ＤＮＡメチル化測定方法
【課題】生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供する。
【解決手段】（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理する第二工程等を有する生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等を提供する。
【解決手段】（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理する第二工程等を有する生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるＤＮＡのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法が存在している（例えば、非特許文献１及び２参照）。
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ支持体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて当該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて当該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
【０００３】
【非特許文献１】Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.
【非特許文献２】Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のいずれの方法とも、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要し、さらに、ＰＣＲが増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記のプライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、しかもその操作は極めて繁雑である。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と前記マスキング用オリゴヌクレオチドとから分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第三（前Ａ）工程）と、
第三（前Ａ）工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第三（前Ｂ）工程）と、
第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三（前Ｃ）工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ａと、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
２．前項１記載の第三工程のメチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である、前項１記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法
３．生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項１〜２のいずれかの前項記載の方法；
４．生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項１〜２のいずれかの前項記載の方法；
５．生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項１〜２のいずれかの前項記載の方法；
６．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜５のいずれかの前項記載の方法；
７．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜６のいずれかの前項記載の方法；
８．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜７のいずれかの前項記載の方法；
９．少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１０．少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII、又はHhaIであることを特徴とする前項１〜９のいずれかの前項記載の方法；
１．第二工程においてメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する請求項１〜１０のいずれかの請求項記載の方法。
２２． 第一工程が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で分離された一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させる第一（Ｂ）工程と、からなり、
第一（Ａ）工程でメチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する前項１〜１１のいずれか一項に記載の方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡをあげることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料もあげられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
【０００８】
本発明における「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する塩基は４種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。
本発明における「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
【０００９】
本発明における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）は、当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいＤＮＡ領域であって、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有するものであり、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡの領域等を挙げることができる。
【００１０】
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号２で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号３で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号４で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号５で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号５で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号６で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号６で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号７で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号７で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列があげられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号８で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号８で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号８で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号９で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号９で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号１０で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１０で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２０】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号１１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号１２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１２で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号１３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１３で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号１４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１４で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号１５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１５で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号１６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１６で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２６】
本発明測定方法における「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本特許記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、あるいは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本特許ではメチル化ＤＮＡ、あるいはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。あるいは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下あるいは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。なお、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内あるいは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法などがあげられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などがあげられる。
【００２７】
一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明測定方法における「メチル化された一本鎖ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されている一本鎖ＤＮＡを意味しており、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧの全てがメチル化されている一本鎖ＤＮＡに限った意味ではない。
【００２８】
本発明における「（目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、）増幅されたＤＮＡの量」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量そのもの、即ち、本発明測定方法の第三工程で求めた量を意味するものである。例えば、生物由来検体が１ｍＬの血清であった場合には、血清１ｍＬ中に含まれる前記のメチル化されたＤＮＡに基づいて増幅されたＤＮＡの量を意味する。
【００２９】
本発明測定方法における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させても、当該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させれば、当該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のＣｐＧ対を含む二本鎖ＤＮＡ（即ち、前記ＣｐＧ対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖ＤＮＡ）を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515）。また、例えば、一本鎖ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素、即ち、メチル化感受性制限酵素の中には、一本鎖ＤＮＡを消化するものもある。例えば、HhaI等を挙げることができる。
【００３０】
本発明における「マスキング用オリゴヌクレオチド」とは、メチル化感受性制限酵素を認識する塩基配列をその一部として有するオリゴヌクレオチドであり、一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも１箇所（全ての個所でも良い）と相補的に結合し二本鎖を形成し（即ち、前記箇所を二本鎖状態にして）、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、また、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖ＤＮＡも消化でき、その消化効率は、二本鎖ＤＮＡに対する方が一本鎖ＤＮＡに対するよりも高い。）での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドを意味する。また、本オリゴヌクレオチドは、後述のフォワード用プライマーまたはリバース用プライマーを伸長プライマーとして、当該マスキング用オリゴヌクレオチドを鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。なお、塩基長としては、８〜２００塩基長が望ましい。
ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、１種類でもよく複数種類でも良い。複数種類を用いると、目的とする領域のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、メチル化感受性制限酵素での、後述の「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができる。マスキング用オリゴヌクレオチドは、例えば、目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、必ずメチル化している場合は消化せずにメチル化していない場合は消化したい箇所（例えば、疾患患者検体では100%メチル化されており、健常者検体では100%メチル化されていない箇所等）について設計し使用すると特に有用である。
【００３１】
本発明における「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ」とは、前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないシトシンである一本鎖ＤＮＡを意味するものである。
【００３２】
「相補性によって結合（相補的な（塩基対合による）結合）」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとシトシン、グアニンとアデニンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的な結合」と呼ぶこともある。「相補的な結合」は、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性により結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作成されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンがシトシン、アデニン、チミンと水素結合の水素結合で結合することも意味する。
「目的とするＤＮＡ領域（に対して相補性である塩基配列）を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
【００３３】
本発明測定方法の第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する。また、第一工程は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する第一（Ａ）工程と、メチル化された一本鎖ＤＮＡを固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ｂ）工程からなる。
一本鎖ＤＮＡを取得するには、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離して取得してもよいし、元来検体中に含まれる一本鎖ＤＮＡをそのまま取得してもよい。尚、この二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離するには、通常の手法を用いて行うことができる。
【００３４】
本発明測定方法の第一（Ａ）工程において、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する」際、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにするための一般的は操作を行えばよい。具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を適当量の超純水に溶解し、95℃で10分間加熱し、氷中で急冷すればよい。
【００３５】
本発明測定方法の第一（Ｂ）工程における「固定化メチル化ＤＮＡ抗体」は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために用いられる。
本固定化メチル化ＤＮＡ抗体は、支持体に固定化され得るものであればよく、「支持体に固定化され得るもの」とは、メチル化ＤＮＡ抗体を支持体へ直接的、あるいは間接的に固定できることを意味する。
このように固定化されるためには、メチル化ＤＮＡ抗体を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従って、支持体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体をビオチン化して得られたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、メチル化ＤＮＡ抗体を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、あるいは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。なお、共有結合には、例えば、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる方法も挙げられる。
さらに、メチル化ＤＮＡ抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、メチル化ＤＮＡ抗体に対する抗体（二次抗体）を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
なお、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択する際に本固定化メチル化ＤＮＡ抗体が支持体に固定化されていればよく、（１）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化メチル化ＤＮＡ抗体との結合前の段階で、本固定化メチル化ＤＮＡ抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また（２）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化メチル化ＤＮＡ抗体との結合後の段階で、本固定化メチル化ＤＮＡ抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。
【００３６】
本発明測定方法の第一（Ｂ）工程において、「メチル化された一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する」際、具体的には例えば、固定化メチル化ＤＮＡ抗体として、「ビオチン標識されたビオチン化メチルシトシン抗体」を使用して、以下のように実施すればよい。
（ａ）ビオチン化メチルシトシン抗体を適当量（例えば、0.1μg/50μL）アビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンの固定化を促す。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をＰＣＲチューブ内に残す。
（ｂ）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡをバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithiothreitol）とを混合して、９５℃で数分間加熱する。その後、約０〜４℃の温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、一本鎖ＤＮＡを形成させる。その後、室温に戻す。
（ｃ）形成された前記一本鎖ＤＮＡを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体と、前記一本鎖ＤＮＡのうちメチル化された一本鎖ＤＮＡとの結合を促す（結合体の形成）（この段階で、少なくともメチル化されてないＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡは、結合体を形成しない。）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、結合体をＰＣＲチューブ内に残す（結合体の選択）。
（ｂ）において使用するバッファーとしては、生物試料由来のゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ分離するために適していれば良く、前記バッファーに限ったわけではない。
（ａ）及び（ｃ）における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていないメチル化ＤＮＡ抗体、メチル化ＤＮＡ抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ、または、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化ＤＮＡ抗体、溶液中に浮遊している一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
【００３７】
本発明測定方法の第二工程では、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡを基質とするメチル化感受性制限酵素により消化されるが、多くの二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素では消化されない。そこで、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡとメチル化感受性制限酵素を認識する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをマスキング用オリゴヌクレオチドとして混合することにより、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でもアンメチル状態のＣｐＧを有するメチル化感受性制限酵素の認識配列を消化できるようにし、また、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での前記箇所の消化効率を向上させることもできるようにした。
マスキング用オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡを一本鎖に分離する前で混合してもよく、または、第二工程の開始前段階として、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡの状態で混合しても良く、あるいは、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合した後に混合しても良く、メチル化感受性制限酵素で処理する前に、当該メチル化感受性制限酵素が認識しうる塩基配列に結合して二本鎖状態を形成していれば良い。
【００３８】
本発明測定方法の第二工程において、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で、選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する。
【００３９】
当該メチル化感受性制限酵素の、マスキング用オリゴヌクレオチドを結合させた状態での消化の有無を調べる方法としては、具体的には例えば、前記の一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含むＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することができる。
因みに、第二工程では、選択された一本鎖ＤＮＡにマスキング用オリゴヌクレオチドが添加されているので、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した目的とするＤＮＡ領域は二本鎖状態になっている。この二本鎖において、負鎖側はマスキング用オリゴヌクレオチドであり、本マスキング用オリゴヌクレオチドに含まれるシトシンはメチル化されていない。一方、正鎖側は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡであり、このゲノムＤＮＡに含まれるシトシンが元々メチル化されていたか、それともメチル化されていなかったかにより、上記二本鎖ＤＮＡの状態がアンメチル状態であるか否かが決まる。即ち、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はヘミメチル状態（アンメチル状態ではない状態。負鎖：メチル化されていない状態、正鎖：メチル化されている状態）であり、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていなければ、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はアンメチル状態（負鎖：メチル化されていない状態、正鎖：メチル化されていない状態）である。従って、前記のメチル化感受性制限酵素がヘミメチル状態である二本鎖ＤＮＡを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はアンメチル状態であり、当該メチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はヘミメチル状態であり、当該メチル化感受性制限酵素により切断されない。したがって、目的とするＤＮＡ領域内のメチル化感受性制限酵素の認識配列にマスキング用オリゴヌクレオチドを結合させてから消化処理を実施して、前記の目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたＰＣＲを実施すると、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、ＰＣＲによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、ＰＣＲによる増幅産物が得られることになる。
メチル化感受性制限酵素としては、具体的に例えば、HpaII、又はHhaIがあり、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加することで、このような酵素を利用することにより、一本鎖ＤＮＡのメチル化の有無を判別することができる。即ち、上記の操作で得られたＤＮＡの一本鎖部分の、HpaII、又はHhaIの認識部位に含まれるＣｐＧのシトシンがメチル化されていたならば、HpaII、又はHhaIは、このＤＮＡを消化することができず、メチル化されていなければ、HpaII、又はHhaIは、このＤＮＡを消化する。従って、上記反応を実施後、目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施すると、検体中のＤＮＡがアンメチル化状態であれば増幅産物は得られず、検体中のＤＮＡがメチル化状態であれば増幅産物が得られることになる。
【００４０】
本発明測定方法の第二工程は、マスキング用オリゴヌクレオチドと当該マスキング用オリゴヌクレオチドで保護されるメチル化感受性制限酵素の認識配列を消化できるメチル化感受性制限酵素を、少なくとも１種類以上添加し、３７℃で１時間〜１晩インキュベーションすることにより消化処理を行う。具体的には例えば、以下のように実施すればよい。第一工程で選択した一本鎖ＤＮＡに、最適な緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を3μL、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素HhaI（10U/μL）を1.5μL加え、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列に対するマスキング用オリゴヌクレオチドを夫々約10pmol加え、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜１晩インキュベーションすればよい。これにより、目的とするＤＮＡ領域内のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位（箇所）がメチル化されていなかった場合、当該箇所は消化されることになる。
【００４１】
このように１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物（前記制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）する。
【００４２】
尚、本発明測定方法の第二工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない（所謂「ＤＮＡの切れ残し」）虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするＤＮＡ領域としては、メチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも１つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられる。また、ここでマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されるメチル化感受性制限酵素の認識部位も多ければ多いほど良いと考えられる。
従って、本発明測定方法の第二工程において複数のメチル化感受性制限酵素による処理を実施する場合には、具体的には例えば、以下のように行えばよい。第一工程において選択された一本鎖ＤＮＡに、最適な緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を3μL、メチル化感受性制限酵素HpaII及びHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL加え、数種の前記メチル化感受性制限酵素の認識配列に対するマスキング用オリゴヌクレオチドを夫々約10pmol加え、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜1晩インキュベーションする。目的とするＤＮＡ領域内のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位（箇所）がメチル化されていなかった場合、当該箇所は消化されることになる。その後、前記と同様な操作に準じて、ピペッティング又はデカンテーションにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
【００４３】
尚、本発明測定方法において、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。ここで、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を本固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、短い鋳型ＤＮＡの方がより選択され易く、また、ＰＣＲで目的領域を増幅する場合にも、鋳型ＤＮＡが短い方がよいと考えられるので、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
また、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。当該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムＤＮＡ自体の場合には前記の方法と同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には前記の方法と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのＤＮＡ量に対して500倍量（10U）又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。
ゲノムＤＮＡは、基本的には二本鎖ＤＮＡとして存在していると考えられる。したがって、本操作においては、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加せず、一般的な方法で消化処理を実施すればよい。
例えば、血液等に含まれる遊離ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡの可能性があり、また、一部のウイルス粒子に含まれるＤＮＡは一本鎖である。このような場合において、二本鎖ＤＮＡのみを消化するような制限酵素を用いて消化処理する場合には、当該制限酵素の認識配列を含むマスキング用ヌクレオチドを用いることもできる。
【００４４】
本発明測定方法の第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して遊離の一本鎖状態のＤＮＡにする工程（第三（前Ａ）工程）と、
第三（前Ａ）工程で遊離の一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）と、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第三（前Ｂ）工程）と、
第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三（前Ｃ）工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ａと、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００４５】
本発明測定方法の第三工程では、まず、下記の各本工程の前工程のうち第三（前Ａ）工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を固定化メチル化ＤＮＡ抗体から一旦分離して一本鎖状態であるＤＮＡにする。具体的には例えば、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）に、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を得る。その後、第三（前Ｂ）工程では、具体的には例えば、第三（前Ａ）工程で得られた一本鎖状態のＤＮＡ（正鎖）とフォワードプライマーを、滅菌超純水を17.85μL、最適な緩衝液（例えば、100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとした溶液中で混合し、37℃で約2時間インキュベーションし、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる。第三（前Ｃ）工程においては、具体的には例えば、第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより混合物を得て、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡに一旦分離する。
その後、本工程として、
(i) 生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）に、前記のフォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォワード用プライマーのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。
(iii)上記(i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる（即ち、第三工程−Ａ）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定方法の第三（前Ｂ）工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３'末端よりさらに３'末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする（即ち、第三工程−Ｂ）。具体的には例えば、上記(iii)の第三工程−Ａと同様に、第三（前Ｂ）工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと（例えば、第三工程−Ａ及び第三工程−Ｂ）により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００４６】
第三工程は、具体的には、第三（前Ａ）工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一つのＰＣＲ反応として実施することもできる。また、第三（前Ａ）工程から第三（前Ｃ）工程まで、各々、独立した反応として実施し、本工程のみをＰＣＲ反応として実施することもできる。
【００４７】
メチル化感受性制限酵素による、マスキング用オリゴヌクレオチドとして結合させた状態での消化処理の後に目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）を増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲを用いることができる。目的領域を増幅する際に、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。ＰＣＲ反応液としては、例えば、本発明測定方法の第二工程で得たＤＮＡに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq Gold (耐熱性DNAポリメラーゼの一種： 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。
目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、蛍光標識体の量の測定によりＰＣＲ反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。当該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
【００４８】
他に、第二工程の態様としては、メチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する等を挙げることができる。目的とするＤＮＡ領域にメチル化感受性制限酵素で切断される塩基配列が無い場合には、第二工程を実施せずに第三工程を実施しても構わない。
【００４９】
他に第一（Ａ）工程において、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際の好ましい態様としては、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。カウンターオリゴヌクレオチドとは、目的とするＤＮＡ領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。通常１０〜１００塩基、より好ましくは、２０〜５０塩基の長さに設計したものであればよい。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、フォーワード用プライマーあるいはリバース用プライマーが目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに比し、大過剰で添加され、目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）にした後、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる際に、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖（負鎖）と目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）が相補性により再結合することを妨げるために添加する。目的とするＤＮＡ領域にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、ＤＮＡのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、目的領域が一本鎖である方がメチル化ＤＮＡ抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比べて、少なくとも１０倍、通常は１００倍以上の量が添加されることが望ましい。
【００５０】
「メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する」とは、具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために、生物由来生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させればよい。例えば、前記ＤＮＡ試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドを、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合して、９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温し、次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻せばよい。
【００５１】
本発明測定方法は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量はほぼ０に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて低メチル化状態（hypomethylation）で、且つ、疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて高メチル化状態（hypermethylation）であるＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は、０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
【００５２】
このような本発明測定方法における、目的領域のメチル化されたＤＮＡ量の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
実施例１
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/50μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００５５】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計９本）に、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置することによりＰＣＲチューブに固定化した。次いで、当該ＰＣＲチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記ＰＣＲチューブ内に１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した。その後、当該ＰＣＲチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。
【００５６】
配列番号１７で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-Ｍ(７)、配列番号１８で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）及び配列番号１９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-ＵＭを別々合成して、夫々につき０．０１ｐｍｏｌ/５０μＬ ＴＥバッファー溶液（以下、オリゴヌクレオチド溶液と記す。）を調製した。
【００５７】
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Nは5-メチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：
5'- gttggccactgcggagtcgngcngggtggcnggccgcacctacagngccgngngngcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号１７）
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)：
5'- gttggccactgcggagtcgcgccgggtggcnggccgcacctacagngccgngngngcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号１８）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
5'- gttggccactgcggagtcgcgccgggtggccggccgcacctacagcgccgcgcgcgcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号１９）
【００５８】
得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した（各溶液について３本ずつ調製）。
【００５９】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製されたオリゴヌクレオチド溶液５０μLを加え、室温で１時間放置した。次いで、当該チューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記のＰＣＲチューブ内に１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した。その後、当該ＰＣＲチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【００６０】
このようにして得られたサンプルにＡ処理、Ｂ処理又はＣ処理を施した（各１本ずつ調製）。
【００６１】
Ａ処理群（無処理群）：前記で調製されたサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）１０μＬとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとした。
【００６２】
Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製されたサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）１０μＬと、ＨｐａＩＩ１０Ｕとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとした。
【００６３】
Ｃ群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）１０μＬと、ＨｐａＩＩを１０Ｕと、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡ（マスキング用オリゴヌクレオチド）５ｐｍｏｌとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとした。
【００６４】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5'- gccacccggcgcga -3'（配列番号２０）
【００６５】
各々の反応液を３７℃で１晩インキュベーションした。次いで、ＰＣＲチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記のＰＣＲチューブ内に１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した。その後、当該ＰＣＲチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【００６６】
次に、このようにして得られたＰＣＲチューブに、配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液（ＰＦ２及びＰＲ２）及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域（ＧＰＲ７-２０７９-２１７６、配列番号２３、メチル化シトシンもCで表す）におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００６７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF2：5'-gttggccactgcggagtcg-3'（配列番号２１）
PR2：5'-gcacgacgagtgtgacgatc-3'（配列番号２２）
【００６８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
GPR7-2079-2176：5'- gttggccactgcggagtcgcgccgggtggccggccgcacctacagcgccgcgcgcgcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号２３）
【００６９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、３μＭに調製された配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各５μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰ５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μL０．２５μLと、５Ｎベタイン水溶液１０μＬとを混合した後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供することによりＤＮＡの増幅を確認した。その結果を図１に示した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
Ａ処理群（無処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）と、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）とでは、ＤＮＡの増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、ＤＮＡの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）の場合も、Ａ処理群と同様の結果であった。Ｃ処理群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）では、ＤＮＡの増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られたが、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、ＤＮＡの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００７０】
実施例２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００７１】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００７２】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２４及び配列番号２５で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号２６、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
【００７３】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' （配列番号２４）
ＰＲ１：5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' （配列番号２５）
【００７４】
＜DNAフラグメント＞
Ｘ：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3'（配列番号２６）
【００７５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
【００７６】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこれらの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＸ、配列番号２７）を得た。
【００７７】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＸ：5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG-3'（配列番号２７）
【００７８】
得られたＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/10μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/10μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００７９】
得られたＤＮＡフラグメントＭＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００８０】
また、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域の負鎖に相補性により結合可能な配列番号２９〜配列番号４０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１２を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【００８１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' （配列番号２８）
【００８２】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' （配列番号２９）
Ｃ２：5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' （配列番号３０）
Ｃ３：5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' （配列番号３１）
Ｃ４：5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' （配列番号３２）
Ｃ５：5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' （配列番号３３）
Ｃ６：5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' （配列番号３４）
Ｃ７：5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' （配列番号３５）
Ｃ８：5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' （配列番号３６）
Ｃ９：5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' （配列番号３７）
Ｃ１０：5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' （配列番号３８）
Ｃ１１：5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' （配列番号３９）
Ｃ１２：5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' （配列番号４０）
【００８３】
前記のＤＮＡフラグメントＸの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＸの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【００８４】
ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【００８５】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【００８６】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’に存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号４１で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ１を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００８７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' （配列番号２８）
【００８８】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
M１：5'- TGCACCGGACGC -3' （配列番号４１）
【００８９】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【００９０】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２４及び配列番号２５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ１及びＰＲ１の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００９１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF１：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' （配列番号２４）
PR１：5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' （配列番号２５）
【００９２】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' （配列番号２８）
【００９３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【００９４】
その結果を図２に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００９５】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【００９６】
実施例３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００９７】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００９８】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号４２及び配列番号４３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号４４、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
【００９９】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' （配列番号４２）
PR２：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' （配列番号４３）
【０１００】
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４４）
【０１０１】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
【０１０２】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＹ、配列番号４５）を得た。
【０１０３】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＹ：5'- GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3'（配列番号４５）
【０１０４】
得られたＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/10μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/10μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０５】
得られたＤＮＡフラグメントＭＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０６】
また、配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号４７、塩基配列２５及び配列番号４９で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１３、Ｃ１４、及びＣ１５を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１０７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４６）
【０１０８】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１３：5'- GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' （配列番号４７）
Ｃ１４：5'- CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3' （配列番号４８）
Ｃ１５：5'- CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3' （配列番号４９）
【０１０９】
前記のＤＮＡフラグメントＹの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＹの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１１０】
ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【０１１１】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【０１１２】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’に存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号５０で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ２を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【０１１３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４６）
【０１１４】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ２：5'- GTCGCCGGCTCC -3' （配列番号５０）
【０１１５】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１１６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４２及び配列番号４３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１１７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' （配列番号４２）
PR２：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' （配列番号４３）
【０１１８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４６）
【０１１９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６０℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１２０】
その結果を図３に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１２１】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１２２】
実施例４
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１２３】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１２４】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14mM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号５１及び配列番号２９で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｚ、配列番号５３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
【０１２５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５１）
PR３：5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' （配列番号５２）
【０１２６】
＜DNAフラグメント＞
Ｚ：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５３）
【０１２７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＺを精製した。
【０１２８】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＺ、配列番号５４）を得た。
【０１２９】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＺ：5'- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５４）
【０１３０】
得られたＤＮＡフラグメントＺについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10pg/10μL TE溶液
溶液Ｂ：1pg/10μL TE溶液
溶液Ｃ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１３１】
得られたＤＮＡフラグメントＭＺについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10pg/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：1pg/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１３２】
また、配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｚ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、及び配列番号５９で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、及びＣ１９を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１３３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１３４】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' （配列番号５６）
Ｃ１７：5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' （配列番号５７）
Ｃ１８：5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' （配列番号５８）
Ｃ１９：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５９）
【０１３５】
前記のＤＮＡフラグメントＺの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＺの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１３６】
ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【０１３７】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【０１３８】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｚ’に存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号６０で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ３を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【０１３９】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１４０】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ３：5'- TCGTCCGGGCGG -3' （配列番号６０）
【０１４１】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１４２】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号５１及び配列番号５２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ３及びＰＲ３の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１４３】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５１）
PR３：5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' （配列番号５２）
【０１４４】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１４５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２８サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１４６】
その結果を図４に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液ＭＡ及びＭＢでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＣでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液Ａ、Ｂ及びＣでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１４７】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１４８】
実施例５
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１４９】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１５０】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14mM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１５１】
得られたゲノムＤＮＡの一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を３回繰り返し、メチル化ゲノムＤＮＡを得た。
【０１５２】
得られたゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/5μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/5μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１５３】
得られたメチル化ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10ng/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１５４】
前記に調製したゲノムＤＮＡ溶液及びメチル化ゲノムＤＮＡ溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１５５】
ＰＣＲチューブに、上記に調製した溶液５μLと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）２μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１５６】
配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域（Ｓ、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、及びＣ２３を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１５７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'（配列番号６１）
【０１５８】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' （配列番号５６）
Ｃ１７：5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' （配列番号５７）
Ｃ１８：5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' （配列番号５８）
Ｃ１９：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５９）
Ｃ２０：5'- AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3' （配列番号６２）
Ｃ２１：5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' （配列番号６３）
Ｃ２２：5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' （配列番号６４）
Ｃ２３：5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' （配列番号６５）
【０１５９】
前記のゲノムＤＮＡ及びメチル化ゲノムＤＮＡの反応液夫々について、以下の処理を施した。
【０１６０】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液２０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【０１６１】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【０１６２】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓに存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号６０で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ３を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【０１６３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'（配列番号６１）
【０１６４】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ３：5'- TCGTCCGGGCGG -3' （配列番号６０）
【０１６５】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１６６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号５１及び配列番号５２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ３及びＰＲ３の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓの部分配列である配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｚ'におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１６７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５１）
PR３：5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' （配列番号５２）
【０１６８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'（配列番号６１）
【０１６９】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１７０】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３１サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１７１】
その結果を図５に示した。メチル化ゲノムＤＮＡの溶液ＭＡ、ＭＢ、及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１７２】
以上より、固定化されたメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、また、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加・混合した後メチル化感受性制限酵素で処理することにより、マスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素認識部位がメチル化されていない目的とするＤＮＡ領域を消化できること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できること等が確認された。
また、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、実施例１において、調製されたサンプルから配列番号２３で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、での結果を示している。
【図２】図２は、実施例２において、調製されたサンプルから配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１７５】
【図３】図３は、実施例３において、調製されたサンプルから配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１７６】
【図４】図４は、実施例４において、調製されたサンプルから配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液「ＭＣ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液「Ｃ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【図５】図５は、実施例５において、調製されたサンプルから配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ｃ」、メチル化されたゲノムＤＮＡの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ｂ」、メチル化ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【配列表フリーテキスト】
【０１７７】
配列番号１７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１９
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２０
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２４
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２７
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号２８
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４１
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号４２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号４５
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号４６
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号４７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５０
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号５１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５３
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号５４
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号５５
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号５６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６０
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号６１
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号６２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるＤＮＡのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法が存在している（例えば、非特許文献１及び２参照）。
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ支持体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて当該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて当該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
【０００３】
【非特許文献１】Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.
【非特許文献２】Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のいずれの方法とも、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要し、さらに、ＰＣＲが増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記のプライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、しかもその操作は極めて繁雑である。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と前記マスキング用オリゴヌクレオチドとから分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第三（前Ａ）工程）と、
第三（前Ａ）工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第三（前Ｂ）工程）と、
第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三（前Ｃ）工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ａと、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
２．前項１記載の第三工程のメチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である、前項１記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法
３．生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項１〜２のいずれかの前項記載の方法；
４．生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項１〜２のいずれかの前項記載の方法；
５．生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項１〜２のいずれかの前項記載の方法；
６．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜５のいずれかの前項記載の方法；
７．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜６のいずれかの前項記載の方法；
８．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜７のいずれかの前項記載の方法；
９．少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１０．少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII、又はHhaIであることを特徴とする前項１〜９のいずれかの前項記載の方法；
１．第二工程においてメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する請求項１〜１０のいずれかの請求項記載の方法。
２２． 第一工程が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で分離された一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させる第一（Ｂ）工程と、からなり、
第一（Ａ）工程でメチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する前項１〜１１のいずれか一項に記載の方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡをあげることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料もあげられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
【０００８】
本発明における「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する塩基は４種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。
本発明における「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
【０００９】
本発明における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）は、当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいＤＮＡ領域であって、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有するものであり、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡの領域等を挙げることができる。
【００１０】
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号２で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号３で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号４で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号５で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号５で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号６で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号６で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号７で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号７で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列があげられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号８で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号８で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号８で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号９で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号９で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号１０で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１０で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２０】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号１１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号１２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１２で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号１３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１３で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号１４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１４で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号１５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１５で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号１６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１６で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２６】
本発明測定方法における「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本特許記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、あるいは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本特許ではメチル化ＤＮＡ、あるいはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。あるいは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下あるいは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。なお、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内あるいは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法などがあげられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などがあげられる。
【００２７】
一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明測定方法における「メチル化された一本鎖ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されている一本鎖ＤＮＡを意味しており、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧの全てがメチル化されている一本鎖ＤＮＡに限った意味ではない。
【００２８】
本発明における「（目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、）増幅されたＤＮＡの量」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量そのもの、即ち、本発明測定方法の第三工程で求めた量を意味するものである。例えば、生物由来検体が１ｍＬの血清であった場合には、血清１ｍＬ中に含まれる前記のメチル化されたＤＮＡに基づいて増幅されたＤＮＡの量を意味する。
【００２９】
本発明測定方法における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させても、当該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させれば、当該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のＣｐＧ対を含む二本鎖ＤＮＡ（即ち、前記ＣｐＧ対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖ＤＮＡ）を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515）。また、例えば、一本鎖ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素、即ち、メチル化感受性制限酵素の中には、一本鎖ＤＮＡを消化するものもある。例えば、HhaI等を挙げることができる。
【００３０】
本発明における「マスキング用オリゴヌクレオチド」とは、メチル化感受性制限酵素を認識する塩基配列をその一部として有するオリゴヌクレオチドであり、一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも１箇所（全ての個所でも良い）と相補的に結合し二本鎖を形成し（即ち、前記箇所を二本鎖状態にして）、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、また、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖ＤＮＡも消化でき、その消化効率は、二本鎖ＤＮＡに対する方が一本鎖ＤＮＡに対するよりも高い。）での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドを意味する。また、本オリゴヌクレオチドは、後述のフォワード用プライマーまたはリバース用プライマーを伸長プライマーとして、当該マスキング用オリゴヌクレオチドを鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。なお、塩基長としては、８〜２００塩基長が望ましい。
ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、１種類でもよく複数種類でも良い。複数種類を用いると、目的とする領域のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、メチル化感受性制限酵素での、後述の「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができる。マスキング用オリゴヌクレオチドは、例えば、目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、必ずメチル化している場合は消化せずにメチル化していない場合は消化したい箇所（例えば、疾患患者検体では100%メチル化されており、健常者検体では100%メチル化されていない箇所等）について設計し使用すると特に有用である。
【００３１】
本発明における「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ」とは、前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないシトシンである一本鎖ＤＮＡを意味するものである。
【００３２】
「相補性によって結合（相補的な（塩基対合による）結合）」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとシトシン、グアニンとアデニンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的な結合」と呼ぶこともある。「相補的な結合」は、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性により結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作成されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンがシトシン、アデニン、チミンと水素結合の水素結合で結合することも意味する。
「目的とするＤＮＡ領域（に対して相補性である塩基配列）を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
【００３３】
本発明測定方法の第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する。また、第一工程は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する第一（Ａ）工程と、メチル化された一本鎖ＤＮＡを固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ｂ）工程からなる。
一本鎖ＤＮＡを取得するには、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離して取得してもよいし、元来検体中に含まれる一本鎖ＤＮＡをそのまま取得してもよい。尚、この二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離するには、通常の手法を用いて行うことができる。
【００３４】
本発明測定方法の第一（Ａ）工程において、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する」際、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにするための一般的は操作を行えばよい。具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を適当量の超純水に溶解し、95℃で10分間加熱し、氷中で急冷すればよい。
【００３５】
本発明測定方法の第一（Ｂ）工程における「固定化メチル化ＤＮＡ抗体」は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために用いられる。
本固定化メチル化ＤＮＡ抗体は、支持体に固定化され得るものであればよく、「支持体に固定化され得るもの」とは、メチル化ＤＮＡ抗体を支持体へ直接的、あるいは間接的に固定できることを意味する。
このように固定化されるためには、メチル化ＤＮＡ抗体を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従って、支持体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体をビオチン化して得られたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、メチル化ＤＮＡ抗体を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、あるいは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。なお、共有結合には、例えば、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる方法も挙げられる。
さらに、メチル化ＤＮＡ抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、メチル化ＤＮＡ抗体に対する抗体（二次抗体）を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
なお、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択する際に本固定化メチル化ＤＮＡ抗体が支持体に固定化されていればよく、（１）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化メチル化ＤＮＡ抗体との結合前の段階で、本固定化メチル化ＤＮＡ抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また（２）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化メチル化ＤＮＡ抗体との結合後の段階で、本固定化メチル化ＤＮＡ抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。
【００３６】
本発明測定方法の第一（Ｂ）工程において、「メチル化された一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する」際、具体的には例えば、固定化メチル化ＤＮＡ抗体として、「ビオチン標識されたビオチン化メチルシトシン抗体」を使用して、以下のように実施すればよい。
（ａ）ビオチン化メチルシトシン抗体を適当量（例えば、0.1μg/50μL）アビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンの固定化を促す。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をＰＣＲチューブ内に残す。
（ｂ）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡをバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithiothreitol）とを混合して、９５℃で数分間加熱する。その後、約０〜４℃の温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、一本鎖ＤＮＡを形成させる。その後、室温に戻す。
（ｃ）形成された前記一本鎖ＤＮＡを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体と、前記一本鎖ＤＮＡのうちメチル化された一本鎖ＤＮＡとの結合を促す（結合体の形成）（この段階で、少なくともメチル化されてないＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡは、結合体を形成しない。）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、結合体をＰＣＲチューブ内に残す（結合体の選択）。
（ｂ）において使用するバッファーとしては、生物試料由来のゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ分離するために適していれば良く、前記バッファーに限ったわけではない。
（ａ）及び（ｃ）における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていないメチル化ＤＮＡ抗体、メチル化ＤＮＡ抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ、または、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化ＤＮＡ抗体、溶液中に浮遊している一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
【００３７】
本発明測定方法の第二工程では、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡを基質とするメチル化感受性制限酵素により消化されるが、多くの二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素では消化されない。そこで、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡとメチル化感受性制限酵素を認識する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをマスキング用オリゴヌクレオチドとして混合することにより、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でもアンメチル状態のＣｐＧを有するメチル化感受性制限酵素の認識配列を消化できるようにし、また、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での前記箇所の消化効率を向上させることもできるようにした。
マスキング用オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡを一本鎖に分離する前で混合してもよく、または、第二工程の開始前段階として、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡの状態で混合しても良く、あるいは、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合した後に混合しても良く、メチル化感受性制限酵素で処理する前に、当該メチル化感受性制限酵素が認識しうる塩基配列に結合して二本鎖状態を形成していれば良い。
【００３８】
本発明測定方法の第二工程において、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で、選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する。
【００３９】
当該メチル化感受性制限酵素の、マスキング用オリゴヌクレオチドを結合させた状態での消化の有無を調べる方法としては、具体的には例えば、前記の一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含むＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することができる。
因みに、第二工程では、選択された一本鎖ＤＮＡにマスキング用オリゴヌクレオチドが添加されているので、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した目的とするＤＮＡ領域は二本鎖状態になっている。この二本鎖において、負鎖側はマスキング用オリゴヌクレオチドであり、本マスキング用オリゴヌクレオチドに含まれるシトシンはメチル化されていない。一方、正鎖側は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡであり、このゲノムＤＮＡに含まれるシトシンが元々メチル化されていたか、それともメチル化されていなかったかにより、上記二本鎖ＤＮＡの状態がアンメチル状態であるか否かが決まる。即ち、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はヘミメチル状態（アンメチル状態ではない状態。負鎖：メチル化されていない状態、正鎖：メチル化されている状態）であり、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていなければ、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はアンメチル状態（負鎖：メチル化されていない状態、正鎖：メチル化されていない状態）である。従って、前記のメチル化感受性制限酵素がヘミメチル状態である二本鎖ＤＮＡを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はアンメチル状態であり、当該メチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はヘミメチル状態であり、当該メチル化感受性制限酵素により切断されない。したがって、目的とするＤＮＡ領域内のメチル化感受性制限酵素の認識配列にマスキング用オリゴヌクレオチドを結合させてから消化処理を実施して、前記の目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたＰＣＲを実施すると、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、ＰＣＲによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドと結合した二本鎖ＤＮＡ部分の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、ＰＣＲによる増幅産物が得られることになる。
メチル化感受性制限酵素としては、具体的に例えば、HpaII、又はHhaIがあり、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加することで、このような酵素を利用することにより、一本鎖ＤＮＡのメチル化の有無を判別することができる。即ち、上記の操作で得られたＤＮＡの一本鎖部分の、HpaII、又はHhaIの認識部位に含まれるＣｐＧのシトシンがメチル化されていたならば、HpaII、又はHhaIは、このＤＮＡを消化することができず、メチル化されていなければ、HpaII、又はHhaIは、このＤＮＡを消化する。従って、上記反応を実施後、目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施すると、検体中のＤＮＡがアンメチル化状態であれば増幅産物は得られず、検体中のＤＮＡがメチル化状態であれば増幅産物が得られることになる。
【００４０】
本発明測定方法の第二工程は、マスキング用オリゴヌクレオチドと当該マスキング用オリゴヌクレオチドで保護されるメチル化感受性制限酵素の認識配列を消化できるメチル化感受性制限酵素を、少なくとも１種類以上添加し、３７℃で１時間〜１晩インキュベーションすることにより消化処理を行う。具体的には例えば、以下のように実施すればよい。第一工程で選択した一本鎖ＤＮＡに、最適な緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を3μL、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素HhaI（10U/μL）を1.5μL加え、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列に対するマスキング用オリゴヌクレオチドを夫々約10pmol加え、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜１晩インキュベーションすればよい。これにより、目的とするＤＮＡ領域内のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位（箇所）がメチル化されていなかった場合、当該箇所は消化されることになる。
【００４１】
このように１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物（前記制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）する。
【００４２】
尚、本発明測定方法の第二工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない（所謂「ＤＮＡの切れ残し」）虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするＤＮＡ領域としては、メチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも１つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられる。また、ここでマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されるメチル化感受性制限酵素の認識部位も多ければ多いほど良いと考えられる。
従って、本発明測定方法の第二工程において複数のメチル化感受性制限酵素による処理を実施する場合には、具体的には例えば、以下のように行えばよい。第一工程において選択された一本鎖ＤＮＡに、最適な緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を3μL、メチル化感受性制限酵素HpaII及びHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL加え、数種の前記メチル化感受性制限酵素の認識配列に対するマスキング用オリゴヌクレオチドを夫々約10pmol加え、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜1晩インキュベーションする。目的とするＤＮＡ領域内のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位（箇所）がメチル化されていなかった場合、当該箇所は消化されることになる。その後、前記と同様な操作に準じて、ピペッティング又はデカンテーションにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
【００４３】
尚、本発明測定方法において、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。ここで、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を本固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、短い鋳型ＤＮＡの方がより選択され易く、また、ＰＣＲで目的領域を増幅する場合にも、鋳型ＤＮＡが短い方がよいと考えられるので、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
また、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。当該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムＤＮＡ自体の場合には前記の方法と同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には前記の方法と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのＤＮＡ量に対して500倍量（10U）又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。
ゲノムＤＮＡは、基本的には二本鎖ＤＮＡとして存在していると考えられる。したがって、本操作においては、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加せず、一般的な方法で消化処理を実施すればよい。
例えば、血液等に含まれる遊離ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡの可能性があり、また、一部のウイルス粒子に含まれるＤＮＡは一本鎖である。このような場合において、二本鎖ＤＮＡのみを消化するような制限酵素を用いて消化処理する場合には、当該制限酵素の認識配列を含むマスキング用ヌクレオチドを用いることもできる。
【００４４】
本発明測定方法の第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して遊離の一本鎖状態のＤＮＡにする工程（第三（前Ａ）工程）と、
第三（前Ａ）工程で遊離の一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）と、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第三（前Ｂ）工程）と、
第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三（前Ｃ）工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ａと、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００４５】
本発明測定方法の第三工程では、まず、下記の各本工程の前工程のうち第三（前Ａ）工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を固定化メチル化ＤＮＡ抗体から一旦分離して一本鎖状態であるＤＮＡにする。具体的には例えば、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）に、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を得る。その後、第三（前Ｂ）工程では、具体的には例えば、第三（前Ａ）工程で得られた一本鎖状態のＤＮＡ（正鎖）とフォワードプライマーを、滅菌超純水を17.85μL、最適な緩衝液（例えば、100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとした溶液中で混合し、37℃で約2時間インキュベーションし、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる。第三（前Ｃ）工程においては、具体的には例えば、第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより混合物を得て、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡに一旦分離する。
その後、本工程として、
(i) 生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）に、前記のフォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォワード用プライマーのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。
(iii)上記(i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる（即ち、第三工程−Ａ）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定方法の第三（前Ｂ）工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３'末端よりさらに３'末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする（即ち、第三工程−Ｂ）。具体的には例えば、上記(iii)の第三工程−Ａと同様に、第三（前Ｂ）工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと（例えば、第三工程−Ａ及び第三工程−Ｂ）により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００４６】
第三工程は、具体的には、第三（前Ａ）工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一つのＰＣＲ反応として実施することもできる。また、第三（前Ａ）工程から第三（前Ｃ）工程まで、各々、独立した反応として実施し、本工程のみをＰＣＲ反応として実施することもできる。
【００４７】
メチル化感受性制限酵素による、マスキング用オリゴヌクレオチドとして結合させた状態での消化処理の後に目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）を増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲを用いることができる。目的領域を増幅する際に、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。ＰＣＲ反応液としては、例えば、本発明測定方法の第二工程で得たＤＮＡに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq Gold (耐熱性DNAポリメラーゼの一種： 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。
目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、蛍光標識体の量の測定によりＰＣＲ反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。当該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
【００４８】
他に、第二工程の態様としては、メチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する等を挙げることができる。目的とするＤＮＡ領域にメチル化感受性制限酵素で切断される塩基配列が無い場合には、第二工程を実施せずに第三工程を実施しても構わない。
【００４９】
他に第一（Ａ）工程において、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際の好ましい態様としては、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。カウンターオリゴヌクレオチドとは、目的とするＤＮＡ領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。通常１０〜１００塩基、より好ましくは、２０〜５０塩基の長さに設計したものであればよい。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、フォーワード用プライマーあるいはリバース用プライマーが目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに比し、大過剰で添加され、目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）にした後、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる際に、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖（負鎖）と目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）が相補性により再結合することを妨げるために添加する。目的とするＤＮＡ領域にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、ＤＮＡのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、目的領域が一本鎖である方がメチル化ＤＮＡ抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比べて、少なくとも１０倍、通常は１００倍以上の量が添加されることが望ましい。
【００５０】
「メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する」とは、具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために、生物由来生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させればよい。例えば、前記ＤＮＡ試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドを、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合して、９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温し、次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻せばよい。
【００５１】
本発明測定方法は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量はほぼ０に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて低メチル化状態（hypomethylation）で、且つ、疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて高メチル化状態（hypermethylation）であるＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は、０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
【００５２】
このような本発明測定方法における、目的領域のメチル化されたＤＮＡ量の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
実施例１
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/50μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００５５】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計９本）に、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置することによりＰＣＲチューブに固定化した。次いで、当該ＰＣＲチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記ＰＣＲチューブ内に１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した。その後、当該ＰＣＲチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。
【００５６】
配列番号１７で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-Ｍ(７)、配列番号１８で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）及び配列番号１９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-ＵＭを別々合成して、夫々につき０．０１ｐｍｏｌ/５０μＬ ＴＥバッファー溶液（以下、オリゴヌクレオチド溶液と記す。）を調製した。
【００５７】
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Nは5-メチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：
5'- gttggccactgcggagtcgngcngggtggcnggccgcacctacagngccgngngngcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号１７）
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)：
5'- gttggccactgcggagtcgcgccgggtggcnggccgcacctacagngccgngngngcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号１８）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
5'- gttggccactgcggagtcgcgccgggtggccggccgcacctacagcgccgcgcgcgcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号１９）
【００５８】
得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した（各溶液について３本ずつ調製）。
【００５９】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製されたオリゴヌクレオチド溶液５０μLを加え、室温で１時間放置した。次いで、当該チューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記のＰＣＲチューブ内に１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した。その後、当該ＰＣＲチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【００６０】
このようにして得られたサンプルにＡ処理、Ｂ処理又はＣ処理を施した（各１本ずつ調製）。
【００６１】
Ａ処理群（無処理群）：前記で調製されたサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）１０μＬとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとした。
【００６２】
Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製されたサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）１０μＬと、ＨｐａＩＩ１０Ｕとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとした。
【００６３】
Ｃ群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）１０μＬと、ＨｐａＩＩを１０Ｕと、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡ（マスキング用オリゴヌクレオチド）５ｐｍｏｌとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとした。
【００６４】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5'- gccacccggcgcga -3'（配列番号２０）
【００６５】
各々の反応液を３７℃で１晩インキュベーションした。次いで、ＰＣＲチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記のＰＣＲチューブ内に１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した。その後、当該ＰＣＲチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【００６６】
次に、このようにして得られたＰＣＲチューブに、配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液（ＰＦ２及びＰＲ２）及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域（ＧＰＲ７-２０７９-２１７６、配列番号２３、メチル化シトシンもCで表す）におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００６７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF2：5'-gttggccactgcggagtcg-3'（配列番号２１）
PR2：5'-gcacgacgagtgtgacgatc-3'（配列番号２２）
【００６８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
GPR7-2079-2176：5'- gttggccactgcggagtcgcgccgggtggccggccgcacctacagcgccgcgcgcgcggtgagcctggccgtgtgggggatcgtcacactcgtcgtgc -3'（配列番号２３）
【００６９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、３μＭに調製された配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各５μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰ５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μL０．２５μLと、５Ｎベタイン水溶液１０μＬとを混合した後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供することによりＤＮＡの増幅を確認した。その結果を図１に示した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
Ａ処理群（無処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）と、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）とでは、ＤＮＡの増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、ＤＮＡの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）の場合も、Ａ処理群と同様の結果であった。Ｃ処理群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）では、ＤＮＡの増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られたが、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、ＤＮＡの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００７０】
実施例２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００７１】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００７２】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２４及び配列番号２５で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号２６、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
【００７３】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' （配列番号２４）
ＰＲ１：5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' （配列番号２５）
【００７４】
＜DNAフラグメント＞
Ｘ：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3'（配列番号２６）
【００７５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
【００７６】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこれらの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＸ、配列番号２７）を得た。
【００７７】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＸ：5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG-3'（配列番号２７）
【００７８】
得られたＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/10μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/10μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００７９】
得られたＤＮＡフラグメントＭＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００８０】
また、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域の負鎖に相補性により結合可能な配列番号２９〜配列番号４０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１２を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【００８１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' （配列番号２８）
【００８２】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' （配列番号２９）
Ｃ２：5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' （配列番号３０）
Ｃ３：5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' （配列番号３１）
Ｃ４：5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' （配列番号３２）
Ｃ５：5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' （配列番号３３）
Ｃ６：5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' （配列番号３４）
Ｃ７：5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' （配列番号３５）
Ｃ８：5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' （配列番号３６）
Ｃ９：5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' （配列番号３７）
Ｃ１０：5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' （配列番号３８）
Ｃ１１：5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' （配列番号３９）
Ｃ１２：5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' （配列番号４０）
【００８３】
前記のＤＮＡフラグメントＸの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＸの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【００８４】
ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【００８５】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【００８６】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’に存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号４１で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ１を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００８７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' （配列番号２８）
【００８８】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
M１：5'- TGCACCGGACGC -3' （配列番号４１）
【００８９】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【００９０】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２４及び配列番号２５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ１及びＰＲ１の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００９１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF１：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' （配列番号２４）
PR１：5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' （配列番号２５）
【００９２】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’：5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' （配列番号２８）
【００９３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【００９４】
その結果を図２に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００９５】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【００９６】
実施例３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００９７】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００９８】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号４２及び配列番号４３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号４４、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
【００９９】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' （配列番号４２）
PR２：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' （配列番号４３）
【０１００】
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４４）
【０１０１】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
【０１０２】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＹ、配列番号４５）を得た。
【０１０３】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＹ：5'- GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3'（配列番号４５）
【０１０４】
得られたＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/10μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/10μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０５】
得られたＤＮＡフラグメントＭＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０６】
また、配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号４７、塩基配列２５及び配列番号４９で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１３、Ｃ１４、及びＣ１５を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１０７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４６）
【０１０８】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１３：5'- GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' （配列番号４７）
Ｃ１４：5'- CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3' （配列番号４８）
Ｃ１５：5'- CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3' （配列番号４９）
【０１０９】
前記のＤＮＡフラグメントＹの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＹの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１１０】
ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【０１１１】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【０１１２】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’に存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号５０で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ２を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【０１１３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４６）
【０１１４】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ２：5'- GTCGCCGGCTCC -3' （配列番号５０）
【０１１５】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１１６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４２及び配列番号４３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１１７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' （配列番号４２）
PR２：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' （配列番号４３）
【０１１８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’：5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'（配列番号４６）
【０１１９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６０℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１２０】
その結果を図３に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１２１】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１２２】
実施例４
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１２３】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１２４】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14mM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号５１及び配列番号２９で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｚ、配列番号５３、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
【０１２５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５１）
PR３：5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' （配列番号５２）
【０１２６】
＜DNAフラグメント＞
Ｚ：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５３）
【０１２７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＺを精製した。
【０１２８】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＺ、配列番号５４）を得た。
【０１２９】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＺ：5'- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５４）
【０１３０】
得られたＤＮＡフラグメントＺについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10pg/10μL TE溶液
溶液Ｂ：1pg/10μL TE溶液
溶液Ｃ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１３１】
得られたＤＮＡフラグメントＭＺについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10pg/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：1pg/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１３２】
また、配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｚ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、及び配列番号５９で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、及びＣ１９を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１３３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１３４】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' （配列番号５６）
Ｃ１７：5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' （配列番号５７）
Ｃ１８：5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' （配列番号５８）
Ｃ１９：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５９）
【０１３５】
前記のＤＮＡフラグメントＺの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＺの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１３６】
ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【０１３７】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【０１３８】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｚ’に存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号６０で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ３を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【０１３９】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１４０】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ３：5'- TCGTCCGGGCGG -3' （配列番号６０）
【０１４１】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１４２】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号５１及び配列番号５２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ３及びＰＲ３の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１４３】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５１）
PR３：5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' （配列番号５２）
【０１４４】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１４５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２８サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１４６】
その結果を図４に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液ＭＡ及びＭＢでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＣでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液Ａ、Ｂ及びＣでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１４７】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１４８】
実施例５
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１４９】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１５０】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14mM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１５１】
得られたゲノムＤＮＡの一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を３回繰り返し、メチル化ゲノムＤＮＡを得た。
【０１５２】
得られたゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/5μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/5μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１５３】
得られたメチル化ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10ng/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１５４】
前記に調製したゲノムＤＮＡ溶液及びメチル化ゲノムＤＮＡ溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１５５】
ＰＣＲチューブに、上記に調製した溶液５μLと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）２μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１５６】
配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域（Ｓ、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、及びＣ２３を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１５７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'（配列番号６１）
【０１５８】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' （配列番号５６）
Ｃ１７：5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' （配列番号５７）
Ｃ１８：5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' （配列番号５８）
Ｃ１９：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５９）
Ｃ２０：5'- AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3' （配列番号６２）
Ｃ２１：5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' （配列番号６３）
Ｃ２２：5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' （配列番号６４）
Ｃ２３：5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' （配列番号６５）
【０１５９】
前記のゲノムＤＮＡ及びメチル化ゲノムＤＮＡの反応液夫々について、以下の処理を施した。
【０１６０】
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液２０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一（Ａ）工程に相当する）。
【０１６１】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第一（Ｂ）工程に相当する）。
【０１６２】
前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕと、配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓに存在するメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ認識サイトに相補性により結合可能な配列番号６０で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ３を５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【０１６３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'（配列番号６１）
【０１６４】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ３：5'- TCGTCCGGGCGG -3' （配列番号６０）
【０１６５】
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーションした後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１６６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号５１及び配列番号５２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ３及びＰＲ３の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓの部分配列である配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｚ'におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１６７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' （配列番号５１）
PR３：5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' （配列番号５２）
【０１６８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'（配列番号６１）
【０１６９】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｚ’：5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'（配列番号５５）
【０１７０】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３１サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１７１】
その結果を図５に示した。メチル化ゲノムＤＮＡの溶液ＭＡ、ＭＢ、及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１７２】
以上より、固定化されたメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、また、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加・混合した後メチル化感受性制限酵素で処理することにより、マスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素認識部位がメチル化されていない目的とするＤＮＡ領域を消化できること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できること等が確認された。
また、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、実施例１において、調製されたサンプルから配列番号２３で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、での結果を示している。
【図２】図２は、実施例２において、調製されたサンプルから配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１７５】
【図３】図３は、実施例３において、調製されたサンプルから配列番号４６で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１７６】
【図４】図４は、実施例４において、調製されたサンプルから配列番号５５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液「ＭＣ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液「Ｃ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＺの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＺの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【図５】図５は、実施例５において、調製されたサンプルから配列番号６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ｃ」、メチル化されたゲノムＤＮＡの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ｂ」、メチル化ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないゲノムＤＮＡの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【配列表フリーテキスト】
【０１７７】
配列番号１７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１９
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２０
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２４
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２７
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号２８
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４１
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号４２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号４５
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号４６
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号４７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５０
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号５１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５３
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号５４
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号５５
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号５６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６０
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号６１
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号６２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と前記マスキング用オリゴヌクレオチドとから分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第三（前Ａ）工程）と、
第三（前Ａ）工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第三（前Ｂ）工程）と、
第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三（前Ｃ）工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ａと、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の第三工程のメチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である、請求項１記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法
【請求項３】
生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項４】
生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項５】
生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項６】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項７】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項８】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII、又はHhaIであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１１】
第二工程で一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する請求項１〜１０のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１２】
第一工程が、
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で分離された一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させる第一（Ｂ）工程と、からなり、
第一（Ａ）工程でメチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合し、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で選択された一本鎖ＤＮＡを消化処理する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドにより保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と前記マスキング用オリゴヌクレオチドとから分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第三（前Ａ）工程）と、
第三（前Ａ）工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第三（前Ｂ）工程）と、
第三（前Ｂ）工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三（前Ｃ）工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ａと、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第三工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の第三工程のメチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である、請求項１記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法
【請求項３】
生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項４】
生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項５】
生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項６】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項７】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項８】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII、又はHhaIであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１１】
第二工程で一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する請求項１〜１０のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１２】
第一工程が、
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で分離された一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させる第一（Ｂ）工程と、からなり、
第一（Ａ）工程でメチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２６３９６２（Ｐ２００８−２６３９６２Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７７９６９（Ｐ２００８−７７９６９）
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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