Ｅ型肝炎パキスタン株の組換えタンパク質ならびに診断法およびワクチンにおけるそれらの利用
【課題】腸伝染性非Ａ型、非Ｂ型の肝炎（Ｅ型肝炎）の流行病に関与するパキスタン（ＳＡＲ−５５）由来のＥ型肝炎のウイルスが開示される。本発明は、ＳＡＲ−５５の構造領域全体（オープンリーディングフレーム−２；ＯＲＦ−２）の真核細胞発現系での発現に関する。
【解決手段】発現されたタンパク質はＨＥＶウイルス様粒子を形成することができ、この粒子は、診断免疫分析における抗原およびＥ型肝炎による感染に対して防御する免疫原またはワクチンとして機能できる。
【解決手段】発現されたタンパク質はＨＥＶウイルス様粒子を形成することができ、この粒子は、診断免疫分析における抗原およびＥ型肝炎による感染に対して防御する免疫原またはワクチンとして機能できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は肝炎ウイルス学の分野に関する。特に、本発明は、腸伝染性のＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５由来の組み換えタンパク質、並びにこれらのタンパク質を使った診断法およびワクチン応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術
腸伝染性非Ａ／非Ｂ型肝炎であるＥ型肝炎の流行は、アジア、アフリカおよび中央アメリカにおいて報告されている（バラヤン（Ｂａｌａｙａｎ），Ｍ．Ｓ．（１９８７）、Ｓｏｖｉｅｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ，Vｉｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ズダノフ（Ｚｈｄａｎｏｖ），V．Ｍ．（編）、クール、スイス：Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｖｏｌ．２，２３５−２６１；ザッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ），Ａ．Ｊ．（編）、パーセル（Ｐｕｒｃｅｌｌ），Ｒ．Ｇ．ら、（１９８８）、“Vｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ“，ニューヨーク：アラン Ｒ．リス（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ），１３１−１３７；ブラドレー（Ｂｒａｄｌｅｙ），Ｄ．Ｗ．（１９９０），Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４６：４４２−４６１；ホリンガー（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ），Ｆ．Ｂ．、レモン（Ｌｅｍｏｎ），Ｓ．Ｍ．、マーゴリス（Ｍａｒｇｏｌｉｓ），Ｈ．Ｓ．（編）、ティチェハースト（Ｔｉｃｅｈｕｒｓｔ），Ｊ．Ｒ．（１９９１）：“Vｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，バルチモア，５０１−５１３）。散発性肝炎のケース（Ｅ型肝炎と推定される）は、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が風土病である国では、報告される肝炎の９０％にまで達する。感染した個体の血清中の抗ＨＥＶ抗体の検出に関する血清学的試験の開発の必要性は、当該分野で広く認識されているが、しかし感染個体もしくは動物から排出されるＨＥＶが非常に低濃度なため、そのようなＨＥＶを血清学的試験用の抗原のソースとして利用することは不可能であった。そして細胞培養でのＨＥＶの増殖において制限付きの成功が報告された（ファン（Ｈｕａｎｇ），Ｒ．Ｔ．ら（１９９２），Ｊ．Ｇｅｎ．Vｉｒｏｌ．，７３：１１４３−１１４８）が、血清学的試験に必要な量の抗原を生産するには、細胞培養は現行ではあまりにも非能率的である。
【０００３】
最近、世界中の多くの労力がＥ型肝炎に関するウイルスゲノム配列を同定するために払われたことにより、数は限られているが幾つかのＨＥＶ株のゲノムがクローン化された（タン（Ｔａｍ），Ａ．Ｍ．ら（１９９１），Vｉｒｏｌｏｇｙ，１８５：１２０−１３１；ツァレフ（Ｔｓａｒｅｖ），Ｓ．Ａ．ら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３；フライ（Ｆｒｙ），Ｋ．Ｅ．ら（１９９２），Vｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，６：１７３−１８５）。ＤＮＡ配列の解析から、研究者たちは、ＨＥＶゲノムが３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に組織されているという仮説、並びにこれらのＯＲＦがインタクトなＨＥＶタンパク質をコードするという仮説を立てるに至った。
【０００４】
ビルマ（ミャンマー）からのＨＥＶ株のゲノムの部分ＤＮＡ配列がレイエス（Ｒｅｙｅｓ）ら１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３３５−１３３９に開示されている。タンら、１９９１、およびレイエスら、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１５６０３号（１９９１年１０月１７日公開）は、ＨＥＶビルマ株の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を開示している。これらの著者たちは、３つの順方向のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が本株の配列内に含まれると仮説を立てた。
【０００５】
イチカワ（Ｉｃｈｉｋａｗａ）ら、１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３５：５３５−５４３は、ＨＥＶ感染したカニクイザルからの血清でλｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングした際に、長さ２４０−３２０ヌクレオチドの一連のクローンが単離されたことを開示している。１つのクローンにより発現される組み換えタンパク質を大腸菌で発現させた。この融合タンパク質は、ＨＥＶミャンマー株のＯＲＦ−２の３’領域にコードされる。
【０００６】
ＨＥＶメキシコ株およびＨＥＶビルマ株のＯＲＦ−２の３’領域内にコードされるさらに別のタンパク質の発現について、ヤーボー（Ｙａｒｂｏｕｇｈ）ら、１９９１ Ｊ．Vｉｒｏｌｏｇｙ，６５：５７９０−５７９７が記載している。この論文は、ＨＥＶ由来の２つのｃＤＮＡクローンの単離を記載している。これらのクローンがＯＲＦ−２の３’領域のタンパク質群をコードする。そのクローンを大腸菌内で融合タンパク質として発現させた。
【０００７】
パーディ（Ｐｕｒｄｙ）ら、１９９２，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Vｉｒｏｌｏｇｙ，１２３：３３５−３４９、およびファボロフ（Ｆａｖｏｒｏｖ）ら、１９９２，Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Vｉｒｏｌｏｇｙ，３６：２４６−２５０は、ビルマ株からのより大きなＯＲＦ−２タンパク質断片の大腸菌での発現を開示している。これらの参考文献は、以前に考察したものと同様に、細菌発現系を用いたＯＲＦ−２遺伝子の一部の発現の開示でしかない。ＯＲＦ−２タンパク質全長を首尾よく発現させることは、本発明までは開示されたことがなかった。
【０００８】
ＨＥＶのゲノム構成および形態学的構造を他のウイルスのそれと比較することにより、ＨＥＶがカリチウイルス（ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）に最も近縁であることがあきらかとなった。興味深いことに、カリチウイルスの構造タンパク質群はゲノムの３’部分にコードされる（ネイル（Ｎｅｉｌ），Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）Ｊ．Vｉｒｏｌ．，６５：５４４０−５４４７；およびカーター（Ｃａｒｔｅｒ），Ｍ．Ｊ．ら、（１９９２），Ｊ．Ａｒｃｈ．Vｉｒｏｌ．，１２２：２２３−２３５）。そしてＨＥＶゲノムの３’端部分も構造タンパク質群をコードするという直接的証拠は無いが、３’ゲノム領域のある小さな部分を細菌細胞で発現させると、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにおいて抗ＨＥＶ血清と反応するタンパク質群が生産される（ヤーボーら、（１９９１）；イチカワら、（１９９１）；ファボロフら、（１９９２）およびドーソン（Ｄａｗｓｏｎ），Ｇ．Ｊ．ら、（１９９２）Ｊ．Vｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３８：１７５−１８６）。しかし、構造タンパク質としてのＯＲＦ−２タンパク質の機能は、本発明までは証明されなかった。
【０００９】
ＯＲＦ−２遺伝子の一部によりコードされる小さなタンパク質群は、動物血清中のＨＥＶに対する抗体を検出するイムノアッセイに利用されてきた。細菌で発現された小さなタンパク質群を血清学的なイムノアッセイにおいて抗原として利用することは、幾つかの潜在的な欠点を有している。第１に、細菌細胞でのこれらの小タンパク質の発現は、可溶性に関する問題、ならびにイムノアッセイに大腸菌の粗溶解物を抗原として用いた場合の、患者血清の大腸菌タンパク質との非特異的交差反応をもたらす（パーディら、（１９９２））。第２に、ルーチン疫学において抗ＨＥＶ抗体に関する血清学的試験の最初のラインとしてウェスタンブロットを用いることは、時間的および経済的制約から実践的ではない。ＨＥＶゲノムの３’端部分由来の小ペプチドを用いたＥＬＩＳＡは、既知のＨＥＶ感染患者中の４１％しか陽性として検出できなかった。第３に、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅに最も近い科であるＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅを含め、多くのウイルスに関して、重要な抗原および免疫原エピトープは立体構造性が高い（ホリンガー，Ｆ．Ｂ．、レモン（Ｌｅｍｏｎ），Ｓ．Ｍ．、マーゴリス，Ｈ．Ｓ．（編）、レモン，Ｓ．Ｍ．ら、（１９９１）：“Vｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，バルチモア、２０−２４）。それゆえ、インタクトなＨＥＶ遺伝子をコードする完全なＯＲＦを真核細胞系で発現させれば、ＨＥＶウイルス様粒子を形成し得るタンパク質の生産をもたらすのではないかと考えられる。そのような完全なＯＲＦタンパク質であれば、上記のより小さなタンパク質（ＨＥＶ構造タンパク質の一部しか表していない）よりも天然のキャプシドタンパク質（群）の免疫学的構造に近い構造を持つだろう。それ故、これらの完全なＯＲＦタンパク質は、現在使われているより小さなタンパク質よりも、より代表的な抗原として並びにより有効な免疫原として役立ちそうである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、分離されて実質的に純粋な、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５の調製品に関する。
【００１１】
本発明はまた、分離されて実質的に純粋な、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５のゲノムＲＮＡの調製品に関する。
本発明はさらに、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５のｃＤＮＡに関する。
【００１２】
本発明の目的は、組み換えＨＥＶタンパク質を生産させることのできる合成核酸配列を、等価な天然核酸配列以外に提供することである。そのような核酸配列は、ＨＥＶタンパク質を合成させることのできる遺伝子を同定し分離することのできるｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから分離することができる。
【００１３】
本発明はさらに、ＳＡＲ−５５ ｃＤＮＡ由来のプライマーを用いたＥ型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいた、生物試料中のＥ型肝炎ウイルスの検出法に関する。
本発明はまた、ＳＡＲ−５５ ｃＤＮＡ由来の一本鎖アンチセンスのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを用いて、Ｅ型肝炎遺伝子の発現を阻害することに関する。
【００１４】
本発明はまた、ＳＡＲ−５５のＨＥＶゲノムにコードされる、または合成核酸配列によりコードされる、単離され実質的に精製されたＨＥＶタンパク質およびその変異体に、特に少なくとも１つの完全なＨＥＶオープンリーディングフレームにコードされる組み換えタンパク質に関する。
【００１５】
本発明はまた、核酸をクローン化し、ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、そして宿主細胞中で組み換えタンパク質を発現させることによって、ＨＥＶゲノム配列由来の組み換えＨＥＶタンパク質を調製する方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、得られた組み換えタンパク質を診断薬およびワクチンとして利用することに関する。本発明はまた、生物試料中のＥ型肝炎ウイルスに特異的な抗体を検出する方法も含む。そのような方法は、ＨＥＶが引き起こす感染症および疾患の診断、並びにそのような疾患の進行の監視に有用である。そのような方法はまた、哺乳動物でのＨＥＶ感染症および疾患の治療過程において治療薬の効力をモニターするのにも有用である。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物でのＥ型肝炎の予防もしくは治療に使われる医薬構成物にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、分離されて実質的に純粋な、パキスタンからのＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ＳＡＲ−５５株に関する。本発明はまた、ＨＥＶタンパク質をコードするウイルス遺伝子のクローン化および発現系を用いた組み換えタンパク質の発現にも関する。
【００１９】
本発明は分離されたタンパク質に関する。望ましくは、本発明のＨＥＶタンパク質は天然のＨＥＶタンパク質に実質的に相同であり、最も望ましくはそれと生物学的に等価である。本明細書および特許請求の範囲を通して使われる「生物学的に等価」によって意味されることは、その構成物がウイルス様粒子を形成でき、免疫原たりうることである。本発明のＨＥＶタンパク質はまた、哺乳動物に注射すると、野生型ＨＥＶに挑戦するときに該哺乳動物を防御してくれる防御抗体の生産を刺激することもできる。本明細書の以下の部分および特許請求の範囲を通して使われる「実質的に相同」によって意味されることは、アミノ酸配列の天然ＨＥＶタンパク質との相同性の度合いである。望ましくは相同性の度合いは７０％より大きく、好適には９０％を越え、特に好適なタンパク質のグループについては天然のＨＥＶタンパク質との相同性が９９％を越える。
【００２０】
好適なＨＥＶタンパク質はＯＲＦ遺伝子にコードされるタンパク質である。ＨＥＶのＯＲＦ−２遺伝子にコードされるタンパク質は特に興味深く、ＨＥＶのＳＡＲ−５５株のＯＲＦ−２遺伝子にコードされるタンパク質は最も興味深い。ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として以下に示される：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【００２１】
【化１】
【００２２】
【化２】
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
【００２６】
【化６】
【００２７】
【化７】
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
【００３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【００３１】
【化１０】
【００３２】
【化１１】
【００３３】
【化１２】
【００３４】
【化１３】
【００３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
【００３６】
【化１４】
【００３７】
３文字の略号は、２０の天然に存在するアミノ酸に対する慣例のアミノ酸速記法に従う。
【００３８】
好適な組み換えＨＥＶタンパク質は少なくとも１つのＯＲＦタンパク質を含む。同じもしくは異なるＯＲＦタンパク質群を複数含む他の組み換えタンパク質を、該タンパク質の生物学的特性を変更するように作製することもできる。種々のアミノ酸もしくは種々のアミノ酸配列の付加、置換もしくは欠失が該ＨＥＶタンパク質の生物学的活性を高めうることも予期される。
【００３９】
本発明はまた、上述のＨＥＶタンパク質もしくは該ＨＥＶタンパク質群に実質的に相同なタンパク質群を生産させることのできる核酸配列である。この核酸配列は、ＳＡＲ−５５と名付けられ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として以下に示され、１９９２年９月１７日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【００４０】
【化１５】
【００４１】
【化１６】
【００４２】
【化１７】
【００４３】
【化１８】
【００４４】
【化１９】
【００４５】
ヌクレオチドに用いた略号は当該分野で標準的に用いられるものである。
一方向の配列を、ＲＮＡウイルスのタンパク質をコードする鎖であることから、慣習により「プラス」配列と表記するが、これは上でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示した配列である。
【００４６】
ＳＡＲ−５５のオープンリーディングフレームの推定されるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である。ＯＲＦ−１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド２８から始まり５０７８ヌクレオチド広がる。ＯＲＦ−２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド５１４７から始まり１９７９ヌクレオチド広がる。ＯＲＦ−３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド５１０６から始まり３６８ヌクレオチド広がる。
【００４７】
ＤＮＡ配列中の変異の結果、ＯＲＦ−２タンパク質の類似物の産生を指示しうるＤＮＡ配列となることもありうると考えられる。上述のＤＮＡ配列は、本発明の好ましい態様を表すものであることに注意されたい。遺伝コードの縮重により、上記のＯＲＦタンパク質またはその類似体の産生を指示しうるＤＮＡ配列とするのに、莫大なヌクレオチドの選択を行えることを、理解すべきである。従って、上述の配列と機能的に同じＤＮＡ配列、またはＯＲＦタンパク質の類似物を上述のアミノ酸配列に準じて産生するよう指示する配列と機能的に同じＤＮＡ配列は、本発明に含まれるものとする。
【００４８】
本発明は生物試料中のＥ型肝炎ウイルスを、Ｅ型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいて検出する方法に関するものである。望ましい形では、本方法はＤＮＡ二重鎖断片の相補鎖の非相同領域に由来する一組の一本鎖プライマーを使用するが、そのＤＮＡ二重鎖断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示したＳＡＲ−５５配列に相同性をもつ領域を含むゲノムを有するＥ型肝炎ウイルスに由来するものである。これらのプライマーを、米国特許第４，６８３，２０２号に規定される特定の核酸配列の増幅過程に従う方法に用いることができる。
【００４９】
本発明はまた、ＳＡＲ−５５ ｃＤＮＡに相同性をもつ配列に由来する一本鎖アンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いて、Ｅ型肝炎遺伝子の発現を阻害することに関するものである。これらのアンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標的とする配列は典型的にはメッセンジャーＲＮＡであり、より好ましいのはＲＮＡのプロセッシングと翻訳に必要なシグナル配列である。アンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、レマイター、Ｍら（Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２）の記述のようにポリリジンなどのポリ陽イオンに結合することができ、この結合物の十分量を哺乳類に投与し、メッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズさせ、その機能を阻害することができる。
【００５０】
本発明はＨＥＶタンパク質の作製のための組換えＤＮＡ法を含み、ＨＥＶタンパク質として望ましいのは少なくとも一つのＯＲＦタンパク質から構成されるタンパク質、最も望ましいのは少なくとも一つのＯＲＦ−２タンパク質から構成されるタンパク質である。組換えＯＲＦタンパク質は一つのＯＲＦタンパク質で構成されるか、または同種あるいは異なるＯＲＦタンパク質の組合せで構成される。天然の核酸配列または合成核酸配列を用いて、ＨＥＶタンパク質の産生を指示することができる。
【００５１】
本発明の一つの態様では、方法は以下の工程を包含する：
（ａ）宿主生物にＨＥＶタンパク質の産生を指示できる核酸配列を調製し；
（ｂ）宿主生物に導入し複製できるベクターで、核酸配列に対する調節要素を含むようなベクターへ核酸配列をクローン化し；
（ｃ）タンパク質を発現できる宿主生物へ、核酸配列と調節要素を含むベクターを導入し；
（ｄ）ベクターの増幅とタンパク質の発現に適当な条件下で宿主生物を培養し；そして
（ｅ）タンパク質を回収する。
【００５２】
本発明のもう一つの態様では、ＨＥＶの核酸でコードされるタンパク質の組換えＤＮＡ合成法は以下のものを包含する。ここでＨＥＶタンパク質は望ましくは少なくとも一つのＨＥＶＯＲＦでコードされるか、または同種あるいは異なるＯＲＦタンパク質の組合せでコードされ、最も望ましくは少なくとも一つのＯＲＦ−２核酸配列でコードされる：
（ａ）宿主生物を形質転換またはトランスフェクションして、宿主生物にタンパク質産生を指示しうる核酸配列を持たせ、タンパク質を産生する条件下でこれを培養すること。ここで前述のタンパク質は、ＨＥＶから単離されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の生来のＨＥＶタンパク質、またはこの組み合わせと実質的に相同性を示すアミノ酸配列を持つものである。
【００５３】
一つの態様ではＨＥＶ株ＳＡＲ−５５のウイルスゲノムのＲＮＡ配列を単離し、以下のようにクローン化しｃＤＮＡとした。ＳＡＲ−５５を感染させたカニクイザルから集めた生物試料より、ウイルスＲＮＡを抽出した後、ウイルスＲＮＡを逆転写し、Ｂｕｒｍａ（タムら（Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．））由来のＨＥＶ株のゲノムまたはＳＡＲ−５５ゲノムのプラス鎖またはマイナス鎖に相補的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。ＰＣＲ断片はｐＢＲ３２２またはｐＧＥＭ−３２にサブクローン化し、二重鎖ＰＣＲ断片の配列を決定した。
【００５４】
本発明に用いることが考えられるベクターには、上に記載した核酸配列を望ましいまたは必要な任意の調節要素と共に挿入することが可能で、さらにその後宿主生物に導入し、そうした生物中で複製可能な全てのベクターが含まれる。望ましいベクターは制限部位がよく記録され、核酸配列の転写に望ましいまたは必要な調節要素を含むものである。
【００５５】
本明細書で論じる「調節要素」には、少なくとも一つのプロモーター、少なくとも一つのオペレーター、少なくとも一つのリーダー配列、少なくとも一つの終止コドン、およびベクター上の核酸の適当な転写とその後の翻訳に必要または望ましい配列全てを含む。特にこうしたベクターとして考えられるのは、宿主生物が認識する少なくとも一つの複製起点を含み、また少なくとも一つの選択マーカー、核酸配列の転写開始を可能とする少なくとも一つのプロモーター配列が存在するものである。
【００５６】
本発明のクローン化ベクターの構築では、核酸配列とこれに付随する調節要素を多コピーで各ベクターに挿入できることを、付加的に記さねばならない。こうした態様では宿主生物は、望みのＨＥＶタンパク質をベクターあたり大量に産生する。ベクターに挿入できるＤＮＡ配列の多コピー数を制限するのは、結果として生じるベクターがその大きさで、適当な宿主微生物に導入され複製、転写される能力を持つか否かだけである。
【００５７】
もう一つの態様では、ＨＥＶタンパク質のコーディング配列を含んだ制限酵素消化断片を、原核または真核細胞中で機能する適当な発現ベクターに挿入することができる。ここで適当というのは、ＨＥＶタンパク質をコードする完全な核酸配列を、望ましくは少なくとも一つの完全なＯＲＦタンパク質をコードする完全な核酸配列を、ベクターが運搬し発現できることを意味する。ＯＲＦ−２の場合には、発現されたタンパク質はウイルス様の粒子を形成しなければならない。望ましい発現ベクターは、真核細胞で機能するものである。こうしたベクターの例にはワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス、望ましいものとしてバキュロウイルス導入ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃが含まれるが、これらに制限される訳ではない。望ましいベクターは完全なＯＲＦ−２遺伝子を含むｐ６３−２、および完全なＯＲＦ−３とＯＲＦ−２遺伝子を含むＰ５９−４である。これらのベクターは１９９２年９月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２ ＵＳＡに寄託された。実施例１はＯＲＦ−２遺伝子をｐＢｌｕｅＢａｃにクローン化しｐ６３−２を作製した例を説明している。この方法に含まれるのは、ＳＡＲ−５５ ＨＥＶ株のゲノムの制限酵素ＮｒｕＩおよびＢｇｌＩＩによる消化、ベクター上の唯一のＮｈｅＩ部位へのＢｌｎＩＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含むポリリンカーの挿入、およびＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ ＯＲＦ−２断片のＢｌｎＩ−ＢｇｌＩＩ Ｐｂｌｕｅｂａｃへのアダプターを用いた挿入である。
【００５８】
さらにもう一つの態様では、組換えタンパク質の発現を目的として、選択した組換え発現ベクターを適当な真核細胞系に導入することもできる。こうした真核細胞系に含まれるのは、ＨｅＬａ、ＭＲＣ−５またはＣｖ−１などの細胞系であるが、これらに制限される訳ではない。望ましい真核細胞系はＳＦ９昆虫細胞である。一つの望ましい方法にはＰｂｌｕｅｂａｃ発現ベクターの使用が含まれるが、ここでは昆虫細胞系ＳＦ−９を組換えＰｂｌｕｅｂａｃとＡｃＭＮＰVバキュロウイルスＤＮＡでＣａ沈澱法により同時形質転換する。
【００５９】
発現した組換えタンパク質は当該分野で知られる方法で検出することができ、これにはクマジーブルー染色、および実施例２に示すような抗ＨＥＶ抗体を含んだ血清を用いたウェスタンブロッティングが含まれる。もう一つの方法は実施例３に示すような、免疫電子顕微鏡によるウイルス様粒子の検出である。
【００６０】
さらに他の態様では、ＳＦ−９細胞で発現された組換えタンパク質を粗抽出物として調製したり、または当該分野で知られる標準的なタンパク質精製操作で精製することも可能であり、こうした操作には分離沈澱、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点焦点電気泳動、ゲル電気泳動、親和性および免疫親和性クロマトグラフィーなどが含まれる。免疫親和性クロマトグラフィーの場合には、ＯＲＦタンパク質に特異的な抗体を結合させたレジンを含むカラムを通過させることで、組換えタンパク質を精製できる。
【００６１】
もう一つの態様では、本発明で発現した組換えタンパク質を用いて、哺乳類のＥ型肝炎の診断、予後のための免疫検定を行うことができる。ここで哺乳類にはヒト、チンパンジー、旧世界サル、新世界サル、その他の霊長類などが含まれるが、これに制限される訳ではない。望ましい態様では、免疫検定はヒトのＥ型肝炎感染の診断に有用である。ＨＥＶタンパク質、特にＯＲＦタンパク質、とりわけＯＲＦ−２タンパク質を用いた免疫検定は、部分的なＯＲＦタンパク質を用いた免疫検定とは対照的に、特異性、感受性、再現性の高いＨＥＶ感染の診断法を供給する。
【００６２】
本発明の免疫検定は放射性免疫検定、ウェスタンブロット検定、免疫蛍光検定、酵素免疫検定、化学発光検定、免疫組織化学検定などでよい。当該技術分野で知られる標準的なＥＬＩＳＡの手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎローズとビガッジ編（Ｒｏｓｅ & Ｂｉｇａｚｚｉ ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８０とキャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗ．Ａ． Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４に記載されており、両者は本明細書に参考文献として取り入れてある。こうした検定は当該技術分野に記載されているように、直接、間接、競争または非競争の免疫検定でありうる。（オレリッヒ，Ｍ（Ｏｏｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．１９８４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５−９０４）こうした検出検定に適した生物試料に含まれるのは、組織生検抽出物、全血液、血漿、血清、脳脊髄液、胸膜液、尿などが含まれるが、これらに限定される訳ではない。
【００６３】
一つの態様では、試験する血清を固体相試薬と反応させるが、この固体相試薬の表面には組換えＨＥＶタンパク質を抗原として結合してあり、特に一つのＯＲＦタンパク質またはＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３といった異なるＯＲＦタンパク質の組合せを、抗原として結合してあるのが望ましい。より望ましい形では、ＨＥＶタンパク質はウイルス様粒子を形成するＯＲＦ−２タンパク質である。固体表面試薬は、タンパク質を固体支持物質に結合させる既知の手法により調製できる。こうした結合法にはタンパク質の支持体への非特異的吸収、または支持体上の反応基へのタンパク質の共有結合が含まれる。抗原を抗ＨＥＶ抗体と反応させた後、結合しなかった血清成分を洗浄して除き、抗原抗体複合体を、標識した抗ヒト抗体などの二次抗体と反応させる。固体支持体を適当な蛍光または比色試薬の存在下でインキュベートすることにより検出できるような酵素を、標識として用いることもできる。放射性標識または金コロイドなどの他の検出標識を用いることもできる。
【００６４】
望ましい態様では、ＳＡＲ−５５のＯＲＦ−２配列全体を含んだＰｂｌｕｅｂａｃ組換えベクターにより発現されるタンパク質は、抗ＨＥＶ抗体、望ましい形ではＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を検出する特異的な結合試薬として使用できる。実施例４および５は、固体相試薬が組換えＯＲＦ−２を表面抗原としてもつようなＥＬＩＳＡの結果を示す。ＯＲＦ−２核酸配列全体でコードされるこのタンパク質は、部分的なＯＲＦ−２タンパク質より優れる。なぜならＨＥＶを感染させた異なる霊長類種のより多くの抗血清に対して、このタンパク質は部分的なＯＲＦ−２抗原よりも反応するからである。本発明のタンパク質はＨＥＶの異なる株に応答して産生された抗体も検出できるが、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎またはＤ型肝炎に応答した抗体は検出しない。
【００６５】
ＨＥＶタンパク質およびその類似体は単体として、または二次抗体などの他の試薬との組合せとして、免疫検定用のキットの形で調製できる。
本発明の組換えＨＥＶタンパク質は、望ましい形では単独のＯＲＦタンパク質またはＯＲＦタンパク質の組合せ、さらに望ましいのはＯＲＦ−２タンパク質であるが、このタンパク質および実質的に相同性をもつタンパク質、および類似体は、哺乳類のＥ型肝炎による感染を防ぐワクチンとして用いることができる。免疫原として作用するワクチンは、細胞、組換え発現ベクターで形質転換した細胞の細胞溶解物または発現されたタンパク質を含んだ培養上清が考えられる。この代わりに免疫原は部分的または実質的に精製された組換えタンパク質でもよい。免疫原を純粋な形または実質的に純粋な形で投与することも可能であるが、薬剤組成物、処方薬、製剤として提示する方が望ましい。
【００６６】
本発明の処方薬は、家畜の治療およびヒトへのの用法のいずれでも、上に記載の免疫原と薬学的に受理できる一種または複数の担体、および随意に他の治療上の成分を含む。担体は、処方薬中の他の成分と両立し、薬の受血者に有害ではないという意味で「受容できる」ものでなければならない。処方薬は投薬量単位という形で便利に提示することが可能であり、薬学技術分野でよく知られるいかなる方法でも調製できる。
【００６７】
全ての方法には、活性のある成分を一種または複数の付属成分を構成する担体と結合させる段階が含まれる。一般に処方薬の調製の際には、均一かつ精細に活性のある成分を、液体担体または細かく砕いた固体担体またはその両者に結合させ、後に必要であれば調製物を望みの処方薬の形にする。
【００６８】
静脈、筋肉、皮下、腹腔内投与に適した処方薬は、披投与者の血液と等張であることが望ましい溶液に、活性のある成分を溶かした無菌水溶液を含むのが、便利である。こうした処方薬を調製するには、塩化ナトリウム（たとえば０．１−２．０Ｍ）、グリシンなどの生理的に害のない基質を含み、水溶液を作製するのに生理的条件と両立するような緩衝化Ｐｈをもつ水に固体活性成分を溶解させ、この水溶液を滅菌するのが便利である。これらはたとえば封印したアンプルまたはバイアル瓶といった、投薬量単位または複数の投薬量の入った入れ物で提供することもできる。
【００６９】
本発明の処方薬は安定剤を含むこともできる。実例となる安定剤はポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機酸、有機酸であり、これらは単独でまたは添加物として用いることができる。これらの安定剤は免疫原の単位重量あたり０．１１−１０，０００の重量部で取り込ませるのが望ましい。二種またはそれ以上の安定剤を用いるのであれば、その総量を上に規定した範囲内にするのが望ましい。これらの安定剤は適当な濃度とＰｈの水溶液で用いる。こうした水溶液の特異的浸透圧は一般に０．１−３．０オスモルの範囲で、０．８−１．２の範囲が望ましい。水溶液のＰｈは５．０−９．０の範囲に調整するべきで、６−８の範囲が望ましい。本発明の免疫原を処方薬とする際には、抗吸着試薬を用いることもできる。
【００７０】
作用の持続期間を制御するために、付加的な薬学的方法を使用することもできる。制御放出製剤は、重合体を用いてタンパク質およびその派生物を複合体とする、または吸収させることで作製することができる。制御された放出を果たすには、適当な巨大分子（たとえばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニル酢酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン）を選択し、巨大分子の濃度と、制御放出のための取り込みの方法を選択すればよい。制御放出製剤による作用の持続期間の制御として可能なもう一つの方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ酪酸、エチレンビニル酪酸共重合体などの重合体物質の粒子に、タンパク質、タンパク質類似体およびこれらの機能的な派生物を取り込ませることである。一方これらの試薬を重合体粒子に取り込ませる代わりに、これらの物質を微量カプセルまたはコロイド薬剤放出系またはマクロ乳剤に入れることも可能であり、こうしたカプセルの調製はたとえばコアセルベーション技術や界面重合化が考えられ、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン微量カプセル、ポリメチルメタクリレート微量カプセルを例として挙げられるし、コロイド薬剤放出系としてたとえばリポソーム、アルブミン微小球、微小乳剤、ナノ粒子、ナノカプセルが考えられる。
【００７１】
経口調剤が望ましい場合には、組成物をとりわけラクトース、スクロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウムタルク、クリスタリンセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムといった典型的な担体に結合させることもできる。
【００７２】
本発明のタンパク質は、キットの形で、単独で、または上に記載した薬剤組成物の形で供給することもできる。
ワクチン化は一般な方法で行える。たとえば生理的食塩水または水などの適当な希釈剤中で、または完全あるいは不完全なアジュバント中で免疫原を用いることができる。さらに免疫原を担体に結合させて、免疫原タンパク質を作製することもできるし、また特にそのようにしなくてもよい。こうした担体分子の例にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイドなどが含まれるが、これに制限される訳ではない。免疫原は、静脈、腹腔内、筋肉、皮下などの抗体作製に適当ないかなる経路によっても、投与することができる。免疫原は有意な力価の抗ＨＥＶ抗体が産生されるまで、一回または定期的な期間で投与する。血清中の抗体は、免疫検定を用いて検出できる。
【００７３】
本発明の免疫原の投与は予防または治療を目的とすることができる。予防のための供給の場合には、免疫原はＨＥＶへのいかなる被曝よりも先んじて、あるいはＨＥＶ感染によるいかなる徴候よりも先んじて投与される。免疫原を予防用として投与することで、哺乳類でのその後のＨＥＶのいかなる感染をも防止あるいは緩和することができる。治療用として供給する際には、感染の始めに（またはそのすぐ後に）、またはＨＥＶに起因する感染または症状の始めに、免疫原を投与する。免疫原を治療投与することで、感染または症状を緩和できる。
【００７４】
望ましい態様はＨＥＶ株ＳＡＲ−５５のＯＲＦ−２配列で発現される組換えＯＲＦ−２タンパク質、またはその同等物を用いて調製したワクチンである。ＯＲＦ−２タンパク質は様々なＨＥＶ陽性血清に反応することが既に示されているので、様々なＨＥＶ株に対する防御の際のこれらの有用性が指摘される。
【００７５】
ワクチンとして用いるのに加えて、本組成はＨＥＶ用粒子に対する抗体の調製に用いることができる。抗体は直接抗ウイルス試薬として用いることができる。抗体を調製するには、ウイルス粒子、または適切な場合には、ウイルス粒子の生来の非粒子抗原を上に記載したような担体に結合させてワクチンとしたものを用いて、宿主動物を免疫する。宿主の血清または血漿を、適当な時間間隔の後に集めて、ウイルス粒子に反応する抗体を含む組成物を供給する。ガンマグロブリン画分またはＩｇＧ抗体を、たとえば飽和硫酸アンモニウムやＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘまたは当業者の既知の他の手法を用いることで、調製できる。こうした抗体は、薬剤などの他の抗ウイルス試薬に付随する多くの有害な副作用を実質的に持たない。
【００７６】
抗体組成物は、潜在する有害な免疫系応答を低減することで、さらに宿主系に害の少ないものとすることができる。これは外来種の抗体のＦｃ部分の全体または一部を取り除くか、宿主動物と同種の抗体たとえばヒト／ヒトハイブリドーマ由来の抗体を用いることにより、可能となる。ヒト化された抗体（すなわちヒトでは免疫原とならない）を作製するには、たとえば抗体の免疫原となる部分を、対応するが免疫原とはならない部分で置換すればよい（すなわちキメラ抗体）。こうしたキメラ抗体は、一つの種由来の抗体の反応性部分または抗原結合部分と、異なる種の抗体のＦｃ部分（免疫原とならない）を含んでいる。キメラ抗体の例には、ヒト以外の哺乳類とヒトのキメラ、醤歯類とヒトのキメラ、マウスとヒトおよびラットとヒトのキメラが含まれるが、これに限定されない。（ロビンソンら（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）国際特許出願（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）１８４，１８７；タニグチ Ｍ．（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ．）欧州特許出願（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）１７１，４９６；モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）欧州特許出願（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）１７３，４９４；ノイバーガーら（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）ＰＣＴ出願ＷＯ／８６／０１５３３；カビリイら（Ｃａｂｉｌｌｙｅｔ ａｌ．），１９８７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９；ニシムラら（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．），１９８７ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９；ウッドら（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．），１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６；ショーら（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．）１９８８ Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５５３、これらは全て本明細書に参考文献として取り込んだ。）
”ヒト化”キメラ抗体についての概論は、モリソンおよびオイらにより提供されている。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２およびＯｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４
適切な”ヒト化”抗体は、ＣＤＲまたはＣＥＡ置換によってつくられる（ジョーンズら、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２；ヴァーホイアンら、Vｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ビードレレットら、Ｂｉｅｄｌｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３，参照により本明細書に含まれる）。
【００７７】
抗体または抗原結合断片は、また遺伝子工学によってもつくられる。大腸菌で重鎖および軽鎖遺伝子を発現させる技術は、ＰＣＴ特許出願の国際公開番号Ｗ０９０１４４３，ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４、およびフセらＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１の主題とされている。
【００７８】
抗体はまた免疫反応を増強させる方法としても使用できる。抗体は、他の治療上の抗体の投与と同程度の量投与できる。例えば、狂犬病、はしか、およびＢ型肝炎などの他のウイルス病の初期潜伏期に、プールしたガンマグロブリンがウイルスの細胞への侵入を阻止するため、体重１ポンド当たり０．０２−０．１ｍｌ投与される。そこで、ＨＥＶウイルス顆粒と反応する抗体は、ＨＥＶが感染した宿主に、免疫反応および／または抗ウイルス薬剤の効果を増強するため、単独で、または他の抗ウイルス薬剤とともに受動的に投与できる。
【００７９】
また、抗ＨＥＶ抗体は、抗原として抗イデオタイプ抗体を投与することで誘導できる。好適には、上に記載された様な精製抗ＨＥＶ抗体の調製物を宿主動物でイデオタイプ抗体を誘導するのに用いる。調製物が適当な希釈で宿主動物へ投与される。投与に続いて、通常は繰り返しの投与に続いて、宿主は抗イデオタイプ抗体を産生する。Ｆｃ領域に対する抗原反応を排除するために、宿主動物と同種の動物によって産生された抗体を用いるか、または、投与する抗体のＦｃ領域を除いて用いてもよい。宿主動物での抗イデオタイプ抗体の誘導に続き、血清または血漿を採取して抗体調製物を産する。抗体調製物は、抗ＨＥＶ抗体について上に記載されたようにして、または親和性マトリクスに結合された抗ＨＥＶ抗体を用いた親和性クロマトグラフィーによって、精製される。産生された抗イデオタイプ抗体は構造的に本来のＨＥＶ抗原に似ており、ＨＥＶ粒子抗原を用いる代わりにＨＥＶワクチンを調製するのに用いられる。
【００８０】
動物中で抗ＨＥＶウイルス抗体を誘導する方法としてもちられる場合、抗体を注入する方法は、予防接種を目的とする場合と同様である。つまり、アジュバントを用いたり、あるいは用いないで、生理学的に適切な希釈液で希釈した効果的濃度で筋肉、腹腔、皮下などへ行う注射である。１回以上の追加投与を用いるのが望ましい。
【００８１】
本発明のＨＥＶ由来タンパク質はまた、感染前予防、または感染後予防のために計画的に抗血清を産生するのに用いられる。ここでは、ひとつのＨＥＶタンパク質またはタンパク質の混合物が、ヒト抗血清を産生する既知の方法に従って、適当なアジュバントとともに処方され、志願者（ボランティア）に注射によって投与される。注射されたタンパク質に反応する抗体は免疫処置後数週間にわたって、一定間隔で血清を取り、ここで記載された免疫アッセイを用いて抗ＨＥＶ血清抗体の存在を同定することでモニターされる。
【００８２】
免疫された人からの血清は、感染の危機にある人の前予防の方法として投与することもできる。血清はまた、Ｂ型肝炎ウイルスに対する高力価の抗血清の後予防としての使用の場合と同様に、後予防で用いるのにも有用である。
【００８３】
ＨＥＶウイルス様粒子およびタンパク質に対する抗体および抗イデオタイプ抗体の生体内での（ｉｎ ｖｉｖｏ）使用および治療上での使用の両方でモノクローン抗体を用いることが好ましい。モノクローン抗ウイルス粒子抗体または抗イデオタイプ抗体は以下の方法で産生できる。免疫された動物から脾臓またはリンパ球を取り出し、不死化するか、または当業者には既知の方法でハイブリドーマを調製するのに用いる。（ゴーディング、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．１９８３．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｐｌａｄｅｒｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ５６−９７）。ヒト−ヒト ハイブリドーマを産生するために、ヒトリンパ球の提供者が選択される。ＨＥＶに感染していることが分かっている提供者は（この場合、感染は例えば血液中の抗ウイルス抗体の存在によって、またはウイルス培養によって示される）、適当なリンパ球の提供者として役立つ。リンパ球は抹消の血液試料から単離できる。また、提供者が脾臓摘出を受けるなら脾臓細胞が用いられる。エプスタインーバーウイルス（ＥＢV）がヒトリンパ球を不死化するのに用いられる。また、ヒト融合パートナーがヒト−ヒト ハイブリドーマを産生するのに用いられる。主に試験管内での（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ペプチドを用いた免疫化がまた、ヒトモノクローン抗体を産するのに用いられる。
【００８４】
不死化細胞から分泌された抗体は、望まれた特異性をもつ抗体を分泌するクローンを決定するために選別される。モノクローン抗ウイルス粒子抗体としては、抗体はＨＥＶウイルス粒子に結合しなければならない。モノクローン抗イデオタイプ抗体としては、抗ウイルス粒子に結合しなければならない。望まれる特異性をもつ抗体を産する細胞が選択される。
【００８５】
上述の抗体およびその抗原結合断片は単独のキットの形態で、または生体内使用用の薬剤組成物として供給される。抗体は、治療用、免疫アッセイでの診断用、または本明細書中に記載されたようなＯＲＦタンパク質を精製するための免疫親和性試薬として用いられる。
【実施例】
【００８６】
材料
以下の実施例で用いられる材料はいかのようなものであった：
霊長類． チンパンジー（Ｃｈｉｍｐ）（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）。旧世界サル：カニクイザル（Ｃｙｎｏ）（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）、ブタオザル（ＰＴ）（Ｍ．ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）、およびアフリアカミドリザル（ＡＧＭ）（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）。新世界サル：クチヒゲタマリン（Ｔａｍ）（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｍｙｓｔａｘ）、リスザル（ＳＱＭ）（Ｓａｉｍｉｒ ｉｓｃｉｕｒｅｕｓ）、およびヨザル（ＯＷＬ）（Ａｏｔｕｓ ｔｒｉｖｉｇａｔｕｓ）。霊長類は生物学的危険物の封じ込め条件下で一匹ずつ飼われた。動物の飼育場、飼育、および世話は、霊長類の飼育上のすべての要求にかなっていたか、十分すぎるほど満たしていた。
【００８７】
多くの動物は、ツァレヴら（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３、およびＴｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））によって記載されたようにウシ胎児血清で希釈された０．５ｍｌの便（ｓｔｏｏｌ）懸濁液中に含まれたＨＥＶ、ＳＡＲ−５５株を静脈注射された。Ｃｈｉｍｐ−１３１３および１３１０は７人のパキスタン人Ｅ型肝炎の患者から採集した便のプールを接種された。
【００８８】
血清試料は接種の前と後のほぼ週２回採集された。肝臓の酵素、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）、およびガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）が商品化された試験法を用いてアッセイされた（メドパス社、メリーランド州ロックビル、Ｍｅｄｐａｔｈ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。血清学的試験は上記のように行った。
【００８９】
実施例１
ＨＥＶ ＳＡＲ−５５株のゲノムのＤＮＡ配列の同定
ＰＣＲ用の鋳型ウイルスＲＮＡの調製 ＨＥＶ感染カニクイザルの胆汁（１０μｌ）、２０%（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ（最終濃度１%）、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ；最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）、１μｌのｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、および３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを最終的に２５０μｌとして混合し、３０分間５５度で保温した。全核酸を胆汁から、フェノール／クロロフォルム、１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて６５度で２回、クロロフォルムを用いて１回処理し抽出し、エタノールで沈殿させ、９５%エタノールで洗い、ＲＴ−ＰＣＲに用いた。糞からの、特に血清からのＨＥＶ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ＲＮＡがもっと大量に精製された場合に、より効果的である。血清（１００μｌ）または１０%糞懸濁液（２００μｌ）を上記のようにプロテイナーゼＫで処理した。３０分の保温の後、３００μｌのＣＨＡＯＳバッファー（４．２Ｍグアニジンチオシアネート／０．５Ｎ ラウロイルサルコシン／０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８．０）を加えた。核酸は６５度でフェノール／クロロフォルムを用いて２回、続いて室温でクロロフォルムを用いて１回処理し抽出した。そして、上層に７．５Ｍ酢酸アンモニウム（２２５μｌ）を加え、核酸を０．６８ｍｌの２−プロパノールで沈殿させた。沈殿を３００μｌのＣＨＡＯＳバッファーで融解し、１００μｌの水を加えた。クロロフォロム抽出および２−プロパノール沈殿を繰り返した。核酸を水に溶かし、エタノールで沈殿させ、９５%エタノールで洗い、ＲＴ−ＰＣＲに用いた。
【００９０】
プライマー ２１−４０ヌクレオチド（ｎｔ）で、ビルマからのＨＥＶ株（ＢＵＲ−１２１）（タムら、Ｔａｍ，Ａ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．（１９９１），Vｉｒｏｌｏｇｙ，１８５：１２０−１３１）のゲノムまたはＳＡＲ−５５ゲノムのプラスまたはマイナス鎖に相補的である、９４個のプライマーをアプライドバイオシステムズモデル３９１ ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３９１ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００９１】
これらの９４個のプライマーの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５からはじまりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８まで以下に示してある：
ＨＥＶプライマーリスト
【００９２】
【化２０】
【００９３】
【化２１】
【００９４】
【化２２】
【００９５】
【化２３】
【００９６】
【化２４】
【００９７】
配列の左の略語は以下のものを表す：ＲおよびＤはそれそれ逆向き（ｒｅｖｅｒｓｅ）および純向き（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーを表す；ＢおよびＳはそれぞれＥ型肝炎のＢｕｒｍａ−１２１株およびＥ型肝炎のＳＡＲ−５５株由来の配列を表す；５’ＮＣおよび３’ＮＣはそれそれＨＥＶゲノムの５’および３’ノンコーディング領域を表す；１，２および３はそれぞれオープンリーディングフレーム１，２および３由来の配列を表す。幾つかの配列の右側に示した（）の記号はこれらの配列に人為的に挿入した制限酵素部位を表す。
【００９８】
ＰＣＲ断片のクローニング用に、３−７ｎｔ上流にＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩ制限酵素部位をプライマーの５’末端に加えた。
ＲＴ−ＰＣＲ 通常の１００μｌのＲＴ−ＰＣＲ混合液は、鋳型、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４種すべてのｄＮＴＰｓ（それぞれ０．２ｍＭ）、５０ｐｍｏｌのダイレクトプライマー、５０ｐｍｏｌのリバースプライマー、４０ｕｎｉｔｓのＲＮａｓｉｎ（プロメガ Ｐｒｏｍｅｇａ）、１６ｕｎｉｔｓの鳥のミエロブラストシスウイルス逆転写酵素（プロメガ）、４ｕｎｉｔｓのＡｍｐｌｉＴａｑ（シータス Ｃｅｔｕｓ）からなり、１００μｌの軽ミネラルオイルをのせた。この混合液を、４２度で１時間保温し、３５回のＰＣＲサイクルで増幅した；９４度１分、４５度１分、７２度１分。ＰＣＲ産物を１%アガロースゲルを用いて解析した。
【００９９】
ＰＣＲ断片のクローニング 末端に制限酵素部位をもつＰＣＲ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、またはＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＢＲ３２２またはｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ）にクローン化した。あるいは、ＰＣＲ断片をＴＡクローニングキット（インビトロゲン Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ１０００（インビトロゲン）にクローン化した。
【０１００】
ＰＣＲ断片およびプラスミドの塩基配列決定 ＰＣＲ断片を１%アガロースゲルから切り出し、ジーンクリーン（バイオ１０１ Ｂｉｏ １０１、カリフォルニア州ラ ジョラ）によって精製した。２本鎖ＰＣＲ断片の塩基配列を、ウインシップ（Ｗｉｎｓｈｉｐ，Ｐ．Ｒ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｖ．，１７：１２２６）により記載されているように、シークエナーゼ（ユナイテッドステーツ バイオケミカル ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）によって決定した。ＣｓＣｌ勾配により精製した２本鎖プラスミドの塩基配列を、シークエナーゼキット（ユナイテッドステーツバイオケミカル）を用いて決定した。
【０１０１】
塩基配列のコンピュータ解析 ＨＥＶ株のヌクレオチド配列をジェネティックス コンピュータグループ（ウイスコンシン州マジソン）ソフトウエアーパッケージ（デベリュークスら Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｖ．，１２：３８７−３９５，ｖｅｒｓｉｏｎ７．５、VＡＸ ８６５０コンピュータを使用（国立ガン研究所 ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、メリーランド州フレデリック））を用いて比較した。
【０１０２】
実施例２
組換え発現ベクター，Ｐ６３−２の構築
ＨＥＶ株ＳＡＲ−５５のゲノムのＯＲＦ−２の全長を含むプラスミド（ツァレブら Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３）をＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ制限酵素断片を得るのに用いた。ＮｒｕＩはＨＥＶ ｃＤＮＡのＯＲＦ−２のＡＴＧ開始コドンの５ヌクレオチド上流を切断する。ＢｇｌＩＩ部位は、前以て、ＨＥＶゲノムの３'末端のポリＡ配列の直前に人為的におかれている（ツァレフら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３）。この断片をｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ ベクター（インビトロゲン）に挿入するために、合成ポリリンカーをベクターの唯一のＮｈｅＩ部位に導入した。このポリリンカーは、ＨＥＶ ｃＤＮＡ配列およびｐＢｌｕｅＢａｃ配列の両方に無いＢｌｎＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含む。ＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ ＯＲＦ−２断片を、図１に示すようなアダプターを用いてＢｌｎＩ−ＢｇｌＩＩ ｐＢｌｕｅＢａｃに挿入した。
【０１０３】
実施例３
ＳＦ９昆虫細胞中でのＰ６３−２の発現
ｐ６３−２およびＡｃＭＮＰVバキュロウイルスＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（インビトロゲン））を、インビトロゲン手順に従ったカルシウム沈澱法によってＳＦ９細胞（インビトロゲン）中に共形質転換した一本手順に従って；ＡｃＭＮＰVバキュロウイルスＤＮＡはｐ６３−２をパッケージして組換えバキュロウイルスを形成できる生きたバキュロウイルスを生産できる。この組換えバキュロウイルスは、４回プラーク精製した。生じた組換えバクロウイルス６３−２−ＩV−２を昆虫ＳＦ９細胞を感染させるのに使用した。
【０１０４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット 昆虫細胞をローディング緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＤＴＴ，２％ＳＤＳ，０．１％ブロモフェノールブルーおよび１０％グリセロール）中に再懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、イギリス（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０に記載されたように行った。ゲルをクマシーブルーで染色するまたはタンパク質をＢＡ−８５ニトロセルロースフィルター（シュライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）＆シュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ））上に電気ブロットした。トランスファーの後、ニトロセルロースメンブレンを１０％胎児牛血清および０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ中でブロックした。一次抗体として１：１０００に希釈したチンパンジー−１３１３の高度免疫血清を使用した。二次抗体として、１：２０００に希釈したヒトＩｇＧに対するホスファターゼでラベルした親和精製済みのやぎ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。フィルターをアルカリホスファターゼに対する基質を固定したウエスタンブルー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で現像した。全てのインキュベーションはブロッキング溶液中で行い、洗いは０．０５％トゥイーン−２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで行った。
【０１０５】
ＨＥＶ ＯＲＦ−２の発現 組換えバキュロウイルス６３−２−ＩV−２を感染させたＳＦ９細胞中で合成される主要なタンパク質は、見かけの分子量７４ｋＤのタンパク質であった（図２Ａ）。この大きさはＯＲＦ−２全体から予測されるものよりも（７１ｋＤ）少し大きい。大きさの違いは、Ｎ末端部分に少なくとも１つの潜在的な糖鎖付加部位（アスパラギン−ロイシン−セリン）が存在するため、タンパク質の糖鎖付加による可能性がある。このタンパク質は感染していない細胞または野生型の組換え体でないバキュロウイルスを感染させた細胞中では検出されなかった。後者の場合には、検出された主要なタンパク質は多面性ウイルス性タンパク質であった。同じ抽出物をチンパンジー−１３１３血清（ＨＥＶで高度に免疫済み）によるウエスタンブロットで解析すると、組換え細胞抽出物中のタンパク質のみが反応し、主要なバンドは再び７４ｋＤタンパク質として現れた（図２Ｂ）。少ない方のバンドはウエスタンブロットにおいてもまた存在した。これら中には糖鎖付加の程度の違いによる可能性がある７４ｋＤよりも大きい分子量のものがあり、また中にはプロセッシングおよび／または分解を反映したと思われるより低い分子量のものもあった。ＨＥＶで接種する前のチンパンジー−１３１３由来の血清は、ウエスタンブロットによるとどのタンパク質とも反応しなかった。
【０１０６】
実施例４
組換え体を感染させたＳＦ９細胞の免疫電子顕微鏡観察
組換え体を感染させたＳＦ９細胞 ５×１０６を、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４、０．３％サルコシルを含む塩化セシウム（１．３０ｇ／ｍｌ）中で音波処理し、６８時間４０，０００ｒｐｍで遠心した（ＳＷ６０Ｔｉ）。ＥＬＩＳＡ反応の最も高く、浮遊密度が１．３０ｇ／ｍｌである５０μｌの画分を１ｍｌ ＰＢＳ中に希釈し、５μｌのチンパンジー−１３１３高度免疫血清を加えた。高度免疫血清は、先に感染させたチンパンジーに肝炎Ｅの第二の株（メキシコのＨＥＶ）で再免疫を行うことによって調製した。試料は１時間室温、それから一晩４℃でインキュベートした。免疫複合体をＳＷ６０Ｔｉローターを使用して３０，０００ｒｐｍ，４℃、２時間で沈澱させた。ペレットを蒸留水中に再溶解し、３％ＰＴＡでネガティブに染色し、炭素グリッドに載せて電子顕微鏡ＥＭ−１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、オバーコッヘン、ドイツ中で４０，０００倍率にて調べた。
【０１０７】
VＰＬの検出
野生型または組換え体バキュロウイルス６３−２−ＩV−２を感染させた昆虫細胞由来の細胞抽出液を塩化セシウム密度勾配遠心によって画分化した。組換え体を感染させた昆虫細胞由来の塩化セシウム勾配の画分をチンパンジー−１３１３高度免疫血清と共にインキュベートすると、抗体で覆われたウイルス様の粒子（VＬＰ）二種類が浮遊密度１．３０ｇ／ｍｌの画分中に観察された：１つは（図３Ａ）、抗体で覆われた、ＨＥＶであることを示唆する大きさ（３０ｎｍ）および形態的構造を持つ個々の粒子、２つ目は（図３Ｂ）、ＨＥＶより小さい粒子であるがその他はＨＥＶに類似する抗体で覆われた粒子の塊（約２０ｎｍ）であった。直接的な電子顕微鏡の使用は、ウイルス粒子に似ているが抗体が結合していないのでＨＥＶとして確定できない、直径３０および２０ｎｍ等を含む非常にヘテロな集団の存在を示した。多くのＩＥＭ実験は、ＨＥＶゲノムのＯＲＦ−２領域から合成される少なくてもいくつかのタンパク質は粒子構造に組み立てられたことを示唆した。小さい方のタンパク質の比率が多い感染後期の昆虫細胞はＥＬＩＳＡで常に良い結果を与えたことが観察された。従って、感染後期の組換え昆虫細胞の未分画抽出液を以下の試験におけるＥＬＩＳＡ用の抗原として使用した。
【０１０８】
実施例５
抗ＨＥＶの完全なＯＲＦ−２を発現し、後にＨＥＶの異なる株で感染させた昆虫細胞の抗原に基づくＥＬＩＳＡによる検出
６３−２−ＩV−２ウイルスを感染させた５×１０６のＳＦ９細胞を１ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ塩化ナトリウム中に再懸濁し、それから３回凍結と融解を行った。この懸濁液１０μｌを１０ｍｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に溶解し、簡易マイクロタイター測定プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を覆うのに使用した。血清試料を１：２０、１：４００および１：８０００、または１：１００、１：１０００および１：１００００に希釈した。ウエスタンブロット用に上記に記載したのと同様のブロッキング溶液および洗い溶液をＥＬＩＳＡに使用した。二次抗体として、ヒトＩｇＧに対するペルオキシダーゼを結合させたヤギＩｇＧ画分または旧または新世界サルに対する西洋わさびペルオキシダーゼでラベルしたヤギ免疫グロブリンを使用した。結果は、４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．）を測定することによって決定した。
【０１０９】
ＨＥＶパキスタン株を代表する昆虫細胞由来の抗原がＨＥＶメキシコ株で感染させたカニクイザル中の抗ＨＥＶ抗体を検出できるかを決定するために、３匹のサルを調査した（図４）。サイノ（カニクイザル）−８０Ａ８２およびサイノ−９Ａ９７の二匹のサルをメキシコ’８６ＨＥＶ株（チセハースト、Ｊ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６５：８３５−８４５）を含む沈澱物で感染させ、および３匹目のサル、サイノ−８３を同じ株の二次培養物で感染させた。コントロールとして、パキスタンＨＥＶ株ＳＡＲ−５５で感染させたサイノ−３７４由来の血清試料を同様の実験で試験した。メキシコ株を感染させた３匹のサルはすべて抗ＨＥＶに血清が変換した。一次培養物感染由来の動物は１５週で血清が変換し、二次培養物感染由来のものは５週で変換した。興味深いことに、４匹の動物の中で最も高い抗ＨＥＶ力価はメキシコ株の二次培養物を接種したサイノ−８３であった。メキシコ株の一次培養物を接種したサイノは最も低い力価を示し、一方パキスタン株の一次培養物を接種したサイノは中間の力価を示した。
【０１１０】
実施例６
完全なＯＲＦ−２を発現する昆虫細胞由来の抗原に基づく抗ＨＥＶ ＥＬＩＳＡの特異性
本明細書中で記載したＥＬＩＳＡが、他の型の肝炎に関連する抗体を除外して、抗ＨＥＶを特異的に検出するかを調べるために、チンパンジーの血清試料を既知の他の肝炎ウイルスで感染させた４匹に付いて分析した（ガルシ、Ｐら．（１９９２），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６５：１００６−１００１；ファルシ，Ｐら．（１９９２），Ｓｃｌｅｎｃｅ（投稿中）；ポンゼットＡ．ら．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：７２−７７；リゼット；ｍら．（１９８１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １：５６７−５７４；チンパンジー−１４１３、１３７３、１４４２、１５５１（ＨＡV）についての参考；およびチンパンジー−９８２、１４４２、１４２０、１７１１０（ＨＢV）についての参考；はパーセルらの未発表データである。）（表１）。接種前の血清試料および接種後５週および１５週の血清試料を血清希釈１：１００、１：１０００および１：１００００にてＨＥＶ ＥＬＩＳＡ中で分析した。ＨＡV，ＨＢV，ＨＣV，およびＨＤVで感染させた動物由来の血清はどれもＨＥＶ抗体に対するＥＬＩＳＡで反応しなかったが、ＨＥＶで感染させた４匹全てのチンパンジーは抗ＨＥＶのＩｇＭおよびＩｇＧを発現した。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
実施例７
ヒト以外の霊鳥類におけるＨＥＶＳＡＲ−５５株の宿主範囲の決定
異なる霊鳥類の種に、ＨＥＶの標準的な便懸濁液を接種し、一連の血清試料を感染を測定するために集めた。血清ＡＬＴレベルを肝炎の指標として決定し、血清変換は抗ＨＥＶの検出によって決定された。
【０１１３】
ＨＥＶで感染させたアカゲザル（表２）はどちらも、血清変換と同様にＡＬＴ活性の非常に突出したピークを示した。増加するＡＬＴ活性の最初の徴候は両動物とも１４日目に観察され、決定的な血清変換は２１日目におきた。抗ＨＥＶの最大力価は２９日目に得られた。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
本実験で使用したアフリカミドリザルはどちらも（表２）ＡＬＴ活性および抗ＨＥＶの増大を表した。ＡＧＭ−２３０は接種後７週で死亡したが、感染の徴候はその時点より前に観察された。ＡＧＭ−７４は他の種で報告されているように（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中））ＡＬＴ活性の２型性の増加を示した。ＡＧＭ−７４およびＡＧＭ−２３０の血清変換は各々２７日目および２１日目に最初に観察された。
【０１１６】
接種した短い尾のマカク（ｍａｃａｑｕｅｓ）はどちらもＡＬＴ活性が僅かに増加したが、これらの増加は先に記載した動物の場合のように顕著ではなかった。しかし、両サルとも２１日目に血清変換し、抗ＨＥＶ力価はチンパンジーおよび他の旧世界サルと等しかった。
【０１１７】
本実験で接種したタマリンはどれもＡＬＴ活性の上昇または抗ＨＥＶへの血清変換を示さなかった（表２）。リスザルはチンパンジーおよび旧世界ザルよりも明らかに低い抗ＨＥＶレベルで反応した（表２）。血清変換の時期もまたこれら他の動物と比較すると遅延していた。ＳＱＭ−８６８は４１日目に血清変換し、ＳＱＭ−８６９は３５日目に血清変換した。抗ＨＥＶ力価は調査した３カ月以上の間どの時点でも１：４００より高くならず、どちらの動物でも４７−５４日目にピークに達してから明らかに衰微した。しかし、ＡＬＴ活性の増加は両動物においてかなり際だっていた。
【０１１８】
フクロウザルはＨＥＶ感染に対して旧世界ザル種とほぼ同様の反応を示した（表２）。どちらのＯＷＭも２１日目に血清変換し、２８日目までには抗ＨＥＶ力価が１：８０００の値まで到達した。ＡＬＴ活性はＯＷＮ−９２４では３５日目にピークになったが、ＯＷＭ−９２５では９１日目までピークにならなかった。
【０１１９】
実施例８
チンパンジーにおける抗ＨＥＶ ＩｇＭおよびＩｇＧの検出
両チンパンジーにおいて、血清ＡＬＴレベルは接種後約４週で増加した（表２、図５）。両チンパンジーともＡＬＴ酵素の上昇の時期またはそれより早くに血清変換した（図５Ａ、５Ｃ）。抗ＨＥＶ ＩｇＭのレベルもまたチンパンジーについて決定された。チンパンジー−１３７４では抗ＨＥＶ ＩｇＭの力価（図５Ｂ）はＩｇＧ力価（図５Ａ）ほど高くなく、２週で衰微した。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体はこの動物に付いて２０日目に最初に検出されたが、その日に抗ＨＥＶ ＩｇＭ力価は最も高く、一方、ＩｇＧ力価はその日に最も低く、それから上昇して３カ月以上およそ同じレベルにとどまった。チンパンジー−１３７５では、抗ＨＥＶ ＩｇＭのみが２０日目に検出された（図５Ｄ）。力価はチンパンジー−１３７４よりも高く、抗ＨＥＶ ＩｇＭは調査の期間中ずっと検出された。抗ＨＥＶ ＩｇＧはこの動物中で２７日目に最初に観察され（図５Ｃ）、実験中およそ同じレベルを保持した。
【０１２０】
実施例９
昆虫細胞中で発現させた完全なＯＲＦ−２タンパク質に基づくＥＬＩＳＡと大腸菌中で発現させた構造タンパク質の断片に基づくＥＬＩＳＡの比較
真核細胞中におけるＨＥＶゲノムの完全なＯＲＦ−２領域の発現は、大腸菌中での構造タンパク質断片の発現に対して何らかの利点があるかを調べるために、細菌中で発現させた抗原断片を使用して（表３）、我々はＥＬＩＳＡ中で以前の抗原を使用して先に分析したサイノモルガスザルの血清（Ｔｒａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＡＳ、８９：５５９−５６３；およびＴｒａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））を再試験した。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
血清はより感受性の低いＯＲＦ−３抗原でも試験した。
Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中）
ＥＬＩＳＡで調べた６匹のサルの３匹に付いて、昆虫細胞中で発現させた抗原は大腸菌中で発現させた抗原より早く血清変換を検出した。昆虫細胞由来の抗原を使用して、我々は最も高度に希釈した試験（１：８０００）ですべての６匹のサル由来の血清中に抗ＨＥＶ抗体を検出することができた。全ての血清を１：１００希釈で試験したが、大腸菌細胞由来の抗原（ブルマ株）では抗ＨＥＶ力価に付いて何の情報も得られなかった（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ；８９：５５９−５６３；Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））。
【０１２３】
別の実験で、肝炎ＥウイルスＳＡＲ−５５株を１０倍ずつ一連に希釈し、１０−１から１０−５希釈をウイルス力価を調べるために２匹のサイノモルガスザルに接種した。血清ＡＬＴレベルを測定して肝炎を決定し、ＨＥＶに対する血清抗体を本発明のＥＬＩＳＡ方法（図のデータ）またはＧｅｎｅｌａｂのＥＬＩＳＡ（図６ａ−ｇの下に陽性（＋）または陰性（−）試験で示したデータ）によって決定した。全ての試料はコード下で試験した。
【０１２４】
本発明のＥＬＩＳＡ法は接種した全てのサイノ中の抗ＨＥＶ ＩｇＧへの血清変換および全ての希釈ウイルスを検出した。
反対に、Ｇｅｎｌａｂの結果は以下にまとめたように著しく多様であった。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
サイノ３８５（１０−５）はＧｅｎｅｌａｂおよび本発明による両ＥＬＩＳＡ試験において陽性であるので、１０−４（１０回以上ウイルス接種した）および１０−３（１００回以上ウイルス接種した）もまた陽性であると予想された。サイノ３８３および３９３のＡＬＴレベルは活性型の肝炎であることを示唆したが、１０−３および１０−４の一つで両方陽性ではないというＧｅｎｌａｂのＥＬＩＳＡとは反対に、本発明はそれらを陽性として数えた。それ故、データはＨＥＶの抗体を検出する先の技術の方法よりも本ＥＬＩＳＡ方法が優ることを支持した。
【０１２７】
実施例１０
ワクチンとしての完全なＯＲＦ−２タンパク質の使用
以前に上述したように、組換えＯＲＦ−２タンパク質は免疫反応性がある。さらに、異なるＨＥＶ株で感染させた異なる動物種から得た様々な血清と反応することが示された。これは様々なＨＥＶ株を予防するためのワクチンとしてのこの組換えタンパク質の使用が支持されることを示す。哺乳類は保護抗体の生産を刺激するのに十分な量の精製または部分的に精製した組換えＯＲＦ−２タンパク質で免疫される。ＨＥＶの野生株で免疫性試験した免疫済みの動物は保護される。
【０１２８】
全ての引用文献、すなわち論文刊行物、特許および類似物の内容は、本明細書中に参照として組み入れてある。
本明細書中に記載された実施例および態様は実例を示す目的であり、当該技術分野に従事する人によるこれらの若干の修飾および改変は本出願の思想及び範囲、並びに請求の範囲の範囲内に含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１はＨＥＶ株ＳＡＲ−５５の完全なＯＲＦ−２タンパク質の発現に使われる組み換えベクターを示す。
【図２】図２ＡおよびＢは、野生型バキュロイウルス若しくは組み換えバキュロウイルス（ＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む）を感染させた昆虫細胞の細胞溶解物を、クマシーブルーで染めた（Ａ）若しくはＨＥＶ感染チンパンジーの血清でウェスタンブロットにかけた（Ｂ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【図３Ａ】図３Ａは、３０および２０ｎｍのウイルス様粒子（組み換え感染昆虫細胞でＯＲＦ−２タンパク質の発現結果として形成される）の免疫電子ミクログラフ（ＩＥＭ）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３０および２０ｎｍのウイルス様粒子（組み換え感染昆虫細胞でＯＲＦ−２タンパク質の発現結果として形成される）の免疫電子ミクログラフ（ＩＥＭ）を示す。
【図４】図４は、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中の抗ＨＥＶ抗体レベルは、ＨＥＶメキシコ株（Ｃｙｎｏ−８０Ａ８２，Ｃｙｎｏ−９Ａ９７およびＣｙｎｏ ８３）若しくはパキスタン株（Ｃｙｎｏ−３７４）をカニクイザルに接種してからの様々な時間で決定した。
【図５Ａ】図５Ａは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図６Ａ】図６Ａは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｇ】図６Ｇは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｈ】図６Ｈは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｉ】図６Ｉは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｊ】図６Ｊは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は肝炎ウイルス学の分野に関する。特に、本発明は、腸伝染性のＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５由来の組み換えタンパク質、並びにこれらのタンパク質を使った診断法およびワクチン応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術
腸伝染性非Ａ／非Ｂ型肝炎であるＥ型肝炎の流行は、アジア、アフリカおよび中央アメリカにおいて報告されている（バラヤン（Ｂａｌａｙａｎ），Ｍ．Ｓ．（１９８７）、Ｓｏｖｉｅｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ，Vｉｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ズダノフ（Ｚｈｄａｎｏｖ），V．Ｍ．（編）、クール、スイス：Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｖｏｌ．２，２３５−２６１；ザッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ），Ａ．Ｊ．（編）、パーセル（Ｐｕｒｃｅｌｌ），Ｒ．Ｇ．ら、（１９８８）、“Vｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ“，ニューヨーク：アラン Ｒ．リス（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ），１３１−１３７；ブラドレー（Ｂｒａｄｌｅｙ），Ｄ．Ｗ．（１９９０），Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４６：４４２−４６１；ホリンガー（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ），Ｆ．Ｂ．、レモン（Ｌｅｍｏｎ），Ｓ．Ｍ．、マーゴリス（Ｍａｒｇｏｌｉｓ），Ｈ．Ｓ．（編）、ティチェハースト（Ｔｉｃｅｈｕｒｓｔ），Ｊ．Ｒ．（１９９１）：“Vｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，バルチモア，５０１−５１３）。散発性肝炎のケース（Ｅ型肝炎と推定される）は、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が風土病である国では、報告される肝炎の９０％にまで達する。感染した個体の血清中の抗ＨＥＶ抗体の検出に関する血清学的試験の開発の必要性は、当該分野で広く認識されているが、しかし感染個体もしくは動物から排出されるＨＥＶが非常に低濃度なため、そのようなＨＥＶを血清学的試験用の抗原のソースとして利用することは不可能であった。そして細胞培養でのＨＥＶの増殖において制限付きの成功が報告された（ファン（Ｈｕａｎｇ），Ｒ．Ｔ．ら（１９９２），Ｊ．Ｇｅｎ．Vｉｒｏｌ．，７３：１１４３−１１４８）が、血清学的試験に必要な量の抗原を生産するには、細胞培養は現行ではあまりにも非能率的である。
【０００３】
最近、世界中の多くの労力がＥ型肝炎に関するウイルスゲノム配列を同定するために払われたことにより、数は限られているが幾つかのＨＥＶ株のゲノムがクローン化された（タン（Ｔａｍ），Ａ．Ｍ．ら（１９９１），Vｉｒｏｌｏｇｙ，１８５：１２０−１３１；ツァレフ（Ｔｓａｒｅｖ），Ｓ．Ａ．ら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３；フライ（Ｆｒｙ），Ｋ．Ｅ．ら（１９９２），Vｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，６：１７３−１８５）。ＤＮＡ配列の解析から、研究者たちは、ＨＥＶゲノムが３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に組織されているという仮説、並びにこれらのＯＲＦがインタクトなＨＥＶタンパク質をコードするという仮説を立てるに至った。
【０００４】
ビルマ（ミャンマー）からのＨＥＶ株のゲノムの部分ＤＮＡ配列がレイエス（Ｒｅｙｅｓ）ら１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３３５−１３３９に開示されている。タンら、１９９１、およびレイエスら、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１５６０３号（１９９１年１０月１７日公開）は、ＨＥＶビルマ株の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を開示している。これらの著者たちは、３つの順方向のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が本株の配列内に含まれると仮説を立てた。
【０００５】
イチカワ（Ｉｃｈｉｋａｗａ）ら、１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３５：５３５−５４３は、ＨＥＶ感染したカニクイザルからの血清でλｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングした際に、長さ２４０−３２０ヌクレオチドの一連のクローンが単離されたことを開示している。１つのクローンにより発現される組み換えタンパク質を大腸菌で発現させた。この融合タンパク質は、ＨＥＶミャンマー株のＯＲＦ−２の３’領域にコードされる。
【０００６】
ＨＥＶメキシコ株およびＨＥＶビルマ株のＯＲＦ−２の３’領域内にコードされるさらに別のタンパク質の発現について、ヤーボー（Ｙａｒｂｏｕｇｈ）ら、１９９１ Ｊ．Vｉｒｏｌｏｇｙ，６５：５７９０−５７９７が記載している。この論文は、ＨＥＶ由来の２つのｃＤＮＡクローンの単離を記載している。これらのクローンがＯＲＦ−２の３’領域のタンパク質群をコードする。そのクローンを大腸菌内で融合タンパク質として発現させた。
【０００７】
パーディ（Ｐｕｒｄｙ）ら、１９９２，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Vｉｒｏｌｏｇｙ，１２３：３３５−３４９、およびファボロフ（Ｆａｖｏｒｏｖ）ら、１９９２，Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Vｉｒｏｌｏｇｙ，３６：２４６−２５０は、ビルマ株からのより大きなＯＲＦ−２タンパク質断片の大腸菌での発現を開示している。これらの参考文献は、以前に考察したものと同様に、細菌発現系を用いたＯＲＦ−２遺伝子の一部の発現の開示でしかない。ＯＲＦ−２タンパク質全長を首尾よく発現させることは、本発明までは開示されたことがなかった。
【０００８】
ＨＥＶのゲノム構成および形態学的構造を他のウイルスのそれと比較することにより、ＨＥＶがカリチウイルス（ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）に最も近縁であることがあきらかとなった。興味深いことに、カリチウイルスの構造タンパク質群はゲノムの３’部分にコードされる（ネイル（Ｎｅｉｌ），Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）Ｊ．Vｉｒｏｌ．，６５：５４４０−５４４７；およびカーター（Ｃａｒｔｅｒ），Ｍ．Ｊ．ら、（１９９２），Ｊ．Ａｒｃｈ．Vｉｒｏｌ．，１２２：２２３−２３５）。そしてＨＥＶゲノムの３’端部分も構造タンパク質群をコードするという直接的証拠は無いが、３’ゲノム領域のある小さな部分を細菌細胞で発現させると、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにおいて抗ＨＥＶ血清と反応するタンパク質群が生産される（ヤーボーら、（１９９１）；イチカワら、（１９９１）；ファボロフら、（１９９２）およびドーソン（Ｄａｗｓｏｎ），Ｇ．Ｊ．ら、（１９９２）Ｊ．Vｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３８：１７５−１８６）。しかし、構造タンパク質としてのＯＲＦ−２タンパク質の機能は、本発明までは証明されなかった。
【０００９】
ＯＲＦ−２遺伝子の一部によりコードされる小さなタンパク質群は、動物血清中のＨＥＶに対する抗体を検出するイムノアッセイに利用されてきた。細菌で発現された小さなタンパク質群を血清学的なイムノアッセイにおいて抗原として利用することは、幾つかの潜在的な欠点を有している。第１に、細菌細胞でのこれらの小タンパク質の発現は、可溶性に関する問題、ならびにイムノアッセイに大腸菌の粗溶解物を抗原として用いた場合の、患者血清の大腸菌タンパク質との非特異的交差反応をもたらす（パーディら、（１９９２））。第２に、ルーチン疫学において抗ＨＥＶ抗体に関する血清学的試験の最初のラインとしてウェスタンブロットを用いることは、時間的および経済的制約から実践的ではない。ＨＥＶゲノムの３’端部分由来の小ペプチドを用いたＥＬＩＳＡは、既知のＨＥＶ感染患者中の４１％しか陽性として検出できなかった。第３に、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅに最も近い科であるＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅを含め、多くのウイルスに関して、重要な抗原および免疫原エピトープは立体構造性が高い（ホリンガー，Ｆ．Ｂ．、レモン（Ｌｅｍｏｎ），Ｓ．Ｍ．、マーゴリス，Ｈ．Ｓ．（編）、レモン，Ｓ．Ｍ．ら、（１９９１）：“Vｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，バルチモア、２０−２４）。それゆえ、インタクトなＨＥＶ遺伝子をコードする完全なＯＲＦを真核細胞系で発現させれば、ＨＥＶウイルス様粒子を形成し得るタンパク質の生産をもたらすのではないかと考えられる。そのような完全なＯＲＦタンパク質であれば、上記のより小さなタンパク質（ＨＥＶ構造タンパク質の一部しか表していない）よりも天然のキャプシドタンパク質（群）の免疫学的構造に近い構造を持つだろう。それ故、これらの完全なＯＲＦタンパク質は、現在使われているより小さなタンパク質よりも、より代表的な抗原として並びにより有効な免疫原として役立ちそうである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、分離されて実質的に純粋な、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５の調製品に関する。
【００１１】
本発明はまた、分離されて実質的に純粋な、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５のゲノムＲＮＡの調製品に関する。
本発明はさらに、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５のｃＤＮＡに関する。
【００１２】
本発明の目的は、組み換えＨＥＶタンパク質を生産させることのできる合成核酸配列を、等価な天然核酸配列以外に提供することである。そのような核酸配列は、ＨＥＶタンパク質を合成させることのできる遺伝子を同定し分離することのできるｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから分離することができる。
【００１３】
本発明はさらに、ＳＡＲ−５５ ｃＤＮＡ由来のプライマーを用いたＥ型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいた、生物試料中のＥ型肝炎ウイルスの検出法に関する。
本発明はまた、ＳＡＲ−５５ ｃＤＮＡ由来の一本鎖アンチセンスのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを用いて、Ｅ型肝炎遺伝子の発現を阻害することに関する。
【００１４】
本発明はまた、ＳＡＲ−５５のＨＥＶゲノムにコードされる、または合成核酸配列によりコードされる、単離され実質的に精製されたＨＥＶタンパク質およびその変異体に、特に少なくとも１つの完全なＨＥＶオープンリーディングフレームにコードされる組み換えタンパク質に関する。
【００１５】
本発明はまた、核酸をクローン化し、ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、そして宿主細胞中で組み換えタンパク質を発現させることによって、ＨＥＶゲノム配列由来の組み換えＨＥＶタンパク質を調製する方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、得られた組み換えタンパク質を診断薬およびワクチンとして利用することに関する。本発明はまた、生物試料中のＥ型肝炎ウイルスに特異的な抗体を検出する方法も含む。そのような方法は、ＨＥＶが引き起こす感染症および疾患の診断、並びにそのような疾患の進行の監視に有用である。そのような方法はまた、哺乳動物でのＨＥＶ感染症および疾患の治療過程において治療薬の効力をモニターするのにも有用である。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物でのＥ型肝炎の予防もしくは治療に使われる医薬構成物にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、分離されて実質的に純粋な、パキスタンからのＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ＳＡＲ−５５株に関する。本発明はまた、ＨＥＶタンパク質をコードするウイルス遺伝子のクローン化および発現系を用いた組み換えタンパク質の発現にも関する。
【００１９】
本発明は分離されたタンパク質に関する。望ましくは、本発明のＨＥＶタンパク質は天然のＨＥＶタンパク質に実質的に相同であり、最も望ましくはそれと生物学的に等価である。本明細書および特許請求の範囲を通して使われる「生物学的に等価」によって意味されることは、その構成物がウイルス様粒子を形成でき、免疫原たりうることである。本発明のＨＥＶタンパク質はまた、哺乳動物に注射すると、野生型ＨＥＶに挑戦するときに該哺乳動物を防御してくれる防御抗体の生産を刺激することもできる。本明細書の以下の部分および特許請求の範囲を通して使われる「実質的に相同」によって意味されることは、アミノ酸配列の天然ＨＥＶタンパク質との相同性の度合いである。望ましくは相同性の度合いは７０％より大きく、好適には９０％を越え、特に好適なタンパク質のグループについては天然のＨＥＶタンパク質との相同性が９９％を越える。
【００２０】
好適なＨＥＶタンパク質はＯＲＦ遺伝子にコードされるタンパク質である。ＨＥＶのＯＲＦ−２遺伝子にコードされるタンパク質は特に興味深く、ＨＥＶのＳＡＲ−５５株のＯＲＦ−２遺伝子にコードされるタンパク質は最も興味深い。ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として以下に示される：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【００２１】
【化１】
【００２２】
【化２】
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
【００２６】
【化６】
【００２７】
【化７】
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
【００３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【００３１】
【化１０】
【００３２】
【化１１】
【００３３】
【化１２】
【００３４】
【化１３】
【００３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
【００３６】
【化１４】
【００３７】
３文字の略号は、２０の天然に存在するアミノ酸に対する慣例のアミノ酸速記法に従う。
【００３８】
好適な組み換えＨＥＶタンパク質は少なくとも１つのＯＲＦタンパク質を含む。同じもしくは異なるＯＲＦタンパク質群を複数含む他の組み換えタンパク質を、該タンパク質の生物学的特性を変更するように作製することもできる。種々のアミノ酸もしくは種々のアミノ酸配列の付加、置換もしくは欠失が該ＨＥＶタンパク質の生物学的活性を高めうることも予期される。
【００３９】
本発明はまた、上述のＨＥＶタンパク質もしくは該ＨＥＶタンパク質群に実質的に相同なタンパク質群を生産させることのできる核酸配列である。この核酸配列は、ＳＡＲ−５５と名付けられ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として以下に示され、１９９２年９月１７日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【００４０】
【化１５】
【００４１】
【化１６】
【００４２】
【化１７】
【００４３】
【化１８】
【００４４】
【化１９】
【００４５】
ヌクレオチドに用いた略号は当該分野で標準的に用いられるものである。
一方向の配列を、ＲＮＡウイルスのタンパク質をコードする鎖であることから、慣習により「プラス」配列と表記するが、これは上でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示した配列である。
【００４６】
ＳＡＲ−５５のオープンリーディングフレームの推定されるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である。ＯＲＦ−１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド２８から始まり５０７８ヌクレオチド広がる。ＯＲＦ−２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド５１４７から始まり１９７９ヌクレオチド広がる。ＯＲＦ−３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド５１０６から始まり３６８ヌクレオチド広がる。
【００４７】
ＤＮＡ配列中の変異の結果、ＯＲＦ−２タンパク質の類似物の産生を指示しうるＤＮＡ配列となることもありうると考えられる。上述のＤＮＡ配列は、本発明の好ましい態様を表すものであることに注意されたい。遺伝コードの縮重により、上記のＯＲＦタンパク質またはその類似体の産生を指示しうるＤＮＡ配列とするのに、莫大なヌクレオチドの選択を行えることを、理解すべきである。従って、上述の配列と機能的に同じＤＮＡ配列、またはＯＲＦタンパク質の類似物を上述のアミノ酸配列に準じて産生するよう指示する配列と機能的に同じＤＮＡ配列は、本発明に含まれるものとする。
【００４８】
本発明は生物試料中のＥ型肝炎ウイルスを、Ｅ型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいて検出する方法に関するものである。望ましい形では、本方法はＤＮＡ二重鎖断片の相補鎖の非相同領域に由来する一組の一本鎖プライマーを使用するが、そのＤＮＡ二重鎖断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示したＳＡＲ−５５配列に相同性をもつ領域を含むゲノムを有するＥ型肝炎ウイルスに由来するものである。これらのプライマーを、米国特許第４，６８３，２０２号に規定される特定の核酸配列の増幅過程に従う方法に用いることができる。
【００４９】
本発明はまた、ＳＡＲ−５５ ｃＤＮＡに相同性をもつ配列に由来する一本鎖アンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いて、Ｅ型肝炎遺伝子の発現を阻害することに関するものである。これらのアンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標的とする配列は典型的にはメッセンジャーＲＮＡであり、より好ましいのはＲＮＡのプロセッシングと翻訳に必要なシグナル配列である。アンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、レマイター、Ｍら（Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２）の記述のようにポリリジンなどのポリ陽イオンに結合することができ、この結合物の十分量を哺乳類に投与し、メッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズさせ、その機能を阻害することができる。
【００５０】
本発明はＨＥＶタンパク質の作製のための組換えＤＮＡ法を含み、ＨＥＶタンパク質として望ましいのは少なくとも一つのＯＲＦタンパク質から構成されるタンパク質、最も望ましいのは少なくとも一つのＯＲＦ−２タンパク質から構成されるタンパク質である。組換えＯＲＦタンパク質は一つのＯＲＦタンパク質で構成されるか、または同種あるいは異なるＯＲＦタンパク質の組合せで構成される。天然の核酸配列または合成核酸配列を用いて、ＨＥＶタンパク質の産生を指示することができる。
【００５１】
本発明の一つの態様では、方法は以下の工程を包含する：
（ａ）宿主生物にＨＥＶタンパク質の産生を指示できる核酸配列を調製し；
（ｂ）宿主生物に導入し複製できるベクターで、核酸配列に対する調節要素を含むようなベクターへ核酸配列をクローン化し；
（ｃ）タンパク質を発現できる宿主生物へ、核酸配列と調節要素を含むベクターを導入し；
（ｄ）ベクターの増幅とタンパク質の発現に適当な条件下で宿主生物を培養し；そして
（ｅ）タンパク質を回収する。
【００５２】
本発明のもう一つの態様では、ＨＥＶの核酸でコードされるタンパク質の組換えＤＮＡ合成法は以下のものを包含する。ここでＨＥＶタンパク質は望ましくは少なくとも一つのＨＥＶＯＲＦでコードされるか、または同種あるいは異なるＯＲＦタンパク質の組合せでコードされ、最も望ましくは少なくとも一つのＯＲＦ−２核酸配列でコードされる：
（ａ）宿主生物を形質転換またはトランスフェクションして、宿主生物にタンパク質産生を指示しうる核酸配列を持たせ、タンパク質を産生する条件下でこれを培養すること。ここで前述のタンパク質は、ＨＥＶから単離されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の生来のＨＥＶタンパク質、またはこの組み合わせと実質的に相同性を示すアミノ酸配列を持つものである。
【００５３】
一つの態様ではＨＥＶ株ＳＡＲ−５５のウイルスゲノムのＲＮＡ配列を単離し、以下のようにクローン化しｃＤＮＡとした。ＳＡＲ−５５を感染させたカニクイザルから集めた生物試料より、ウイルスＲＮＡを抽出した後、ウイルスＲＮＡを逆転写し、Ｂｕｒｍａ（タムら（Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．））由来のＨＥＶ株のゲノムまたはＳＡＲ−５５ゲノムのプラス鎖またはマイナス鎖に相補的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。ＰＣＲ断片はｐＢＲ３２２またはｐＧＥＭ−３２にサブクローン化し、二重鎖ＰＣＲ断片の配列を決定した。
【００５４】
本発明に用いることが考えられるベクターには、上に記載した核酸配列を望ましいまたは必要な任意の調節要素と共に挿入することが可能で、さらにその後宿主生物に導入し、そうした生物中で複製可能な全てのベクターが含まれる。望ましいベクターは制限部位がよく記録され、核酸配列の転写に望ましいまたは必要な調節要素を含むものである。
【００５５】
本明細書で論じる「調節要素」には、少なくとも一つのプロモーター、少なくとも一つのオペレーター、少なくとも一つのリーダー配列、少なくとも一つの終止コドン、およびベクター上の核酸の適当な転写とその後の翻訳に必要または望ましい配列全てを含む。特にこうしたベクターとして考えられるのは、宿主生物が認識する少なくとも一つの複製起点を含み、また少なくとも一つの選択マーカー、核酸配列の転写開始を可能とする少なくとも一つのプロモーター配列が存在するものである。
【００５６】
本発明のクローン化ベクターの構築では、核酸配列とこれに付随する調節要素を多コピーで各ベクターに挿入できることを、付加的に記さねばならない。こうした態様では宿主生物は、望みのＨＥＶタンパク質をベクターあたり大量に産生する。ベクターに挿入できるＤＮＡ配列の多コピー数を制限するのは、結果として生じるベクターがその大きさで、適当な宿主微生物に導入され複製、転写される能力を持つか否かだけである。
【００５７】
もう一つの態様では、ＨＥＶタンパク質のコーディング配列を含んだ制限酵素消化断片を、原核または真核細胞中で機能する適当な発現ベクターに挿入することができる。ここで適当というのは、ＨＥＶタンパク質をコードする完全な核酸配列を、望ましくは少なくとも一つの完全なＯＲＦタンパク質をコードする完全な核酸配列を、ベクターが運搬し発現できることを意味する。ＯＲＦ−２の場合には、発現されたタンパク質はウイルス様の粒子を形成しなければならない。望ましい発現ベクターは、真核細胞で機能するものである。こうしたベクターの例にはワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス、望ましいものとしてバキュロウイルス導入ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃが含まれるが、これらに制限される訳ではない。望ましいベクターは完全なＯＲＦ−２遺伝子を含むｐ６３−２、および完全なＯＲＦ−３とＯＲＦ−２遺伝子を含むＰ５９−４である。これらのベクターは１９９２年９月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２ ＵＳＡに寄託された。実施例１はＯＲＦ−２遺伝子をｐＢｌｕｅＢａｃにクローン化しｐ６３−２を作製した例を説明している。この方法に含まれるのは、ＳＡＲ−５５ ＨＥＶ株のゲノムの制限酵素ＮｒｕＩおよびＢｇｌＩＩによる消化、ベクター上の唯一のＮｈｅＩ部位へのＢｌｎＩＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含むポリリンカーの挿入、およびＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ ＯＲＦ−２断片のＢｌｎＩ−ＢｇｌＩＩ Ｐｂｌｕｅｂａｃへのアダプターを用いた挿入である。
【００５８】
さらにもう一つの態様では、組換えタンパク質の発現を目的として、選択した組換え発現ベクターを適当な真核細胞系に導入することもできる。こうした真核細胞系に含まれるのは、ＨｅＬａ、ＭＲＣ−５またはＣｖ−１などの細胞系であるが、これらに制限される訳ではない。望ましい真核細胞系はＳＦ９昆虫細胞である。一つの望ましい方法にはＰｂｌｕｅｂａｃ発現ベクターの使用が含まれるが、ここでは昆虫細胞系ＳＦ−９を組換えＰｂｌｕｅｂａｃとＡｃＭＮＰVバキュロウイルスＤＮＡでＣａ沈澱法により同時形質転換する。
【００５９】
発現した組換えタンパク質は当該分野で知られる方法で検出することができ、これにはクマジーブルー染色、および実施例２に示すような抗ＨＥＶ抗体を含んだ血清を用いたウェスタンブロッティングが含まれる。もう一つの方法は実施例３に示すような、免疫電子顕微鏡によるウイルス様粒子の検出である。
【００６０】
さらに他の態様では、ＳＦ−９細胞で発現された組換えタンパク質を粗抽出物として調製したり、または当該分野で知られる標準的なタンパク質精製操作で精製することも可能であり、こうした操作には分離沈澱、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点焦点電気泳動、ゲル電気泳動、親和性および免疫親和性クロマトグラフィーなどが含まれる。免疫親和性クロマトグラフィーの場合には、ＯＲＦタンパク質に特異的な抗体を結合させたレジンを含むカラムを通過させることで、組換えタンパク質を精製できる。
【００６１】
もう一つの態様では、本発明で発現した組換えタンパク質を用いて、哺乳類のＥ型肝炎の診断、予後のための免疫検定を行うことができる。ここで哺乳類にはヒト、チンパンジー、旧世界サル、新世界サル、その他の霊長類などが含まれるが、これに制限される訳ではない。望ましい態様では、免疫検定はヒトのＥ型肝炎感染の診断に有用である。ＨＥＶタンパク質、特にＯＲＦタンパク質、とりわけＯＲＦ−２タンパク質を用いた免疫検定は、部分的なＯＲＦタンパク質を用いた免疫検定とは対照的に、特異性、感受性、再現性の高いＨＥＶ感染の診断法を供給する。
【００６２】
本発明の免疫検定は放射性免疫検定、ウェスタンブロット検定、免疫蛍光検定、酵素免疫検定、化学発光検定、免疫組織化学検定などでよい。当該技術分野で知られる標準的なＥＬＩＳＡの手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎローズとビガッジ編（Ｒｏｓｅ & Ｂｉｇａｚｚｉ ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８０とキャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗ．Ａ． Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４に記載されており、両者は本明細書に参考文献として取り入れてある。こうした検定は当該技術分野に記載されているように、直接、間接、競争または非競争の免疫検定でありうる。（オレリッヒ，Ｍ（Ｏｏｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．１９８４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５−９０４）こうした検出検定に適した生物試料に含まれるのは、組織生検抽出物、全血液、血漿、血清、脳脊髄液、胸膜液、尿などが含まれるが、これらに限定される訳ではない。
【００６３】
一つの態様では、試験する血清を固体相試薬と反応させるが、この固体相試薬の表面には組換えＨＥＶタンパク質を抗原として結合してあり、特に一つのＯＲＦタンパク質またはＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３といった異なるＯＲＦタンパク質の組合せを、抗原として結合してあるのが望ましい。より望ましい形では、ＨＥＶタンパク質はウイルス様粒子を形成するＯＲＦ−２タンパク質である。固体表面試薬は、タンパク質を固体支持物質に結合させる既知の手法により調製できる。こうした結合法にはタンパク質の支持体への非特異的吸収、または支持体上の反応基へのタンパク質の共有結合が含まれる。抗原を抗ＨＥＶ抗体と反応させた後、結合しなかった血清成分を洗浄して除き、抗原抗体複合体を、標識した抗ヒト抗体などの二次抗体と反応させる。固体支持体を適当な蛍光または比色試薬の存在下でインキュベートすることにより検出できるような酵素を、標識として用いることもできる。放射性標識または金コロイドなどの他の検出標識を用いることもできる。
【００６４】
望ましい態様では、ＳＡＲ−５５のＯＲＦ−２配列全体を含んだＰｂｌｕｅｂａｃ組換えベクターにより発現されるタンパク質は、抗ＨＥＶ抗体、望ましい形ではＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を検出する特異的な結合試薬として使用できる。実施例４および５は、固体相試薬が組換えＯＲＦ−２を表面抗原としてもつようなＥＬＩＳＡの結果を示す。ＯＲＦ−２核酸配列全体でコードされるこのタンパク質は、部分的なＯＲＦ−２タンパク質より優れる。なぜならＨＥＶを感染させた異なる霊長類種のより多くの抗血清に対して、このタンパク質は部分的なＯＲＦ−２抗原よりも反応するからである。本発明のタンパク質はＨＥＶの異なる株に応答して産生された抗体も検出できるが、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎またはＤ型肝炎に応答した抗体は検出しない。
【００６５】
ＨＥＶタンパク質およびその類似体は単体として、または二次抗体などの他の試薬との組合せとして、免疫検定用のキットの形で調製できる。
本発明の組換えＨＥＶタンパク質は、望ましい形では単独のＯＲＦタンパク質またはＯＲＦタンパク質の組合せ、さらに望ましいのはＯＲＦ−２タンパク質であるが、このタンパク質および実質的に相同性をもつタンパク質、および類似体は、哺乳類のＥ型肝炎による感染を防ぐワクチンとして用いることができる。免疫原として作用するワクチンは、細胞、組換え発現ベクターで形質転換した細胞の細胞溶解物または発現されたタンパク質を含んだ培養上清が考えられる。この代わりに免疫原は部分的または実質的に精製された組換えタンパク質でもよい。免疫原を純粋な形または実質的に純粋な形で投与することも可能であるが、薬剤組成物、処方薬、製剤として提示する方が望ましい。
【００６６】
本発明の処方薬は、家畜の治療およびヒトへのの用法のいずれでも、上に記載の免疫原と薬学的に受理できる一種または複数の担体、および随意に他の治療上の成分を含む。担体は、処方薬中の他の成分と両立し、薬の受血者に有害ではないという意味で「受容できる」ものでなければならない。処方薬は投薬量単位という形で便利に提示することが可能であり、薬学技術分野でよく知られるいかなる方法でも調製できる。
【００６７】
全ての方法には、活性のある成分を一種または複数の付属成分を構成する担体と結合させる段階が含まれる。一般に処方薬の調製の際には、均一かつ精細に活性のある成分を、液体担体または細かく砕いた固体担体またはその両者に結合させ、後に必要であれば調製物を望みの処方薬の形にする。
【００６８】
静脈、筋肉、皮下、腹腔内投与に適した処方薬は、披投与者の血液と等張であることが望ましい溶液に、活性のある成分を溶かした無菌水溶液を含むのが、便利である。こうした処方薬を調製するには、塩化ナトリウム（たとえば０．１−２．０Ｍ）、グリシンなどの生理的に害のない基質を含み、水溶液を作製するのに生理的条件と両立するような緩衝化Ｐｈをもつ水に固体活性成分を溶解させ、この水溶液を滅菌するのが便利である。これらはたとえば封印したアンプルまたはバイアル瓶といった、投薬量単位または複数の投薬量の入った入れ物で提供することもできる。
【００６９】
本発明の処方薬は安定剤を含むこともできる。実例となる安定剤はポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機酸、有機酸であり、これらは単独でまたは添加物として用いることができる。これらの安定剤は免疫原の単位重量あたり０．１１−１０，０００の重量部で取り込ませるのが望ましい。二種またはそれ以上の安定剤を用いるのであれば、その総量を上に規定した範囲内にするのが望ましい。これらの安定剤は適当な濃度とＰｈの水溶液で用いる。こうした水溶液の特異的浸透圧は一般に０．１−３．０オスモルの範囲で、０．８−１．２の範囲が望ましい。水溶液のＰｈは５．０−９．０の範囲に調整するべきで、６−８の範囲が望ましい。本発明の免疫原を処方薬とする際には、抗吸着試薬を用いることもできる。
【００７０】
作用の持続期間を制御するために、付加的な薬学的方法を使用することもできる。制御放出製剤は、重合体を用いてタンパク質およびその派生物を複合体とする、または吸収させることで作製することができる。制御された放出を果たすには、適当な巨大分子（たとえばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニル酢酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン）を選択し、巨大分子の濃度と、制御放出のための取り込みの方法を選択すればよい。制御放出製剤による作用の持続期間の制御として可能なもう一つの方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ酪酸、エチレンビニル酪酸共重合体などの重合体物質の粒子に、タンパク質、タンパク質類似体およびこれらの機能的な派生物を取り込ませることである。一方これらの試薬を重合体粒子に取り込ませる代わりに、これらの物質を微量カプセルまたはコロイド薬剤放出系またはマクロ乳剤に入れることも可能であり、こうしたカプセルの調製はたとえばコアセルベーション技術や界面重合化が考えられ、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン微量カプセル、ポリメチルメタクリレート微量カプセルを例として挙げられるし、コロイド薬剤放出系としてたとえばリポソーム、アルブミン微小球、微小乳剤、ナノ粒子、ナノカプセルが考えられる。
【００７１】
経口調剤が望ましい場合には、組成物をとりわけラクトース、スクロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウムタルク、クリスタリンセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムといった典型的な担体に結合させることもできる。
【００７２】
本発明のタンパク質は、キットの形で、単独で、または上に記載した薬剤組成物の形で供給することもできる。
ワクチン化は一般な方法で行える。たとえば生理的食塩水または水などの適当な希釈剤中で、または完全あるいは不完全なアジュバント中で免疫原を用いることができる。さらに免疫原を担体に結合させて、免疫原タンパク質を作製することもできるし、また特にそのようにしなくてもよい。こうした担体分子の例にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイドなどが含まれるが、これに制限される訳ではない。免疫原は、静脈、腹腔内、筋肉、皮下などの抗体作製に適当ないかなる経路によっても、投与することができる。免疫原は有意な力価の抗ＨＥＶ抗体が産生されるまで、一回または定期的な期間で投与する。血清中の抗体は、免疫検定を用いて検出できる。
【００７３】
本発明の免疫原の投与は予防または治療を目的とすることができる。予防のための供給の場合には、免疫原はＨＥＶへのいかなる被曝よりも先んじて、あるいはＨＥＶ感染によるいかなる徴候よりも先んじて投与される。免疫原を予防用として投与することで、哺乳類でのその後のＨＥＶのいかなる感染をも防止あるいは緩和することができる。治療用として供給する際には、感染の始めに（またはそのすぐ後に）、またはＨＥＶに起因する感染または症状の始めに、免疫原を投与する。免疫原を治療投与することで、感染または症状を緩和できる。
【００７４】
望ましい態様はＨＥＶ株ＳＡＲ−５５のＯＲＦ−２配列で発現される組換えＯＲＦ−２タンパク質、またはその同等物を用いて調製したワクチンである。ＯＲＦ−２タンパク質は様々なＨＥＶ陽性血清に反応することが既に示されているので、様々なＨＥＶ株に対する防御の際のこれらの有用性が指摘される。
【００７５】
ワクチンとして用いるのに加えて、本組成はＨＥＶ用粒子に対する抗体の調製に用いることができる。抗体は直接抗ウイルス試薬として用いることができる。抗体を調製するには、ウイルス粒子、または適切な場合には、ウイルス粒子の生来の非粒子抗原を上に記載したような担体に結合させてワクチンとしたものを用いて、宿主動物を免疫する。宿主の血清または血漿を、適当な時間間隔の後に集めて、ウイルス粒子に反応する抗体を含む組成物を供給する。ガンマグロブリン画分またはＩｇＧ抗体を、たとえば飽和硫酸アンモニウムやＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘまたは当業者の既知の他の手法を用いることで、調製できる。こうした抗体は、薬剤などの他の抗ウイルス試薬に付随する多くの有害な副作用を実質的に持たない。
【００７６】
抗体組成物は、潜在する有害な免疫系応答を低減することで、さらに宿主系に害の少ないものとすることができる。これは外来種の抗体のＦｃ部分の全体または一部を取り除くか、宿主動物と同種の抗体たとえばヒト／ヒトハイブリドーマ由来の抗体を用いることにより、可能となる。ヒト化された抗体（すなわちヒトでは免疫原とならない）を作製するには、たとえば抗体の免疫原となる部分を、対応するが免疫原とはならない部分で置換すればよい（すなわちキメラ抗体）。こうしたキメラ抗体は、一つの種由来の抗体の反応性部分または抗原結合部分と、異なる種の抗体のＦｃ部分（免疫原とならない）を含んでいる。キメラ抗体の例には、ヒト以外の哺乳類とヒトのキメラ、醤歯類とヒトのキメラ、マウスとヒトおよびラットとヒトのキメラが含まれるが、これに限定されない。（ロビンソンら（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）国際特許出願（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）１８４，１８７；タニグチ Ｍ．（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ．）欧州特許出願（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）１７１，４９６；モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）欧州特許出願（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）１７３，４９４；ノイバーガーら（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）ＰＣＴ出願ＷＯ／８６／０１５３３；カビリイら（Ｃａｂｉｌｌｙｅｔ ａｌ．），１９８７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９；ニシムラら（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．），１９８７ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９；ウッドら（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．），１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６；ショーら（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．）１９８８ Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５５３、これらは全て本明細書に参考文献として取り込んだ。）
”ヒト化”キメラ抗体についての概論は、モリソンおよびオイらにより提供されている。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２およびＯｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４
適切な”ヒト化”抗体は、ＣＤＲまたはＣＥＡ置換によってつくられる（ジョーンズら、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２；ヴァーホイアンら、Vｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ビードレレットら、Ｂｉｅｄｌｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３，参照により本明細書に含まれる）。
【００７７】
抗体または抗原結合断片は、また遺伝子工学によってもつくられる。大腸菌で重鎖および軽鎖遺伝子を発現させる技術は、ＰＣＴ特許出願の国際公開番号Ｗ０９０１４４３，ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４、およびフセらＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１の主題とされている。
【００７８】
抗体はまた免疫反応を増強させる方法としても使用できる。抗体は、他の治療上の抗体の投与と同程度の量投与できる。例えば、狂犬病、はしか、およびＢ型肝炎などの他のウイルス病の初期潜伏期に、プールしたガンマグロブリンがウイルスの細胞への侵入を阻止するため、体重１ポンド当たり０．０２−０．１ｍｌ投与される。そこで、ＨＥＶウイルス顆粒と反応する抗体は、ＨＥＶが感染した宿主に、免疫反応および／または抗ウイルス薬剤の効果を増強するため、単独で、または他の抗ウイルス薬剤とともに受動的に投与できる。
【００７９】
また、抗ＨＥＶ抗体は、抗原として抗イデオタイプ抗体を投与することで誘導できる。好適には、上に記載された様な精製抗ＨＥＶ抗体の調製物を宿主動物でイデオタイプ抗体を誘導するのに用いる。調製物が適当な希釈で宿主動物へ投与される。投与に続いて、通常は繰り返しの投与に続いて、宿主は抗イデオタイプ抗体を産生する。Ｆｃ領域に対する抗原反応を排除するために、宿主動物と同種の動物によって産生された抗体を用いるか、または、投与する抗体のＦｃ領域を除いて用いてもよい。宿主動物での抗イデオタイプ抗体の誘導に続き、血清または血漿を採取して抗体調製物を産する。抗体調製物は、抗ＨＥＶ抗体について上に記載されたようにして、または親和性マトリクスに結合された抗ＨＥＶ抗体を用いた親和性クロマトグラフィーによって、精製される。産生された抗イデオタイプ抗体は構造的に本来のＨＥＶ抗原に似ており、ＨＥＶ粒子抗原を用いる代わりにＨＥＶワクチンを調製するのに用いられる。
【００８０】
動物中で抗ＨＥＶウイルス抗体を誘導する方法としてもちられる場合、抗体を注入する方法は、予防接種を目的とする場合と同様である。つまり、アジュバントを用いたり、あるいは用いないで、生理学的に適切な希釈液で希釈した効果的濃度で筋肉、腹腔、皮下などへ行う注射である。１回以上の追加投与を用いるのが望ましい。
【００８１】
本発明のＨＥＶ由来タンパク質はまた、感染前予防、または感染後予防のために計画的に抗血清を産生するのに用いられる。ここでは、ひとつのＨＥＶタンパク質またはタンパク質の混合物が、ヒト抗血清を産生する既知の方法に従って、適当なアジュバントとともに処方され、志願者（ボランティア）に注射によって投与される。注射されたタンパク質に反応する抗体は免疫処置後数週間にわたって、一定間隔で血清を取り、ここで記載された免疫アッセイを用いて抗ＨＥＶ血清抗体の存在を同定することでモニターされる。
【００８２】
免疫された人からの血清は、感染の危機にある人の前予防の方法として投与することもできる。血清はまた、Ｂ型肝炎ウイルスに対する高力価の抗血清の後予防としての使用の場合と同様に、後予防で用いるのにも有用である。
【００８３】
ＨＥＶウイルス様粒子およびタンパク質に対する抗体および抗イデオタイプ抗体の生体内での（ｉｎ ｖｉｖｏ）使用および治療上での使用の両方でモノクローン抗体を用いることが好ましい。モノクローン抗ウイルス粒子抗体または抗イデオタイプ抗体は以下の方法で産生できる。免疫された動物から脾臓またはリンパ球を取り出し、不死化するか、または当業者には既知の方法でハイブリドーマを調製するのに用いる。（ゴーディング、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．１９８３．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｐｌａｄｅｒｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ５６−９７）。ヒト−ヒト ハイブリドーマを産生するために、ヒトリンパ球の提供者が選択される。ＨＥＶに感染していることが分かっている提供者は（この場合、感染は例えば血液中の抗ウイルス抗体の存在によって、またはウイルス培養によって示される）、適当なリンパ球の提供者として役立つ。リンパ球は抹消の血液試料から単離できる。また、提供者が脾臓摘出を受けるなら脾臓細胞が用いられる。エプスタインーバーウイルス（ＥＢV）がヒトリンパ球を不死化するのに用いられる。また、ヒト融合パートナーがヒト−ヒト ハイブリドーマを産生するのに用いられる。主に試験管内での（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ペプチドを用いた免疫化がまた、ヒトモノクローン抗体を産するのに用いられる。
【００８４】
不死化細胞から分泌された抗体は、望まれた特異性をもつ抗体を分泌するクローンを決定するために選別される。モノクローン抗ウイルス粒子抗体としては、抗体はＨＥＶウイルス粒子に結合しなければならない。モノクローン抗イデオタイプ抗体としては、抗ウイルス粒子に結合しなければならない。望まれる特異性をもつ抗体を産する細胞が選択される。
【００８５】
上述の抗体およびその抗原結合断片は単独のキットの形態で、または生体内使用用の薬剤組成物として供給される。抗体は、治療用、免疫アッセイでの診断用、または本明細書中に記載されたようなＯＲＦタンパク質を精製するための免疫親和性試薬として用いられる。
【実施例】
【００８６】
材料
以下の実施例で用いられる材料はいかのようなものであった：
霊長類． チンパンジー（Ｃｈｉｍｐ）（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）。旧世界サル：カニクイザル（Ｃｙｎｏ）（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）、ブタオザル（ＰＴ）（Ｍ．ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）、およびアフリアカミドリザル（ＡＧＭ）（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）。新世界サル：クチヒゲタマリン（Ｔａｍ）（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｍｙｓｔａｘ）、リスザル（ＳＱＭ）（Ｓａｉｍｉｒ ｉｓｃｉｕｒｅｕｓ）、およびヨザル（ＯＷＬ）（Ａｏｔｕｓ ｔｒｉｖｉｇａｔｕｓ）。霊長類は生物学的危険物の封じ込め条件下で一匹ずつ飼われた。動物の飼育場、飼育、および世話は、霊長類の飼育上のすべての要求にかなっていたか、十分すぎるほど満たしていた。
【００８７】
多くの動物は、ツァレヴら（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３、およびＴｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））によって記載されたようにウシ胎児血清で希釈された０．５ｍｌの便（ｓｔｏｏｌ）懸濁液中に含まれたＨＥＶ、ＳＡＲ−５５株を静脈注射された。Ｃｈｉｍｐ−１３１３および１３１０は７人のパキスタン人Ｅ型肝炎の患者から採集した便のプールを接種された。
【００８８】
血清試料は接種の前と後のほぼ週２回採集された。肝臓の酵素、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）、およびガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）が商品化された試験法を用いてアッセイされた（メドパス社、メリーランド州ロックビル、Ｍｅｄｐａｔｈ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。血清学的試験は上記のように行った。
【００８９】
実施例１
ＨＥＶ ＳＡＲ−５５株のゲノムのＤＮＡ配列の同定
ＰＣＲ用の鋳型ウイルスＲＮＡの調製 ＨＥＶ感染カニクイザルの胆汁（１０μｌ）、２０%（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ（最終濃度１%）、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ；最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）、１μｌのｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、および３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを最終的に２５０μｌとして混合し、３０分間５５度で保温した。全核酸を胆汁から、フェノール／クロロフォルム、１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて６５度で２回、クロロフォルムを用いて１回処理し抽出し、エタノールで沈殿させ、９５%エタノールで洗い、ＲＴ−ＰＣＲに用いた。糞からの、特に血清からのＨＥＶ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ＲＮＡがもっと大量に精製された場合に、より効果的である。血清（１００μｌ）または１０%糞懸濁液（２００μｌ）を上記のようにプロテイナーゼＫで処理した。３０分の保温の後、３００μｌのＣＨＡＯＳバッファー（４．２Ｍグアニジンチオシアネート／０．５Ｎ ラウロイルサルコシン／０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８．０）を加えた。核酸は６５度でフェノール／クロロフォルムを用いて２回、続いて室温でクロロフォルムを用いて１回処理し抽出した。そして、上層に７．５Ｍ酢酸アンモニウム（２２５μｌ）を加え、核酸を０．６８ｍｌの２−プロパノールで沈殿させた。沈殿を３００μｌのＣＨＡＯＳバッファーで融解し、１００μｌの水を加えた。クロロフォロム抽出および２−プロパノール沈殿を繰り返した。核酸を水に溶かし、エタノールで沈殿させ、９５%エタノールで洗い、ＲＴ−ＰＣＲに用いた。
【００９０】
プライマー ２１−４０ヌクレオチド（ｎｔ）で、ビルマからのＨＥＶ株（ＢＵＲ−１２１）（タムら、Ｔａｍ，Ａ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．（１９９１），Vｉｒｏｌｏｇｙ，１８５：１２０−１３１）のゲノムまたはＳＡＲ−５５ゲノムのプラスまたはマイナス鎖に相補的である、９４個のプライマーをアプライドバイオシステムズモデル３９１ ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３９１ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００９１】
これらの９４個のプライマーの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５からはじまりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８まで以下に示してある：
ＨＥＶプライマーリスト
【００９２】
【化２０】
【００９３】
【化２１】
【００９４】
【化２２】
【００９５】
【化２３】
【００９６】
【化２４】
【００９７】
配列の左の略語は以下のものを表す：ＲおよびＤはそれそれ逆向き（ｒｅｖｅｒｓｅ）および純向き（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーを表す；ＢおよびＳはそれぞれＥ型肝炎のＢｕｒｍａ−１２１株およびＥ型肝炎のＳＡＲ−５５株由来の配列を表す；５’ＮＣおよび３’ＮＣはそれそれＨＥＶゲノムの５’および３’ノンコーディング領域を表す；１，２および３はそれぞれオープンリーディングフレーム１，２および３由来の配列を表す。幾つかの配列の右側に示した（）の記号はこれらの配列に人為的に挿入した制限酵素部位を表す。
【００９８】
ＰＣＲ断片のクローニング用に、３−７ｎｔ上流にＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩ制限酵素部位をプライマーの５’末端に加えた。
ＲＴ−ＰＣＲ 通常の１００μｌのＲＴ−ＰＣＲ混合液は、鋳型、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４種すべてのｄＮＴＰｓ（それぞれ０．２ｍＭ）、５０ｐｍｏｌのダイレクトプライマー、５０ｐｍｏｌのリバースプライマー、４０ｕｎｉｔｓのＲＮａｓｉｎ（プロメガ Ｐｒｏｍｅｇａ）、１６ｕｎｉｔｓの鳥のミエロブラストシスウイルス逆転写酵素（プロメガ）、４ｕｎｉｔｓのＡｍｐｌｉＴａｑ（シータス Ｃｅｔｕｓ）からなり、１００μｌの軽ミネラルオイルをのせた。この混合液を、４２度で１時間保温し、３５回のＰＣＲサイクルで増幅した；９４度１分、４５度１分、７２度１分。ＰＣＲ産物を１%アガロースゲルを用いて解析した。
【００９９】
ＰＣＲ断片のクローニング 末端に制限酵素部位をもつＰＣＲ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、またはＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＢＲ３２２またはｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ）にクローン化した。あるいは、ＰＣＲ断片をＴＡクローニングキット（インビトロゲン Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ１０００（インビトロゲン）にクローン化した。
【０１００】
ＰＣＲ断片およびプラスミドの塩基配列決定 ＰＣＲ断片を１%アガロースゲルから切り出し、ジーンクリーン（バイオ１０１ Ｂｉｏ １０１、カリフォルニア州ラ ジョラ）によって精製した。２本鎖ＰＣＲ断片の塩基配列を、ウインシップ（Ｗｉｎｓｈｉｐ，Ｐ．Ｒ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｖ．，１７：１２２６）により記載されているように、シークエナーゼ（ユナイテッドステーツ バイオケミカル ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）によって決定した。ＣｓＣｌ勾配により精製した２本鎖プラスミドの塩基配列を、シークエナーゼキット（ユナイテッドステーツバイオケミカル）を用いて決定した。
【０１０１】
塩基配列のコンピュータ解析 ＨＥＶ株のヌクレオチド配列をジェネティックス コンピュータグループ（ウイスコンシン州マジソン）ソフトウエアーパッケージ（デベリュークスら Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｖ．，１２：３８７−３９５，ｖｅｒｓｉｏｎ７．５、VＡＸ ８６５０コンピュータを使用（国立ガン研究所 ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、メリーランド州フレデリック））を用いて比較した。
【０１０２】
実施例２
組換え発現ベクター，Ｐ６３−２の構築
ＨＥＶ株ＳＡＲ−５５のゲノムのＯＲＦ−２の全長を含むプラスミド（ツァレブら Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３）をＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ制限酵素断片を得るのに用いた。ＮｒｕＩはＨＥＶ ｃＤＮＡのＯＲＦ−２のＡＴＧ開始コドンの５ヌクレオチド上流を切断する。ＢｇｌＩＩ部位は、前以て、ＨＥＶゲノムの３'末端のポリＡ配列の直前に人為的におかれている（ツァレフら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５９−５６３）。この断片をｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ ベクター（インビトロゲン）に挿入するために、合成ポリリンカーをベクターの唯一のＮｈｅＩ部位に導入した。このポリリンカーは、ＨＥＶ ｃＤＮＡ配列およびｐＢｌｕｅＢａｃ配列の両方に無いＢｌｎＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含む。ＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ ＯＲＦ−２断片を、図１に示すようなアダプターを用いてＢｌｎＩ−ＢｇｌＩＩ ｐＢｌｕｅＢａｃに挿入した。
【０１０３】
実施例３
ＳＦ９昆虫細胞中でのＰ６３−２の発現
ｐ６３−２およびＡｃＭＮＰVバキュロウイルスＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（インビトロゲン））を、インビトロゲン手順に従ったカルシウム沈澱法によってＳＦ９細胞（インビトロゲン）中に共形質転換した一本手順に従って；ＡｃＭＮＰVバキュロウイルスＤＮＡはｐ６３−２をパッケージして組換えバキュロウイルスを形成できる生きたバキュロウイルスを生産できる。この組換えバキュロウイルスは、４回プラーク精製した。生じた組換えバクロウイルス６３−２−ＩV−２を昆虫ＳＦ９細胞を感染させるのに使用した。
【０１０４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット 昆虫細胞をローディング緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＤＴＴ，２％ＳＤＳ，０．１％ブロモフェノールブルーおよび１０％グリセロール）中に再懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、イギリス（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０に記載されたように行った。ゲルをクマシーブルーで染色するまたはタンパク質をＢＡ−８５ニトロセルロースフィルター（シュライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）＆シュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ））上に電気ブロットした。トランスファーの後、ニトロセルロースメンブレンを１０％胎児牛血清および０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ中でブロックした。一次抗体として１：１０００に希釈したチンパンジー−１３１３の高度免疫血清を使用した。二次抗体として、１：２０００に希釈したヒトＩｇＧに対するホスファターゼでラベルした親和精製済みのやぎ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。フィルターをアルカリホスファターゼに対する基質を固定したウエスタンブルー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で現像した。全てのインキュベーションはブロッキング溶液中で行い、洗いは０．０５％トゥイーン−２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで行った。
【０１０５】
ＨＥＶ ＯＲＦ−２の発現 組換えバキュロウイルス６３−２−ＩV−２を感染させたＳＦ９細胞中で合成される主要なタンパク質は、見かけの分子量７４ｋＤのタンパク質であった（図２Ａ）。この大きさはＯＲＦ−２全体から予測されるものよりも（７１ｋＤ）少し大きい。大きさの違いは、Ｎ末端部分に少なくとも１つの潜在的な糖鎖付加部位（アスパラギン−ロイシン−セリン）が存在するため、タンパク質の糖鎖付加による可能性がある。このタンパク質は感染していない細胞または野生型の組換え体でないバキュロウイルスを感染させた細胞中では検出されなかった。後者の場合には、検出された主要なタンパク質は多面性ウイルス性タンパク質であった。同じ抽出物をチンパンジー−１３１３血清（ＨＥＶで高度に免疫済み）によるウエスタンブロットで解析すると、組換え細胞抽出物中のタンパク質のみが反応し、主要なバンドは再び７４ｋＤタンパク質として現れた（図２Ｂ）。少ない方のバンドはウエスタンブロットにおいてもまた存在した。これら中には糖鎖付加の程度の違いによる可能性がある７４ｋＤよりも大きい分子量のものがあり、また中にはプロセッシングおよび／または分解を反映したと思われるより低い分子量のものもあった。ＨＥＶで接種する前のチンパンジー−１３１３由来の血清は、ウエスタンブロットによるとどのタンパク質とも反応しなかった。
【０１０６】
実施例４
組換え体を感染させたＳＦ９細胞の免疫電子顕微鏡観察
組換え体を感染させたＳＦ９細胞 ５×１０６を、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４、０．３％サルコシルを含む塩化セシウム（１．３０ｇ／ｍｌ）中で音波処理し、６８時間４０，０００ｒｐｍで遠心した（ＳＷ６０Ｔｉ）。ＥＬＩＳＡ反応の最も高く、浮遊密度が１．３０ｇ／ｍｌである５０μｌの画分を１ｍｌ ＰＢＳ中に希釈し、５μｌのチンパンジー−１３１３高度免疫血清を加えた。高度免疫血清は、先に感染させたチンパンジーに肝炎Ｅの第二の株（メキシコのＨＥＶ）で再免疫を行うことによって調製した。試料は１時間室温、それから一晩４℃でインキュベートした。免疫複合体をＳＷ６０Ｔｉローターを使用して３０，０００ｒｐｍ，４℃、２時間で沈澱させた。ペレットを蒸留水中に再溶解し、３％ＰＴＡでネガティブに染色し、炭素グリッドに載せて電子顕微鏡ＥＭ−１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、オバーコッヘン、ドイツ中で４０，０００倍率にて調べた。
【０１０７】
VＰＬの検出
野生型または組換え体バキュロウイルス６３−２−ＩV−２を感染させた昆虫細胞由来の細胞抽出液を塩化セシウム密度勾配遠心によって画分化した。組換え体を感染させた昆虫細胞由来の塩化セシウム勾配の画分をチンパンジー−１３１３高度免疫血清と共にインキュベートすると、抗体で覆われたウイルス様の粒子（VＬＰ）二種類が浮遊密度１．３０ｇ／ｍｌの画分中に観察された：１つは（図３Ａ）、抗体で覆われた、ＨＥＶであることを示唆する大きさ（３０ｎｍ）および形態的構造を持つ個々の粒子、２つ目は（図３Ｂ）、ＨＥＶより小さい粒子であるがその他はＨＥＶに類似する抗体で覆われた粒子の塊（約２０ｎｍ）であった。直接的な電子顕微鏡の使用は、ウイルス粒子に似ているが抗体が結合していないのでＨＥＶとして確定できない、直径３０および２０ｎｍ等を含む非常にヘテロな集団の存在を示した。多くのＩＥＭ実験は、ＨＥＶゲノムのＯＲＦ−２領域から合成される少なくてもいくつかのタンパク質は粒子構造に組み立てられたことを示唆した。小さい方のタンパク質の比率が多い感染後期の昆虫細胞はＥＬＩＳＡで常に良い結果を与えたことが観察された。従って、感染後期の組換え昆虫細胞の未分画抽出液を以下の試験におけるＥＬＩＳＡ用の抗原として使用した。
【０１０８】
実施例５
抗ＨＥＶの完全なＯＲＦ−２を発現し、後にＨＥＶの異なる株で感染させた昆虫細胞の抗原に基づくＥＬＩＳＡによる検出
６３−２−ＩV−２ウイルスを感染させた５×１０６のＳＦ９細胞を１ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ塩化ナトリウム中に再懸濁し、それから３回凍結と融解を行った。この懸濁液１０μｌを１０ｍｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に溶解し、簡易マイクロタイター測定プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を覆うのに使用した。血清試料を１：２０、１：４００および１：８０００、または１：１００、１：１０００および１：１００００に希釈した。ウエスタンブロット用に上記に記載したのと同様のブロッキング溶液および洗い溶液をＥＬＩＳＡに使用した。二次抗体として、ヒトＩｇＧに対するペルオキシダーゼを結合させたヤギＩｇＧ画分または旧または新世界サルに対する西洋わさびペルオキシダーゼでラベルしたヤギ免疫グロブリンを使用した。結果は、４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．）を測定することによって決定した。
【０１０９】
ＨＥＶパキスタン株を代表する昆虫細胞由来の抗原がＨＥＶメキシコ株で感染させたカニクイザル中の抗ＨＥＶ抗体を検出できるかを決定するために、３匹のサルを調査した（図４）。サイノ（カニクイザル）−８０Ａ８２およびサイノ−９Ａ９７の二匹のサルをメキシコ’８６ＨＥＶ株（チセハースト、Ｊ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６５：８３５−８４５）を含む沈澱物で感染させ、および３匹目のサル、サイノ−８３を同じ株の二次培養物で感染させた。コントロールとして、パキスタンＨＥＶ株ＳＡＲ−５５で感染させたサイノ−３７４由来の血清試料を同様の実験で試験した。メキシコ株を感染させた３匹のサルはすべて抗ＨＥＶに血清が変換した。一次培養物感染由来の動物は１５週で血清が変換し、二次培養物感染由来のものは５週で変換した。興味深いことに、４匹の動物の中で最も高い抗ＨＥＶ力価はメキシコ株の二次培養物を接種したサイノ−８３であった。メキシコ株の一次培養物を接種したサイノは最も低い力価を示し、一方パキスタン株の一次培養物を接種したサイノは中間の力価を示した。
【０１１０】
実施例６
完全なＯＲＦ−２を発現する昆虫細胞由来の抗原に基づく抗ＨＥＶ ＥＬＩＳＡの特異性
本明細書中で記載したＥＬＩＳＡが、他の型の肝炎に関連する抗体を除外して、抗ＨＥＶを特異的に検出するかを調べるために、チンパンジーの血清試料を既知の他の肝炎ウイルスで感染させた４匹に付いて分析した（ガルシ、Ｐら．（１９９２），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６５：１００６−１００１；ファルシ，Ｐら．（１９９２），Ｓｃｌｅｎｃｅ（投稿中）；ポンゼットＡ．ら．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：７２−７７；リゼット；ｍら．（１９８１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １：５６７−５７４；チンパンジー−１４１３、１３７３、１４４２、１５５１（ＨＡV）についての参考；およびチンパンジー−９８２、１４４２、１４２０、１７１１０（ＨＢV）についての参考；はパーセルらの未発表データである。）（表１）。接種前の血清試料および接種後５週および１５週の血清試料を血清希釈１：１００、１：１０００および１：１００００にてＨＥＶ ＥＬＩＳＡ中で分析した。ＨＡV，ＨＢV，ＨＣV，およびＨＤVで感染させた動物由来の血清はどれもＨＥＶ抗体に対するＥＬＩＳＡで反応しなかったが、ＨＥＶで感染させた４匹全てのチンパンジーは抗ＨＥＶのＩｇＭおよびＩｇＧを発現した。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
実施例７
ヒト以外の霊鳥類におけるＨＥＶＳＡＲ−５５株の宿主範囲の決定
異なる霊鳥類の種に、ＨＥＶの標準的な便懸濁液を接種し、一連の血清試料を感染を測定するために集めた。血清ＡＬＴレベルを肝炎の指標として決定し、血清変換は抗ＨＥＶの検出によって決定された。
【０１１３】
ＨＥＶで感染させたアカゲザル（表２）はどちらも、血清変換と同様にＡＬＴ活性の非常に突出したピークを示した。増加するＡＬＴ活性の最初の徴候は両動物とも１４日目に観察され、決定的な血清変換は２１日目におきた。抗ＨＥＶの最大力価は２９日目に得られた。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
本実験で使用したアフリカミドリザルはどちらも（表２）ＡＬＴ活性および抗ＨＥＶの増大を表した。ＡＧＭ−２３０は接種後７週で死亡したが、感染の徴候はその時点より前に観察された。ＡＧＭ−７４は他の種で報告されているように（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中））ＡＬＴ活性の２型性の増加を示した。ＡＧＭ−７４およびＡＧＭ−２３０の血清変換は各々２７日目および２１日目に最初に観察された。
【０１１６】
接種した短い尾のマカク（ｍａｃａｑｕｅｓ）はどちらもＡＬＴ活性が僅かに増加したが、これらの増加は先に記載した動物の場合のように顕著ではなかった。しかし、両サルとも２１日目に血清変換し、抗ＨＥＶ力価はチンパンジーおよび他の旧世界サルと等しかった。
【０１１７】
本実験で接種したタマリンはどれもＡＬＴ活性の上昇または抗ＨＥＶへの血清変換を示さなかった（表２）。リスザルはチンパンジーおよび旧世界ザルよりも明らかに低い抗ＨＥＶレベルで反応した（表２）。血清変換の時期もまたこれら他の動物と比較すると遅延していた。ＳＱＭ−８６８は４１日目に血清変換し、ＳＱＭ−８６９は３５日目に血清変換した。抗ＨＥＶ力価は調査した３カ月以上の間どの時点でも１：４００より高くならず、どちらの動物でも４７−５４日目にピークに達してから明らかに衰微した。しかし、ＡＬＴ活性の増加は両動物においてかなり際だっていた。
【０１１８】
フクロウザルはＨＥＶ感染に対して旧世界ザル種とほぼ同様の反応を示した（表２）。どちらのＯＷＭも２１日目に血清変換し、２８日目までには抗ＨＥＶ力価が１：８０００の値まで到達した。ＡＬＴ活性はＯＷＮ−９２４では３５日目にピークになったが、ＯＷＭ−９２５では９１日目までピークにならなかった。
【０１１９】
実施例８
チンパンジーにおける抗ＨＥＶ ＩｇＭおよびＩｇＧの検出
両チンパンジーにおいて、血清ＡＬＴレベルは接種後約４週で増加した（表２、図５）。両チンパンジーともＡＬＴ酵素の上昇の時期またはそれより早くに血清変換した（図５Ａ、５Ｃ）。抗ＨＥＶ ＩｇＭのレベルもまたチンパンジーについて決定された。チンパンジー−１３７４では抗ＨＥＶ ＩｇＭの力価（図５Ｂ）はＩｇＧ力価（図５Ａ）ほど高くなく、２週で衰微した。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体はこの動物に付いて２０日目に最初に検出されたが、その日に抗ＨＥＶ ＩｇＭ力価は最も高く、一方、ＩｇＧ力価はその日に最も低く、それから上昇して３カ月以上およそ同じレベルにとどまった。チンパンジー−１３７５では、抗ＨＥＶ ＩｇＭのみが２０日目に検出された（図５Ｄ）。力価はチンパンジー−１３７４よりも高く、抗ＨＥＶ ＩｇＭは調査の期間中ずっと検出された。抗ＨＥＶ ＩｇＧはこの動物中で２７日目に最初に観察され（図５Ｃ）、実験中およそ同じレベルを保持した。
【０１２０】
実施例９
昆虫細胞中で発現させた完全なＯＲＦ−２タンパク質に基づくＥＬＩＳＡと大腸菌中で発現させた構造タンパク質の断片に基づくＥＬＩＳＡの比較
真核細胞中におけるＨＥＶゲノムの完全なＯＲＦ−２領域の発現は、大腸菌中での構造タンパク質断片の発現に対して何らかの利点があるかを調べるために、細菌中で発現させた抗原断片を使用して（表３）、我々はＥＬＩＳＡ中で以前の抗原を使用して先に分析したサイノモルガスザルの血清（Ｔｒａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＡＳ、８９：５５９−５６３；およびＴｒａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））を再試験した。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
血清はより感受性の低いＯＲＦ−３抗原でも試験した。
Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中）
ＥＬＩＳＡで調べた６匹のサルの３匹に付いて、昆虫細胞中で発現させた抗原は大腸菌中で発現させた抗原より早く血清変換を検出した。昆虫細胞由来の抗原を使用して、我々は最も高度に希釈した試験（１：８０００）ですべての６匹のサル由来の血清中に抗ＨＥＶ抗体を検出することができた。全ての血清を１：１００希釈で試験したが、大腸菌細胞由来の抗原（ブルマ株）では抗ＨＥＶ力価に付いて何の情報も得られなかった（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ；８９：５５９−５６３；Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））。
【０１２３】
別の実験で、肝炎ＥウイルスＳＡＲ−５５株を１０倍ずつ一連に希釈し、１０−１から１０−５希釈をウイルス力価を調べるために２匹のサイノモルガスザルに接種した。血清ＡＬＴレベルを測定して肝炎を決定し、ＨＥＶに対する血清抗体を本発明のＥＬＩＳＡ方法（図のデータ）またはＧｅｎｅｌａｂのＥＬＩＳＡ（図６ａ−ｇの下に陽性（＋）または陰性（−）試験で示したデータ）によって決定した。全ての試料はコード下で試験した。
【０１２４】
本発明のＥＬＩＳＡ法は接種した全てのサイノ中の抗ＨＥＶ ＩｇＧへの血清変換および全ての希釈ウイルスを検出した。
反対に、Ｇｅｎｌａｂの結果は以下にまとめたように著しく多様であった。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
サイノ３８５（１０−５）はＧｅｎｅｌａｂおよび本発明による両ＥＬＩＳＡ試験において陽性であるので、１０−４（１０回以上ウイルス接種した）および１０−３（１００回以上ウイルス接種した）もまた陽性であると予想された。サイノ３８３および３９３のＡＬＴレベルは活性型の肝炎であることを示唆したが、１０−３および１０−４の一つで両方陽性ではないというＧｅｎｌａｂのＥＬＩＳＡとは反対に、本発明はそれらを陽性として数えた。それ故、データはＨＥＶの抗体を検出する先の技術の方法よりも本ＥＬＩＳＡ方法が優ることを支持した。
【０１２７】
実施例１０
ワクチンとしての完全なＯＲＦ−２タンパク質の使用
以前に上述したように、組換えＯＲＦ−２タンパク質は免疫反応性がある。さらに、異なるＨＥＶ株で感染させた異なる動物種から得た様々な血清と反応することが示された。これは様々なＨＥＶ株を予防するためのワクチンとしてのこの組換えタンパク質の使用が支持されることを示す。哺乳類は保護抗体の生産を刺激するのに十分な量の精製または部分的に精製した組換えＯＲＦ−２タンパク質で免疫される。ＨＥＶの野生株で免疫性試験した免疫済みの動物は保護される。
【０１２８】
全ての引用文献、すなわち論文刊行物、特許および類似物の内容は、本明細書中に参照として組み入れてある。
本明細書中に記載された実施例および態様は実例を示す目的であり、当該技術分野に従事する人によるこれらの若干の修飾および改変は本出願の思想及び範囲、並びに請求の範囲の範囲内に含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１はＨＥＶ株ＳＡＲ−５５の完全なＯＲＦ−２タンパク質の発現に使われる組み換えベクターを示す。
【図２】図２ＡおよびＢは、野生型バキュロイウルス若しくは組み換えバキュロウイルス（ＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む）を感染させた昆虫細胞の細胞溶解物を、クマシーブルーで染めた（Ａ）若しくはＨＥＶ感染チンパンジーの血清でウェスタンブロットにかけた（Ｂ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【図３Ａ】図３Ａは、３０および２０ｎｍのウイルス様粒子（組み換え感染昆虫細胞でＯＲＦ−２タンパク質の発現結果として形成される）の免疫電子ミクログラフ（ＩＥＭ）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３０および２０ｎｍのウイルス様粒子（組み換え感染昆虫細胞でＯＲＦ−２タンパク質の発現結果として形成される）の免疫電子ミクログラフ（ＩＥＭ）を示す。
【図４】図４は、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中の抗ＨＥＶ抗体レベルは、ＨＥＶメキシコ株（Ｃｙｎｏ−８０Ａ８２，Ｃｙｎｏ−９Ａ９７およびＣｙｎｏ ８３）若しくはパキスタン株（Ｃｙｎｏ−３７４）をカニクイザルに接種してからの様々な時間で決定した。
【図５Ａ】図５Ａは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。
【図６Ａ】図６Ａは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｇ】図６Ｇは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｈ】図６Ｈは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｉ】図６Ｉは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【図６Ｊ】図６Ｊは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＥＶ抗体と免疫応答性であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で４６．３と７４．７キロダルトンとの間の分子量を有するＥ型肝炎ウイルスのオープンリーディングフレーム２タンパク質であって、Ｅ型肝炎ウイルスの完全なオープンリーディングフレーム２コード配列を含む組換えバキュロウイルスベクターを含有する昆虫細胞の発現産物から入手可能なタンパク質であって、ここで、当該タンパク質は全長ではない、前記タンパク質。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のｃＤＮＡ配列に含有される完全なオープンリーディングフレーム２コード配列によってコードされる、請求項１のタンパク質。
【請求項３】
組換えＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の製造方法であって、
（ａ）Ｅ型肝炎ウイルスの完全なオープンリーディングフレーム２コード配列を含む組換えバキュロウイルスベクターを含有する昆虫細胞を、該ベクターからのタンパク質の発現のために適切な条件下で培養し；そして
（ｂ）前記タンパク質を回収する
ことを含む、前記製造方法。
【請求項４】
Ｅ型肝炎ウイルスの完全なオープンリーディングフレーム２コード配列を含む、組換えバキュロウイルス発現ベクター。
【請求項５】
前記コード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のｃＤＮＡ配列に含有される、請求項４の組換えバキュロウイルス発現ベクター。
【請求項６】
ｐ６３−２である、請求項５の組換えバキュロウイルス発現ベクター。
【請求項７】
請求項４、５または６の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた昆虫宿主細胞。
【請求項８】
生物学的サンプル中のＥ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出方法であって、
（ａ）前記サンプルを請求項１のＥ型肝炎ウイルスのオープンリーディングフレーム２タンパク質と接触させ、抗体との免疫複合体を形成させ；そして
（ｂ）前記免疫複合体の存在を検出する
ことを含む、前記検出方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、脳脊髄液、組織、尿、及び胸膜液である、請求項８の方法。
【請求項１０】
ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を検出する、請求項８の方法。
【請求項１１】
組換えＨＥＶタンパク質が固体支持体に結合されている、請求項８の方法。
【請求項１２】
免疫複合体が標識抗体を用いて検出される、請求項８の方法。
【請求項１３】
請求項１のタンパク質を含む、請求項８の方法に用いるキット。
【請求項１４】
標識された二次抗体をさらに含む、請求項１３のキット。
【請求項１５】
防御抗体の産生を刺激するために有効な量の請求項１のタンパク質、および適当な助剤、希釈剤、または担体を含む、Ｅ型肝炎の治療または予防のための薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む、哺乳動物をＥ型肝炎感染に対して免疫するためのワクチン。
【請求項１】
抗ＨＥＶ抗体と免疫応答性であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で４６．３と７４．７キロダルトンとの間の分子量を有するＥ型肝炎ウイルスのオープンリーディングフレーム２タンパク質であって、Ｅ型肝炎ウイルスの完全なオープンリーディングフレーム２コード配列を含む組換えバキュロウイルスベクターを含有する昆虫細胞の発現産物から入手可能なタンパク質であって、ここで、当該タンパク質は全長ではない、前記タンパク質。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のｃＤＮＡ配列に含有される完全なオープンリーディングフレーム２コード配列によってコードされる、請求項１のタンパク質。
【請求項３】
組換えＨＥＶ ＯＲＦ２タンパク質の製造方法であって、
（ａ）Ｅ型肝炎ウイルスの完全なオープンリーディングフレーム２コード配列を含む組換えバキュロウイルスベクターを含有する昆虫細胞を、該ベクターからのタンパク質の発現のために適切な条件下で培養し；そして
（ｂ）前記タンパク質を回収する
ことを含む、前記製造方法。
【請求項４】
Ｅ型肝炎ウイルスの完全なオープンリーディングフレーム２コード配列を含む、組換えバキュロウイルス発現ベクター。
【請求項５】
前記コード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のｃＤＮＡ配列に含有される、請求項４の組換えバキュロウイルス発現ベクター。
【請求項６】
ｐ６３−２である、請求項５の組換えバキュロウイルス発現ベクター。
【請求項７】
請求項４、５または６の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた昆虫宿主細胞。
【請求項８】
生物学的サンプル中のＥ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出方法であって、
（ａ）前記サンプルを請求項１のＥ型肝炎ウイルスのオープンリーディングフレーム２タンパク質と接触させ、抗体との免疫複合体を形成させ；そして
（ｂ）前記免疫複合体の存在を検出する
ことを含む、前記検出方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、脳脊髄液、組織、尿、及び胸膜液である、請求項８の方法。
【請求項１０】
ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を検出する、請求項８の方法。
【請求項１１】
組換えＨＥＶタンパク質が固体支持体に結合されている、請求項８の方法。
【請求項１２】
免疫複合体が標識抗体を用いて検出される、請求項８の方法。
【請求項１３】
請求項１のタンパク質を含む、請求項８の方法に用いるキット。
【請求項１４】
標識された二次抗体をさらに含む、請求項１３のキット。
【請求項１５】
防御抗体の産生を刺激するために有効な量の請求項１のタンパク質、および適当な助剤、希釈剤、または担体を含む、Ｅ型肝炎の治療または予防のための薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む、哺乳動物をＥ型肝炎感染に対して免疫するためのワクチン。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【公開番号】特開２００６−１４９３９３（Ｐ２００６−１４９３９３Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７７４２９（Ｐ２００５−３７７４２９）
【出願日】平成１７年１２月２８日（２００５．１２．２８）
【分割の表示】特願２００４−１１３５４８（Ｐ２００４−１１３５４８）の分割
【原出願日】平成５年９月１７日（１９９３．９．１７）
【出願人】（５０２００６７８２）アメリカ合衆国 (47)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２８日（２００５．１２．２８）
【分割の表示】特願２００４−１１３５４８（Ｐ２００４−１１３５４８）の分割
【原出願日】平成５年９月１７日（１９９３．９．１７）
【出願人】（５０２００６７８２）アメリカ合衆国 (47)
【Ｆターム（参考）】
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