Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体
【課題】本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体、またはその生物学的機能的フラグメント、およびそれらの使用を提供する。
【解決手段】Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏ活性を阻害する抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用を阻害し、そして／またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用を阻害する抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そして腫瘍増殖を阻害する抗体もまた提供される。Ｃｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏ活性を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する抗体もまた提供される。本発明はまた、治療適用、診断適用、および研究適用におけるこれらの抗体の使用方法を提供する。
【解決手段】Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏ活性を阻害する抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用を阻害し、そして／またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用を阻害する抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そして腫瘍増殖を阻害する抗体もまた提供される。Ｃｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏ活性を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する抗体もまた提供される。本発明はまた、治療適用、診断適用、および研究適用におけるこれらの抗体の使用方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年３月２２日出願の米国出願番号第６０／３６７，００２；２００１年６月２６日出願の米国出願番号第６０／３０１，０９１；２００１年５月１７日出願の米国出願番号第６０／２９３，０２０；２００１年４月２６日に出願の米国出願番号第６０／２８６，７８２に対する優先権を主張する２００２年４月２４日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１９５０に対する優先権を主張する。これらの全内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
一般的に、本発明は、遺伝学および細胞生物学ならびに、分子生物学に関する。さらに詳しくは、本発明は、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃｒｉｐｔｏは、１８８アミノ酸の細胞表面タンパク質である。Ｃｒｉｐｔｏは、ヒト胚性癌ライブラリのｃＤＮＡスクリーンにおいて、思いがけなく単離された（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８：１９８７−９１）。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質は、少なくとも２つの注目すべきドメインを有する：システインに富む（ｃｙｓ−リッチ）ドメインおよび、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーで見られるドメインと類似しているとして、最初に特徴付けられたドメイン。Ｃｒｉｐｔｏとは、もとは、ＥＧＦファミリーのメンバーとして分類されていた（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら，前出）；しかし、その後の分析が、Ｃｒｉｐｔｏが公知のどのＥＧＦレセプターにも結合しないことならびに、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインが実際は、ＥＧＦファミリーから相違することを示した（Ｂｉａｎｃｏら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８６２４〜２９）。
【０００４】
Ｃｒｉｐｔｏシグナル経路は、続行する研究にも関わらず理解されないままである。文献は、種々の異なる経路の活性化を支持している。種々の経路には、ＭＡＰキナーゼ経路（ＤｅＳａｎｔｉｓら，１９９７，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８：１２５７〜６６；Ｋａｎｎａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３３３０〜３５）；ＴＧＦ−β経路（Ｇｒｉｔｓｍａｎら，１９９９，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：９２１〜３２；Ｓｃｈｉｅｒら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０３：３８５〜８９）；Ｗｎｔ経路との可能な相互作用（Ｓａｌｏｍｏｎら，２０００，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ．７：１９９〜２２６）；およびＥＧＦ経路とのクロストーク（Ｂｉａｎｃｏら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８６２４〜２９）が挙げられる。
【０００５】
米国特許第５，２５６，６４３号およびこれに関する２つの特許（米国特許第５，６５４，１４０号、米国特許第５，７９２，６１６号）が、ヒトＣｒｉｐｔｏ遺伝子、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質およびＣｒｉｐｔｏに対する抗体を開示している。
【０００６】
米国特許第５，２６４，５５７号およびこれに関する３つの特許（米国特許第５，６２０，８６６号、米国特許第５，６５０，２８５号ならびに米国特許第５，８５４，３９９号）が、ヒトＣｒｉｐｔｏに関する遺伝子およびヒトＣｒｉｐｔｏに関するタンパク質を開示している。そのＣｒｉｐｔｏに関するタンパク質に結合するが、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質自身の結合によって交差反応しない抗体も開示されている。
【０００７】
小さなＣｒｉｐｔｏペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体でのヒト組織の免疫染色によって示されるように、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の過剰発現は、多くの組織における癌と関係している（脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頚部、膵臓、および胃が挙げられるが、これらに限定されない）。Ｐａｎｉｃｏら，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６５：５１〜５６；Ｂｙｒｎｅら，１９９８，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１８５：１０８〜１１；Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓら，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：４３７〜４０。従って、当該分野は、このような過剰発現の調節、制限、および／または防止、Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害、ならびにＣｒｉｐｔｏ発現の結果を阻害する方法を必要としている（すなわち、細胞形質転換の促進および／または維持）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明の要約）
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する新規な抗体ならびに、このような抗体の作製方法および使用方法を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合する抗体ならびに、Ｃｒｉｐｔｏの活性またはタンパク質の相互作用を阻害する（例えば、Ｃｒｉｐｔｏに結合するため、Ｃｒｉｐｔｏとタンパク質の相互作用で生じるシグナルが、下方調節される）抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、腫瘍の増殖を阻害する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害し、腫瘍の増殖を阻害する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用および／またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックするならびに、腫瘍の増殖を阻害する抗体を提供する。したがって、本発明は以下をも提供する。
（１）
Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメインにおけるエピトープに特異的に結合する抗体。
（２）
前記Ｃｒｉｐｔｏは、配列番号１または２からなる群より選択される、項目１に記載の抗体。
（３）
前記エピトープは、ＥＧＦ様ドメインに存在する、項目２に記載の抗体。
（４）
前記エピトープは、ｃｙｓ−リッチドメインに存在する、項目２に記載の抗体。
（５）
Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、Ｂ６Ｇ７．１０、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２からなる群より選択される、項目２に記載の抗体。
（６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ６Ｇ７．１０、Ａ１７Ｇ１２．１およびＡ１８Ｂ３．１１からなる群より選択される、項目３に記載の抗体。
（７）
Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６、Ａ６Ｃ１２．１１、１−ｌＡ４Ｃ．２および２−２Ｃ９．２からなる群より選択される、項目４に記載の抗体。
（８）
Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２にわたるドメインを含むエピトープに特異的に結合する抗体。
（９）
Ａ１０Ｂ２．１８、Ｂ３Ｆ６．１７、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．２および３−４Ｅ８．３からなる群より選択される、項目８に記載の抗体。
（１０）
抗体Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、Ｂ６Ｇ７．１０、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が結合するエピトープからなる群より選択されるエピトープに特異的に結合する抗体。
（１１）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏ活性を阻害する、抗体。
（１２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目１１に記載の抗体。
（１３）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２および２−４Ｄ１．３からなる群より選択される、項目１２に記載の抗体。
（１４）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する項目１１に記載の抗体。
（１５）
Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２および２−２Ｃ９．２からなる群より選択される、項目１４に記載の抗体。
（１６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群より選択される、項目１１に記載の抗体。
（１７）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を阻害する、抗体。
（１８）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目１７に記載の抗体。
（１９）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する項目１７に記載の抗体。
（２０）
Ａ２７Ｆ６．１、Ａ８Ｇ３．５およびＢ６Ｇ７．１０からなる群より選択される、項目１７に記載の抗体。
（２１）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏ活性を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する、抗体
（２２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目２１に記載の抗体。
（２３）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する項目２１に記載の抗体。
（２４）
Ａ２７Ｆ６．１，Ａ８Ｇ３および１−１Ａ４Ｃ．２からなる群より選択される、項目２１に記載の抗体。
（２５）
Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体。
（２６）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用を阻害する、抗体。
（２７）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目２６に記載の抗体。
（２８）
Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群より選択される、項目２６に記載の抗体。
（２９）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する、抗体。
（３０）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目２９に記載の抗体。
（３１）
Ａ８Ｇ３．５または１−ｌＡ４Ｃ．２である、項目２９に記載の抗体。
（３２）
Ｃｒｉｐｔｏを内在化し得る、Ｃｒｉｐｔｏ抗体。
（３３）
前記抗体は、化学療法剤に結合体化されている、項目３２に記載の抗体。
（３４）
Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ３Ｆ６．１７、Ａ８Ｇ３、１−ｌＡ４Ｃ．２および３−４Ｅ８．３からなる群より選択される、項目３２に記載の抗体。
（３５）
Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する哺乳動物に投与するための、項目１〜３４のいずれかに記載の抗体の少なくとも１つを含む、組成物。
（３６）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目３５に記載の組成物。
（３７）
薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、項目３５に記載の組成物。
（３８）
前記抗体は、化学療法剤に結合体化されている、項目３５に記載の組成物。
（３９）
結合体化されていない化学療法剤をさらに含む、項目３５に記載の組成物。
（４０）
サンプルにおいてインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を該サンプルに添加する工程を包含する、方法。
（４１）
哺乳動物においてインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（４２）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目４１に記載の方法。
（４３）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（４４）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目３７に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（４５）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目３８に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（４６）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目３９に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（４７）
前記腫瘍細胞が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍細胞からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（４８）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
（４９）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（５０）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４３に記載の方法。
（５１）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４４に記載の方法。
（５２）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４５に記載の方法。
（５３）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（５４）
組織がＣｒｉｐｔｏを発現するか否かを決定する方法であって、該方法は、項目１〜３４のいずれかに記載の抗体を使用する免疫アッセイにおいて、哺乳動物由来の組織を分析する工程を包含する、方法。
（５５）
細胞株がＣｒｉｐｔｏを過剰発現するか否かを決定する方法であって、該方法は、項目１〜３４のいずれかに記載の抗体を使用する免疫アッセイにおいて、該細胞株を分析する工程を包含する、方法。
（５６）
前記抗体は、モノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体。
（５７）
前記抗体は、ヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（５８）
前記抗体は、ヒト抗体である、項目１に記載の抗体。
（５９）
所望でない細胞増殖に関連した状態について哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（６０）
前記抗体は、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害する、項目４に記載の抗体。
（６１）
前記抗体は、Ａ８Ｇ３．５または１−ｌＡ４Ｃ．２である、項目６０に記載の抗体。
（６２）
項目６０に記載の抗体および薬学的受容可能な賦形剤を含む、組成物。
（６３）
ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害する方法であって、Ｃｒｉｐｔｏと項目６０に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、方法。
（６４）
前記接触させる工程が、哺乳動物において行われる、項目６３に記載の方法。
（６５）前記哺乳動物は、ヒトである、項目６４に記載の方法。
（６６）
前記Ｃｒｉｐｔｏは、細胞の表面上に存在する、項目６５に記載の方法。
（６７）
前記細胞は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現している腫瘍細胞である、項目６６に記載の方法。
（６８）
哺乳動物における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、項目６２に記載の組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（６９）
前記腫瘍細胞は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する、項目６８に記載の方法。
（７０）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目６８に記載の方法。
（７１）
前記腫瘍細胞は、ヒト乳癌細胞である、項目７０に記載の方法。
（７２）
腫瘍を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、項目６２に記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（７３）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目７２に記載の方法。
（７４）
前記腫瘍は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する、項目７２に記載の方法。
（７５）
ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
候補化合物を得る工程；
該候補化合物の存在下で、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとを接触させる工程；および
ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用の変化を検出する工程、
を包含し、ここで、該変化の検出は、該候補化合物がＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害することを示す、方法。
（７６）
前記化合物は、抗体である、項目７５に記載の方法。
【０００９】
本発明の１つの局面において、本発明の抗体は、抗体Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が結合するエピトープの群から選択されるエピトープに特異的に結合する。
【００１０】
本発明の別の局面において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する。Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１（配列番号：１）またはＣＲ−３（配列番号：２）から選択され得る。さらに詳しい実施形態において、リガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体には、例えば、Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９A１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３
３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が挙げられる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、ＥＧＦ様ドメインである。ＥＧＦ様ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−４Ｄ１．３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
別の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、ｃｙｓ−リッチドメインである。ｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体は、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、アミノ末端中にある。アミノ末端中のエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ１０Ｂ２．１７が挙げられるが、これに限定されない。
【００１４】
また他の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、Ｃｒｉｐｔｏのドメインにまたがるアミノ酸残基４６〜６２ある。Ｃｒｉｐｔｏのドメインにまたがるアミノ酸残基４６〜６２中のエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ａ１７Ａ２．１６、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−１Ｅ７．２、３−３Ｇ１．１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１５】
他の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、ＣＲ４０（配列番号：３）、ＣＲ４１（配列番号：４）、ＣＲ４３（配列番号：５）、ＣＲ４４（配列番号：６）、ＣＲ４９（配列番号：７）、ＣＲ５０（配列番号：８）またはＣＲ５１（配列番号：９）ポリペプチド中にある。これらペプチドの１つにおけるエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、Ｂ６Ｇ７．１０、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６，２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能な抗体には、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２および２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能な本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１７】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１８】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、腫瘍の増殖を阻害可能な本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００２１】
また別の局面において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ８Ｇ３．５、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００２３】
また別の局面において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
また別の局面において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合を阻害する方法を提供する。この方法は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能な抗体をサンプルに加える工程を包含する。関連した局面において、本発明は、哺乳動物におけるＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢの結合を阻害する方法を包含する。この方法は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能な抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ登録簿雲合ＰＴＡ−３３１５）Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２からなる群から選択されたハイブリドーマによって産生された抗体を提供する。抗体のいくつかは、以下のような別の名を有する：１−１Ａ４Ｃ．２は、１Ｐ１Ａ４−Ｃ２．１（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである；２−２Ｃ９．２は、２Ｐ２Ｃ９．２（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである。；２−４Ｅ５．６は、２Ｐ４Ｅ５．６（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである；３−３Ｇ１．１は、３Ｐ３Ｇ１．１（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである；ならびに３−４Ｅ８．３は、３Ｐ４Ｅ８．３（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである。
【００２７】
本発明の抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ化抗体およびヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明はまた、上で記載した抗体の少なくとも１つを包含する、Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する哺乳動物への投与のための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。上で記載された抗体は、化学療法薬と結合され得るし、非結合化化学療法と組み合わせて提供され得る。
【００２９】
本発明の別の局面には、サンプル中のインビトロの腫瘍細胞の増殖の阻害の方法が含まれる。この方法は、上で記載した組成物をサンプルに加える工程を包含する。
【００３０】
哺乳動物のインビボ腫瘍細胞の増殖阻害の方法もまた含まれる。この方法は、上で記載した組成物の有効な量を哺乳動物へ投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現している腫瘍を有する哺乳動物の処置の方法であり、この処置は、上で記載した組成物を哺乳動物に有効な量投与する工程を包含する。投与のための組成物は、薬物学的に受容可能な賦形剤、化学療法薬に結合した抗体および非結合化化学療法薬と組み合わせて投与される抗体を含み得る。
【００３２】
本発明の方法は、腫瘍細胞の増殖の阻害および／または腫瘍（ここで腫瘍細胞は、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頚部腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）の処置において特に有用である。
【００３３】
また別の実施形態において、本発明は、組織がＣｒｉｐｔｏを発現しているか銅かを決定する方法を含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、哺乳動物由来の腫瘍を分析する工程を包含する。細胞株が、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現しているかどうかを決定する方法も含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、細胞株を分析する工程を包含する。
【００３４】
さらなる局面において、本発明は、アクチビンＢ誘導性の腫瘍細胞の阻害を維持または持続する方法を提供する。この方法は、本発明の抗体に腫瘍細胞を露出する工程を包含する。特定の実施形態において、腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、胚腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頚腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される。
【００３５】
また別の実施形態において、本発明は、組織がＣｒｉｐｔｏを発現しているかどうかを決定する方法を含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、哺乳動物由来の組織を分析する工程を包含する。細胞株が、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現しているかどうかを決定する方法も含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、細胞株を分析する工程を包含する。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、アクチビンＢ誘導性の腫瘍細胞の阻害を維持または持続する方法を提供する。この方法は、本発明の抗体に腫瘍細胞を露出する工程を包含する。特定の実施形態において、腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頚腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される。
【００３７】
また他の局面において、本発明は、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能な化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、候補の化合物の存在下におけるＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢを接触させる工程および、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用の変化を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、化合物は、抗体である。
【００３８】
本発明のこれら局面および他の局面は、以下の本発明の詳細な記載において、さらに詳細に述べられている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、Ａ２７Ｆ６．１によるＣｒｉｐｔｏ誘導性ルシフェラーゼシグナルの阻害を表す。
【図２】図２は、Ａ２７Ｆ６．１によるＣｒｉｐｔｏ誘導性ルシフェラーゼシグナルの阻害を表す。
【図３】図３は、ヒト精巣癌腫細胞株をＣｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した後の、腫瘍重量の変化を表す。
【図４】図４は、ヒト精巣癌腫細胞株をＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した後の、腫瘍重量の変化を表す。
【図５】図５は、ＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
【図６】図６は、Ｔ−４７Ｄ細胞の増殖が、未処理細胞と比較して、約４０％、アクチビンＡまたはアクチビンＢによって阻害されたことを示すグラフである。
【図７】図７は、アクチビンＢの増殖抑制活性が、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのｍａｂ Ａ８Ｇ３．５の存在下で回復されたことを示すグラフである。
【図８】図８は、ＣＲ−Ｆｃが、アクチビンＢを含むウェルに結合したが、アクチビンＡにも他のリガンドにも結合しなかったことを示すグラフである。
【図９】図９は、アクチビンＢコーティングプレートに加える前に、溶液中のアクチビンＡまたはアクチビンＢとともにＣＲ−Ｆｃをプレインキュベートし、アクチビンＢのみが、結合を阻害したことを示すグラフである。
【図１０】図１０は、アクチビンＢが、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＣＲ−Ｆｃに高い強度で直接結合するが、コントロールＬＴβＲ−Ｆｃタンパク質に結合しないこと示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（本発明の詳細な記載）
本発明は、特定のＣｒｉｐｔｏ特異的抗体が、例えば、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用の阻害および／またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用の阻害によってＣｒｉｐｔｏの活性に影響し得るという発見ならびに、特定のＣｒｉｐｔｏ特異的抗体が、腫瘍細胞の増殖の阻害のために使用され得るという発見に基いている。これら抗体のいくつかは、天然のＣｒｉｐｔｏタンパク質またなＣｒｉｐｔｏの変性型いずれかのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する。例えば、これら抗体は、ＥＧＦ様ドメイン、システインリッチドメインまたは、Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸４６〜１５０の長さの領域に由来するペプチド（例えば、約３アミノ酸〜約２０アミノ酸）に結合し得る。
【００４１】
腫瘍の増殖が、少なくとも部分的にＣｒｉｐｔｏに依存する哺乳動物の悪性腫瘍または良性腫瘍の治療において、本発明の抗体は、有用である。通常、この増殖は、正常な恒常性に必要な増殖速度を超過した異常な増殖速度を有し、同じ起源の正常な組織の増殖速度を超過している。
【００４２】
（Ｉ．定義）
この文書を通じて、種々の定義がなされている。ほとんどの言葉は、当業者によってその言葉に帰する意味を有する。以下またはこの文書中のどこかにおいて詳細に定義されている言葉は、本発明の関係で提供される意味を有し、それらは代表的に当業者によって理解される。
【００４３】
本明細書中で使用される「領域」は、生体分子の１次構造の物理的に隣接した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列での隣接した部分によって定義される。
【００４４】
本明細書中で使用される「ドメイン」は、生体分子の公知の機能または潜在的な機能に寄与する生体分子の構造的部分を意味する。ドメインは、領域または領域の部分と共通した広範囲を占め得る；ドメインはまた、特定の領域の全てまたは一部に加えて、その特定の領域から区別される生体分子の一部分を組み込み得る。タンパク質ドメインの例として、細胞外ドメイン（ＣＲ−１（配列番号：１）およびＣＲ−３（配列番号：２）を含むＣｒｉｐｔｏの残基約３１〜残基約１８８の長さ）ならびに膜貫通ドメイン（ＣＲ−１およびＣＲ−３を含むＣｒｉｐｔｏの残基約１６９〜残基約１８８の長さ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のリガンド／レセプター結合ドメインは、ＣＲ−１およびＣＲ−３を含むＣｒｉｐｔｏの残基約７５〜残基約１５０に及ぶ；このドメインは、例えば、ＣＲ−１およびＣＲ−３を含むＣｒｉｐｔｏの残基約７５〜残基約１１２に及ぶＥＧＦ様ドメイン、ならびに例えば、ＣＲ−１およびＣＲ−３を含む残基約１１４〜残基約１５０に及ぶシステインリッチドメイン含む。本発明の多くのモノクローナル抗体は、ＥＧＦ様ドメインまたはシステインリッチドメインに結合するとして同定された。さらに、モノクローナル抗体Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１１）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１２）、およびＡ１７Ａ２．１６は、ＥＧＦ様ドメインの上流のＣｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２の長さの領域中のドメインにおいて形成されるエピトープに結合するとして同定された。以下の実施例３を参照のこと。
【００４５】
本発明の抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体が結合するエピトープは、高次構造的に天然のＣｒｉｐｔｏタンパク質または変性したＣｒｉｐｔｏタンパク質において存在し得る。加えて、エピトープは、Ｃｒｉｐｔｏポリペプチドでの近接していない配列によって形成され得る。
【００４６】
本明細書中で使用される、本発明の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又は、キメラ抗体であり得る。抗体は、任意のアイソタイプまたはサブタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２；κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかを備える）の抗体全体（すなわち、２つの完全な長さの軽鎖および２つの完全な長さの重鎖を備える）であり得る。あるいは、本発明の抗体は、抗体全体の抗原−結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および単鎖Ｆｖ）を指す。
【００４７】
本発明の抗体はどれも、以下で記載するように、必要に応じて化学療法と組み合わされ得る。
【００４８】
本明細書中で使用される「Ｃｒｉｐｔｏを内部移行することが可能な抗体」は、細胞表面からＣｒｉｐｔｏを除去する間に細胞に入る抗体を意味する。例えば、蛍光標識されたＣｒｉｐｔｏモノクローナル抗体の使用により、Ｃｒｉｐｔｏを内部移行することが可能なＣｒｉｐｔｏ抗体をスクリーニングすることが可能である。どの抗体が、Ｃｒｉｐｔｏ陽性細胞へ内部移行し得るのかを決定するために、蛍光顕微鏡および／または共焦点顕微鏡下で細胞を見ることによって、標識抗体の蛍光シグナルの細胞への取り込みを分析し得る。これら内部移行される抗体は、細胞質または細胞小胞における蛍光シグナルとして検出される。非限定的なＣｒｉｐｔｏを内部移行可能なＣｒｉｐｔｏ抗体の例としては、Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ３Ｆ６．１７および１−１Ａ４Ｃ．２が挙げられる。
【００４９】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の同定可能な化学薬品又または、分子を意味する。化合物としては、イオン、原子、小さな分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドおよび核酸が挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物は、自然または合成であり得る。
【００５０】
本明細書中で使用される「変調する」または「改変する」は、特定の活性または特定のタンパク質の量、質もしくは効果の上昇あるいは減少を意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される、「阻害する」は、特定の活性または特定のタンパク質の量、質もしくは効果の減少を意味する。
【００５２】
本明細書中で使用される「Ｃｒｉｐｔｏの活性を変調する」は、Ｃｒｉｐｔｏの活性の量、質もしくは効果の上昇もしくは減少を意味する。Ｃｒｉｐｔｏの活性の量、質もしくは効果における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。活性は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例３で示されているヌル細胞アッセイ）により測定され得る。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏと他のタンパク質との間のタンパク質相互作用は、本発明の抗体の結合を介して阻害される。
【００５３】
本明細書中で使用される「ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用のブロック」又は、「ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用の変調」は、相互作用（すなわちＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の結合）の上昇または減少を意味する。相互作用における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。実施例８で示されている結合アッセイの様に、当該分野で公知のアッセイによって活性は測定され得る。
【００５４】
本発明中で使用される「ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用のブロッキング」または「ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用の変調」は、相互作用（すなわちＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合）の上昇または減少を意味する。相互作用における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。実施例１１で示されている結合アッセイの様に、当該分野で公知のアッセイによって活性は測定され得る。
【００５５】
本発明中で使用される「インビトロにおける腫瘍細胞の増殖の変調」は、インビトロでの腫瘍細胞の数における上昇または減少を意味する。腫瘍細胞の数における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。インビトロでの腫瘍細胞増殖の変調は、実施例４で示されているＧＥＯ細胞軟寒天アッセイの様に、当該分野で公知のアッセイによって測定され得る。
【００５６】
本明細書中で使用される「インビボにおける腫瘍細胞の増殖の変調」は、インビボでの腫瘍細胞の数、血管形成、および／または転移における減少を意味する。腫瘍細胞の数における減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。インビボでの腫瘍細胞増殖の変調は、実施例５で示されているものの様に、当該分野で公知のアッセイによって測定され得る。
【００５７】
本明細書中で使用される「治療的効果」は、異常な状態の阻害を意味する。治療的効果は、異常な状態の１つ以上の症状をいくらか軽減する。異常な状態の処置に関して、治療的効果は、以下の１つ以上をいう：（ａ）細胞の増殖、成長および／または分化における増加もしくは減少；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち、遅延または停止）もしくは促進（すなわち、上昇もしくは開始）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関する１つ以上の症状のいくらかの軽減；および（ｅ）細胞集団の機能の増強。異常な状態に対して効力を示す化合物は、本明細書中で記載されているように同定され得る。
【００５８】
本明細書中で使用される「投与」は、生物の細胞または組織に化合物を組み込む方法を意味する。生物の細胞もしくは組織が生物内（インビボ）または生物の外（エキソビボ）で存在する場合に、異常な状態は、予防もしくは処置され得る。生物の外に存在する細胞は、細胞培養皿もしくは、他の生物において維持または増殖され得る。生物内に存在する細胞については、当該分野において化合物を投与するための多くの技術が存在する。この技術には、経口、非経口、経皮、注射、およびエアロゾル適用が挙げられるがこれらに限定されない。生物体外の細胞については、当該分野において、化合物を投与する多くの技術が存在する。この技術には、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術およびキャリア技術が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の多くの様式（例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋内など）によって投与は達成され得る。インビボの治療に使用される際、本発明の抗体は、患者に有効な量で投与される。本明細書中で使用される「有効な量」は、有益な臨床結果または所望する臨床結果をもたらすのに十分な量である（すなわち、患者の腫瘍の負担を排除するもしくは、減少される量）。有効な量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のためには、有効な量の本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏまたはアクチビンＢ関連の疾患の状態（特に、Ｃｒｉｐｔｏもしくは、アクチビンＢに関する腫瘍）の発生の改善、安定化、予防、または遅延するために十分な量である。
【００５９】
代表的な処置レジメンの１例として、週間スケジュールにおける本発明の抗体の静脈内注入による約２〜５ｍｇ／ｋｇの投与量の投与が挙げられる。患者が入院を必要としない限り、この抗体は、外来患者の化学注入単位で投与される。当該分野で公知の他の投与レジメンも含まれる。
【００６０】
生物へのシグナル伝達経路において異常を有する細胞群への本発明の抗体の投与によって、異常な状態は、予防もしくは処置され得る。その生物機能における化合物投与の効果は、その後、モニターされ得る。好ましくは、生物はヒトである。
【００６１】
本明細書中で使用される「Ｃｒｉｐｔｏ過剰発現」は、正常な組織または細胞のＣｒｉｐｔｏ発現よりも統計学的に有意な量、多く発現している（例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくは少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍）組織または細胞によるＣｒｉｐｔｏの発現を意味する。
【００６２】
本発明所中で使用される「化学療法薬」は、腫瘍増殖の阻害、阻害された腫瘍増殖の維持および／もしくは、緩解の誘発において治療的効果を有すると当該分野で同定されている任意の薬物（例えば、天然の化合物、合成化合物、タンパク質、改変されたタンパク質および放射活性化合物）を意味する。化学療法薬には、本発明の抗体に結合され得る薬あるいは、抗体に結合されること無く、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る薬が挙げられる。本発明の抗体へ結合され得る代表的な化学療法薬には、放射性結合体（９０Ｙ、１３１Ｉ、９９ｍＴＣ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｈなど）、腫瘍活性化プロドラッグ（メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ＣＣ−１０６５アナログ、クリチェアミシン（Ｃｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）誘導体、アントラサイクリン、ビンカアルカロイドなど）、リシン、ジフテリア毒およびシュードモナス外毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
化学治療薬剤は、本発明の抗体へ結合されるよりも、本発明の抗体と組み合わせて（すなわち、非結合体化学療法薬）使用され得る。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プラチナ（すなわち、シスプラチナ）、アントラサイクリン、ヌクレオシドアナログ（プリンおよびピリミジン）、タキサン、カンプトテシン、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ＤＮＡアルキル化因子、葉酸アンタゴニスト、ビンカアルカロイド、リボヌクレオチドレダクターゼインヒビター、エストロゲンインヒビター、プロゲステロンインヒビター、アンドロゲンインヒビター、アロマターゼインヒビター、インターフェロン、インテーロイキン、モノクローナル抗体、タキソール、カンプトサー（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、アドリアマイシン（ドックス）、５−ＦＵおよびゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）。このような、化学療法薬は、抗体および非結合体化学療法薬の付属的な投与による本発明の抗体と組み合わせての本発明の実行に使用され得る。
【００６４】
本明細書中で使用される「薬学的に受容可能キャリアまたは賦形剤」は、当該分野で公知の生物学的に不活性な化合物を意味し、本発明の抗体の投与において使用される。受容可能なキャリアは、当該分野において周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，編集，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＣＯ．，１９９０に記載されている。受容可能なキャリアには、生体適合性な塩、不活性な塩または生体吸収性な塩、緩衝化因子、オリゴ糖または多糖、ポリマー、ヒアルロン酸といった粘弾性の化合物、増粘性因子、防腐剤などが挙げられる。
【００６５】
（ＩＩ．本発明の抗体）
本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する。本明細書中で使用される、Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、ＣＲ−３Ｃｒｉｐｔｏタンパク質およびそれらのフラグメントを含む。このようなフラグメントは、細胞外ドメインまたは細胞内ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、システインリッチドメイン、レセプター結合ドメインなどの全体のドメインであり得る。このようなフラグメントはまた、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の任意のドメインでの近接するエピトープおよび近接しないエピトープを含み得る。Ｃｒｉｐｔｏに対して特異的な抗体を産生するために使用される抗原の例としては、ＣＲ４０（配列番号：３）、ＣＲ４１（配列番号：４）、ＣＲ４３（配列番号：５）、ＣＲ４４（配列番号：６）、ＣＲ４９（配列番号：７）、ＣＲ５０（配列番号：８）およびＣＲ５１（配列番号：９）、これらのアミノ酸配列は、実施例２において提供されている）が挙げられが、これらに限定されない。
【００６６】
ＣＲ−１の１８８アミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号：１）：
ＭＤＣＲＫＭＡＲＦＳＹＳＶＩＷＩＭＡＩＳＫＶＦＥＬＧＬＶＡＧＬＧＨＱＥＦＡＲＰＳＲＧＹＬＡＦＲＤＤＳＩＷＰＱＥＥＰＡＩＲＰＲＳＳＱＲＶＰＰＭＧＩＱＨＳＫＥＬＮＲＴＣＣＬＮＧＧＴＣＭＬＧＳＦＣＡＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫＥＮＣＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫＣＳＬＣＫＣＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱＡＦＬＰＧＣＤＧＬＶＭＤＥＨＬＶＡＳＲＴＰＥＬＰＰＳＡＲＴＴＴＦＭＬＶＧＩＣＬＳＩＱＳＹＹ
ＣＲ−３の１８８アミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号：２）：
ＭＤＣＲＫＭＶＲＦＳＹＳＶＩＷＩＭＡＩＳＫＡＦＥＬＧＬＶＡＧＬＧＨＱＥＦＡＲＰＳＲＧＤＬＡＦＲＤＤＳＩＷＰＱＥＥＰＡＩＲＰＲＳＳＱＲＶＬＰＭＧＩＱＨＳＫＥＬＮＲＴＣＣＬＮＧＧＴＣＭＬＥＳＦＣＡＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫＥＮＣＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫＣＳＬＣＫＣＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱＡＦＬＰＧＣＤＧＬＶＭＤＥＨＬＶＡＳＲＴＰＥＬＰＰＳＡＲＴＴＴＦＭＬＡＧＩＣＬＳＩＱＳＹＹ
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン中のエピトープに結合する。このＥＧＦ様ドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基およそ７５〜アミノ酸残基およそ１１２に及ぶ。このＥＧＦ様ドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の線状または非線状の広がり（ｓｐａｎ）を含み得る。線状エピトープの例としては、残基およそ７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９５〜１０５、１００〜１１０、または１０５〜１１２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＥＧＦドメイン中のエピトープは、変性Ｃｒｉｐｔｏタンパク質に対して立体配置的にネイティブであるＣｒｉｐｔｏタンパク質中で形成されるエピトープである。
【００６７】
他の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのシステインリッチなドメイン中のエピトープに結合する。このシステインリッチなドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基およそ１１４〜アミノ酸残基およそ１５０に及ぶ。このシステインリッチなドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の線状または非線状の広がりを含み得る。線状エピトープの例としては、残基およそ１１４〜１２５、１２０〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３５〜１４５、または１４０〜１５０が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、このシステインリッチなドメイン中のエピトープは、変性Ｃｒｉｐｔｏタンパク質に対して立体配置的にネイティブであるＣｒｉｐｔｏタンパク質中に形成されるエピトープである。
【００６８】
一旦抗体が生成されると、Ｃｒｉｐｔｏへのその抗体の結合が、当該分野で公知の標準的技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用してアッセイされ得、一方で、細胞表面上のＣｒｉｐｔｏの存在が、実施例２に示されるように、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用してアッセイされ得る。このような結合を測定する他の任意の技術が、別に使用され得る。
【００６９】
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体／二重特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体（本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む）を提供する。用語「特異的」および「選択的」とは、本発明の抗体の結合を記載するために使用される場合、本発明の抗体の可変領域がＣｒｉｐｔｏポリペプチドを認識しこのＣｒｉｐｔｏポリペプチドに結合することを、示す。本発明の特異的抗体はまた、他のタンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質ＡもしくはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）に、それらの抗体の可変領域外の配列（特に、その分子の定常領域中の配列）との相互作用を介して、相互作用し得ることが、理解される。
【００７０】
本発明の抗体（例えば、リガンド／レセプター結合ドメインまたはアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメインのエピトープに特異的に結合する抗体）の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該分野で周知であり、慣用的に実施される。このようなアッセイの包括的考察について、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），第６章を参照のこと。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のフラグメントを認識して結合する抗体もまた、含まれるが、但し、その抗体は、Ｃｒｉｐｔｏポリペプチドに特異的である。本発明の抗体は、当該分野で周知の任意の方法を使用して生成され得、慣用的に実施され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。抗体特異性は、以下により詳細に記載される。しかし、以前に文献に記載された他のポリペプチドから生成され得、かつＣｒｉｐｔｏと（例えば、両方のポリペプチド中の類似するエピトープの偶発的存在に起因して）偶発的に交差反応し得る、抗体が、「交差反応性」抗体と考えられることが、強調されるべきである。このような交差反応性抗体は、Ｃｒｉｐｔｏにとって「特異的」である抗体ではない。抗体がＣｒｉｐｔｏのエピトープに特異的に結合するか否かの決定は、当該分野で周知であるいくつかのアッセイ（例えば、ウェスタンブロッティングアッセイ）のいずれかを使用して、なされる。Ｃｒｉｐｔｏを発現する細胞を同定するため、そしてまたＣｒｉｐｔｏリガンド／レセプター結合活性を阻害するために、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の細胞外エピトープ（すなわち、その細胞外で見出されるＣｒｉｐｔｏタンパク質の部分）に特異的に結合する抗体が、特に有用である。
【００７２】
本発明はまた、ポリクローナル抗体を含む無細胞組成物を提供し、その抗体のうちの少なくとも１つは、本発明の抗体である。動物から単離された抗血清は、例示的組成物であり、水、または別の希釈剤、賦形剤、もしくはキャリア中に再懸濁された抗血清の抗体画分を含む組成物もまた、例示的組成物である。
【００７３】
他の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対する。さらに、代表的には、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、その抗原上の単一の決定基に対する。モノクローナル抗体は、抗原−抗体結合を使用する診断アッセイ法および分析アッセイ法の選択性および特異性を改善するために、有用である。モノクローナル抗体の別の利点は、モノクローナル抗体が、培養細胞（例えば、ハイブリドーマ）によって合成され得、他の免疫グロブリンが非混入であり得ることである。そのような抗体を生成する組換え細胞およびハイブリドーマもまた、本発明の局面として意図される。これもまた下記を参照のこと。
【００７４】
なお他の関連する実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的である抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体のより詳細な考察について、例えば、米国特許第６，０６３，３７９号および同第５，７８０，０２９号を参照のこと。
【００７５】
抗体は、化学的にかまたは組換え技術によって単離され得る、比較的小さい抗原結合ドメインを含む。そのようなドメインは、それ自体が有用なＣｒｉｐｔｏ結合分子であり、そしてまた、ヒト抗体中に再導入され得るか、または化学療法剤もしくはポリペプチドに融合され得る。従って、なお別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供し、そのフラグメントおよび関連分子（存在する場合）は、このＣｒｉｐｔｏに結合する。非限定的例として、本発明は、単鎖抗体およびＣＤＲ移植抗体である、ポリペプチドを提供する。ＣＤＲ移植抗体のより詳細な考察について、例えば、米国特許第５，８５９，２０５号および下記の考察を参照のこと。
【００７６】
他の実施形態において、非ヒト抗体が、当該分野で公知の方法のいずれかによってヒト化され得る。ヒト化抗体は、インビボ治療適用のために有用である。さらに、組換え「ヒト化」抗体が、合成され得る。ヒト化抗体は、抗原結合のために必要ではないアミノ酸のいくらかまたはすべてを組換えＤＮＡ技術を使用してヒト免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖の対応する領域由来のアミノ酸で置換している、非ヒト動物からまず誘導される抗体である。すなわち、ヒト化抗体は、ほとんどヒト免疫グロブリン配列を含むキメラであり、特異的抗原結合を担う領域が、置換されている。
【００７７】
種々の形態の抗体が、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜９９）。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、周知のハイブリドーマ技術によって生成され得る。例えば、動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）は、精製Ｃｒｉｐｔｏ調製物または粗Ｃｒｉｐｔｏ調製物、ＣｒｉｐｔｏをコードするｃＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞、Ｃｒｉｐｔｏを構成的に発現する細胞などを用いて、免疫され得る。さらに、その抗原は、精製タンパク質、細胞上で発現されるタンパク質、タンパク質フラグメントもしくはそのペプチドとして、またはそのタンパク質、タンパク質フラグメント、もしくはペプチドをコードする裸のＤＮＡまたはウイルスベクターとして、送達され得る。その後、免疫された動物の血清が、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の存在について試験される。Ｂ細胞が、試験陽性の動物から単離され、ハイブリドーマが、これらのＢ細胞を用いて生成される。
【００７８】
そのハイブリドーマにより分泌される抗体が、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合するその能力（例えば、Ｃｒｉｐｔｏでトランスフェクトした細胞に結合するが、非トランスフェクト親細胞には結合しない）について、そして他の任意の望ましい特徴（例えば、望ましいＣＤＲコンセンサス配列を有すること、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の結合またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合を阻害する（または非ブロッカーの場合には阻害しない）こと）について、スクリーニングされる。
【００７９】
このスクリーニングアッセイにおいて試験陽性であるハイブリドーマ細胞が、その細胞が培養培地中にモノクローナル抗体を分泌するのを可能にする条件下で、栄養培地中で培養される。その後、馴化ハイブリドーマ培養上清が、収集され、そしてその上清中に含まれる抗体が、精製される。あるいは、望ましい抗体が、そのハイブリドーマ細胞を非免疫動物（例えば、マウス）の腹腔中に注入することによって、生成され得る。そのハイブリドーマ細胞は、腹腔中で増殖し、腹水として蓄積する抗体を分泌する。その後、その抗体は、腹腔から腹水をシリンジで回収することによって、採集され得る。
【００８０】
そのモノクローナル抗体はまた、抗体コードｃＤＮＡを望ましいハイブリドーマから単離すること、そのｃＤＮＡで哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）をトランスフェクトすること、そのトランスフェクト宿主細胞を培養すること、そしてその培養培地からその抗体を取り出すことによって、生成され得る。
【００８１】
本発明のモノクローナル抗体はまた、同族ハイブリドーマ（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）抗体を操作することによって、生成され得る。例えば、同族抗体は、組換えＤＮＡ技術によって、その重鎖ならびに／または軽鎖のヒンジ領域および／もしくは定常領域のうちの一部もしくはすべてが別の種（例えば、ヒト）由来の抗体の対応成分で置換されるように、改変され得る。一般的に、その操作した抗体の可変ドメインは、その同族抗体の可変ドメインと同一または実質的に同一のままである。そのような操作抗体は、キメラ抗体と呼ばれ、そのヒンジ領域および／または定常領域が起源とする種（例えば、ヒト）の個体に投与された場合、その同族抗体よりも抗原性が小さい。キメラ抗体を生成
する方法は、当該分野で周知である。ヒト定常領域は、ＩｇＧ１由来の領域およびＩｇＧ４由来の領域を含む。
【００８２】
本発明のモノクローナル抗体はまた、完全ヒト抗体を含む。その完全ヒト抗体は、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５により記載されるようなインビトロ刺激（ｐｒｉｍｅｄ）ヒト脾細胞を使用してか、または例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されるようなファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用して、調製され得る。
【００８３】
あるいは、完全ヒト抗体は、Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４３２〜３６；ならびにＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：２２７〜３６により記載されるようなレパートリークローニングによって、調製され得る。さらに、米国特許第５，７９８，２３０号は、ヒトＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製を記載し、この調製において、ヒト抗体生成Ｂ細胞は、不死化のために必要なタンパク質であるエプスタイン−バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン−バーウイルスまたはその誘導体の感染によって、不死化される。このＥＢＮＡ２機能は、その後、遮断され、抗体生成の増加を生じる。
【００８４】
完全ヒト抗体を生成するための他のいくつかの方法は、不活化内因性Ｉｇ遺伝子座を有し、かつ再配列していないヒト抗体重鎖および軽鎖の遺伝子についてトランスジェニックである、非ヒト動物の使用を包含する。そのようなトランスジェニック動物は、Ｃｒｉｐｔｏを用いて免疫され得、そしてハイブリドーマが、その動物由来のＢ細胞から生成される。これらの方法は、例えば、ヒトＩｇミニ遺伝子座を含むトランスジェニックマウスに関する種々のＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の公開／特許（例えば、米国特許第５，７８９，６５０号）；ＸＥＮＯＭＩＣＥＴＭに関する種々のＡｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の公開／特許（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号；Ｇｒｅｅｎら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３〜２１；ならびにＭｅｎｄｅｚら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜５６）；ならびに「トランソミック（ｔｒａｎｓｏｍｉｃ）マウスに関する種々のＫｉｒｉｎ（日本）の公開／特許（例えば、ＥＰ ８４３ ９６１、およびＴｏｍｉｚｕｋａら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：１４３３〜４３）に記載される。また、例えば、米国特許第５，５６９，８２５号、ＷＯ０００７６３１０、ＷＯ０００５８４９９、およびＷＯ０００３７５０４（これらはその全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００８５】
本発明のモノクローナル抗体はまた、他の種由来の同族抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体のヒト化バージョンを含む。ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって生成される抗体であり、その抗体において、抗原結合に必要ではないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖（例えば、可変ドメインの定常領域およびフレームワーク領域）のアミノ酸のうちのいくらかまたはすべてが、同族の非ヒト抗体の軽鎖または重鎖由来の対応アミノ酸で置換するために使用される。例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化バージョンは、その重鎖および軽鎖の両方に、（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；および（３）マウス抗体由来のＣＤＲを有する。必要な場合、そのヒトフレームワーク領域中の１つ以上の残基は、マウス抗体中の対応位置の残基へと変化されて、その抗原に対するそのヒト化抗体の結合親和性が保存され得る。この変化は、時には「戻し変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」と呼ばれる。ヒト化抗体は、一般的には、キメラヒト抗体と比較して、ヒトにおいて免疫応答を惹起する可能性が低い。なぜなら、前者は、比較的少ない非ヒト成分しか含まないからである。
【００８６】
ヒト化抗体を生成するための方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，ＥＰ ２３９ ４００；Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜３６；Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜３３；米国特許第６，１８０，３７０号；およびＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３〜３７に記載される。また、例えば、ＰＣＴ特許出願番号９４／０４６７９も参照のこと。霊長類化抗体は、霊長類（例えば、アカゲザル、ヒヒ、およびチンパンジー）抗体遺伝子を同様に使用して、生成され得る。その後、さらなる変化が、その抗体フレームワーク中に導入されて、親和性または免疫原性が調節され得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照のこと。
【００８７】
一般的には、ヒト抗体上へのマウス（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植は、以下のように達成される。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡが、ハイブリドーマから単離される。その可変ドメイン（ＣＤＲを含む）のＤＮＡ配列が、配列決定によって決定される。そのＣＤＲをコードするＤＮＡは、部位特異的変異誘発によって、ヒト抗体重鎖または軽鎖の、可変ドメインコード配列の対応領域へと移される。その後、望ましいアイソタイプ（例えば、ＣＨについてγ１、ＣＬについてκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントが、付加される。そのヒト化重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）中に共発現されて、可溶性ヒト化抗体が生成される。抗体の大規模生成を容易にするために、その抗体を発現する細胞を含むバイオリアクター中でそのようなヒト化抗体を生成すること、またはその抗体を乳汁中に発現するトランスジェニック動物（例えば、ヤギ、ウシ、またはヒツジ）を生成すること（例えば、米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと）が、しばしば望ましい。
【００８８】
時折、ヒトフレームワークへのＣＤＲの直接転移は、生じる抗体の抗原結合親和性の喪失をもたらす。これは、いくつかの同族抗体においては、そのフレームワーク領域中の特定のアミノ酸がそのＣＤＲと相互作用することによって、その抗体の全体的抗原結合親和性に影響するからである。このような場合、「戻し変異」（前出）が、アクセプター抗体のフレームワーク領域中に導入されて、その同族抗体の抗原結合活性が保持されるべきである。
【００８９】
戻し変異を生成する一般的アプローチは、当該分野で公知である。例えば、Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜３３、Ｃｏら，１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９〜７３、およびＷＯ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．）は、２つの重要な工程を含むアプローチを記載する。まず、ヒトＶフレームワーク領域が、同族マウス抗体のＶ領域フレームワークとの最適なタンパク質配列相同性についてコンピューター分析によって選択される。その後、そのマウスＶ領域の３次構造が、コンピューターによってモデル化されて、マウスＣＤＲと相互作用する可能性があるフレームワークアミノ酸残基が可視化され、その後、これらのマウスアミノ酸残基が、相同なヒトフレームワーク上に重層される。
【００９０】
この２工程アプローチのもとで、ヒト化抗体を設計するためのいくつかの基準がある。第１の基準は、ヒトアクセプターとして、特定のヒト免疫グロブリン（これは通常、非ヒトドナー免疫グロブリンと相同である）由来のフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することである。第２の基準は、ヒトアクセプター残基が異常であり、かつドナー残基がフレームワークの特定の残基においてヒト配列に典型的である場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を使用することである。第３の基準は、ＣＤＲにすぐ隣接した位置におけるアクセプターではなくドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。
【００９１】
当業者は、例えば、Ｔｅｒｍｐｅｓｔ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−７１に記載されるような異なるアプローチを使用し得る。このアプローチのもとで、ＮＥＷＭ由来のＶ領域フレームワーク、ならびにＲＥＩ重鎖および軽鎖は、それぞれ、マウス残基の放射状の導入を伴うことなく、ＣＤＲグラフト化のために使用される。このアプローチを使用する利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩ可変領域の三次元構造が、Ｘ線結晶分析から分かり、したがって、ＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用が容易にモデリングされ得ることである。
【００９２】
本発明のヒト化抗体は、重鎖の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７または８個）の特定の位置において、変異（例えば、欠失、置換または付加）を含み、その結果、この抗体のエフェクター機能（例えば、この抗体がＦｃレセプターまたは相補因子に結合する能力）が、この抗体がＣｒｉｐｔｏに結合する能力に影響を与えることなく変化する（米国特許第５，６４８，２６０号）。これらの重鎖位置としては、残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２（ＥＵ番号付けシステム）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ヒト化抗体は、その重鎖に、突然変異Ｌ２３４Ａ（すなわち、未改変抗体の２３４位におけるロイシンのアラニンでの置換）、およびＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付けシステム）を含み得る。
【００９３】
さらに、本発明のヒト化抗体は、グルコシル化のための部位であるアミノ酸残基において、突然変異（例えば、欠失または置換）を含みえ、その結果、このグルコシル化部位が排除される。このような抗体は、そのＣｒｉｐｔｏ結合親和性を維持しつつ、減少したエフェクター機能または他の所望しない機能を有するために、臨床的に有益であり得る。グリコシル化部位の突然変異もまた、プロセス開発（例えば、タンパク質の発現および精製）のために有益であり得る。例えば、この抗体の重鎖は、突然変異Ｎ２９７Ｑ（ＥＵ番号付けシステム）を含みえ、その結果、この重鎖は、もはやこの部位でグリコシル化され得ない。
【００９４】
さらに他の実施形態において、本発明の抗体の重鎖および/または軽鎖は、Ｃｒｉｐｔ
ｏへの結合に対する親和性を増加し、それによりＣｒｉｐｔｏ媒介性障害を処置するための効力を増加する突然変異を含む。
【００９５】
本発明のモノクローナル抗体は、所望機能を実施するかまたは増大させるほかの部分をさらに含み得る。例えば、この抗体は、抗体によって標的化される細胞を殺傷するために毒性部分（例えば、破傷風毒素またはリシン）または放射性核種（例えば、１１１Ｉｎまたは９０Ｙ）を含み得る（例えば、米国特許第６，３０７，０２６号を参照のこと）。この抗体は、単離または検出を容易にするための部分（例えば、ビオチン、蛍光部分、放射活性部分、ヒスチジンタグまたは他のペプチドタグ）を含み得る。この抗体はまた、その血清半減期を延長し得る部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）、および免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメント（例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の一部（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域））を含み得る。
【００９６】
抗体フラグメントおよび一価の抗体もまた、本発明の方法および組成物で使用され得る。一価の抗体は、第２の重鎖のＦｃ（またはステム）領域に結合した重鎖/軽鎖ダイマー
を含む。「Ｆａｂ領域」とは、重鎖のＹ分枝部分を含む配列に対して、および軽鎖全体に対してほぼ等価であるかまたは類似しており、かつ一緒になって（凝集体で）抗体活性を示すことが示されている鎖の部分をいう。Ｆａｂタンパク質は、１つの重鎖および１つの軽鎖（一般的に、Ｆａｂ’として知られている）の凝集体、ならびに四量体を含み、この四量体は、上記のいずれかが共有結合で凝集していても非共有結合で凝集していても、この凝集が特定の抗原または抗原ファミリーと特異的に反応し得る限りは、抗体Ｙの２つの分枝セグメント（一般に、Ｆ（ａｂ）２として公知）に対応する。
【００９７】
（ＩＩＩ．シグナル調節）
本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏ活性および/またはＣｒｉｐｔｏとそのリガンドとの相
互作用を阻害し得る。Ｃｒｉｐｔｏ活性の過剰発現は、脱分化状態促進間葉細胞特性、増殖の増加、および細胞移動（Ｓａｌｏｍｏｎら．，１９９９，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２１：６１−７０；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら．，１９９４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２９１−９８；およびＢａｌｄａｓｓａｒｒｅら．，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：５３８−４３）、新生物形成において見られる細胞形質転換に関連した表現型をもたらし得る。
【００９８】
Ｃｒｉｐｔｏ抗体の活性およびＣｒｉｐｔｏ活性を阻害するその能力を試験する１つの方法は、Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏノックアウト（ＫＯ）細胞株を用いることである（Ｍｎｃｈｉｏｔｔｉら．，２０００，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３−４２）。Ｃｒｉｐｔｏは、Ｓｍａｄ２リン酸化およびＸｅｎｏｐｕｓ胚における転写因子ＦＡＳＴを刺激し、そしてこの転写因子ＦＡＳＴの活性は、ＦＡＳＴ調節エレメント−るルシフェラーゼレポーター遺伝子由来のルシフェラーゼ活性を測定することによってモニタリングされ得る（Ｓａｉｊｏｈら．，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：３５−４７）。Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子においてヌル突然変異を有し、かつＣｒｉｐｔｏ依存性シグナル伝達を伝達し得ない（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、前出）。Ｃｒｉｐｔｏ活性は、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞をＣｒｉｐｔｏ、ＦＡＳＴ、およびＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ遺伝子構築物でトランスフェクトすることによって、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において評価され得る。Ｃｒｉｐｔｏ依存性ＦＡＳＴルシフェラーゼ活性は、Ｃｒｉｐｔｏ ｃＤＮＡおよびＦＡＳＴ ｃＤＮＡがこれらの細胞にトランスフェクトされない限り、これらの細胞において見出されない。Ｃｒｉｐｔｏ依存性Ｎｏｄａｌシグナル伝達をブロックし抗体、Ｃｒｉｐｔｏ活性をブロックする抗体である。
【００９９】
Ｃｒｉｐｔｏの活性を測定し得る他のアッセイ（例えば、軟質寒天アッセイ）が、当業者によって使用され得る（例えば、以下の実施例４を参照のこと）。軟質寒天で細胞が増殖する能力は、細胞形質転換に関連し、そしてそのアッセイは、腫瘍細胞増殖の阻害を測定するための古典的インビトロアッセイである。活性の阻害を決定するのに有用な他のアッセイとしては、プラスチック上のインビトロアッセイなどが上げら得る。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害する。本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏがアクチビンＡに結合し得、かつアクチビンＢシグナル伝達経路を阻害し得ることを発見した。アクチビンＢは、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る（Ｒｉｓｂｒｉｄｇｅｒら．，２００１，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２２２：８３６−５８）。アクチビンＢへのＣｒｉｐｔｏの結合はまた、増殖のアクチビンＢ誘導性の阻害を破壊し得る。
【０１０１】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の活性およびそれがＣｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害する能力を試験するための１つの方法は、増殖のアクチビンＢ誘導性阻害のＣｒｉｐｔｏ媒介性破壊を防止する抗体の能力を測定することである。１つのこのような方法は、実施例９に記載される。抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体がＣｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害する能力を直接試験するための方法は、実施例１１に記載される。
【０１０２】
（ＩＶ．治療的用途）
本発明の抗体はまた、治療目的（例えば、腫瘍細胞増殖の阻害）、Ｃｒｉｐｔｏを検出または定量するための診断目的、およびＣｒｉｐｔｏの精製のために有用である。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、患者の腫瘍細胞の増殖を阻害（特に、腫瘍増殖がアクチビンＢシグナル伝達の欠失または減少によって媒介される場合）する抗体が提供される。特定の実施形態において、腫瘍細胞は、脳、心臓、首部、前立腺、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍細胞である。
【０１０４】
他の実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、かつＣｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍細胞を阻害する抗体が提供される。一実施形態において、この腫瘍細胞は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する細胞株（例えば、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の癌に由来する細胞株）である。
【０１０５】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体は、以下の実施例４に例示されるように、当業者によって使用される標準的なプロトコールに従って、強力な抗癌剤としてのインビボ活性についてスクリーニングされ得る。このようなプロトコールの例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）によって、その「インビボ癌モデルスクリーニング」プロトコール、ＮＩＨ公開番号８４−２６３５（Ｆｅｂ １９８４）において概説されている。
【０１０６】
本発明の他の実施形態において、本発明の抗体は、癌性腫瘍を有する患者を処置するために使用される。
【０１０７】
本発明の抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わされ、そして治療有効用量で患者に投与される。腫瘍の増殖を阻害する方法の考察については、例えば、米国特許第６，１６５，４６４号を参照のこと。
【０１０８】
Ｃｒｉｐｔｏレベルの上昇またはアクチビンＢレベルの低下に関連する障害に罹患した哺乳動物を処置する方法もまた包含され、ここでこの方法は、この哺乳動物に有効量の抗体（これはＣｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープ（これに限定されない）に特異的に結合する）を投与する工程を包含し、このエピトープは、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチなドメインである。
【０１０９】
Ｃｒｉｐｔｏレベルの上昇に関連した障害に罹患した哺乳動物を処置する方法もまた包含され、ここでこの方法は、この哺乳動物に有効量の抗体を投与する工程を包含し、この抗体は、Ｃｒｉｐｔｏと複合体を特異的に形成し、かつ以下からなる群から選択される抗体が指向されるエピトープに指向される：Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｅ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２。
【０１１０】
Ｃｒｉｐｔｏの検出による診断は、本発明の新規の抗体を使用して、標準的なアッセイによって容易に達成され、当業者は、特に種々のサンプル、培養物などの中のＣｒｉｐｔｏの存在を検出し得る。
【０１１１】
本命際書中に記載の任意の目的のために、本発明の抗体を含むキットもまた企図される。一般に、本発明のキットは、抗体が免疫特異的であるコントロール抗原を含む。実施形態は、すべての試薬およびその使用のための使用書を含む。
【実施例】
【０１１２】
本発明のさらなる特徴が、以下の実施例から明らかとなる。以下の実施例は、例示のみの目的のためであり、いかなる様式でも本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではないことが理解される。
【０１１３】
（実施例１：Ｃｒｉｐｔｏの発現および精製）
ｐＳＧＳ４８０と名付けた発現プラスミドを、ヒトＣｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基１〜１６９（アミノ酸１〜１６９（配列番号１））をコードするｃＤＮＡをサブクローニングし、ベクターｐＥＡＧ１１００中でヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（すなわち、「ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃ」）と融合させることにより構築した。このベクターのより詳細な説明については、米国特許出願第６０／２３３，１４８号（２０００年９月１８日出願）を参照のこと。このベクターｐＥＡＧ１１００は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−ｂｅｔａｇａｌの誘導体であり、ＣＨＯ一過的トランスフェクションでのその使用が、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｉら、１９９９、Ｆｏｃｕｓ ２１：１６によって記載された。以下のように、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼＮｏｔＩフラグメントをプラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−Ｂｅｔａｇａｌ（カタログ番号１０５８６−０１４）から除去することにより、このベクターを作製した：プラスミドをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、その４．３８ｋｂのＮｏｔＩベクター骨格をゲル精製して、ライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。単離した単一のコロニーから、ｐＥＡＧ１１００を所望の組替え体を含むプラスミドとして単離した。プロモーター、ポリリンカー、および転写終結シグナルを含むｐＥＡＧ１１００の配列を、確認した。
【０１１４】
プラスミドｐＳＧＳ４８０をＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトし、この細胞を２８℃で７日間増殖させた。これらの細胞および馴化培地中でのＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質の存在をウエスタンブロット分析によって試験した。ウエスタンブロット分析について、Ｃｒｉｐｔｏトランスフェクト細胞に由来する馴化培地および細胞を、還元条件下で４〜２０％の勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動的にニトロセルロースに転写し、そしてＣｒｉｐｔｏ融合タンパク質を、Ｃｒｉｐｔｏ１７マーペプチド（配列番号１の残基９７〜残基１１３を含む）−キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）結合体に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清で検出した。遠心分離して細胞を除去した後で、ウエスタンブロット分析により、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質が、馴化培地（上澄液）中に効率的に分泌されていることが示された。この上澄液をプロテインＡ−セファロース（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、そして結合しているタンパク質を２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出したタンパク質を０．５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）で中和し、２４０〜３４０ｎｍでの吸光度の測定値から全タンパク質含量について分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について分析した。溶出したタンパク質を０．２ミクロンフィルターを通して濾過し、−７０℃で保存した。
【０１１５】
（実施例２：抗体の産生およびスクリーニング） 溶出したＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質および他のＣｒｉｐｔｏポリペプチドをマウスに注射し、当業者に公知の標準的技術を使用してハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を産生する。
【０１１６】
（Ａ．抗体の産生）
メスのロバートソニアン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｉａｎ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を、フロイント完全アジュバント（「ＦＣＡ」；ＧｉｂｃｏＢＲＬ 番号１５７２１−０１２）で乳化した２５μｇの精製ヒトＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃで腹腔内に免疫した。それらをフロイント不完全アジュバント（「ＦＩＡ」；ＧｉｂｃｏＢＲＬ 番号１５７２０−０１４）で乳化した２５μｇのＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃを２回、そしてプロテインＡビーズを１回、腹腔内に（ＩＰ）ブースター投与した。血清をスクリーニングし、最後のブースター投与の３週間後に、最も良い力価を有していたマウスに、融合の３日前に５０μｇの可溶性ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃを腹腔内にブースター投与した。このマウスに、融合の前の日に５０μｇのＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃを静脈内に（ＩＶ）ブースター投与した。
【０１１７】
脾臓１：ミエローマ６の比で、マウス脾臓細胞をＦＬ６５３ミエローマ細胞と融合させ、選択培地において、９６ウェル組織培養プレート中に１ウェルあたり１００，０００細胞、３３，０００細胞および１１，０００細胞でプレートした。１週間後、増殖について陽性であるウェルを、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡでスクリーニングした。２回の融合を実行した。
【０１１８】
（Ｂ．抗体のスクリーニング）
１回目または２回目の融合によって生じた上澄液を、最初に、Ｃｒｉｐｔｏ（ｄｅｌ Ｃ）の認識および／またはＣｒｉｐｔｏ ＥＧＦ様ドメインタンパク質についてＥＬＩＳＡプレート上でスクリーニングした。ヒトＦｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を除くために、コントロールの融合タンパク質（ＬＴ−βレセプター−Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ＥＬＩＳＡを下の節Ｃに記載するように実行した。一回目の融合において、最初の上澄液をまた、精巣腫瘍細胞株ＮＣＣＩＴ上の細胞表面Ｃｒｉｐｔｏタンパク質を認識するその能力について、ＦＡＣＳによってもスクリーニングした。２回目の融合において、２つの腫瘍細胞株、ＮＣＣＩＴおよび乳癌系統ＤＵ４４７５上のＣｒｉｐｔｏを認識する上澄液の能力を、ＦＡＣＳによって分析した。２次的スクリーニングは、以下を試験する工程を含んでいた；一群の腫瘍細胞株上の細胞表面Ｃｒｉｐｔｏを認識するモノクローナル抗体上澄液の能力（結果については表１および２を参照のこと）、ヒトの乳房腫瘍および結腸腫瘍の組織切片においてヒトＣｒｉｐｔｏを免疫組織化学的に認識するモノクローナル抗体の能力、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達アッセイにおいてシグナル伝達を阻止するモノクローナル抗体の能力、プラスチック上またはソフトアガーアッセイにおける腫瘍細胞株の増殖を阻止する能力、および細胞表面Ｃｒｉｐｔｏを内在化させる能力。
【０１１９】
（Ｃ．ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように実行した：
材料：
プレート：Ｃｏｓｔａｒ ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅａｓｙ−ｗａｓｈ ９６Ｗ ｐｌａｔｅ（０７−２００−６４２）
二次抗体：Ｐｉｅｒｃｅ Ｇｔ ａｎｔｉ−Ｍｓ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｐ１３１４３０）
基質：Ｐｉｅｒｃｅ ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（３４０２１）
停止溶液：１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
バッファー： 結合バッファー：０．１Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ９．０）
ブロッキングバッファー：ＰＢＳ＋１０％ ドナー（Ｄｏｎｏｒ）仔ウシ血清
洗浄バッファー：ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０。
【０１２０】
抗原ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−ＦｃおよびＣＲ−ＥＧＦ−Ｆｃ、コントロールｈｕ ＩｇＧ１融合タンパク質を結合バッファーで希釈して５００ｎｇ／ｍｌとした。１ウェルにつき１００μｌを添加し、３７℃で１時間、または４℃で一晩中インキュベートした。液体をデカントし、このプレートを逆さにして乾燥するまでブロットした。次いで、１ウェルにつき２５０μｌのブロッキングバッファーを添加し、続いて３０分間、３７℃でインキュベートした。再度、液体をデカントし、このプレートを逆さにして乾燥するまでブロットした。上澄液を洗浄バッファーで１：５０に希釈し、１ウェルにつき５０μｌでプレートし、続いて、室温で１時間インキュベーションした。プレートを、１ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回激しく洗浄した。次いで、洗浄バッファーで１：１０，０００に希釈した二次抗体を１ウェルにつき１００μｌで添加した。続いて３０分間、室温でインキュベートした。次いで、プレートを１ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで激しく３回洗浄し、次いで、基質を１ウェルにつき１００μｌで添加した。色を十分に暗くなるまで発色させ、次いで、１ウェルにつき１００μｌの停止バッファーを添加し、プレートを４５０ｎｍの吸光度について読み取った。
【０１２１】
特定の実験において、本発明者らは、０．１Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ９．０）中０．５μｇ／ｍｌのＣｒｉｐｔｏタンパク質の１００μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、９６ウェルプレートをＣｒｉｐｔｏタンパク質でコーティングした。本発明者らは、プレートをＰＢＳ／１０％ ＤＣＳでブロックした。本発明者らは、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で希釈した抗体を１ウェルにつき５０μｌで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。本発明者らは、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で洗浄し、抗マウス−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）でプローブした。本発明者らは、ＴＭＢを添加し、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、４５０ｎｍで読み取ることによって、結合した抗体を検出した。
【０１２２】
また他の実験において、本発明者らは、５０ｍＭ 炭酸塩（ｐＨ９．５）中３〜５μｇ／ｍｌのアクチビンＢまたは他のリガンドを各ウェルに１００μｌ添加することによって９６ウェルプレートをコーティングした。本発明者らは、プレートを１時間、室温でインキュベートし、４℃で一晩中ＴＢＳ／１％ ＢＳＡでブロックした。本発明者らは、プレートを室温でブロッキングバッファー中のＣＲ−ＦｃまたはＡＬＫ４−Ｆｃと共にインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、抗ヒト−ＡＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）でプローブした。本発明者らは、プレートをＴＢＳＴで洗浄し、１０×基質バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）で１回洗浄し、ＣＳＰＤおよびＳａｐｐｈｉｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｉｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。
【０１２３】
（Ｄ．フローサイトメトリー）
細胞表面染色およびフローサイトメトリーを以下のように使用して、Ｃｒｉｐｔｏへの結合についてモノクローナル抗体をアッセイするために、Ｃｒｉｐｔｏ陽性細胞株を使用し得る：
５ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で１０分間用いて、２ｍｌのＰＢＳを有するＴ１６２フラスコ中から細胞を遊離させる。血清を含有する培地で２０ｍｌにまで量を増やして、細胞の塊を分解するために数回上下にピペッティングする。１２００ｒｐｍで５分間回転させる。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（４℃）（洗浄バッファー）の５〜１０ｍｌで細胞を洗浄する。１２００ｒｐｍで５分間回転させる。洗浄バッファーで４×１０６〜１０７／ｍｌで再懸濁する。氷上で保持する。
【０１２４】
染色のために抗体を調製する。精製抗体を洗浄バッファーで希釈して１〜１０μｇ／ｍｌにする。９６ウェル Ｌｉｎｂｒｏ Ｖ ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｐｌａｔｅ（ＩＣＮ ７６３２１０５）に５０μｌの細胞を添加する。分析されるべき各細胞株についての各コントロールのための細胞を１つのウェルにプレートする。このようなコントロールのための細胞としては、抗体なし、二次抗体のみ、ハイブリドーマ培地、ポジティブコントロールの抗体上澄液（利用可能であるか、または精製されている場合）、およびＩｇＧサブクラスコントロール（精製抗体を使用する場合）のための細胞が挙げられる。
【０１２５】
分析されるべき各細胞株の各実験サンプルのための細胞を1つのウェルにプレートした
。４℃にした卓上遠心分離機を使用して、プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させる。プレートを逆にして、液体が実質的に除去されるまで振ることによって、バッファーを取り除く。ウェルに４０〜５０μｌの抗体（または、抗体なしのコントロールウェルおよび二次抗体のみのコントロールウェルについては洗浄バッファー）を添加する。少なくとも３０分間〜１時間、４℃でインキュベートする。プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させる。抗体溶液を取り除く。１ウェルにつき２００μｌの洗浄バッファーで２回ウェルを洗浄する（各洗浄のあとには回転させる。）。バッファーを取り除く。
【０１２６】
各ウェルの細胞を５０μｌの（洗浄バッファー中）１：２００希釈のＲ−ＰＥタグ化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ カタログ番号１１５−１１６−０７１）に再懸濁する。暗黒下で２０分間、４℃でインキュベートする。各ウェルの細胞に１５０μｌの洗浄バッファーを添加する。プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させる。１ウェルにつき２００μｌの洗浄バッファーで１回洗浄する。ＰＢＳ中１％ＰＦＡの１５０μｌ中に細胞を再懸濁する。各ウェルの内容物を別個のチューブ（５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎポリスチレン丸底チューブ−３５２０５２）に移す。チューブを薄いホイルでラップする。
【０１２７】
次いで、チューブの内容物をフローサイトメトリーで読み取る。
【０１２８】
本方法によって分析した特定のモノクローナル抗体の２回のスクリーニングの結果、下の表１および２にまとめてある、以下の結果が得られた。ここで、第１の列は、ハイブリドーマのサブクローンについてつけた名称を提供し、次の２つの列は、ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示し、残りの列は、４つのｃｒｉｐｔｏ陽性細胞株についてのフローサイトメトリー分析の結果を示す。この結果は、平均蛍光指標（ＭＦＩ）の単位で示してある。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
【表２】
本発明者らはまた、下に示すように、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質および領域特異的Ｃｒｉｐｔｏペプチドを使用する多数の別の免疫プロトコルを使用した。これらの場合において、本発明者らはまた。記載するようにハイブリドーマを産生した。ＣｒｉｐｔｏペプチドをＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質に加えて、またはＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質の代わりに使用した。これらのプロトコルによって、本発明の抗体のいくつかを同定した。当業者に理解されるように、これらの実験によって、複数の多様な免疫プロトコルが、本発明の抗体を産生するために使用され得ることが示された。
【０１３１】
１つの例示的な免疫プロトコルにおいて、キーホールリンペットへモシアニン（ＫＬＨ）と結合した可溶性ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃ組換えタンパク質または領域特異的Ｃｒｉｐｔｏペプチドのいずれか５０μｇ、およびフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む乳剤で、８週齢のメスのＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を腹腔内に（ＩＰ）免疫した。詳細には、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質−ＫＬＨまたはＣｒｉｐｔｏペプチドＣＲ４０（アミノ酸３６〜４２；配列番号３）−ＫＬＨを、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）で２ｍｇ／ｍｌの推定濃度に希釈した。乳化および免疫の前に、このタンパク質に等容量のＦＣＡを添加した。乳化したＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質−ＫＬＨまたはＣｒｉｐｔｏペプチドＣＲ４０−ＫＬＨの５０μｇを含む５０μｌを、初回の免疫のために各マウスにＩＰ投与した。下に示すように、後の全ての免疫を、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）またはＲＩＢＩアジュバント１，２（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のいずれかを使用して同様に投与した。ブースター免疫を、２〜３週毎に投与した。1回目の免疫の前、ブースター免
疫の7日後、そしてまたリンパ球細胞との融合の前に、免疫したマウスの血清サンプルを
収集した。以下に示すように、ＥＬＩＳＡアッセイおよびフローサイトメトリーアッセイの両方を使用して、血清力価を測定した。
【０１３２】
異なるＣｒｉｐｔｏ抗原による種々の例示的な免疫プロトコールおよびそれによって同定される抗体は、以下の通りである：
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
【表５】
抗原４−（ｘ＝ＫＬＨに結合体化したペプチドの数；本発明者らはまた、例えば、プロトコールＣにおいて記載されたようにＣＲ（ｄｅｌＣ）−Ｆｃにより予め免疫されたマウスにＫＬＨと結合体化したペプチドを注入する）：
本発明者らが使用した例示的なＣＲｘペプチドの配列および全長Ｃｒｉｐｔｏタンパク質におけるそれらの位置は、以下の通りである：
ＣＲ４０＝ＦＲＤＤＳＩＷＰＱＥＥＰＡＩＲＰＲ（ａａ４６−４２，Ａ１０．Ｂ２；配列番号：３）
ＣＲ４１＝ＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫＥ（ａａ９７−１１３；配列番号：４）
ＣＲ４３＝ＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫＣ（ａａ １１６−１２８；配列番号：５）
ＣＲ４４＝ＳＬＣＫＳＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱ（ａａ １２９−１４３；配列番号：６）
ＣＲ４９＝アセチル化Ｎ−ＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＲＥＮＣＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫ−ＣＯＯ−（ａａ１００−ａａ１２７；配列番号：７）
ＣＲ５０＝アセチル化Ｎ−ＬＮＥＧＴＣＭＬＧＳＦＣＡＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫ−ＣＯＯ−（ａａ８４−ａａ１１２，フコシル化領域を含む；配列番号：８）
ＣＲ５１＝アセチル化Ｎ−ＰＨＮＴＷＬＰＫＫＣＳＬＣＫＣＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱＡＦＬＰＧＣＤ−ＣＯＯ−（ａａ１１９−ａａ１５０；配列番号：９）
【０１３６】
【表６】
（実施例３：Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害についてのヌル細胞アッセイ）
以下は、Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害を評価するのに使用したＦ９ Ｃｒｉｐｔｏヌル細胞シグナル伝達アッセイを記載する。
【０１３７】
第０日 ６ウェルのプレートを０．１％ゼラチン ２ｍｌ／ウェルで３７℃１５分間コーティングする。１ウェルあたり６×１０５ Ｆ９ ＣＲＩＰＴＯ ＮＵＬＬ細胞で細胞を播種する
第１日 トランスフェクション：以下のサンプルの各々を３００μｌのＯｐｔｉＭｅｍ１に加えて、各サンプルについての溶液Ａを得る：
サンプル１：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ ＦＡＳＴ レポーター ｃＤＮＡ
および１．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル２：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ ＦＡＳＴ，および１μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル３：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ ＡＤＤ ０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル４：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル５：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル６：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル７：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル８：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル９：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
【０１３８】
溶液Ｂは、３０μｌのリポフェクタミンおよび２７０μｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を含む。
【０１３９】
各サンプルについて、溶液Ａと溶液Ｂを一緒に混合する。室温で４５分間インキュベートする。２ｍｌ／ウェルのＯｐｔｉＭｅｍ１でウェルを洗浄する。次の工程の直前に吸引する。
【０１４０】
２．４ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を溶液Ａ＋Ｂの各混合物に加え、混合し、１．５ｍｌ／ウェルを加えて、ウェルを複製する。３７℃で５時間インキュベートする。１．５ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭおよび２０％のＦＣＳ、２ｍＭ Ｇｌｎ、Ｐ／Ｓをウェルに加え、これらのウェルは、サンプル１〜３を受容する。以下のように抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を加える：サンプル４ウェル：Ａ２７Ｆ６．１，１０μｇ／ｍｌ；サンプル５ウェル：Ａ２７Ｆ６．１，２μｇ／ｍｌ；サンプル６ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８；１０μｇ／ｍｌ，サンプル７ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８ ２μｇ／ｍｌ；サンプル８ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８，１０μｇ／ｍｌ；サンプル９ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８，２μｇ／ｍｌ。
【０１４１】
第２日 培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄（２ｍｌ／ウェル）する。先日のように同量のＣｒｉｐｔｏ抗体と共にＤＭＥＭおよび０．５％ ＦＣＳ，２ｍＭ Ｇｌｎ，Ｐ／Ｓを同じウェルに加える。
【０１４２】
第３日 ルシフェラーゼシグナルを現像する。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＭｇ２＋によりウェルを洗浄（２ｍｌ／ウェル）する。ＬｕｃＬｉｔｅキット（Ｐａｃｋａｒｄカタログ番号；６０１６９１１）を使用する。緩衝液と基質とを室温にする。光を薄暗くする。１０ｍｌの緩衝液により基質を再構築する。ＰＢＳおよびＣａ２＋およびＭｇ２＋により１：１に希釈する。ウェルを吸引する。反復ピペッターを使用して、１ウェルあたり２５０μｌの希釈した基質を素早く加える。溶液をかき混ぜ、９６ウェル白色不透明底プレート（Ｆａｌｃｏｎ３５−３２９６）のウェルに２００μｌを移す。Ｗｉｎｇｌｏｗを使用して照度計上でプレートを読み取り、データをＥｘｃｅｌ（登録商標）にエキスポートする。
【０１４３】
本発明の特定の抗体によるこのアッセイの結果を以下の表３に要約する。
【０１４４】
【表７】
本発明者らはまた、Ａ２７Ｆ６．１抗体の他の濃度を試験した。本発明者らは、これらの細胞の培地に０．５〜２０ ｍｇ／ｍｌのｍａｂ Ａ２７Ｆ６．１を加えることで、Ｃｒｉｐｔｏ誘導性ルシフェラーゼシグナルを３４〜９５％阻害したことを観察した（図１）。本発明者らはまた、本発明の他の抗体を試験し、ｍａｂ Ａ６Ｃ１２．１１およびｍａｂ Ａ８Ｇ３．５はまた、シグナル生成を阻害したことを観察した。
【０１４５】
代替のアッセイ系として、本発明者らは、ＮＣＣＩＴ細胞におけるＦＡＳＴ／（Ｎ２）７−ｌｕｃ活性の阻害について本発明のＣｒｉｐｔｏ特異的ｍａｂを試験した。ＮｏｄａｌおよびＡＬＫ４の異所性発現が、レポーター活性化に対してこれらの細胞において必要であることを除いて、これらのアッセイはＦ９細胞についてのアッセイと同様であった。本発明者らは、ｍａｂ Ａ２７Ｆ６．１が、２μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌの両方において、これらの細胞におけるルシフェラーゼ活性を９０％減少させたことを観察した（図２）。
（実施例４：腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害についてのアッセイ）
Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害はまた、軟寒天におけるＧＥＯ細胞の増殖を測定することによってアッセイされ得る。例えば、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら，１９９４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
９：２９１−９８；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：１０５１−５４を参照のこと。
【０１４６】
本発明者らは、３％のバクトアガー（ｂａｃｔｏａｇａｒ）を融解し、水浴中で４２℃に維持した。本発明者らは、３％のバクトアガー溶液と予め温めた完全培地とを混合し、０．６％のバクトアガーの溶液を作製して、これを４２℃に維持した。本発明者らは、４ｍｌの溶液を６ｃｍの皿にプレーティングし、これを少なくとも３０分間冷却し、底に寒天層を形成した。本発明者らは、ＧＥＯ細胞をトリプシン処理し、完全培地中、１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。本発明者らは、この細胞懸濁物にアッセイされるべき抗体、またはコントロールを加え、２０μｇから１μｇまで抗体を滴定した。本発明者らは、等容量のＧＥＯ細胞懸濁物と０．６％のバクトアガーとを混合し、底にある寒天層の上面に２ｍｌ重ねた。本発明者らは、プレートを少なくとも１時間冷却した。本発明者らは、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、１４日間インキュベートした。本発明者らは、顕微鏡を用いなくても確認できるコロニーをカウントした。ネガティブコントロールと比較して、コロニーが存在しないことは、試験した抗体がインビトロで腫瘍細胞増殖を阻害したことを示した。
【０１４７】
このアッセイを使用して、抗体Ａ２７Ｆ６．１およびＢ６Ｇ７．１０について表４に示される結果を得、これらの両方の抗体は、ＧＥＯ細胞コロニーの増殖を減少させる能力を実証する。
【０１４８】
【表８】
本発明者らは、Ｔ−４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ）による増殖阻害アッセイを実施し、この細胞は、実施例９に記載されるように非腫瘍形成性ヒト胸部癌腫である。
（実施例５：腫瘍細胞増殖のインビボ阻害についてのアッセイ）
腫瘍細胞増殖の阻害を評価するために、ヒト腫瘍細胞株を無胸腺ヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍阻害に対する相乗作用効果または相加効果を提供し得るさらなる化学療法処置の有無のもと、本発明の抗体の効果を観察する。
【０１４９】
このアッセイは、以下の異なる腫瘍細胞株を用いて代替的に実施され得る：例えば、ＧＥＯ（十分に分化したヒト結腸癌インビトロ細胞株であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる）、ＤＵ−４４７５（ＡＴＣＣから得られる乳癌インビトロ細胞株）、ＮＣＣＩＴ（ＡＴＣＣから得られる精巣腫瘍細胞株）、または当該分野で公知の他のもの。このようなアッセイの１つの例を以下に記載する。
【０１５０】
動物を耳をパンチすることで個別にマーキングする。ＧＥＯ細胞株をインビトロまたはインビボで１〜４回継代させる。動物に右側腹領域の皮下にＧＥＯ細胞を移植する。以下の動物の群を使用し得る：
グループ番号 処置 マウスの番号
１． 生理食塩水 コントロール，０．２ｍｌ／マウス， ２０
ｉ．ｐ．１週間に３回（Ｍ，Ｗ，Ｆ）
２． Ｍａｂ，低用量，ｉ．ｐ． １０
３． Ｍａｂ，中用量，ｉ．ｐ． １０４． Ｍａｂ，高用量，ｉ．ｐ． １０
５． ５−ＦＵ，３０ ｍｇ／ｋｇ／注入，ｉ．ｐ．， １０
３ Ｒｘ／ｗｋ （Ｍ，Ｗ，Ｆ）
６． シスプラチン，２ ｍｇ／ｋｇ／注入，ｓ．ｃ．， １０
Ｒｘ／ｗｋ（Ｍ，Ｗ，Ｆ）
７． アドリアマイシン，１．６ ｍｇ／ｋｇ／注入，ｉ．ｐ．， １０
３ Ｒｘ／ｗｋ（Ｍ，Ｗ，Ｆ）
８． イリノテカン，１０ ｍｇ／ｋｇ／注入．，ｉ．ｐ．， １０
５ Ｒｘ／ｗｋ（Ｍ−Ｆ）
９． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋ ５−ＦＵ １０
（中間用量）
１０． ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋ ５−ＦＵ １０
（中間用量）
１１． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋ ５−ＦＵ １０
（中間用量）
１２． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋シスプラチン １０
グループ番号 処置 マウスの番号
（中間用量）
１３． ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋シスプラチン １０
（中間用量）
１４． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋シスプラチン １０
（中間用量）
１５． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋アドリアマイシン １０
（中間用量）
１６． ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋ １０
アドリアマイシン（中間用量）
１７． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋アドリアマイシン １０
（中間用量）
１８． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋イリノテカン １０
（中間用量）
１９ ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋ １０
イリノテカン（中間用量）
２０． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋イリノテカン １０
（中間用量）
第０日：腫瘍を移植し、動物の初期体重を記録する。
第１日：上記の処置を開始する。
第５日：腫瘍サイズ測定および体重測定を開始し、実験が終了するまで１週間に２回継続する。
【０１５１】
初期体重、腫瘍サイズおよび体重測定、屠殺のときの組織学、および腫瘍についての免疫組織化学分析を、Ｃｒｉｐｔｏ発現、腫瘍増殖、およびそれらの阻害について試験する。
【０１５２】
（実施例６：インビボ異種移植片腫瘍モデル−Ｃｙｓリッチブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌腫細胞株をＣｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した。実験方法を以下に列挙する。結果を図３に示す。
【０１５３】
（方法および材料）
動物：無胸腺ヌードマウスを使用した。耳を穿孔することによって、動物を個々に番号付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ、縦隔混合型胚細胞ヒト精巣癌腫インビトロ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから元々得られた）。細胞株を、抗生物質無しで、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中で６継代にわたって、インビトロで継代させた。動物の右側腹部に、５×１０６細胞／０．２ｍｌマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で動物に皮下的に移植した。
【０１５４】
【表９】
処置を１日目に開始した。
【０１５５】
試験スケジュール
−１日目：マウスをコントロール群および処置群に無作為化した。動物の初期の体重を記録した。最初の処置を抗体群に施した。投薬溶液を作製した。アッセイが終了するまで、技師に対して処置は盲検であった。
０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍において細菌培養を実施した。
１日目：最初の処置をポジティブな化学療法群へ施した。
４日目：マトリゲルにおいて腫瘍ベースラインについての初期腫瘍サイズ測定を記録した。マウス２×／週で、腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。研究を毎日モニターし、そして動物について任意の異常な観測を記録した。
終点：初期体重
腫瘍サイズおよび体重測定。
【０１５６】
（実施例７：インビボ異種移植片腫瘍モデル−ＥＧＦ様ドメインブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌腫細胞株を、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した。実験方法を以下に列挙する。結果を図４に示す。
【０１５７】
（方法および材料）
動物：無胸腺ヌードマウスを使用した。耳を穿孔することによって、動物を個々に番号付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ、縦隔混合型胚細胞腫ヒト精巣癌インビトロ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから元々得られた）。細胞株を、抗生物質無しで、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中で８継代にわたって、インビトロで継代させた。動物の右側腹部に、５×１０６細胞／０．２ｍｌマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で動物に皮下的に移植した。
【０１５８】
【表１０】
処置を１日目に開始した。
【０１５９】
試験スケジュール
−１日目：マウスをコントロール群および処置群に無作為化した。動物の初期の体重を記録した。最初の処置を抗体群に施した。投薬溶液を作製した。アッセイが終了するまで、技師に対して処置は、盲検であった。
０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍において細菌培養を実施した。細菌培養をは、サンプリングの２４時間後および４８時間後に、混入についてネガティブであった。
１日目：最初の処置をポジティブな化学療法群へ施した。
４日目：マトリゲルにおいて腫瘍ベースラインについての初期腫瘍サイズ測定を記録した。マウス２×／週で、腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。研究を毎日モニターし、そして動物について任意の異常な観測を記録した。
終点：初期体重
腫瘍サイズおよび体重測定。
【０１６０】
（実施例８：Ｃｒｉｐｔｏ ｍａｂは、ＡＬＫ４結合を調節する）
Ｃｒｉｐｔｏ特異的モノクローナル抗体が、ＡＬＫ４（アクチビンＩ型レセプターに結合するＣｒｉｐｔｏの能力と妨害し得るか否かを評価するために、本発明者らは、ＡＬＫ４を安定に発現する２９３細胞株を使用して、フローサイトメトリー分析を使用した。この細胞株を作製するために、２９３細胞を、ＨＡエピトープでＣ末端においてタグ化されたＡＬＫ４を発現するプラスミドおよびピューロマイシンを発現するプラスミドを、１０：１の比で同時トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞をコロニーが形成されるまでピューロマイシン中で選択した。次いで、コロニーを、拾い上げ、増殖させ、そしてＨＡについてウェスタンブロット分析を使用して、ＡＬＫ４発現について分析した。クローン２１（２９３−Ａｌｋ４−２１）が、コントロールの非トランスフェクト２９３細胞と比較して、高レベルのＡＬＫ４を発現することが見出された。
【０１６１】
フローサイトメトリーによってＣｒｉｐｔｏ−ＡＬＫ４結合を分析するために、ヒトＩｇＧ（ＣＲ（ｄｅｌＣ）−Ｆｃ）のＦｃ部分に融合したヒトＣｒｉｐｔｏ（ａａ１〜１６９）の精製された可溶性形態を使用した。約５μｇ／ｍｌのＣＲ（ｄｅｌＣ）−Ｆｃタンパク質またはコントロールＦｃタンパク質を、５０μｌの合計容量のＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で、３０分間、氷上で３×１０５ ２９３−Ａｌｋ４−２１細胞とともにインキュベートした。抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を含有するサンプルについて、５μｇ／ｍｌのＣｒｄｅｌＣ−ＦＣを、細胞の添加の前に、氷上で、５０μｇ／ｍｌの各Ｃｒｉｐｔｏ抗体（Ａ１０．Ｂ２．１８、Ａ４０．Ｇ１２．８、Ａ２７．Ｆ６．１、Ａ８．Ｈ３．１、Ａ１９．Ａ１０．３０、Ａ６．Ｆ８．６、Ａ８．Ｇ３．５、Ａ６．Ｃ１２．１１）とともにプレインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、そして結合したＦｃタンパク質を、細胞をＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓ製のＲ−フィコエリトリン結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）とともにインキュベートすることによって検出した。次いで、サンプルを再び洗浄し、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして標準的フローサイトメトリー手順を使用して分析した。ＦＡＣＳアッセイの結果を図５に示す。
【０１６２】
（実施例９：Ｃｒｉｐｔｏが、乳癌細胞のアクチビンＢ誘導型増殖抑制を破壊する）
ＡＴＣＣからの継代番号２のＴ４７Ｄ細胞（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／１０μｇ／ｍｌインシュリン中で維持した）に、Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥｃｏＲ；Ｂ．Ｅｌｅｎｂａａｓ）について発現プラスミドをトランスフェクトし、そして１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地中で選択した。ｐＢＡＢＥ−ＧＦＰマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の感染を可能にするＴ−４７Ｄ−ＥｃｏＲのコロニーを増殖させ、ｐＢＡＢＥ−ｈＣｒ−ＰＵＲＯ−ＭＬＶにより感染させ、そしてピューロマイシン培地において選択した。このオリゴクローナル株（Ｔ−４７Ｄ−ｈＣｒ）を、特異的抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を用いて、ｈＣｒ（ヒトＣｒｉｐｔｏ）発現についてＦＡＣＳによって分析した。約４０００細胞／ウェルのＴ−４７Ｄ−ＥｃｏＲまたはＴ−４７Ｄ−ｈＣｒを、２５ｎｇアクチビンＢ（Ｒ＆Ｄ）、または２５ｎｇアクチビンＢおよび０．１〜５０μｇ／ｍｌ Ａ８Ｇ３．５を伴う／伴わない２％血清を含有する培地中で、９６ウェルプレートでプレートした。因子を伴う培地を、７〜８日間、毎日交換した。２０μｌ／ウェル ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、プレートを収集し、２時間３７℃でインキュベートし、そして４９０ｎｍで読んだ。
【０１６３】
本発明者らは、アクチビンＡまたはアクチビンＢを伴うかまたは伴わない低血清濃度でＴ−４７Ｄ細胞およびＴ−４７Ｄ−ＥｃｏＲ細胞を増殖させ、そしてＭＴＴ比色アッセイを使用して細胞を増殖するためにアッセイした。本発明者らは、Ｔ−４７Ｄ細胞の増殖が、未処理細胞と比較して、約４０％、アクチビンＡまたはアクチビンＢによって阻害されたことを観察した（図６）。本発明者らはまた、Ｔ−４７Ｄ−ＣＲ細胞が、アクチビンＡによって阻害されたことを観察したが、Ｔ−４７Ｄ−ＣＲ細胞は、アクチビンＢに対して応答性ではなかったことを発見した（図６）。この結果は、これらの細胞の増殖に対するＣｒｉｐｔｏの効果が、アクチビンＢに特異的であることを示す。本発明者らは、未処理のＴ−４７Ｄ細胞およびＴ−４７Ｄ−ＣＲ細胞が、正常培地または低血清条件のいずれにおいても増殖速度が異ならなかったことをコントロール実験において観察した。
【０１６４】
次いで、本発明者らは、本発明の抗体が、Ｃｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害し得るか否かを試験した。本発明者らは、本発明の種々の抗体の存在下で、アクチビンＢを用いて、Ｔ−４７Ｄ−ＣＲを処理した。本発明者らは、アクチビンＢの増殖抑制活性が、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのｍａｂ Ａ８Ｇ３．５の存在下で回復されたことを観察した（図７）。本発明者らは、Ａ２７Ｆ６．１ ｍａｂが、これらの細胞のアクチビンＢ増殖抑制を回復し得なかったことを観察した。
【０１６５】
（実施例１０：Ｃｒｉｐｔｏは、アクチビンＢに直接結合する）。
【０１６６】
本発明者らは、Ｃｒｉｐｔｏが、アクチビンＢに直接結合することを発見した。本発明者らは、精製アクチビンＢ、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＧＤＮＦまたはＢＭＰ２を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、そしてＣＲ−Ｆｃとともにインキュベートした。次いで、本発明者らは、アルカリホスファターゼに結合体化された抗Ｆｃ抗体を添加し、そしてアルカリホスファターゼ基質を添加しそして発色させることによって結合をモニターした。本発明者らは、ＣＲ−Ｆｃが、アクチビンＢを含むウェルに結合したが、アクチビンＡにも他のリガンドにも結合しなかったことを観察した（図８）。さらに、本発明者らは、アクチビンＢコーティングプレートに加える前に、溶液中のアクチビンＡまたはアクチビンＢとともにＣＲ−Ｆｃをプレインキュベートし、アクチビンＢのみが、結合を阻害したことを観察した（図９）。これらの結果は、Ｃｒｉｐｔｏが、アクチビンＢに特異的に結合することを確認した。
【０１６７】
本発明者らはまた、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を分析した。本発明者らは、アクチビンＢが、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＣＲ−Ｆｃに高い強度で直接結合するが、コントロールＬＴβＲ−Ｆｃタンパク質に結合しないことを発見した（図１０）。本発明者らはまた、ＣＲ−Ｆｃに結合するアクチビンＡが、無視され得ることを観察した。これらのデータは、アクチビンＢが約１ｎＭの競合形式アッセイを測定された溶液中で迅速な速度および見かけの親和性でＣｒｉｐｔｏに結合したことを示す。
【０１６８】
Ｃｒｉｐｔｏ抗ＣＦＣモノクローナル抗体２−２Ｃ９．２およびＡ８Ｇ３は、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの相互作用を調節した。これは、アクチビンＢへのＣｒｉｐｔｏの結合が、Ａ８Ｇ３または２−２Ｃ９．２の添加によって阻害された同時免疫沈降実験によって示された。抗アクチビンＢ抗体を用いる従来のウェスタンブロット技術を使用して、阻害を測定した。
【０１６９】
上記の本発明の実施形態のいくつかは、以下に概説され、これらは、以下の実施形態を含むがこれらに限定されない。当業者が理解するように、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の種々の実施形態に対して、多くの変更および改変がなされ得る。全てのこのような変更が、本発明の範囲内に入ることが意図される。
【０１７０】
本明細書中に引用される各刊行物の開示全体が、本明細書によって参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年３月２２日出願の米国出願番号第６０／３６７，００２；２００１年６月２６日出願の米国出願番号第６０／３０１，０９１；２００１年５月１７日出願の米国出願番号第６０／２９３，０２０；２００１年４月２６日に出願の米国出願番号第６０／２８６，７８２に対する優先権を主張する２００２年４月２４日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１９５０に対する優先権を主張する。これらの全内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
一般的に、本発明は、遺伝学および細胞生物学ならびに、分子生物学に関する。さらに詳しくは、本発明は、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃｒｉｐｔｏは、１８８アミノ酸の細胞表面タンパク質である。Ｃｒｉｐｔｏは、ヒト胚性癌ライブラリのｃＤＮＡスクリーンにおいて、思いがけなく単離された（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８：１９８７−９１）。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質は、少なくとも２つの注目すべきドメインを有する：システインに富む（ｃｙｓ−リッチ）ドメインおよび、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーで見られるドメインと類似しているとして、最初に特徴付けられたドメイン。Ｃｒｉｐｔｏとは、もとは、ＥＧＦファミリーのメンバーとして分類されていた（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら，前出）；しかし、その後の分析が、Ｃｒｉｐｔｏが公知のどのＥＧＦレセプターにも結合しないことならびに、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインが実際は、ＥＧＦファミリーから相違することを示した（Ｂｉａｎｃｏら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８６２４〜２９）。
【０００４】
Ｃｒｉｐｔｏシグナル経路は、続行する研究にも関わらず理解されないままである。文献は、種々の異なる経路の活性化を支持している。種々の経路には、ＭＡＰキナーゼ経路（ＤｅＳａｎｔｉｓら，１９９７，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８：１２５７〜６６；Ｋａｎｎａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３３３０〜３５）；ＴＧＦ−β経路（Ｇｒｉｔｓｍａｎら，１９９９，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：９２１〜３２；Ｓｃｈｉｅｒら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０３：３８５〜８９）；Ｗｎｔ経路との可能な相互作用（Ｓａｌｏｍｏｎら，２０００，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ．７：１９９〜２２６）；およびＥＧＦ経路とのクロストーク（Ｂｉａｎｃｏら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８６２４〜２９）が挙げられる。
【０００５】
米国特許第５，２５６，６４３号およびこれに関する２つの特許（米国特許第５，６５４，１４０号、米国特許第５，７９２，６１６号）が、ヒトＣｒｉｐｔｏ遺伝子、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質およびＣｒｉｐｔｏに対する抗体を開示している。
【０００６】
米国特許第５，２６４，５５７号およびこれに関する３つの特許（米国特許第５，６２０，８６６号、米国特許第５，６５０，２８５号ならびに米国特許第５，８５４，３９９号）が、ヒトＣｒｉｐｔｏに関する遺伝子およびヒトＣｒｉｐｔｏに関するタンパク質を開示している。そのＣｒｉｐｔｏに関するタンパク質に結合するが、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質自身の結合によって交差反応しない抗体も開示されている。
【０００７】
小さなＣｒｉｐｔｏペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体でのヒト組織の免疫染色によって示されるように、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の過剰発現は、多くの組織における癌と関係している（脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頚部、膵臓、および胃が挙げられるが、これらに限定されない）。Ｐａｎｉｃｏら，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６５：５１〜５６；Ｂｙｒｎｅら，１９９８，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１８５：１０８〜１１；Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓら，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：４３７〜４０。従って、当該分野は、このような過剰発現の調節、制限、および／または防止、Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害、ならびにＣｒｉｐｔｏ発現の結果を阻害する方法を必要としている（すなわち、細胞形質転換の促進および／または維持）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明の要約）
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する新規な抗体ならびに、このような抗体の作製方法および使用方法を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合する抗体ならびに、Ｃｒｉｐｔｏの活性またはタンパク質の相互作用を阻害する（例えば、Ｃｒｉｐｔｏに結合するため、Ｃｒｉｐｔｏとタンパク質の相互作用で生じるシグナルが、下方調節される）抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、腫瘍の増殖を阻害する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害し、腫瘍の増殖を阻害する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用および／またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックするならびに、腫瘍の増殖を阻害する抗体を提供する。したがって、本発明は以下をも提供する。
（１）
Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメインにおけるエピトープに特異的に結合する抗体。
（２）
前記Ｃｒｉｐｔｏは、配列番号１または２からなる群より選択される、項目１に記載の抗体。
（３）
前記エピトープは、ＥＧＦ様ドメインに存在する、項目２に記載の抗体。
（４）
前記エピトープは、ｃｙｓ−リッチドメインに存在する、項目２に記載の抗体。
（５）
Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、Ｂ６Ｇ７．１０、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２からなる群より選択される、項目２に記載の抗体。
（６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ６Ｇ７．１０、Ａ１７Ｇ１２．１およびＡ１８Ｂ３．１１からなる群より選択される、項目３に記載の抗体。
（７）
Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６、Ａ６Ｃ１２．１１、１−ｌＡ４Ｃ．２および２−２Ｃ９．２からなる群より選択される、項目４に記載の抗体。
（８）
Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２にわたるドメインを含むエピトープに特異的に結合する抗体。
（９）
Ａ１０Ｂ２．１８、Ｂ３Ｆ６．１７、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．２および３−４Ｅ８．３からなる群より選択される、項目８に記載の抗体。
（１０）
抗体Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、Ｂ６Ｇ７．１０、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が結合するエピトープからなる群より選択されるエピトープに特異的に結合する抗体。
（１１）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏ活性を阻害する、抗体。
（１２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目１１に記載の抗体。
（１３）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２および２−４Ｄ１．３からなる群より選択される、項目１２に記載の抗体。
（１４）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する項目１１に記載の抗体。
（１５）
Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２および２−２Ｃ９．２からなる群より選択される、項目１４に記載の抗体。
（１６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群より選択される、項目１１に記載の抗体。
（１７）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を阻害する、抗体。
（１８）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目１７に記載の抗体。
（１９）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する項目１７に記載の抗体。
（２０）
Ａ２７Ｆ６．１、Ａ８Ｇ３．５およびＢ６Ｇ７．１０からなる群より選択される、項目１７に記載の抗体。
（２１）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏ活性を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する、抗体
（２２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目２１に記載の抗体。
（２３）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する項目２１に記載の抗体。
（２４）
Ａ２７Ｆ６．１，Ａ８Ｇ３および１−１Ａ４Ｃ．２からなる群より選択される、項目２１に記載の抗体。
（２５）
Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−ｌＡ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体。
（２６）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用を阻害する、抗体。
（２７）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目２６に記載の抗体。
（２８）
Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群より選択される、項目２６に記載の抗体。
（２９）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する、抗体。
（３０）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメインに存在するエピトープに特異的に結合する、項目２９に記載の抗体。
（３１）
Ａ８Ｇ３．５または１−ｌＡ４Ｃ．２である、項目２９に記載の抗体。
（３２）
Ｃｒｉｐｔｏを内在化し得る、Ｃｒｉｐｔｏ抗体。
（３３）
前記抗体は、化学療法剤に結合体化されている、項目３２に記載の抗体。
（３４）
Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ３Ｆ６．１７、Ａ８Ｇ３、１−ｌＡ４Ｃ．２および３−４Ｅ８．３からなる群より選択される、項目３２に記載の抗体。
（３５）
Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する哺乳動物に投与するための、項目１〜３４のいずれかに記載の抗体の少なくとも１つを含む、組成物。
（３６）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目３５に記載の組成物。
（３７）
薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、項目３５に記載の組成物。
（３８）
前記抗体は、化学療法剤に結合体化されている、項目３５に記載の組成物。
（３９）
結合体化されていない化学療法剤をさらに含む、項目３５に記載の組成物。
（４０）
サンプルにおいてインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を該サンプルに添加する工程を包含する、方法。
（４１）
哺乳動物においてインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（４２）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目４１に記載の方法。
（４３）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（４４）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目３７に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（４５）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目３８に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（４６）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、該方法は、項目３９に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（４７）
前記腫瘍細胞が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍細胞からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（４８）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
（４９）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（５０）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４３に記載の方法。
（５１）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４４に記載の方法。
（５２）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４５に記載の方法。
（５３）
前記腫瘍が、脳、胸部、精巣、大腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍からなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（５４）
組織がＣｒｉｐｔｏを発現するか否かを決定する方法であって、該方法は、項目１〜３４のいずれかに記載の抗体を使用する免疫アッセイにおいて、哺乳動物由来の組織を分析する工程を包含する、方法。
（５５）
細胞株がＣｒｉｐｔｏを過剰発現するか否かを決定する方法であって、該方法は、項目１〜３４のいずれかに記載の抗体を使用する免疫アッセイにおいて、該細胞株を分析する工程を包含する、方法。
（５６）
前記抗体は、モノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体。
（５７）
前記抗体は、ヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（５８）
前記抗体は、ヒト抗体である、項目１に記載の抗体。
（５９）
所望でない細胞増殖に関連した状態について哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、項目３５に記載の組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（６０）
前記抗体は、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害する、項目４に記載の抗体。
（６１）
前記抗体は、Ａ８Ｇ３．５または１−ｌＡ４Ｃ．２である、項目６０に記載の抗体。
（６２）
項目６０に記載の抗体および薬学的受容可能な賦形剤を含む、組成物。
（６３）
ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害する方法であって、Ｃｒｉｐｔｏと項目６０に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、方法。
（６４）
前記接触させる工程が、哺乳動物において行われる、項目６３に記載の方法。
（６５）前記哺乳動物は、ヒトである、項目６４に記載の方法。
（６６）
前記Ｃｒｉｐｔｏは、細胞の表面上に存在する、項目６５に記載の方法。
（６７）
前記細胞は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現している腫瘍細胞である、項目６６に記載の方法。
（６８）
哺乳動物における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、項目６２に記載の組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（６９）
前記腫瘍細胞は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する、項目６８に記載の方法。
（７０）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目６８に記載の方法。
（７１）
前記腫瘍細胞は、ヒト乳癌細胞である、項目７０に記載の方法。
（７２）
腫瘍を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、項目６２に記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（７３）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目７２に記載の方法。
（７４）
前記腫瘍は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する、項目７２に記載の方法。
（７５）
ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
候補化合物を得る工程；
該候補化合物の存在下で、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとを接触させる工程；および
ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用の変化を検出する工程、
を包含し、ここで、該変化の検出は、該候補化合物がＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合相互作用を阻害することを示す、方法。
（７６）
前記化合物は、抗体である、項目７５に記載の方法。
【０００９】
本発明の１つの局面において、本発明の抗体は、抗体Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が結合するエピトープの群から選択されるエピトープに特異的に結合する。
【００１０】
本発明の別の局面において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する。Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１（配列番号：１）またはＣＲ−３（配列番号：２）から選択され得る。さらに詳しい実施形態において、リガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体には、例えば、Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９A１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３
３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が挙げられる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、ＥＧＦ様ドメインである。ＥＧＦ様ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−４Ｄ１．３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
別の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、ｃｙｓ−リッチドメインである。ｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体は、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、アミノ末端中にある。アミノ末端中のエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ１０Ｂ２．１７が挙げられるが、これに限定されない。
【００１４】
また他の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、Ｃｒｉｐｔｏのドメインにまたがるアミノ酸残基４６〜６２ある。Ｃｒｉｐｔｏのドメインにまたがるアミノ酸残基４６〜６２中のエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ａ１７Ａ２．１６、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−１Ｅ７．２、３−３Ｇ１．１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１５】
他の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、ＣＲ４０（配列番号：３）、ＣＲ４１（配列番号：４）、ＣＲ４３（配列番号：５）、ＣＲ４４（配列番号：６）、ＣＲ４９（配列番号：７）、ＣＲ５０（配列番号：８）またはＣＲ５１（配列番号：９）ポリペプチド中にある。これらペプチドの１つにおけるエピトープに特異的に結合する抗体には、Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、Ｂ６Ｇ７．１０、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６，２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能な抗体には、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２および２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能な本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１７】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ６Ｃ１２．１１、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１８】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロックする本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、腫瘍の増殖を阻害可能な本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００２１】
また別の局面において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ８Ｇ３．５、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏの活性を阻害可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓ−リッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００２３】
また別の局面において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
また別の局面において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体を含む。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能で、腫瘍の増殖を阻害可能な抗体には、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、１−１Ａ４Ｃ．２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合を阻害する方法を提供する。この方法は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能な抗体をサンプルに加える工程を包含する。関連した局面において、本発明は、哺乳動物におけるＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢの結合を阻害する方法を包含する。この方法は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能な抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ登録簿雲合ＰＴＡ−３３１５）Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｄ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２からなる群から選択されたハイブリドーマによって産生された抗体を提供する。抗体のいくつかは、以下のような別の名を有する：１−１Ａ４Ｃ．２は、１Ｐ１Ａ４−Ｃ２．１（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである；２−２Ｃ９．２は、２Ｐ２Ｃ９．２（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである。；２−４Ｅ５．６は、２Ｐ４Ｅ５．６（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである；３−３Ｇ１．１は、３Ｐ３Ｇ１．１（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである；ならびに３−４Ｅ８．３は、３Ｐ４Ｅ８．３（ＡＴＣＣ受託番号は、指定される）と同じである。
【００２７】
本発明の抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ化抗体およびヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明はまた、上で記載した抗体の少なくとも１つを包含する、Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する哺乳動物への投与のための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。上で記載された抗体は、化学療法薬と結合され得るし、非結合化化学療法と組み合わせて提供され得る。
【００２９】
本発明の別の局面には、サンプル中のインビトロの腫瘍細胞の増殖の阻害の方法が含まれる。この方法は、上で記載した組成物をサンプルに加える工程を包含する。
【００３０】
哺乳動物のインビボ腫瘍細胞の増殖阻害の方法もまた含まれる。この方法は、上で記載した組成物の有効な量を哺乳動物へ投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現している腫瘍を有する哺乳動物の処置の方法であり、この処置は、上で記載した組成物を哺乳動物に有効な量投与する工程を包含する。投与のための組成物は、薬物学的に受容可能な賦形剤、化学療法薬に結合した抗体および非結合化化学療法薬と組み合わせて投与される抗体を含み得る。
【００３２】
本発明の方法は、腫瘍細胞の増殖の阻害および／または腫瘍（ここで腫瘍細胞は、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頚部腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）の処置において特に有用である。
【００３３】
また別の実施形態において、本発明は、組織がＣｒｉｐｔｏを発現しているか銅かを決定する方法を含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、哺乳動物由来の腫瘍を分析する工程を包含する。細胞株が、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現しているかどうかを決定する方法も含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、細胞株を分析する工程を包含する。
【００３４】
さらなる局面において、本発明は、アクチビンＢ誘導性の腫瘍細胞の阻害を維持または持続する方法を提供する。この方法は、本発明の抗体に腫瘍細胞を露出する工程を包含する。特定の実施形態において、腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、胚腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頚腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される。
【００３５】
また別の実施形態において、本発明は、組織がＣｒｉｐｔｏを発現しているかどうかを決定する方法を含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、哺乳動物由来の組織を分析する工程を包含する。細胞株が、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現しているかどうかを決定する方法も含む。この方法は、上で記載された任意の抗体を使用した免疫アッセイにおいて、細胞株を分析する工程を包含する。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、アクチビンＢ誘導性の腫瘍細胞の阻害を維持または持続する方法を提供する。この方法は、本発明の抗体に腫瘍細胞を露出する工程を包含する。特定の実施形態において、腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頚腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される。
【００３７】
また他の局面において、本発明は、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用をブロック可能な化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、候補の化合物の存在下におけるＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢを接触させる工程および、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用の変化を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、化合物は、抗体である。
【００３８】
本発明のこれら局面および他の局面は、以下の本発明の詳細な記載において、さらに詳細に述べられている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、Ａ２７Ｆ６．１によるＣｒｉｐｔｏ誘導性ルシフェラーゼシグナルの阻害を表す。
【図２】図２は、Ａ２７Ｆ６．１によるＣｒｉｐｔｏ誘導性ルシフェラーゼシグナルの阻害を表す。
【図３】図３は、ヒト精巣癌腫細胞株をＣｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した後の、腫瘍重量の変化を表す。
【図４】図４は、ヒト精巣癌腫細胞株をＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した後の、腫瘍重量の変化を表す。
【図５】図５は、ＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
【図６】図６は、Ｔ−４７Ｄ細胞の増殖が、未処理細胞と比較して、約４０％、アクチビンＡまたはアクチビンＢによって阻害されたことを示すグラフである。
【図７】図７は、アクチビンＢの増殖抑制活性が、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのｍａｂ Ａ８Ｇ３．５の存在下で回復されたことを示すグラフである。
【図８】図８は、ＣＲ−Ｆｃが、アクチビンＢを含むウェルに結合したが、アクチビンＡにも他のリガンドにも結合しなかったことを示すグラフである。
【図９】図９は、アクチビンＢコーティングプレートに加える前に、溶液中のアクチビンＡまたはアクチビンＢとともにＣＲ−Ｆｃをプレインキュベートし、アクチビンＢのみが、結合を阻害したことを示すグラフである。
【図１０】図１０は、アクチビンＢが、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＣＲ−Ｆｃに高い強度で直接結合するが、コントロールＬＴβＲ−Ｆｃタンパク質に結合しないこと示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（本発明の詳細な記載）
本発明は、特定のＣｒｉｐｔｏ特異的抗体が、例えば、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用の阻害および／またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用の阻害によってＣｒｉｐｔｏの活性に影響し得るという発見ならびに、特定のＣｒｉｐｔｏ特異的抗体が、腫瘍細胞の増殖の阻害のために使用され得るという発見に基いている。これら抗体のいくつかは、天然のＣｒｉｐｔｏタンパク質またなＣｒｉｐｔｏの変性型いずれかのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する。例えば、これら抗体は、ＥＧＦ様ドメイン、システインリッチドメインまたは、Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸４６〜１５０の長さの領域に由来するペプチド（例えば、約３アミノ酸〜約２０アミノ酸）に結合し得る。
【００４１】
腫瘍の増殖が、少なくとも部分的にＣｒｉｐｔｏに依存する哺乳動物の悪性腫瘍または良性腫瘍の治療において、本発明の抗体は、有用である。通常、この増殖は、正常な恒常性に必要な増殖速度を超過した異常な増殖速度を有し、同じ起源の正常な組織の増殖速度を超過している。
【００４２】
（Ｉ．定義）
この文書を通じて、種々の定義がなされている。ほとんどの言葉は、当業者によってその言葉に帰する意味を有する。以下またはこの文書中のどこかにおいて詳細に定義されている言葉は、本発明の関係で提供される意味を有し、それらは代表的に当業者によって理解される。
【００４３】
本明細書中で使用される「領域」は、生体分子の１次構造の物理的に隣接した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列での隣接した部分によって定義される。
【００４４】
本明細書中で使用される「ドメイン」は、生体分子の公知の機能または潜在的な機能に寄与する生体分子の構造的部分を意味する。ドメインは、領域または領域の部分と共通した広範囲を占め得る；ドメインはまた、特定の領域の全てまたは一部に加えて、その特定の領域から区別される生体分子の一部分を組み込み得る。タンパク質ドメインの例として、細胞外ドメイン（ＣＲ−１（配列番号：１）およびＣＲ−３（配列番号：２）を含むＣｒｉｐｔｏの残基約３１〜残基約１８８の長さ）ならびに膜貫通ドメイン（ＣＲ−１およびＣＲ−３を含むＣｒｉｐｔｏの残基約１６９〜残基約１８８の長さ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のリガンド／レセプター結合ドメインは、ＣＲ−１およびＣＲ−３を含むＣｒｉｐｔｏの残基約７５〜残基約１５０に及ぶ；このドメインは、例えば、ＣＲ−１およびＣＲ−３を含むＣｒｉｐｔｏの残基約７５〜残基約１１２に及ぶＥＧＦ様ドメイン、ならびに例えば、ＣＲ−１およびＣＲ−３を含む残基約１１４〜残基約１５０に及ぶシステインリッチドメイン含む。本発明の多くのモノクローナル抗体は、ＥＧＦ様ドメインまたはシステインリッチドメインに結合するとして同定された。さらに、モノクローナル抗体Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１１）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１２）、およびＡ１７Ａ２．１６は、ＥＧＦ様ドメインの上流のＣｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２の長さの領域中のドメインにおいて形成されるエピトープに結合するとして同定された。以下の実施例３を参照のこと。
【００４５】
本発明の抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体が結合するエピトープは、高次構造的に天然のＣｒｉｐｔｏタンパク質または変性したＣｒｉｐｔｏタンパク質において存在し得る。加えて、エピトープは、Ｃｒｉｐｔｏポリペプチドでの近接していない配列によって形成され得る。
【００４６】
本明細書中で使用される、本発明の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又は、キメラ抗体であり得る。抗体は、任意のアイソタイプまたはサブタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２；κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかを備える）の抗体全体（すなわち、２つの完全な長さの軽鎖および２つの完全な長さの重鎖を備える）であり得る。あるいは、本発明の抗体は、抗体全体の抗原−結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および単鎖Ｆｖ）を指す。
【００４７】
本発明の抗体はどれも、以下で記載するように、必要に応じて化学療法と組み合わされ得る。
【００４８】
本明細書中で使用される「Ｃｒｉｐｔｏを内部移行することが可能な抗体」は、細胞表面からＣｒｉｐｔｏを除去する間に細胞に入る抗体を意味する。例えば、蛍光標識されたＣｒｉｐｔｏモノクローナル抗体の使用により、Ｃｒｉｐｔｏを内部移行することが可能なＣｒｉｐｔｏ抗体をスクリーニングすることが可能である。どの抗体が、Ｃｒｉｐｔｏ陽性細胞へ内部移行し得るのかを決定するために、蛍光顕微鏡および／または共焦点顕微鏡下で細胞を見ることによって、標識抗体の蛍光シグナルの細胞への取り込みを分析し得る。これら内部移行される抗体は、細胞質または細胞小胞における蛍光シグナルとして検出される。非限定的なＣｒｉｐｔｏを内部移行可能なＣｒｉｐｔｏ抗体の例としては、Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ３Ｆ６．１７および１−１Ａ４Ｃ．２が挙げられる。
【００４９】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の同定可能な化学薬品又または、分子を意味する。化合物としては、イオン、原子、小さな分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドおよび核酸が挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物は、自然または合成であり得る。
【００５０】
本明細書中で使用される「変調する」または「改変する」は、特定の活性または特定のタンパク質の量、質もしくは効果の上昇あるいは減少を意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される、「阻害する」は、特定の活性または特定のタンパク質の量、質もしくは効果の減少を意味する。
【００５２】
本明細書中で使用される「Ｃｒｉｐｔｏの活性を変調する」は、Ｃｒｉｐｔｏの活性の量、質もしくは効果の上昇もしくは減少を意味する。Ｃｒｉｐｔｏの活性の量、質もしくは効果における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。活性は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例３で示されているヌル細胞アッセイ）により測定され得る。いくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏと他のタンパク質との間のタンパク質相互作用は、本発明の抗体の結合を介して阻害される。
【００５３】
本明細書中で使用される「ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用のブロック」又は、「ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用の変調」は、相互作用（すなわちＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の結合）の上昇または減少を意味する。相互作用における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。実施例８で示されている結合アッセイの様に、当該分野で公知のアッセイによって活性は測定され得る。
【００５４】
本発明中で使用される「ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用のブロッキング」または「ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の相互作用の変調」は、相互作用（すなわちＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合）の上昇または減少を意味する。相互作用における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。実施例１１で示されている結合アッセイの様に、当該分野で公知のアッセイによって活性は測定され得る。
【００５５】
本発明中で使用される「インビトロにおける腫瘍細胞の増殖の変調」は、インビトロでの腫瘍細胞の数における上昇または減少を意味する。腫瘍細胞の数における上昇または減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。約１００％より大きな上昇もまた想定される。例えば、少なくとも、約３倍，４倍，５倍，１０倍、２０倍、もしくはさらに大きく。インビトロでの腫瘍細胞増殖の変調は、実施例４で示されているＧＥＯ細胞軟寒天アッセイの様に、当該分野で公知のアッセイによって測定され得る。
【００５６】
本明細書中で使用される「インビボにおける腫瘍細胞の増殖の変調」は、インビボでの腫瘍細胞の数、血管形成、および／または転移における減少を意味する。腫瘍細胞の数における減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、であり得る。インビボでの腫瘍細胞増殖の変調は、実施例５で示されているものの様に、当該分野で公知のアッセイによって測定され得る。
【００５７】
本明細書中で使用される「治療的効果」は、異常な状態の阻害を意味する。治療的効果は、異常な状態の１つ以上の症状をいくらか軽減する。異常な状態の処置に関して、治療的効果は、以下の１つ以上をいう：（ａ）細胞の増殖、成長および／または分化における増加もしくは減少；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち、遅延または停止）もしくは促進（すなわち、上昇もしくは開始）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関する１つ以上の症状のいくらかの軽減；および（ｅ）細胞集団の機能の増強。異常な状態に対して効力を示す化合物は、本明細書中で記載されているように同定され得る。
【００５８】
本明細書中で使用される「投与」は、生物の細胞または組織に化合物を組み込む方法を意味する。生物の細胞もしくは組織が生物内（インビボ）または生物の外（エキソビボ）で存在する場合に、異常な状態は、予防もしくは処置され得る。生物の外に存在する細胞は、細胞培養皿もしくは、他の生物において維持または増殖され得る。生物内に存在する細胞については、当該分野において化合物を投与するための多くの技術が存在する。この技術には、経口、非経口、経皮、注射、およびエアロゾル適用が挙げられるがこれらに限定されない。生物体外の細胞については、当該分野において、化合物を投与する多くの技術が存在する。この技術には、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術およびキャリア技術が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の多くの様式（例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋内など）によって投与は達成され得る。インビボの治療に使用される際、本発明の抗体は、患者に有効な量で投与される。本明細書中で使用される「有効な量」は、有益な臨床結果または所望する臨床結果をもたらすのに十分な量である（すなわち、患者の腫瘍の負担を排除するもしくは、減少される量）。有効な量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のためには、有効な量の本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏまたはアクチビンＢ関連の疾患の状態（特に、Ｃｒｉｐｔｏもしくは、アクチビンＢに関する腫瘍）の発生の改善、安定化、予防、または遅延するために十分な量である。
【００５９】
代表的な処置レジメンの１例として、週間スケジュールにおける本発明の抗体の静脈内注入による約２〜５ｍｇ／ｋｇの投与量の投与が挙げられる。患者が入院を必要としない限り、この抗体は、外来患者の化学注入単位で投与される。当該分野で公知の他の投与レジメンも含まれる。
【００６０】
生物へのシグナル伝達経路において異常を有する細胞群への本発明の抗体の投与によって、異常な状態は、予防もしくは処置され得る。その生物機能における化合物投与の効果は、その後、モニターされ得る。好ましくは、生物はヒトである。
【００６１】
本明細書中で使用される「Ｃｒｉｐｔｏ過剰発現」は、正常な組織または細胞のＣｒｉｐｔｏ発現よりも統計学的に有意な量、多く発現している（例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくは少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍）組織または細胞によるＣｒｉｐｔｏの発現を意味する。
【００６２】
本発明所中で使用される「化学療法薬」は、腫瘍増殖の阻害、阻害された腫瘍増殖の維持および／もしくは、緩解の誘発において治療的効果を有すると当該分野で同定されている任意の薬物（例えば、天然の化合物、合成化合物、タンパク質、改変されたタンパク質および放射活性化合物）を意味する。化学療法薬には、本発明の抗体に結合され得る薬あるいは、抗体に結合されること無く、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る薬が挙げられる。本発明の抗体へ結合され得る代表的な化学療法薬には、放射性結合体（９０Ｙ、１３１Ｉ、９９ｍＴＣ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｈなど）、腫瘍活性化プロドラッグ（メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ＣＣ−１０６５アナログ、クリチェアミシン（Ｃｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）誘導体、アントラサイクリン、ビンカアルカロイドなど）、リシン、ジフテリア毒およびシュードモナス外毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
化学治療薬剤は、本発明の抗体へ結合されるよりも、本発明の抗体と組み合わせて（すなわち、非結合体化学療法薬）使用され得る。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プラチナ（すなわち、シスプラチナ）、アントラサイクリン、ヌクレオシドアナログ（プリンおよびピリミジン）、タキサン、カンプトテシン、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ＤＮＡアルキル化因子、葉酸アンタゴニスト、ビンカアルカロイド、リボヌクレオチドレダクターゼインヒビター、エストロゲンインヒビター、プロゲステロンインヒビター、アンドロゲンインヒビター、アロマターゼインヒビター、インターフェロン、インテーロイキン、モノクローナル抗体、タキソール、カンプトサー（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、アドリアマイシン（ドックス）、５−ＦＵおよびゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）。このような、化学療法薬は、抗体および非結合体化学療法薬の付属的な投与による本発明の抗体と組み合わせての本発明の実行に使用され得る。
【００６４】
本明細書中で使用される「薬学的に受容可能キャリアまたは賦形剤」は、当該分野で公知の生物学的に不活性な化合物を意味し、本発明の抗体の投与において使用される。受容可能なキャリアは、当該分野において周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，編集，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＣＯ．，１９９０に記載されている。受容可能なキャリアには、生体適合性な塩、不活性な塩または生体吸収性な塩、緩衝化因子、オリゴ糖または多糖、ポリマー、ヒアルロン酸といった粘弾性の化合物、増粘性因子、防腐剤などが挙げられる。
【００６５】
（ＩＩ．本発明の抗体）
本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する。本明細書中で使用される、Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、ＣＲ−３Ｃｒｉｐｔｏタンパク質およびそれらのフラグメントを含む。このようなフラグメントは、細胞外ドメインまたは細胞内ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、システインリッチドメイン、レセプター結合ドメインなどの全体のドメインであり得る。このようなフラグメントはまた、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の任意のドメインでの近接するエピトープおよび近接しないエピトープを含み得る。Ｃｒｉｐｔｏに対して特異的な抗体を産生するために使用される抗原の例としては、ＣＲ４０（配列番号：３）、ＣＲ４１（配列番号：４）、ＣＲ４３（配列番号：５）、ＣＲ４４（配列番号：６）、ＣＲ４９（配列番号：７）、ＣＲ５０（配列番号：８）およびＣＲ５１（配列番号：９）、これらのアミノ酸配列は、実施例２において提供されている）が挙げられが、これらに限定されない。
【００６６】
ＣＲ−１の１８８アミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号：１）：
ＭＤＣＲＫＭＡＲＦＳＹＳＶＩＷＩＭＡＩＳＫＶＦＥＬＧＬＶＡＧＬＧＨＱＥＦＡＲＰＳＲＧＹＬＡＦＲＤＤＳＩＷＰＱＥＥＰＡＩＲＰＲＳＳＱＲＶＰＰＭＧＩＱＨＳＫＥＬＮＲＴＣＣＬＮＧＧＴＣＭＬＧＳＦＣＡＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫＥＮＣＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫＣＳＬＣＫＣＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱＡＦＬＰＧＣＤＧＬＶＭＤＥＨＬＶＡＳＲＴＰＥＬＰＰＳＡＲＴＴＴＦＭＬＶＧＩＣＬＳＩＱＳＹＹ
ＣＲ−３の１８８アミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号：２）：
ＭＤＣＲＫＭＶＲＦＳＹＳＶＩＷＩＭＡＩＳＫＡＦＥＬＧＬＶＡＧＬＧＨＱＥＦＡＲＰＳＲＧＤＬＡＦＲＤＤＳＩＷＰＱＥＥＰＡＩＲＰＲＳＳＱＲＶＬＰＭＧＩＱＨＳＫＥＬＮＲＴＣＣＬＮＧＧＴＣＭＬＥＳＦＣＡＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫＥＮＣＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫＣＳＬＣＫＣＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱＡＦＬＰＧＣＤＧＬＶＭＤＥＨＬＶＡＳＲＴＰＥＬＰＰＳＡＲＴＴＴＦＭＬＡＧＩＣＬＳＩＱＳＹＹ
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン中のエピトープに結合する。このＥＧＦ様ドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基およそ７５〜アミノ酸残基およそ１１２に及ぶ。このＥＧＦ様ドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の線状または非線状の広がり（ｓｐａｎ）を含み得る。線状エピトープの例としては、残基およそ７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９５〜１０５、１００〜１１０、または１０５〜１１２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＥＧＦドメイン中のエピトープは、変性Ｃｒｉｐｔｏタンパク質に対して立体配置的にネイティブであるＣｒｉｐｔｏタンパク質中で形成されるエピトープである。
【００６７】
他の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのシステインリッチなドメイン中のエピトープに結合する。このシステインリッチなドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基およそ１１４〜アミノ酸残基およそ１５０に及ぶ。このシステインリッチなドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の線状または非線状の広がりを含み得る。線状エピトープの例としては、残基およそ１１４〜１２５、１２０〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３５〜１４５、または１４０〜１５０が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、このシステインリッチなドメイン中のエピトープは、変性Ｃｒｉｐｔｏタンパク質に対して立体配置的にネイティブであるＣｒｉｐｔｏタンパク質中に形成されるエピトープである。
【００６８】
一旦抗体が生成されると、Ｃｒｉｐｔｏへのその抗体の結合が、当該分野で公知の標準的技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用してアッセイされ得、一方で、細胞表面上のＣｒｉｐｔｏの存在が、実施例２に示されるように、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用してアッセイされ得る。このような結合を測定する他の任意の技術が、別に使用され得る。
【００６９】
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体／二重特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体（本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む）を提供する。用語「特異的」および「選択的」とは、本発明の抗体の結合を記載するために使用される場合、本発明の抗体の可変領域がＣｒｉｐｔｏポリペプチドを認識しこのＣｒｉｐｔｏポリペプチドに結合することを、示す。本発明の特異的抗体はまた、他のタンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質ＡもしくはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）に、それらの抗体の可変領域外の配列（特に、その分子の定常領域中の配列）との相互作用を介して、相互作用し得ることが、理解される。
【００７０】
本発明の抗体（例えば、リガンド／レセプター結合ドメインまたはアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメインのエピトープに特異的に結合する抗体）の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該分野で周知であり、慣用的に実施される。このようなアッセイの包括的考察について、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），第６章を参照のこと。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のフラグメントを認識して結合する抗体もまた、含まれるが、但し、その抗体は、Ｃｒｉｐｔｏポリペプチドに特異的である。本発明の抗体は、当該分野で周知の任意の方法を使用して生成され得、慣用的に実施され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。抗体特異性は、以下により詳細に記載される。しかし、以前に文献に記載された他のポリペプチドから生成され得、かつＣｒｉｐｔｏと（例えば、両方のポリペプチド中の類似するエピトープの偶発的存在に起因して）偶発的に交差反応し得る、抗体が、「交差反応性」抗体と考えられることが、強調されるべきである。このような交差反応性抗体は、Ｃｒｉｐｔｏにとって「特異的」である抗体ではない。抗体がＣｒｉｐｔｏのエピトープに特異的に結合するか否かの決定は、当該分野で周知であるいくつかのアッセイ（例えば、ウェスタンブロッティングアッセイ）のいずれかを使用して、なされる。Ｃｒｉｐｔｏを発現する細胞を同定するため、そしてまたＣｒｉｐｔｏリガンド／レセプター結合活性を阻害するために、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の細胞外エピトープ（すなわち、その細胞外で見出されるＣｒｉｐｔｏタンパク質の部分）に特異的に結合する抗体が、特に有用である。
【００７２】
本発明はまた、ポリクローナル抗体を含む無細胞組成物を提供し、その抗体のうちの少なくとも１つは、本発明の抗体である。動物から単離された抗血清は、例示的組成物であり、水、または別の希釈剤、賦形剤、もしくはキャリア中に再懸濁された抗血清の抗体画分を含む組成物もまた、例示的組成物である。
【００７３】
他の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対する。さらに、代表的には、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、その抗原上の単一の決定基に対する。モノクローナル抗体は、抗原−抗体結合を使用する診断アッセイ法および分析アッセイ法の選択性および特異性を改善するために、有用である。モノクローナル抗体の別の利点は、モノクローナル抗体が、培養細胞（例えば、ハイブリドーマ）によって合成され得、他の免疫グロブリンが非混入であり得ることである。そのような抗体を生成する組換え細胞およびハイブリドーマもまた、本発明の局面として意図される。これもまた下記を参照のこと。
【００７４】
なお他の関連する実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的である抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体のより詳細な考察について、例えば、米国特許第６，０６３，３７９号および同第５，７８０，０２９号を参照のこと。
【００７５】
抗体は、化学的にかまたは組換え技術によって単離され得る、比較的小さい抗原結合ドメインを含む。そのようなドメインは、それ自体が有用なＣｒｉｐｔｏ結合分子であり、そしてまた、ヒト抗体中に再導入され得るか、または化学療法剤もしくはポリペプチドに融合され得る。従って、なお別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供し、そのフラグメントおよび関連分子（存在する場合）は、このＣｒｉｐｔｏに結合する。非限定的例として、本発明は、単鎖抗体およびＣＤＲ移植抗体である、ポリペプチドを提供する。ＣＤＲ移植抗体のより詳細な考察について、例えば、米国特許第５，８５９，２０５号および下記の考察を参照のこと。
【００７６】
他の実施形態において、非ヒト抗体が、当該分野で公知の方法のいずれかによってヒト化され得る。ヒト化抗体は、インビボ治療適用のために有用である。さらに、組換え「ヒト化」抗体が、合成され得る。ヒト化抗体は、抗原結合のために必要ではないアミノ酸のいくらかまたはすべてを組換えＤＮＡ技術を使用してヒト免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖の対応する領域由来のアミノ酸で置換している、非ヒト動物からまず誘導される抗体である。すなわち、ヒト化抗体は、ほとんどヒト免疫グロブリン配列を含むキメラであり、特異的抗原結合を担う領域が、置換されている。
【００７７】
種々の形態の抗体が、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜９９）。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、周知のハイブリドーマ技術によって生成され得る。例えば、動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）は、精製Ｃｒｉｐｔｏ調製物または粗Ｃｒｉｐｔｏ調製物、ＣｒｉｐｔｏをコードするｃＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞、Ｃｒｉｐｔｏを構成的に発現する細胞などを用いて、免疫され得る。さらに、その抗原は、精製タンパク質、細胞上で発現されるタンパク質、タンパク質フラグメントもしくはそのペプチドとして、またはそのタンパク質、タンパク質フラグメント、もしくはペプチドをコードする裸のＤＮＡまたはウイルスベクターとして、送達され得る。その後、免疫された動物の血清が、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の存在について試験される。Ｂ細胞が、試験陽性の動物から単離され、ハイブリドーマが、これらのＢ細胞を用いて生成される。
【００７８】
そのハイブリドーマにより分泌される抗体が、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合するその能力（例えば、Ｃｒｉｐｔｏでトランスフェクトした細胞に結合するが、非トランスフェクト親細胞には結合しない）について、そして他の任意の望ましい特徴（例えば、望ましいＣＤＲコンセンサス配列を有すること、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の結合またはＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの間の結合を阻害する（または非ブロッカーの場合には阻害しない）こと）について、スクリーニングされる。
【００７９】
このスクリーニングアッセイにおいて試験陽性であるハイブリドーマ細胞が、その細胞が培養培地中にモノクローナル抗体を分泌するのを可能にする条件下で、栄養培地中で培養される。その後、馴化ハイブリドーマ培養上清が、収集され、そしてその上清中に含まれる抗体が、精製される。あるいは、望ましい抗体が、そのハイブリドーマ細胞を非免疫動物（例えば、マウス）の腹腔中に注入することによって、生成され得る。そのハイブリドーマ細胞は、腹腔中で増殖し、腹水として蓄積する抗体を分泌する。その後、その抗体は、腹腔から腹水をシリンジで回収することによって、採集され得る。
【００８０】
そのモノクローナル抗体はまた、抗体コードｃＤＮＡを望ましいハイブリドーマから単離すること、そのｃＤＮＡで哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）をトランスフェクトすること、そのトランスフェクト宿主細胞を培養すること、そしてその培養培地からその抗体を取り出すことによって、生成され得る。
【００８１】
本発明のモノクローナル抗体はまた、同族ハイブリドーマ（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）抗体を操作することによって、生成され得る。例えば、同族抗体は、組換えＤＮＡ技術によって、その重鎖ならびに／または軽鎖のヒンジ領域および／もしくは定常領域のうちの一部もしくはすべてが別の種（例えば、ヒト）由来の抗体の対応成分で置換されるように、改変され得る。一般的に、その操作した抗体の可変ドメインは、その同族抗体の可変ドメインと同一または実質的に同一のままである。そのような操作抗体は、キメラ抗体と呼ばれ、そのヒンジ領域および／または定常領域が起源とする種（例えば、ヒト）の個体に投与された場合、その同族抗体よりも抗原性が小さい。キメラ抗体を生成
する方法は、当該分野で周知である。ヒト定常領域は、ＩｇＧ１由来の領域およびＩｇＧ４由来の領域を含む。
【００８２】
本発明のモノクローナル抗体はまた、完全ヒト抗体を含む。その完全ヒト抗体は、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５により記載されるようなインビトロ刺激（ｐｒｉｍｅｄ）ヒト脾細胞を使用してか、または例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されるようなファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用して、調製され得る。
【００８３】
あるいは、完全ヒト抗体は、Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４３２〜３６；ならびにＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：２２７〜３６により記載されるようなレパートリークローニングによって、調製され得る。さらに、米国特許第５，７９８，２３０号は、ヒトＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製を記載し、この調製において、ヒト抗体生成Ｂ細胞は、不死化のために必要なタンパク質であるエプスタイン−バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン−バーウイルスまたはその誘導体の感染によって、不死化される。このＥＢＮＡ２機能は、その後、遮断され、抗体生成の増加を生じる。
【００８４】
完全ヒト抗体を生成するための他のいくつかの方法は、不活化内因性Ｉｇ遺伝子座を有し、かつ再配列していないヒト抗体重鎖および軽鎖の遺伝子についてトランスジェニックである、非ヒト動物の使用を包含する。そのようなトランスジェニック動物は、Ｃｒｉｐｔｏを用いて免疫され得、そしてハイブリドーマが、その動物由来のＢ細胞から生成される。これらの方法は、例えば、ヒトＩｇミニ遺伝子座を含むトランスジェニックマウスに関する種々のＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の公開／特許（例えば、米国特許第５，７８９，６５０号）；ＸＥＮＯＭＩＣＥＴＭに関する種々のＡｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の公開／特許（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号；Ｇｒｅｅｎら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３〜２１；ならびにＭｅｎｄｅｚら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜５６）；ならびに「トランソミック（ｔｒａｎｓｏｍｉｃ）マウスに関する種々のＫｉｒｉｎ（日本）の公開／特許（例えば、ＥＰ ８４３ ９６１、およびＴｏｍｉｚｕｋａら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：１４３３〜４３）に記載される。また、例えば、米国特許第５，５６９，８２５号、ＷＯ０００７６３１０、ＷＯ０００５８４９９、およびＷＯ０００３７５０４（これらはその全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００８５】
本発明のモノクローナル抗体はまた、他の種由来の同族抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体のヒト化バージョンを含む。ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって生成される抗体であり、その抗体において、抗原結合に必要ではないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖（例えば、可変ドメインの定常領域およびフレームワーク領域）のアミノ酸のうちのいくらかまたはすべてが、同族の非ヒト抗体の軽鎖または重鎖由来の対応アミノ酸で置換するために使用される。例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化バージョンは、その重鎖および軽鎖の両方に、（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；および（３）マウス抗体由来のＣＤＲを有する。必要な場合、そのヒトフレームワーク領域中の１つ以上の残基は、マウス抗体中の対応位置の残基へと変化されて、その抗原に対するそのヒト化抗体の結合親和性が保存され得る。この変化は、時には「戻し変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」と呼ばれる。ヒト化抗体は、一般的には、キメラヒト抗体と比較して、ヒトにおいて免疫応答を惹起する可能性が低い。なぜなら、前者は、比較的少ない非ヒト成分しか含まないからである。
【００８６】
ヒト化抗体を生成するための方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，ＥＰ ２３９ ４００；Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜３６；Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜３３；米国特許第６，１８０，３７０号；およびＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３〜３７に記載される。また、例えば、ＰＣＴ特許出願番号９４／０４６７９も参照のこと。霊長類化抗体は、霊長類（例えば、アカゲザル、ヒヒ、およびチンパンジー）抗体遺伝子を同様に使用して、生成され得る。その後、さらなる変化が、その抗体フレームワーク中に導入されて、親和性または免疫原性が調節され得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照のこと。
【００８７】
一般的には、ヒト抗体上へのマウス（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植は、以下のように達成される。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡが、ハイブリドーマから単離される。その可変ドメイン（ＣＤＲを含む）のＤＮＡ配列が、配列決定によって決定される。そのＣＤＲをコードするＤＮＡは、部位特異的変異誘発によって、ヒト抗体重鎖または軽鎖の、可変ドメインコード配列の対応領域へと移される。その後、望ましいアイソタイプ（例えば、ＣＨについてγ１、ＣＬについてκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントが、付加される。そのヒト化重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）中に共発現されて、可溶性ヒト化抗体が生成される。抗体の大規模生成を容易にするために、その抗体を発現する細胞を含むバイオリアクター中でそのようなヒト化抗体を生成すること、またはその抗体を乳汁中に発現するトランスジェニック動物（例えば、ヤギ、ウシ、またはヒツジ）を生成すること（例えば、米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと）が、しばしば望ましい。
【００８８】
時折、ヒトフレームワークへのＣＤＲの直接転移は、生じる抗体の抗原結合親和性の喪失をもたらす。これは、いくつかの同族抗体においては、そのフレームワーク領域中の特定のアミノ酸がそのＣＤＲと相互作用することによって、その抗体の全体的抗原結合親和性に影響するからである。このような場合、「戻し変異」（前出）が、アクセプター抗体のフレームワーク領域中に導入されて、その同族抗体の抗原結合活性が保持されるべきである。
【００８９】
戻し変異を生成する一般的アプローチは、当該分野で公知である。例えば、Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜３３、Ｃｏら，１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９〜７３、およびＷＯ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．）は、２つの重要な工程を含むアプローチを記載する。まず、ヒトＶフレームワーク領域が、同族マウス抗体のＶ領域フレームワークとの最適なタンパク質配列相同性についてコンピューター分析によって選択される。その後、そのマウスＶ領域の３次構造が、コンピューターによってモデル化されて、マウスＣＤＲと相互作用する可能性があるフレームワークアミノ酸残基が可視化され、その後、これらのマウスアミノ酸残基が、相同なヒトフレームワーク上に重層される。
【００９０】
この２工程アプローチのもとで、ヒト化抗体を設計するためのいくつかの基準がある。第１の基準は、ヒトアクセプターとして、特定のヒト免疫グロブリン（これは通常、非ヒトドナー免疫グロブリンと相同である）由来のフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することである。第２の基準は、ヒトアクセプター残基が異常であり、かつドナー残基がフレームワークの特定の残基においてヒト配列に典型的である場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を使用することである。第３の基準は、ＣＤＲにすぐ隣接した位置におけるアクセプターではなくドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。
【００９１】
当業者は、例えば、Ｔｅｒｍｐｅｓｔ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−７１に記載されるような異なるアプローチを使用し得る。このアプローチのもとで、ＮＥＷＭ由来のＶ領域フレームワーク、ならびにＲＥＩ重鎖および軽鎖は、それぞれ、マウス残基の放射状の導入を伴うことなく、ＣＤＲグラフト化のために使用される。このアプローチを使用する利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩ可変領域の三次元構造が、Ｘ線結晶分析から分かり、したがって、ＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用が容易にモデリングされ得ることである。
【００９２】
本発明のヒト化抗体は、重鎖の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７または８個）の特定の位置において、変異（例えば、欠失、置換または付加）を含み、その結果、この抗体のエフェクター機能（例えば、この抗体がＦｃレセプターまたは相補因子に結合する能力）が、この抗体がＣｒｉｐｔｏに結合する能力に影響を与えることなく変化する（米国特許第５，６４８，２６０号）。これらの重鎖位置としては、残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２（ＥＵ番号付けシステム）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ヒト化抗体は、その重鎖に、突然変異Ｌ２３４Ａ（すなわち、未改変抗体の２３４位におけるロイシンのアラニンでの置換）、およびＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付けシステム）を含み得る。
【００９３】
さらに、本発明のヒト化抗体は、グルコシル化のための部位であるアミノ酸残基において、突然変異（例えば、欠失または置換）を含みえ、その結果、このグルコシル化部位が排除される。このような抗体は、そのＣｒｉｐｔｏ結合親和性を維持しつつ、減少したエフェクター機能または他の所望しない機能を有するために、臨床的に有益であり得る。グリコシル化部位の突然変異もまた、プロセス開発（例えば、タンパク質の発現および精製）のために有益であり得る。例えば、この抗体の重鎖は、突然変異Ｎ２９７Ｑ（ＥＵ番号付けシステム）を含みえ、その結果、この重鎖は、もはやこの部位でグリコシル化され得ない。
【００９４】
さらに他の実施形態において、本発明の抗体の重鎖および/または軽鎖は、Ｃｒｉｐｔ
ｏへの結合に対する親和性を増加し、それによりＣｒｉｐｔｏ媒介性障害を処置するための効力を増加する突然変異を含む。
【００９５】
本発明のモノクローナル抗体は、所望機能を実施するかまたは増大させるほかの部分をさらに含み得る。例えば、この抗体は、抗体によって標的化される細胞を殺傷するために毒性部分（例えば、破傷風毒素またはリシン）または放射性核種（例えば、１１１Ｉｎまたは９０Ｙ）を含み得る（例えば、米国特許第６，３０７，０２６号を参照のこと）。この抗体は、単離または検出を容易にするための部分（例えば、ビオチン、蛍光部分、放射活性部分、ヒスチジンタグまたは他のペプチドタグ）を含み得る。この抗体はまた、その血清半減期を延長し得る部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）、および免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメント（例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の一部（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域））を含み得る。
【００９６】
抗体フラグメントおよび一価の抗体もまた、本発明の方法および組成物で使用され得る。一価の抗体は、第２の重鎖のＦｃ（またはステム）領域に結合した重鎖/軽鎖ダイマー
を含む。「Ｆａｂ領域」とは、重鎖のＹ分枝部分を含む配列に対して、および軽鎖全体に対してほぼ等価であるかまたは類似しており、かつ一緒になって（凝集体で）抗体活性を示すことが示されている鎖の部分をいう。Ｆａｂタンパク質は、１つの重鎖および１つの軽鎖（一般的に、Ｆａｂ’として知られている）の凝集体、ならびに四量体を含み、この四量体は、上記のいずれかが共有結合で凝集していても非共有結合で凝集していても、この凝集が特定の抗原または抗原ファミリーと特異的に反応し得る限りは、抗体Ｙの２つの分枝セグメント（一般に、Ｆ（ａｂ）２として公知）に対応する。
【００９７】
（ＩＩＩ．シグナル調節）
本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏ活性および/またはＣｒｉｐｔｏとそのリガンドとの相
互作用を阻害し得る。Ｃｒｉｐｔｏ活性の過剰発現は、脱分化状態促進間葉細胞特性、増殖の増加、および細胞移動（Ｓａｌｏｍｏｎら．，１９９９，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２１：６１−７０；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら．，１９９４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２９１−９８；およびＢａｌｄａｓｓａｒｒｅら．，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：５３８−４３）、新生物形成において見られる細胞形質転換に関連した表現型をもたらし得る。
【００９８】
Ｃｒｉｐｔｏ抗体の活性およびＣｒｉｐｔｏ活性を阻害するその能力を試験する１つの方法は、Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏノックアウト（ＫＯ）細胞株を用いることである（Ｍｎｃｈｉｏｔｔｉら．，２０００，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３−４２）。Ｃｒｉｐｔｏは、Ｓｍａｄ２リン酸化およびＸｅｎｏｐｕｓ胚における転写因子ＦＡＳＴを刺激し、そしてこの転写因子ＦＡＳＴの活性は、ＦＡＳＴ調節エレメント−るルシフェラーゼレポーター遺伝子由来のルシフェラーゼ活性を測定することによってモニタリングされ得る（Ｓａｉｊｏｈら．，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：３５−４７）。Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子においてヌル突然変異を有し、かつＣｒｉｐｔｏ依存性シグナル伝達を伝達し得ない（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、前出）。Ｃｒｉｐｔｏ活性は、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞をＣｒｉｐｔｏ、ＦＡＳＴ、およびＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ遺伝子構築物でトランスフェクトすることによって、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において評価され得る。Ｃｒｉｐｔｏ依存性ＦＡＳＴルシフェラーゼ活性は、Ｃｒｉｐｔｏ ｃＤＮＡおよびＦＡＳＴ ｃＤＮＡがこれらの細胞にトランスフェクトされない限り、これらの細胞において見出されない。Ｃｒｉｐｔｏ依存性Ｎｏｄａｌシグナル伝達をブロックし抗体、Ｃｒｉｐｔｏ活性をブロックする抗体である。
【００９９】
Ｃｒｉｐｔｏの活性を測定し得る他のアッセイ（例えば、軟質寒天アッセイ）が、当業者によって使用され得る（例えば、以下の実施例４を参照のこと）。軟質寒天で細胞が増殖する能力は、細胞形質転換に関連し、そしてそのアッセイは、腫瘍細胞増殖の阻害を測定するための古典的インビトロアッセイである。活性の阻害を決定するのに有用な他のアッセイとしては、プラスチック上のインビトロアッセイなどが上げら得る。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害する。本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏがアクチビンＡに結合し得、かつアクチビンＢシグナル伝達経路を阻害し得ることを発見した。アクチビンＢは、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る（Ｒｉｓｂｒｉｄｇｅｒら．，２００１，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２２２：８３６−５８）。アクチビンＢへのＣｒｉｐｔｏの結合はまた、増殖のアクチビンＢ誘導性の阻害を破壊し得る。
【０１０１】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の活性およびそれがＣｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害する能力を試験するための１つの方法は、増殖のアクチビンＢ誘導性阻害のＣｒｉｐｔｏ媒介性破壊を防止する抗体の能力を測定することである。１つのこのような方法は、実施例９に記載される。抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体がＣｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害する能力を直接試験するための方法は、実施例１１に記載される。
【０１０２】
（ＩＶ．治療的用途）
本発明の抗体はまた、治療目的（例えば、腫瘍細胞増殖の阻害）、Ｃｒｉｐｔｏを検出または定量するための診断目的、およびＣｒｉｐｔｏの精製のために有用である。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、患者の腫瘍細胞の増殖を阻害（特に、腫瘍増殖がアクチビンＢシグナル伝達の欠失または減少によって媒介される場合）する抗体が提供される。特定の実施形態において、腫瘍細胞は、脳、心臓、首部、前立腺、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の腫瘍細胞である。
【０１０４】
他の実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、かつＣｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍細胞を阻害する抗体が提供される。一実施形態において、この腫瘍細胞は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する細胞株（例えば、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃の癌に由来する細胞株）である。
【０１０５】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体は、以下の実施例４に例示されるように、当業者によって使用される標準的なプロトコールに従って、強力な抗癌剤としてのインビボ活性についてスクリーニングされ得る。このようなプロトコールの例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）によって、その「インビボ癌モデルスクリーニング」プロトコール、ＮＩＨ公開番号８４−２６３５（Ｆｅｂ １９８４）において概説されている。
【０１０６】
本発明の他の実施形態において、本発明の抗体は、癌性腫瘍を有する患者を処置するために使用される。
【０１０７】
本発明の抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わされ、そして治療有効用量で患者に投与される。腫瘍の増殖を阻害する方法の考察については、例えば、米国特許第６，１６５，４６４号を参照のこと。
【０１０８】
Ｃｒｉｐｔｏレベルの上昇またはアクチビンＢレベルの低下に関連する障害に罹患した哺乳動物を処置する方法もまた包含され、ここでこの方法は、この哺乳動物に有効量の抗体（これはＣｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープ（これに限定されない）に特異的に結合する）を投与する工程を包含し、このエピトープは、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチなドメインである。
【０１０９】
Ｃｒｉｐｔｏレベルの上昇に関連した障害に罹患した哺乳動物を処置する方法もまた包含され、ここでこの方法は、この哺乳動物に有効量の抗体を投与する工程を包含し、この抗体は、Ｃｒｉｐｔｏと複合体を特異的に形成し、かつ以下からなる群から選択される抗体が指向されるエピトープに指向される：Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１０Ａ１０．３０、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１７、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、１−１Ａ４Ｃ．２、２−２Ｃ９．２、２−３Ｈ９．２、２−４Ｅ５．６、２−４Ｅ１．３、３−４Ｅ８．３、３−３Ｇ１．１、４−２Ｆ６、４−３Ａ７および４−１Ｅ２。
【０１１０】
Ｃｒｉｐｔｏの検出による診断は、本発明の新規の抗体を使用して、標準的なアッセイによって容易に達成され、当業者は、特に種々のサンプル、培養物などの中のＣｒｉｐｔｏの存在を検出し得る。
【０１１１】
本命際書中に記載の任意の目的のために、本発明の抗体を含むキットもまた企図される。一般に、本発明のキットは、抗体が免疫特異的であるコントロール抗原を含む。実施形態は、すべての試薬およびその使用のための使用書を含む。
【実施例】
【０１１２】
本発明のさらなる特徴が、以下の実施例から明らかとなる。以下の実施例は、例示のみの目的のためであり、いかなる様式でも本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではないことが理解される。
【０１１３】
（実施例１：Ｃｒｉｐｔｏの発現および精製）
ｐＳＧＳ４８０と名付けた発現プラスミドを、ヒトＣｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基１〜１６９（アミノ酸１〜１６９（配列番号１））をコードするｃＤＮＡをサブクローニングし、ベクターｐＥＡＧ１１００中でヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（すなわち、「ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃ」）と融合させることにより構築した。このベクターのより詳細な説明については、米国特許出願第６０／２３３，１４８号（２０００年９月１８日出願）を参照のこと。このベクターｐＥＡＧ１１００は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−ｂｅｔａｇａｌの誘導体であり、ＣＨＯ一過的トランスフェクションでのその使用が、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｉら、１９９９、Ｆｏｃｕｓ ２１：１６によって記載された。以下のように、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼＮｏｔＩフラグメントをプラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−Ｂｅｔａｇａｌ（カタログ番号１０５８６−０１４）から除去することにより、このベクターを作製した：プラスミドをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、その４．３８ｋｂのＮｏｔＩベクター骨格をゲル精製して、ライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。単離した単一のコロニーから、ｐＥＡＧ１１００を所望の組替え体を含むプラスミドとして単離した。プロモーター、ポリリンカー、および転写終結シグナルを含むｐＥＡＧ１１００の配列を、確認した。
【０１１４】
プラスミドｐＳＧＳ４８０をＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトし、この細胞を２８℃で７日間増殖させた。これらの細胞および馴化培地中でのＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質の存在をウエスタンブロット分析によって試験した。ウエスタンブロット分析について、Ｃｒｉｐｔｏトランスフェクト細胞に由来する馴化培地および細胞を、還元条件下で４〜２０％の勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動的にニトロセルロースに転写し、そしてＣｒｉｐｔｏ融合タンパク質を、Ｃｒｉｐｔｏ１７マーペプチド（配列番号１の残基９７〜残基１１３を含む）−キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）結合体に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清で検出した。遠心分離して細胞を除去した後で、ウエスタンブロット分析により、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質が、馴化培地（上澄液）中に効率的に分泌されていることが示された。この上澄液をプロテインＡ−セファロース（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、そして結合しているタンパク質を２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出したタンパク質を０．５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）で中和し、２４０〜３４０ｎｍでの吸光度の測定値から全タンパク質含量について分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について分析した。溶出したタンパク質を０．２ミクロンフィルターを通して濾過し、−７０℃で保存した。
【０１１５】
（実施例２：抗体の産生およびスクリーニング） 溶出したＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質および他のＣｒｉｐｔｏポリペプチドをマウスに注射し、当業者に公知の標準的技術を使用してハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を産生する。
【０１１６】
（Ａ．抗体の産生）
メスのロバートソニアン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｉａｎ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を、フロイント完全アジュバント（「ＦＣＡ」；ＧｉｂｃｏＢＲＬ 番号１５７２１−０１２）で乳化した２５μｇの精製ヒトＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃで腹腔内に免疫した。それらをフロイント不完全アジュバント（「ＦＩＡ」；ＧｉｂｃｏＢＲＬ 番号１５７２０−０１４）で乳化した２５μｇのＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃを２回、そしてプロテインＡビーズを１回、腹腔内に（ＩＰ）ブースター投与した。血清をスクリーニングし、最後のブースター投与の３週間後に、最も良い力価を有していたマウスに、融合の３日前に５０μｇの可溶性ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃを腹腔内にブースター投与した。このマウスに、融合の前の日に５０μｇのＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃを静脈内に（ＩＶ）ブースター投与した。
【０１１７】
脾臓１：ミエローマ６の比で、マウス脾臓細胞をＦＬ６５３ミエローマ細胞と融合させ、選択培地において、９６ウェル組織培養プレート中に１ウェルあたり１００，０００細胞、３３，０００細胞および１１，０００細胞でプレートした。１週間後、増殖について陽性であるウェルを、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡでスクリーニングした。２回の融合を実行した。
【０１１８】
（Ｂ．抗体のスクリーニング）
１回目または２回目の融合によって生じた上澄液を、最初に、Ｃｒｉｐｔｏ（ｄｅｌ Ｃ）の認識および／またはＣｒｉｐｔｏ ＥＧＦ様ドメインタンパク質についてＥＬＩＳＡプレート上でスクリーニングした。ヒトＦｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を除くために、コントロールの融合タンパク質（ＬＴ−βレセプター−Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ＥＬＩＳＡを下の節Ｃに記載するように実行した。一回目の融合において、最初の上澄液をまた、精巣腫瘍細胞株ＮＣＣＩＴ上の細胞表面Ｃｒｉｐｔｏタンパク質を認識するその能力について、ＦＡＣＳによってもスクリーニングした。２回目の融合において、２つの腫瘍細胞株、ＮＣＣＩＴおよび乳癌系統ＤＵ４４７５上のＣｒｉｐｔｏを認識する上澄液の能力を、ＦＡＣＳによって分析した。２次的スクリーニングは、以下を試験する工程を含んでいた；一群の腫瘍細胞株上の細胞表面Ｃｒｉｐｔｏを認識するモノクローナル抗体上澄液の能力（結果については表１および２を参照のこと）、ヒトの乳房腫瘍および結腸腫瘍の組織切片においてヒトＣｒｉｐｔｏを免疫組織化学的に認識するモノクローナル抗体の能力、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達アッセイにおいてシグナル伝達を阻止するモノクローナル抗体の能力、プラスチック上またはソフトアガーアッセイにおける腫瘍細胞株の増殖を阻止する能力、および細胞表面Ｃｒｉｐｔｏを内在化させる能力。
【０１１９】
（Ｃ．ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように実行した：
材料：
プレート：Ｃｏｓｔａｒ ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅａｓｙ−ｗａｓｈ ９６Ｗ ｐｌａｔｅ（０７−２００−６４２）
二次抗体：Ｐｉｅｒｃｅ Ｇｔ ａｎｔｉ−Ｍｓ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｐ１３１４３０）
基質：Ｐｉｅｒｃｅ ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（３４０２１）
停止溶液：１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
バッファー： 結合バッファー：０．１Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ９．０）
ブロッキングバッファー：ＰＢＳ＋１０％ ドナー（Ｄｏｎｏｒ）仔ウシ血清
洗浄バッファー：ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０。
【０１２０】
抗原ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−ＦｃおよびＣＲ−ＥＧＦ−Ｆｃ、コントロールｈｕ ＩｇＧ１融合タンパク質を結合バッファーで希釈して５００ｎｇ／ｍｌとした。１ウェルにつき１００μｌを添加し、３７℃で１時間、または４℃で一晩中インキュベートした。液体をデカントし、このプレートを逆さにして乾燥するまでブロットした。次いで、１ウェルにつき２５０μｌのブロッキングバッファーを添加し、続いて３０分間、３７℃でインキュベートした。再度、液体をデカントし、このプレートを逆さにして乾燥するまでブロットした。上澄液を洗浄バッファーで１：５０に希釈し、１ウェルにつき５０μｌでプレートし、続いて、室温で１時間インキュベーションした。プレートを、１ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回激しく洗浄した。次いで、洗浄バッファーで１：１０，０００に希釈した二次抗体を１ウェルにつき１００μｌで添加した。続いて３０分間、室温でインキュベートした。次いで、プレートを１ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで激しく３回洗浄し、次いで、基質を１ウェルにつき１００μｌで添加した。色を十分に暗くなるまで発色させ、次いで、１ウェルにつき１００μｌの停止バッファーを添加し、プレートを４５０ｎｍの吸光度について読み取った。
【０１２１】
特定の実験において、本発明者らは、０．１Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ９．０）中０．５μｇ／ｍｌのＣｒｉｐｔｏタンパク質の１００μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、９６ウェルプレートをＣｒｉｐｔｏタンパク質でコーティングした。本発明者らは、プレートをＰＢＳ／１０％ ＤＣＳでブロックした。本発明者らは、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で希釈した抗体を１ウェルにつき５０μｌで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。本発明者らは、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で洗浄し、抗マウス−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）でプローブした。本発明者らは、ＴＭＢを添加し、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、４５０ｎｍで読み取ることによって、結合した抗体を検出した。
【０１２２】
また他の実験において、本発明者らは、５０ｍＭ 炭酸塩（ｐＨ９．５）中３〜５μｇ／ｍｌのアクチビンＢまたは他のリガンドを各ウェルに１００μｌ添加することによって９６ウェルプレートをコーティングした。本発明者らは、プレートを１時間、室温でインキュベートし、４℃で一晩中ＴＢＳ／１％ ＢＳＡでブロックした。本発明者らは、プレートを室温でブロッキングバッファー中のＣＲ−ＦｃまたはＡＬＫ４−Ｆｃと共にインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、抗ヒト−ＡＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）でプローブした。本発明者らは、プレートをＴＢＳＴで洗浄し、１０×基質バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）で１回洗浄し、ＣＳＰＤおよびＳａｐｐｈｉｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｉｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。
【０１２３】
（Ｄ．フローサイトメトリー）
細胞表面染色およびフローサイトメトリーを以下のように使用して、Ｃｒｉｐｔｏへの結合についてモノクローナル抗体をアッセイするために、Ｃｒｉｐｔｏ陽性細胞株を使用し得る：
５ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で１０分間用いて、２ｍｌのＰＢＳを有するＴ１６２フラスコ中から細胞を遊離させる。血清を含有する培地で２０ｍｌにまで量を増やして、細胞の塊を分解するために数回上下にピペッティングする。１２００ｒｐｍで５分間回転させる。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（４℃）（洗浄バッファー）の５〜１０ｍｌで細胞を洗浄する。１２００ｒｐｍで５分間回転させる。洗浄バッファーで４×１０６〜１０７／ｍｌで再懸濁する。氷上で保持する。
【０１２４】
染色のために抗体を調製する。精製抗体を洗浄バッファーで希釈して１〜１０μｇ／ｍｌにする。９６ウェル Ｌｉｎｂｒｏ Ｖ ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｐｌａｔｅ（ＩＣＮ ７６３２１０５）に５０μｌの細胞を添加する。分析されるべき各細胞株についての各コントロールのための細胞を１つのウェルにプレートする。このようなコントロールのための細胞としては、抗体なし、二次抗体のみ、ハイブリドーマ培地、ポジティブコントロールの抗体上澄液（利用可能であるか、または精製されている場合）、およびＩｇＧサブクラスコントロール（精製抗体を使用する場合）のための細胞が挙げられる。
【０１２５】
分析されるべき各細胞株の各実験サンプルのための細胞を1つのウェルにプレートした
。４℃にした卓上遠心分離機を使用して、プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させる。プレートを逆にして、液体が実質的に除去されるまで振ることによって、バッファーを取り除く。ウェルに４０〜５０μｌの抗体（または、抗体なしのコントロールウェルおよび二次抗体のみのコントロールウェルについては洗浄バッファー）を添加する。少なくとも３０分間〜１時間、４℃でインキュベートする。プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させる。抗体溶液を取り除く。１ウェルにつき２００μｌの洗浄バッファーで２回ウェルを洗浄する（各洗浄のあとには回転させる。）。バッファーを取り除く。
【０１２６】
各ウェルの細胞を５０μｌの（洗浄バッファー中）１：２００希釈のＲ−ＰＥタグ化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ カタログ番号１１５−１１６−０７１）に再懸濁する。暗黒下で２０分間、４℃でインキュベートする。各ウェルの細胞に１５０μｌの洗浄バッファーを添加する。プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させる。１ウェルにつき２００μｌの洗浄バッファーで１回洗浄する。ＰＢＳ中１％ＰＦＡの１５０μｌ中に細胞を再懸濁する。各ウェルの内容物を別個のチューブ（５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎポリスチレン丸底チューブ−３５２０５２）に移す。チューブを薄いホイルでラップする。
【０１２７】
次いで、チューブの内容物をフローサイトメトリーで読み取る。
【０１２８】
本方法によって分析した特定のモノクローナル抗体の２回のスクリーニングの結果、下の表１および２にまとめてある、以下の結果が得られた。ここで、第１の列は、ハイブリドーマのサブクローンについてつけた名称を提供し、次の２つの列は、ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示し、残りの列は、４つのｃｒｉｐｔｏ陽性細胞株についてのフローサイトメトリー分析の結果を示す。この結果は、平均蛍光指標（ＭＦＩ）の単位で示してある。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
【表２】
本発明者らはまた、下に示すように、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質および領域特異的Ｃｒｉｐｔｏペプチドを使用する多数の別の免疫プロトコルを使用した。これらの場合において、本発明者らはまた。記載するようにハイブリドーマを産生した。ＣｒｉｐｔｏペプチドをＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質に加えて、またはＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質の代わりに使用した。これらのプロトコルによって、本発明の抗体のいくつかを同定した。当業者に理解されるように、これらの実験によって、複数の多様な免疫プロトコルが、本発明の抗体を産生するために使用され得ることが示された。
【０１３１】
１つの例示的な免疫プロトコルにおいて、キーホールリンペットへモシアニン（ＫＬＨ）と結合した可溶性ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃ組換えタンパク質または領域特異的Ｃｒｉｐｔｏペプチドのいずれか５０μｇ、およびフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む乳剤で、８週齢のメスのＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を腹腔内に（ＩＰ）免疫した。詳細には、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質−ＫＬＨまたはＣｒｉｐｔｏペプチドＣＲ４０（アミノ酸３６〜４２；配列番号３）−ＫＬＨを、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）で２ｍｇ／ｍｌの推定濃度に希釈した。乳化および免疫の前に、このタンパク質に等容量のＦＣＡを添加した。乳化したＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質−ＫＬＨまたはＣｒｉｐｔｏペプチドＣＲ４０−ＫＬＨの５０μｇを含む５０μｌを、初回の免疫のために各マウスにＩＰ投与した。下に示すように、後の全ての免疫を、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）またはＲＩＢＩアジュバント１，２（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のいずれかを使用して同様に投与した。ブースター免疫を、２〜３週毎に投与した。1回目の免疫の前、ブースター免
疫の7日後、そしてまたリンパ球細胞との融合の前に、免疫したマウスの血清サンプルを
収集した。以下に示すように、ＥＬＩＳＡアッセイおよびフローサイトメトリーアッセイの両方を使用して、血清力価を測定した。
【０１３２】
異なるＣｒｉｐｔｏ抗原による種々の例示的な免疫プロトコールおよびそれによって同定される抗体は、以下の通りである：
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
【表５】
抗原４−（ｘ＝ＫＬＨに結合体化したペプチドの数；本発明者らはまた、例えば、プロトコールＣにおいて記載されたようにＣＲ（ｄｅｌＣ）−Ｆｃにより予め免疫されたマウスにＫＬＨと結合体化したペプチドを注入する）：
本発明者らが使用した例示的なＣＲｘペプチドの配列および全長Ｃｒｉｐｔｏタンパク質におけるそれらの位置は、以下の通りである：
ＣＲ４０＝ＦＲＤＤＳＩＷＰＱＥＥＰＡＩＲＰＲ（ａａ４６−４２，Ａ１０．Ｂ２；配列番号：３）
ＣＲ４１＝ＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫＥ（ａａ９７−１１３；配列番号：４）
ＣＲ４３＝ＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫＣ（ａａ １１６−１２８；配列番号：５）
ＣＲ４４＝ＳＬＣＫＳＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱ（ａａ １２９−１４３；配列番号：６）
ＣＲ４９＝アセチル化Ｎ−ＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＲＥＮＣＧＳＶＰＨＤＴＷＬＰＫＫ−ＣＯＯ−（ａａ１００−ａａ１２７；配列番号：７）
ＣＲ５０＝アセチル化Ｎ−ＬＮＥＧＴＣＭＬＧＳＦＣＡＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫ−ＣＯＯ−（ａａ８４−ａａ１１２，フコシル化領域を含む；配列番号：８）
ＣＲ５１＝アセチル化Ｎ−ＰＨＮＴＷＬＰＫＫＣＳＬＣＫＣＷＨＧＱＬＲＣＦＰＱＡＦＬＰＧＣＤ−ＣＯＯ−（ａａ１１９−ａａ１５０；配列番号：９）
【０１３６】
【表６】
（実施例３：Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害についてのヌル細胞アッセイ）
以下は、Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害を評価するのに使用したＦ９ Ｃｒｉｐｔｏヌル細胞シグナル伝達アッセイを記載する。
【０１３７】
第０日 ６ウェルのプレートを０．１％ゼラチン ２ｍｌ／ウェルで３７℃１５分間コーティングする。１ウェルあたり６×１０５ Ｆ９ ＣＲＩＰＴＯ ＮＵＬＬ細胞で細胞を播種する
第１日 トランスフェクション：以下のサンプルの各々を３００μｌのＯｐｔｉＭｅｍ１に加えて、各サンプルについての溶液Ａを得る：
サンプル１：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ ＦＡＳＴ レポーター ｃＤＮＡ
および１．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル２：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ ＦＡＳＴ，および１μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル３：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ ＡＤＤ ０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル４：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル５：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル６：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル７：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル８：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
サンプル９：０．５μｇ（Ｎ２）７ ルシフェラーゼ，０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ，０．５ ＦＡＳＴ，および０．５μｇ 空のベクター ｃＤＮＡ。
【０１３８】
溶液Ｂは、３０μｌのリポフェクタミンおよび２７０μｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を含む。
【０１３９】
各サンプルについて、溶液Ａと溶液Ｂを一緒に混合する。室温で４５分間インキュベートする。２ｍｌ／ウェルのＯｐｔｉＭｅｍ１でウェルを洗浄する。次の工程の直前に吸引する。
【０１４０】
２．４ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を溶液Ａ＋Ｂの各混合物に加え、混合し、１．５ｍｌ／ウェルを加えて、ウェルを複製する。３７℃で５時間インキュベートする。１．５ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭおよび２０％のＦＣＳ、２ｍＭ Ｇｌｎ、Ｐ／Ｓをウェルに加え、これらのウェルは、サンプル１〜３を受容する。以下のように抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を加える：サンプル４ウェル：Ａ２７Ｆ６．１，１０μｇ／ｍｌ；サンプル５ウェル：Ａ２７Ｆ６．１，２μｇ／ｍｌ；サンプル６ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８；１０μｇ／ｍｌ，サンプル７ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８ ２μｇ／ｍｌ；サンプル８ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８，１０μｇ／ｍｌ；サンプル９ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８，２μｇ／ｍｌ。
【０１４１】
第２日 培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄（２ｍｌ／ウェル）する。先日のように同量のＣｒｉｐｔｏ抗体と共にＤＭＥＭおよび０．５％ ＦＣＳ，２ｍＭ Ｇｌｎ，Ｐ／Ｓを同じウェルに加える。
【０１４２】
第３日 ルシフェラーゼシグナルを現像する。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＭｇ２＋によりウェルを洗浄（２ｍｌ／ウェル）する。ＬｕｃＬｉｔｅキット（Ｐａｃｋａｒｄカタログ番号；６０１６９１１）を使用する。緩衝液と基質とを室温にする。光を薄暗くする。１０ｍｌの緩衝液により基質を再構築する。ＰＢＳおよびＣａ２＋およびＭｇ２＋により１：１に希釈する。ウェルを吸引する。反復ピペッターを使用して、１ウェルあたり２５０μｌの希釈した基質を素早く加える。溶液をかき混ぜ、９６ウェル白色不透明底プレート（Ｆａｌｃｏｎ３５−３２９６）のウェルに２００μｌを移す。Ｗｉｎｇｌｏｗを使用して照度計上でプレートを読み取り、データをＥｘｃｅｌ（登録商標）にエキスポートする。
【０１４３】
本発明の特定の抗体によるこのアッセイの結果を以下の表３に要約する。
【０１４４】
【表７】
本発明者らはまた、Ａ２７Ｆ６．１抗体の他の濃度を試験した。本発明者らは、これらの細胞の培地に０．５〜２０ ｍｇ／ｍｌのｍａｂ Ａ２７Ｆ６．１を加えることで、Ｃｒｉｐｔｏ誘導性ルシフェラーゼシグナルを３４〜９５％阻害したことを観察した（図１）。本発明者らはまた、本発明の他の抗体を試験し、ｍａｂ Ａ６Ｃ１２．１１およびｍａｂ Ａ８Ｇ３．５はまた、シグナル生成を阻害したことを観察した。
【０１４５】
代替のアッセイ系として、本発明者らは、ＮＣＣＩＴ細胞におけるＦＡＳＴ／（Ｎ２）７−ｌｕｃ活性の阻害について本発明のＣｒｉｐｔｏ特異的ｍａｂを試験した。ＮｏｄａｌおよびＡＬＫ４の異所性発現が、レポーター活性化に対してこれらの細胞において必要であることを除いて、これらのアッセイはＦ９細胞についてのアッセイと同様であった。本発明者らは、ｍａｂ Ａ２７Ｆ６．１が、２μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌの両方において、これらの細胞におけるルシフェラーゼ活性を９０％減少させたことを観察した（図２）。
（実施例４：腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害についてのアッセイ）
Ｃｒｉｐｔｏ活性の阻害はまた、軟寒天におけるＧＥＯ細胞の増殖を測定することによってアッセイされ得る。例えば、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら，１９９４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
９：２９１−９８；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：１０５１−５４を参照のこと。
【０１４６】
本発明者らは、３％のバクトアガー（ｂａｃｔｏａｇａｒ）を融解し、水浴中で４２℃に維持した。本発明者らは、３％のバクトアガー溶液と予め温めた完全培地とを混合し、０．６％のバクトアガーの溶液を作製して、これを４２℃に維持した。本発明者らは、４ｍｌの溶液を６ｃｍの皿にプレーティングし、これを少なくとも３０分間冷却し、底に寒天層を形成した。本発明者らは、ＧＥＯ細胞をトリプシン処理し、完全培地中、１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。本発明者らは、この細胞懸濁物にアッセイされるべき抗体、またはコントロールを加え、２０μｇから１μｇまで抗体を滴定した。本発明者らは、等容量のＧＥＯ細胞懸濁物と０．６％のバクトアガーとを混合し、底にある寒天層の上面に２ｍｌ重ねた。本発明者らは、プレートを少なくとも１時間冷却した。本発明者らは、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、１４日間インキュベートした。本発明者らは、顕微鏡を用いなくても確認できるコロニーをカウントした。ネガティブコントロールと比較して、コロニーが存在しないことは、試験した抗体がインビトロで腫瘍細胞増殖を阻害したことを示した。
【０１４７】
このアッセイを使用して、抗体Ａ２７Ｆ６．１およびＢ６Ｇ７．１０について表４に示される結果を得、これらの両方の抗体は、ＧＥＯ細胞コロニーの増殖を減少させる能力を実証する。
【０１４８】
【表８】
本発明者らは、Ｔ−４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ）による増殖阻害アッセイを実施し、この細胞は、実施例９に記載されるように非腫瘍形成性ヒト胸部癌腫である。
（実施例５：腫瘍細胞増殖のインビボ阻害についてのアッセイ）
腫瘍細胞増殖の阻害を評価するために、ヒト腫瘍細胞株を無胸腺ヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍阻害に対する相乗作用効果または相加効果を提供し得るさらなる化学療法処置の有無のもと、本発明の抗体の効果を観察する。
【０１４９】
このアッセイは、以下の異なる腫瘍細胞株を用いて代替的に実施され得る：例えば、ＧＥＯ（十分に分化したヒト結腸癌インビトロ細胞株であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる）、ＤＵ−４４７５（ＡＴＣＣから得られる乳癌インビトロ細胞株）、ＮＣＣＩＴ（ＡＴＣＣから得られる精巣腫瘍細胞株）、または当該分野で公知の他のもの。このようなアッセイの１つの例を以下に記載する。
【０１５０】
動物を耳をパンチすることで個別にマーキングする。ＧＥＯ細胞株をインビトロまたはインビボで１〜４回継代させる。動物に右側腹領域の皮下にＧＥＯ細胞を移植する。以下の動物の群を使用し得る：
グループ番号 処置 マウスの番号
１． 生理食塩水 コントロール，０．２ｍｌ／マウス， ２０
ｉ．ｐ．１週間に３回（Ｍ，Ｗ，Ｆ）
２． Ｍａｂ，低用量，ｉ．ｐ． １０
３． Ｍａｂ，中用量，ｉ．ｐ． １０４． Ｍａｂ，高用量，ｉ．ｐ． １０
５． ５−ＦＵ，３０ ｍｇ／ｋｇ／注入，ｉ．ｐ．， １０
３ Ｒｘ／ｗｋ （Ｍ，Ｗ，Ｆ）
６． シスプラチン，２ ｍｇ／ｋｇ／注入，ｓ．ｃ．， １０
Ｒｘ／ｗｋ（Ｍ，Ｗ，Ｆ）
７． アドリアマイシン，１．６ ｍｇ／ｋｇ／注入，ｉ．ｐ．， １０
３ Ｒｘ／ｗｋ（Ｍ，Ｗ，Ｆ）
８． イリノテカン，１０ ｍｇ／ｋｇ／注入．，ｉ．ｐ．， １０
５ Ｒｘ／ｗｋ（Ｍ−Ｆ）
９． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋ ５−ＦＵ １０
（中間用量）
１０． ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋ ５−ＦＵ １０
（中間用量）
１１． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋ ５−ＦＵ １０
（中間用量）
１２． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋シスプラチン １０
グループ番号 処置 マウスの番号
（中間用量）
１３． ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋シスプラチン １０
（中間用量）
１４． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋シスプラチン １０
（中間用量）
１５． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋アドリアマイシン １０
（中間用量）
１６． ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋ １０
アドリアマイシン（中間用量）
１７． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋アドリアマイシン １０
（中間用量）
１８． ＭＡｂ，低用量，ｉ．ｐ．＋イリノテカン １０
（中間用量）
１９ ＭＡｂ，中用量，ｉ．ｐ．＋ １０
イリノテカン（中間用量）
２０． ＭＡｂ，高用量，ｉ．ｐ．＋イリノテカン １０
（中間用量）
第０日：腫瘍を移植し、動物の初期体重を記録する。
第１日：上記の処置を開始する。
第５日：腫瘍サイズ測定および体重測定を開始し、実験が終了するまで１週間に２回継続する。
【０１５１】
初期体重、腫瘍サイズおよび体重測定、屠殺のときの組織学、および腫瘍についての免疫組織化学分析を、Ｃｒｉｐｔｏ発現、腫瘍増殖、およびそれらの阻害について試験する。
【０１５２】
（実施例６：インビボ異種移植片腫瘍モデル−Ｃｙｓリッチブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌腫細胞株をＣｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した。実験方法を以下に列挙する。結果を図３に示す。
【０１５３】
（方法および材料）
動物：無胸腺ヌードマウスを使用した。耳を穿孔することによって、動物を個々に番号付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ、縦隔混合型胚細胞ヒト精巣癌腫インビトロ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから元々得られた）。細胞株を、抗生物質無しで、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中で６継代にわたって、インビトロで継代させた。動物の右側腹部に、５×１０６細胞／０．２ｍｌマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で動物に皮下的に移植した。
【０１５４】
【表９】
処置を１日目に開始した。
【０１５５】
試験スケジュール
−１日目：マウスをコントロール群および処置群に無作為化した。動物の初期の体重を記録した。最初の処置を抗体群に施した。投薬溶液を作製した。アッセイが終了するまで、技師に対して処置は盲検であった。
０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍において細菌培養を実施した。
１日目：最初の処置をポジティブな化学療法群へ施した。
４日目：マトリゲルにおいて腫瘍ベースラインについての初期腫瘍サイズ測定を記録した。マウス２×／週で、腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。研究を毎日モニターし、そして動物について任意の異常な観測を記録した。
終点：初期体重
腫瘍サイズおよび体重測定。
【０１５６】
（実施例７：インビボ異種移植片腫瘍モデル−ＥＧＦ様ドメインブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌腫細胞株を、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに結合する抗体とともに皮下的に移植した。実験方法を以下に列挙する。結果を図４に示す。
【０１５７】
（方法および材料）
動物：無胸腺ヌードマウスを使用した。耳を穿孔することによって、動物を個々に番号付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ、縦隔混合型胚細胞腫ヒト精巣癌インビトロ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから元々得られた）。細胞株を、抗生物質無しで、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中で８継代にわたって、インビトロで継代させた。動物の右側腹部に、５×１０６細胞／０．２ｍｌマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で動物に皮下的に移植した。
【０１５８】
【表１０】
処置を１日目に開始した。
【０１５９】
試験スケジュール
−１日目：マウスをコントロール群および処置群に無作為化した。動物の初期の体重を記録した。最初の処置を抗体群に施した。投薬溶液を作製した。アッセイが終了するまで、技師に対して処置は、盲検であった。
０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍において細菌培養を実施した。細菌培養をは、サンプリングの２４時間後および４８時間後に、混入についてネガティブであった。
１日目：最初の処置をポジティブな化学療法群へ施した。
４日目：マトリゲルにおいて腫瘍ベースラインについての初期腫瘍サイズ測定を記録した。マウス２×／週で、腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。研究を毎日モニターし、そして動物について任意の異常な観測を記録した。
終点：初期体重
腫瘍サイズおよび体重測定。
【０１６０】
（実施例８：Ｃｒｉｐｔｏ ｍａｂは、ＡＬＫ４結合を調節する）
Ｃｒｉｐｔｏ特異的モノクローナル抗体が、ＡＬＫ４（アクチビンＩ型レセプターに結合するＣｒｉｐｔｏの能力と妨害し得るか否かを評価するために、本発明者らは、ＡＬＫ４を安定に発現する２９３細胞株を使用して、フローサイトメトリー分析を使用した。この細胞株を作製するために、２９３細胞を、ＨＡエピトープでＣ末端においてタグ化されたＡＬＫ４を発現するプラスミドおよびピューロマイシンを発現するプラスミドを、１０：１の比で同時トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞をコロニーが形成されるまでピューロマイシン中で選択した。次いで、コロニーを、拾い上げ、増殖させ、そしてＨＡについてウェスタンブロット分析を使用して、ＡＬＫ４発現について分析した。クローン２１（２９３−Ａｌｋ４−２１）が、コントロールの非トランスフェクト２９３細胞と比較して、高レベルのＡＬＫ４を発現することが見出された。
【０１６１】
フローサイトメトリーによってＣｒｉｐｔｏ−ＡＬＫ４結合を分析するために、ヒトＩｇＧ（ＣＲ（ｄｅｌＣ）−Ｆｃ）のＦｃ部分に融合したヒトＣｒｉｐｔｏ（ａａ１〜１６９）の精製された可溶性形態を使用した。約５μｇ／ｍｌのＣＲ（ｄｅｌＣ）−Ｆｃタンパク質またはコントロールＦｃタンパク質を、５０μｌの合計容量のＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で、３０分間、氷上で３×１０５ ２９３−Ａｌｋ４−２１細胞とともにインキュベートした。抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を含有するサンプルについて、５μｇ／ｍｌのＣｒｄｅｌＣ−ＦＣを、細胞の添加の前に、氷上で、５０μｇ／ｍｌの各Ｃｒｉｐｔｏ抗体（Ａ１０．Ｂ２．１８、Ａ４０．Ｇ１２．８、Ａ２７．Ｆ６．１、Ａ８．Ｈ３．１、Ａ１９．Ａ１０．３０、Ａ６．Ｆ８．６、Ａ８．Ｇ３．５、Ａ６．Ｃ１２．１１）とともにプレインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、そして結合したＦｃタンパク質を、細胞をＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓ製のＲ−フィコエリトリン結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）とともにインキュベートすることによって検出した。次いで、サンプルを再び洗浄し、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして標準的フローサイトメトリー手順を使用して分析した。ＦＡＣＳアッセイの結果を図５に示す。
【０１６２】
（実施例９：Ｃｒｉｐｔｏが、乳癌細胞のアクチビンＢ誘導型増殖抑制を破壊する）
ＡＴＣＣからの継代番号２のＴ４７Ｄ細胞（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／１０μｇ／ｍｌインシュリン中で維持した）に、Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥｃｏＲ；Ｂ．Ｅｌｅｎｂａａｓ）について発現プラスミドをトランスフェクトし、そして１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地中で選択した。ｐＢＡＢＥ−ＧＦＰマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の感染を可能にするＴ−４７Ｄ−ＥｃｏＲのコロニーを増殖させ、ｐＢＡＢＥ−ｈＣｒ−ＰＵＲＯ−ＭＬＶにより感染させ、そしてピューロマイシン培地において選択した。このオリゴクローナル株（Ｔ−４７Ｄ−ｈＣｒ）を、特異的抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を用いて、ｈＣｒ（ヒトＣｒｉｐｔｏ）発現についてＦＡＣＳによって分析した。約４０００細胞／ウェルのＴ−４７Ｄ−ＥｃｏＲまたはＴ−４７Ｄ−ｈＣｒを、２５ｎｇアクチビンＢ（Ｒ＆Ｄ）、または２５ｎｇアクチビンＢおよび０．１〜５０μｇ／ｍｌ Ａ８Ｇ３．５を伴う／伴わない２％血清を含有する培地中で、９６ウェルプレートでプレートした。因子を伴う培地を、７〜８日間、毎日交換した。２０μｌ／ウェル ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、プレートを収集し、２時間３７℃でインキュベートし、そして４９０ｎｍで読んだ。
【０１６３】
本発明者らは、アクチビンＡまたはアクチビンＢを伴うかまたは伴わない低血清濃度でＴ−４７Ｄ細胞およびＴ−４７Ｄ−ＥｃｏＲ細胞を増殖させ、そしてＭＴＴ比色アッセイを使用して細胞を増殖するためにアッセイした。本発明者らは、Ｔ−４７Ｄ細胞の増殖が、未処理細胞と比較して、約４０％、アクチビンＡまたはアクチビンＢによって阻害されたことを観察した（図６）。本発明者らはまた、Ｔ−４７Ｄ−ＣＲ細胞が、アクチビンＡによって阻害されたことを観察したが、Ｔ−４７Ｄ−ＣＲ細胞は、アクチビンＢに対して応答性ではなかったことを発見した（図６）。この結果は、これらの細胞の増殖に対するＣｒｉｐｔｏの効果が、アクチビンＢに特異的であることを示す。本発明者らは、未処理のＴ−４７Ｄ細胞およびＴ−４７Ｄ−ＣＲ細胞が、正常培地または低血清条件のいずれにおいても増殖速度が異ならなかったことをコントロール実験において観察した。
【０１６４】
次いで、本発明者らは、本発明の抗体が、Ｃｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を阻害し得るか否かを試験した。本発明者らは、本発明の種々の抗体の存在下で、アクチビンＢを用いて、Ｔ−４７Ｄ−ＣＲを処理した。本発明者らは、アクチビンＢの増殖抑制活性が、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのｍａｂ Ａ８Ｇ３．５の存在下で回復されたことを観察した（図７）。本発明者らは、Ａ２７Ｆ６．１ ｍａｂが、これらの細胞のアクチビンＢ増殖抑制を回復し得なかったことを観察した。
【０１６５】
（実施例１０：Ｃｒｉｐｔｏは、アクチビンＢに直接結合する）。
【０１６６】
本発明者らは、Ｃｒｉｐｔｏが、アクチビンＢに直接結合することを発見した。本発明者らは、精製アクチビンＢ、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＧＤＮＦまたはＢＭＰ２を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、そしてＣＲ−Ｆｃとともにインキュベートした。次いで、本発明者らは、アルカリホスファターゼに結合体化された抗Ｆｃ抗体を添加し、そしてアルカリホスファターゼ基質を添加しそして発色させることによって結合をモニターした。本発明者らは、ＣＲ−Ｆｃが、アクチビンＢを含むウェルに結合したが、アクチビンＡにも他のリガンドにも結合しなかったことを観察した（図８）。さらに、本発明者らは、アクチビンＢコーティングプレートに加える前に、溶液中のアクチビンＡまたはアクチビンＢとともにＣＲ−Ｆｃをプレインキュベートし、アクチビンＢのみが、結合を阻害したことを観察した（図９）。これらの結果は、Ｃｒｉｐｔｏが、アクチビンＢに特異的に結合することを確認した。
【０１６７】
本発明者らはまた、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ−アクチビンＢ相互作用を分析した。本発明者らは、アクチビンＢが、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＣＲ−Ｆｃに高い強度で直接結合するが、コントロールＬＴβＲ−Ｆｃタンパク質に結合しないことを発見した（図１０）。本発明者らはまた、ＣＲ−Ｆｃに結合するアクチビンＡが、無視され得ることを観察した。これらのデータは、アクチビンＢが約１ｎＭの競合形式アッセイを測定された溶液中で迅速な速度および見かけの親和性でＣｒｉｐｔｏに結合したことを示す。
【０１６８】
Ｃｒｉｐｔｏ抗ＣＦＣモノクローナル抗体２−２Ｃ９．２およびＡ８Ｇ３は、ＣｒｉｐｔｏとアクチビンＢとの相互作用を調節した。これは、アクチビンＢへのＣｒｉｐｔｏの結合が、Ａ８Ｇ３または２−２Ｃ９．２の添加によって阻害された同時免疫沈降実験によって示された。抗アクチビンＢ抗体を用いる従来のウェスタンブロット技術を使用して、阻害を測定した。
【０１６９】
上記の本発明の実施形態のいくつかは、以下に概説され、これらは、以下の実施形態を含むがこれらに限定されない。当業者が理解するように、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の種々の実施形態に対して、多くの変更および改変がなされ得る。全てのこのような変更が、本発明の範囲内に入ることが意図される。
【０１７０】
本明細書中に引用される各刊行物の開示全体が、本明細書によって参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１６１５３９（Ｐ２００９−１６１５３９Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０９４９（Ｐ２００９−２０９４９）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【分割の表示】特願２００３−５８０４７７（Ｐ２００３−５８０４７７）の分割
【原出願日】平成１４年１０月１日（２００２．１０．１）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【分割の表示】特願２００３−５８０４７７（Ｐ２００３−５８０４７７）の分割
【原出願日】平成１４年１０月１日（２００２．１０．１）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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