ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時に増幅するためのプライマーセット
【課題】ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時に増幅するためのプライマーセットを提供する。
【解決手段】以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方と（C）のプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型領域を同時に増幅する。（A）特定の配列を有する２種類の塩基配列のうち、それぞれ連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）(A)と異なる特定の配列を有する２種類の塩基配列のうち、それぞれ連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）(A)および(B)と異なる特定の配列を有する２種類の塩基配列のうち、それぞれ連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー
【解決手段】以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方と（C）のプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型領域を同時に増幅する。（A）特定の配列を有する２種類の塩基配列のうち、それぞれ連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）(A)と異なる特定の配列を有する２種類の塩基配列のうち、それぞれ連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）(A)および(B)と異なる特定の配列を有する２種類の塩基配列のうち、それぞれ連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時に増幅するためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、個別化医療に関する研究として、ゲノム中の塩基の変異とそれによって生じる表現型の違いはよく研究され、薬剤の副作用、体質などの蓄積がなされている。なかでもＣＹＰ２Ｃ９はヒトチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）分子種のうちの一つで種々の薬物の代謝を触媒する酵素である。
循環器診療では、ワーファリンによる抗凝固療法は広く行われており、特に、人工弁置換術後の抗凝固療法は重要であるが、ＣＹＰ２Ｃ９は、ワーファリンなどの薬剤の代謝に関連する酵素をコードする遺伝子であるため、この遺伝子に変異を持つ人はワーファリンなどの薬剤を代謝する速度が低下するため、副作用がでる。
一方、血液凝固因子である第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）は血液凝固機構の引き金ともいうべき因子であり、この遺伝子に変異を持つ人は血栓形成傾向がある。
したがって、これらを同時に調べることにより罹患のリスクおよび治療指針を同時に検討することが可能になる。
【０００３】
これらの遺伝子を調べることは個別化医療のためには必要なことであり、その遺伝子を調べる方法としては変異箇所に特異的なプライマーを設計してＰＣＲ等による増幅の有無を調べる方法、変異箇所を含む領域をＰＣＲ等によって増幅を行い、制限酵素による切断の有無で変異を確認する方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）、ＴａｑＭａｎやＤＮＡマイクロアレイなどハイブリダイゼーションによって多型を検出する方法が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、上記の方法では多型ごとに増幅用のプライマーを設計する必要があり、複数の変異を検出するためにはその数だけ増幅を行わなければならないため、鋳型として必要となるゲノム量が多くなる。このため、複数の多型箇所を同時に増幅する方法が求められている。しかしながら、ＰＣＲ等で用いるプライマーセットは非特許文献１または２に示されるように単一の領域を増幅することは可能であるが、複数領域を同時に増幅させるためには各領域を同程度に増幅させる必要があるため、検出に使用する多型領域のセットごとにプライマーの配列、組み合わせを検討しなければならない。さらにＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、および第ＸＩＩ因子遺伝子の各多型領域を同時に増幅することの可能なプライマーセットは報告がない。
【非特許文献１】ＪＡＭＡ ２００２ Ｖｏｌ．２８７ ｐ１６９０−１６９８
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ １９９８ Ｖｏｌ．９１ ｐ２０１０−２０１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時に増幅するためのプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方と（C）のプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時
に増幅できることを見出し、発明を完成するに至った。
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【０００７】
すなわち、本発明は上記プライマーセットを提供する。本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの長さは１０〜３５塩基が好ましく、１３〜３０塩基がより好ましい。
本発明はまた、上記プライマーセットを用いてＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子を増幅する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のプライマーセットを用いることによりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む複数のフラグメントを同時に増幅することができ、一塩基多型の検出を簡便に行うことができる。また、使用するゲノムの量を減らすことや増幅に使用する試薬の量を減らすことができるため、検査にかかるコストを低減することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のプライマーセットは以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方、及び（C）のプライマーを含むプライマーセットである。
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【００１０】
配列番号１〜４の配列はヒトCYP2C9遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１３、１４；GenBank Accession No. AY341248）の部分配列またはその相補配列である。配列番号１は配列番号１３の474-513番目の塩基配列、配列番号２は配列番号１３の606-645番目の塩基配列の相補配列、配列番号３は配列番号１４の１−４０番目の塩基配列、配列番号４は配列番号１４の255-294番目の塩基配列の相補配列である。
配列番号５，６の配列はヒト第ＸＩＩ因子遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１５；GenBank Accession No. M17464）の部分配列またはその相補配列である。配列番号５は第ＸＩＩ因子遺伝子の304-343番目の塩基配列、配列番号６は第ＸＩＩ因子遺伝子の435-474番目の塩基配列の相補配列である。
なお、ヒトCYP2C9遺伝子は上記（A）及び（B）のプライマーセットによって特異的に増幅されるものである限り特に制限されず、その配列は人種の違いなどにより変化することもあるため、例えば、配列番号１３又は１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション反応を行った後に６５℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件が挙げられる。
また、第ＸＩＩ因子遺伝子も上記（C）のプライマーセットによって特異的に増幅されるものである限り特に制限されず、その配列は人種の違いなどにより変化することもあるため、例えば、配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件と
は、上記と同様の条件が挙げられる。
【００１１】
本発明のプライマーセットは上記（Ａ）及び（C）、もしくは（Ｂ）及び（Ｃ）の2対、または（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の3対のプライマーを含むプライマーセットである。なお、この組み合わせに他の多型領域を増幅するプライマーセットを加えてもかまわない。
各プライマーの鎖長は増幅方法や増幅条件によって異なるため、各領域が単一で増幅される範囲において特に制限されないが、１０塩基から３５塩基が好ましく、１５塩基から３０塩基がより好ましい。
【００１２】
本発明のプライマーを構成するオリゴヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸等が挙げられるが増幅が行える範囲であれば特に制限されない。また、合成方法は通常のオリゴヌクレオチドと同様にして例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって行うことができる。
またプライマーは標識されたものであってもよい。プライマーを標識する物質は、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００１３】
上記プライマーセットを同時に用いることにより、CYP2C9遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊２（配列番号１３の563番目の塩基におけるC／T多型）及び／又はＣＹＰ２Ｃ９＊３（配列番号１４の153番目の塩基におけるA／C多型）、並びに第ＸＩＩ因子遺伝子の46C→T（配列番号１５の401番目の塩基におけるC／T多型）のそれぞれの一塩基多型を含むフラグメントを２種以上同時に増幅することができる。すなわち、上記（Ａ）のプライマーによりCYP2C9遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊２の多型部位を含む領域が増幅され、上記（Ｂ）のプライマーによりCYP2C9遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊３の多型部位を含む領域が増幅され、上記（Ｃ）のプライマーにより第ＸＩＩ因子遺伝子の46C→Tの多型部位を含む領域が増幅されるため、（Ａ）及び（C）、もしくは（Ｂ）及び（Ｃ）の2対、または（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の3対のプライマーセットを用いることによりCYP2C9遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の多型を含む領域を同時に増幅することができる。ここで、同時とは、単一の反応系において、単一の増幅反応（増幅サイクル）で反応を行うことを意味する。
なお、多型の塩基番号は配列番号１３、１４，１５の１番目の塩基から数えた番号で示しているが、これらの番号はCYP2C9遺伝子や第ＸＩＩ因子遺伝子における塩基の付加や欠失によって変動することがあり、その場合、配列番号１３の563番目の塩基、配列番号１４の153番目の塩基、または配列番号１５の401番目の塩基に相当する塩基の番号となる。
CYP2C9遺伝子、第ＸＩＩ因子遺伝子における上記3種類の一塩基多型はＪＡＭＡ ２００２ Ｖｏｌ．２８７ ｐ１６９０−１６９８またはＢｌｏｏｄ １９９８ Ｖｏｌ．９１ ｐ２０１０−２０１４に開示されており、これらの多型と配列番号１〜６の配列との位置関係は図１に示される。
なお、本発明のプライマーセットは、この組み合わせに臨床検査に開示されているような他の多型領域を増幅するプライマーセットを含むものであってもよい。
【００１４】
増幅方法は上記のプライマーを用いることができる方法であれば特に制限されないが、PCR、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などが挙げられる。この中ではPCR法が特に好ましい。反応条件は通常の条件を採用することができ、試料中の標的核酸の濃度などに応じて適宜変更することができる。
【００１５】
増幅に用いる鋳型は人由来のゲノム、プラスミド、RNAなど特に制限されない。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられている方法を採用することができる。例えばＡｎｉｍ
．Ｓｃｉ．Ｊ．７１（８）：２２２−２３４，２０００で紹介されている方法が挙げられる。
【００１６】
本発明のプライマーを用いた増幅反応により得られた増幅産物を用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子および第ＸＩＩ因子遺伝子の多型を検出することができる。多型を検出する方法は特に制限されないが、例えば、各多型に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用意し、各プローブと増幅産物のハイブリダイゼーションの有無を測定することにより検出する方法が挙げられる。このようなハイブリダイゼーションによる検出方法としては、マイクロアレイを用いた方法がより好ましい。この場合、各塩基におけるそれぞれの多型に対応したプローブを同時に用いることにより、２または３箇所の塩基における多型を同時に検出することが特に好ましい。
なお、多型の検出方法は上記の方法に限定されず、TaqManプローブを用いたやシークエンスによる方法であってもよい。
【００１７】
なお、上記（Ａ）及び（Ｂ）のプライマーを含むプライマーセットを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊２の多型（配列番号１３の563番目の塩基におけるC／T多型）を含む領域及びＣＹＰ２Ｃ９＊３の多型（配列番号１４の153番目の塩基におけるA／C多型）を含む領域を同時に増幅して検出することができる。したがって、（Ａ）及び（Ｂ）のプライマーを含むプライマーセットも本発明に含まれる。
【実施例】
【００１８】
実施例１
（１）プライマーの設計
ＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー１（配列番号１の１２−３２番目：ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＣＧＧ）、リバースプライマー２（配列番号２の９−３１番目：ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＧＡ ＧＴＡ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣ）、ＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー２（配列番号３の４−２６番目：ＣＴＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＴＡ ＣＴ）、リバースプライマー２（配列番号４の７−２８番目：ＧＡＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＴＧ ＧＧＡ ＣＴＴ Ｃ）、第ＸＩＩ因子が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー３（配列番号５の９−３１番目：ＧＧＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＡＡ ＴＣＴ ＣＴＡ Ｔ）、リバースプライマー３（配列番号６の９−３１番目：ＴＣＡ ＣＣＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＣＣＡ Ａ）を設計した。
ＣＹＰ２Ｃ９＊２多型領域増幅用プライマー、ＣＹＰ２Ｃ９＊３多型領域増幅用プライマー、第ＸＩＩ因子多型領域増幅用プライマーそれぞれのＰＣＲ反応後の予想される鎖長は１５３ｂｐ、２８４ｂｐ、１５３ｂｐである。
【００１９】
（２）プライマーの合成
（１）で設計したフォワードプライマー１〜３とリバースプライマー１〜３をそれぞれ市販のＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００２０】
（３）鋳型ＤＮＡの抽出
ヒト血液より市販のＤＮＡ抽出キットを用いて常法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００２１】
（４）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５μLと１０μＭフォワードプライマー１〜３：各１μＬ、１０μＭリバースプライマー
１〜３：各１μＬ、蒸留水：１９μＬをそれぞれ加え、総量５０μＬとした。
ＰＣＲ反応はＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃、３０秒で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。
【００２２】
（５）電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物溶液２μＬを５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をしたところ、２８０ｂｐ付近と１５０ｂｐ付近に計二本のバンドが確認された。２８０ｂｐ付近にバンドが得られたことからＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域の増幅が確認された。
【００２３】
（６）増幅産物のクローニングおよびクローンの増幅
一方、１５０ｂｐ付近のバンドはＣＹＰ２Ｃ９＊３と第ＸＩＩ因子の２種類の増幅産物であると考えられたので、クローン化、シーケンス解析を試みた。
電気泳動によって得られた１５０ｂｐ付近のＰＣＲ産物を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製産物をｐＧＥＭにライゲーションした。作製したライゲーション反応液を大腸菌へトランスフォーメーションし、その後、ＬＢ寒天培地上で一晩３７℃にて培養を行った。形成したコロニーのうち２０個を選びそれぞれＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてクローンの抽出を行った。
【００２４】
（７）シーケンス解析
（６）で抽出したクローンをＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を使用し、それぞれシーケンス解析を行った。得られた配列をＢｌａｓｔによって配列の相同性を調べ、遺伝子を特定した。以下にその結果を示す。シーケンス解析を行った２０クローンのうち１１クローンがＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域の配列で、９クローンが第ＸＩＩ因子が有する多型領域の配列となった。以上のことより本発明のプライマーを用いることにより３領域を同時に増幅することが確認された。
【００２５】
【表１】
【００２６】
［比較例］
（１）プライマーの設計
実施例１で設計したプライマーセットとの比較として、ＣＹＰ２Ｃ９についてはＪＡＭＡ（２００２ Ｖｏｌ．２８７ ｐ１６９０−１６９８）記載のプライマーを用いた。ＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域の増幅用としては配列番号７および配列番号８記載の配列を、ＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域の増幅用としては配列番号９および配列番号１０記載の配列を用いた。それぞれのＰＣＲ反応後の予想される鎖長は４９０ｂｐ、２８４ｂｐである。
一方ＦＸＩＩが有する多型領域の増幅用としてはＢｌｏｏｄ（１９９８ Ｖｏｌ．９１ ｐ２０１０−２０１４）記載の配列、具体的には配列番号１１および配列番号１２記載の配列を用いた。ＰＣＲ反応後の予想される差長は３６９ｂｐである。
【００２７】
（２）プライマーの合成
（１）で設計したプライマーをそれぞれ市販のＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００２８】
（３）鋳型ＤＮＡの抽出
ヒト血液より市販のＤＮＡ抽出キットを用いて常法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００２９】
（４）ＰＣＲ反応
実施例１と同様の条件によりＰＣＲ反応を行った。具体的にはＰＣＲ反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５μLと１０μＭ配列番号７〜１２記載のプライマー各１μＬ、蒸留水：１９μＬをそれぞれ加え、総量５０μＬとした。
ＰＣＲ反応はＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃、３０秒で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。
【００３０】
（５）電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物溶液２μＬを５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をしたところ、２９０ｂｐ付近と３７０ｂｐ付近に二本のバンドが確認されたが４９０ｂｐ付近にはバンドが確認されなかった。このことよりＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域を含む配列、ＦＸＩＩが有する多型領域を含む配列は同時に増幅されたものと推測されるがＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域を含む配列は増幅されなかった。一方実施例１に示したように本発明のプライマーセットをもちいると、ＣＹＰ２Ｃ９＊２、ＣＹＰ２Ｃ９＊３、ＦＸＩＩ全てが増幅されている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】CYP2C9遺伝子と第ＸＩＩ因子遺伝子上の一塩基多型と配列番号１〜６の配列との位置関係を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時に増幅するためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、個別化医療に関する研究として、ゲノム中の塩基の変異とそれによって生じる表現型の違いはよく研究され、薬剤の副作用、体質などの蓄積がなされている。なかでもＣＹＰ２Ｃ９はヒトチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）分子種のうちの一つで種々の薬物の代謝を触媒する酵素である。
循環器診療では、ワーファリンによる抗凝固療法は広く行われており、特に、人工弁置換術後の抗凝固療法は重要であるが、ＣＹＰ２Ｃ９は、ワーファリンなどの薬剤の代謝に関連する酵素をコードする遺伝子であるため、この遺伝子に変異を持つ人はワーファリンなどの薬剤を代謝する速度が低下するため、副作用がでる。
一方、血液凝固因子である第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）は血液凝固機構の引き金ともいうべき因子であり、この遺伝子に変異を持つ人は血栓形成傾向がある。
したがって、これらを同時に調べることにより罹患のリスクおよび治療指針を同時に検討することが可能になる。
【０００３】
これらの遺伝子を調べることは個別化医療のためには必要なことであり、その遺伝子を調べる方法としては変異箇所に特異的なプライマーを設計してＰＣＲ等による増幅の有無を調べる方法、変異箇所を含む領域をＰＣＲ等によって増幅を行い、制限酵素による切断の有無で変異を確認する方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）、ＴａｑＭａｎやＤＮＡマイクロアレイなどハイブリダイゼーションによって多型を検出する方法が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、上記の方法では多型ごとに増幅用のプライマーを設計する必要があり、複数の変異を検出するためにはその数だけ増幅を行わなければならないため、鋳型として必要となるゲノム量が多くなる。このため、複数の多型箇所を同時に増幅する方法が求められている。しかしながら、ＰＣＲ等で用いるプライマーセットは非特許文献１または２に示されるように単一の領域を増幅することは可能であるが、複数領域を同時に増幅させるためには各領域を同程度に増幅させる必要があるため、検出に使用する多型領域のセットごとにプライマーの配列、組み合わせを検討しなければならない。さらにＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、および第ＸＩＩ因子遺伝子の各多型領域を同時に増幅することの可能なプライマーセットは報告がない。
【非特許文献１】ＪＡＭＡ ２００２ Ｖｏｌ．２８７ ｐ１６９０−１６９８
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ １９９８ Ｖｏｌ．９１ ｐ２０１０−２０１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時に増幅するためのプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方と（C）のプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時
に増幅できることを見出し、発明を完成するに至った。
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【０００７】
すなわち、本発明は上記プライマーセットを提供する。本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの長さは１０〜３５塩基が好ましく、１３〜３０塩基がより好ましい。
本発明はまた、上記プライマーセットを用いてＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子を増幅する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のプライマーセットを用いることによりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の一塩基多型を含む複数のフラグメントを同時に増幅することができ、一塩基多型の検出を簡便に行うことができる。また、使用するゲノムの量を減らすことや増幅に使用する試薬の量を減らすことができるため、検査にかかるコストを低減することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のプライマーセットは以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方、及び（C）のプライマーを含むプライマーセットである。
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【００１０】
配列番号１〜４の配列はヒトCYP2C9遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１３、１４；GenBank Accession No. AY341248）の部分配列またはその相補配列である。配列番号１は配列番号１３の474-513番目の塩基配列、配列番号２は配列番号１３の606-645番目の塩基配列の相補配列、配列番号３は配列番号１４の１−４０番目の塩基配列、配列番号４は配列番号１４の255-294番目の塩基配列の相補配列である。
配列番号５，６の配列はヒト第ＸＩＩ因子遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１５；GenBank Accession No. M17464）の部分配列またはその相補配列である。配列番号５は第ＸＩＩ因子遺伝子の304-343番目の塩基配列、配列番号６は第ＸＩＩ因子遺伝子の435-474番目の塩基配列の相補配列である。
なお、ヒトCYP2C9遺伝子は上記（A）及び（B）のプライマーセットによって特異的に増幅されるものである限り特に制限されず、その配列は人種の違いなどにより変化することもあるため、例えば、配列番号１３又は１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション反応を行った後に６５℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件が挙げられる。
また、第ＸＩＩ因子遺伝子も上記（C）のプライマーセットによって特異的に増幅されるものである限り特に制限されず、その配列は人種の違いなどにより変化することもあるため、例えば、配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件と
は、上記と同様の条件が挙げられる。
【００１１】
本発明のプライマーセットは上記（Ａ）及び（C）、もしくは（Ｂ）及び（Ｃ）の2対、または（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の3対のプライマーを含むプライマーセットである。なお、この組み合わせに他の多型領域を増幅するプライマーセットを加えてもかまわない。
各プライマーの鎖長は増幅方法や増幅条件によって異なるため、各領域が単一で増幅される範囲において特に制限されないが、１０塩基から３５塩基が好ましく、１５塩基から３０塩基がより好ましい。
【００１２】
本発明のプライマーを構成するオリゴヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸等が挙げられるが増幅が行える範囲であれば特に制限されない。また、合成方法は通常のオリゴヌクレオチドと同様にして例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって行うことができる。
またプライマーは標識されたものであってもよい。プライマーを標識する物質は、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００１３】
上記プライマーセットを同時に用いることにより、CYP2C9遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊２（配列番号１３の563番目の塩基におけるC／T多型）及び／又はＣＹＰ２Ｃ９＊３（配列番号１４の153番目の塩基におけるA／C多型）、並びに第ＸＩＩ因子遺伝子の46C→T（配列番号１５の401番目の塩基におけるC／T多型）のそれぞれの一塩基多型を含むフラグメントを２種以上同時に増幅することができる。すなわち、上記（Ａ）のプライマーによりCYP2C9遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊２の多型部位を含む領域が増幅され、上記（Ｂ）のプライマーによりCYP2C9遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊３の多型部位を含む領域が増幅され、上記（Ｃ）のプライマーにより第ＸＩＩ因子遺伝子の46C→Tの多型部位を含む領域が増幅されるため、（Ａ）及び（C）、もしくは（Ｂ）及び（Ｃ）の2対、または（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の3対のプライマーセットを用いることによりCYP2C9遺伝子及び第ＸＩＩ因子遺伝子の多型を含む領域を同時に増幅することができる。ここで、同時とは、単一の反応系において、単一の増幅反応（増幅サイクル）で反応を行うことを意味する。
なお、多型の塩基番号は配列番号１３、１４，１５の１番目の塩基から数えた番号で示しているが、これらの番号はCYP2C9遺伝子や第ＸＩＩ因子遺伝子における塩基の付加や欠失によって変動することがあり、その場合、配列番号１３の563番目の塩基、配列番号１４の153番目の塩基、または配列番号１５の401番目の塩基に相当する塩基の番号となる。
CYP2C9遺伝子、第ＸＩＩ因子遺伝子における上記3種類の一塩基多型はＪＡＭＡ ２００２ Ｖｏｌ．２８７ ｐ１６９０−１６９８またはＢｌｏｏｄ １９９８ Ｖｏｌ．９１ ｐ２０１０−２０１４に開示されており、これらの多型と配列番号１〜６の配列との位置関係は図１に示される。
なお、本発明のプライマーセットは、この組み合わせに臨床検査に開示されているような他の多型領域を増幅するプライマーセットを含むものであってもよい。
【００１４】
増幅方法は上記のプライマーを用いることができる方法であれば特に制限されないが、PCR、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などが挙げられる。この中ではPCR法が特に好ましい。反応条件は通常の条件を採用することができ、試料中の標的核酸の濃度などに応じて適宜変更することができる。
【００１５】
増幅に用いる鋳型は人由来のゲノム、プラスミド、RNAなど特に制限されない。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられている方法を採用することができる。例えばＡｎｉｍ
．Ｓｃｉ．Ｊ．７１（８）：２２２−２３４，２０００で紹介されている方法が挙げられる。
【００１６】
本発明のプライマーを用いた増幅反応により得られた増幅産物を用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子および第ＸＩＩ因子遺伝子の多型を検出することができる。多型を検出する方法は特に制限されないが、例えば、各多型に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用意し、各プローブと増幅産物のハイブリダイゼーションの有無を測定することにより検出する方法が挙げられる。このようなハイブリダイゼーションによる検出方法としては、マイクロアレイを用いた方法がより好ましい。この場合、各塩基におけるそれぞれの多型に対応したプローブを同時に用いることにより、２または３箇所の塩基における多型を同時に検出することが特に好ましい。
なお、多型の検出方法は上記の方法に限定されず、TaqManプローブを用いたやシークエンスによる方法であってもよい。
【００１７】
なお、上記（Ａ）及び（Ｂ）のプライマーを含むプライマーセットを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のＣＹＰ２Ｃ９＊２の多型（配列番号１３の563番目の塩基におけるC／T多型）を含む領域及びＣＹＰ２Ｃ９＊３の多型（配列番号１４の153番目の塩基におけるA／C多型）を含む領域を同時に増幅して検出することができる。したがって、（Ａ）及び（Ｂ）のプライマーを含むプライマーセットも本発明に含まれる。
【実施例】
【００１８】
実施例１
（１）プライマーの設計
ＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー１（配列番号１の１２−３２番目：ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＣＧＧ）、リバースプライマー２（配列番号２の９−３１番目：ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＧＡ ＧＴＡ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣ）、ＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー２（配列番号３の４−２６番目：ＣＴＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＴＡ ＣＴ）、リバースプライマー２（配列番号４の７−２８番目：ＧＡＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＴＧ ＧＧＡ ＣＴＴ Ｃ）、第ＸＩＩ因子が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー３（配列番号５の９−３１番目：ＧＧＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＡＡ ＴＣＴ ＣＴＡ Ｔ）、リバースプライマー３（配列番号６の９−３１番目：ＴＣＡ ＣＣＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＣＣＡ Ａ）を設計した。
ＣＹＰ２Ｃ９＊２多型領域増幅用プライマー、ＣＹＰ２Ｃ９＊３多型領域増幅用プライマー、第ＸＩＩ因子多型領域増幅用プライマーそれぞれのＰＣＲ反応後の予想される鎖長は１５３ｂｐ、２８４ｂｐ、１５３ｂｐである。
【００１９】
（２）プライマーの合成
（１）で設計したフォワードプライマー１〜３とリバースプライマー１〜３をそれぞれ市販のＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００２０】
（３）鋳型ＤＮＡの抽出
ヒト血液より市販のＤＮＡ抽出キットを用いて常法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００２１】
（４）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５μLと１０μＭフォワードプライマー１〜３：各１μＬ、１０μＭリバースプライマー
１〜３：各１μＬ、蒸留水：１９μＬをそれぞれ加え、総量５０μＬとした。
ＰＣＲ反応はＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃、３０秒で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。
【００２２】
（５）電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物溶液２μＬを５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をしたところ、２８０ｂｐ付近と１５０ｂｐ付近に計二本のバンドが確認された。２８０ｂｐ付近にバンドが得られたことからＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域の増幅が確認された。
【００２３】
（６）増幅産物のクローニングおよびクローンの増幅
一方、１５０ｂｐ付近のバンドはＣＹＰ２Ｃ９＊３と第ＸＩＩ因子の２種類の増幅産物であると考えられたので、クローン化、シーケンス解析を試みた。
電気泳動によって得られた１５０ｂｐ付近のＰＣＲ産物を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製産物をｐＧＥＭにライゲーションした。作製したライゲーション反応液を大腸菌へトランスフォーメーションし、その後、ＬＢ寒天培地上で一晩３７℃にて培養を行った。形成したコロニーのうち２０個を選びそれぞれＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてクローンの抽出を行った。
【００２４】
（７）シーケンス解析
（６）で抽出したクローンをＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を使用し、それぞれシーケンス解析を行った。得られた配列をＢｌａｓｔによって配列の相同性を調べ、遺伝子を特定した。以下にその結果を示す。シーケンス解析を行った２０クローンのうち１１クローンがＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域の配列で、９クローンが第ＸＩＩ因子が有する多型領域の配列となった。以上のことより本発明のプライマーを用いることにより３領域を同時に増幅することが確認された。
【００２５】
【表１】
【００２６】
［比較例］
（１）プライマーの設計
実施例１で設計したプライマーセットとの比較として、ＣＹＰ２Ｃ９についてはＪＡＭＡ（２００２ Ｖｏｌ．２８７ ｐ１６９０−１６９８）記載のプライマーを用いた。ＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域の増幅用としては配列番号７および配列番号８記載の配列を、ＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域の増幅用としては配列番号９および配列番号１０記載の配列を用いた。それぞれのＰＣＲ反応後の予想される鎖長は４９０ｂｐ、２８４ｂｐである。
一方ＦＸＩＩが有する多型領域の増幅用としてはＢｌｏｏｄ（１９９８ Ｖｏｌ．９１ ｐ２０１０−２０１４）記載の配列、具体的には配列番号１１および配列番号１２記載の配列を用いた。ＰＣＲ反応後の予想される差長は３６９ｂｐである。
【００２７】
（２）プライマーの合成
（１）で設計したプライマーをそれぞれ市販のＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００２８】
（３）鋳型ＤＮＡの抽出
ヒト血液より市販のＤＮＡ抽出キットを用いて常法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００２９】
（４）ＰＣＲ反応
実施例１と同様の条件によりＰＣＲ反応を行った。具体的にはＰＣＲ反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５μLと１０μＭ配列番号７〜１２記載のプライマー各１μＬ、蒸留水：１９μＬをそれぞれ加え、総量５０μＬとした。
ＰＣＲ反応はＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃、３０秒で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。
【００３０】
（５）電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物溶液２μＬを５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をしたところ、２９０ｂｐ付近と３７０ｂｐ付近に二本のバンドが確認されたが４９０ｂｐ付近にはバンドが確認されなかった。このことよりＣＹＰ２Ｃ９＊３が有する多型領域を含む配列、ＦＸＩＩが有する多型領域を含む配列は同時に増幅されたものと推測されるがＣＹＰ２Ｃ９＊２が有する多型領域を含む配列は増幅されなかった。一方実施例１に示したように本発明のプライマーセットをもちいると、ＣＹＰ２Ｃ９＊２、ＣＹＰ２Ｃ９＊３、ＦＸＩＩ全てが増幅されている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】CYP2C9遺伝子と第ＸＩＩ因子遺伝子上の一塩基多型と配列番号１〜６の配列との位置関係を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方、及び（C）のプライマーを含むプライマーセット：
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【請求項２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）に含まれる全てのプライマーが１０塩基から３５塩基の長さのプライマーである、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記（Ａ）〜（Ｃ）に含まれる全てのプライマーが１３塩基から３０塩基の長さのプライマーである、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項４】
ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子及び血液凝固第ＸＩＩ因子遺伝子を増幅する方法であって、請求項１に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする方法。
【請求項５】
以下の（A）及び（B）のプライマーを含むプライマーセット：
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【請求項１】
以下の（A）、（B）のいずれか一方又は両方、及び（C）のプライマーを含むプライマーセット：
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（C）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【請求項２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）に含まれる全てのプライマーが１０塩基から３５塩基の長さのプライマーである、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記（Ａ）〜（Ｃ）に含まれる全てのプライマーが１３塩基から３０塩基の長さのプライマーである、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項４】
ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子及び血液凝固第ＸＩＩ因子遺伝子を増幅する方法であって、請求項１に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする方法。
【請求項５】
以下の（A）及び（B）のプライマーを含むプライマーセット：
（A）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（B）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【図１】
【公開番号】特開２００６−２９６２８１（Ｐ２００６−２９６２８１Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２２１２８（Ｐ２００５−１２２１２８）
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
【Ｆターム（参考）】
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