ＦＲＥＴ測定方法及びＦＲＥＴ測定装置
【課題】解離定数Ｋｄの大きさによらず、解離定数Ｋｄを精度よく求めることができるＦＲＥＴ測定技術を提供する。
【解決手段】レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴを測定するＦＲＥＴ測定方法であって、レーザ光を測定サンプルに照射するステップと、測定サンプルが発する蛍光を計測するステップと、第１分子の蛍光寿命を算出するステップと、結合比率を算出するステップと、測定サンプルの結合条件を設定するステップと、解離定数を算出するステップと、を有し、解離定数を算出するステップは、最小二乗法を用いて、測定サンプル中のレセプターの全濃度と解離定数とを変数とする関数を、結合比率算出ステップで算出された結合比率にフィッティングすることにより、解離定数を求める。
【解決手段】レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴを測定するＦＲＥＴ測定方法であって、レーザ光を測定サンプルに照射するステップと、測定サンプルが発する蛍光を計測するステップと、第１分子の蛍光寿命を算出するステップと、結合比率を算出するステップと、測定サンプルの結合条件を設定するステップと、解離定数を算出するステップと、を有し、解離定数を算出するステップは、最小二乗法を用いて、測定サンプル中のレセプターの全濃度と解離定数とを変数とする関数を、結合比率算出ステップで算出された結合比率にフィッティングすることにより、解離定数を求める。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光の照射によってドナー分子（第１分子）がエネルギーを吸収し、ドナー分子からアクセプター分子（第２分子）へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を測定する方法及び装置に関する。具体的には、レセプターとリガンドが結合し、ドナー分子及びアクセプター分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、解離定数を求めるＦＲＥＴ測定装置及びＦＲＥＴ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用の解析が行われている。ＦＲＥＴ現象により生じる蛍光を測定することにより、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を測定することができる。
【０００３】
例えば、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光寿命τ＊ｄと、アクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命τｄとを用いて、ドナー分子からアクセプター分子へのエネルギー移動の程度を示すＦＲＥＴ効率を求める技術が知られている（特許文献１）。
上記特許文献１において、ＦＲＥＴ効率は、１−τ＊ｄ／τｄにより求められる。
【０００４】
しかし、上記ＦＲＥＴ効率は、ドナー分子やアクセプター分子の濃度に影響を受けるため、上記技術を用いて細胞等に含まれるタンパク質の相互作用の強さを定量的に求めることは難しい。
【０００５】
一般に、分子が相互作用する際の結合の強さを表す指標として、解離定数Ｋｄが用いられる。しかし、解離定数Ｋｄを精度よく測定することが容易ではない場合がある。以下、解離定数Ｋｄについて説明する。例えば、下記式（１）に示される反応の場合、解離定数Ｋｄは、下記式（２）のように定義される。ここで、Ｌはリガンド、Ｒはレセプター、ＬＲはリガンドと結合しているレセプターを示す。また、［Ｌ］はレセプターと結合していないリガンドの濃度（以下、「リガンド濃度」と呼ぶ。）、［Ｒ］はリガンドと結合していないレセプターの濃度（以下、「レセプター濃度」と呼ぶ。）、［ＬＲ］はリガンドと結合しているレセプターの濃度を示す。
【数１】
【数２】
【０００６】
ここで、サンプル中に含まれる全リガンド濃度を［Ｌ０］、全レセプター濃度を［Ｒ０］とすると、［Ｌ０］、［Ｒ０］は以下のような関係式で表される。
【数３】
【０００７】
式（２）と式（４）より［Ｒ］を消去すると、下記式（５）が得られる。
【数４】
式（５）の左辺は、全レセプターのうちリガンドと結合しているレセプターの割合を示すものである。［ＬＲ］／［Ｒ０］を［Ｌ］の対数軸に対してプロットすると、シグモイド曲線となる。
【０００８】
解離定数Ｋｄが大きいことは、式（１）の右辺から左辺への反応が起こりやすいことを示す。そのため、解離定数Ｋｄがある程度大きい場合は、［Ｌ］＞＞［ＬＲ］の関係が成り立つ。このとき、式（３）と式（５）より、［ＬＲ］／［Ｒ０］は下記式（６）のように近似される。
【数５】
【０００９】
式（６）によれば、全リガンド濃度［Ｌ０］が解離定数Ｋｄに等しくなるとき、サンプル中に含まれる全レセプターのうちリガンドと結合しているレセプターの割合［ＬＲ］／［Ｒ０］が０．５となる。そのため、全リガンド濃度［Ｌ０］を変化させながら［ＬＲ］／［Ｒ０］を測定し、［ＬＲ］／［Ｒ０］が０．５となるときの全リガンド濃度［Ｌ０］から解離定数Ｋｄを求めることができる。
平衡状態にあるリガンドの濃度［Ｌ］を測定するのが困難な場合であっても、全リガンド濃度［Ｌ０］を求めることは可能であるため、上記のような方法により解離定数Ｋｄを求める手法が用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−２４０４２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、解離定数Ｋｄが小さい場合は、［Ｌ］＞＞［ＬＲ］の関係式が成り立たないため、式（５）を式（６）のように近似することができない。そのため、解離定数Ｋｄが小さい場合、全リガンド濃度［Ｌ０］を変化させながら［ＬＲ］／［Ｒ０］を測定し、［ＬＲ］／［Ｒ０］が０．５となるときの全リガンド濃度［Ｌ０］は、解離定数Ｋｄの値とは異なる値となり、従来の手法では、解離定数Ｋｄを正しく求めることができない。
【００１２】
そこで、本発明は、解離定数Ｋｄの大きさによらず、解離定数Ｋｄを精度よく測定することができるＦＲＥＴ測定方法及びＦＲＥＴ測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のＦＲＥＴ測定方法は、レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定方法であって、強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射する照射ステップと、前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測ステップと、前記計測ステップで計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出ステップと、前記蛍光寿命算出ステップで算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出ステップと、前記結合比率が異なるように、前記測定サンプルの結合条件を設定する結合条件設定ステップと、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出ステップと、を有し、前記解離定数算出ステップは、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率算出ステップで算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とする。
【００１４】
また、前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、前記解離定数算出ステップは、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求めることが好ましい。
【数６】
【００１５】
また、前記蛍光寿命算出ステップは、前記計測ステップで計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出することが好ましい。
【００１６】
また、前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定することが好ましい。
【００１７】
また、前記レセプターには、第１分子が結合しており、前記リガンドには、第２分子が結合しており、前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定することが好ましい。
【００１８】
本発明のＦＲＥＴ測定装置は、レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定装置であって、強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射するレーザ光源部と、前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測部と、前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出部と、前記蛍光寿命算出部で算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出部と、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出部と、を備え、前記解離定数算出部は、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率が異なる複数の結合条件において前記結合比率算出部で算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とする。
【００１９】
また、前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、前記解離定数算出部は、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求めることが好ましい。
【数７】
【００２０】
また、前記蛍光寿命算出部は、前記計測部で計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出することが好ましい。
【００２１】
また、前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることが好ましい。
【００２２】
また、前記レセプターには、第１分子が結合しており、前記リガンドには、第２分子が結合しており、前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のＦＲＥＴ測定方法及びＦＲＥＴ測定装置によれば、解離定数Ｋｄの大きさによらず、解離定数Ｋｄを精度よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＦＲＥＴ測定装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】（ａ）は、レセプターにリガンドが結合していない状態のサンプルを示す図であり、（ｂ）は、レセプターにリガンドが結合している状態のサンプルを示す図である。
【図３】ドナー分子とアクセプター分子のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルの一例を示す図である。
【図４】図１に示すフローサイトメータの計測部の一例を示す概略構成図である。
【図５】図１に示すフローサイトメータの制御・処理部の一例を示す概略構成図である。
【図６】図１に示すフローサイトメータの分析装置の一例を示す概略構成図である。
【図７】ＦＲＥＴ測定方法の一例を示すフローチャートである。
【図８】全リガンド濃度に対するドナー分子の蛍光寿命の測定結果の一例を示す図である。
【図９】全リガンド濃度に対する結合比率の測定結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（ＦＲＥＴ測定装置の概略構成）
以下、本発明のＦＲＥＴ測定方法及び装置について、詳細に説明する。
図１は、本発明のＦＲＥＴ測定装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
本実施形態のフローサイトメータ１０は、例えば、測定対象となる生細胞中のタンパク質をドナー分子とアクセプター分子で標識したサンプル１２（測定サンプル）にレーザ光を照射し、サンプル１２が発する蛍光を計測する。計測された蛍光信号を用いることにより、フローサイトメータ１０は、解離定数Ｋｄの値を求める。図１に示されるように、フローサイトメータ１０は、管路２０と、レーザ光源部３０と、計測部４０，５０と、制御・処理部１００と、分析装置１５０と、を備える。
【００２６】
管路２０は、高速流を形成するシース液とともにサンプル１２を流す。管路２０の出口には、サンプル１２を回収する回収容器２２が設けられている。
ここで、図２を参照して、本実施形態のサンプル１２について説明する。本実施形態のサンプル１２では、レセプターＲにドナー分子１６とアクセプター分子１８が結合している。図２（ａ）は、レセプターＲにリガンドＬが結合していない状態のサンプル１２を示す図であり、図２（ｂ）は、レセプターＲにリガンドＬが結合している状態のサンプル１２を示す図である。図２（ａ）、（ｂ）に示されるように、本実施形態では、レセプターＲにリガンドＬが結合するとレセプターＲが変形する。その結果、ドナー分子１６とアクセプター分子１８との距離が近くなり、ＦＲＥＴ現象が生じる。従って、本実施形態のフローサイトメータ１０によりＦＲＥＴ現象を測定することにより、レセプターＲにリガンドＬがどの程度結合しているかを知ることが可能となる。
【００２７】
図１に戻り、レーザ光源部３０は、強度が時間変調されたレーザ光をサンプル１２に照射する。サンプル１２にレーザ光が照射されることにより、ドナー分子１６とアクセプター分子１８はそれぞれエネルギーを吸収する。例えば、ドナー分子１６がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプター分子１８がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）である場合、ドナー分子１６が主にエネルギーを吸収する波長４０５ｎｍ〜４５０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光源部３０は、例えば、半導体レーザである。レーザ光源部３０が出射するレーザ光の出力は、例えば、５ｍＷ〜１００ｍＷである。
【００２８】
ここで、レーザ光源部３０が照射するレーザ光の波長と、ドナー分子１６及びアクセプター分子１８がエネルギーを吸収する波長との関係、及びＦＲＥＴの発生について説明する。
図３は、ドナー分子１６がＣＦＰ、アクセプター分子１８がＹＦＰである場合のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルを示す図である。曲線Ａ１はドナー分子１６のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ａ２はドナー分子１６の蛍光放射スペクトルである。また、曲線Ｂ１はアクセプター分子１８のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ｂ２はアクセプター分子１８の蛍光放射スペクトルである。
図３に示されるように、ドナー分子１６が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４０５ｎｍ〜４５０ｎｍである。また、アクセプター分子１８が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４７０ｎｍ〜５３０ｎｍである。
【００２９】
一般に、ドナー分子１６とアクセプター分子１８との距離が１０ｎｍ以下である場合、レーザ光の照射によりドナー分子１６が吸収したエネルギーの一部が、クーロン相互作用によりアクセプター分子１８へ移動する。アクセプター分子１８は、クーロン相互作用によりドナー分子１６から移動したエネルギーを吸収することにより励起され、蛍光を発する。この現象は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれる。
【００３０】
ドナー分子１６としてＣＦＰを用い、アクセプター分子１８としてＹＦＰを用いた場合もＦＲＥＴが発生する。すなわち、クーロン相互作用によりドナー分子１６からアクセプター分子１８へエネルギーが移動することにより、アクセプター分子１８が励起されたことに起因する蛍光を発する。
【００３１】
図１に戻り、計測部４０は、管路２０を挟んでレーザ光源部３０と対向するように配置されている。計測部４０は、測定点を通過するサンプル１２によってレーザ光が前方散乱することにより、サンプル１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。計測部４０から出力される信号は、制御・処理部１００に供給される。計測部４０から制御・処理部１００に供給される信号は、サンプル１２が管路２０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００３２】
計測部５０は、測定点を通り、レーザ光源部３０から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交する平面と、測定点を通り、管路２０中のサンプル１２の移動方向に対して直交する平面との交線上に配置されている。計測部５０は、測定点にてレーザ光を照射されたサンプル１２が発する蛍光を受光する光電子倍増管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を備える。
【００３３】
ここで、図４を参照して、計測部５０の構成の詳細を説明する。図４は、本実施形態の計測部５０の一例を示す概略構成図である。図４に示されるように、計測部５０は、レンズ系５１と、ダイクロイックミラー５２と、バンドパスフィルター５３，５４と、光電変換器５５，５６と、を備える。
レンズ系５１は、サンプル１２が発する蛍光を集束させる。ダイクロイックミラー５２は、アクセプター分子１８が発する蛍光を透過し、ドナー分子１６が発する蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められている。
【００３４】
バンドパスフィルター５３，５４は、光電変換器５５，５６の受光面の前面に設けられる。バンドパスフィルター５３，５４は、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させる。具体的には、バンドパスフィルター５３は、ドナー分子１６が主に蛍光を発する波長帯域（図３においてＡで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。また、バンドパスフィルター５４は、アクセプター分子１８が主に蛍光を発する波長帯域（図３においてＢで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。
【００３５】
光電変換器５５，５６は、受光した光を電気信号に変換する。光電変換器５５，５６は、例えば、光電子倍増管を備えたセンサである。光電変換器５５，５６が受光する蛍光は、強度変調されたレーザ光よりも位相が遅れている。そのため、光電変換器５５，５６は、強度変調されたレーザ光に対する位相差の情報を持った光信号を受光し、電気信号に変換する。光電変換器５５，５６から出力された信号（蛍光信号）は、制御・処理部１００に供給される。
【００３６】
ここで、図５を参照して、制御・処理部１００の構成の詳細を説明する。図５は、本実施形態の制御・処理部１００の一例を示す概略構成図である。図５に示されるように、制御・処理部１００は、信号生成部１１０と、信号処理部１２０と、コントローラ１３０と、を備える。
信号生成部１１０は、レーザ光の強度を時間変調するための変調信号を生成する。変調信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号であり、１０ＭＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
信号生成部１１０は、発振器１１２と、パワースプリッタ１１４と、増幅器１１６，１１８と、を備える。発振器１１２により生成された変調信号は、パワースプリッタ１１４により分けられ、レーザ光源部３０と信号処理部１２０とに供給される。信号生成部１１０が変調信号を信号処理部１２０に供給するのは、後述するように、変調信号に対する蛍光信号の位相差を測定するための参照信号として用いるためである。また、変調信号は、レーザ光源部３０が出射するレーザ光の振幅を変調するための信号として用いられる。
【００３７】
信号処理部１２０は、光電変換器５５，５６から出力される蛍光信号を用いて、サンプル１２が発する蛍光の情報を抽出する。サンプル１２が発する蛍光の情報は、例えば、蛍光の強度に関する情報や、蛍光の寿命に関する情報である。信号処理部１２０は、増幅器１２２，１２４と、位相差検出器１２６と、を備える。
増幅器１２２，１２４は、光電変換器５５，５６から出力される信号を増幅し、増幅した信号を位相差検出器１２６に出力する。
【００３８】
位相差検出器１２６は、光電変換器５５，５６から出力された蛍光信号のそれぞれについて、変調信号（参照信号）に対する位相差を検出する。位相差検出器１２６は、不図示のＩＱミキサを備えている。ＩＱミキサは、参照信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。また、ＩＱミキサは、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。
【００３９】
コントローラ１３０は、信号生成部１１０が所定の周波数の正弦波信号を生成するように、信号生成部１１０を制御する。また、コントローラ１３０は、信号処理部１２０により出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を求める。
【００４０】
コントローラ１３０は、ローパスフィルタ１３２と、増幅器１３４と、Ａ／Ｄ変換器１３６と、システム制御器１３８と、を備える。ローパスフィルタ１３２は、信号処理部１２０から出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分と高周波成分を含む信号から、高周波成分を取り除く。増幅器１３４は、ローパスフィルタ１３２によって高周波成分が取り除かれた信号である、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅し、Ａ／Ｄ変換器１３６に出力する。Ａ／Ｄ変換器１３６は、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号をサンプリングし、分析装置１５０に供給する。システム制御器１３８は、計測部４０から出力されるトリガ信号の入力を受ける。また、システム制御器１３８は、発振器１１２とＡ／Ｄ変換器１３６を制御する。
【００４１】
図１に戻り、分析装置１５０は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号から、蛍光寿命、結合比率、解離定数などを算出する。
分析装置１５０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置である。ここで、図６を参照して、分析装置１５０の構成を詳細に説明する。図６は、本実施形態の分析装置１５０の一例を示す概略構成図である。図６に示されるように、分析装置１５０は、ＣＰＵ１５２と、メモリ１５４と、入出力ポート１５６と、蛍光寿命算出ユニット１５８と、結合比率算出ユニット１６０と、解離定数算出ユニット１６２と、判定部１６４と、を備える。
また分析装置１５０には、ディスプレイ２００が接続されている。
【００４２】
ＣＰＵ１５２は、コンピュータに設けられた演算プロセッサである。ＣＰＵ１５２は、蛍光寿命算出ユニット１５８、結合比率算出ユニット１６０、解離定数算出ユニット１６２の各種計算を実質的に実行する。
メモリ１５４は、コンピュータ上で実行することにより、蛍光寿命算出ユニット１５８、結合比率算出ユニット１６０、解離定数算出ユニット１６２を形成するプログラムを格納したＲＯＭと、これらのユニットにより算出された処理結果や入出力ポート１５６から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備える。
【００４３】
入出力ポート１５６は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を受ける。また、入出力ポート１５６は、各ユニットにより算出された処理結果をディスプレイ２００に出力する。
ディスプレイ２００は、各ユニットにより求められた各種情報や処理結果などを表示する。
【００４４】
蛍光寿命算出ユニット１５８は、計測部５０で計測された蛍光信号を用いて、ドナー分子１６の蛍光寿命を算出する。例えば、蛍光寿命算出ユニット１５８は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値から、変調信号に対する蛍光信号の位相差を求める。また、蛍光寿命算出ユニット１５８は、求めた位相差を用いて、ドナー分子１６の蛍光寿命を算出する。具体的に、蛍光寿命算出ユニット１５８は、後述する式（２１）に基づいて、位相差のｔａｎ成分を変調信号の角周波数で除算することにより、蛍光寿命を算出する。蛍光寿命は、レーザ光の照射により発せられる蛍光成分が、１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数で表される。
【００４５】
結合比率算出ユニット１６０は、蛍光寿命算出ユニット１５８で算出された蛍光寿命を用いて、サンプル１２中に含まれるレセプターＲのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する。具体的には、結合比率算出ユニット１６０は、後述する式（２３）により規定される結合比率κＦＲＥＴを算出する。
【００４６】
解離定数算出ユニット１６２は、レセプターＲとリガンドＬとの結合の度合いを示す解離定数Ｋｄを算出する。具体的には、解離定数算出ユニット１６２は、サンプル１２中のレセプターＲの全濃度と解離定数Ｋｄとを変数とする最小二乗法を用いて、結合比率算出部１６０で算出された結合比率κＦＲＥＴにフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄを求める。より具体的には、解離定数算出ユニット１６２は、サンプル１２中のレセプターＲの全濃度と解離定数Ｋｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、後述する式（８）をフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄを求める。
【００４７】
判定部１６４は、解離定数算出ユニット１６２が二変数最小二乗法を用いてフィッティングするために必要となる所定数の測定データが得られたか否かを判定する。
以上が、本実施形態のフローサイトメータ１０の構成である。
【００４８】
（ＦＲＥＴ測定方法の概要）
次に、本発明のＦＲＥＴ測定方法の概要を説明する。
図２を参照して説明したように、本実施形態では、レセプターＲにリガンドＬが結合することによりＦＲＥＴ現象が生じる。サンプル１２中で、レセプターＲとリガンドＬは、上述した式（１）で表される平衡状態となる。ここで、上述した式（２）、式（３）、式（４）を用いて、［Ｌ］、［Ｒ］を消去すると、下記式（７）が得られる。
【数８】
【００４９】
［ＬＲ］＜［Ｌ０］の条件において、上記式（７）を［ＬＲ］について解くと、下記式（８）が得られる。
【数９】
上記式（８）は、式（７）の厳密解であり、解離定数Ｋｄの大きさによらずに成り立つ関係式である。また、［ＬＲ］／［Ｒ０］は、全レセプターＲのうちリガンドＬと結合しているレセプターＲの比率を示す。以下、レセプターＲとリガンドＬが結合すると常にＦＲＥＴが発生すると仮定する。また、サンプル１２に含まれるレセプターＲのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターＲの比率［ＬＲ］／［Ｒ０］を結合比率κＦＲＥＴと定義する。
【００５０】
本発明のＦＲＥＴ測定方法では、全リガンド濃度［Ｌ０］の値を異ならせ、全リガンド濃度［Ｌ０］の各々に対して全リガンド濃度［Ｌ０］に対応する結合比率κＦＲＥＴを測定する。また、全レセプター濃度［Ｒ０］と解離定数Ｋｄを変数とし、上記式（８）に基づく曲線を、二変数最小二乗法を用いて［Ｌ０］、κＦＲＥＴにフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄを求める。
【００５１】
（結合比率κＦＲＥＴの算出方法）
まず、結合比率κＦＲＥＴの算出方法を説明する。
サンプル１２中の全レセプター濃度をＣ０、ＦＲＥＴが発生しているレセプターの濃度をＣ＋、ＦＲＥＴが発生していないレセプターの濃度をＣ−と定義する。ここで、Ｃ−＝Ｃ０−Ｃ＋である。また、レーザ光による励起パワーをＰ（ｔ）、ＦＲＥＴが発生しているレセプターＲに結合しているドナー分子１６の励起電子数をＮ＋（ｔ）、ＦＲＥＴが発生していないレセプターＲに結合しているドナー分子１６の励起電子数をＮ−（ｔ）と定義する。このとき、励起電子のレート方程式は、下記式（９）、式（１０）で表される。
【数１０】
ここで、ｋｆは発光遷移の速度定数、ｋｎｒは無輻射遷移の速度定数、ｋｔは共鳴エネルギー移動の速度定数である。また、ＫＰ（ｔ）は、単位時間、単位体積当りにレーザ光により励起される電子数である。
【００５２】
サンプル１２に含まれるレセプターＲのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターＲの比率である結合比率κＦＲＥＴは、下記式（１１）で表される。
【数１１】
ここで、式（９）、式（１０）、式（１１）よりＣ＋、Ｃ−を消去し、Ｋｅｘ＝Ｃ０Ｋとすると、励起電子のレート方程式は、下記式（１２）、式（１３）で表される。
【数１２】
【００５３】
式（１２）、式（１３）をラプラス変換すると、下記式（１４）、式（１５）が得られる。
【数１３】
ここで、τｍｉｎはドナー分子１６の蛍光寿命の最小値であり、１／τｍｉｎ＝ｋｆ＋ｋｎｒ＋ｋｔの関係式を満たす。また、τｍａｘはドナー分子１６の蛍光寿命の最大値であり、１／τｍａｘ＝ｋｆ＋ｋｎｒの関係式を満たす。
【００５４】
τｍｉｎはサンプル１２中の全てのドナー分子１６でＦＲＥＴが発生している場合のドナー分子１６の蛍光寿命である。例えば、ドナー分子１６に対してアクセプター分子１８の濃度を十分に大きくした条件でドナー分子１６の蛍光寿命を測定することにより、τｍｉｎを測定することができる。
また、τｍａｘはサンプル１２中の全てのドナー分子１６でＦＲＥＴが発生していない場合のドナー分子１６の蛍光寿命である。例えば、サンプル１２中にアクセプター分子１８を添加しない条件でドナー分子１６の蛍光寿命を測定することにより、τｍａｘを測定することができる。
このように、τｍｉｎとτｍａｘの値は、測定により求めることができる。
【００５５】
上記式（１４）、式（１５）より、サンプル１２中のドナー分子１６の励起電子数Ｎ（ｓ）は、下記式（１６）で表される。
【数１４】
式（１６）の括弧で示される部分がドナー分子１６の蛍光寿命に関係するため、式（１６）の括弧で示される部分をＴと定義して整理すると、下記式（１７）が得られる。
【数１５】
【００５６】
ここで、上記式（１７）のｓにｊωを代入して整理すると、下記式（１８）が得られる。
【数１６】
ここで、θ１、θ２は、下記式（１９）、式（２０）で表される。
【数１７】
ここで、ωはレーザ光を変調する変調信号の角周波数である。また、θ１−θ２は、ドナー分子１６の蛍光信号とレーザ光を変調する変調信号との位相差である。
【００５７】
ドナー分子１６の蛍光信号とレーザ光を変調する変調信号との位相差、および、変調信号の角周波数より、ドナー分子１６の蛍光寿命τは、下記式（２１）により求められる。
【数１８】
ここで、上記式（１９）、式（２１）よりθ１を消去すると、下記式（２２）が得られる。
【数１９】
【００５８】
上記式（２２）をκＦＲＥＴについて解くと、下記式（２３）が得られる。
【数２０】
上記式（２３）により、ドナー分子１６の蛍光寿命τから結合比率κＦＲＥＴを求めることができる。なお、上述したように、τｍｉｎ、τｍａｘの値は、別途測定により求めることができる。式（２３）により求められた結合比率κＦＲＥＴを用いて、後述するように結合定数Ｋｄを求めることができる。
【００５９】
（ＦＲＥＴ測定方法）
次に、図７、図８、図９を参照して、本発明のＦＲＥＴ測定方法について説明する。図７は、本発明のＦＲＥＴ測定方法の一例を示すフローチャートである。図８は、全リガンド濃度［Ｌ０］に対するドナー分子１６の蛍光寿命τの測定結果の一例を示す図である。図９は、全リガンド濃度［Ｌ０］に対する結合比率κＦＲＥＴの測定結果の一例を示す図である。
【００６０】
まず、フローサイトメータ１０がサンプル１２の結合条件を設定する（ステップＳ１０１）。例えば、サンプル１２に添加される全リガンド濃度［Ｌ０］を調整することにより、サンプル１２の結合条件が設定される。
次に、強度が時間変調されたレーザ光を、レーザ光源部３０がサンプル１２に照射する（ステップＳ１０２）。次に、計測部５０が、測定点にてレーザ光を照射されたサンプル１２が発する蛍光を受光する（ステップＳ１０３）。
【００６１】
次に、蛍光寿命算出ユニット１５８が、計測部５０で計測された蛍光信号を用いて、ドナー分子１６の蛍光寿命を算出する（ステップＳ１０４）。具体的には、蛍光信号と変調信号との位相差（θ１−θ２）から、上述した式（２１）に基づいて、蛍光寿命算出ユニット１５８がドナー分子１６の蛍光寿命を算出する。ステップＳ１０４により、図８に示される１つの測定結果が得られる。
【００６２】
次に、結合比率算出ユニット１６０が、蛍光寿命算出ユニット１５８で算出された蛍光寿命τを用いて、結合比率κＦＲＥＴを算出する（ステップＳ１０５）。具体的には、蛍光寿命算出ユニット１５８で算出された蛍光寿命τを用いて、上述した式（２３）に基づいて、結合比率算出ユニット１６０が結合比率κＦＲＥＴを算出する。調整した［Ｌ０］に応じて、結合比率κＦＲＥＴが得られる。したがって、ステップＳ１０５により、図９に示される１つの測定結果が得られる。
【００６３】
次に、二変数最小二乗法を用いてフィッティングするために必要となる所定数の測定データが得られたか否かを、判定部１６４が判定する（ステップＳ１０６）。解離定数算出ユニット１６２が二変数最小二乗法を用いてフィッティングするために、例えば、１０〜１５点程度の測定データが得られていることが好ましい。得られた測定データの数（測定数）が所定数よりも少ないと判定部１６４が判定した場合、所定数の測定データが得られるまで、上述したステップＳ１０１〜Ｓ１０５を繰り返す。
【００６４】
所定数の測定データが得られ、測定数が所定数に等しいと判定部１６４が判定した場合、解離定数算出ユニット１６２が、レセプターＲとリガンドＬとの結合の度合いを示す解離定数Ｋｄを算出する。具体的には、全レセプター濃度［Ｒ０］と解離定数Ｋｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、解離定数算出ユニット１６２が上述した式（８）を、結合比率κＦＲＥＴ、全リガンド濃度［Ｌ０］にフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄが求められる。
【００６５】
以上説明したように、本発明によれば、最小二乗法を用いて、サンプル１２中の全レセプター濃度［Ｒ０］と解離定数Ｋｄとを変数とする関数を、結合比率κＦＲＥＴ、全リガンド濃度［Ｌ０］にフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄが求められる。そのため、本発明によれば、解離定数Ｋｄの大きさによらず、解離定数Ｋｄを精度よく測定することができる。
【００６６】
なお、上述した実施形態では、図２を参照して説明したように、レセプターＲにドナー分子１６とアクセプター分子１８が結合している場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、レセプターＲにドナー分子１６が結合しており、リガンドＬにアクセプター分子１８が結合している場合にも、本発明を適用することができる。
【００６７】
以上、本発明のＦＲＥＴ測定方法、及び、ＦＲＥＴ測定装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。また、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００６８】
１０ フローサイトメータ
１２ サンプル
１６ ドナー分子
１８ アクセプター分子
２０ 管路
２２ 回収容器
３０ レーザ光源部
４０，５０ 計測部
５１ レンズ系
５２ ダイクロイックミラー
５３，５４ バンドパスフィルター
５５，５６ 光電変換器
１００ 制御・処理部
１１０ 信号生成部
１１２ 発振器
１１４ パワースプリッタ
１１６，１１８ 増幅器
１２０ 信号処理部
１２２，１２４ 増幅器
１２６ 位相差検出器
１３０ コントローラ
１３２ ローパスフィルタ
１３４ 増幅器
１３６ Ａ／Ｄ変換器
１３８ システム制御器
１５０ 分析装置
１５２ ＣＰＵ
１５４ メモリ
１５６ 入出力ポート
１５８ 蛍光寿命算出ユニット
１６０ 結合比率算出ユニット
１６２ 解離定数算出ユニット
１６４ 判定部
２００ ディスプレイ
Ｒ レセプター
Ｌ リガンド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光の照射によってドナー分子（第１分子）がエネルギーを吸収し、ドナー分子からアクセプター分子（第２分子）へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を測定する方法及び装置に関する。具体的には、レセプターとリガンドが結合し、ドナー分子及びアクセプター分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、解離定数を求めるＦＲＥＴ測定装置及びＦＲＥＴ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用の解析が行われている。ＦＲＥＴ現象により生じる蛍光を測定することにより、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を測定することができる。
【０００３】
例えば、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光寿命τ＊ｄと、アクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命τｄとを用いて、ドナー分子からアクセプター分子へのエネルギー移動の程度を示すＦＲＥＴ効率を求める技術が知られている（特許文献１）。
上記特許文献１において、ＦＲＥＴ効率は、１−τ＊ｄ／τｄにより求められる。
【０００４】
しかし、上記ＦＲＥＴ効率は、ドナー分子やアクセプター分子の濃度に影響を受けるため、上記技術を用いて細胞等に含まれるタンパク質の相互作用の強さを定量的に求めることは難しい。
【０００５】
一般に、分子が相互作用する際の結合の強さを表す指標として、解離定数Ｋｄが用いられる。しかし、解離定数Ｋｄを精度よく測定することが容易ではない場合がある。以下、解離定数Ｋｄについて説明する。例えば、下記式（１）に示される反応の場合、解離定数Ｋｄは、下記式（２）のように定義される。ここで、Ｌはリガンド、Ｒはレセプター、ＬＲはリガンドと結合しているレセプターを示す。また、［Ｌ］はレセプターと結合していないリガンドの濃度（以下、「リガンド濃度」と呼ぶ。）、［Ｒ］はリガンドと結合していないレセプターの濃度（以下、「レセプター濃度」と呼ぶ。）、［ＬＲ］はリガンドと結合しているレセプターの濃度を示す。
【数１】
【数２】
【０００６】
ここで、サンプル中に含まれる全リガンド濃度を［Ｌ０］、全レセプター濃度を［Ｒ０］とすると、［Ｌ０］、［Ｒ０］は以下のような関係式で表される。
【数３】
【０００７】
式（２）と式（４）より［Ｒ］を消去すると、下記式（５）が得られる。
【数４】
式（５）の左辺は、全レセプターのうちリガンドと結合しているレセプターの割合を示すものである。［ＬＲ］／［Ｒ０］を［Ｌ］の対数軸に対してプロットすると、シグモイド曲線となる。
【０００８】
解離定数Ｋｄが大きいことは、式（１）の右辺から左辺への反応が起こりやすいことを示す。そのため、解離定数Ｋｄがある程度大きい場合は、［Ｌ］＞＞［ＬＲ］の関係が成り立つ。このとき、式（３）と式（５）より、［ＬＲ］／［Ｒ０］は下記式（６）のように近似される。
【数５】
【０００９】
式（６）によれば、全リガンド濃度［Ｌ０］が解離定数Ｋｄに等しくなるとき、サンプル中に含まれる全レセプターのうちリガンドと結合しているレセプターの割合［ＬＲ］／［Ｒ０］が０．５となる。そのため、全リガンド濃度［Ｌ０］を変化させながら［ＬＲ］／［Ｒ０］を測定し、［ＬＲ］／［Ｒ０］が０．５となるときの全リガンド濃度［Ｌ０］から解離定数Ｋｄを求めることができる。
平衡状態にあるリガンドの濃度［Ｌ］を測定するのが困難な場合であっても、全リガンド濃度［Ｌ０］を求めることは可能であるため、上記のような方法により解離定数Ｋｄを求める手法が用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−２４０４２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、解離定数Ｋｄが小さい場合は、［Ｌ］＞＞［ＬＲ］の関係式が成り立たないため、式（５）を式（６）のように近似することができない。そのため、解離定数Ｋｄが小さい場合、全リガンド濃度［Ｌ０］を変化させながら［ＬＲ］／［Ｒ０］を測定し、［ＬＲ］／［Ｒ０］が０．５となるときの全リガンド濃度［Ｌ０］は、解離定数Ｋｄの値とは異なる値となり、従来の手法では、解離定数Ｋｄを正しく求めることができない。
【００１２】
そこで、本発明は、解離定数Ｋｄの大きさによらず、解離定数Ｋｄを精度よく測定することができるＦＲＥＴ測定方法及びＦＲＥＴ測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のＦＲＥＴ測定方法は、レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定方法であって、強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射する照射ステップと、前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測ステップと、前記計測ステップで計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出ステップと、前記蛍光寿命算出ステップで算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出ステップと、前記結合比率が異なるように、前記測定サンプルの結合条件を設定する結合条件設定ステップと、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出ステップと、を有し、前記解離定数算出ステップは、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率算出ステップで算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とする。
【００１４】
また、前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、前記解離定数算出ステップは、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求めることが好ましい。
【数６】
【００１５】
また、前記蛍光寿命算出ステップは、前記計測ステップで計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出することが好ましい。
【００１６】
また、前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定することが好ましい。
【００１７】
また、前記レセプターには、第１分子が結合しており、前記リガンドには、第２分子が結合しており、前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定することが好ましい。
【００１８】
本発明のＦＲＥＴ測定装置は、レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定装置であって、強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射するレーザ光源部と、前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測部と、前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出部と、前記蛍光寿命算出部で算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出部と、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出部と、を備え、前記解離定数算出部は、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率が異なる複数の結合条件において前記結合比率算出部で算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とする。
【００１９】
また、前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、前記解離定数算出部は、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求めることが好ましい。
【数７】
【００２０】
また、前記蛍光寿命算出部は、前記計測部で計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出することが好ましい。
【００２１】
また、前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることが好ましい。
【００２２】
また、前記レセプターには、第１分子が結合しており、前記リガンドには、第２分子が結合しており、前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のＦＲＥＴ測定方法及びＦＲＥＴ測定装置によれば、解離定数Ｋｄの大きさによらず、解離定数Ｋｄを精度よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＦＲＥＴ測定装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】（ａ）は、レセプターにリガンドが結合していない状態のサンプルを示す図であり、（ｂ）は、レセプターにリガンドが結合している状態のサンプルを示す図である。
【図３】ドナー分子とアクセプター分子のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルの一例を示す図である。
【図４】図１に示すフローサイトメータの計測部の一例を示す概略構成図である。
【図５】図１に示すフローサイトメータの制御・処理部の一例を示す概略構成図である。
【図６】図１に示すフローサイトメータの分析装置の一例を示す概略構成図である。
【図７】ＦＲＥＴ測定方法の一例を示すフローチャートである。
【図８】全リガンド濃度に対するドナー分子の蛍光寿命の測定結果の一例を示す図である。
【図９】全リガンド濃度に対する結合比率の測定結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（ＦＲＥＴ測定装置の概略構成）
以下、本発明のＦＲＥＴ測定方法及び装置について、詳細に説明する。
図１は、本発明のＦＲＥＴ測定装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
本実施形態のフローサイトメータ１０は、例えば、測定対象となる生細胞中のタンパク質をドナー分子とアクセプター分子で標識したサンプル１２（測定サンプル）にレーザ光を照射し、サンプル１２が発する蛍光を計測する。計測された蛍光信号を用いることにより、フローサイトメータ１０は、解離定数Ｋｄの値を求める。図１に示されるように、フローサイトメータ１０は、管路２０と、レーザ光源部３０と、計測部４０，５０と、制御・処理部１００と、分析装置１５０と、を備える。
【００２６】
管路２０は、高速流を形成するシース液とともにサンプル１２を流す。管路２０の出口には、サンプル１２を回収する回収容器２２が設けられている。
ここで、図２を参照して、本実施形態のサンプル１２について説明する。本実施形態のサンプル１２では、レセプターＲにドナー分子１６とアクセプター分子１８が結合している。図２（ａ）は、レセプターＲにリガンドＬが結合していない状態のサンプル１２を示す図であり、図２（ｂ）は、レセプターＲにリガンドＬが結合している状態のサンプル１２を示す図である。図２（ａ）、（ｂ）に示されるように、本実施形態では、レセプターＲにリガンドＬが結合するとレセプターＲが変形する。その結果、ドナー分子１６とアクセプター分子１８との距離が近くなり、ＦＲＥＴ現象が生じる。従って、本実施形態のフローサイトメータ１０によりＦＲＥＴ現象を測定することにより、レセプターＲにリガンドＬがどの程度結合しているかを知ることが可能となる。
【００２７】
図１に戻り、レーザ光源部３０は、強度が時間変調されたレーザ光をサンプル１２に照射する。サンプル１２にレーザ光が照射されることにより、ドナー分子１６とアクセプター分子１８はそれぞれエネルギーを吸収する。例えば、ドナー分子１６がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプター分子１８がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）である場合、ドナー分子１６が主にエネルギーを吸収する波長４０５ｎｍ〜４５０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光源部３０は、例えば、半導体レーザである。レーザ光源部３０が出射するレーザ光の出力は、例えば、５ｍＷ〜１００ｍＷである。
【００２８】
ここで、レーザ光源部３０が照射するレーザ光の波長と、ドナー分子１６及びアクセプター分子１８がエネルギーを吸収する波長との関係、及びＦＲＥＴの発生について説明する。
図３は、ドナー分子１６がＣＦＰ、アクセプター分子１８がＹＦＰである場合のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルを示す図である。曲線Ａ１はドナー分子１６のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ａ２はドナー分子１６の蛍光放射スペクトルである。また、曲線Ｂ１はアクセプター分子１８のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ｂ２はアクセプター分子１８の蛍光放射スペクトルである。
図３に示されるように、ドナー分子１６が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４０５ｎｍ〜４５０ｎｍである。また、アクセプター分子１８が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４７０ｎｍ〜５３０ｎｍである。
【００２９】
一般に、ドナー分子１６とアクセプター分子１８との距離が１０ｎｍ以下である場合、レーザ光の照射によりドナー分子１６が吸収したエネルギーの一部が、クーロン相互作用によりアクセプター分子１８へ移動する。アクセプター分子１８は、クーロン相互作用によりドナー分子１６から移動したエネルギーを吸収することにより励起され、蛍光を発する。この現象は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれる。
【００３０】
ドナー分子１６としてＣＦＰを用い、アクセプター分子１８としてＹＦＰを用いた場合もＦＲＥＴが発生する。すなわち、クーロン相互作用によりドナー分子１６からアクセプター分子１８へエネルギーが移動することにより、アクセプター分子１８が励起されたことに起因する蛍光を発する。
【００３１】
図１に戻り、計測部４０は、管路２０を挟んでレーザ光源部３０と対向するように配置されている。計測部４０は、測定点を通過するサンプル１２によってレーザ光が前方散乱することにより、サンプル１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。計測部４０から出力される信号は、制御・処理部１００に供給される。計測部４０から制御・処理部１００に供給される信号は、サンプル１２が管路２０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００３２】
計測部５０は、測定点を通り、レーザ光源部３０から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交する平面と、測定点を通り、管路２０中のサンプル１２の移動方向に対して直交する平面との交線上に配置されている。計測部５０は、測定点にてレーザ光を照射されたサンプル１２が発する蛍光を受光する光電子倍増管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を備える。
【００３３】
ここで、図４を参照して、計測部５０の構成の詳細を説明する。図４は、本実施形態の計測部５０の一例を示す概略構成図である。図４に示されるように、計測部５０は、レンズ系５１と、ダイクロイックミラー５２と、バンドパスフィルター５３，５４と、光電変換器５５，５６と、を備える。
レンズ系５１は、サンプル１２が発する蛍光を集束させる。ダイクロイックミラー５２は、アクセプター分子１８が発する蛍光を透過し、ドナー分子１６が発する蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められている。
【００３４】
バンドパスフィルター５３，５４は、光電変換器５５，５６の受光面の前面に設けられる。バンドパスフィルター５３，５４は、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させる。具体的には、バンドパスフィルター５３は、ドナー分子１６が主に蛍光を発する波長帯域（図３においてＡで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。また、バンドパスフィルター５４は、アクセプター分子１８が主に蛍光を発する波長帯域（図３においてＢで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。
【００３５】
光電変換器５５，５６は、受光した光を電気信号に変換する。光電変換器５５，５６は、例えば、光電子倍増管を備えたセンサである。光電変換器５５，５６が受光する蛍光は、強度変調されたレーザ光よりも位相が遅れている。そのため、光電変換器５５，５６は、強度変調されたレーザ光に対する位相差の情報を持った光信号を受光し、電気信号に変換する。光電変換器５５，５６から出力された信号（蛍光信号）は、制御・処理部１００に供給される。
【００３６】
ここで、図５を参照して、制御・処理部１００の構成の詳細を説明する。図５は、本実施形態の制御・処理部１００の一例を示す概略構成図である。図５に示されるように、制御・処理部１００は、信号生成部１１０と、信号処理部１２０と、コントローラ１３０と、を備える。
信号生成部１１０は、レーザ光の強度を時間変調するための変調信号を生成する。変調信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号であり、１０ＭＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
信号生成部１１０は、発振器１１２と、パワースプリッタ１１４と、増幅器１１６，１１８と、を備える。発振器１１２により生成された変調信号は、パワースプリッタ１１４により分けられ、レーザ光源部３０と信号処理部１２０とに供給される。信号生成部１１０が変調信号を信号処理部１２０に供給するのは、後述するように、変調信号に対する蛍光信号の位相差を測定するための参照信号として用いるためである。また、変調信号は、レーザ光源部３０が出射するレーザ光の振幅を変調するための信号として用いられる。
【００３７】
信号処理部１２０は、光電変換器５５，５６から出力される蛍光信号を用いて、サンプル１２が発する蛍光の情報を抽出する。サンプル１２が発する蛍光の情報は、例えば、蛍光の強度に関する情報や、蛍光の寿命に関する情報である。信号処理部１２０は、増幅器１２２，１２４と、位相差検出器１２６と、を備える。
増幅器１２２，１２４は、光電変換器５５，５６から出力される信号を増幅し、増幅した信号を位相差検出器１２６に出力する。
【００３８】
位相差検出器１２６は、光電変換器５５，５６から出力された蛍光信号のそれぞれについて、変調信号（参照信号）に対する位相差を検出する。位相差検出器１２６は、不図示のＩＱミキサを備えている。ＩＱミキサは、参照信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。また、ＩＱミキサは、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。
【００３９】
コントローラ１３０は、信号生成部１１０が所定の周波数の正弦波信号を生成するように、信号生成部１１０を制御する。また、コントローラ１３０は、信号処理部１２０により出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を求める。
【００４０】
コントローラ１３０は、ローパスフィルタ１３２と、増幅器１３４と、Ａ／Ｄ変換器１３６と、システム制御器１３８と、を備える。ローパスフィルタ１３２は、信号処理部１２０から出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分と高周波成分を含む信号から、高周波成分を取り除く。増幅器１３４は、ローパスフィルタ１３２によって高周波成分が取り除かれた信号である、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅し、Ａ／Ｄ変換器１３６に出力する。Ａ／Ｄ変換器１３６は、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号をサンプリングし、分析装置１５０に供給する。システム制御器１３８は、計測部４０から出力されるトリガ信号の入力を受ける。また、システム制御器１３８は、発振器１１２とＡ／Ｄ変換器１３６を制御する。
【００４１】
図１に戻り、分析装置１５０は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号から、蛍光寿命、結合比率、解離定数などを算出する。
分析装置１５０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置である。ここで、図６を参照して、分析装置１５０の構成を詳細に説明する。図６は、本実施形態の分析装置１５０の一例を示す概略構成図である。図６に示されるように、分析装置１５０は、ＣＰＵ１５２と、メモリ１５４と、入出力ポート１５６と、蛍光寿命算出ユニット１５８と、結合比率算出ユニット１６０と、解離定数算出ユニット１６２と、判定部１６４と、を備える。
また分析装置１５０には、ディスプレイ２００が接続されている。
【００４２】
ＣＰＵ１５２は、コンピュータに設けられた演算プロセッサである。ＣＰＵ１５２は、蛍光寿命算出ユニット１５８、結合比率算出ユニット１６０、解離定数算出ユニット１６２の各種計算を実質的に実行する。
メモリ１５４は、コンピュータ上で実行することにより、蛍光寿命算出ユニット１５８、結合比率算出ユニット１６０、解離定数算出ユニット１６２を形成するプログラムを格納したＲＯＭと、これらのユニットにより算出された処理結果や入出力ポート１５６から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備える。
【００４３】
入出力ポート１５６は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を受ける。また、入出力ポート１５６は、各ユニットにより算出された処理結果をディスプレイ２００に出力する。
ディスプレイ２００は、各ユニットにより求められた各種情報や処理結果などを表示する。
【００４４】
蛍光寿命算出ユニット１５８は、計測部５０で計測された蛍光信号を用いて、ドナー分子１６の蛍光寿命を算出する。例えば、蛍光寿命算出ユニット１５８は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値から、変調信号に対する蛍光信号の位相差を求める。また、蛍光寿命算出ユニット１５８は、求めた位相差を用いて、ドナー分子１６の蛍光寿命を算出する。具体的に、蛍光寿命算出ユニット１５８は、後述する式（２１）に基づいて、位相差のｔａｎ成分を変調信号の角周波数で除算することにより、蛍光寿命を算出する。蛍光寿命は、レーザ光の照射により発せられる蛍光成分が、１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数で表される。
【００４５】
結合比率算出ユニット１６０は、蛍光寿命算出ユニット１５８で算出された蛍光寿命を用いて、サンプル１２中に含まれるレセプターＲのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する。具体的には、結合比率算出ユニット１６０は、後述する式（２３）により規定される結合比率κＦＲＥＴを算出する。
【００４６】
解離定数算出ユニット１６２は、レセプターＲとリガンドＬとの結合の度合いを示す解離定数Ｋｄを算出する。具体的には、解離定数算出ユニット１６２は、サンプル１２中のレセプターＲの全濃度と解離定数Ｋｄとを変数とする最小二乗法を用いて、結合比率算出部１６０で算出された結合比率κＦＲＥＴにフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄを求める。より具体的には、解離定数算出ユニット１６２は、サンプル１２中のレセプターＲの全濃度と解離定数Ｋｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、後述する式（８）をフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄを求める。
【００４７】
判定部１６４は、解離定数算出ユニット１６２が二変数最小二乗法を用いてフィッティングするために必要となる所定数の測定データが得られたか否かを判定する。
以上が、本実施形態のフローサイトメータ１０の構成である。
【００４８】
（ＦＲＥＴ測定方法の概要）
次に、本発明のＦＲＥＴ測定方法の概要を説明する。
図２を参照して説明したように、本実施形態では、レセプターＲにリガンドＬが結合することによりＦＲＥＴ現象が生じる。サンプル１２中で、レセプターＲとリガンドＬは、上述した式（１）で表される平衡状態となる。ここで、上述した式（２）、式（３）、式（４）を用いて、［Ｌ］、［Ｒ］を消去すると、下記式（７）が得られる。
【数８】
【００４９】
［ＬＲ］＜［Ｌ０］の条件において、上記式（７）を［ＬＲ］について解くと、下記式（８）が得られる。
【数９】
上記式（８）は、式（７）の厳密解であり、解離定数Ｋｄの大きさによらずに成り立つ関係式である。また、［ＬＲ］／［Ｒ０］は、全レセプターＲのうちリガンドＬと結合しているレセプターＲの比率を示す。以下、レセプターＲとリガンドＬが結合すると常にＦＲＥＴが発生すると仮定する。また、サンプル１２に含まれるレセプターＲのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターＲの比率［ＬＲ］／［Ｒ０］を結合比率κＦＲＥＴと定義する。
【００５０】
本発明のＦＲＥＴ測定方法では、全リガンド濃度［Ｌ０］の値を異ならせ、全リガンド濃度［Ｌ０］の各々に対して全リガンド濃度［Ｌ０］に対応する結合比率κＦＲＥＴを測定する。また、全レセプター濃度［Ｒ０］と解離定数Ｋｄを変数とし、上記式（８）に基づく曲線を、二変数最小二乗法を用いて［Ｌ０］、κＦＲＥＴにフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄを求める。
【００５１】
（結合比率κＦＲＥＴの算出方法）
まず、結合比率κＦＲＥＴの算出方法を説明する。
サンプル１２中の全レセプター濃度をＣ０、ＦＲＥＴが発生しているレセプターの濃度をＣ＋、ＦＲＥＴが発生していないレセプターの濃度をＣ−と定義する。ここで、Ｃ−＝Ｃ０−Ｃ＋である。また、レーザ光による励起パワーをＰ（ｔ）、ＦＲＥＴが発生しているレセプターＲに結合しているドナー分子１６の励起電子数をＮ＋（ｔ）、ＦＲＥＴが発生していないレセプターＲに結合しているドナー分子１６の励起電子数をＮ−（ｔ）と定義する。このとき、励起電子のレート方程式は、下記式（９）、式（１０）で表される。
【数１０】
ここで、ｋｆは発光遷移の速度定数、ｋｎｒは無輻射遷移の速度定数、ｋｔは共鳴エネルギー移動の速度定数である。また、ＫＰ（ｔ）は、単位時間、単位体積当りにレーザ光により励起される電子数である。
【００５２】
サンプル１２に含まれるレセプターＲのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターＲの比率である結合比率κＦＲＥＴは、下記式（１１）で表される。
【数１１】
ここで、式（９）、式（１０）、式（１１）よりＣ＋、Ｃ−を消去し、Ｋｅｘ＝Ｃ０Ｋとすると、励起電子のレート方程式は、下記式（１２）、式（１３）で表される。
【数１２】
【００５３】
式（１２）、式（１３）をラプラス変換すると、下記式（１４）、式（１５）が得られる。
【数１３】
ここで、τｍｉｎはドナー分子１６の蛍光寿命の最小値であり、１／τｍｉｎ＝ｋｆ＋ｋｎｒ＋ｋｔの関係式を満たす。また、τｍａｘはドナー分子１６の蛍光寿命の最大値であり、１／τｍａｘ＝ｋｆ＋ｋｎｒの関係式を満たす。
【００５４】
τｍｉｎはサンプル１２中の全てのドナー分子１６でＦＲＥＴが発生している場合のドナー分子１６の蛍光寿命である。例えば、ドナー分子１６に対してアクセプター分子１８の濃度を十分に大きくした条件でドナー分子１６の蛍光寿命を測定することにより、τｍｉｎを測定することができる。
また、τｍａｘはサンプル１２中の全てのドナー分子１６でＦＲＥＴが発生していない場合のドナー分子１６の蛍光寿命である。例えば、サンプル１２中にアクセプター分子１８を添加しない条件でドナー分子１６の蛍光寿命を測定することにより、τｍａｘを測定することができる。
このように、τｍｉｎとτｍａｘの値は、測定により求めることができる。
【００５５】
上記式（１４）、式（１５）より、サンプル１２中のドナー分子１６の励起電子数Ｎ（ｓ）は、下記式（１６）で表される。
【数１４】
式（１６）の括弧で示される部分がドナー分子１６の蛍光寿命に関係するため、式（１６）の括弧で示される部分をＴと定義して整理すると、下記式（１７）が得られる。
【数１５】
【００５６】
ここで、上記式（１７）のｓにｊωを代入して整理すると、下記式（１８）が得られる。
【数１６】
ここで、θ１、θ２は、下記式（１９）、式（２０）で表される。
【数１７】
ここで、ωはレーザ光を変調する変調信号の角周波数である。また、θ１−θ２は、ドナー分子１６の蛍光信号とレーザ光を変調する変調信号との位相差である。
【００５７】
ドナー分子１６の蛍光信号とレーザ光を変調する変調信号との位相差、および、変調信号の角周波数より、ドナー分子１６の蛍光寿命τは、下記式（２１）により求められる。
【数１８】
ここで、上記式（１９）、式（２１）よりθ１を消去すると、下記式（２２）が得られる。
【数１９】
【００５８】
上記式（２２）をκＦＲＥＴについて解くと、下記式（２３）が得られる。
【数２０】
上記式（２３）により、ドナー分子１６の蛍光寿命τから結合比率κＦＲＥＴを求めることができる。なお、上述したように、τｍｉｎ、τｍａｘの値は、別途測定により求めることができる。式（２３）により求められた結合比率κＦＲＥＴを用いて、後述するように結合定数Ｋｄを求めることができる。
【００５９】
（ＦＲＥＴ測定方法）
次に、図７、図８、図９を参照して、本発明のＦＲＥＴ測定方法について説明する。図７は、本発明のＦＲＥＴ測定方法の一例を示すフローチャートである。図８は、全リガンド濃度［Ｌ０］に対するドナー分子１６の蛍光寿命τの測定結果の一例を示す図である。図９は、全リガンド濃度［Ｌ０］に対する結合比率κＦＲＥＴの測定結果の一例を示す図である。
【００６０】
まず、フローサイトメータ１０がサンプル１２の結合条件を設定する（ステップＳ１０１）。例えば、サンプル１２に添加される全リガンド濃度［Ｌ０］を調整することにより、サンプル１２の結合条件が設定される。
次に、強度が時間変調されたレーザ光を、レーザ光源部３０がサンプル１２に照射する（ステップＳ１０２）。次に、計測部５０が、測定点にてレーザ光を照射されたサンプル１２が発する蛍光を受光する（ステップＳ１０３）。
【００６１】
次に、蛍光寿命算出ユニット１５８が、計測部５０で計測された蛍光信号を用いて、ドナー分子１６の蛍光寿命を算出する（ステップＳ１０４）。具体的には、蛍光信号と変調信号との位相差（θ１−θ２）から、上述した式（２１）に基づいて、蛍光寿命算出ユニット１５８がドナー分子１６の蛍光寿命を算出する。ステップＳ１０４により、図８に示される１つの測定結果が得られる。
【００６２】
次に、結合比率算出ユニット１６０が、蛍光寿命算出ユニット１５８で算出された蛍光寿命τを用いて、結合比率κＦＲＥＴを算出する（ステップＳ１０５）。具体的には、蛍光寿命算出ユニット１５８で算出された蛍光寿命τを用いて、上述した式（２３）に基づいて、結合比率算出ユニット１６０が結合比率κＦＲＥＴを算出する。調整した［Ｌ０］に応じて、結合比率κＦＲＥＴが得られる。したがって、ステップＳ１０５により、図９に示される１つの測定結果が得られる。
【００６３】
次に、二変数最小二乗法を用いてフィッティングするために必要となる所定数の測定データが得られたか否かを、判定部１６４が判定する（ステップＳ１０６）。解離定数算出ユニット１６２が二変数最小二乗法を用いてフィッティングするために、例えば、１０〜１５点程度の測定データが得られていることが好ましい。得られた測定データの数（測定数）が所定数よりも少ないと判定部１６４が判定した場合、所定数の測定データが得られるまで、上述したステップＳ１０１〜Ｓ１０５を繰り返す。
【００６４】
所定数の測定データが得られ、測定数が所定数に等しいと判定部１６４が判定した場合、解離定数算出ユニット１６２が、レセプターＲとリガンドＬとの結合の度合いを示す解離定数Ｋｄを算出する。具体的には、全レセプター濃度［Ｒ０］と解離定数Ｋｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、解離定数算出ユニット１６２が上述した式（８）を、結合比率κＦＲＥＴ、全リガンド濃度［Ｌ０］にフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄが求められる。
【００６５】
以上説明したように、本発明によれば、最小二乗法を用いて、サンプル１２中の全レセプター濃度［Ｒ０］と解離定数Ｋｄとを変数とする関数を、結合比率κＦＲＥＴ、全リガンド濃度［Ｌ０］にフィッティングすることにより、解離定数Ｋｄが求められる。そのため、本発明によれば、解離定数Ｋｄの大きさによらず、解離定数Ｋｄを精度よく測定することができる。
【００６６】
なお、上述した実施形態では、図２を参照して説明したように、レセプターＲにドナー分子１６とアクセプター分子１８が結合している場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、レセプターＲにドナー分子１６が結合しており、リガンドＬにアクセプター分子１８が結合している場合にも、本発明を適用することができる。
【００６７】
以上、本発明のＦＲＥＴ測定方法、及び、ＦＲＥＴ測定装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。また、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００６８】
１０ フローサイトメータ
１２ サンプル
１６ ドナー分子
１８ アクセプター分子
２０ 管路
２２ 回収容器
３０ レーザ光源部
４０，５０ 計測部
５１ レンズ系
５２ ダイクロイックミラー
５３，５４ バンドパスフィルター
５５，５６ 光電変換器
１００ 制御・処理部
１１０ 信号生成部
１１２ 発振器
１１４ パワースプリッタ
１１６，１１８ 増幅器
１２０ 信号処理部
１２２，１２４ 増幅器
１２６ 位相差検出器
１３０ コントローラ
１３２ ローパスフィルタ
１３４ 増幅器
１３６ Ａ／Ｄ変換器
１３８ システム制御器
１５０ 分析装置
１５２ ＣＰＵ
１５４ メモリ
１５６ 入出力ポート
１５８ 蛍光寿命算出ユニット
１６０ 結合比率算出ユニット
１６２ 解離定数算出ユニット
１６４ 判定部
２００ ディスプレイ
Ｒ レセプター
Ｌ リガンド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定方法であって、
強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射する照射ステップと、
前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測ステップと、
前記計測ステップで計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出ステップと、
前記蛍光寿命算出ステップで算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出ステップと、
前記結合比率が異なるように、前記測定サンプルの結合条件を設定する結合条件設定ステップと、
前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出ステップと、を有し、
前記解離定数算出ステップは、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率算出ステップで算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とするＦＲＥＴ測定方法。
【請求項２】
前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、
前記解離定数算出ステップは、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求める、請求項１に記載のＦＲＥＴ測定方法。
【数１】
【請求項３】
前記蛍光寿命算出ステップは、前記計測ステップで計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する、請求項１又は２に記載のＦＲＥＴ測定方法。
【請求項４】
前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、
前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定する、請求項１乃至３のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定方法。
【請求項５】
前記レセプターには、第１分子が結合しており、
前記リガンドには、第２分子が結合しており、
前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定する、請求項１乃至３のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定方法。
【請求項６】
レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定装置であって、
強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射するレーザ光源部と、
前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測部と、
前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出部と、
前記蛍光寿命算出部で算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出部と、
前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出部と、を備え、
前記解離定数算出部は、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率が異なる複数の結合条件において前記結合比率算出部で算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とするＦＲＥＴ測定装置。
【請求項７】
前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、
前記解離定数算出部は、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求める、請求項６に記載のＦＲＥＴ測定装置。
【数２】
【請求項８】
前記蛍光寿命算出部は、前記計測部で計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する、請求項６又は７に記載のＦＲＥＴ測定装置。
【請求項９】
前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、
前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求める、請求項６乃至８のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定装置。
【請求項１０】
前記レセプターには、第１分子が結合しており、
前記リガンドには、第２分子が結合しており、
前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求める、請求項６乃至８のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定装置。
【請求項１】
レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定方法であって、
強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射する照射ステップと、
前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測ステップと、
前記計測ステップで計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出ステップと、
前記蛍光寿命算出ステップで算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出ステップと、
前記結合比率が異なるように、前記測定サンプルの結合条件を設定する結合条件設定ステップと、
前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出ステップと、を有し、
前記解離定数算出ステップは、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率算出ステップで算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とするＦＲＥＴ測定方法。
【請求項２】
前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、
前記解離定数算出ステップは、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求める、請求項１に記載のＦＲＥＴ測定方法。
【数１】
【請求項３】
前記蛍光寿命算出ステップは、前記計測ステップで計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する、請求項１又は２に記載のＦＲＥＴ測定方法。
【請求項４】
前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、
前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定する、請求項１乃至３のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定方法。
【請求項５】
前記レセプターには、第１分子が結合しており、
前記リガンドには、第２分子が結合しており、
前記結合条件設定ステップは、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより、前記結合比率が異なるように前記サンプルの結合条件を設定する、請求項１乃至３のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定方法。
【請求項６】
レセプターとリガンドが結合し、第１分子及び第２分子が設けられた測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定装置であって、
強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射するレーザ光源部と、
前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測部と、
前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出部と、
前記蛍光寿命算出部で算出された前記蛍光寿命を用いて、前記測定サンプルに含まれる前記レセプターのうちＦＲＥＴが発生しているレセプターの比率である結合比率を算出する結合比率算出部と、
前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出部と、を備え、
前記解離定数算出部は、最小二乗法を用いて、前記測定サンプル中の前記レセプターの全濃度と前記解離定数とを変数とする関数を、前記結合比率が異なる複数の結合条件において前記結合比率算出部で算出された前記結合比率にフィッティングすることにより、前記解離定数を求めることを特徴とするＦＲＥＴ測定装置。
【請求項７】
前記結合比率をκＦＲＥＴ、前記測定サンプル中に含まれる前記レセプターの全濃度を［Ｒ０］、前記測定サンプル中に含まれる前記リガンドの全濃度を［Ｌ０］、前記解離定数をＫｄとすると、
前記解離定数算出部は、［Ｒ０］とＫｄとを変数とする二変数最小二乗法を用いて、下記式を、κＦＲＥＴと［Ｌ０］とにフィッティングすることにより、前記解離定数Ｋｄを求める、請求項６に記載のＦＲＥＴ測定装置。
【数２】
【請求項８】
前記蛍光寿命算出部は、前記計測部で計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する、請求項６又は７に記載のＦＲＥＴ測定装置。
【請求項９】
前記レセプターには、第１分子と第２分子が結合しており、
前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求める、請求項６乃至８のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定装置。
【請求項１０】
前記レセプターには、第１分子が結合しており、
前記リガンドには、第２分子が結合しており、
前記解離定数算出部は、前記測定サンプルに前記リガンドを添加することにより前記結合比率を異ならせた複数の結合条件において、前記結合比率算出部で算出された前記結合比率をフィッティングすることにより、前記解離定数を求める、請求項６乃至８のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−２３７３４２（Ｐ２０１１−２３７３４２Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１０３８３（Ｐ２０１０−１１０３８３）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]