断片が変更された立体配座を取る、という事実のためである。したがってＣｙａＡのＣＤ１１ｂ結合ドメインを配置するための突然変異アプローチを、われわれは用いた。材料および方法の抗で詳述したように、毒性ポリペプチド全体を通した種々の限定位置でのＦＬＡＧエピトープ（アミノ酸配列：DYKDDDDKの）の挿入により、17の異なる修飾ＣｙａＡ分子を構築した。ＣＤ１１ｂ結合ドメインのある位置での異種および高荷電ペプチドの挿入は、ＣＤ１１ｂと相互作用するその能力を崩壊し得る、とわれわれは仮定した。17のＦＬＡＧタグ化ＣｙａＡ分子を発現し、均質に精製して、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチンの結合を抑制する能力に関して試験した（2つの場合（ＣｙａＡΔ５１０〜５１５／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧ）、それぞれＣｙａＡのアミノ酸５１０〜５１５または１２４５〜１２７３を欠失し、挿入ＦＬＡＧエピトープに取り換えた、ということに留意）。図７に示したように、残基１１６６〜１２８１間に位置する3つの異なる部位でのＦＬＡＧエピトープの挿入は、ＣＤ１１ｂとの相互作用を全体的に阻止した。対応する修飾ＣｙａＡは、30 nM濃度で試験した場合、本質的にはＣＤ１１ｂ結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合できなかった。これに対比して、全ての他のＦＬＡＧタグ化組換えＣｙａＡはＣＤ１１ｂ+細胞との結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合し得たが、しかし種々の効率を有した。注目すべきは、タンパク質のカルボキシ末端近くに（即ち、位置１４１６、１６２３および１６４８）挿入されたＦＬＡＧエピトープを有する3つの組換えＣｙａＡ構築物もＣＤ１１ｂ結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合するそれらの能力も部分的に減損された。
【０１２７】
ＣＤ１１ｂと相互作用するＣｙａＡドメインをさらに特性化するために、無傷ＣｙａＡと同様に効率的にＣＤ１１ｂ+細胞を結合することが示された4つの他のＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子のほかに、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制することができなかった3つのＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子に焦点を合わせた．これらのＣｙａＡ分子を再び発現し、精製して均質に近づけ（図８Ａ）、ヒツジ赤血球膜（ＲＢＣ）に浸透する、そして外部に付加されたトリプシンに近づきがたい区画に触媒ドメインをデリバリーするそれらの能力を分析することにより、それらの細胞侵襲活性を調べた。図８Ｂに示したように、ＣｙａＡ１３８７／ＦＬＡＧを除いて、他の全ての試験されたＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子の侵襲活性は、ある程度までＦＬＡＧペプチドの挿入により影響を及ぼされた。赤血球に触媒ドメインを転位するＣｙａＡの能力を反映するＣｙａＡ５２４／ＦＬＡＧの侵襲性活性は、残基５２４でのＦＬＡＧペプチドの挿入により完全に除去された。しかしながらＲＢＣ中に浸透するその他のタンパク質、ＣｙａＡ４２４／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡ７２２／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧの、そして小程度にＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧタンパク質の能力は、共通点があった。
【０１２８】
ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との結合に関してＣｙａＡ−ビオチンと競合するこれらの分子の能力を、図９に示したように用量依存的方法で試験した。予測どおり、ＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧタンパク質は、240 nMという高い濃度でさえ、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制することができなかった。これに対比して、他の全てのＣｙａＡ／ＦＬＡＧ構築物は、無傷ＣｙａＡと同様に、用量依存的方法でＣｙａＡ−ビオチン結合を抑制した。それゆえＣｙａＡ１１６６／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３／ＦＬＡＧおよびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧによる結合の抑制の欠如は、ＲＢＣ上のこれらの構築物の侵襲性活性がＣＤ１１ｂ+細胞と非常に効率的に相互作用したＣｙａＡ４２４／ＦＬＡＧタンパク質の活性に匹敵したため、ＦＬＡＧ挿入により引き起こされる毒素の全般的立体配座崩壊に起因すると考えられなかった。
【０１２９】
要するにこれらの結果は、残基１１６６および１２８１により限定され、2つの保存ＲＴＸ反復ブロックを含むＣｙａＡＲＴＸ反復ドメインの部分（Osicka et al., 2000）は、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡ相互作用のために重要であり、それはほとんどＣｙａＡの主要インテグリン結合ドメインを表す、という説得力のある証拠を提供する。
【０１３０】
Ｃ．考察
アデニレートシクラーゼ毒素（ＡＣＴまたはＣｙａＡ）の生物学的活性は、完全に共有結合的翻訳後脂肪アシル化によっている。保存Ｌｙｓ−９８３残基のアシル化の不存在下では、ＣｙａＡはその触媒ドメインを赤血球サイトゾルにデリバリーできず、溶血性チャンネルを形成できない（Barry et al., 1991; Basar et al., 2001 Hackett et al., 1994）。ＣｙａＡは、さまざまな種類の赤血球に検出可能効率で浸透することが示された。しかしながら、その主要標的細胞は、ＣｙａＡに特に感受性である骨髄性細胞、例えば好中球および肺マクロファージであり、ＣｙａＡへの曝露時に無力化され、アポトーシスに委ねられるということが実証された（Confer and Eaton, 1982; Khelef and Guiso, 1995; Khelef et al., 1993）。実際近年、毒素は特定の細胞受容体αMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を有し、これは免疫細胞、例えば好中球、マクロファージまたは樹状細胞上で専ら発現されるということ、そしてＣＤ１１ｂの発現はほとんどＣｙａＡに対するこれらの細胞の高感受性を説明する、ということをわれわれは示した（Guermonprez et al., 2001）。本試験において、ＣｙａＡアシル化はＣＤ１１ｂ+細胞とのその相互作用に主要な役割を演じる、ということを本発明者らは示した。実際、非アシル化プロＣｙａＡはＣｙａＡと同様に効率的にＣＤ１１ｂ+細胞と結合し得るが、しかしそれはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ+細胞との結合に関してアシル化ＣｙａＡと競合するのに不十分であり、これらの細胞との抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ結合を完全に遮断し得た．これは、依然としてＣＤ１１ｂと相互作用しながら、相互作用の性質、特にプロＣｙａＡ−ＣＤ１１ｂ複合体の親和性および／または安定性が成熟ＣｙａＡのＣＤ１１ｂ相互作用に関与するものとは有意に異なる、ということを示唆する。さらにプロＣｙａＡは依然としてＣＤ１１ｂ受容体と結合し得るが、しかしこの相互作用はプロトキシンの膜透過を可能にしない。それゆえ、それがｃＡＭＰへのＡＴＰの転化を触媒し得る細胞サイトゾルへの触媒ドメインのデリバリーに必要とされるＣｙａＡの転位に足る立体配座を付与するために、アシル化が必要とされ得る。
【０１３１】
機能的には、ＣｙａＡは2つの主要ドメインに分けられ得る：即ち、残基１〜４００間に位置するアデニレートシクラーゼ活性ドメインと、残基４００〜１７０６間に位置する溶血活性に関与するものである（Ladant and Ullmann, 1999）。標的細胞との毒素相互作用後、触媒ドメインは、赤血球の形質膜を横断して直接転位され得る。本データは、触媒ドメインがｃＡＭＰへのＡＴＰの転化を食倍することによりＣｙａＡの細胞傷害性活性に重要な役割を演じるが、しかしこのドメインはＣｙａＡがその受容体と結合するためには必要でない、ということを示す。これらの結果はさらに、ＣｙａＡ／ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインがヘモリシン部分に、さらに精確にはＣＤ１１ｂ+細胞との強力作用結合を有する構築物中のＦＬＡＧエピトープの挿入部位により表されるような残基１１６６〜１２８１を含む富グリシン−および富アスパルテートＲＴＸ反復領域の部分に位置する、ということを示す。特に2つのＲＴＸ反復ブロック間に差し挟まれ、残基１２０８〜１２４３を含む予測ループ構造（Osicka et al., 2000）は、ＣＤ１１ｂ+細胞とのＣｙａＡの相互作用において重要な役割を演じ得た。ＣＤ１１ｂと、それぞれＣｙａＡ１１６６／ＦＬＧＡ、ＣｙａＡΔ１２４５〜１２７３およびＣｙａＡ１２８１／ＦＬＡＧ構築物との相互作用の損失は、構造変化によるもので、ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡタンパク質の相互作用に特に関与する帰納的に不可欠なセグメントに選択的に影響を及ぼし得る。これは、ＣＤ１１ｂと結合できない3つの構築物全てが依然として赤血球上の代理検定系において実質的細胞侵襲性活性を示す（無傷ＣｙａＡの20％〜50％）ため、一見信頼できそうであるが、この場合、毒素活性はＣＤ１１ｂとの相互作用によらない。これは、位置１１６６、１２４５および１２８１でのＦＬＡＧ挿入がＣｙａＡの全体的構造を減損せず、むしろＣＤ１１ｂ+細胞と相互作用するそれらの構築物の能力を選択的に除去する、ということを示す。要するにこれらの結果は、ＣｙａＡの残基１１６６〜１２８１がαMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）との毒素相互作用に関与するインテグリン結合ドメインの必須部分を表す、ということを示唆する。
【０１３２】
この結論は、ＣｙａＡの最初の800残基内に挿入されたＦＬＡＧペプチドを有する全てのＣｙａＡ変異体がＣＤ１１ｂとの結合に関してビオチニル化無傷ＣｙａＡと完全に競合する、ということを示す結果により支持される。これに対比して、ＣＤ１１ｂ結合能力は、タンパク質ＣｙａＡ１４１６／ＦＬＡＧ、ＣｙａＡ／ＦＬＡＧ１６２３およびＣｙａＡ／ＦＬＡＧ１６４８に関しても多少低減されたが、このことは、ＣｙａＡの副ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインが毒素のＲＴＸ反復部分のカルボキシ末端に向けて配置され得る、ということを示唆する。
【０１３３】
ＣｙａＡの主要ＣＤ１１ｂ結合モチーフとして領域１１６６〜１２８７を同定する本結果は、ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡの結合が厳密にカルシウム依存性であったという従来の観察に関する興味深い説明を提供する（Guermonprez et al., 2001）。ＲＴＸドメインはカルシウム結合に関与し、カルシウム結合時に主要構造再配列を受ける（Rose et al., 1995）ので、領域１１６６〜１２８７に存在するＣＤ１１ｂ結合モチーフはＲＴＸドメインのカルシウム結合立体配座においてのみ曝露され得る、と推測され得る。ＣｙａＡのアミノ酸領域１１６６〜１２８７内のここで同定されたＣＤ１１ｂ結合モチーフは、ＲＴＸ反復の第二および第三ブロック間に正確に局在される。このセグメントのαらせん構造がＣＤ１１ｂに関するドッキング部位の形成に関与する、と仮定し得る。
【０１３４】
ＣｙａＡは、百日咳のマウスモデルにおけるいくつかの受動的および能動的防御プロトコールに用いられてきた。抗ＣｙａＡ特異的抗体を用いた、または精製ＣｙａＡを用いた免疫感作は、百日咳菌による気道コロニー形成の時間経過を低減し、そして致死的鼻内感染に対してマウスを防御した（Guiso et al., 1989; Guiso et al., 1991）。さらにＣｙａＡに特異的な抗体は、百日咳菌に感染したヒト乳児の血清中に検出された（Arciniega et al., 1991; Guiso et al., 1993）。本結果は、ＣｙａＡ／ＣＤ１１ｂ相互作用ドメインを欠くＣｙａＡ分子が百日咳菌感染に対する防御のための安全無細胞ワクチンとして製造するために設計され得る、ということを示唆する。このような分子の触媒活性は、ＣｙａＡの残基１８８および１８９間に位置するＡＴＰ結合部位内のジペプチド挿入により容易に不活性化され得る（Fayolle et al., 1996）が、一方、ＣＤ１１ｂ相互作用ドメイン内の欠失は、潜在的陰性作用、例えばトキソイドによるインテグリン嵌入時のシグナル伝達および／または補体受容体ＣＲ３としても役立つＣＤ１１ｂへの結合に関するＣｙａＡトキソイドとの競合のためのなんらかの機能的妨害から免疫細胞を保護し得る。
【０１３５】
要するに、本発明のデータは、ＣＤ１１ｂ+細胞とのその相互作用における、ならびにその後のこの相互作用により誘発される生物学的活性における、百日咳菌のアデニレートシクラーゼのアシル化の、および異なるドメインの役割に重要な新規の洞察を提供する。
【０１３６】
【化１】
【０１３７】
【化２】
【０１３８】
【化３】
【０１３９】
【化４】
【０１４０】
【化５】
【０１４１】
【化６】
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１． ＣｙａＡはＣＤ１１ｂ細胞と特異的に結合し、そしてこれらの細胞と結合するＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体をともに抑制する （Ａ）ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、指示濃度のＣｙａＡとともにインキュベートした。抗ＣｙａＡ Ｍａｂ（５Ｇ１２）を用いたＦＡＣＳにより、表面結合ＣｙａＡを検出した。結果は、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡを伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として表わされ、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。 （Ｂ）ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、指示濃度のＣｙａＡとともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡ−ビオチン（30 nM）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（2 μg/ml）を毒素の連続存在下で別々に付加して、ＦＡＣＳによりそれらの結合を測定した。 （Ｃ）指示濃度のＣｙａＡとともに予備インキュベーション後、ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞またはＣＨＯ−ＣＤ１１ｃ細胞を、毒素の連続存在下で、それぞれ抗ＣＤ１１ｂまたは抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体とともにインキュベートした。次に、ＦＡＣＳにより抗体結合を確定した。 （Ｂ）および（Ｃ）に関しては、結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図２】図２． ＣＨＯトランスフェクト体へのＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの直接結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞（Ａ）またはＣＨＯ細胞（Ｂ）を指示濃度のＣｙａＡまたはプロＣｙａＡとともにインキュベートした。抗−ＣｙａＡ Ｍａｂ（５Ｇ１２）を用いて、表面結合ＣｙａＡを検出した。結果は、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡとともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡを伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として表わされ、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図３】図３． ＣｙａＡアシル化はＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞との安定会合のために必要である ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を指示濃度のＣｙａＡまたはプロＣｙａＡとともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチン（Ａ）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（Ｂ）を付加した。ＦＡＣＳにより、表面結合ＣｙａＡ−ビオチンまたは抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂを測定した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図４】図４． ＣｙａＡアシル化はＣｙａＡ誘導性ｃＡＭＰ蓄積および細胞傷害性に必要である ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、37℃で20分間、指示濃度でのＣｙａＡまたはプロＣｙａＡとともにインキュベートした。次に細胞を溶解し、ｃＡＭＰを測定した（Ａ）。平行して、指示濃度のＣｙａＡまたはプロＣｙａＡの存在下で37℃で4時間のＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞のインキュベーション後に培地中に放出されるラクテートデヒドロゲナーゼの量を測定することにより、毒性を確定した（Ｂ）。結果は、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図５】図５． 触媒ドメインはＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ相互作用のために必要でない ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を指示濃度のＣｙａＡ、ＣｙａＡ １−３８４またはＣｙａＡ ３７３−１７０６とともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡ−ビオチン（Ａ）または抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂ（Ｂ）とともに細胞をインキュベートした。ＦＡＣＳにより、ＣｙａＡ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｂ Ｍａｂの結合を測定した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図６】図６． ＣＤ１１ｂ細胞へのＣｙａＡ断片の直接結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞（Ａ、Ｃ）またはＣＨＯ細胞（Ｂ、Ｄ）を指示濃度のＣｙａＡ、ＣｙａＡ １−３８４およびＣｙａＡ ３７３−１７０６とともにインキュベートした。次に、触媒ドメインを認識する抗−ＣｙａＡ 5Ｇ１２ Ｍａｂ（Ａ）、または反復ドメインを認識する抗ＣｙａＡ ６Ｄ７ Ｍａｂ（Ｃ、Ｄ）を用いて、表面結合ＣｙａＡを検出した。結果は、ΔＭＦＩ＝（ＣｙａＡまたはＣｙａＡ断片とともにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）−（ＣｙａＡまたはＣｙａＡ断片を伴わずにインキュベートされた細胞のＭＦＩ値）として表わされ、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図７】図７． ＣｙａＡ−ＦＬＡＧ突然変異体の存在下でのＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ−ビオチン結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞をＣｙａＡまたはＣｙａＡ ＦＬＡＧ突然変異体（30 nM）とともに予備インキュベートした。次にＣｙａＡまたはＣｙａＡ−ＦＬＡＧ分子の連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチンを付加した。ストレプタビジン−ＰＥを用いたＦＡＣＳにより、表面結合ＣｙａＡ−ビオチンを検出した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【図８】図８． 精製ＣｙａＡ調製物のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析ならびに赤血球に及ぼすそれらの侵襲性活性 （Ａ）ＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子を野生型ＣｙａＡと一緒に、前に記載されたようにＤＥＡＥ−およびフェニルセファロースクロマトグラフィーにより尿素抽出物から精製した（Karimova et al., 1998）。クーマシーブルーで染色した7.5％アクリルアミドゲル上で、約3 μgの各タンパク質を分析した。（Ｂ）ヒツジ赤血球に及ぼすＣｙａＡ／ＦＬＡＧ分子の侵襲性活性。2 μgの種々のＣｙａＡタンパク質を5×108個の洗浄ヒツジ赤血球とともに30分間インキュベートし、細胞中に転位されたＡＣ活性の量を前に記載されたように確定した（Osicka et al., 2000）。値は、二重反復実験（ｎ＝6）で実施された3つの実験からの平均を表す。
【図９】図９． ＣｙａＡ−ＦＬＡＧ突然変異体の存在下でのＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞とのＣｙａＡ結合 ＣＨＯ−ＣＤ１１ｂ細胞を、7.5 nM〜240 nMの範囲の種々の濃度でのＣｙａＡまたはＣｙａＡ ＦＬＡＧ突然変異体とともに予備インキュベートした。ＣｙａＡ分子の連続存在下で、ＣｙａＡ−ビオチンを付加し、表面結合ＣｙａＡ−ビオチンを明示した。結果は、結合パーセンテージ＝（試料結合）／（最大結合）×100として表され、少なくとも2つの個々の実験を代表するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のアミノ酸欠失、置換または挿入によりＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン内で修飾されるボルデテラアデニレートシクラーゼから成るタンパク質であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠き、そして野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼを認識する抗血清と特異的に反応する前記タンパク質。
【請求項２】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの完全欠失により修飾される、請求項1記載のタンパク質。
【請求項３】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインがその中へのペプチドの挿入により修飾される、請求項1または2記載のタンパク質。
【請求項４】
ボルデテラアデニレートシクラーゼがＮ末端触媒ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によりさらに修飾される請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質であって、前記修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼが野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼ活性と比較して低減される触媒活性を有する前記タンパク質。
【請求項５】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼがＮ末端触媒ドメインの少なくともアミノ酸残基１〜３００の欠失、好ましくはアミノ酸残基１〜３７３の欠失により修飾される、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼが翻訳後アシル化されるアミノ酸において修飾され、これらのアミノ酸が百日咳菌Bordetella pertussisアデニレートシクラーゼのＬｙｓ９８３およびＬｙｓ８６０に対応する、請求項４記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼが百日咳菌Bordetella pertussisアデニレートシクラーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
製薬上許容可能なビヒクルと組合せて請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項９】
免疫防御および非毒性量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、ワクチンとして用いるための、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
１つまたは複数の適切なプライミングアジュバントをさらに含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１２】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合し得るポリペプチドであって、以下の：
ａ． 30〜500アミノ酸、好ましくは50〜300、さらに好ましくは50〜150アミノ酸を有するボルデテラアデニレートシクラーゼの断片であって、前記ボルデテラアデニレートシクラーゼの野生型ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むか、またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有するのに十分な前記野生型ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの断片を含む断片、
ｂ． 前記断片と少なくとも70％の同一性、好ましくは80％、さらに好ましくは90％の同一性を有する前記断片の変異体であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有する変異体
である前記ポリペプチド。
【請求項１３】
ボルデテラ属アデニレートシクラーゼ、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼを特異的に認識する抗体を産生し得る、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
百日咳菌アデニレートシクラーゼの断片、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ断片、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１２０８からアミノ酸１２４３に及ぶ領域を含む断片である、請求項１２または１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アデニレートシクラーゼのアシル化ドメインおよび／または疎水性ドメインをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
哺乳類にin vivoで投与された場合に有毒でない、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して特異的に当該分子をターゲッティングするためのベクターの製造における、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１９】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクターであって、当該分子に結合された請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合し得るポリペプチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項２０】
前記当該分子が、以下の：ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、多糖、オリゴ糖、核酸、脂質および化学物質からなる群の中から選択される、請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
前記当該分子が薬剤の有効成分である、請求項１９または２０記載のベクター。
【請求項２２】
前記当該分子が化学結合により結合される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２３】
前記当該分子が抗原またはエピトープを含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２４】
前記当該分子が抗原またはエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドである、請求項23記載のベクター。
【請求項２５】
以下のポリペプチド：
ａ． 請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質；
ｂ． 請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド；
ｃ． 請求項２４記載のベクター
のうちの1つをコードする核酸。
【請求項２６】
宿主細胞中のコード化ポリペプチドの発現に適した発現ベクター中でクローン化される、請求項２５記載の核酸により構成される組換え核酸。
【請求項２７】
前記発現ベクターがプラスミド、コスミド、ファージミドまたはウイルスＤＮＡである、請求項２６記載の組換え核酸。
【請求項２８】
請求項25記載の核酸あるいは請求項２６または２７記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のベクターを製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２３または２４のいずれか一項に記載のベクターを含む医薬組成物であって、当該分子が薬剤の有効成分である前記組成物。
【請求項３１】
前記組成物がワクチンである、請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いた、あるいは請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物を用いた動物またはヒトの免疫感作により得られるポリクローナル血清。
【請求項３３】
請求項１２〜１６記載のポリペプチドに対して特異的に向けられるモノクローナル抗体。
【請求項３４】
請求項３２記載のポリクローナル血清、あるいは請求項３３記載のモノクローナル抗体であって、アデニレートシクラーゼとＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の結合を遮断し得るポリクローナル結成またはモノクローナル抗体。
【請求項３５】
請求項３２記載のポリクローナル血清または請求項３３記載のモノクローナル抗体を製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物。
【請求項３６】
百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における請求項３５記載のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体の使用。
【請求項３７】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をin vitroターゲッティングするための方法であって、以下の：
ａ． 生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞を提供し、
ｂ． 前記ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して前記ベクターをターゲッティングするための適切な条件下で請求項１９〜２４のいずれかに記載のベクターとともに前記ＣＤ１１ｂ発現細胞を培養する
ことを包含する前記方法。
【請求項３８】
前記当該分子が抗原またはエピトープを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が骨髄系樹状細胞である、請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項３７〜３９のいずれかに記載の方法により得られる当該分子を含むＣＤ１１ｂ発現細胞。
【請求項４１】
請求項３８記載の方法により得られる抗原またはエピトープを含むＣＤ１１ｂ発現細胞。
【請求項４２】
抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質であって、効率的量の請求項４１記載のＣＤ１１ｂ発現細胞を製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含むことを特徴とする前記物質。
【請求項４３】
抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質の製造における、請求項４１記載のＣＤ１１ｂ発現細胞の使用。
【請求項４４】
抗原に対して患者を免疫感作するための方法であって、以下の：
ａ． 前記患者からＣＤ１１ｂ発現細胞を抽出し；
ｂ． 前記細胞に対して前記ベクターをターゲッティングするのに適した条件下で請求項２３または２４記載のベクターとともに前記ＣＤ１１ｂ発現細胞をin vitro培養し；
ｃ． 前記ベクターを含む効率的量の前記細胞を前記患者に再投与して、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋応答を初回刺激して、それにより前記抗原に対して前記患者を免疫感作する
ことを包含する前記方法。
【請求項４５】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が骨髄系樹状細胞である、請求項４４記載の方法。
【請求項１】
１つまたは複数のアミノ酸欠失、置換または挿入によりＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメイン内で修飾されるボルデテラアデニレートシクラーゼから成るタンパク質であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８結合を欠き、そして野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼを認識する抗血清と特異的に反応する前記タンパク質。
【請求項２】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの完全欠失により修飾される、請求項1記載のタンパク質。
【請求項３】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインがその中へのペプチドの挿入により修飾される、請求項1または2記載のタンパク質。
【請求項４】
ボルデテラアデニレートシクラーゼがＮ末端触媒ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によりさらに修飾される請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質であって、前記修飾ボルデテラアデニレートシクラーゼが野生型ボルデテラアデニレートシクラーゼ活性と比較して低減される触媒活性を有する前記タンパク質。
【請求項５】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼがＮ末端触媒ドメインの少なくともアミノ酸残基１〜３００の欠失、好ましくはアミノ酸残基１〜３７３の欠失により修飾される、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼが翻訳後アシル化されるアミノ酸において修飾され、これらのアミノ酸が百日咳菌Bordetella pertussisアデニレートシクラーゼのＬｙｓ９８３およびＬｙｓ８６０に対応する、請求項４記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ボルデテラアデニレートシクラーゼが百日咳菌Bordetella pertussisアデニレートシクラーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
製薬上許容可能なビヒクルと組合せて請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項９】
免疫防御および非毒性量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、ワクチンとして用いるための、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
１つまたは複数の適切なプライミングアジュバントをさらに含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１２】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合し得るポリペプチドであって、以下の：
ａ． 30〜500アミノ酸、好ましくは50〜300、さらに好ましくは50〜150アミノ酸を有するボルデテラアデニレートシクラーゼの断片であって、前記ボルデテラアデニレートシクラーゼの野生型ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインを含むか、またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有するのに十分な前記野生型ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８相互作用ドメインの断片を含む断片、
ｂ． 前記断片と少なくとも70％の同一性、好ましくは80％、さらに好ましくは90％の同一性を有する前記断片の変異体であって、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合する能力を保有する変異体
である前記ポリペプチド。
【請求項１３】
ボルデテラ属アデニレートシクラーゼ、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼを特異的に認識する抗体を産生し得る、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
百日咳菌アデニレートシクラーゼの断片、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１１６６からアミノ酸１２８１に及ぶ断片、好ましくは百日咳菌アデニレートシクラーゼのアミノ酸１２０８からアミノ酸１２４３に及ぶ領域を含む断片である、請求項１２または１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アデニレートシクラーゼのアシル化ドメインおよび／または疎水性ドメインをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
哺乳類にin vivoで投与された場合に有毒でない、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して特異的に当該分子をターゲッティングするためのベクターの製造における、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１９】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をターゲッティングするためのベクターであって、当該分子に結合された請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と結合し得るポリペプチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項２０】
前記当該分子が、以下の：ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、多糖、オリゴ糖、核酸、脂質および化学物質からなる群の中から選択される、請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
前記当該分子が薬剤の有効成分である、請求項１９または２０記載のベクター。
【請求項２２】
前記当該分子が化学結合により結合される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２３】
前記当該分子が抗原またはエピトープを含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２４】
前記当該分子が抗原またはエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドである、請求項23記載のベクター。
【請求項２５】
以下のポリペプチド：
ａ． 請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質；
ｂ． 請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド；
ｃ． 請求項２４記載のベクター
のうちの1つをコードする核酸。
【請求項２６】
宿主細胞中のコード化ポリペプチドの発現に適した発現ベクター中でクローン化される、請求項２５記載の核酸により構成される組換え核酸。
【請求項２７】
前記発現ベクターがプラスミド、コスミド、ファージミドまたはウイルスＤＮＡである、請求項２６記載の組換え核酸。
【請求項２８】
請求項25記載の核酸あるいは請求項２６または２７記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のベクターを製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２３または２４のいずれか一項に記載のベクターを含む医薬組成物であって、当該分子が薬剤の有効成分である前記組成物。
【請求項３１】
前記組成物がワクチンである、請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いた、あるいは請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物を用いた動物またはヒトの免疫感作により得られるポリクローナル血清。
【請求項３３】
請求項１２〜１６記載のポリペプチドに対して特異的に向けられるモノクローナル抗体。
【請求項３４】
請求項３２記載のポリクローナル血清、あるいは請求項３３記載のモノクローナル抗体であって、アデニレートシクラーゼとＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の結合を遮断し得るポリクローナル結成またはモノクローナル抗体。
【請求項３５】
請求項３２記載のポリクローナル血清または請求項３３記載のモノクローナル抗体を製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含む医薬組成物。
【請求項３６】
百日咳に関連した疾患症候のヒトまたは動物における予防または治療のための、および／またはボルデテラ感染に関連した疾患症候に対してヒトまたは動物を防御するための医薬の製造における請求項３５記載のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体の使用。
【請求項３７】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して当該分子をin vitroターゲッティングするための方法であって、以下の：
ａ． 生体から抽出されるＣＤ１１ｂ発現細胞を提供し、
ｂ． 前記ＣＤ１１ｂ発現細胞に対して前記ベクターをターゲッティングするための適切な条件下で請求項１９〜２４のいずれかに記載のベクターとともに前記ＣＤ１１ｂ発現細胞を培養する
ことを包含する前記方法。
【請求項３８】
前記当該分子が抗原またはエピトープを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が骨髄系樹状細胞である、請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項３７〜３９のいずれかに記載の方法により得られる当該分子を含むＣＤ１１ｂ発現細胞。
【請求項４１】
請求項３８記載の方法により得られる抗原またはエピトープを含むＣＤ１１ｂ発現細胞。
【請求項４２】
抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質であって、効率的量の請求項４１記載のＣＤ１１ｂ発現細胞を製薬上許容可能なビヒクルと組合せて含むことを特徴とする前記物質。
【請求項４３】
抗原に対してヒトまたは動物を免疫感作するための細胞療法物質の製造における、請求項４１記載のＣＤ１１ｂ発現細胞の使用。
【請求項４４】
抗原に対して患者を免疫感作するための方法であって、以下の：
ａ． 前記患者からＣＤ１１ｂ発現細胞を抽出し；
ｂ． 前記細胞に対して前記ベクターをターゲッティングするのに適した条件下で請求項２３または２４記載のベクターとともに前記ＣＤ１１ｂ発現細胞をin vitro培養し；
ｃ． 前記ベクターを含む効率的量の前記細胞を前記患者に再投与して、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋応答を初回刺激して、それにより前記抗原に対して前記患者を免疫感作する
ことを包含する前記方法。
【請求項４５】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が骨髄系樹状細胞である、請求項４４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２７６９７（Ｐ２００７−５２７６９７Ａ）
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６０９８（Ｐ２００６−５１６０９８）
【出願日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７８１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３３７２
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９１２８２９８４）アンスティテュ パストゥール (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７８１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３３７２
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９１２８２９８４）アンスティテュ パストゥール (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
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