ＤＮＡワクチンのためのアジュバント
本発明は、乳癌の処置に有用なＤＮＡワクチンを提供する。通常、該ワクチンは、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターと、ＩＲＭ化合物とを含む。また本発明は、ＤＮＡワクチンの効力を増大することができるＤＮＡワクチンアジュバントも提供する。通常、該アジュバントはＴＬＲ８選択性アゴニストを含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
免疫系の特定の重要な側面を刺激することによって、そして特定の他の側面を抑制することによって作用する新しい薬剤化合物を発見するために、近年大きな努力がなされており、著しい成功が収められている（例えば、米国特許第６，０３９，９６９号および第６，２００，５９２号を参照）。本明細書中で免疫応答修飾物質（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ、ＩＲＭ）と呼ばれるこれらの化合物は、トール様受容体（ＴＬＲ）として知られる基本の免疫系メカニズムにより作用して、選択されるサイトカイン生合成を誘発すると思われる。これらは、様々な種類の疾患および状態を処置するために有用であり得る。例えば、特定のＩＲＭは、ウィルス性疾患（例えば、ヒトパピローマウィルス、肝炎、ヘルペス）、新形成（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線性角化症、メラノーマ）、およびＴH２媒介性疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎）を処置するために有用であり、またワクチンアジュバントとしても有用である（米国特許第６，０８３，５０５号および米国特許出願公開第２００４／００７６６３３号）。
【０００２】
ＩＲＭ化合物の多くは小さい有機分子のイミダゾキノリンアミン誘導体（例えば、米国特許第４，６８９，３３８号を参照）であるが、多数の他の化合物の種類も同様に知られており（例えば、米国特許第５，４４６，１５３号、第６，１９４，４２５号、および第６，１１０，９２９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００５／０７９１９５号パンフレットを参照）、さらに多くのものが今でもまだ開発されている。ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドなどの他のＩＲＭは、より高い分子量を有する（例えば米国特許第６，１９４，３８８号を参照）。
【０００３】
積極的な多様的療法にもかかわらず再発または進行することがとても多い乳癌における成果を改善するために、免疫療法などの新しい革新的な処置戦略が必要とされる。癌ワクチンは、現存する癌を処置する可能性、その再発を防止する可能性、あるいは両方の可能性を有する。さらに、乳癌ワクチンは、乳癌の非常に早期の形態である非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）が浸潤性癌に進行することを防止するための理想的な介入であり得る。
【０００４】
１つの処置戦略は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質を標的とするワクチンの投与を含む。このタンパク質は、ＤＣＩＳ腫瘍の５０％以上および浸潤性乳癌の３０％の細胞表面において異常に大量に見られる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は細胞の表面に見られ、これらの細胞を成長させるシグナルを受け取る。異常に高いレベルで存在する場合、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、細胞が成長シグナルに対してあまりにも攻撃的に応答するようにし、従って、制御不能に成長し、腫瘍性形質転換（すなわち、腫瘍成長）が起こる。
【０００５】
トラスツズマブ（ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））はＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対するモノクローナル抗体であり、ＨＥＲ−２／ｎｅｕにより促進される乳癌の処置のために承認されている。モノクローナル抗体は、腫瘍細胞表面のＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の少なくともいくつかと結合し、それにより、結合ＨＥＲ−２／ｎｅｕが成長シグナルを受け取るのを阻害すると考えられる。また抗体は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に結合すると、免疫系が腫瘍細胞を異常であると確認するのを助け、従って腫瘍細胞を免疫系の細胞による破壊および／または除去の標的にするのを助けることができる。
【０００６】
腫瘍抗原に対する遺伝子による免疫化は、癌の進行を妨害することができる免疫応答を誘発するためのもう１つの戦略である。遺伝子による免疫化は、腫瘍特異性抗原の少なくとも一部をコードするＤＮＡ発現ベクターにより被検者にワクチン接種することを含む。ワクチン接種を行えば、被検者の体内の細胞は発現ベクターを受け取り、ベクターにコードされた遺伝子を（例えば、腫瘍抗原）を発現する。発現ベクターからの腫瘍抗原の発現は、被検者の免疫系を促して、（ａ）腫瘍抗原に対する抗体、そしてそれにより腫瘍細胞に対する抗体、および／または（ｂ）抗原特異性の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｉｘｉｃ）Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を発生させることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
概要
特定のＩＲＭ化合物は、ＤＮＡワクチンのためのアジュバントとして有用であり得ることが分かっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ＩＲＭ化合物と、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを含むＤＮＡワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンは単一の製剤でもよいが、別の特定の実施形態では、発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は別々の製剤において提供されてもよい。
【０００９】
もう１つの態様では、本発明は、ＴＬＲ８選択性アゴニストを含むＤＮＡワクチンアジュバントと、アジュバントとしてＴＬＲ８選択性アゴニストを含むＤＮＡワクチンとを提供する。
【００１０】
もう１つの態様では、本発明は、被検者において乳癌を処置する方法を提供する。一般に、該方法は、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与することと、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を被検者に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、乳癌は、浸潤性乳癌または非浸潤性乳管癌を含み得る。
【００１１】
さらにもう１つの態様では、本発明は、乳癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用を提供し、該ＤＮＡワクチンは、ＩＲＭ化合物と、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを含む。
【００１２】
もう１つの態様では、本発明は、被検者において癌を処置する方法を提供する。一般に、該方法は、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与することと、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＴＬＲ８選択性アゴニストを被検者に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、肝細胞癌、子宮頸癌、結腸癌、メラノーマ、または肺癌を含み得る。
【００１３】
さらにもう１つの態様では、本発明は、癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用を提供し、該ＤＮＡワクチンは、ＴＬＲ８選択性アゴニストと、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを含む。
【００１４】
本発明の様々な他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲および添付図面を参照して、容易に明らかになるはずである。明細書中のいくつかの箇所では、実例の一覧によって案内が提供される。各場合において、引用される一覧は単に代表群としての役割を果たすだけであり、排他的な一覧として解釈されてはならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の例証的な実施態様の詳細な説明
特定のＩＲＭ化合物は、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドを標的とするＤＮＡワクチンのためのアジュバントとして有用であると確認されている。さらに、特定のＩＲＭ化合物は可能性のあるＤＮＡワクチンアジュバントとして提案されているが、これは、自然発生的な（すなわち、非形質移入の）腫瘍特異性抗原を標的とするＤＮＡワクチンのためのアジュバントとしてＩＲＭ化合物が有効であり得るという最初の証明である。
【００１６】
本発明の目的では、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
「アゴニスト」は、受容体（例えば、ＴＬＲ）と組み合わされて細胞の活性を誘発することができる化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドでもよい。あるいは、アゴニストは、例えば（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成することによって、あるいは（ｂ）別の方法で別の化合物の修飾をもたらし、他の化合物を受容体に直接結合させることによって、受容体と間接的に組み合わされてもよい。アゴニストは、特定のＴＬＲのアゴニスト（例えば、ＴＬＲ８アゴニスト）またはＴＬＲの特定の組み合わせ（例えば、ＴＬＲ７／８アゴニスト−ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のアゴニスト）と見なされ得る。
【００１７】
「抗原」は、免疫応答の標的であることができる任意の物質を指す。抗原は、例えば、被検生物体により生じる細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的でもよい。あるいは、抗原は、免疫細胞と接触される場合に細胞性免疫応答（例えば、免疫細胞の成熟、サイトカインの産生、抗体の産生など）の標的でもよい。
【００１８】
「抗原ペプチド」は、細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的であることが可能である、指示されるタンパク質に由来する任意の長さのペプチドを指す。例えば、「抗原性ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチド」は、細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的であることが可能である、ヒト、ラット、またはマウスのＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来するペプチドを指す。もう１つの例として、「抗原性マンマグロブリン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎ）−Ａ」ペプチドは、細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的であることが可能である、マンマグロブリン−Ａに由来するペプチドを指す。
【００１９】
「ＤＮＡワクチン」およびその変形は、抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を指し、被検者に直接導入されて、抗原ペプチドに対する被検者の免疫応答を誘発し得る。
「ＨＥＲ−２」、「ｎｅｕ」、および「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」は、ラットｎｅｕ癌原遺伝子およびそのヒト相同体、ＨＥＲ−２、またはそのマウス相同体、ｎｅｕによりコードされる１８５ｋＤタンパク質を交換可能に指す。
【００２０】
「ペプチド」は、配列の長さに関係なくアミノ酸残基の配列を指す。従って、「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸を有するアミノ酸配列を指し、全長タンパク質、そして場合によりポリタンパク質も含む。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、乳癌を処置するためのＤＮＡワクチンを提供する。一般に、該ワクチンは、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターと、ＩＲＭ化合物とを含む。
【００２２】
本明細書で使用される場合、状態を「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置する（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」とは、状態に関連する症候または臨床徴候を、ある程度、低減、進行の制限、回復、または解消することを指す。「処置」は、状態を処置することができる任意の物質、組成物、投与計画などを指し、治療的、予防的、または両方と説明することができる。「治療的」およびその変形は、状態に関連する１つまたは複数の現存の症候または臨床徴候を回復させる処置を指す。「予防的」およびその変形は、状態の症候または臨床徴候の発生および／または出現をある程度制限する処置を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチド」は、細胞マーカー、通常はペプチドまたは全長タンパク質を指し、すなわち、（ａ）正常細胞と腫瘍細胞の間で差次的に発現されることと、（ｂ）差次的発現が乳癌の発生を処置または防止するために利用され得ることの両方である。
【００２４】
正常細胞と腫瘍細胞との間の差次的発現は、通常、腫瘍細胞が正常細胞よりも大きい程度にマーカーを発現することを意味する。例えば、いくつかの臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドは腫瘍細胞によって発現され得るが、正常細胞では発現されない。このような抗原ペプチドは、腫瘍細胞によってのみ、すなわち特異的に発現されるので、腫瘍特異性抗原ペプチドと考えることができる。しかしながら、他の場合には、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドは正常細胞によって自然に発現され得るが、腫瘍細胞によって過剰発現、すなわち通常のレベルよりも多く発現される。
【００２５】
発現ベクターは、限定されないが、裸のＤＮＡを含む任意の適切な形態を有し得る。あるいは、例えば、発現ベクターは、例えばシンドビドウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｄ ｖｉｒｕｓ）、セムリキ森林ウィルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウィルス（ＶＥＥ）に基づくようなアルファウィルス属ベクターなどの弱毒細菌またはウィルス由来のベクター内に、あるいはその一部としてパッケージされ得る。適切なアルファウィルス属ベクターには、例えば、例えば、ライトナー（Ｌｅｉｔｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３年）、第９巻、３３−３９頁、ドゥベンスキー（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６年）、第７０巻、５０８−５１９頁、およびパシュコ（Ｐｕｓｈｋｏ）ら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９７年）、第２３９巻、３８９−４０１頁に記載されるようなダブルプロモーターベクターおよびレプリコンベクターが含まれる。
【００２６】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターは既知である。例えば、ｐＣＭＶｎｅｕＮＴは、全長ラットｎｅｕタンパク質をコードする。しかしながら、特定の証拠によって、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの切断型をコードする発現ベクターは、全長ｎｅｕタンパク質をコードするベクターよりも、保護性の抗腫瘍免疫の誘発に有効であり得ることが暗示される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの切断型をコードする発現ベクターは、例えば、ｐＣＭＶ−ＥＣＤ（ｎｅｕ細胞外ドメインをコードする）、およびｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭ（ｎｅｕ細胞外および膜貫通ドメインをコードする）を含む。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの少なくとも一部をコードする発現ベクターは、例えば、Ｙ．チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８年）、第５８巻、１９６５−１９７１頁に記載されている。
【００２７】
マンマグロブリン−Ａは、乳腫瘍の８０％において発現されるもう１つの臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドである。マンマグロブリン−ＡのｃＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、マンマグロブリン−Ａ+腫瘍に対してＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を発生することができる。さらに、ワクチン接種されたマウスから、活発に成長するマンマグロブリン−Ａ+腫瘍を有する動物へのＣＤ８+ＣＴＬの移動は、著しい腫瘍の後退を引き起こした。特定のマンマグロブリン−Ａエピトープは、免疫化マウスおよび乳癌患者の両方からのＣＤ８+ＣＴＬによって認識された。マンマグロブリン−Ａの少なくとも一部をコードする発現ベクターは、例えば、Ｋ．ナラヤナン（Ｎａｒａｙａｎａｎ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（２００４年）、第９６巻、１３８８−１３９６頁）に記載されている。
【００２８】
ＭＵＣ１（多型上皮ムチン（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｕｃｉｎ）、すなわちＰＥＭ）は、もう１つの臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドである。ＭＵＣ１は、例えば、ほとんどの上皮癌などの多くの癌の腫瘍細胞によって発現される。ＭＵＣ１ムチンは正常な腺上皮の頂端細胞表面において発現され、例えば、乳癌などの特定の癌において過剰発現される高分子量（＞４００ｋＤ）の膜貫通糖タンパク質である。ＭＵＣ１コアペプチドを認識し、インビトロの腫瘍標的の溶解を媒介する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、乳癌、膵癌、および卵巣癌の患者から得られている。循環ＭＵＣ１免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）抗体は、乳癌、結腸癌、および膵癌の患者において見出されている。循環ＭＵＣ１免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、結腸直腸癌の患者において検出されている。ＭＵＣ１の少なくとも一部をコードする発現ベクターでワクチン接種されたマウスは、引き続いて行なわれるＭＵＣ１を発現する同系の腫瘍細胞による攻撃の後の腫瘍の発生から保護される。ＭＵＣ１の少なくとも一部をコードする特定の発現ベクターは、ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞による攻撃の後にインビボで特異的なＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答を発生することができる。ＭＵＣ１の少なくとも一部をコードする発現ベクターは、例えば、Ｔ．プランケット（Ｐｌｕｎｋｅｔｔ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００４年）、第１０９巻、６９１−６９７頁に記載されている。
【００２９】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする他の発現ベクターは、例えば、ＳＩＮＣＰ−βｇａｌ（カリフォルニア州エミリービルのカイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ））および特定のＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークのアルファバックス社（ＡｌｐｈａＶａｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ ｐａｒｋ，ＮＣ））を含む。
【００３０】
従って、１つの実施形態では、ワクチンは、（ａ）抗原性ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドをコードする発現ベクターと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。他の実施形態では、ワクチンは、（ａ）抗原性マンマグロブリン−Ａペプチドをコードする発現ベクターと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。もう１つの実施形態では、ワクチンは、（ａ）抗原性ＭＵＣ１ペプチドをコードする発現ベクターと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。もう１つの実施形態では、ワクチンは、ＳＩＮＣＰ−βｇａｌおよびＩＲＭ化合物を含む。さらにもう１つの実施形態では、ワクチンは、（ａ）乳癌関連抗原ペプチドをコードするＶＥＥレプリコンと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。
【００３１】
もう１つの態様では、本発明は、ＤＮＡワクチンにおいて使用するためのアジュバントと、結果として得られる該アジュバントを含むＤＮＡワクチンとを提供する。一般に、該アジュバントは、ＴＬＲ８選択性アゴニストであるＩＲＭ化合物を含む。従って、ＤＮＡワクチンは、一般に、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターと、ＴＬＲ８選択性アゴニストであるＩＲＭ化合物とを含む。
【００３２】
ＴＬＲ８選択性アゴニストによって提供されるアジュバント効果は、ワクチン依存性ではないかもしれない。すなわち、ＴＬＲ８選択性アゴニストは、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを含むＤＮＡワクチンのための効果的なアジュバントであり得る。従って、特定の臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドおよび該ペプチドをコードする発現ベクターの説明は単なる例であって、全ての適切な臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドおよび該ペプチドをコードする発現ベクターの網羅的な説明であることは意図されない。
【００３３】
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドは、乳癌関連抗原ペプチドである上記のものを含むが、例えばＭＵＣ１などのいくつかのものは、さらに乳癌以外の癌と関連し得る。
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）は、肝細胞癌（ＨＣＣ）に関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＨＣＣ、原発性の肝臓癌は、癌死亡の主要な原因である。アジアに特有の疾患は、Ｂ型肝炎感染の結果として肝硬変を患っている個人において顕著である。毎年およそ１２０万人の新たな症例が発生し、ほとんど全ての患者は診断の６ヶ月以内に死亡する。ＡＦＰの抗原性部分をコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、腫瘍の成長の遅延を経験した。このような発現ベクターは、例えば米国特許出願公開第２００３／０１４３２３７号に記載されている。
【００３４】
ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）オンコプロテインＥ６およびＥ７は、子宮頸癌に関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＨＰＶはほとんどの子宮頸癌に存在し、ＨＰＶオンコプロテインＥ６およびＥ７はＨＰＶ関連の癌細胞において一貫して発現され、その悪性形質転換の原因である。抗原性Ｅ７ペプチドをコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、Ｅ７特異性ＣＤ８+Ｔリンパ球免疫応答を発生することができる。抗原性Ｅ６ペプチドをコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、（ａ）Ｅ６特異性ＣＤ８+Ｔリンパ球免疫応答を発生することができ、そして（ｂ）Ｅ６を発現する腫瘍細胞株によるチャレンジ後の腫瘍の発生から保護され得る。Ｅ７の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、Ｗ．Ｆ．チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．（２００１年）、第１０８巻、６６９−６７８頁に記載されている。Ｅ６の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、ペン（Ｐｅｎｇ）ら（２００４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８．１６：８４６８−８４７６頁に記載されている。
【００３５】
チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）は、メラノーマに関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＴＲＰ−１は、メラノーマ細胞において高レベルで発現される腫瘍拒絶抗原である。ＴＲＰ−１の少なくとも一部をコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、メラノーマ細胞によるチャレンジ後の腫瘍の発生から保護された。ＴＲＰ−１の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、ライトナー（Ｌｅｉｔｎｅｒ）ら（２００３年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第９巻、第１号、３３−３９頁に記載されている。
【００３６】
血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ２）は、多くのタイプの腫瘍に関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＶＥＧＦ２の発現は、腫瘍脈管構造の血管新生の間に上方制御される。血管新生は、固形腫瘍の浸潤、成長、および転移において中心的な役割を果たす。従って、腫瘍脈管構造における増殖性内皮細胞（ＶＥＧＦ２を過剰発現するもの）に対する免疫応答は腫瘍血管の崩壊を発生させ、それにより、完全に発生する前に、癌を本質的に欠乏させることができる。ＶＥＧＦ２をコードする発現ベクターでワクチン接種されたマウスは、メラノーマまたは非小細胞肺癌細胞によりチャレンジされたときに腫瘍成長の阻害を経験し、自発性の肺転移（例えば、非小細胞肺癌）から保護され、結腸癌細胞による攻撃後に寿命の延長を有し、そして治療的なモデルでは、結腸癌細胞から生じる確定した転移の成長の減少を経験した。ＶＥＧＦ２の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、ニータマー（Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ）ら（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第８巻、第１２号、１３６９−１３７５頁に記載されている。
【００３７】
従って、いくつかの実施形態では、ワクチンは、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチド、すなわち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチド、マンマグロブリン−Ａペプチド、またはＭＵＣ１をコードする発現ベクターと、ＴＬＲ８選択性アゴニストとを含むことができる。他の実施形態では、ワクチンは、例えば、抗原性アルファフェトプロテインペプチド（ＨＣＣ関連）、抗原性ＴＲＰ−１ペプチド（メラノーマ関連）、抗原性ＶＥＧＦ２ペプチド（多腫瘍関連）、または抗原性Ｅ６またはＥ７ペプチド（子宮頸癌関連）などの臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターと、ＴＬＲ８選択性アゴニストと含むことができる。
【００３８】
上記のように、本発明に従うＤＮＡワクチンを被検者に投与すると、被検者に予防的および／または治療的な癌処置を提供することができる。しかしながら、もう１つの態様では、本発明は、予防的および／または治療的な癌処置を別の被検者に提供することができる癌処置用組成物の調製方法を提供する。一般に、該方法は、ＩＲＭ化合物と、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを被検者に投与することと、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの血清免疫応答を被検者に発生させることと、そして最後に、被検者の血清の少なくとも一部を採取することとを含む。被検者から採取された材料はさらに加工されて、採取した材料を特定の物質（例えば、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する抗体）について濃縮する、あるいは採取した材料を特定の物質（例えば、細胞、ＡＢＯ血液型抗体、Ｒｈ因子）について枯渇させることができる。
【００３９】
被検者から採取した材料の少なくとも一部（さらに加工されていてもいなくても）は、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに関連する癌の処置を必要としている第２の被検者、例えば、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに関連する癌を発生する危険性のある被検者、あるいは患っていると診断された被検者に投与され得る。したがって、本発明のＤＮＡワクチンの投与は、一次的な処置（すなわち、ＤＮＡワクチンが投与される被検者に対する）、または二次的な処置（例えば、ＤＮＡワクチンが投与された被検者から採取された血清を受け取る被検者に対する）のいずれかを提供することができる。
【００４０】
ＩＲＭ化合物は、抗ウィルス活性および抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫調節活性を有する化合物を含む。特定のＩＲＭは、サイトカインの産生および分泌を調節する。例えば、特定のＩＲＭ化合物は、例えば、Ｉ型インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１、および／またはＭＣＰ−１などのサイトカインの産生および分泌を誘発する。さらに、いくつかのＩＲＭ化合物は、ＩＬ−１およびＴＮＦを抑制するといわれている（米国特許第６，５１８，２６５号）。
【００４１】
例えば、米国特許第４，６８９，３３８号、第４，９２９，６２４号、第５，２６６，５７５号、第５，２６８，３７６号、第５，３４６，９０５号、第５，３５２，７８４号、第５，３８９，６４０号、第５，４４６，１５３号、第５，４８２，９３６号、第５，７５６，７４７号、第６，１１０，９２９号、第６，１９４，４２５号、第６，３３１，５３９号、第６，３７６，６６９号、第６，４５１，８１０号、第６，５２５，０６４号、第６，５４１，４８５号、第６，５４５，０１６号、第６，５４５，０１７号、第６，５７３，２７３号、第６，６５６，９３８号、第６，６６０，７３５号、第６，６６０，７４７号、第６，６６４，２６０号、第６，６６４，２６４号、第６，６６４，２６５号、第６，６６７，３１２号、第６，６７０，３７２号、第６，６７７，３４７号、第６，６７７，３４８号、第６，６７７，３４９号、第６，６８３，０８８号、第６，７５６，３８２号、第６，７９７，７１８号、および第６，８１８，６５０号、米国特許出願公開第２００４／００９１４９１号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１４７５４３号、および第２００４／０１７６３６７号、ならびに国際公開第ＷＯ２００５／１８５５１号、第ＷＯ２００５／１８５５６号、第ＷＯ２００５／２０９９９号、第ＷＯ２００５／０３２４８４号、第ＷＯ２００５／０４８９３３号、第ＷＯ２００５／０４８９４５号、第ＷＯ２００５／０５１３１７号、第ＷＯ２００５／０５１３２４号、第ＷＯ２００５／０６６１６９号、第ＷＯ２００５／０６６１７０号、第ＷＯ２００５／０６６１７２号、第ＷＯ２００５／０７６７８３号、および第ＷＯ２００５／０７９１９５号に記載されるもののように、特定のＩＲＭは、小さい有機分子（例えば、タンパク質、ペプチドなどの大きい生体分子とは対照的に約１０００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量）である。
【００４２】
小分子ＩＲＭのさらなる例には、特定のプリン誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号および第６，０２８，０７６号に記載されるものなど）、特定のイミダゾキノリンアミド誘導体（米国特許第６，０６９，１４９号に記載されるものなど）、特定のイミダゾピリジン誘導体（米国特許第６，５１８，２６５号に記載されるものなど）、特定のベンゾイミダゾール誘導体（米国特許第６，３８７，９３８号に記載されるものなど）、５員窒素含有複素環式環に縮合された４−アミノピリミジンの特定の誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号、第６，０２８，０７６号および第６，３２９，３８１号、ならびに国際公開第ＷＯ０２／０８９０５号パンフレットに記載されるアデニン誘導体など）、そして特定の３−β−Ｄ−リボフラノシルチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体（米国特許出願公開第２００３／０１９９４６１号に記載されるものなど）が含まれる。
【００４３】
他のＩＲＭには、オリゴヌクレオチド配列などの大きい生体分子が含まれる。いくつかのＩＲＭオリゴヌクレオチド配列は、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有し、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、第６，２０７，６４６号、第６，２３９，１１６号、第６，３３９，０６８号、および第６，４０６，７０５号に記載されている。いくつかのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，４２６，３３４号および第６，４７６，０００号に記載されるものなどの合成免疫調節構造モチーフを含むことができる。他のＩＲＭヌクレオチド配列はＣｐＧ配列が欠けており、例えば、国際公開第ＷＯ００／７５３０４号パンフレットに記載されている。
【００４４】
他のＩＲＭは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）などの生体分子を含み、例えば、米国特許第６，１１３，９１８号、第６，３０３，３４７号、第６，５２５，０２８号、および第６，６４９，１７２号に記載されている。
【００４５】
別途指示されない限り、化合物への言及は、異性体（例えば、ジアステレオマーまたはエナンチオマー）、塩、溶媒和物、多形体などを含む薬学的に許容可能な任意の形態の化合物を含むことができる。特に、化合物が光学活性であれば、化合物への言及は、化合物のエナンチオマーのそれぞれ、およびエナンチオマーのラセミ混合物を含むことができる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、少なくとも１つのＴＬＲのアゴニスト、好ましくはＴＬＲ６、ＴＬＲ７、またはＴＬＲ８のアゴニストであり得る。またＩＲＭは、いくつかの場合には、ＴＬＲ４またはＴＬＲ９のアゴニストでもよい。本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、小分子の免疫応答調節剤（例えば、約１０００ダルトン未満の分子量）であり得る。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、５員窒素含有複素環式環に縮合した２−アミノピリジン、または５員窒素含有複素環式環に縮合した４−アミノピリミジンを含み得る。
【００４８】
本発明における使用に適したＩＲＭ化合物は、５員窒素含有複素環式環に縮合した２−アミノピリジンを有する化合物を含む。例えば、このような化合物としては、例えばアミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−、または９−アリール、ヘテロアリール、アリールオキシまたはアリールアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、およびイミダゾキノリンジアミンなどの置換イミダゾキノリンアミンを含むがこれらに限定されないイミダゾキノリンアミンと、アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、オキシム置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、およびテトラヒドロイミダゾキノリンジアミンを含むがこれらに限定されないテトラヒドロイミダゾキノリンアミンと、アミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエーテル、およびチオエーテル置換イミダゾピリジンアミンを含むがこれらに限定されないイミダゾピリジンアミンと、１，２−架橋イミダゾキノリンアミンと、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミンと、イミダゾナフチリジンアミンと、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミンと、オキサゾロキノリンアミンと、チアゾロキノリンアミンと、オキサゾロピリジンアミンと、チアゾロピリジンアミンと、オキサゾロナフチリジンアミンと、チアゾロナフチリジンアミンと、ピラゾロピリジンアミンと、ピラゾロキノリンアミンと、テトラヒドロピラゾロキノリンアミンと、ピラゾロナフチリジンアミンと、テトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンと、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミン、またはテトラヒドロナフチリジンアミンに縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーとが挙げられる。
【００４９】
１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンまたは４−アミノ−α，α，２−トリメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールなどのイミダゾキノリンアミンでよい。
【００５０】
代替の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、チアゾロキノリンアミン、チアゾロピリジンアミン、またはチアゾロナフチリジンアミンでよい。１つの特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンでよい。もう１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、２−プロピル−７−（ピリジン−３−イル）−チアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンでよい。もう１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタノールでよい。さらにもう１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、Ｎ−［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタンスルホンアミドでよい。
【００５１】
特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、またはチアゾロナフチリジンアミンでよい。
【００５２】
特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、置換イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンでよい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、置換イミダゾキノリンアミンは、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−、または９−アリール、ヘテロアリール、アリールオキシまたはアリールアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、もしくはイミダゾキノリンジアミンを指す。本明細書で使用される場合、置換イミダゾキノリンアミンは、具体的には、そして明確に、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンおよび４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールを除外する。
【００５４】
また、適切なＩＲＭ化合物は、プリン誘導体、イミダゾキノリンアミド誘導体、ベンゾイミダゾール誘導体、アデニン誘導体、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、および上記のオリゴヌクレオチド配列も含むことができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、１つまたは複数のＴＬＲのアゴニストであると確認される化合物でもよい。例えば、ＩＲＭ化合物は、ＴＬＲ８のアゴニストでよい。特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、ＴＬＲ８選択性アゴニストでよい。本明細書で使用される場合、「ＴＬＲ８選択性アゴニスト」という用語は、ＴＬＲ８のアゴニストとして働くが、ＴＬＲ７のアゴニストとしては働かない化合物を指す。「ＴＬＲ７／８アゴニスト」は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のアゴニストとして働く化合物を指す。
【００５６】
ＴＬＲ８選択性アゴニストは、ＴＬＲ８と、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、またはＴＬＲ１０のうちの１つまたは複数とのアゴニストとして働くことができるが、ＴＬＲ７のアゴニストとしては働かない。したがって、「ＴＬＲ８選択性アゴニスト」は、ＴＬＲ８のためであって他のＴＬＲのためではないアゴニストとして働く化合物を指すことができるが、代替として、ＴＬＲ８と、例えばＴＬＲ４とのアゴニストとして働く化合物を指すこともできる。
【００５７】
特定の化合物のＴＬＲアゴニズムは、任意の適切な方法で評価することができる。例えば、試験化合物のＴＬＲアゴニズムを検出するために適したアッセイおよび組換え細胞株は、例えば、米国特許出願公開第２００４／００１４７７９号、第２００４／０１３２０７９号、第２００４／０１６２３０９号、第２００４／０１７１０８６号、第２００４／０１９１８３３号、および第２００４／０１９７８６５号において記載されている。
【００５８】
使用される特定のアッセイにかかわらず、化合物によるアッセイの実施が、少なくとも、特定のＴＬＲにより媒介される何らかの生物活性のしきい値の増大をもたらせば、化合物は特定のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ８）のアゴニストであると確認することができる。反対に、指定のＴＬＲにより媒介される生物活性を検出するように設計されたアッセイを実施するために使用されたときに、化合物が生物活性のしきい値の増大を誘発することができなければ、化合物は指定のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ７）のアゴニストとして働かないと確認することができる。別途指示されない限りは、生物活性の増大は、適切な制御の下で観察される生物活性に関して同じ生物活性の増大を指す。アッセイは、適切な制御と共に実施されてもそうでなくてもよい。経験と共に、当業者は特定のアッセイに十分に熟知する（例えば、特定のアッセイ条件下で、適切な制御において観察される値の範囲）ようになり、特定のアッセイにおいて化合物のＴＬＲアゴニズムを決定するために制御の実施が常に必要ではないかもしれない。
【００５９】
所与のアッセイにおいて特定の化合物が特定のＴＬＲのアゴニストであるかどうかを決定するためのＴＬＲ媒介の生物活性の正確なしきい値の増大は、アッセイの終点として観察される生物活性、アッセイの終点を測定または検出するために使用される方法、アッセイの信号対雑音比、アッセイの精度、両方のＴＬＲのための化合物のアゴニズムを決定するために同じアッセイが使用されているかどうかを含むがこれらに限定されない当該技術分野で既知の因子に従って変化し得る。従って、全ての可能なアッセイについて特定のＴＬＲのアゴニストまたは非アゴニストであると化合物を確認するために必要とされるＴＬＲ媒介の生物活性のしきい値増大を一般的に説明することは実用的ではない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して、適切なしきい値を容易に決定することができる。
【００６０】
発現可能なＴＬＲ構造遺伝子を形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を用いるアッセイは、化合物が細胞内に形質移入されたＴＬＲのアゴニストであると確認するために例えば約１μＭ〜約１０μＭの濃度で化合物が提供される場合、例えばＴＬＲ媒介の生物活性の少なくとも３倍の増大（例えば、ＮＦκＢ活性化）のしきい値を使用することができる。しかしながら、特定の状況では、異なるしきい値および／または異なる濃度範囲が適切なこともある。また、異なるアッセイのためには異なるしきい値が適切であり得る。
【００６１】
ＩＲＭ化合物および発現ベクターはそれぞれ、被検者への投与に適切な任意の製剤において提供することができる。製剤の適切なタイプな、例えば、米国特許第５，２３８，９４４号、第５，９３９，０９０号、第６，２４５，７７６号、欧州特許第ＥＰ０３９４０２６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１９９５３８号明細書および第２００４／００７６６３３号において記載されている。適切な製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、または任意の形態の混合物を含むことができるが、これらに限定されない。適切な製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリヤ、または媒体を含むことができる。発現ベクターを送達するために適切な製剤は、裸のＤＮＡとしても発現ベクターを含むことができる。あるいは、発現ベクターは、例えばウィルス由来レプリコンまたは弱毒細菌内に、またはその一部としてパッケージされ得る。
【００６２】
ＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントＩＲＭ化合物を含有する製剤は、例えば、非腸管外または腸管外などの適切な方法で投与することができる。本明細書における使用では、非腸管外とは、経口摂取を含む消化管を通る投与を指す。腸管外は、例えば、静脈内、筋肉内、経皮的、皮下、経粘膜的（例えば、吸入によって）、または局所的などの消化管を通る以外の投与を指す。
【００６３】
発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は、単一の製剤において一緒に提供されてもよい。あるいは、発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は、異なる製剤において別々に提供されてもよい。別々の製剤で提供される場合、発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は、単一の部位または異なる部位で、同一または異なる経路により、そして同一または異なる時間に投与され得る。
【００６４】
ＩＲＭ化合物を含む製剤の組成は、ＩＲＭ化合物の物理的および化学的性質、キャリヤの性質、意図される投薬計画、被検者の免疫系の状態（例えば、抑制、不全、刺激）、ＩＲＭ化合物の投与方法、およびＤＮＡワクチンの効力を含むがこれらに限定されない当該技術分野において既知の因子に従って変化し得る。従って、全ての可能な用途に対してＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効な製剤の組成を一般的に示すことは実用的でない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して、適切な製剤を容易に決定することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、製剤は、例えば約０．０００１％〜約１０％（別途指示されない限り、本明細書において提供される全ての割合は、製剤全体に関して重量／重量である）のＩＲＭ化合物を含むことができるが、いくつかの実施形態では、製剤はこの範囲外の濃度のＩＲＭ化合物を含むことができる。特定の実施形態では、製剤は約０．０１％〜約５％のＩＲＭ化合物を含み、例えば、製剤は約０．１％〜約１．０％のＩＲＭ化合物を含む。
【００６６】
ＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効なＩＲＭ化合物の量は、ＤＮＡワクチンの効力を増大させるのに十分な量である。ＤＮＡワクチンの効力は、例えば、以下の：特定のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０）の誘発、ＤＮＡワクチンによりコードされる抗原に対する抗体の体液性の力価の増大、腫瘍の数またはサイズの減少、腫瘍の発生の遅延、被検者の期待寿命の延長、抗原特異性のＣＴＬの発生、および／または抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、特に例えばＤＣ−１細胞における同時刺激マーカー発現の上方制御のうちの１つまたは複数によって示すことができる。
【００６７】
ＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効なＩＲＭ化合物の正確な量は、ＩＲＭ化合物の物理的および化学的性質、キャリヤの性質、意図される投薬計画、被検者の免疫系の状態（例えば、抑制、不全、刺激）、ＩＲＭ化合物の投与方法、およびＤＮＡワクチンの効力を含むがこれらに限定されない当該技術分野において既知の因子に従って変化し得る。従って、全ての可能な用途に対してＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効な量のＩＲＭ化合物を構成する量を一般的に示すことは実用的でない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して適切な量を容易に決定することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量において提供され得るが、いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、この範囲外の用量で提供されてもよい。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ＩＲＭ化合物は、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量、例えば約０．６ｍｇ／ｋｇの用量で提供され得る。
【００６９】
投薬計画は、少なくとも部分的に、ＩＲＭ化合物の物理的および化学的性質、キャリヤの性質、投与されているＩＲＭの量、被検者の免疫系の状態（例えば、抑制、不全、刺激）、ＩＲＭ化合物の投与方法、ならびにＤＮＡワクチンの効力および送達方法を含むがこれらに限定されない当該技術分野で既知の多くの因子に依存し得る。従って、全ての可能な用途に対してＤＮＡワクチンの効力を増大させるために有効な投与計画を一般的に示すことは実用的でない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して、適切な投与計画を容易に決定することができる。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば１日１回〜約１回投与することができるが、いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、この範囲外の頻度で投与されてもよい。特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、一週間に約１回から１日あたり約１回までで投与され得る。１つの特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、３日ごとに１回投与される。
【００７１】
本発明の方法は、任意の適切な被検者において実施することができる。適切な被検者としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、または雌ウシなど（限定はされない）の動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００７２】
実施例
以下の実施例は、単に、本発明の特徴、利点、および他の詳細をさらに説明するために選択されている。しかしながら、実施例はこの目的を果たすが、使用される特定の材料および量、ならびに他の条件および詳細が、本発明の範囲を不当に限定し得る状況で解釈されてはならないことは明白に理解されるはずである。
【００７３】
ＩＲＭ化合物
実施例において使用されるＩＲＭ化合物は、表１に示される。
【００７４】
【表１】
【００７５】
実施例１ インビボの腫瘍成長
活性化ラットｎｅｕ遺伝子を含有するメスのＦＶＢ／Ｎマウス（カリフォルニア州ホリスターのチャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））を、標準的な明／暗療法（１２時間明：１２時間暗）の下で、特定の病原体がない状態に保持した。マウスをプラスチック製のメッキしていないケージ（１つのケージにつき４〜６匹のマウス）内に収容し、標準的なペレットフードおよび水道水を随意に与えた。
指示される最終濃度が得られるまでＩＲＭ化合物を０．２％のＤＭＳＯおよび水に溶解することによって、ＩＲＭ溶液を調製した。
【００７６】
ＣＭＶ真核生物プロモーターの制御下で細胞外および膜貫通ＨＥＲ−２／ｎｅｕ領域をコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭは記載されている（Ｙ．チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８年）、第５８巻、１９６５−１９７１頁）。プラズマ・ギガ（Ｐｌａｓｍａ Ｇｉｇａ）キット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用い、製造業者の使用説明書に従ってプラスミドＤＮＡの大量調製を実施した。
【００７７】
次のような：ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋ＩＲＭ１（ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭ１により処置）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋ＩＲＭ２（ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭ２により処置）、コントロール（免疫化なし、ＩＲＭによる処置なし）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭによる処置なし）、ＩＲＭ１（免疫化なし、ＩＲＭ１により処置）、およびＩＲＭ２（免疫化なし、ＩＲＭ２により処置）の処置グループ（ｎ＝１５）に動物を分けた。
【００７８】
ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭ ＤＮＡで免疫化した動物を、ヘリオス（ＨＥＬＩＯＳ）遺伝子銃システム（カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオ−ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用いて、粒子媒介の免疫療法的な送達によって８、１０、および１２週齢で免疫化した。それぞれのワクチン接種は２μｇのプラスミドＤＮＡ（２回の遺伝子銃ショット）を含み、製造業者の使用説明書に従って投与した。
【００７９】
ＩＲＭ化合物で処置した動物は、２００μＬの水中の０．６ｍｇ／ｋｇの化合物を腹腔内に受けた。これらのＩＲＭ化合物の受取りは、最初のＤＮＡ注射の２日前から開始して免疫化の期間中（８〜１２週齢）３日ごとに行われた。
【００８０】
ノギスにより２本の垂直な直径で腫瘍性の塊（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｍａｓｓ）を測定することによって、腫瘍の発生および成長を一週間に２回評価した。少なくとも３ｍｍの平均直径を有する腫瘍を発生していれば、マウスを腫瘍ありとして分類した。評価期間の最後に腫瘍の徴候のないマウスは、腫瘍なしと分類した。マウスあたりの触知可能な乳癌の平均数は、（発生腫瘍の累積数）／（マウスの総数）として計算した。
【００８１】
図１は、ワクチンだけで免疫化されたマウス、またはＩＲＭ１による処置と組み合わされたマウスにおいて、腫瘍なしのマウスの割合（上部）と、マウスあたりの触知可能な乳癌の平均数（下部）とを示す。
【００８２】
図２は、ワクチンだけで免疫化されたマウス、またはＩＲＭ２による処置と組み合わされたマウスにおいて、腫瘍なしのマウスの割合（上部）と、マウスあたりの触知可能な乳癌の平均数（下部）とを示す。
【００８３】
実施例２ 抗原特異性の細胞傷害アッセイ
実施例１に記載したように、動物を分類し、免疫化および／または処置した。Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、メリーランド州ゲイサーズバーグのギブコ（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））溶液中で６０ミクロンメッシュのふるいによって脾臓を収集して処置した。脾臓細胞をリンパ球Ｍ（カナダ国オンタリオ州ホーンビイのシダーレーン・ラボラトリーズ社（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）において分画し、密度勾配遠心分離（５００ｇ、２０分）によって単核細胞を分離した。勾配の界面からの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（メリーランド州ゲイサーズバーグのライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））中に再懸濁した。
【００８４】
刺激物質としてＮ２０２．１Ａ腫瘍細胞（ナンニ（Ｎａｎｎｉ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、第８７巻、１８６−１９４頁）（２０：１比の刺激物質：リンパ球）の存在下、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、メリーランド州ゲイサーズバーグのライフ・テクノロジーズ社）を含有するＲＰＭＩ媒体中で、脾細胞を３７℃および５％ＣＯ2で５日間インキュベートした。
【００８５】
カルボキシフルオレセインジアセテートの保存溶液（ｃ’ＦＤＡ、オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））（２０ｍｇ／ｍＬのアセトン、−２０℃で貯蔵）をＰＢＳ中に希釈して、７５μｇ／ｍＬの最終濃度を与えた。Ｎ２０２．１Ａ腫瘍細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に、１ｍＬの作用溶液中に細胞を再懸濁し、加湿した５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で３０分間インキュベートすることによってｃ’ＦＤＡにより標識化した。次に、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中に１×１０5細胞／ｍＬの濃度で懸濁された１％のＢＳＡ（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含有するＰＢＳ中で、標的細胞を３回洗浄した。
【００８６】
１×１０4のｃ’ＦＤＡ標識化腫瘍標的細胞を、９６ウェルの丸型マイクロタイタープレート（デンマーク、ロスキレのヌンク社（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において２００μＬの総体積で、エフェクター脾臓細胞と共にインキュベートした。１００：１〜１２．５：１の範囲であるエフェクター：標的細胞比を三重に試験した。加湿５％ＣＯ2インキュベータ中でプレートを３７℃で３時間維持し、次に７００ｇで５分間遠心分離した。プレートを急速に反転させ、上澄みをすばやく出すことによって細胞画分から上澄みを分離した。０．０５Ｍのホウ酸緩衝液、ｐＨ９．０中の１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００の１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを４℃で２０時間保持して可溶化させた。１４２０ビクター（ＶＩＣＴＯＲ）2マルチラベルカウンター（マサチューセッツ州ボストンのパーキンエルマー・ライフ・アンド・アナリティカル・サイエンシーズ社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））により蛍光についてプレートを読み取った。特異的な溶解（すなわち、抗原特異性の細胞傷害）の割合を以下のように計算した。
【数１】
式中、Ｆは、上澄みを除去した後の可溶化細胞の蛍光を表し、
Ｆmed＝媒体のみの中でインキュベートした標的からのＦであり、
Ｆexp＝エフェクター細胞と共にインキュベートした標的からのＦである。
【００８７】
結果は図４に要約される。
【００８８】
実施例３ 抗原特異性の体液性免疫
実施例１に記載したように、動物を分類し、免疫化および／または処置した。免疫化期間の完了の２週間後に、コントロールおよび実験動物から血清を収集した。血清を−８０℃で貯蔵し、フローサイトメトリーにより連続的に分析した。高レベルの腫瘍特異性の抗原ｐ１８５neuを発現する２×１０5Ｎ２０２．１Ａ細胞を、２％ＢＳＡおよび０．５％ナトリウムアジドが補充された冷ＰＢＳ（ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ）で２回洗浄した。次に、ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ中に１：１０で希釈した５０μＬのコントロールまたは免疫血清を用いて、標準的な間接免疫蛍光法手順で細胞を染色した。フルオレセイン結合ウサギ抗マウスＩｇ（カリフォルニア州サンディエゴのＥＭＤバイオサイエンシーズ社（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を二次抗体として使用した。細胞をアイソトン（Ｉｓｏｔｏｎ）ＩＩ中に再懸濁し、コールター・エピックス（ＣＯＵＬＴＥＲ ＥＰＩＣＳ）ＸＬ（カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））フローサイトメーターにより評価した。血清のＮ２０２．１Ａ結合能（Ｓｂｐ）、抗原特異性の体液性免疫応答の尺度を以下のように計算した。
Ｓｂｐ＝［（％T）（蛍光平均値）］−［（％C）（蛍光平均値）］×血清希釈度
式中、％Tは、試験血清中の陽性細胞のパーセントであり、
％Cは、コントロール血清中の陽性細胞のパーセントである。
【００８９】
結果は図３に要約される。
【００９０】
実施例４ 細胞内サイトカインの染色
脾細胞を実施例２に記載したように入手し、刺激物質としてＮ２０２．１Ａ腫瘍細胞（２０：１比の刺激物質：リンパ球）の存在下、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ媒体中で、３７℃および５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。細胞を収集し、ＰＥ結合抗ＣＤ４または抗ＣＤ８モノクローナル抗体（カリフォルニア州サンノゼのＢＤバイオサイエンシーズ、ベクトン、ディッキンソン社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））により５％ＦＣＳおよび０．０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ緩衝液中で染色した。次に、細胞を０．２％ホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎｅ）中で固定し、ＦＩＴＣ結合抗ＩＬ１０、抗ＩＬ−１２、または抗ＩＦＮ−γ（ＢＤバイオサイエンシーズ）により５％ＦＣＳおよび０．０５％ホルマリンを含有するＰＢＳ緩衝液中で連続的に染色した。コールター・エピックスＸＬフローサイトメーター（カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社）によって染色を評価した。
結果は図５に要約される。
【００９１】
実施例５
上記のように調製および送達した５０μｇまたは１００μｇのｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭワクチンにより、２、３０、および５８日目にアカゲザルを左上腕で免疫化する。免疫化部位において、ＩＲＭ化合物で処置される動物は、ＰＢＳ中に溶解した０．５ｍｇ／ｋｇのＩＲＭ１、もしくは０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのＩＲＭ３、ＩＲＭ４、ＩＲＭ５、またはＩＲＭ６、もしくは５０ｍｇ／ｋｇのＩＲＭ５を含有する皮内注射を受ける。これらのＩＲＭ化合物の受け取りは、０日目から開始して期間中３日ごとに行われる。１６、４５、および７２日目に血液を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ−γ産生細胞の数を測定する。ＩＦＮ−γ産生細胞の数は、ＩＲＭ用量に依存するように変動し得る。
【００９２】
実施例６
実施例５に記載したように、アカゲザルを分類し、免疫化および／または処置する。免疫化期間の完了の２週間後に、コントロールおよび実験動物から血清を収集する。血清を−８０℃で貯蔵し、フローサイトメトリーにより連続的に分析する。高レベルの腫瘍特異性抗原Ｈｅｒ−２を発現する２×１０5ＳＫ−ＢＲ−３細胞（バージニア州マナサス（Ｍａｎｎａｓａｓ）のＡＴＣＣ）を、２％ＢＳＡおよび０．５％ナトリウムアジドが補充された冷ＰＢＳ（ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ）で２回洗浄する。次に、ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ中に１：１０で希釈した５０μＬのコントロールまたは免疫血清を用いて、標準的な間接免疫蛍光法手順で細胞を染色する。フルオレセインイストチオシアネート（ｉｓｔｈｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）結合ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソン・イムノリサーチ・ラブズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））を二次抗体として使用する。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液（カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｒｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（カリフォルニア州サンノゼのＢＤバイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））フローサイトメーターにより評価する。血清のＳＫ−ＢＲ−３結合能（Ｓｂｐ）、抗原特異性の体液性免疫応答の尺度は以下のように計算される。
Ｓｂｐ＝［（％T）（蛍光平均値）］−［（％C）（蛍光平均値）］×血清希釈度
式中、％Tは、試験血清中の陽性細胞のパーセントであり、
％Cは、コントロール血清中の陽性細胞のパーセントである。
Ｓｐｂは、ＩＲＭ用量に依存するように変化し得る。
【００９３】
実施例７
以下のグループ：（１）ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭによる処置なし（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、（２）ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭ２により処置（ＩＲＭ＋ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、または（３）未処置（コントロール）のそれぞれに対して、実施例１と同様にして動物を処置した。免疫化期間の完了の２週間後に、動物から血清を収集し、同じ処置を受ける動物の間でプールした。
【００９４】
１５０μＬのプール血清を８週齢の動物（５匹の動物／処置血清）に注入した。血清投与の２４時間後に、各マウスを１０5Ｎ２０２／１Ａ腫瘍細胞により皮下で攻撃し、腫瘍の発生を記録するためにモニターした。
【００９５】
結果は、図６に示される。ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭで免疫化されたマウスからの血清で処置した、より多い割合の動物は、コントロールマウスと比較して腫瘍がないままであった。ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭおよびＩＲＭ２で免疫化されたマウスからの血清で処置した、さらにより多い割合のマウスは、モニタリングの過程を通して、腫瘍がないままであった。
【００９６】
本明細書中で引用される特許、特許文献および刊行物の完全な開示は、それぞれが個別に援用されたかのように参照によってその全体が援用される。抵触の場合には、本明細書は、定義を含めて規制するものとする。
【００９７】
本発明に対する様々な変更および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかになるであろう。説明的な実施形態および実施例は例として提供されるだけであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１ａ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭが、腫瘍の防止（図１ａ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図１ｂ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭが、腫瘍の数の減少（図１ｂ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図２ａ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのもう１つのＩＲＭが、腫瘍の防止（図２ａ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図２ｂ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのもう１つのＩＲＭが、腫瘍の数の減少（図２ｂ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図３】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ワクチンによって誘発される抗原特異性の体液性免疫を増大させることを示す。
【図４】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ワクチンによって誘発される細胞傷害を増大させることを示す。
【図５ａ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、抗腫瘍サイトカインのＩＦＮ−γ（図５ａ）を産生するためにワクチンによって誘発される細胞の割合を増大させることを示す。
【図５ｂ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ＩＬ−２（図５ｂ）を産生するためにワクチンによって誘発される細胞の割合を増大させることを示す。
【図５ｃ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ＩＬ−１０（図５ｃ）を産生するためにワクチンによって誘発される細胞の割合を増大させることを示す。
【図６】ＩＲＭおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンで処置したマウスからの血清が、レシピエントのマウスにおける腫瘍発生に対する保護を提供できることを示す。
【背景技術】
【０００１】
背景
免疫系の特定の重要な側面を刺激することによって、そして特定の他の側面を抑制することによって作用する新しい薬剤化合物を発見するために、近年大きな努力がなされており、著しい成功が収められている（例えば、米国特許第６，０３９，９６９号および第６，２００，５９２号を参照）。本明細書中で免疫応答修飾物質（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ、ＩＲＭ）と呼ばれるこれらの化合物は、トール様受容体（ＴＬＲ）として知られる基本の免疫系メカニズムにより作用して、選択されるサイトカイン生合成を誘発すると思われる。これらは、様々な種類の疾患および状態を処置するために有用であり得る。例えば、特定のＩＲＭは、ウィルス性疾患（例えば、ヒトパピローマウィルス、肝炎、ヘルペス）、新形成（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線性角化症、メラノーマ）、およびＴH２媒介性疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎）を処置するために有用であり、またワクチンアジュバントとしても有用である（米国特許第６，０８３，５０５号および米国特許出願公開第２００４／００７６６３３号）。
【０００２】
ＩＲＭ化合物の多くは小さい有機分子のイミダゾキノリンアミン誘導体（例えば、米国特許第４，６８９，３３８号を参照）であるが、多数の他の化合物の種類も同様に知られており（例えば、米国特許第５，４４６，１５３号、第６，１９４，４２５号、および第６，１１０，９２９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００５／０７９１９５号パンフレットを参照）、さらに多くのものが今でもまだ開発されている。ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドなどの他のＩＲＭは、より高い分子量を有する（例えば米国特許第６，１９４，３８８号を参照）。
【０００３】
積極的な多様的療法にもかかわらず再発または進行することがとても多い乳癌における成果を改善するために、免疫療法などの新しい革新的な処置戦略が必要とされる。癌ワクチンは、現存する癌を処置する可能性、その再発を防止する可能性、あるいは両方の可能性を有する。さらに、乳癌ワクチンは、乳癌の非常に早期の形態である非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）が浸潤性癌に進行することを防止するための理想的な介入であり得る。
【０００４】
１つの処置戦略は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質を標的とするワクチンの投与を含む。このタンパク質は、ＤＣＩＳ腫瘍の５０％以上および浸潤性乳癌の３０％の細胞表面において異常に大量に見られる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は細胞の表面に見られ、これらの細胞を成長させるシグナルを受け取る。異常に高いレベルで存在する場合、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、細胞が成長シグナルに対してあまりにも攻撃的に応答するようにし、従って、制御不能に成長し、腫瘍性形質転換（すなわち、腫瘍成長）が起こる。
【０００５】
トラスツズマブ（ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））はＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対するモノクローナル抗体であり、ＨＥＲ−２／ｎｅｕにより促進される乳癌の処置のために承認されている。モノクローナル抗体は、腫瘍細胞表面のＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の少なくともいくつかと結合し、それにより、結合ＨＥＲ−２／ｎｅｕが成長シグナルを受け取るのを阻害すると考えられる。また抗体は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に結合すると、免疫系が腫瘍細胞を異常であると確認するのを助け、従って腫瘍細胞を免疫系の細胞による破壊および／または除去の標的にするのを助けることができる。
【０００６】
腫瘍抗原に対する遺伝子による免疫化は、癌の進行を妨害することができる免疫応答を誘発するためのもう１つの戦略である。遺伝子による免疫化は、腫瘍特異性抗原の少なくとも一部をコードするＤＮＡ発現ベクターにより被検者にワクチン接種することを含む。ワクチン接種を行えば、被検者の体内の細胞は発現ベクターを受け取り、ベクターにコードされた遺伝子を（例えば、腫瘍抗原）を発現する。発現ベクターからの腫瘍抗原の発現は、被検者の免疫系を促して、（ａ）腫瘍抗原に対する抗体、そしてそれにより腫瘍細胞に対する抗体、および／または（ｂ）抗原特異性の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｉｘｉｃ）Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を発生させることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
概要
特定のＩＲＭ化合物は、ＤＮＡワクチンのためのアジュバントとして有用であり得ることが分かっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ＩＲＭ化合物と、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを含むＤＮＡワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンは単一の製剤でもよいが、別の特定の実施形態では、発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は別々の製剤において提供されてもよい。
【０００９】
もう１つの態様では、本発明は、ＴＬＲ８選択性アゴニストを含むＤＮＡワクチンアジュバントと、アジュバントとしてＴＬＲ８選択性アゴニストを含むＤＮＡワクチンとを提供する。
【００１０】
もう１つの態様では、本発明は、被検者において乳癌を処置する方法を提供する。一般に、該方法は、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与することと、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を被検者に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、乳癌は、浸潤性乳癌または非浸潤性乳管癌を含み得る。
【００１１】
さらにもう１つの態様では、本発明は、乳癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用を提供し、該ＤＮＡワクチンは、ＩＲＭ化合物と、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを含む。
【００１２】
もう１つの態様では、本発明は、被検者において癌を処置する方法を提供する。一般に、該方法は、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与することと、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＴＬＲ８選択性アゴニストを被検者に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、肝細胞癌、子宮頸癌、結腸癌、メラノーマ、または肺癌を含み得る。
【００１３】
さらにもう１つの態様では、本発明は、癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用を提供し、該ＤＮＡワクチンは、ＴＬＲ８選択性アゴニストと、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを含む。
【００１４】
本発明の様々な他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲および添付図面を参照して、容易に明らかになるはずである。明細書中のいくつかの箇所では、実例の一覧によって案内が提供される。各場合において、引用される一覧は単に代表群としての役割を果たすだけであり、排他的な一覧として解釈されてはならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の例証的な実施態様の詳細な説明
特定のＩＲＭ化合物は、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドを標的とするＤＮＡワクチンのためのアジュバントとして有用であると確認されている。さらに、特定のＩＲＭ化合物は可能性のあるＤＮＡワクチンアジュバントとして提案されているが、これは、自然発生的な（すなわち、非形質移入の）腫瘍特異性抗原を標的とするＤＮＡワクチンのためのアジュバントとしてＩＲＭ化合物が有効であり得るという最初の証明である。
【００１６】
本発明の目的では、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
「アゴニスト」は、受容体（例えば、ＴＬＲ）と組み合わされて細胞の活性を誘発することができる化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドでもよい。あるいは、アゴニストは、例えば（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成することによって、あるいは（ｂ）別の方法で別の化合物の修飾をもたらし、他の化合物を受容体に直接結合させることによって、受容体と間接的に組み合わされてもよい。アゴニストは、特定のＴＬＲのアゴニスト（例えば、ＴＬＲ８アゴニスト）またはＴＬＲの特定の組み合わせ（例えば、ＴＬＲ７／８アゴニスト−ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のアゴニスト）と見なされ得る。
【００１７】
「抗原」は、免疫応答の標的であることができる任意の物質を指す。抗原は、例えば、被検生物体により生じる細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的でもよい。あるいは、抗原は、免疫細胞と接触される場合に細胞性免疫応答（例えば、免疫細胞の成熟、サイトカインの産生、抗体の産生など）の標的でもよい。
【００１８】
「抗原ペプチド」は、細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的であることが可能である、指示されるタンパク質に由来する任意の長さのペプチドを指す。例えば、「抗原性ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチド」は、細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的であることが可能である、ヒト、ラット、またはマウスのＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来するペプチドを指す。もう１つの例として、「抗原性マンマグロブリン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎ）−Ａ」ペプチドは、細胞媒介性および／または体液性の免疫応答の標的であることが可能である、マンマグロブリン−Ａに由来するペプチドを指す。
【００１９】
「ＤＮＡワクチン」およびその変形は、抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を指し、被検者に直接導入されて、抗原ペプチドに対する被検者の免疫応答を誘発し得る。
「ＨＥＲ−２」、「ｎｅｕ」、および「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」は、ラットｎｅｕ癌原遺伝子およびそのヒト相同体、ＨＥＲ−２、またはそのマウス相同体、ｎｅｕによりコードされる１８５ｋＤタンパク質を交換可能に指す。
【００２０】
「ペプチド」は、配列の長さに関係なくアミノ酸残基の配列を指す。従って、「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸を有するアミノ酸配列を指し、全長タンパク質、そして場合によりポリタンパク質も含む。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、乳癌を処置するためのＤＮＡワクチンを提供する。一般に、該ワクチンは、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターと、ＩＲＭ化合物とを含む。
【００２２】
本明細書で使用される場合、状態を「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置する（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」とは、状態に関連する症候または臨床徴候を、ある程度、低減、進行の制限、回復、または解消することを指す。「処置」は、状態を処置することができる任意の物質、組成物、投与計画などを指し、治療的、予防的、または両方と説明することができる。「治療的」およびその変形は、状態に関連する１つまたは複数の現存の症候または臨床徴候を回復させる処置を指す。「予防的」およびその変形は、状態の症候または臨床徴候の発生および／または出現をある程度制限する処置を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチド」は、細胞マーカー、通常はペプチドまたは全長タンパク質を指し、すなわち、（ａ）正常細胞と腫瘍細胞の間で差次的に発現されることと、（ｂ）差次的発現が乳癌の発生を処置または防止するために利用され得ることの両方である。
【００２４】
正常細胞と腫瘍細胞との間の差次的発現は、通常、腫瘍細胞が正常細胞よりも大きい程度にマーカーを発現することを意味する。例えば、いくつかの臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドは腫瘍細胞によって発現され得るが、正常細胞では発現されない。このような抗原ペプチドは、腫瘍細胞によってのみ、すなわち特異的に発現されるので、腫瘍特異性抗原ペプチドと考えることができる。しかしながら、他の場合には、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドは正常細胞によって自然に発現され得るが、腫瘍細胞によって過剰発現、すなわち通常のレベルよりも多く発現される。
【００２５】
発現ベクターは、限定されないが、裸のＤＮＡを含む任意の適切な形態を有し得る。あるいは、例えば、発現ベクターは、例えばシンドビドウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｄ ｖｉｒｕｓ）、セムリキ森林ウィルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウィルス（ＶＥＥ）に基づくようなアルファウィルス属ベクターなどの弱毒細菌またはウィルス由来のベクター内に、あるいはその一部としてパッケージされ得る。適切なアルファウィルス属ベクターには、例えば、例えば、ライトナー（Ｌｅｉｔｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３年）、第９巻、３３−３９頁、ドゥベンスキー（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６年）、第７０巻、５０８−５１９頁、およびパシュコ（Ｐｕｓｈｋｏ）ら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９７年）、第２３９巻、３８９−４０１頁に記載されるようなダブルプロモーターベクターおよびレプリコンベクターが含まれる。
【００２６】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターは既知である。例えば、ｐＣＭＶｎｅｕＮＴは、全長ラットｎｅｕタンパク質をコードする。しかしながら、特定の証拠によって、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの切断型をコードする発現ベクターは、全長ｎｅｕタンパク質をコードするベクターよりも、保護性の抗腫瘍免疫の誘発に有効であり得ることが暗示される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの切断型をコードする発現ベクターは、例えば、ｐＣＭＶ−ＥＣＤ（ｎｅｕ細胞外ドメインをコードする）、およびｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭ（ｎｅｕ細胞外および膜貫通ドメインをコードする）を含む。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの少なくとも一部をコードする発現ベクターは、例えば、Ｙ．チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８年）、第５８巻、１９６５−１９７１頁に記載されている。
【００２７】
マンマグロブリン−Ａは、乳腫瘍の８０％において発現されるもう１つの臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドである。マンマグロブリン−ＡのｃＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、マンマグロブリン−Ａ+腫瘍に対してＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を発生することができる。さらに、ワクチン接種されたマウスから、活発に成長するマンマグロブリン−Ａ+腫瘍を有する動物へのＣＤ８+ＣＴＬの移動は、著しい腫瘍の後退を引き起こした。特定のマンマグロブリン−Ａエピトープは、免疫化マウスおよび乳癌患者の両方からのＣＤ８+ＣＴＬによって認識された。マンマグロブリン−Ａの少なくとも一部をコードする発現ベクターは、例えば、Ｋ．ナラヤナン（Ｎａｒａｙａｎａｎ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（２００４年）、第９６巻、１３８８−１３９６頁）に記載されている。
【００２８】
ＭＵＣ１（多型上皮ムチン（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｕｃｉｎ）、すなわちＰＥＭ）は、もう１つの臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドである。ＭＵＣ１は、例えば、ほとんどの上皮癌などの多くの癌の腫瘍細胞によって発現される。ＭＵＣ１ムチンは正常な腺上皮の頂端細胞表面において発現され、例えば、乳癌などの特定の癌において過剰発現される高分子量（＞４００ｋＤ）の膜貫通糖タンパク質である。ＭＵＣ１コアペプチドを認識し、インビトロの腫瘍標的の溶解を媒介する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、乳癌、膵癌、および卵巣癌の患者から得られている。循環ＭＵＣ１免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）抗体は、乳癌、結腸癌、および膵癌の患者において見出されている。循環ＭＵＣ１免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、結腸直腸癌の患者において検出されている。ＭＵＣ１の少なくとも一部をコードする発現ベクターでワクチン接種されたマウスは、引き続いて行なわれるＭＵＣ１を発現する同系の腫瘍細胞による攻撃の後の腫瘍の発生から保護される。ＭＵＣ１の少なくとも一部をコードする特定の発現ベクターは、ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞による攻撃の後にインビボで特異的なＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答を発生することができる。ＭＵＣ１の少なくとも一部をコードする発現ベクターは、例えば、Ｔ．プランケット（Ｐｌｕｎｋｅｔｔ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００４年）、第１０９巻、６９１−６９７頁に記載されている。
【００２９】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする他の発現ベクターは、例えば、ＳＩＮＣＰ−βｇａｌ（カリフォルニア州エミリービルのカイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ））および特定のＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークのアルファバックス社（ＡｌｐｈａＶａｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ ｐａｒｋ，ＮＣ））を含む。
【００３０】
従って、１つの実施形態では、ワクチンは、（ａ）抗原性ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドをコードする発現ベクターと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。他の実施形態では、ワクチンは、（ａ）抗原性マンマグロブリン−Ａペプチドをコードする発現ベクターと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。もう１つの実施形態では、ワクチンは、（ａ）抗原性ＭＵＣ１ペプチドをコードする発現ベクターと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。もう１つの実施形態では、ワクチンは、ＳＩＮＣＰ−βｇａｌおよびＩＲＭ化合物を含む。さらにもう１つの実施形態では、ワクチンは、（ａ）乳癌関連抗原ペプチドをコードするＶＥＥレプリコンと、（ｂ）ＩＲＭ化合物とを含む。
【００３１】
もう１つの態様では、本発明は、ＤＮＡワクチンにおいて使用するためのアジュバントと、結果として得られる該アジュバントを含むＤＮＡワクチンとを提供する。一般に、該アジュバントは、ＴＬＲ８選択性アゴニストであるＩＲＭ化合物を含む。従って、ＤＮＡワクチンは、一般に、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターと、ＴＬＲ８選択性アゴニストであるＩＲＭ化合物とを含む。
【００３２】
ＴＬＲ８選択性アゴニストによって提供されるアジュバント効果は、ワクチン依存性ではないかもしれない。すなわち、ＴＬＲ８選択性アゴニストは、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを含むＤＮＡワクチンのための効果的なアジュバントであり得る。従って、特定の臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドおよび該ペプチドをコードする発現ベクターの説明は単なる例であって、全ての適切な臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドおよび該ペプチドをコードする発現ベクターの網羅的な説明であることは意図されない。
【００３３】
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドは、乳癌関連抗原ペプチドである上記のものを含むが、例えばＭＵＣ１などのいくつかのものは、さらに乳癌以外の癌と関連し得る。
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）は、肝細胞癌（ＨＣＣ）に関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＨＣＣ、原発性の肝臓癌は、癌死亡の主要な原因である。アジアに特有の疾患は、Ｂ型肝炎感染の結果として肝硬変を患っている個人において顕著である。毎年およそ１２０万人の新たな症例が発生し、ほとんど全ての患者は診断の６ヶ月以内に死亡する。ＡＦＰの抗原性部分をコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、腫瘍の成長の遅延を経験した。このような発現ベクターは、例えば米国特許出願公開第２００３／０１４３２３７号に記載されている。
【００３４】
ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）オンコプロテインＥ６およびＥ７は、子宮頸癌に関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＨＰＶはほとんどの子宮頸癌に存在し、ＨＰＶオンコプロテインＥ６およびＥ７はＨＰＶ関連の癌細胞において一貫して発現され、その悪性形質転換の原因である。抗原性Ｅ７ペプチドをコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、Ｅ７特異性ＣＤ８+Ｔリンパ球免疫応答を発生することができる。抗原性Ｅ６ペプチドをコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、（ａ）Ｅ６特異性ＣＤ８+Ｔリンパ球免疫応答を発生することができ、そして（ｂ）Ｅ６を発現する腫瘍細胞株によるチャレンジ後の腫瘍の発生から保護され得る。Ｅ７の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、Ｗ．Ｆ．チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．（２００１年）、第１０８巻、６６９−６７８頁に記載されている。Ｅ６の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、ペン（Ｐｅｎｇ）ら（２００４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８．１６：８４６８−８４７６頁に記載されている。
【００３５】
チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）は、メラノーマに関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＴＲＰ−１は、メラノーマ細胞において高レベルで発現される腫瘍拒絶抗原である。ＴＲＰ−１の少なくとも一部をコードする発現ベクターで免疫化されたマウスは、メラノーマ細胞によるチャレンジ後の腫瘍の発生から保護された。ＴＲＰ−１の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、ライトナー（Ｌｅｉｔｎｅｒ）ら（２００３年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第９巻、第１号、３３−３９頁に記載されている。
【００３６】
血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ２）は、多くのタイプの腫瘍に関連する臨床的に適切な抗原ペプチドである。ＶＥＧＦ２の発現は、腫瘍脈管構造の血管新生の間に上方制御される。血管新生は、固形腫瘍の浸潤、成長、および転移において中心的な役割を果たす。従って、腫瘍脈管構造における増殖性内皮細胞（ＶＥＧＦ２を過剰発現するもの）に対する免疫応答は腫瘍血管の崩壊を発生させ、それにより、完全に発生する前に、癌を本質的に欠乏させることができる。ＶＥＧＦ２をコードする発現ベクターでワクチン接種されたマウスは、メラノーマまたは非小細胞肺癌細胞によりチャレンジされたときに腫瘍成長の阻害を経験し、自発性の肺転移（例えば、非小細胞肺癌）から保護され、結腸癌細胞による攻撃後に寿命の延長を有し、そして治療的なモデルでは、結腸癌細胞から生じる確定した転移の成長の減少を経験した。ＶＥＧＦ２の少なくとも抗原性部分をコードする発現ベクターは、例えば、ニータマー（Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ）ら（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第８巻、第１２号、１３６９−１３７５頁に記載されている。
【００３７】
従って、いくつかの実施形態では、ワクチンは、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチド、すなわち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチド、マンマグロブリン−Ａペプチド、またはＭＵＣ１をコードする発現ベクターと、ＴＬＲ８選択性アゴニストとを含むことができる。他の実施形態では、ワクチンは、例えば、抗原性アルファフェトプロテインペプチド（ＨＣＣ関連）、抗原性ＴＲＰ−１ペプチド（メラノーマ関連）、抗原性ＶＥＧＦ２ペプチド（多腫瘍関連）、または抗原性Ｅ６またはＥ７ペプチド（子宮頸癌関連）などの臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターと、ＴＬＲ８選択性アゴニストと含むことができる。
【００３８】
上記のように、本発明に従うＤＮＡワクチンを被検者に投与すると、被検者に予防的および／または治療的な癌処置を提供することができる。しかしながら、もう１つの態様では、本発明は、予防的および／または治療的な癌処置を別の被検者に提供することができる癌処置用組成物の調製方法を提供する。一般に、該方法は、ＩＲＭ化合物と、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターとを被検者に投与することと、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの血清免疫応答を被検者に発生させることと、そして最後に、被検者の血清の少なくとも一部を採取することとを含む。被検者から採取された材料はさらに加工されて、採取した材料を特定の物質（例えば、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する抗体）について濃縮する、あるいは採取した材料を特定の物質（例えば、細胞、ＡＢＯ血液型抗体、Ｒｈ因子）について枯渇させることができる。
【００３９】
被検者から採取した材料の少なくとも一部（さらに加工されていてもいなくても）は、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに関連する癌の処置を必要としている第２の被検者、例えば、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに関連する癌を発生する危険性のある被検者、あるいは患っていると診断された被検者に投与され得る。したがって、本発明のＤＮＡワクチンの投与は、一次的な処置（すなわち、ＤＮＡワクチンが投与される被検者に対する）、または二次的な処置（例えば、ＤＮＡワクチンが投与された被検者から採取された血清を受け取る被検者に対する）のいずれかを提供することができる。
【００４０】
ＩＲＭ化合物は、抗ウィルス活性および抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫調節活性を有する化合物を含む。特定のＩＲＭは、サイトカインの産生および分泌を調節する。例えば、特定のＩＲＭ化合物は、例えば、Ｉ型インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１、および／またはＭＣＰ−１などのサイトカインの産生および分泌を誘発する。さらに、いくつかのＩＲＭ化合物は、ＩＬ−１およびＴＮＦを抑制するといわれている（米国特許第６，５１８，２６５号）。
【００４１】
例えば、米国特許第４，６８９，３３８号、第４，９２９，６２４号、第５，２６６，５７５号、第５，２６８，３７６号、第５，３４６，９０５号、第５，３５２，７８４号、第５，３８９，６４０号、第５，４４６，１５３号、第５，４８２，９３６号、第５，７５６，７４７号、第６，１１０，９２９号、第６，１９４，４２５号、第６，３３１，５３９号、第６，３７６，６６９号、第６，４５１，８１０号、第６，５２５，０６４号、第６，５４１，４８５号、第６，５４５，０１６号、第６，５４５，０１７号、第６，５７３，２７３号、第６，６５６，９３８号、第６，６６０，７３５号、第６，６６０，７４７号、第６，６６４，２６０号、第６，６６４，２６４号、第６，６６４，２６５号、第６，６６７，３１２号、第６，６７０，３７２号、第６，６７７，３４７号、第６，６７７，３４８号、第６，６７７，３４９号、第６，６８３，０８８号、第６，７５６，３８２号、第６，７９７，７１８号、および第６，８１８，６５０号、米国特許出願公開第２００４／００９１４９１号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１４７５４３号、および第２００４／０１７６３６７号、ならびに国際公開第ＷＯ２００５／１８５５１号、第ＷＯ２００５／１８５５６号、第ＷＯ２００５／２０９９９号、第ＷＯ２００５／０３２４８４号、第ＷＯ２００５／０４８９３３号、第ＷＯ２００５／０４８９４５号、第ＷＯ２００５／０５１３１７号、第ＷＯ２００５／０５１３２４号、第ＷＯ２００５／０６６１６９号、第ＷＯ２００５／０６６１７０号、第ＷＯ２００５／０６６１７２号、第ＷＯ２００５／０７６７８３号、および第ＷＯ２００５／０７９１９５号に記載されるもののように、特定のＩＲＭは、小さい有機分子（例えば、タンパク質、ペプチドなどの大きい生体分子とは対照的に約１０００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量）である。
【００４２】
小分子ＩＲＭのさらなる例には、特定のプリン誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号および第６，０２８，０７６号に記載されるものなど）、特定のイミダゾキノリンアミド誘導体（米国特許第６，０６９，１４９号に記載されるものなど）、特定のイミダゾピリジン誘導体（米国特許第６，５１８，２６５号に記載されるものなど）、特定のベンゾイミダゾール誘導体（米国特許第６，３８７，９３８号に記載されるものなど）、５員窒素含有複素環式環に縮合された４−アミノピリミジンの特定の誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号、第６，０２８，０７６号および第６，３２９，３８１号、ならびに国際公開第ＷＯ０２／０８９０５号パンフレットに記載されるアデニン誘導体など）、そして特定の３−β−Ｄ−リボフラノシルチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体（米国特許出願公開第２００３／０１９９４６１号に記載されるものなど）が含まれる。
【００４３】
他のＩＲＭには、オリゴヌクレオチド配列などの大きい生体分子が含まれる。いくつかのＩＲＭオリゴヌクレオチド配列は、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有し、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、第６，２０７，６４６号、第６，２３９，１１６号、第６，３３９，０６８号、および第６，４０６，７０５号に記載されている。いくつかのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，４２６，３３４号および第６，４７６，０００号に記載されるものなどの合成免疫調節構造モチーフを含むことができる。他のＩＲＭヌクレオチド配列はＣｐＧ配列が欠けており、例えば、国際公開第ＷＯ００／７５３０４号パンフレットに記載されている。
【００４４】
他のＩＲＭは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）などの生体分子を含み、例えば、米国特許第６，１１３，９１８号、第６，３０３，３４７号、第６，５２５，０２８号、および第６，６４９，１７２号に記載されている。
【００４５】
別途指示されない限り、化合物への言及は、異性体（例えば、ジアステレオマーまたはエナンチオマー）、塩、溶媒和物、多形体などを含む薬学的に許容可能な任意の形態の化合物を含むことができる。特に、化合物が光学活性であれば、化合物への言及は、化合物のエナンチオマーのそれぞれ、およびエナンチオマーのラセミ混合物を含むことができる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、少なくとも１つのＴＬＲのアゴニスト、好ましくはＴＬＲ６、ＴＬＲ７、またはＴＬＲ８のアゴニストであり得る。またＩＲＭは、いくつかの場合には、ＴＬＲ４またはＴＬＲ９のアゴニストでもよい。本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、小分子の免疫応答調節剤（例えば、約１０００ダルトン未満の分子量）であり得る。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、５員窒素含有複素環式環に縮合した２−アミノピリジン、または５員窒素含有複素環式環に縮合した４−アミノピリミジンを含み得る。
【００４８】
本発明における使用に適したＩＲＭ化合物は、５員窒素含有複素環式環に縮合した２−アミノピリジンを有する化合物を含む。例えば、このような化合物としては、例えばアミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−、または９−アリール、ヘテロアリール、アリールオキシまたはアリールアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、およびイミダゾキノリンジアミンなどの置換イミダゾキノリンアミンを含むがこれらに限定されないイミダゾキノリンアミンと、アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、オキシム置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、およびテトラヒドロイミダゾキノリンジアミンを含むがこれらに限定されないテトラヒドロイミダゾキノリンアミンと、アミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエーテル、およびチオエーテル置換イミダゾピリジンアミンを含むがこれらに限定されないイミダゾピリジンアミンと、１，２−架橋イミダゾキノリンアミンと、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミンと、イミダゾナフチリジンアミンと、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミンと、オキサゾロキノリンアミンと、チアゾロキノリンアミンと、オキサゾロピリジンアミンと、チアゾロピリジンアミンと、オキサゾロナフチリジンアミンと、チアゾロナフチリジンアミンと、ピラゾロピリジンアミンと、ピラゾロキノリンアミンと、テトラヒドロピラゾロキノリンアミンと、ピラゾロナフチリジンアミンと、テトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンと、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミン、またはテトラヒドロナフチリジンアミンに縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーとが挙げられる。
【００４９】
１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンまたは４−アミノ−α，α，２−トリメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールなどのイミダゾキノリンアミンでよい。
【００５０】
代替の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、チアゾロキノリンアミン、チアゾロピリジンアミン、またはチアゾロナフチリジンアミンでよい。１つの特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンでよい。もう１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、２−プロピル−７−（ピリジン−３−イル）−チアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンでよい。もう１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタノールでよい。さらにもう１つの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば、Ｎ−［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタンスルホンアミドでよい。
【００５１】
特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、またはチアゾロナフチリジンアミンでよい。
【００５２】
特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、置換イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンでよい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、置換イミダゾキノリンアミンは、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−、または９−アリール、ヘテロアリール、アリールオキシまたはアリールアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、もしくはイミダゾキノリンジアミンを指す。本明細書で使用される場合、置換イミダゾキノリンアミンは、具体的には、そして明確に、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンおよび４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールを除外する。
【００５４】
また、適切なＩＲＭ化合物は、プリン誘導体、イミダゾキノリンアミド誘導体、ベンゾイミダゾール誘導体、アデニン誘導体、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、および上記のオリゴヌクレオチド配列も含むことができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、１つまたは複数のＴＬＲのアゴニストであると確認される化合物でもよい。例えば、ＩＲＭ化合物は、ＴＬＲ８のアゴニストでよい。特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、ＴＬＲ８選択性アゴニストでよい。本明細書で使用される場合、「ＴＬＲ８選択性アゴニスト」という用語は、ＴＬＲ８のアゴニストとして働くが、ＴＬＲ７のアゴニストとしては働かない化合物を指す。「ＴＬＲ７／８アゴニスト」は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のアゴニストとして働く化合物を指す。
【００５６】
ＴＬＲ８選択性アゴニストは、ＴＬＲ８と、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、またはＴＬＲ１０のうちの１つまたは複数とのアゴニストとして働くことができるが、ＴＬＲ７のアゴニストとしては働かない。したがって、「ＴＬＲ８選択性アゴニスト」は、ＴＬＲ８のためであって他のＴＬＲのためではないアゴニストとして働く化合物を指すことができるが、代替として、ＴＬＲ８と、例えばＴＬＲ４とのアゴニストとして働く化合物を指すこともできる。
【００５７】
特定の化合物のＴＬＲアゴニズムは、任意の適切な方法で評価することができる。例えば、試験化合物のＴＬＲアゴニズムを検出するために適したアッセイおよび組換え細胞株は、例えば、米国特許出願公開第２００４／００１４７７９号、第２００４／０１３２０７９号、第２００４／０１６２３０９号、第２００４／０１７１０８６号、第２００４／０１９１８３３号、および第２００４／０１９７８６５号において記載されている。
【００５８】
使用される特定のアッセイにかかわらず、化合物によるアッセイの実施が、少なくとも、特定のＴＬＲにより媒介される何らかの生物活性のしきい値の増大をもたらせば、化合物は特定のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ８）のアゴニストであると確認することができる。反対に、指定のＴＬＲにより媒介される生物活性を検出するように設計されたアッセイを実施するために使用されたときに、化合物が生物活性のしきい値の増大を誘発することができなければ、化合物は指定のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ７）のアゴニストとして働かないと確認することができる。別途指示されない限りは、生物活性の増大は、適切な制御の下で観察される生物活性に関して同じ生物活性の増大を指す。アッセイは、適切な制御と共に実施されてもそうでなくてもよい。経験と共に、当業者は特定のアッセイに十分に熟知する（例えば、特定のアッセイ条件下で、適切な制御において観察される値の範囲）ようになり、特定のアッセイにおいて化合物のＴＬＲアゴニズムを決定するために制御の実施が常に必要ではないかもしれない。
【００５９】
所与のアッセイにおいて特定の化合物が特定のＴＬＲのアゴニストであるかどうかを決定するためのＴＬＲ媒介の生物活性の正確なしきい値の増大は、アッセイの終点として観察される生物活性、アッセイの終点を測定または検出するために使用される方法、アッセイの信号対雑音比、アッセイの精度、両方のＴＬＲのための化合物のアゴニズムを決定するために同じアッセイが使用されているかどうかを含むがこれらに限定されない当該技術分野で既知の因子に従って変化し得る。従って、全ての可能なアッセイについて特定のＴＬＲのアゴニストまたは非アゴニストであると化合物を確認するために必要とされるＴＬＲ媒介の生物活性のしきい値増大を一般的に説明することは実用的ではない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して、適切なしきい値を容易に決定することができる。
【００６０】
発現可能なＴＬＲ構造遺伝子を形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を用いるアッセイは、化合物が細胞内に形質移入されたＴＬＲのアゴニストであると確認するために例えば約１μＭ〜約１０μＭの濃度で化合物が提供される場合、例えばＴＬＲ媒介の生物活性の少なくとも３倍の増大（例えば、ＮＦκＢ活性化）のしきい値を使用することができる。しかしながら、特定の状況では、異なるしきい値および／または異なる濃度範囲が適切なこともある。また、異なるアッセイのためには異なるしきい値が適切であり得る。
【００６１】
ＩＲＭ化合物および発現ベクターはそれぞれ、被検者への投与に適切な任意の製剤において提供することができる。製剤の適切なタイプな、例えば、米国特許第５，２３８，９４４号、第５，９３９，０９０号、第６，２４５，７７６号、欧州特許第ＥＰ０３９４０２６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１９９５３８号明細書および第２００４／００７６６３３号において記載されている。適切な製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、または任意の形態の混合物を含むことができるが、これらに限定されない。適切な製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリヤ、または媒体を含むことができる。発現ベクターを送達するために適切な製剤は、裸のＤＮＡとしても発現ベクターを含むことができる。あるいは、発現ベクターは、例えばウィルス由来レプリコンまたは弱毒細菌内に、またはその一部としてパッケージされ得る。
【００６２】
ＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントＩＲＭ化合物を含有する製剤は、例えば、非腸管外または腸管外などの適切な方法で投与することができる。本明細書における使用では、非腸管外とは、経口摂取を含む消化管を通る投与を指す。腸管外は、例えば、静脈内、筋肉内、経皮的、皮下、経粘膜的（例えば、吸入によって）、または局所的などの消化管を通る以外の投与を指す。
【００６３】
発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は、単一の製剤において一緒に提供されてもよい。あるいは、発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は、異なる製剤において別々に提供されてもよい。別々の製剤で提供される場合、発現ベクターおよびＩＲＭ化合物は、単一の部位または異なる部位で、同一または異なる経路により、そして同一または異なる時間に投与され得る。
【００６４】
ＩＲＭ化合物を含む製剤の組成は、ＩＲＭ化合物の物理的および化学的性質、キャリヤの性質、意図される投薬計画、被検者の免疫系の状態（例えば、抑制、不全、刺激）、ＩＲＭ化合物の投与方法、およびＤＮＡワクチンの効力を含むがこれらに限定されない当該技術分野において既知の因子に従って変化し得る。従って、全ての可能な用途に対してＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効な製剤の組成を一般的に示すことは実用的でない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して、適切な製剤を容易に決定することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、製剤は、例えば約０．０００１％〜約１０％（別途指示されない限り、本明細書において提供される全ての割合は、製剤全体に関して重量／重量である）のＩＲＭ化合物を含むことができるが、いくつかの実施形態では、製剤はこの範囲外の濃度のＩＲＭ化合物を含むことができる。特定の実施形態では、製剤は約０．０１％〜約５％のＩＲＭ化合物を含み、例えば、製剤は約０．１％〜約１．０％のＩＲＭ化合物を含む。
【００６６】
ＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効なＩＲＭ化合物の量は、ＤＮＡワクチンの効力を増大させるのに十分な量である。ＤＮＡワクチンの効力は、例えば、以下の：特定のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０）の誘発、ＤＮＡワクチンによりコードされる抗原に対する抗体の体液性の力価の増大、腫瘍の数またはサイズの減少、腫瘍の発生の遅延、被検者の期待寿命の延長、抗原特異性のＣＴＬの発生、および／または抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、特に例えばＤＣ−１細胞における同時刺激マーカー発現の上方制御のうちの１つまたは複数によって示すことができる。
【００６７】
ＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効なＩＲＭ化合物の正確な量は、ＩＲＭ化合物の物理的および化学的性質、キャリヤの性質、意図される投薬計画、被検者の免疫系の状態（例えば、抑制、不全、刺激）、ＩＲＭ化合物の投与方法、およびＤＮＡワクチンの効力を含むがこれらに限定されない当該技術分野において既知の因子に従って変化し得る。従って、全ての可能な用途に対してＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するために有効な量のＩＲＭ化合物を構成する量を一般的に示すことは実用的でない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して適切な量を容易に決定することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量において提供され得るが、いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、この範囲外の用量で提供されてもよい。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ＩＲＭ化合物は、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量、例えば約０．６ｍｇ／ｋｇの用量で提供され得る。
【００６９】
投薬計画は、少なくとも部分的に、ＩＲＭ化合物の物理的および化学的性質、キャリヤの性質、投与されているＩＲＭの量、被検者の免疫系の状態（例えば、抑制、不全、刺激）、ＩＲＭ化合物の投与方法、ならびにＤＮＡワクチンの効力および送達方法を含むがこれらに限定されない当該技術分野で既知の多くの因子に依存し得る。従って、全ての可能な用途に対してＤＮＡワクチンの効力を増大させるために有効な投与計画を一般的に示すことは実用的でない。しかしながら、当業者は、このような因子を十分に考慮して、適切な投与計画を容易に決定することができる。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、例えば１日１回〜約１回投与することができるが、いくつかの実施形態では、ＩＲＭ化合物は、この範囲外の頻度で投与されてもよい。特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、一週間に約１回から１日あたり約１回までで投与され得る。１つの特定の実施形態では、ＩＲＭ化合物は、３日ごとに１回投与される。
【００７１】
本発明の方法は、任意の適切な被検者において実施することができる。適切な被検者としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、または雌ウシなど（限定はされない）の動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００７２】
実施例
以下の実施例は、単に、本発明の特徴、利点、および他の詳細をさらに説明するために選択されている。しかしながら、実施例はこの目的を果たすが、使用される特定の材料および量、ならびに他の条件および詳細が、本発明の範囲を不当に限定し得る状況で解釈されてはならないことは明白に理解されるはずである。
【００７３】
ＩＲＭ化合物
実施例において使用されるＩＲＭ化合物は、表１に示される。
【００７４】
【表１】
【００７５】
実施例１ インビボの腫瘍成長
活性化ラットｎｅｕ遺伝子を含有するメスのＦＶＢ／Ｎマウス（カリフォルニア州ホリスターのチャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））を、標準的な明／暗療法（１２時間明：１２時間暗）の下で、特定の病原体がない状態に保持した。マウスをプラスチック製のメッキしていないケージ（１つのケージにつき４〜６匹のマウス）内に収容し、標準的なペレットフードおよび水道水を随意に与えた。
指示される最終濃度が得られるまでＩＲＭ化合物を０．２％のＤＭＳＯおよび水に溶解することによって、ＩＲＭ溶液を調製した。
【００７６】
ＣＭＶ真核生物プロモーターの制御下で細胞外および膜貫通ＨＥＲ−２／ｎｅｕ領域をコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭは記載されている（Ｙ．チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８年）、第５８巻、１９６５−１９７１頁）。プラズマ・ギガ（Ｐｌａｓｍａ Ｇｉｇａ）キット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用い、製造業者の使用説明書に従ってプラスミドＤＮＡの大量調製を実施した。
【００７７】
次のような：ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋ＩＲＭ１（ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭ１により処置）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋ＩＲＭ２（ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭ２により処置）、コントロール（免疫化なし、ＩＲＭによる処置なし）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭによる処置なし）、ＩＲＭ１（免疫化なし、ＩＲＭ１により処置）、およびＩＲＭ２（免疫化なし、ＩＲＭ２により処置）の処置グループ（ｎ＝１５）に動物を分けた。
【００７８】
ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭ ＤＮＡで免疫化した動物を、ヘリオス（ＨＥＬＩＯＳ）遺伝子銃システム（カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオ−ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用いて、粒子媒介の免疫療法的な送達によって８、１０、および１２週齢で免疫化した。それぞれのワクチン接種は２μｇのプラスミドＤＮＡ（２回の遺伝子銃ショット）を含み、製造業者の使用説明書に従って投与した。
【００７９】
ＩＲＭ化合物で処置した動物は、２００μＬの水中の０．６ｍｇ／ｋｇの化合物を腹腔内に受けた。これらのＩＲＭ化合物の受取りは、最初のＤＮＡ注射の２日前から開始して免疫化の期間中（８〜１２週齢）３日ごとに行われた。
【００８０】
ノギスにより２本の垂直な直径で腫瘍性の塊（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｍａｓｓ）を測定することによって、腫瘍の発生および成長を一週間に２回評価した。少なくとも３ｍｍの平均直径を有する腫瘍を発生していれば、マウスを腫瘍ありとして分類した。評価期間の最後に腫瘍の徴候のないマウスは、腫瘍なしと分類した。マウスあたりの触知可能な乳癌の平均数は、（発生腫瘍の累積数）／（マウスの総数）として計算した。
【００８１】
図１は、ワクチンだけで免疫化されたマウス、またはＩＲＭ１による処置と組み合わされたマウスにおいて、腫瘍なしのマウスの割合（上部）と、マウスあたりの触知可能な乳癌の平均数（下部）とを示す。
【００８２】
図２は、ワクチンだけで免疫化されたマウス、またはＩＲＭ２による処置と組み合わされたマウスにおいて、腫瘍なしのマウスの割合（上部）と、マウスあたりの触知可能な乳癌の平均数（下部）とを示す。
【００８３】
実施例２ 抗原特異性の細胞傷害アッセイ
実施例１に記載したように、動物を分類し、免疫化および／または処置した。Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、メリーランド州ゲイサーズバーグのギブコ（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））溶液中で６０ミクロンメッシュのふるいによって脾臓を収集して処置した。脾臓細胞をリンパ球Ｍ（カナダ国オンタリオ州ホーンビイのシダーレーン・ラボラトリーズ社（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）において分画し、密度勾配遠心分離（５００ｇ、２０分）によって単核細胞を分離した。勾配の界面からの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（メリーランド州ゲイサーズバーグのライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））中に再懸濁した。
【００８４】
刺激物質としてＮ２０２．１Ａ腫瘍細胞（ナンニ（Ｎａｎｎｉ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、第８７巻、１８６−１９４頁）（２０：１比の刺激物質：リンパ球）の存在下、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、メリーランド州ゲイサーズバーグのライフ・テクノロジーズ社）を含有するＲＰＭＩ媒体中で、脾細胞を３７℃および５％ＣＯ2で５日間インキュベートした。
【００８５】
カルボキシフルオレセインジアセテートの保存溶液（ｃ’ＦＤＡ、オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））（２０ｍｇ／ｍＬのアセトン、−２０℃で貯蔵）をＰＢＳ中に希釈して、７５μｇ／ｍＬの最終濃度を与えた。Ｎ２０２．１Ａ腫瘍細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に、１ｍＬの作用溶液中に細胞を再懸濁し、加湿した５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で３０分間インキュベートすることによってｃ’ＦＤＡにより標識化した。次に、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中に１×１０5細胞／ｍＬの濃度で懸濁された１％のＢＳＡ（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含有するＰＢＳ中で、標的細胞を３回洗浄した。
【００８６】
１×１０4のｃ’ＦＤＡ標識化腫瘍標的細胞を、９６ウェルの丸型マイクロタイタープレート（デンマーク、ロスキレのヌンク社（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において２００μＬの総体積で、エフェクター脾臓細胞と共にインキュベートした。１００：１〜１２．５：１の範囲であるエフェクター：標的細胞比を三重に試験した。加湿５％ＣＯ2インキュベータ中でプレートを３７℃で３時間維持し、次に７００ｇで５分間遠心分離した。プレートを急速に反転させ、上澄みをすばやく出すことによって細胞画分から上澄みを分離した。０．０５Ｍのホウ酸緩衝液、ｐＨ９．０中の１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００の１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを４℃で２０時間保持して可溶化させた。１４２０ビクター（ＶＩＣＴＯＲ）2マルチラベルカウンター（マサチューセッツ州ボストンのパーキンエルマー・ライフ・アンド・アナリティカル・サイエンシーズ社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））により蛍光についてプレートを読み取った。特異的な溶解（すなわち、抗原特異性の細胞傷害）の割合を以下のように計算した。
【数１】
式中、Ｆは、上澄みを除去した後の可溶化細胞の蛍光を表し、
Ｆmed＝媒体のみの中でインキュベートした標的からのＦであり、
Ｆexp＝エフェクター細胞と共にインキュベートした標的からのＦである。
【００８７】
結果は図４に要約される。
【００８８】
実施例３ 抗原特異性の体液性免疫
実施例１に記載したように、動物を分類し、免疫化および／または処置した。免疫化期間の完了の２週間後に、コントロールおよび実験動物から血清を収集した。血清を−８０℃で貯蔵し、フローサイトメトリーにより連続的に分析した。高レベルの腫瘍特異性の抗原ｐ１８５neuを発現する２×１０5Ｎ２０２．１Ａ細胞を、２％ＢＳＡおよび０．５％ナトリウムアジドが補充された冷ＰＢＳ（ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ）で２回洗浄した。次に、ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ中に１：１０で希釈した５０μＬのコントロールまたは免疫血清を用いて、標準的な間接免疫蛍光法手順で細胞を染色した。フルオレセイン結合ウサギ抗マウスＩｇ（カリフォルニア州サンディエゴのＥＭＤバイオサイエンシーズ社（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を二次抗体として使用した。細胞をアイソトン（Ｉｓｏｔｏｎ）ＩＩ中に再懸濁し、コールター・エピックス（ＣＯＵＬＴＥＲ ＥＰＩＣＳ）ＸＬ（カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））フローサイトメーターにより評価した。血清のＮ２０２．１Ａ結合能（Ｓｂｐ）、抗原特異性の体液性免疫応答の尺度を以下のように計算した。
Ｓｂｐ＝［（％T）（蛍光平均値）］−［（％C）（蛍光平均値）］×血清希釈度
式中、％Tは、試験血清中の陽性細胞のパーセントであり、
％Cは、コントロール血清中の陽性細胞のパーセントである。
【００８９】
結果は図３に要約される。
【００９０】
実施例４ 細胞内サイトカインの染色
脾細胞を実施例２に記載したように入手し、刺激物質としてＮ２０２．１Ａ腫瘍細胞（２０：１比の刺激物質：リンパ球）の存在下、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ媒体中で、３７℃および５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。細胞を収集し、ＰＥ結合抗ＣＤ４または抗ＣＤ８モノクローナル抗体（カリフォルニア州サンノゼのＢＤバイオサイエンシーズ、ベクトン、ディッキンソン社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））により５％ＦＣＳおよび０．０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ緩衝液中で染色した。次に、細胞を０．２％ホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎｅ）中で固定し、ＦＩＴＣ結合抗ＩＬ１０、抗ＩＬ−１２、または抗ＩＦＮ−γ（ＢＤバイオサイエンシーズ）により５％ＦＣＳおよび０．０５％ホルマリンを含有するＰＢＳ緩衝液中で連続的に染色した。コールター・エピックスＸＬフローサイトメーター（カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社）によって染色を評価した。
結果は図５に要約される。
【００９１】
実施例５
上記のように調製および送達した５０μｇまたは１００μｇのｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭワクチンにより、２、３０、および５８日目にアカゲザルを左上腕で免疫化する。免疫化部位において、ＩＲＭ化合物で処置される動物は、ＰＢＳ中に溶解した０．５ｍｇ／ｋｇのＩＲＭ１、もしくは０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのＩＲＭ３、ＩＲＭ４、ＩＲＭ５、またはＩＲＭ６、もしくは５０ｍｇ／ｋｇのＩＲＭ５を含有する皮内注射を受ける。これらのＩＲＭ化合物の受け取りは、０日目から開始して期間中３日ごとに行われる。１６、４５、および７２日目に血液を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ−γ産生細胞の数を測定する。ＩＦＮ−γ産生細胞の数は、ＩＲＭ用量に依存するように変動し得る。
【００９２】
実施例６
実施例５に記載したように、アカゲザルを分類し、免疫化および／または処置する。免疫化期間の完了の２週間後に、コントロールおよび実験動物から血清を収集する。血清を−８０℃で貯蔵し、フローサイトメトリーにより連続的に分析する。高レベルの腫瘍特異性抗原Ｈｅｒ−２を発現する２×１０5ＳＫ−ＢＲ−３細胞（バージニア州マナサス（Ｍａｎｎａｓａｓ）のＡＴＣＣ）を、２％ＢＳＡおよび０．５％ナトリウムアジドが補充された冷ＰＢＳ（ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ）で２回洗浄する。次に、ＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ中に１：１０で希釈した５０μＬのコントロールまたは免疫血清を用いて、標準的な間接免疫蛍光法手順で細胞を染色する。フルオレセインイストチオシアネート（ｉｓｔｈｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）結合ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソン・イムノリサーチ・ラブズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））を二次抗体として使用する。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液（カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｒｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（カリフォルニア州サンノゼのＢＤバイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））フローサイトメーターにより評価する。血清のＳＫ−ＢＲ−３結合能（Ｓｂｐ）、抗原特異性の体液性免疫応答の尺度は以下のように計算される。
Ｓｂｐ＝［（％T）（蛍光平均値）］−［（％C）（蛍光平均値）］×血清希釈度
式中、％Tは、試験血清中の陽性細胞のパーセントであり、
％Cは、コントロール血清中の陽性細胞のパーセントである。
Ｓｐｂは、ＩＲＭ用量に依存するように変化し得る。
【００９３】
実施例７
以下のグループ：（１）ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭによる処置なし（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、（２）ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭにより免疫化、ＩＲＭ２により処置（ＩＲＭ＋ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、または（３）未処置（コントロール）のそれぞれに対して、実施例１と同様にして動物を処置した。免疫化期間の完了の２週間後に、動物から血清を収集し、同じ処置を受ける動物の間でプールした。
【００９４】
１５０μＬのプール血清を８週齢の動物（５匹の動物／処置血清）に注入した。血清投与の２４時間後に、各マウスを１０5Ｎ２０２／１Ａ腫瘍細胞により皮下で攻撃し、腫瘍の発生を記録するためにモニターした。
【００９５】
結果は、図６に示される。ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭで免疫化されたマウスからの血清で処置した、より多い割合の動物は、コントロールマウスと比較して腫瘍がないままであった。ｐＣＭＶ−ＥＣＤ−ＴＭおよびＩＲＭ２で免疫化されたマウスからの血清で処置した、さらにより多い割合のマウスは、モニタリングの過程を通して、腫瘍がないままであった。
【００９６】
本明細書中で引用される特許、特許文献および刊行物の完全な開示は、それぞれが個別に援用されたかのように参照によってその全体が援用される。抵触の場合には、本明細書は、定義を含めて規制するものとする。
【００９７】
本発明に対する様々な変更および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかになるであろう。説明的な実施形態および実施例は例として提供されるだけであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１ａ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭが、腫瘍の防止（図１ａ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図１ｂ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭが、腫瘍の数の減少（図１ｂ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図２ａ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのもう１つのＩＲＭが、腫瘍の防止（図２ａ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図２ｂ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのもう１つのＩＲＭが、腫瘍の数の減少（図２ｂ）によって測定される場合にワクチンの効力を増大させることを示す。
【図３】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ワクチンによって誘発される抗原特異性の体液性免疫を増大させることを示す。
【図４】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ワクチンによって誘発される細胞傷害を増大させることを示す。
【図５ａ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、抗腫瘍サイトカインのＩＦＮ−γ（図５ａ）を産生するためにワクチンによって誘発される細胞の割合を増大させることを示す。
【図５ｂ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ＩＬ−２（図５ｂ）を産生するためにワクチンによって誘発される細胞の割合を増大させることを示す。
【図５ｃ】ＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンに対するアジュバントとしてのＩＲＭ化合物が、ＩＬ−１０（図５ｃ）を産生するためにワクチンによって誘発される細胞の割合を増大させることを示す。
【図６】ＩＲＭおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく乳癌ＤＮＡワクチンで処置したマウスからの血清が、レシピエントのマウスにおける腫瘍発生に対する保護を提供できることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＩＲＭ化合物
を含むＤＮＡワクチン組成物。
【請求項２】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、ヒトＨＥＲ−２タンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、ラットｐ１８５neuタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、マウスＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、マンマグロブリン−Ａの少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、ＭＵＣ１の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＩＲＭ化合物が、イミダゾキノリンアミンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＩＲＭ化合物が、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＩＲＭ化合物が、４−アミノ−α，α，２−トリメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＩＲＭ化合物が、ＴＬＲ８選択性アゴニストを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現ベクターおよび前記ＩＲＭ化合物が、別々の製剤において提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＮＡ組成物の効力を増大させるのに有効な量のＴＬＲ８選択性アゴニスト、
を含むＤＮＡワクチンアジュバント組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントが、イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＩＲＭ化合物が、チアゾロキノリンアミンを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＩＲＭ化合物が、２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＩＲＭ化合物が、２−プロピル−７−（ピリジン−３−イル）−チアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＩＲＭ化合物が、Ｎ−［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタンスルホンアミドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＩＲＭ化合物が、［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタノールを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含むＤＮＡワクチン。
【請求項２０】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を被検者において発生させる方法であって、
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＩＲＭ化合物
を含むワクチンで被検者を免疫化することを含む方法。
【請求項２１】
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を被検者において発生させる方法であって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＴＬＲ８選択性アゴニストである化合物
を含むワクチンで被検者を免疫化することを含む方法。
【請求項２２】
前記抗原ペプチドが、肝細胞癌関連ペプチド、子宮頸癌関連ペプチド、メラノーマ関連ペプチド、肺癌関連ペプチド、結腸癌関連ペプチド、乳癌関連ペプチド、膵癌関連ペプチド、または卵巣癌関連ペプチドである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌関連抗原ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、マンマグロブリン−Ａ、ＭＵＣ１、アルファフェトプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＴＲＰ−１、またはＶＥＧＦ２を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＲＭ化合物が、イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンを含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、チアゾロキノリンアミンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
被検者において乳癌を処置する方法であって、
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与すること；および
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を被検者に投与すること
を含む方法。
【請求項２７】
前記乳癌が、浸潤性乳癌または非浸潤性乳管癌を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
乳癌の処置が、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する体液性抗体を発生させること、乳癌腫瘍のサイズを減少させること、乳癌腫瘍の数を減少させること、あるいは非浸潤性乳管癌が浸潤性乳癌に進行する可能性を低下させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
被検者において癌を処置する方法であって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与すること；および
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＴＬＲ８選択性アゴニストを被検者に投与すること
を含む方法。
【請求項３０】
前記癌が、肝細胞癌、子宮頸癌、メラノーマ、肺癌、結腸癌、乳癌、膵癌、または卵巣癌を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌関連抗原ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、マンマグロブリン−Ａ、ＭＵＣ１、アルファフェトプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＴＲＰ−１、またはＶＥＧＦ２を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
癌の処置が、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する体液性抗体を発生させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の数を減少させること、腫瘍の発生を遅延すること、被検者の期待寿命を延長すること、あるいは抗原特異性の細胞傷害性Ｔリンパ球を発生させることを含む、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
乳癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用であって、前記ＤＮＡワクチンが、
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＩＲＭ化合物
を含む使用。
【請求項３４】
前記ＩＲＭ化合物が、ＴＬＲ８選択性アゴニストを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用であって、前記ＤＮＡワクチンが、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＴＬＲ８選択性アゴニストである化合物
を含む使用。
【請求項３６】
前記化合物が、イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンを含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記化合物が、チアゾロキノリンアミンを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
癌処置用組成物を調製する方法あって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を被検者に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの血清免疫応答を被検者に発生させること；および
被検者の血清の少なくとも一部を採取すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記癌が、肝細胞癌、子宮頸癌、メラノーマ、肺癌、結腸癌、乳癌、膵癌、または卵巣癌を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌関連抗原ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、マンマグロブリン−Ａ、ＭＵＣ１、アルファフェトプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＴＲＰ−１、またはＶＥＧＦ２を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
被検者において癌を処置する方法であって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを哺乳類に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を哺乳類に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの血清免疫応答を哺乳類に発生させること；
哺乳類の血清の少なくとも一部を採取すること；および
癌を処置するために有効な量で、前記哺乳類の血清の少なくとも一部を被検者に投与すること
を含む方法。
【請求項４２】
前記哺乳類の血清の一部が、臨床的に適切な癌関連抗原に対する抗体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項１】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＩＲＭ化合物
を含むＤＮＡワクチン組成物。
【請求項２】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、ヒトＨＥＲ−２タンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、ラットｐ１８５neuタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、マウスＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、マンマグロブリン−Ａの少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドが、ＭＵＣ１の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＩＲＭ化合物が、イミダゾキノリンアミンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＩＲＭ化合物が、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＩＲＭ化合物が、４−アミノ−α，α，２−トリメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＩＲＭ化合物が、ＴＬＲ８選択性アゴニストを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現ベクターおよび前記ＩＲＭ化合物が、別々の製剤において提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＮＡ組成物の効力を増大させるのに有効な量のＴＬＲ８選択性アゴニスト、
を含むＤＮＡワクチンアジュバント組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントが、イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＩＲＭ化合物が、チアゾロキノリンアミンを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＩＲＭ化合物が、２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＩＲＭ化合物が、２−プロピル−７−（ピリジン−３−イル）−チアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＩＲＭ化合物が、Ｎ−［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタンスルホンアミドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＩＲＭ化合物が、［３−（４−アミノ−２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−７−イル）フェニル］メタノールを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含むＤＮＡワクチン。
【請求項２０】
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を被検者において発生させる方法であって、
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＩＲＭ化合物
を含むワクチンで被検者を免疫化することを含む方法。
【請求項２１】
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を被検者において発生させる方法であって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＴＬＲ８選択性アゴニストである化合物
を含むワクチンで被検者を免疫化することを含む方法。
【請求項２２】
前記抗原ペプチドが、肝細胞癌関連ペプチド、子宮頸癌関連ペプチド、メラノーマ関連ペプチド、肺癌関連ペプチド、結腸癌関連ペプチド、乳癌関連ペプチド、膵癌関連ペプチド、または卵巣癌関連ペプチドである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌関連抗原ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、マンマグロブリン−Ａ、ＭＵＣ１、アルファフェトプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＴＲＰ−１、またはＶＥＧＦ２を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＲＭ化合物が、イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンを含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、チアゾロキノリンアミンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
被検者において乳癌を処置する方法であって、
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与すること；および
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を被検者に投与すること
を含む方法。
【請求項２７】
前記乳癌が、浸潤性乳癌または非浸潤性乳管癌を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
乳癌の処置が、臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドに対する体液性抗体を発生させること、乳癌腫瘍のサイズを減少させること、乳癌腫瘍の数を減少させること、あるいは非浸潤性乳管癌が浸潤性乳癌に進行する可能性を低下させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
被検者において癌を処置する方法であって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与すること；および
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＴＬＲ８選択性アゴニストを被検者に投与すること
を含む方法。
【請求項３０】
前記癌が、肝細胞癌、子宮頸癌、メラノーマ、肺癌、結腸癌、乳癌、膵癌、または卵巣癌を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌関連抗原ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、マンマグロブリン−Ａ、ＭＵＣ１、アルファフェトプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＴＲＰ−１、またはＶＥＧＦ２を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
癌の処置が、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する体液性抗体を発生させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の数を減少させること、腫瘍の発生を遅延すること、被検者の期待寿命を延長すること、あるいは抗原特異性の細胞傷害性Ｔリンパ球を発生させることを含む、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
乳癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用であって、前記ＤＮＡワクチンが、
臨床的に適切な乳癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＩＲＭ化合物
を含む使用。
【請求項３４】
前記ＩＲＭ化合物が、ＴＬＲ８選択性アゴニストを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
癌を処置するためのＤＮＡワクチンの製造におけるＩＲＭ化合物の使用であって、前記ＤＮＡワクチンが、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクター；および
ＴＬＲ８選択性アゴニストである化合物
を含む使用。
【請求項３６】
前記化合物が、イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２−架橋イミダゾキノリンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、またはテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンを含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記化合物が、チアゾロキノリンアミンを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
癌処置用組成物を調製する方法あって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを被検者に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を被検者に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの血清免疫応答を被検者に発生させること；および
被検者の血清の少なくとも一部を採取すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記癌が、肝細胞癌、子宮頸癌、メラノーマ、肺癌、結腸癌、乳癌、膵癌、または卵巣癌を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌関連抗原ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、マンマグロブリン−Ａ、ＭＵＣ１、アルファフェトプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＴＲＰ−１、またはＶＥＧＦ２を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
被検者において癌を処置する方法であって、
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドに対する免疫応答を発生させるために有効な量の、臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドをコードする発現ベクターを哺乳類に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの免疫応答を増強するために有効な量のＩＲＭ化合物を哺乳類に投与すること；
臨床的に適切な癌関連抗原ペプチドへの血清免疫応答を哺乳類に発生させること；
哺乳類の血清の少なくとも一部を採取すること；および
癌を処置するために有効な量で、前記哺乳類の血清の少なくとも一部を被検者に投与すること
を含む方法。
【請求項４２】
前記哺乳類の血清の一部が、臨床的に適切な癌関連抗原に対する抗体を含む、請求項４１に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５１５９２８（Ｐ２００８−５１５９２８Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５９０９（Ｐ２００７−５３５９０９）
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３６５９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２２５４
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５９９０５６４３７）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (1,802)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３６５９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２２５４
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５９９０５６４３７）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (1,802)
【Ｆターム（参考）】
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