ＤＮＡ一本鎖切断を検出する方法
真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を検出する方法であって、（ａ）真核細胞サンプルを水溶性テトラゾリウム塩に、テトラゾリウム塩がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で細胞サンプルにおいてホルマザン染料に変換する条件の下で、接触させるステップと、（ｂ）細胞サンプル中のホルマザン染料の存在を検出するステップであって、ホルマザン染料のレベルの減少が真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断の増加レベルを示す、ステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立環境衛生科学研究所の後援を受けている研究の過程でなされた（NIEHS認可番号P30-ES10126、R42-ES11746-02、およびP42-ES05948）。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、ＤＮＡ内の一本鎖切断(single stranded breaks)の迅速な検出のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞内のＤＮＡは、内因性および外因性のアルキル化剤および酸化ストレスを受けることからの損傷に絶えず晒されている。塩基除去修復(base excision repair)は、これらの有害なＤＮＡ損傷の大部分の除去のための主たる責任を担っているように思われる(Wood(1996)Annu.Rev.Biochem.65:135-167)。これらの因子(agent)によって誘発されたＤＮＡ損傷に加えて、自発的な脱プリン化／脱ピリミジン化(depyrimidination)が、生理的条件の下で有意な量の脱プリン部位／脱ピリミジン(apyrimidinic)（ＡＰ）部位を導入させることがあり得る(Nakamura,et al.(1998)Cancer Res.58:222-225)。アルデヒド反応性プローブおよびスロットブロット技法の組み合わせを用いて、生理的条件の下での自発的な脱プリン化速度は、１日につき１細胞毎に９０００個のＡＰ部位に対応する、１日につき１０6個のヌクレオチド毎に１．５個のＡＰ部位であることが判明した(Nakamura,et al.(1998)Cancer Res.58:222-225)。修正された塩基およびＡＰ部位は、塩基除去修復経路の中間体として一本鎖切断ＤＮＡを導入させる(Krokan,et al.(1997)Biochem.J.325:1-16)。このプロセスでは、ＤＮＡグリコシラーゼは、修正された塩基またはさらには通常の塩基とデオキシリボースとの間のＮ−グリコシリック(glycosylic)結合を裂き、ＡＰ部位をそのままにする(Krokan,et al.(1997)Biochem.J:325:1-16;Lindahl(2000)Mutat.Res.462:129-135)。ＤＮＡグリコシラーゼによって生成されたＡＰ部位は、その後クラスＩＩ Ａｐエンドヌクレアーゼによって開裂され(DempleおよびHarrison(1994)Annu.Rev.Biochem.63:915-948)、結果として３’−ヒドロキシル基および５’−デオキシリボースホスフェート（５’−ｄＲｐ）を生じる。ＤＮＡポリメラーゼβ（β−ｐｏｌ）による５’−ｄＲｐの切除の後に、β−ｐｏｌおよびＤＮＡリガーゼのそれぞれポリメラーゼ活性およびリガーゼ活性によって、修復が完了する。さらに、反応性酸素種（ＲＯＳ:reactive oxygen species）もまた、デオキシリボースの水素除去によって損傷を誘発し、酸化されたＡＰ部位ならびにＤＮＡ一本鎖切断をしばしば作り出す(Breen and Murphy(1995)Free Radic.Biol.Med.18:1033-1077)。Ｂ型二本鎖ＤＮＡでは、デオキシリボースのＣ−４’およびＣ−５’位における水素原子は、ＲＯＳに最もアクセスでき(Von Sonntag(1987)In:The Chemical Basis of Radiation Biology,pp.238-249,Taylor and Francis,London)、それぞれ３’−末端および５’−末端の損傷を生じさせる。そのために、ＤＮＡの一本鎖切断は、生理的条件の下でさえ哺乳動物細胞での最も頻繁なＤＮＡ損傷の１つである。単一細胞アガロースゲル電気泳動、すなわちコメットアッセイは周知であり、一本鎖切断およびその修復の量を評価するための高感度アッセイである(Tice,et al.(2000)Environ.Mol.Mutagen.35:206-221)。しかしながら、このアッセイは、後になされるゲル電気泳動のためにＤＮＡを変性させるアルカリ性条件を通常必要とする。アルキル化剤および酸化剤は、アルカリで不安定な塩基損傷またはＡＰ部位を導入させ、基本条件の下で一本鎖切断をもたらす(Burrows and Muller(1998)Chem.Rev.98:1109-1152;Miyamae,et al.(1997)Mutat.Res.393:107-113)。したがって、一本鎖切断の人為的な形成が、ＤＮＡ抽出の間にもたらされるかもしれない。そのため、単離された細胞ＤＮＡを使った場合、一本鎖切断の数およびその修復における不均衡を正確に決定することは難しい。
【発明の開示】
【０００４】
一般に、ＤＮＡの一本鎖切断修復の不均衡を検出する高感度で信頼性が高くリアルタイムな方法で、細胞内のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの消耗を通してポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）活性化を間接的に測定する方法が、今や見いだされている（図１）。本発明は、以下においていっそう詳細に説明される。
【０００５】
本発明は、細胞または細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の増加レベルを検出する方法を提供する。本方法は、（ａ）細胞を水溶性のテトラゾリウム塩に、テトラゾリウム塩がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で細胞内においてホルマザン染料に変換される条件の下で、接触させるステップと、（ｂ）細胞内のホルマザン染料の存在を検出するステップであって、ホルマザン染料のレベルの減少（例えば、同一の接触条件および同一の検出条件の下で標準細胞またはコントロール細胞内で生成したホルマザン染料のような任意の適切な基準と比較した場合の「減少」）が細胞内のＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を示す、ステップとを含む。ホルマザン染料は、水溶性であっても非水溶性であってもよい。しかし、水溶性のホルマザン染料を使用するには、検出するステップの前に細胞を溶解する必要がある。特定の実施形態では、細胞は生きている細胞、または生きている細胞の培養物またはサンプルである。接触させステップは水溶液で実行されるのが好ましく、検出するステップは、ＵＶ吸光度（本明細書ではＵＶ透過率を検出することと同じものとして扱われる）を検出するような任意の適切な手段で実行することができる。
【０００６】
１つの実施形態では、テスト化合物は、接触させるステップの前または接触させるステップの間に細胞に接触させ、一本鎖切断のレベルの増加は、テスト化合物が細胞に遺伝毒性(genotoxic)があることを示し、一本鎖切断のレベルの減少は、テスト化合物が細胞を保護するもの(protective)であることを示す。細胞は、接触させるステップの前または接触ステップの間に酸化ストレスを受け得る。テスト化合物は、接触させるステップの前または接触させるステップの間に細胞に接触させ、一本鎖切断のレベルの増加は、テスト化合物が酸化ストレスを悪化させる(exacerbate)ことを示し、一本鎖切断のレベルの減少は、テスト化合物が酸化ストレスに対して保護するものであることを示す。
【０００７】
別の実施形態では、細胞が植物被検体または動物被検体から集められ、遺伝毒性のある化合物に接触する場合、細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の量は、遺伝毒性のある化合物に接触させていない同様の細胞の当該量と比較され、遺伝毒性のある化合物に対する当該被検体の感受性を決定する。
【０００８】
さらに別の実施形態では、細胞が植物被検体または動物被検体から集められ、酸化ストレスにさらす場合、細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の量は、酸化ストレスにさらされていない同様の細胞の当該量と比較され、酸化ストレスに対する当該被検体の感受性を決定する。
【０００９】
本発明の前記の目的、他の目的および態様は、以下に記載される明細書で詳細に説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書で用いられる「アルキル」は、一般的に低級アルキル(loweralkyl)またはＣ１〜Ｃ４アルキルをいい、メチル、エチル、プロピルおよびブチルを含むが、これらに限定されない。
【００１１】
本明細書で用いられる「アルコキシ」は、一般的に低級アルコキシ(loweralkoxy)またはＣ１〜Ｃ４アルコキシをいい、メチル、エチル、プロピルおよびブチルを含むが、これらに限定されない。
【００１２】
本明細書で用いられる「アルカリ金属」は、ナトリウムおよびカリウムを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ナトリウムである。
【００１３】
本明細書で用いられる「ハロゲン」は、任意の適切なハロゲン原子であり、フルオロ、ブロモ、クロロ、ヨードを含むが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書で用いられる「細胞」は、任意のタイプの細胞をいい、好ましくは植物細胞および動物細胞を含む真核細胞である。適切な細胞としては、酵母細胞および哺乳動物細胞（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ヒト）が含まれる。細胞は、どの組織タイプのものであってもよく、皮膚、血などが含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書で用いられる「酸化ストレス」は、任意のタイプの酸化ストレスをいい、細胞内でフリーラジカルを発生させるイオン化放射能、化合物にさらされることなどを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書で用いられる「遺伝毒性のある」は、細胞内での核酸の分裂または破壊のために有毒な化合物をいい、例えば、発癌性化合物および催奇性化合物を含むことが意図されている。
【００１７】
出願人は、本明細書で引用した全ての米国特許で開示されたものが、引用によりその全体として本明細書に組み込むことを特に意図する。
【００１８】
水溶性または非水溶性のホルマザン染料を作り出す水溶性のテトラゾリウム塩は公知であり、以下に記載されている。例えば、米国特許第6,063,587号Ishiyama et al;米国特許第5,185,450号Owen;D.A.Scudiero,R.H.Shoemaker,K.D.Paull,A.Monks,S.Tierney,T.H.Nofziger,M.J.Curens,D.Seniff,M.R.Boyd,Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Tumor Cell Lines,Cancer Res.48,4827(1988);N.W.Roehm,G.H.Rodgers,S.M.Hatfield,A.L.Glasebrook,An Improved Colorimetric Assay for Cell Proliferation and Viability Utilizing the Tetrazolium Salt XTT,J Immunol.Methods,142,257(1991);M.G.Stevens,S.C.Olsen,Comparative Analysis of Using MTT and XTT in Colorimetric Assays for Quantitating Bovine Neutrophil Bactericidal Activity,J Immunol.Methods,157,225(1993)。
【００１９】
１つの実施形態では、Ishiyama et al.の米国特許第6,063,587号で明らかにされたように、このようなテトラゾリウム塩は、下記の一般式の化合物のようなスルホン化テトラゾリウム塩である。
【化１】
式中、Ａ、ＢおよびＣは、独立して選択された（例えば、１箇所または２箇所における、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシなどのような独立して選択された基による）置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基（例えば、フェニル）であり、Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つが、ＳＯ3-で少なくとも１箇所（好ましくは２箇所）置換されている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、テトラゾリウム塩は、下記の一般式を有する。
【化２】
式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素またはニトロを表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。
【００２１】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、下記の一般式を有する。
【化３】
式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基またはハロゲン原子を表す。Ｒ3は、アルキル基またはアルコキシル基を表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。
【００２２】
水溶性のテトラゾリウム塩の他の例としては、Owenの米国特許第5,185,450号に記載のように、側鎖としてそのテトラゾリウム環に付いたナフタレン環であって、２つのスルホネート基を有するナフタレン環（例えば、２−ナフチル−６，８−ジスルホネート）を有するテトラゾリウム化合物、またはそのテトラゾリウム環に付いた側鎖であって、１つのスルホネート基およびオキシ酢酸基またはホスホモノエステル(phosphomonoester)基からなる群から選択されるスルホネート基より弱い酸の１つの基を有し、その化合物および関連するホルマザンを水溶性とする側鎖を有するテトラゾリウム化合物である。
【００２３】
１つの実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＷＳＴ−８、すなわち２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩である。
【００２４】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＷＳＴ−１、すなわち４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］１，３−ベンゼンジスルホネートである。
【００２５】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＸＴＴ、すなわち２，３−ビス［２−メトキシ（ｍｅｔｈｙｏｘｙ）−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリドである（また、「（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシ−アニリド内塩」とも呼ばれる。）。
【００２６】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＭＴＳ、すなわち３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩である。
【００２７】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＭＴＴ、すなわち３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物である。（ＭＴＴは、水溶性の染料を生成するが、検出するステップまたは決定するステップの前に細胞を溶解させることによって、使用することができる。）
【００２８】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＷＳＴ−３、すなわち２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、ナトリウム塩；ＷＳＴ−４、すなわち２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル−カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム；あるいはＷＳＴ−５、すなわち２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、ジナトリウム塩である。
【００２９】
ＤＮＡの一本鎖切断は、酸化ストレスまたは塩基除去修復経路によって生み出される、ゲノムＤＮＡでの最も頻繁な損傷の１つである。ＤＮＡの一本鎖切断は、ＰＡＲＰ−１の活性化を誘発する(Lautier,et al.(1993)Mol.Cell Biochem.122:171-193;de Murcia,et al.(1994)Mol.Cell Biochem.138:15-24)。これにより、細胞内のＮＡＤ+が消耗される(Berger(1985)Radiat.Res.101:4-15)。さらに、細胞内のＮＡＤ+の減少は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨだけでなく、ＡＴＰを消耗させる(Carson,et al.(1986)Exp.Cell Res.164:273-281;OleinickおよびEvans(1985)Radiat.Res.101:29-46)。したがって、本発明は、本明細書でＮＡＤ（Ｐ）Ｈと呼ばれるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの細胞内のレベルを測ることによって、細胞内での一本鎖切断ＤＮＡを検出するための方法を提供する。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明の方法は、生検標本、組織、細胞または液体（例えば、全血または血漿）のようなサンプルを被検体から得るステップと、そのサンプルを水溶性のテトラゾリウム塩と接触させるステップと、テトラゾリウム塩のホルマザン染料への還元を介してサンプル内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを測定するステップとにより実行される。ホルマザン染料の形成は、任意の標準的な分光光度計の使用のような任意の適切な技法によって測定される。分光光度計は、同時に多数のサンプルを読むことができるものが好ましい（例えば、９６−ウエルプレートリーダー）。サンプル内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルは、コントロールと比較されるか、または一定の時間（例えば、３０分から４時間または８時間）にわったてモニターされて、ＤＮＡの一本鎖切断修復メカニズムに不均衡があるかどうかを評価することができる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルが減少しているサンプルは、ＰＡＲＰ活性化、すなわち、サンプルが得られた被検体の中でＤＮＡの一本鎖が切断されていることを示している。したがって、一本鎖切断ＤＮＡを検出するための方法は、ＤＮＡ損傷因子に晒されていると思われる被検体の選別の一部として用いることができる。さらに、本発明の検出方法は、単独で、またはＤＮＡ一本鎖切断を確認するための他の周知の診断方法と組み合わせて使うことができる。
【００３１】
ＤＮＡでの一本鎖切断は、遺伝関連または年齢関連の基礎をなすことがあり、またはアルキル化によってＤＮＡ付加物を生成するものを含む因子に晒されることの結果として生じ得る。例えば、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン（ＭＮＮＧ）、ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）、ジメチルスルフェート）；反応性酸素種（例えば、過酸化物）；ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジンおよびアミノプリンのような塩基アナログ；または紫外線およびイオン化放射能（例えば、Ｘ線およびγ線）のような照射である。
【００３２】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することによって決定される細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の検出は、医療実験および他の処置の間に治療の効果をモニターするのに有用である。したがって、細胞内でＤＮＡ一本鎖切断を引き起こすように設計された放射線療法のための放射性核種(radionucleide)または化学療法のための細胞毒性薬のような因子の治療効果は、最終標的としてのＰＡＲＰの活性化、すなわちＮＡＤ（Ｐ）Ｈの還元を用いてモニターされ得る。
【００３３】
さらに、本発明の検出方法は、一本鎖切断の修復または塩基除去修復のいずれかの減少した能力について個人を選別するために使うことができる。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、サンプル中のＤＮＡ損傷因子を検出する方法を提供する。サンプルは、生体由来または環境由来のいずれでもよい。生体サンプルとしては、上記で与えられたもの、ならびに乳製品、野菜、肉類および肉類副産物のような食品および原料および廃棄物が挙げられる。環境サンプルとしては、表面物質、土壌、水、廃水、下水、汚泥、工業サンプル（例、工業用水）のような環境物質ならびに、食品加工および乳製品加工の器具、装置、設備、使い捨て商品および使い捨てでない商品から得られるサンプルが挙げられる。これらの環境サンプルの他に、飲料水を本発明の方法で使うことができると考えられる。飲料水という用語には、ヒトおよび他の動物による消費のために使われるあらゆるタイプの水が含まれ、井戸水、廃水、貯水池、川、小川などに貯められた水などが挙げられるが、これらに限定されないことが意図されている。本方法は、ＤＮＡ損傷因子を有すると推測されるサンプルとテスト細胞とを接触させ、そのサンプルの存在下でテスト細胞をインキュベートし、当該細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを測定することにより、テスト細胞内でＤＮＡ一本鎖切断が生じたかどうかを検出する。さらに、ＸＲＣＣ１欠損細胞、ＡＰエンドヌクレアーゼ欠損細胞、ＤＮＡグリコシラーゼ−欠損細胞、ＤＮＡリガーゼ欠損細胞またはＤＮＡポリメラーゼヌル変異体細胞のような塩基除去修復欠損細胞系をＤＮＡ損傷因子にさらし、当該因子により誘発されたＤＮＡ損傷が塩基除去修復によって修復されるかどうかを決定することができる。細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することにより、細胞内でのＤＮＡ一本鎖切断を検出する方法は、本明細書で提供される。さらに、ＤＮＡ修復のプロセスは、たいていＤＮＡ合成を必要とするので、ヒドロキシウレアのようなＤＮＡ合成インヒビターと組み合わされるこの細胞ベースの方法は、ＤＮＡ損傷因子により誘発されたＤＮＡ ＳＳＢの蓄積を促進する。したがって、この応用により、研究者は、通常のＤＮＡ修復熟達(repair-proficient)細胞を使ってＤＮＡ損傷因子を高感度で都合よく検出することができるようになる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、ＤＮＡ修復酵素の活性化を調節する因子を識別する細胞ベースの方法を提供する。平静な(unperturbed)細胞では、ＰＡＲＰのようなＤＮＡ修復酵素は、不活性の状態にある。ＤＮＡ一本鎖切断の際、これらの酵素は活性化し、ＰＡＲＰの場合は同時にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの還元をもたらす。したがって、ＰＡＲＰの活性化を調節する因子は、細胞を因子に接触させるステップと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定するステップとにより、スクリーニングアッセイにおいて同定される。さらに、当該アッセイは、テトラゾリウム塩を添加する前の洗浄し、テトラゾリウム塩と相互作用し得る残存する因子を除去するステップを含んでもよい。ＰＡＲＰ活性化は、活性化をブロックし、阻害し、または減少させるだけでなく、刺激し、促進し、または活性化の速度もしくは量を増加させることにより調節することができる。インヒビターのための一般的なスクリーニングアッセイには、因子およびメチルメタンスルホネートのような遺伝子毒を平静な細胞に接触させるステップと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することによりＰＡＲＰの活性化を当該因子がブロックまたは阻害するかどうかを決定するステップとが含まれる。ＰＡＲＰ活性化を阻害する因子は、多様なヒトの腫瘍の処置における放射線増感剤または化学増感剤(chemosensitizers)として有用である。エンハンサーのための一般的なスクリーニングアッセイには、因子を平静な細胞に接触させるステップと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することにより当該因子がＰＡＲＰの活性化を促進または刺激するかどうかを決定するステップとが含まれる。ＰＡＲＰの活性化を促進または活発にする因子は、癌細胞に対する化学療法薬剤として役立つ。細胞内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定するための方法は、本明細書において提供される。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、癌化学療法薬剤だけではなく、抗ＨＩＶ薬のためのＤＮＡ合成インヒビターを同定する細胞ベースの方法を提供する。前述したように、大部分のＤＮＡ修復経路は、損傷を受けた塩基またはヌクレオチドの除去の後にＤＮＡ合成を必要とする。したがって、ＤＮＡ損傷因子とこの細胞ベースのアッセイとの組み合わせにより、４時間以内にＤＮＡ合成を妨害する化学物質またはタンパク質を効率的に選別することができる。ＤＮＡ合成インヒビターは、抗ＨＩＶ剤として有用であることが知られているので、この方法は、ＨＩＶ関連の研究に適用することができる。
【００３７】
本明細書で提供されるスクリーニングアッセイを用いて選別され得る因子には、多くの化学物質の種類が含まれる。それらは、一般的に有機分子であるが、好ましくは１００ダルトンより大きく、約２５００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機化合物である。
【００３８】
因子は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含む。その官能基の例としては、一般的に、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基が挙げられ、少なくとも２つの官能化学基があることが好ましい。当該因子は、しばしば、１以上の上記の官能基で置換された環状炭素もしくはヘテロ環状構造物および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。因子はまた、ペプチド、抗体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログまたは組み合わせを含む生体分子の間で見いだすことができる。このような因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーまたは組み合わせライブラリーを含む多様なソースから得ることができる。
【００３９】
他の種々の試薬を、スクリーニングアッセイに含めることができる。この例としては、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、および／または非特異性相互作用またはバックグラウンド相互作用を減らすために使うことのできる塩、中性タンパク質（例、アルブミン）、洗浄剤などのような試薬が挙げられる。また、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのようなアッセイの効率を別の方法で改善する試薬を用いることもできる。必要な結合を提供する成分の混合物を、任意の順序で添加することができる。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、サンプル中のＤＮＡ損傷因子を検出するためのキットを提供する。キットには、テトラゾリウム塩が含まれる。キットには、さらにテスト細胞を含むことができる。さらに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在量を標準と比較するための手段をキットの中に提供することができる。キットは適切な容器でパッケージされて、さらに上記の方法を実行するための説明書のようなＤＮＡ損傷因子を検出するためのキットを使用するための説明書（例、印刷された説明書）を含めることができる。
【００４１】
１つの実施形態では、（ｃ）ホルマザン染料の検出された存在から、細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の量を定量的に示すステップを、前記検出するステップの後に含む。この示すステップは、任意の適切な技法により実行することができる。例えば、選択された細胞で検出されたホルマザン染料のレベルをコントロール細胞でのホルマザン染料のレベルと比較することによって、経時的に形成されたホルマザン染料の量を決定することよって、他の知られている標準と比較することによって、または他の任意の適切な技法などである。
【００４２】
本方法は、リアルタイム手法で実行される。すなわち、抽出するステップを行わずに、生きている細胞を用いて、および経時的に同一の細胞または細胞サンプルから受ける多数の測定により連続的に、生きている細胞のサンプルをモニターすることができる。さらに、（装置の感度により）500,000個未満の細胞、200,000個未満の細胞、100,000個未満の細胞、10,000個未満の細胞、および1,000個未満の細胞であっても、アッセイのために必要とされる。最終的に、アッセイのステップは、現在利用可能な技法に必要とされる時間と比較すると、例えば、４時間、３時間、２時間未満、または１時間未満以内であっても、迅速に実行することができる。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を例証するために記載されており、本発明を限定すると解釈するべきではない。
【実施例】
【００４４】
［実施例１：細胞培養］
ＸＲＣＣｌが十分な(proficient)ＣＨＯ細胞およびＸＲＣＣｌ欠損ＣＨＯ細胞(Taylor,et al.(2002)Mol.Cell.Biol.22:2556-2563)を、１０％のウシ胎児血清（Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）、１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したα−最小必須培地（INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad、米国カリフォルニア州）で、単層として培養した。ＰＡＲＰ−１+/+およびＰＡＲＰ−１-/-由来の固定化マウス胎児線維芽細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地、１０％のウシ胎児血清および０．５％のゲンタマイシン(Schreiber,et al.(2002)J Biol.Chem.277:23028-23036)を補充した４．５ｇ／リットルのグルコース培地（INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad、米国カリフォルニア州）で維持した。ヒトリンパ芽球様細胞（GM15030、GM15061、GM15237、GM15268、GM15339、GM15349、GM15365およびGM15380；Coriell Cell Repositories、Camden、米国ニュージャージー州）を、１５％のウシ胎児血清（Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）、１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad、米国カリフォルニア州）で増殖させた。その細胞を５％のＣＯ2および９５％の空気の湿潤雰囲気で３７℃において維持した。
【００４５】
［実施例２：細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの検出］
水溶性テトラゾリウム塩を使い、ホルマザン染料への還元を通して細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を測定した。培地で生存能力のある細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの全体の量を、分光光度計によって周期的に決定した。細胞を９６ウエルプレート（ＣＨＯ細胞およびマウス線維芽細胞：５×１０3細胞／ウエル；リンパ芽球様細胞：１５×１０3細胞／ウエル）に播種し、上記のウシ胎児血清および抗生物質を含む１００μＬの培地で培養した。３０分のインキュベーションの後に、細胞を、指示された濃度のＭＭＳならびに水溶性の２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−８；５ｍＭ）および電子メディエーターとして１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（１−メトキシＰＭＳ；０．２ｍＭ）からなる１／１０体積のＣＣＫ−８溶液（Dojindo Molecular Technology、Gaithersburg、米国メリーランド州）で処理した。各ウエルの中の細胞を、さらに最高４時間まで培養した。ＷＳＴ−８は、１−メトキシＰＭＳのような電子キャリア、ジアフォラーゼ、フラビン酵素の存在下で、または直接ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって、その生体還元を介して水溶性で黄色のホルマザン染料を生成した。したがって、テトラゾリウム塩の還元は、主に細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量に依存している。培地で生きている細胞によって作り出されたホルマザン染料の量を、分光光度計によりコントロールの値と比較して、約３０分ごとに決定した。吸光度を、６５０ｎｍの参照フィルターを用い、４５０ｎｍにおいて９６−ウエルプレートリーダーに記録した。培地ブランクを培地およびＣＣＫ−８反応溶液だけで調製した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみで処理された細胞を含むウエルの吸光度に対するＭＭＳで処理された細胞を含むウエルの吸光度を比較することにより、細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を算定した。
【００４６】
細胞死をトリパンブルー染色で決定した。細胞を０、０．７５および１．５ｍＭにおけるＭＭＳにより１〜４時間の間で処理された。トリプシン化(trypsinization)の後に、細胞を標準的なトリパンブルー染料排除アッセイを使って染色した。
【００４７】
ＸＲＣＣ１は、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ１）、ＤＮＡ Ｐｏｌ−β、ＤＮＡリガーゼIII、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）およびＰＡＲＰ−１を含む他の塩基ベース切除修復関連タンパク質との相互作用のために骨格(scaffold)として機能する(Caldecott,et al.(1996)Nucl.Acids Res.24:4387-4394;Whitehouse,et al.(2001)Cell 104:1-11;Kubota,et al.(1996)EMBO J.15:6662-6670;Caldecott,et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14:68-76;Caldecott,et al.(1995)Nucl.Acids Res.23:4836-4843)。ＸＲＣＣ１は、哺乳動物細胞において効率的な一本鎖切断修復および遺伝子安定性のために必要とされる。ＸＲＣＣ１欠損であるげっ歯類の細胞は、ＤＮＡ損傷因子に過敏である(Whitehouse,et al.(2001)Cell 104:1-11;Kubota,et al.(1996)EMBO J 15:6662-6670;Caldecott,et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14:68-76)。ＸＲＣＣ１の損失はまた、自発的および／または誘発された染色体転位および染色体欠失が起こる頻度が多くなることも含めて、遺伝子の安定性を減少させることももたらす(Caldecott,et al.(1995)上記;Carrano,et al.(1986)Mutat.Res.162:233-239;Dominguez,et al.(1998)Mutat.Res.398:67-73;Thompson,et al.(1982)Mutat.Res.95:427-440;Veld,et al.(1998)Mutat.Res.398:83-92;Zdzienicka,et al.(1992)Mutagenesis 7:265-269)。細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルの量をモニターするために、水溶性テトラゾリウム塩を使って、ＸＲＣＣ１が十分(proficient)または不十分のいずれかの同質遺伝子(isogenic)ＣＨＯ細胞系をＭＭＳにさらした。使われた細胞系は、一本鎖切断修復欠損細胞として空のｐｃＤ２Ｅベクター（ＥＭ９−Ｖ）を発現し、一本鎖切断修復熟達細胞として野生型のヒトＸＲＣＣ１（ｐｃＤ２ＥＸＨ）（ＥＭ９−ＸＨ５）を発現するＸＲＣＣｌ欠損ＣＨＯ ＥＭ９細胞であった(Whitehouse,et al.(2001)Cell 104:1-11)。これらの細胞を様々な濃度のＭＭＳに４時間さらした。トリパンブルー排除アッセイは、どの濃度におけるＭＭＳ処理においても主要な細胞死を全く実証しなかったが、両方の細胞系における細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、用量依存手法におけるＭＭＳでの処理により、有意に減少させた（図２、パネルＡ）。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を示すこれらのデータは、生存能力のある細胞の数の減少によるものである。
【００４８】
細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少において早期の段階で起きることをモニターするために、測定をＭＭＳに晒した４時間の間で約３０分ごとに行った。ＣＣＫ−８は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの実証のために細胞溶解を必要としないので、リアルタイムＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイを ９６−ウエルプレートリーダーを用いて行った。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少は、ＥＭ９−Ｖ細胞をＭＭＳにさらしている間の３０分ぐらいの早期に検出された（図２、パネルＢ）。ＥＭ９−ＸＨ５細胞に対するＥＭ９−Ｖ中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比をＭＭＳにさらした時間の関数としてプロットしたものは、その比が１時間以内に安定期に達したことを示した（図２、パネルＣ）。したがって、引き続いてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定をＭＭＳにさらした細胞で１〜４時間の間で行った。本明細書で提供された方法の再現性は、図２、パネルＤに示される。細胞をＭＭＳへ４時間晒して、４つの独立した実験を行った。
【００４９】
［実施例３：ＰＡＲＰインヒビターの存在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少］
ＰＡＲＰは、ＤＮＡ一本鎖切断によるその活性化を介して、ＡＤＰ−リボースの数百の分岐鎖を核タンパク質に転換する(Kubota,et al.(1996)上記;Caldecott,et al.(1994)上記)。大量のＤＮＡ損傷の下で、ＰＡＲＰの活性化は、その基質ＮＡＤ+を消耗する(Taylor,et al.(2002)上記)。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、デヒドロゲナーゼとその基質との反応によってＮＡＤ（Ｐ）から生成されるので、ＮＡＤ（Ｐ）の量の減少によりＮＡＤ+が消耗される。ＮＡＤＨの減少が、ミトコンドリア機能の減少によるものか、またはＰＡＲＰ活性化によるＮＡＤ+の消耗によるものかどうか決定するために、ＣＨＯ細胞をＭＭＳおよび特定のＰＡＲＰインヒビターに共にさらした。特定のＰＡＲＰインヒビターである３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ；Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）（１０ｍＭ）および３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ；Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）（９０μＭ）を、ＭＭＳ処理の前に１〜２時間添加し、細胞が分析されるまでＭＭＳにさらしている間に培地を維持した。３−ＡＢおよびＤＰＱは、ＥＭ９−ＶおよびＥＭ９−ＸＨ５細胞系の両方において、ＭＭＳで誘発された細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の減少をほとんど完全に妨げた（図３、パネルＡおよびＢ）。これらの結果により、４時間ＭＭＳにさらしたＣＨＯ細胞での細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少が、一本鎖切断の形成を介したＰＡＲＰ活性化を理由とするものであったことが示された。
【００５０】
［実施例４：ＰＡＲＰ−１-/-細胞内でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少］
ＰＡＲＰ−１-/-細胞およびＰＡＲＰ−１+/+細胞をＭＭＳにさらし、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少が、ＰＡＲＰ活性化によるものかどうか決定した。ＭＭＳは、ＰＡＲＰ−１+/+細胞内でＮＡＤ（Ｐ）Ｈを減少させた（図４、パネルＡ）。ところが、ＰＡＲＰ−１-/-細胞は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少に抵抗をもっと示した（図４、パネルＢ）。さらに、３−ＡＢは、ＭＭＳに晒される際のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少からＰＡＲＰ−１+/+細胞を保護した。ＰＡＲＰ−１-/-細胞でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのわずかな減少は、ミトコンドリア機能の減少によるものとされている。
【００５１】
［実施例５：コメットアッセイに対してのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ決定アッセイ］
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する本発明の方法と一本鎖切断の検出のためのコメットアッセイとの間の直接の比較を行った。コメットアッセイのためのスライドを周知の方法により調製した(Tennant,et al.(2001)Mutat.Res.493:1-10)。簡単にいえば、スライドをアガロースに浸漬し、６０℃で乾燥する。低融点アガロース（０．５％）を調製し、４２℃に保つ。細胞懸濁液（１×１０4細胞／１０μＬ）を１９０μＬの低融点アガロースと混合した。９０μＬのこの懸濁液を各２つのスライド上にピペットで取り、カバーグラスで覆った。各スライドを５分間氷の上に置き、カバーグラスをはずして、９０μＬの低融点アガロースを各スライド上にピペットで取り、カバーグラスを再び被せて、スライドを氷に戻した。５分後、カバーグラスをはずして、スライドを、２．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＮａサルコシネート、１％のTRITON(登録商標)X-100および１０％のジメチルスルホキシドを含有する溶解緩衝液（ｐＨ１１）中に２０分間静置した。溶解に続いて、スライドを変性緩衝液（すなわち、電気泳動緩衝液；３００ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１３）中に静置した。電気泳動を、BIO-RAD(登録商標)1000電源（BIO-RAD（登録商標）Labs、Hercules、米国カリフォルニア州）を使って、大きい水平ユニット（Fisher Biotech、ピッツバーグ、米国ペンシルベニア州）で２０分間３００ｍＶにおいて行った。スライドを取り出し、０．４ＭのＴｒｉｓを含むｐＨ７．５の中性緩衝液の中に１５分間静置した。その後、スライドを９５％のエタノール中に５分間置き、一晩中フード内で乾燥空気をあてた。
【００５２】
スライドを３５μＬのSYBR GREEN-1（登録商標）（MOLECULAR PROBES（登録商標）、ユージーン、米国オレゴン州）（Tris-EDTA緩衝液ｐＨ０．８で１０Ｘ）で染色し、カバーグラスを当てた。細胞を１００ＷのＨｇ蛍光源およびライツ(Leitz)Ｉ３フィルターキューブを用いて、ライツオルトプラン顕微鏡で観察した。Dage CCD725カメラ（Dage MTI、ミシガンシティ、米国アイオワ州）をイメージを得るために使った。各２つのスライドから５０個の細胞をその処理の知識のない独立したスコアラーによって分析した。分析をKOMET(登録商標)5.0（Kinetic Imaging、英国）コメット分析ソフトウェアを使って実行した。テイル中のテイルレングス(tail length)およびＤＮＡのパーセンテージについてデータを集めた。終点を使って、式：テイルモーメント＝テイルレングス×ＤＮＡ中のＤＮＡのパーセンテージ／１００を用いて、KOMET(登録商標)5.0ソフトウェアによりテイルモーメントを計算した。コクランＣ検定(Cochran's C test)およびバートレット検定を使って分散の均一性を調べた後、単純線形回帰（１つのテイル）を行った。統計学的に有意な正の勾配が得られた場合、１つのテイルのダネット(Dunnett)分析を用いて、各処理の平均値とそれに関するコントロールを比較した。培養物を実験の単位とし、全てのテストにおいてαを０．０５に設定した。全てのテストをSTAGRAPHICS(登録商標)プラスバージョン５統計パッケージを使って行った。
【００５３】
約５μＭぐらいの低い濃度のＭＭＳに４時間さらしたＸＲＣＣ１欠損ＥＭ９−Ｖ細胞で比較を行った。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の減少を１０μＭ以下ぐらいの濃度のＭＭＳに１時間、２時間および４時間晒した細胞において検出した（図５、それぞれパネルＡ、ＢおよびＣ）。コメットアッセイを使って、５０μＭ以下のＭＭＳに晒したＥＭ９−Ｖ細胞においてテイルモーメントの量の増加を検出した（図５、パネルＤ）。これらの結果により、本明細書で提供された方法がコメットアッセイより感度が良く、細胞内の一本鎖切断の不均衡を評価するのに有用であることが示された。
【００５４】
［実施例６：ＭＭＳにさらしたヒトリンパ芽球様細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］
８人の様々な健康な個体から確立されたヒトリンパ芽球様細胞の中の一本鎖切断修復能力におけるバリエーションを決定した。本明細書で提供される一本鎖切断を検出する方法は、リンパ芽球様細胞系でのＭＭＳへの感度における広いバリエーションを実証した（図６、パネルＡ）。最も耐性の高い細胞（３９：GM15339）および最も敏感な細胞（８０：GM15380）から得られたデータを、ＥＭ９−ＸＨ５細胞およびＥＭ９−Ｖ細胞からのデータと比較した（図６、パネルＢ）。GM15339の感度は、ＸＲＣＣｌ十分のＥＭ９−ＸＨ５細胞の感度とほとんど等しかった。それと対照的に、GM15380細胞系は、２つの同質遺伝子ＥＭ９細胞系と比較して感度では中間であった。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルの減少をＰＡＲＰインヒビターとの共インキュベーションによりかなり抑制した（図６、パネルＣ）。これらの結果により、本明細書で提供される方法が、集団ベースのサンプルまたは臨床サンプルにおいて一本鎖切断修復の不均衡をモニターすることに役立つことが示される。
【００５５】
［実施例７：ＸＴＴまたはＭＴＳのいずれかを使った細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの検出］
水溶性のテトラゾリウム塩である、ＸＴＴ1)（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド内塩）およびＭＴＳ2)（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩）を使って、水溶性ホルマザン染料への還元を介して細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を測定した。ＥＭ９−Ｖ細胞およびＸＨ５細胞を９６ウエルプレートに播種し、ウシ胎児血清および前述した抗生物質を含む１００μＬの培地で培養した（１ウエルにつき10,000個の細胞）。３０分間のインキュベーションの後、指示された濃度のＤＭＳ（ジメチルスルファート）および１／１０体積のフェノジンメトスルファートのような電子カップリング剤を含むＸＴＴ(Sigma)もしくはフェノジンメトスルファートを含むＭＴＳ(Promega)のいずれかで、細胞を処理した。さらに、各ウエル中の細胞を最高４時間までで培養した。ＸＴＴまたはＭＴＳのいずれかが、水溶性の黄色のホルマザン染料を生成し、吸光度を６５０ｎｍの参照フィルターにより４５０ｎｍにおいて９６ウエルプレートリーダーに記録した。
【００５６】
これらの細胞を、様々な濃度のＤＭＳに２．５時間または４時間晒した。ＥＭ９−ＸＨ５細胞ではなく、ＥＭ９−Ｖ細胞系での細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、用量依存の手法でＤＭＳでの処理により有意に減少させた（図７、パネルＡおよびＢ）。さらに、ＣＨＯ細胞を、ＤＭＳおよびＰＡＲＰインヒビターに共にさらした。ＤＭＳ処理の前に、３−アミノベンズアミド（１０ｍＭ）を１〜２時間加え、細胞が分析されるまでＤＭＳにさらしている間に培地を維持した。３−ＡＢは、両方のＥＭ９−Ｖ細胞系において、ＤＭＳで誘発された細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の減少を完全に妨げた（図７、パネルＡおよびＢ）。これらの結果により、ＷＳＴ−８に加えて、ＸＴＴおよびＭＴＳの両方は、ＳＳＢ修復の不均衡をモニターするための生きている細胞内でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルをモニターするのに利用することができることが示された。これらのデータにより、水溶性ホルマザンを形成する水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１、−３、−４および−８、ＸＴＴおよびＭＳＴ）は、ＳＳＢの蓄積をモニターするために細胞内でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを定量するのに利用可能であることもまた示された。
【００５７】
上記の実施例は、本発明を例証するものであり、本発明を制限すると解釈されるべきではない。本発明は、それに含まれる特許請求の範囲と均等な事項と共に、特許請求の範囲により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、一本鎖切断修復の不均衡、ＮＡＤ+消耗およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗を表現する。
【図２】図２は、空のベクター（ＥＭ９−Ｖ）およびヒト野生型ＸＲＣＣ１（ＥＭ９−ＸＨ５）を発現している、生きているチャイニーズハムスター卵巣ＥＭ９細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを示す。パネルＡは、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）に４時間さらした細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを示す。パネルＢは、ＭＭＳにさらしたＥＭ９−Ｖ細胞のリアルタイムＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイの結果を示す。パネルＣは、ＭＭＳにさらした時間の関数としてＥＭ９−ＸＨ５細胞に対するＥＭ９−Ｖ細胞でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルの比の経時変化を示す。パネルＤは、４つの独立した実験の平均値としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイの再現性を示す。パネルＤに提示したデータを除いて、結果は３つの組のサンプルから得たものであり、再現性は少なくとも３回確かめられている。バーは、標準偏差を表す。
【図３】図３は、ＰＡＲＰインヒビター、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）（１０ｍＭ；パネルＡ）または３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ）（９０μＭ、パネルＢ）の非存在下または存在下で、ＭＭＳに４時間さらしたＥＭ９−ＶおよびＥＭ９−ＸＨ５におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消耗の用量依存を示す。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。
【図４】図４は、３−ＡＢ（１０ｍＭ）の非存在下または存在下でＭＭＳに４時間晒した野生型（ＰＡＲＰ+/+、パネルＡ）線維芽細胞およびＰＡＲＰ−１ノックアウト（ＰＡＲＰ-/-、パネルＢ）線維芽細胞におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消耗を示す。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。
【図５】図５は、本発明のＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイおよびコメットアッセイにより検出されたＭＭＳによって誘発された細胞の効果の比較を示す。ＭＭＳに１時間（パネルＡ）、２時間（パネルＢ）、および４時間（パネルＣ）さらしたＥＭ９−Ｖ細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消耗。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。パネルＤは、０ｍＭ、０．００５９ｍＭ、０．０１１７ｍＭまたは０．０４６９ｍＭでＭＭＳ処理を１時間された直後のＥＭ９−Ｖ細胞でのコメットアッセイにより定量されたテイルモーメントを示す。結果は、３つの組のサンプルからの平均値である。バーは、標準偏差を表す。
【図６】図６は、８人の健康な個体から確証されたヒトリンパ芽球様細胞のＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイからの結果を示す。パネルＡは、ＭＭＳに４時間晒したリンパ芽球様細胞（３０：GM15030、６１：ＧＭ15061、37：ＧＭ15237、68：ＧＭ15268、39：ＧＭ15339、49：ＧＭ15349、65：GM15365、および８０：GM15380）におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗を示す。パネルＢは、リンパ芽球様細胞３９および８０とＥＭ９−Ｖ細胞およびＥＭ９−ＸＨ５細胞との間のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗の比較を示す。パネルＣは、３−ＡＢ（１６ｍＭ）の非存在下または存在下でＭＭＳに４時間晒したリンパ芽球様細胞３９および８０のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗を示す。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。
【図７】図７は、ＰＡＲＰインヒビター、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）（１０ｍＭ）の非存在下または存在下で、ＤＭＳに４時間（ＸＴＴを使用；パネルＡ）および２．５時間（ＭＴＳを使用；パネルＢ）さらしたＥＭ９−ＶおよびＥＭ９−ＸＨ５におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗の用量依存性を示す。結果は、３つの組のサンプルからの平均値を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立環境衛生科学研究所の後援を受けている研究の過程でなされた（NIEHS認可番号P30-ES10126、R42-ES11746-02、およびP42-ES05948）。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、ＤＮＡ内の一本鎖切断(single stranded breaks)の迅速な検出のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞内のＤＮＡは、内因性および外因性のアルキル化剤および酸化ストレスを受けることからの損傷に絶えず晒されている。塩基除去修復(base excision repair)は、これらの有害なＤＮＡ損傷の大部分の除去のための主たる責任を担っているように思われる(Wood(1996)Annu.Rev.Biochem.65:135-167)。これらの因子(agent)によって誘発されたＤＮＡ損傷に加えて、自発的な脱プリン化／脱ピリミジン化(depyrimidination)が、生理的条件の下で有意な量の脱プリン部位／脱ピリミジン(apyrimidinic)（ＡＰ）部位を導入させることがあり得る(Nakamura,et al.(1998)Cancer Res.58:222-225)。アルデヒド反応性プローブおよびスロットブロット技法の組み合わせを用いて、生理的条件の下での自発的な脱プリン化速度は、１日につき１細胞毎に９０００個のＡＰ部位に対応する、１日につき１０6個のヌクレオチド毎に１．５個のＡＰ部位であることが判明した(Nakamura,et al.(1998)Cancer Res.58:222-225)。修正された塩基およびＡＰ部位は、塩基除去修復経路の中間体として一本鎖切断ＤＮＡを導入させる(Krokan,et al.(1997)Biochem.J.325:1-16)。このプロセスでは、ＤＮＡグリコシラーゼは、修正された塩基またはさらには通常の塩基とデオキシリボースとの間のＮ−グリコシリック(glycosylic)結合を裂き、ＡＰ部位をそのままにする(Krokan,et al.(1997)Biochem.J:325:1-16;Lindahl(2000)Mutat.Res.462:129-135)。ＤＮＡグリコシラーゼによって生成されたＡＰ部位は、その後クラスＩＩ Ａｐエンドヌクレアーゼによって開裂され(DempleおよびHarrison(1994)Annu.Rev.Biochem.63:915-948)、結果として３’−ヒドロキシル基および５’−デオキシリボースホスフェート（５’−ｄＲｐ）を生じる。ＤＮＡポリメラーゼβ（β−ｐｏｌ）による５’−ｄＲｐの切除の後に、β−ｐｏｌおよびＤＮＡリガーゼのそれぞれポリメラーゼ活性およびリガーゼ活性によって、修復が完了する。さらに、反応性酸素種（ＲＯＳ:reactive oxygen species）もまた、デオキシリボースの水素除去によって損傷を誘発し、酸化されたＡＰ部位ならびにＤＮＡ一本鎖切断をしばしば作り出す(Breen and Murphy(1995)Free Radic.Biol.Med.18:1033-1077)。Ｂ型二本鎖ＤＮＡでは、デオキシリボースのＣ−４’およびＣ−５’位における水素原子は、ＲＯＳに最もアクセスでき(Von Sonntag(1987)In:The Chemical Basis of Radiation Biology,pp.238-249,Taylor and Francis,London)、それぞれ３’−末端および５’−末端の損傷を生じさせる。そのために、ＤＮＡの一本鎖切断は、生理的条件の下でさえ哺乳動物細胞での最も頻繁なＤＮＡ損傷の１つである。単一細胞アガロースゲル電気泳動、すなわちコメットアッセイは周知であり、一本鎖切断およびその修復の量を評価するための高感度アッセイである(Tice,et al.(2000)Environ.Mol.Mutagen.35:206-221)。しかしながら、このアッセイは、後になされるゲル電気泳動のためにＤＮＡを変性させるアルカリ性条件を通常必要とする。アルキル化剤および酸化剤は、アルカリで不安定な塩基損傷またはＡＰ部位を導入させ、基本条件の下で一本鎖切断をもたらす(Burrows and Muller(1998)Chem.Rev.98:1109-1152;Miyamae,et al.(1997)Mutat.Res.393:107-113)。したがって、一本鎖切断の人為的な形成が、ＤＮＡ抽出の間にもたらされるかもしれない。そのため、単離された細胞ＤＮＡを使った場合、一本鎖切断の数およびその修復における不均衡を正確に決定することは難しい。
【発明の開示】
【０００４】
一般に、ＤＮＡの一本鎖切断修復の不均衡を検出する高感度で信頼性が高くリアルタイムな方法で、細胞内のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの消耗を通してポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）活性化を間接的に測定する方法が、今や見いだされている（図１）。本発明は、以下においていっそう詳細に説明される。
【０００５】
本発明は、細胞または細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の増加レベルを検出する方法を提供する。本方法は、（ａ）細胞を水溶性のテトラゾリウム塩に、テトラゾリウム塩がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で細胞内においてホルマザン染料に変換される条件の下で、接触させるステップと、（ｂ）細胞内のホルマザン染料の存在を検出するステップであって、ホルマザン染料のレベルの減少（例えば、同一の接触条件および同一の検出条件の下で標準細胞またはコントロール細胞内で生成したホルマザン染料のような任意の適切な基準と比較した場合の「減少」）が細胞内のＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を示す、ステップとを含む。ホルマザン染料は、水溶性であっても非水溶性であってもよい。しかし、水溶性のホルマザン染料を使用するには、検出するステップの前に細胞を溶解する必要がある。特定の実施形態では、細胞は生きている細胞、または生きている細胞の培養物またはサンプルである。接触させステップは水溶液で実行されるのが好ましく、検出するステップは、ＵＶ吸光度（本明細書ではＵＶ透過率を検出することと同じものとして扱われる）を検出するような任意の適切な手段で実行することができる。
【０００６】
１つの実施形態では、テスト化合物は、接触させるステップの前または接触させるステップの間に細胞に接触させ、一本鎖切断のレベルの増加は、テスト化合物が細胞に遺伝毒性(genotoxic)があることを示し、一本鎖切断のレベルの減少は、テスト化合物が細胞を保護するもの(protective)であることを示す。細胞は、接触させるステップの前または接触ステップの間に酸化ストレスを受け得る。テスト化合物は、接触させるステップの前または接触させるステップの間に細胞に接触させ、一本鎖切断のレベルの増加は、テスト化合物が酸化ストレスを悪化させる(exacerbate)ことを示し、一本鎖切断のレベルの減少は、テスト化合物が酸化ストレスに対して保護するものであることを示す。
【０００７】
別の実施形態では、細胞が植物被検体または動物被検体から集められ、遺伝毒性のある化合物に接触する場合、細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の量は、遺伝毒性のある化合物に接触させていない同様の細胞の当該量と比較され、遺伝毒性のある化合物に対する当該被検体の感受性を決定する。
【０００８】
さらに別の実施形態では、細胞が植物被検体または動物被検体から集められ、酸化ストレスにさらす場合、細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の量は、酸化ストレスにさらされていない同様の細胞の当該量と比較され、酸化ストレスに対する当該被検体の感受性を決定する。
【０００９】
本発明の前記の目的、他の目的および態様は、以下に記載される明細書で詳細に説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書で用いられる「アルキル」は、一般的に低級アルキル(loweralkyl)またはＣ１〜Ｃ４アルキルをいい、メチル、エチル、プロピルおよびブチルを含むが、これらに限定されない。
【００１１】
本明細書で用いられる「アルコキシ」は、一般的に低級アルコキシ(loweralkoxy)またはＣ１〜Ｃ４アルコキシをいい、メチル、エチル、プロピルおよびブチルを含むが、これらに限定されない。
【００１２】
本明細書で用いられる「アルカリ金属」は、ナトリウムおよびカリウムを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ナトリウムである。
【００１３】
本明細書で用いられる「ハロゲン」は、任意の適切なハロゲン原子であり、フルオロ、ブロモ、クロロ、ヨードを含むが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書で用いられる「細胞」は、任意のタイプの細胞をいい、好ましくは植物細胞および動物細胞を含む真核細胞である。適切な細胞としては、酵母細胞および哺乳動物細胞（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ヒト）が含まれる。細胞は、どの組織タイプのものであってもよく、皮膚、血などが含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書で用いられる「酸化ストレス」は、任意のタイプの酸化ストレスをいい、細胞内でフリーラジカルを発生させるイオン化放射能、化合物にさらされることなどを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書で用いられる「遺伝毒性のある」は、細胞内での核酸の分裂または破壊のために有毒な化合物をいい、例えば、発癌性化合物および催奇性化合物を含むことが意図されている。
【００１７】
出願人は、本明細書で引用した全ての米国特許で開示されたものが、引用によりその全体として本明細書に組み込むことを特に意図する。
【００１８】
水溶性または非水溶性のホルマザン染料を作り出す水溶性のテトラゾリウム塩は公知であり、以下に記載されている。例えば、米国特許第6,063,587号Ishiyama et al;米国特許第5,185,450号Owen;D.A.Scudiero,R.H.Shoemaker,K.D.Paull,A.Monks,S.Tierney,T.H.Nofziger,M.J.Curens,D.Seniff,M.R.Boyd,Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Tumor Cell Lines,Cancer Res.48,4827(1988);N.W.Roehm,G.H.Rodgers,S.M.Hatfield,A.L.Glasebrook,An Improved Colorimetric Assay for Cell Proliferation and Viability Utilizing the Tetrazolium Salt XTT,J Immunol.Methods,142,257(1991);M.G.Stevens,S.C.Olsen,Comparative Analysis of Using MTT and XTT in Colorimetric Assays for Quantitating Bovine Neutrophil Bactericidal Activity,J Immunol.Methods,157,225(1993)。
【００１９】
１つの実施形態では、Ishiyama et al.の米国特許第6,063,587号で明らかにされたように、このようなテトラゾリウム塩は、下記の一般式の化合物のようなスルホン化テトラゾリウム塩である。
【化１】
式中、Ａ、ＢおよびＣは、独立して選択された（例えば、１箇所または２箇所における、アルキル、アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシなどのような独立して選択された基による）置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基（例えば、フェニル）であり、Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つが、ＳＯ3-で少なくとも１箇所（好ましくは２箇所）置換されている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、テトラゾリウム塩は、下記の一般式を有する。
【化２】
式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素またはニトロを表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。
【００２１】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、下記の一般式を有する。
【化３】
式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基またはハロゲン原子を表す。Ｒ3は、アルキル基またはアルコキシル基を表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。
【００２２】
水溶性のテトラゾリウム塩の他の例としては、Owenの米国特許第5,185,450号に記載のように、側鎖としてそのテトラゾリウム環に付いたナフタレン環であって、２つのスルホネート基を有するナフタレン環（例えば、２−ナフチル−６，８−ジスルホネート）を有するテトラゾリウム化合物、またはそのテトラゾリウム環に付いた側鎖であって、１つのスルホネート基およびオキシ酢酸基またはホスホモノエステル(phosphomonoester)基からなる群から選択されるスルホネート基より弱い酸の１つの基を有し、その化合物および関連するホルマザンを水溶性とする側鎖を有するテトラゾリウム化合物である。
【００２３】
１つの実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＷＳＴ−８、すなわち２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩である。
【００２４】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＷＳＴ−１、すなわち４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］１，３−ベンゼンジスルホネートである。
【００２５】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＸＴＴ、すなわち２，３−ビス［２−メトキシ（ｍｅｔｈｙｏｘｙ）−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリドである（また、「（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシ−アニリド内塩」とも呼ばれる。）。
【００２６】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＭＴＳ、すなわち３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩である。
【００２７】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＭＴＴ、すなわち３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物である。（ＭＴＴは、水溶性の染料を生成するが、検出するステップまたは決定するステップの前に細胞を溶解させることによって、使用することができる。）
【００２８】
別の実施形態では、水溶性のテトラゾリウム塩は、ＷＳＴ−３、すなわち２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、ナトリウム塩；ＷＳＴ−４、すなわち２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル−カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム；あるいはＷＳＴ−５、すなわち２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、ジナトリウム塩である。
【００２９】
ＤＮＡの一本鎖切断は、酸化ストレスまたは塩基除去修復経路によって生み出される、ゲノムＤＮＡでの最も頻繁な損傷の１つである。ＤＮＡの一本鎖切断は、ＰＡＲＰ−１の活性化を誘発する(Lautier,et al.(1993)Mol.Cell Biochem.122:171-193;de Murcia,et al.(1994)Mol.Cell Biochem.138:15-24)。これにより、細胞内のＮＡＤ+が消耗される(Berger(1985)Radiat.Res.101:4-15)。さらに、細胞内のＮＡＤ+の減少は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨだけでなく、ＡＴＰを消耗させる(Carson,et al.(1986)Exp.Cell Res.164:273-281;OleinickおよびEvans(1985)Radiat.Res.101:29-46)。したがって、本発明は、本明細書でＮＡＤ（Ｐ）Ｈと呼ばれるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの細胞内のレベルを測ることによって、細胞内での一本鎖切断ＤＮＡを検出するための方法を提供する。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明の方法は、生検標本、組織、細胞または液体（例えば、全血または血漿）のようなサンプルを被検体から得るステップと、そのサンプルを水溶性のテトラゾリウム塩と接触させるステップと、テトラゾリウム塩のホルマザン染料への還元を介してサンプル内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを測定するステップとにより実行される。ホルマザン染料の形成は、任意の標準的な分光光度計の使用のような任意の適切な技法によって測定される。分光光度計は、同時に多数のサンプルを読むことができるものが好ましい（例えば、９６−ウエルプレートリーダー）。サンプル内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルは、コントロールと比較されるか、または一定の時間（例えば、３０分から４時間または８時間）にわったてモニターされて、ＤＮＡの一本鎖切断修復メカニズムに不均衡があるかどうかを評価することができる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルが減少しているサンプルは、ＰＡＲＰ活性化、すなわち、サンプルが得られた被検体の中でＤＮＡの一本鎖が切断されていることを示している。したがって、一本鎖切断ＤＮＡを検出するための方法は、ＤＮＡ損傷因子に晒されていると思われる被検体の選別の一部として用いることができる。さらに、本発明の検出方法は、単独で、またはＤＮＡ一本鎖切断を確認するための他の周知の診断方法と組み合わせて使うことができる。
【００３１】
ＤＮＡでの一本鎖切断は、遺伝関連または年齢関連の基礎をなすことがあり、またはアルキル化によってＤＮＡ付加物を生成するものを含む因子に晒されることの結果として生じ得る。例えば、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン（ＭＮＮＧ）、ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）、ジメチルスルフェート）；反応性酸素種（例えば、過酸化物）；ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジンおよびアミノプリンのような塩基アナログ；または紫外線およびイオン化放射能（例えば、Ｘ線およびγ線）のような照射である。
【００３２】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することによって決定される細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の検出は、医療実験および他の処置の間に治療の効果をモニターするのに有用である。したがって、細胞内でＤＮＡ一本鎖切断を引き起こすように設計された放射線療法のための放射性核種(radionucleide)または化学療法のための細胞毒性薬のような因子の治療効果は、最終標的としてのＰＡＲＰの活性化、すなわちＮＡＤ（Ｐ）Ｈの還元を用いてモニターされ得る。
【００３３】
さらに、本発明の検出方法は、一本鎖切断の修復または塩基除去修復のいずれかの減少した能力について個人を選別するために使うことができる。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、サンプル中のＤＮＡ損傷因子を検出する方法を提供する。サンプルは、生体由来または環境由来のいずれでもよい。生体サンプルとしては、上記で与えられたもの、ならびに乳製品、野菜、肉類および肉類副産物のような食品および原料および廃棄物が挙げられる。環境サンプルとしては、表面物質、土壌、水、廃水、下水、汚泥、工業サンプル（例、工業用水）のような環境物質ならびに、食品加工および乳製品加工の器具、装置、設備、使い捨て商品および使い捨てでない商品から得られるサンプルが挙げられる。これらの環境サンプルの他に、飲料水を本発明の方法で使うことができると考えられる。飲料水という用語には、ヒトおよび他の動物による消費のために使われるあらゆるタイプの水が含まれ、井戸水、廃水、貯水池、川、小川などに貯められた水などが挙げられるが、これらに限定されないことが意図されている。本方法は、ＤＮＡ損傷因子を有すると推測されるサンプルとテスト細胞とを接触させ、そのサンプルの存在下でテスト細胞をインキュベートし、当該細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを測定することにより、テスト細胞内でＤＮＡ一本鎖切断が生じたかどうかを検出する。さらに、ＸＲＣＣ１欠損細胞、ＡＰエンドヌクレアーゼ欠損細胞、ＤＮＡグリコシラーゼ−欠損細胞、ＤＮＡリガーゼ欠損細胞またはＤＮＡポリメラーゼヌル変異体細胞のような塩基除去修復欠損細胞系をＤＮＡ損傷因子にさらし、当該因子により誘発されたＤＮＡ損傷が塩基除去修復によって修復されるかどうかを決定することができる。細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することにより、細胞内でのＤＮＡ一本鎖切断を検出する方法は、本明細書で提供される。さらに、ＤＮＡ修復のプロセスは、たいていＤＮＡ合成を必要とするので、ヒドロキシウレアのようなＤＮＡ合成インヒビターと組み合わされるこの細胞ベースの方法は、ＤＮＡ損傷因子により誘発されたＤＮＡ ＳＳＢの蓄積を促進する。したがって、この応用により、研究者は、通常のＤＮＡ修復熟達(repair-proficient)細胞を使ってＤＮＡ損傷因子を高感度で都合よく検出することができるようになる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、ＤＮＡ修復酵素の活性化を調節する因子を識別する細胞ベースの方法を提供する。平静な(unperturbed)細胞では、ＰＡＲＰのようなＤＮＡ修復酵素は、不活性の状態にある。ＤＮＡ一本鎖切断の際、これらの酵素は活性化し、ＰＡＲＰの場合は同時にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの還元をもたらす。したがって、ＰＡＲＰの活性化を調節する因子は、細胞を因子に接触させるステップと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定するステップとにより、スクリーニングアッセイにおいて同定される。さらに、当該アッセイは、テトラゾリウム塩を添加する前の洗浄し、テトラゾリウム塩と相互作用し得る残存する因子を除去するステップを含んでもよい。ＰＡＲＰ活性化は、活性化をブロックし、阻害し、または減少させるだけでなく、刺激し、促進し、または活性化の速度もしくは量を増加させることにより調節することができる。インヒビターのための一般的なスクリーニングアッセイには、因子およびメチルメタンスルホネートのような遺伝子毒を平静な細胞に接触させるステップと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することによりＰＡＲＰの活性化を当該因子がブロックまたは阻害するかどうかを決定するステップとが含まれる。ＰＡＲＰ活性化を阻害する因子は、多様なヒトの腫瘍の処置における放射線増感剤または化学増感剤(chemosensitizers)として有用である。エンハンサーのための一般的なスクリーニングアッセイには、因子を平静な細胞に接触させるステップと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定することにより当該因子がＰＡＲＰの活性化を促進または刺激するかどうかを決定するステップとが含まれる。ＰＡＲＰの活性化を促進または活発にする因子は、癌細胞に対する化学療法薬剤として役立つ。細胞内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの細胞内のレベルを測定するための方法は、本明細書において提供される。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、癌化学療法薬剤だけではなく、抗ＨＩＶ薬のためのＤＮＡ合成インヒビターを同定する細胞ベースの方法を提供する。前述したように、大部分のＤＮＡ修復経路は、損傷を受けた塩基またはヌクレオチドの除去の後にＤＮＡ合成を必要とする。したがって、ＤＮＡ損傷因子とこの細胞ベースのアッセイとの組み合わせにより、４時間以内にＤＮＡ合成を妨害する化学物質またはタンパク質を効率的に選別することができる。ＤＮＡ合成インヒビターは、抗ＨＩＶ剤として有用であることが知られているので、この方法は、ＨＩＶ関連の研究に適用することができる。
【００３７】
本明細書で提供されるスクリーニングアッセイを用いて選別され得る因子には、多くの化学物質の種類が含まれる。それらは、一般的に有機分子であるが、好ましくは１００ダルトンより大きく、約２５００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機化合物である。
【００３８】
因子は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含む。その官能基の例としては、一般的に、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基が挙げられ、少なくとも２つの官能化学基があることが好ましい。当該因子は、しばしば、１以上の上記の官能基で置換された環状炭素もしくはヘテロ環状構造物および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。因子はまた、ペプチド、抗体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログまたは組み合わせを含む生体分子の間で見いだすことができる。このような因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーまたは組み合わせライブラリーを含む多様なソースから得ることができる。
【００３９】
他の種々の試薬を、スクリーニングアッセイに含めることができる。この例としては、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、および／または非特異性相互作用またはバックグラウンド相互作用を減らすために使うことのできる塩、中性タンパク質（例、アルブミン）、洗浄剤などのような試薬が挙げられる。また、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのようなアッセイの効率を別の方法で改善する試薬を用いることもできる。必要な結合を提供する成分の混合物を、任意の順序で添加することができる。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、サンプル中のＤＮＡ損傷因子を検出するためのキットを提供する。キットには、テトラゾリウム塩が含まれる。キットには、さらにテスト細胞を含むことができる。さらに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在量を標準と比較するための手段をキットの中に提供することができる。キットは適切な容器でパッケージされて、さらに上記の方法を実行するための説明書のようなＤＮＡ損傷因子を検出するためのキットを使用するための説明書（例、印刷された説明書）を含めることができる。
【００４１】
１つの実施形態では、（ｃ）ホルマザン染料の検出された存在から、細胞内のＤＮＡ一本鎖切断の量を定量的に示すステップを、前記検出するステップの後に含む。この示すステップは、任意の適切な技法により実行することができる。例えば、選択された細胞で検出されたホルマザン染料のレベルをコントロール細胞でのホルマザン染料のレベルと比較することによって、経時的に形成されたホルマザン染料の量を決定することよって、他の知られている標準と比較することによって、または他の任意の適切な技法などである。
【００４２】
本方法は、リアルタイム手法で実行される。すなわち、抽出するステップを行わずに、生きている細胞を用いて、および経時的に同一の細胞または細胞サンプルから受ける多数の測定により連続的に、生きている細胞のサンプルをモニターすることができる。さらに、（装置の感度により）500,000個未満の細胞、200,000個未満の細胞、100,000個未満の細胞、10,000個未満の細胞、および1,000個未満の細胞であっても、アッセイのために必要とされる。最終的に、アッセイのステップは、現在利用可能な技法に必要とされる時間と比較すると、例えば、４時間、３時間、２時間未満、または１時間未満以内であっても、迅速に実行することができる。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を例証するために記載されており、本発明を限定すると解釈するべきではない。
【実施例】
【００４４】
［実施例１：細胞培養］
ＸＲＣＣｌが十分な(proficient)ＣＨＯ細胞およびＸＲＣＣｌ欠損ＣＨＯ細胞(Taylor,et al.(2002)Mol.Cell.Biol.22:2556-2563)を、１０％のウシ胎児血清（Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）、１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したα−最小必須培地（INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad、米国カリフォルニア州）で、単層として培養した。ＰＡＲＰ−１+/+およびＰＡＲＰ−１-/-由来の固定化マウス胎児線維芽細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地、１０％のウシ胎児血清および０．５％のゲンタマイシン(Schreiber,et al.(2002)J Biol.Chem.277:23028-23036)を補充した４．５ｇ／リットルのグルコース培地（INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad、米国カリフォルニア州）で維持した。ヒトリンパ芽球様細胞（GM15030、GM15061、GM15237、GM15268、GM15339、GM15349、GM15365およびGM15380；Coriell Cell Repositories、Camden、米国ニュージャージー州）を、１５％のウシ胎児血清（Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）、１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad、米国カリフォルニア州）で増殖させた。その細胞を５％のＣＯ2および９５％の空気の湿潤雰囲気で３７℃において維持した。
【００４５】
［実施例２：細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの検出］
水溶性テトラゾリウム塩を使い、ホルマザン染料への還元を通して細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を測定した。培地で生存能力のある細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの全体の量を、分光光度計によって周期的に決定した。細胞を９６ウエルプレート（ＣＨＯ細胞およびマウス線維芽細胞：５×１０3細胞／ウエル；リンパ芽球様細胞：１５×１０3細胞／ウエル）に播種し、上記のウシ胎児血清および抗生物質を含む１００μＬの培地で培養した。３０分のインキュベーションの後に、細胞を、指示された濃度のＭＭＳならびに水溶性の２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−８；５ｍＭ）および電子メディエーターとして１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（１−メトキシＰＭＳ；０．２ｍＭ）からなる１／１０体積のＣＣＫ−８溶液（Dojindo Molecular Technology、Gaithersburg、米国メリーランド州）で処理した。各ウエルの中の細胞を、さらに最高４時間まで培養した。ＷＳＴ−８は、１−メトキシＰＭＳのような電子キャリア、ジアフォラーゼ、フラビン酵素の存在下で、または直接ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって、その生体還元を介して水溶性で黄色のホルマザン染料を生成した。したがって、テトラゾリウム塩の還元は、主に細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量に依存している。培地で生きている細胞によって作り出されたホルマザン染料の量を、分光光度計によりコントロールの値と比較して、約３０分ごとに決定した。吸光度を、６５０ｎｍの参照フィルターを用い、４５０ｎｍにおいて９６−ウエルプレートリーダーに記録した。培地ブランクを培地およびＣＣＫ−８反応溶液だけで調製した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみで処理された細胞を含むウエルの吸光度に対するＭＭＳで処理された細胞を含むウエルの吸光度を比較することにより、細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を算定した。
【００４６】
細胞死をトリパンブルー染色で決定した。細胞を０、０．７５および１．５ｍＭにおけるＭＭＳにより１〜４時間の間で処理された。トリプシン化(trypsinization)の後に、細胞を標準的なトリパンブルー染料排除アッセイを使って染色した。
【００４７】
ＸＲＣＣ１は、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ１）、ＤＮＡ Ｐｏｌ−β、ＤＮＡリガーゼIII、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）およびＰＡＲＰ−１を含む他の塩基ベース切除修復関連タンパク質との相互作用のために骨格(scaffold)として機能する(Caldecott,et al.(1996)Nucl.Acids Res.24:4387-4394;Whitehouse,et al.(2001)Cell 104:1-11;Kubota,et al.(1996)EMBO J.15:6662-6670;Caldecott,et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14:68-76;Caldecott,et al.(1995)Nucl.Acids Res.23:4836-4843)。ＸＲＣＣ１は、哺乳動物細胞において効率的な一本鎖切断修復および遺伝子安定性のために必要とされる。ＸＲＣＣ１欠損であるげっ歯類の細胞は、ＤＮＡ損傷因子に過敏である(Whitehouse,et al.(2001)Cell 104:1-11;Kubota,et al.(1996)EMBO J 15:6662-6670;Caldecott,et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14:68-76)。ＸＲＣＣ１の損失はまた、自発的および／または誘発された染色体転位および染色体欠失が起こる頻度が多くなることも含めて、遺伝子の安定性を減少させることももたらす(Caldecott,et al.(1995)上記;Carrano,et al.(1986)Mutat.Res.162:233-239;Dominguez,et al.(1998)Mutat.Res.398:67-73;Thompson,et al.(1982)Mutat.Res.95:427-440;Veld,et al.(1998)Mutat.Res.398:83-92;Zdzienicka,et al.(1992)Mutagenesis 7:265-269)。細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルの量をモニターするために、水溶性テトラゾリウム塩を使って、ＸＲＣＣ１が十分(proficient)または不十分のいずれかの同質遺伝子(isogenic)ＣＨＯ細胞系をＭＭＳにさらした。使われた細胞系は、一本鎖切断修復欠損細胞として空のｐｃＤ２Ｅベクター（ＥＭ９−Ｖ）を発現し、一本鎖切断修復熟達細胞として野生型のヒトＸＲＣＣ１（ｐｃＤ２ＥＸＨ）（ＥＭ９−ＸＨ５）を発現するＸＲＣＣｌ欠損ＣＨＯ ＥＭ９細胞であった(Whitehouse,et al.(2001)Cell 104:1-11)。これらの細胞を様々な濃度のＭＭＳに４時間さらした。トリパンブルー排除アッセイは、どの濃度におけるＭＭＳ処理においても主要な細胞死を全く実証しなかったが、両方の細胞系における細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、用量依存手法におけるＭＭＳでの処理により、有意に減少させた（図２、パネルＡ）。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を示すこれらのデータは、生存能力のある細胞の数の減少によるものである。
【００４８】
細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少において早期の段階で起きることをモニターするために、測定をＭＭＳに晒した４時間の間で約３０分ごとに行った。ＣＣＫ−８は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの実証のために細胞溶解を必要としないので、リアルタイムＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイを ９６−ウエルプレートリーダーを用いて行った。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少は、ＥＭ９−Ｖ細胞をＭＭＳにさらしている間の３０分ぐらいの早期に検出された（図２、パネルＢ）。ＥＭ９−ＸＨ５細胞に対するＥＭ９−Ｖ中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比をＭＭＳにさらした時間の関数としてプロットしたものは、その比が１時間以内に安定期に達したことを示した（図２、パネルＣ）。したがって、引き続いてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定をＭＭＳにさらした細胞で１〜４時間の間で行った。本明細書で提供された方法の再現性は、図２、パネルＤに示される。細胞をＭＭＳへ４時間晒して、４つの独立した実験を行った。
【００４９】
［実施例３：ＰＡＲＰインヒビターの存在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少］
ＰＡＲＰは、ＤＮＡ一本鎖切断によるその活性化を介して、ＡＤＰ−リボースの数百の分岐鎖を核タンパク質に転換する(Kubota,et al.(1996)上記;Caldecott,et al.(1994)上記)。大量のＤＮＡ損傷の下で、ＰＡＲＰの活性化は、その基質ＮＡＤ+を消耗する(Taylor,et al.(2002)上記)。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、デヒドロゲナーゼとその基質との反応によってＮＡＤ（Ｐ）から生成されるので、ＮＡＤ（Ｐ）の量の減少によりＮＡＤ+が消耗される。ＮＡＤＨの減少が、ミトコンドリア機能の減少によるものか、またはＰＡＲＰ活性化によるＮＡＤ+の消耗によるものかどうか決定するために、ＣＨＯ細胞をＭＭＳおよび特定のＰＡＲＰインヒビターに共にさらした。特定のＰＡＲＰインヒビターである３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ；Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）（１０ｍＭ）および３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ；Sigma-Aldrich、セントルイス、米国ミズーリ州）（９０μＭ）を、ＭＭＳ処理の前に１〜２時間添加し、細胞が分析されるまでＭＭＳにさらしている間に培地を維持した。３−ＡＢおよびＤＰＱは、ＥＭ９−ＶおよびＥＭ９−ＸＨ５細胞系の両方において、ＭＭＳで誘発された細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の減少をほとんど完全に妨げた（図３、パネルＡおよびＢ）。これらの結果により、４時間ＭＭＳにさらしたＣＨＯ細胞での細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少が、一本鎖切断の形成を介したＰＡＲＰ活性化を理由とするものであったことが示された。
【００５０】
［実施例４：ＰＡＲＰ−１-/-細胞内でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少］
ＰＡＲＰ−１-/-細胞およびＰＡＲＰ−１+/+細胞をＭＭＳにさらし、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少が、ＰＡＲＰ活性化によるものかどうか決定した。ＭＭＳは、ＰＡＲＰ−１+/+細胞内でＮＡＤ（Ｐ）Ｈを減少させた（図４、パネルＡ）。ところが、ＰＡＲＰ−１-/-細胞は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少に抵抗をもっと示した（図４、パネルＢ）。さらに、３−ＡＢは、ＭＭＳに晒される際のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少からＰＡＲＰ−１+/+細胞を保護した。ＰＡＲＰ−１-/-細胞でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのわずかな減少は、ミトコンドリア機能の減少によるものとされている。
【００５１】
［実施例５：コメットアッセイに対してのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ決定アッセイ］
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する本発明の方法と一本鎖切断の検出のためのコメットアッセイとの間の直接の比較を行った。コメットアッセイのためのスライドを周知の方法により調製した(Tennant,et al.(2001)Mutat.Res.493:1-10)。簡単にいえば、スライドをアガロースに浸漬し、６０℃で乾燥する。低融点アガロース（０．５％）を調製し、４２℃に保つ。細胞懸濁液（１×１０4細胞／１０μＬ）を１９０μＬの低融点アガロースと混合した。９０μＬのこの懸濁液を各２つのスライド上にピペットで取り、カバーグラスで覆った。各スライドを５分間氷の上に置き、カバーグラスをはずして、９０μＬの低融点アガロースを各スライド上にピペットで取り、カバーグラスを再び被せて、スライドを氷に戻した。５分後、カバーグラスをはずして、スライドを、２．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＮａサルコシネート、１％のTRITON(登録商標)X-100および１０％のジメチルスルホキシドを含有する溶解緩衝液（ｐＨ１１）中に２０分間静置した。溶解に続いて、スライドを変性緩衝液（すなわち、電気泳動緩衝液；３００ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１３）中に静置した。電気泳動を、BIO-RAD(登録商標)1000電源（BIO-RAD（登録商標）Labs、Hercules、米国カリフォルニア州）を使って、大きい水平ユニット（Fisher Biotech、ピッツバーグ、米国ペンシルベニア州）で２０分間３００ｍＶにおいて行った。スライドを取り出し、０．４ＭのＴｒｉｓを含むｐＨ７．５の中性緩衝液の中に１５分間静置した。その後、スライドを９５％のエタノール中に５分間置き、一晩中フード内で乾燥空気をあてた。
【００５２】
スライドを３５μＬのSYBR GREEN-1（登録商標）（MOLECULAR PROBES（登録商標）、ユージーン、米国オレゴン州）（Tris-EDTA緩衝液ｐＨ０．８で１０Ｘ）で染色し、カバーグラスを当てた。細胞を１００ＷのＨｇ蛍光源およびライツ(Leitz)Ｉ３フィルターキューブを用いて、ライツオルトプラン顕微鏡で観察した。Dage CCD725カメラ（Dage MTI、ミシガンシティ、米国アイオワ州）をイメージを得るために使った。各２つのスライドから５０個の細胞をその処理の知識のない独立したスコアラーによって分析した。分析をKOMET(登録商標)5.0（Kinetic Imaging、英国）コメット分析ソフトウェアを使って実行した。テイル中のテイルレングス(tail length)およびＤＮＡのパーセンテージについてデータを集めた。終点を使って、式：テイルモーメント＝テイルレングス×ＤＮＡ中のＤＮＡのパーセンテージ／１００を用いて、KOMET(登録商標)5.0ソフトウェアによりテイルモーメントを計算した。コクランＣ検定(Cochran's C test)およびバートレット検定を使って分散の均一性を調べた後、単純線形回帰（１つのテイル）を行った。統計学的に有意な正の勾配が得られた場合、１つのテイルのダネット(Dunnett)分析を用いて、各処理の平均値とそれに関するコントロールを比較した。培養物を実験の単位とし、全てのテストにおいてαを０．０５に設定した。全てのテストをSTAGRAPHICS(登録商標)プラスバージョン５統計パッケージを使って行った。
【００５３】
約５μＭぐらいの低い濃度のＭＭＳに４時間さらしたＸＲＣＣ１欠損ＥＭ９−Ｖ細胞で比較を行った。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の減少を１０μＭ以下ぐらいの濃度のＭＭＳに１時間、２時間および４時間晒した細胞において検出した（図５、それぞれパネルＡ、ＢおよびＣ）。コメットアッセイを使って、５０μＭ以下のＭＭＳに晒したＥＭ９−Ｖ細胞においてテイルモーメントの量の増加を検出した（図５、パネルＤ）。これらの結果により、本明細書で提供された方法がコメットアッセイより感度が良く、細胞内の一本鎖切断の不均衡を評価するのに有用であることが示された。
【００５４】
［実施例６：ＭＭＳにさらしたヒトリンパ芽球様細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］
８人の様々な健康な個体から確立されたヒトリンパ芽球様細胞の中の一本鎖切断修復能力におけるバリエーションを決定した。本明細書で提供される一本鎖切断を検出する方法は、リンパ芽球様細胞系でのＭＭＳへの感度における広いバリエーションを実証した（図６、パネルＡ）。最も耐性の高い細胞（３９：GM15339）および最も敏感な細胞（８０：GM15380）から得られたデータを、ＥＭ９−ＸＨ５細胞およびＥＭ９−Ｖ細胞からのデータと比較した（図６、パネルＢ）。GM15339の感度は、ＸＲＣＣｌ十分のＥＭ９−ＸＨ５細胞の感度とほとんど等しかった。それと対照的に、GM15380細胞系は、２つの同質遺伝子ＥＭ９細胞系と比較して感度では中間であった。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルの減少をＰＡＲＰインヒビターとの共インキュベーションによりかなり抑制した（図６、パネルＣ）。これらの結果により、本明細書で提供される方法が、集団ベースのサンプルまたは臨床サンプルにおいて一本鎖切断修復の不均衡をモニターすることに役立つことが示される。
【００５５】
［実施例７：ＸＴＴまたはＭＴＳのいずれかを使った細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの検出］
水溶性のテトラゾリウム塩である、ＸＴＴ1)（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド内塩）およびＭＴＳ2)（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩）を使って、水溶性ホルマザン染料への還元を介して細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を測定した。ＥＭ９−Ｖ細胞およびＸＨ５細胞を９６ウエルプレートに播種し、ウシ胎児血清および前述した抗生物質を含む１００μＬの培地で培養した（１ウエルにつき10,000個の細胞）。３０分間のインキュベーションの後、指示された濃度のＤＭＳ（ジメチルスルファート）および１／１０体積のフェノジンメトスルファートのような電子カップリング剤を含むＸＴＴ(Sigma)もしくはフェノジンメトスルファートを含むＭＴＳ(Promega)のいずれかで、細胞を処理した。さらに、各ウエル中の細胞を最高４時間までで培養した。ＸＴＴまたはＭＴＳのいずれかが、水溶性の黄色のホルマザン染料を生成し、吸光度を６５０ｎｍの参照フィルターにより４５０ｎｍにおいて９６ウエルプレートリーダーに記録した。
【００５６】
これらの細胞を、様々な濃度のＤＭＳに２．５時間または４時間晒した。ＥＭ９−ＸＨ５細胞ではなく、ＥＭ９−Ｖ細胞系での細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、用量依存の手法でＤＭＳでの処理により有意に減少させた（図７、パネルＡおよびＢ）。さらに、ＣＨＯ細胞を、ＤＭＳおよびＰＡＲＰインヒビターに共にさらした。ＤＭＳ処理の前に、３−アミノベンズアミド（１０ｍＭ）を１〜２時間加え、細胞が分析されるまでＤＭＳにさらしている間に培地を維持した。３−ＡＢは、両方のＥＭ９−Ｖ細胞系において、ＤＭＳで誘発された細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の減少を完全に妨げた（図７、パネルＡおよびＢ）。これらの結果により、ＷＳＴ−８に加えて、ＸＴＴおよびＭＴＳの両方は、ＳＳＢ修復の不均衡をモニターするための生きている細胞内でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルをモニターするのに利用することができることが示された。これらのデータにより、水溶性ホルマザンを形成する水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１、−３、−４および−８、ＸＴＴおよびＭＳＴ）は、ＳＳＢの蓄積をモニターするために細胞内でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを定量するのに利用可能であることもまた示された。
【００５７】
上記の実施例は、本発明を例証するものであり、本発明を制限すると解釈されるべきではない。本発明は、それに含まれる特許請求の範囲と均等な事項と共に、特許請求の範囲により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、一本鎖切断修復の不均衡、ＮＡＤ+消耗およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗を表現する。
【図２】図２は、空のベクター（ＥＭ９−Ｖ）およびヒト野生型ＸＲＣＣ１（ＥＭ９−ＸＨ５）を発現している、生きているチャイニーズハムスター卵巣ＥＭ９細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを示す。パネルＡは、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）に４時間さらした細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベルを示す。パネルＢは、ＭＭＳにさらしたＥＭ９−Ｖ細胞のリアルタイムＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイの結果を示す。パネルＣは、ＭＭＳにさらした時間の関数としてＥＭ９−ＸＨ５細胞に対するＥＭ９−Ｖ細胞でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルの比の経時変化を示す。パネルＤは、４つの独立した実験の平均値としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイの再現性を示す。パネルＤに提示したデータを除いて、結果は３つの組のサンプルから得たものであり、再現性は少なくとも３回確かめられている。バーは、標準偏差を表す。
【図３】図３は、ＰＡＲＰインヒビター、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）（１０ｍＭ；パネルＡ）または３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ）（９０μＭ、パネルＢ）の非存在下または存在下で、ＭＭＳに４時間さらしたＥＭ９−ＶおよびＥＭ９−ＸＨ５におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消耗の用量依存を示す。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。
【図４】図４は、３−ＡＢ（１０ｍＭ）の非存在下または存在下でＭＭＳに４時間晒した野生型（ＰＡＲＰ+/+、パネルＡ）線維芽細胞およびＰＡＲＰ−１ノックアウト（ＰＡＲＰ-/-、パネルＢ）線維芽細胞におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消耗を示す。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。
【図５】図５は、本発明のＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイおよびコメットアッセイにより検出されたＭＭＳによって誘発された細胞の効果の比較を示す。ＭＭＳに１時間（パネルＡ）、２時間（パネルＢ）、および４時間（パネルＣ）さらしたＥＭ９−Ｖ細胞中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消耗。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。パネルＤは、０ｍＭ、０．００５９ｍＭ、０．０１１７ｍＭまたは０．０４６９ｍＭでＭＭＳ処理を１時間された直後のＥＭ９−Ｖ細胞でのコメットアッセイにより定量されたテイルモーメントを示す。結果は、３つの組のサンプルからの平均値である。バーは、標準偏差を表す。
【図６】図６は、８人の健康な個体から確証されたヒトリンパ芽球様細胞のＮＡＤ（Ｐ）Ｈアッセイからの結果を示す。パネルＡは、ＭＭＳに４時間晒したリンパ芽球様細胞（３０：GM15030、６１：ＧＭ15061、37：ＧＭ15237、68：ＧＭ15268、39：ＧＭ15339、49：ＧＭ15349、65：GM15365、および８０：GM15380）におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗を示す。パネルＢは、リンパ芽球様細胞３９および８０とＥＭ９−Ｖ細胞およびＥＭ９−ＸＨ５細胞との間のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗の比較を示す。パネルＣは、３−ＡＢ（１６ｍＭ）の非存在下または存在下でＭＭＳに４時間晒したリンパ芽球様細胞３９および８０のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗を示す。結果は３つの組のサンプルを表す。再現性は少なくとも３回確認した。バーは、標準偏差を表す。
【図７】図７は、ＰＡＲＰインヒビター、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）（１０ｍＭ）の非存在下または存在下で、ＤＭＳに４時間（ＸＴＴを使用；パネルＡ）および２．５時間（ＭＴＳを使用；パネルＢ）さらしたＥＭ９−ＶおよびＥＭ９−ＸＨ５におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消耗の用量依存性を示す。結果は、３つの組のサンプルからの平均値を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断の増加レベルを検出する方法であって、
（ａ）真核細胞サンプルを水溶性テトラゾリウム塩に、前記テトラゾリウム塩がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で前記細胞サンプルにおいてホルマザン染料に変換される条件の下で、接触させるステップと、
（ｂ）前記細胞サンプル中の前記ホルマザン染料の存在を検出するステップであって、前記ホルマザン染料のレベルの減少が前記真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を示す、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記真核細胞サンプルが植物細胞サンプルまたは動物細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記真核細胞サンプルが哺乳動物細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記真核細胞サンプルが生細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させるステップが水溶液中で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出するステップがＵＶ吸光度を検出することにより実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｃ）前記のホルマザン染料の検出された存在から、前記細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の量を定量的に示すステップを、前記検出するステップの後に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させるステップの前または間にテスト化合物を前記細胞サンプルに接触させ、一本鎖切断のレベルの増加が、前記テスト化合物が前記細胞サンプルに遺伝毒性があることを示し、一本鎖切断のレベルの減少が、前記テスト化合物が前記細胞サンプルを保護するものであることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記接触させるステップの前または間に前記細胞サンプルを酸化ストレスにさらし、前記接触させるステップの前または間にテスト化合物を前記細胞サンプルに接触させ、一本鎖切断のレベルの増加が、前記テスト化合物が酸化ストレスを悪化させることを示し、一本鎖切断のレベルの減少が、前記テスト化合物が酸化ストレスに対して保護するものであることを示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞サンプルを植物被検体または動物被検体から集め、遺伝毒性化合物に接触させ、前記細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の量を、前記遺伝毒性化合物に接触させていない同様の細胞サンプルのＤＮＡ一本鎖切断の量と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞サンプルを植物被検体または動物被検体から集め、酸化ストレスにさらし、前記細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の量を、酸化ストレスにさらされていない同様の細胞サンプルのＤＮＡ一本鎖切断の量と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶性テトラゾリウム塩がスルホン化テトラゾリウム塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水溶性テトラゾリウム塩が下記の一般式を有する、請求項１に記載の方法。
【化１】
（式中、Ａ、ＢおよびＣは、独立して選択された置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基であり、Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つが、ＳＯ3-で少なくとも１箇所置換されている。）
【請求項１４】
前記水溶性テトラゾリウム塩が下記の一般式を有する、請求項１に記載の方法。
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素またはニトロを表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。）
【請求項１５】
前記水溶性テトラゾリウム塩が下記の一般式を有する、請求項１に記載の方法。
【化３】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基またはハロゲン原子を表し、Ｒ3はアルキル基またはアルコキシル基を表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。）
【請求項１６】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、
２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩（ＷＳＴ−８）；
４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−１）；および
２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（ＸＴＴ）；
２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）；
２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル−カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４）；
２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、ジナトリウム塩（ＷＳＴ−５）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法
【請求項１７】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩（ＭＴＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２イル］２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞サンプルが５００，０００個以下の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触させるステップおよび前記検出するステップが、４時間以内の全体時間で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
生存真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を検出する方法であって、
（ａ）５００，０００以下の細胞を水溶液中に含む生存真核細胞サンプルを水溶性テトラゾウリウム塩に、前記テトラゾリウム塩がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で前記細胞サンプルにおいて水溶性ホルマザン染料に変換される条件の下で、接触させるステップと、
（ｂ）前記細胞サンプル中の前記ホルマザン染料の存在を検出するステップであって、前記ホルマザン染料のレベルの減少が前記真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を示す、ステップと、
を含み、
前記接触させるステップおよび前記検出するステップが４時間以内で実行される、
方法。
【請求項２２】
前記真核細胞サンプルが植物細胞サンプルまたは動物細胞サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核細胞サンプルが哺乳動物細胞サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩である、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断の増加レベルを検出する方法であって、
（ａ）真核細胞サンプルを水溶性テトラゾリウム塩に、前記テトラゾリウム塩がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で前記細胞サンプルにおいてホルマザン染料に変換される条件の下で、接触させるステップと、
（ｂ）前記細胞サンプル中の前記ホルマザン染料の存在を検出するステップであって、前記ホルマザン染料のレベルの減少が前記真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を示す、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記真核細胞サンプルが植物細胞サンプルまたは動物細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記真核細胞サンプルが哺乳動物細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記真核細胞サンプルが生細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させるステップが水溶液中で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出するステップがＵＶ吸光度を検出することにより実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｃ）前記のホルマザン染料の検出された存在から、前記細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の量を定量的に示すステップを、前記検出するステップの後に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させるステップの前または間にテスト化合物を前記細胞サンプルに接触させ、一本鎖切断のレベルの増加が、前記テスト化合物が前記細胞サンプルに遺伝毒性があることを示し、一本鎖切断のレベルの減少が、前記テスト化合物が前記細胞サンプルを保護するものであることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記接触させるステップの前または間に前記細胞サンプルを酸化ストレスにさらし、前記接触させるステップの前または間にテスト化合物を前記細胞サンプルに接触させ、一本鎖切断のレベルの増加が、前記テスト化合物が酸化ストレスを悪化させることを示し、一本鎖切断のレベルの減少が、前記テスト化合物が酸化ストレスに対して保護するものであることを示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞サンプルを植物被検体または動物被検体から集め、遺伝毒性化合物に接触させ、前記細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の量を、前記遺伝毒性化合物に接触させていない同様の細胞サンプルのＤＮＡ一本鎖切断の量と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞サンプルを植物被検体または動物被検体から集め、酸化ストレスにさらし、前記細胞サンプル内のＤＮＡ一本鎖切断の量を、酸化ストレスにさらされていない同様の細胞サンプルのＤＮＡ一本鎖切断の量と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶性テトラゾリウム塩がスルホン化テトラゾリウム塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水溶性テトラゾリウム塩が下記の一般式を有する、請求項１に記載の方法。
【化１】
（式中、Ａ、ＢおよびＣは、独立して選択された置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基であり、Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つが、ＳＯ3-で少なくとも１箇所置換されている。）
【請求項１４】
前記水溶性テトラゾリウム塩が下記の一般式を有する、請求項１に記載の方法。
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素またはニトロを表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。）
【請求項１５】
前記水溶性テトラゾリウム塩が下記の一般式を有する、請求項１に記載の方法。
【化３】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基またはハロゲン原子を表し、Ｒ3はアルキル基またはアルコキシル基を表し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを表す。）
【請求項１６】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、
２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩（ＷＳＴ−８）；
４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−１）；および
２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（ＸＴＴ）；
２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）；
２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル−カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４）；
２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、ジナトリウム塩（ＷＳＴ−５）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法
【請求項１７】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩（ＭＴＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２イル］２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞サンプルが５００，０００個以下の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触させるステップおよび前記検出するステップが、４時間以内の全体時間で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
生存真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を検出する方法であって、
（ａ）５００，０００以下の細胞を水溶液中に含む生存真核細胞サンプルを水溶性テトラゾウリウム塩に、前記テトラゾリウム塩がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で前記細胞サンプルにおいて水溶性ホルマザン染料に変換される条件の下で、接触させるステップと、
（ｂ）前記細胞サンプル中の前記ホルマザン染料の存在を検出するステップであって、前記ホルマザン染料のレベルの減少が前記真核細胞サンプルにおけるＤＮＡ一本鎖切断のレベルの増加を示す、ステップと、
を含み、
前記接触させるステップおよび前記検出するステップが４時間以内で実行される、
方法。
【請求項２２】
前記真核細胞サンプルが植物細胞サンプルまたは動物細胞サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核細胞サンプルが哺乳動物細胞サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記水溶性テトラゾリウム塩が、２−（２−メトキシル−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩である、請求項２１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５１７１００（Ｐ２００６−５１７１００Ａ）
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００７７８（Ｐ２００６−５００７７８）
【出願日】平成１６年１月６日（２００４．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００００６８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６３３５３
【国際公開日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【出願人】（５００２８２２０９）ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月６日（２００４．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００００６８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６３３５３
【国際公開日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【出願人】（５００２８２２０９）ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
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