ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦがノックアウトされた遺伝子導入マウス−血友病Ａモデル
本発明は、概して、内因性第ＶＩＩＩ因子および内因性フォンヴィレブランド因子を欠失する血友病Ａの遺伝子導入非ヒト動物モデル、ならびに外因性ヒトＶＷＦの投与により、遺伝性もしくは後天性の血友病Ａまたはフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）を治療するための方法に関する。本発明により、例えば、機能的な内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子欠損および機能的な内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子欠損を有するゲノムを有する、遺伝子導入非ヒト動物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年８月４日に出願された米国特許仮出願第６１／２３１，２３０号の優先権の利益を主張し、参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して、血友病Ａ等の血液凝固障害の研究に有用な、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）を欠損する遺伝子導入非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固は、とりわけフィブリノゲン、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子の成分の一連の連続的な相互作用を含む複合過程である。それら１つの成分の損失、またはその機能性の阻害は、血液凝固の増加傾向または、一部の患者では生命を脅かす恐れがある凝固不能を引き起こす場合がある。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固へと導く反応の連鎖にある共同因子として作動する、血漿で築かれたタンパク質である。血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の量の欠乏は、遺伝性疾患で主に男性に影響を与える凝固障害血友病Ａをもたらす。血友病Ａはヒト血漿から抽出された、またはＤＮＡ組み換え技術を用いて製造された第ＶＩＩＩ因子の治療的調製で治療されている。そのような調製は出血症状に応えて、あるいは頻繁に、一定間隔でコントロール不可能である出血を防ぐために（予防法）投与される。
【０００５】
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、第ＶＩＩＩ因子と錯体を形成した血漿で循環する。第ＶＩＩＩ因子と錯体を形成したＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子タンパク質を安定させる、またはタンパク質分解から保護する。血小板凝集ではその機能に起因して、ＶＷＦは血液凝固にも直接的に干渉する。フォンヴィレブランド欠乏症（ＶＷＤ）（フォンヴィレブランド症候群としても知られている）は欠乏症あるいはＶＷＦの過剰発現に由来する。ＶＷＦの欠乏症は、ＶＷＦ共同因子が欠損した第ＶＩＩＩ因子の急速分解に起因する、血友病に似た病気をもたらす。
【０００６】
血友病Ａおよびフォンヴィレブランド症候群の療法の従来の方法は、第ＶＩＩＩ因子または血漿から回収された、もしくは組み換え源によって製造されたＶＷＦを使用し、そして精製された第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ、または第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体で患者を治療する多くの試みがある。
【０００７】
遺伝子導入動物技術は、非ヒト動物内のヒトタンパク質の特性を研究するただ一つの機会を提示する。組み換えＤＮＡおよび遺伝子工学技術は、内因性遺伝子の発現に干渉または導入する、そして目的配列または、とりわけインビボ分子の効果を研究し、そして分子に結合する薬剤を研究することを可能にしている受容動物内の遺伝子を発現することを可能にした。遺伝子導入マウスを製造する１つの方法は、新たに交尾した雌マウスからの受精卵の回収および、動物内の発現または卵の雄性前核の中の内因性遺伝子発現で干渉するための当該の遺伝子のＤＮＡのマイクロインジェクションが必要である。マイクロインジェクションを施された卵は、それから１日偽妊娠した育ての母の卵管内に植えつけ、出産に進ませる。例えば、非特許文献１，特許文献１および特許文献２を参照のこと。別の手順は当該遺伝子を導入された胚幹細胞を使用する。導入胚幹細胞はそれから、生殖細胞系を含む全組織形成に加わるマウス胚盤胞腔に注射されるので、それゆえ遺伝子導入子孫を生成する。同種組み換え技術と組み合わせたこの取り組みは、規制された方法で胚の胚幹細胞改造することの可能性を提供するので、それゆえ、規定のゲノムで遺伝子導入のマウスを生成する。例えば、非特許文献２、あるいは、非特許文献３、あるいは、非特許文献４を参照のこと。
【０００８】
遺伝子導入のマウスは、発現するため、または当該（ノックインマウス）タンパク質を過剰に発現する場合があり、もしくは当該（ノックアウトマウス）遺伝子を削除するために発生させる可能性がある。ヒトタンパク質分子を発現する遺伝子導入マウスは、インビボヒト分子の研究を考慮に入れる。例えば、非特許文献５は、遺伝子導入マウスが組み換えＦＶＩＩＩの活性を抑制するＦＶＩＩＩ抑制抗体の問題を回避するよう設計されている、修正されたヒトＦＶＩＩＩタンパク質（Ｂ−ドメイン欠損）を発現している、と記載する。ヒトＶＷＤと似た症状を示すＶＷＦノックアウトマウスは、ＶＷＦ欠乏症を治すためにマウスＶＷＦからなる遺伝子療法ベクターの投与を記載する、非特許文献６で開示された。
【０００９】
それゆえ、人間患者への研究なしにインビボヒト血液凝固因子活性の研究のための改良方法を発展する技術の必要性が存在する。さらにまた、血友病Ａのような血液凝固障害を有する患者に対する、外因性治療的タンパク質の投与の治療的効果を決定する技術の必要性が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，８７３，１９１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２９４，７５５号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗａｇｎｅｒｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３７６−６３８０（１９８１）
【非特許文献２】Ｂａｒｉｂａｕｌｔ ａｎｄ Ｋｅｍｌｅｒ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．６：４８１−９２，１９８９
【非特許文献３】Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｂ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：６０３−１３，２０００
【非特許文献４】Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ ａｎｄ Ｒａｄｆｏｒｄ．Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｔｈｅ ｎｅｗ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７５：２０８−１６，１９９７
【非特許文献５】Ｓｈｉら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：１９７４−８２，２００６
【非特許文献６】Ｐｅｒｇｏｌｉｚｚｉら，Ｂｌｏｏｄ．１０８：８６２−９，２００６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、インビボでの治療的養生法における効果の研究と、同様に外因性ヒト血液凝固因子の投与を用いてヒト血液凝固障害を治療する方法の発達に有益である遺伝子導入の非ヒト動物の提供による、血液凝固障害の治療に関連する当技術分野における１つ以上の必要性に取り組む。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、機能性が欠損しているゲノム、内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子、および内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子である機能性が欠損しているゲノムを有する遺伝子導入の非ヒト動物を提供する。一態様において、遺伝子導入動物は、ヒトＶＷＦをコード化しているヒト導入遺伝子ポリヌクレオチド配列から成るゲノムを有する。任意で、ポリヌクレオチド配列はプロモーターポリヌクレオチド配列と作動可能に連結され、および／または、ポリヌクレオチド配列はポリアデニル化ポリヌクレオチド配列から成る。様々な態様において動物は齧歯動物であり、特定の一態様において動物はマウスである。
【００１４】
本発明はまた、機能的な内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の欠損および機能的な内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子の欠損を有するゲノムを有する非ヒト遺伝子導入動物も提供し、このゲノムは、ヒトフォンヴィレブランド因子をコードするポリヌクレオチドを含み、このヒトＶＷＦは、ヒトＶＷＦの生理学的活性を有し、この遺伝子導入哺乳動物は、その遺伝子内に、転写制御ポリヌクレオチド配列、上述のヒトＶＷＦをコードするＤＮＡ、およびポリアデニル化シグナルを含む外因性導入遺伝子構築物を有し、転写制御ポリヌクレオチド配列、上述のヒトＶＷＦをコードするＤＮＡ、およびポリアデニル化シグナルは、ヒトＶＷＦまたはその断片の遺伝子導入動物中の産生を得るために、外因性遺伝子構築物内で作動可能に連結される。一態様において、転写制御ポリヌクレオチド配列は５’転写制御ポリヌクレオチド配列、３’転写制御ポリヌクレオチド配列、内部転写制御ポリヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。特定の態様において、５’制御配列は、任意選択でエンハンサー領域を含むプロモーターである。
【００１５】
提供される遺伝子導入の動物の様々な実施形態において、動物はヒト後天的血友病Ａの実験的モデルである。
【００１６】
さらに、先に述べたように治療有効量のヒトＶＷＦの動物への投与から成る内因性第ＶＩＩＩ因子および内因性ＶＷＦの欠乏した哺乳動物における、外因性ヒトフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の効果の評価、および臨床的読出しの改善が外因性ＶＷＦの治療的効果を示しているＶＷＦ活性の臨床的読出し測定のための方法が提供される。その方法のある態様において、ＶＷＦは腹腔内または皮下に投与される。他の態様において、ＶＷＦは５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇまでの範囲で投与される。さらに他の態様において、ＶＷＦ活性の臨床的読出しは血液組成、血小板凝集、血小板粘着および血小板活性化から構成される基より選ばれる。
【００１７】
本発明は、外因性多量体ヒトフォンヴィレブランド因子の血友病Ａの症状改善に効果的な量を、腹腔内または皮下に投与されることから成る血友病Ａを有する被験対象の治療のための方法を、さらになお提供する。一態様において、症状は出血性障害、自己免疫疾患、異常血小板凝集、異常血小板粘着および異常血小板活性化から構成される基から選ばれる。別の態様において、ＶＷＦは５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇまでの範囲で投与される。
【００１８】
前述で提供される方法の様々な実施形態において、ＶＷＦはヒト第ＶＩＩＩ因子と組み合わせて投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】２００ｒＶＷＦ／ｋｇ（図１Ａ）または４００ｒＶＷＦ／ｋｇ（図１Ｂ）の投与後のＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスの血漿における、組み換えＶＷＦ抗原のレベルを示す。
【図２】腹腔内に注射されたｒＶＷＦがＦＶＩＩＩｘＶＷＤマウスの血漿において高分子量マルチマーとして検出されたことを図示している低分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ａ）または高分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ｂ）を表す。
【図３】は、腹腔内に注射されたＶＷＦに由来する血漿がＦＶＩＩＩｘＶＷＤノックアウトマウスの血液循環において検出されたことを図示する。
【図４】腹腔内に注射されたＶＷＦに由来する血漿が、無傷マルチマーとして血液循環において保存されていることを示す。（Ａ）低分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（Ｂ）高分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５】ｒＶＷＦ：Ａｇが２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇおよび２００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの腹腔内注射後２４時間まで血漿において検出可能であることを示す。
【図６】ＦＶＩＩＩが２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇおよび２００ ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの腹腔内注射後９時間まで血漿において検出可能であったが、２４時間以降は検出可能でなかったことを示す。
【図７】ＦＶＩＩＩ（図７Ａ）およびｒＶＷＦ：Ａｇ（図７Ｂ）の、２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇおよび２００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの腹腔内注射後４８時間までの血中濃度を図示する。ＦＶＩＩＩおよびｒＶＷＦは、４６時間以降は血液循環において検出可能ではなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、血液凝固障害を治療するために有用な改善された方法および組成物の当技術分野における必要性に取り組む。本発明は、さらに、ヒト血液凝固障害の治療における治療的組成物の有効性に取り組むために、内因性血液凝固因子が欠損している、および血液凝固因子内因性の代わりにヒト凝固因子が発現しているいくつかの症例において遺伝子導入動物を提供する。
【００２１】
定義
他に定義済みである場合を除いて、本明細書で使用された全ての技術および化学用語は、この発明が属する当業者によって一般に理解された同様の意味を有する。下記の参考文献は本発明において使われた多くの用語の通常の定義と共に、当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ ｅｄ．１９９４）； ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）； ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）； ａｎｄ Ｈａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００２２】
各出版物、特許出願、特許、および他の本明細書に引用された参照文献は、本開示と矛盾しない範囲全体中の参照文献によって連携される。
【００２３】
この明細書および添付の請求項において使用された、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに指し示さない限り、複数形を含むということをここに留意する。
【００２４】
本明細書で使用される、以下の用語は、他を特定しない限りそれらに属する意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用される、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素のような「コード配列」または配列「コード化」生成物は、発現した際、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産出をもたらす、ヌクレオチド配列である。つまりヌクレオチド配列がポリペプチド、タンパク質または酵素に必要なアミノ酸配列をコードする。タンパク質に対するコード配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）および終始コドンを含む可能性がある。
【００２６】
本明細書で使用される「遺伝子」は、コードするＤＮＡ配列または、１つ以上のポリペプチド、タンパク質または酵素の全てまたは一部から成る、アミノ酸の特定配列に言及し、イントロン、および、例えば、その遺伝子が発現される下の条件に影響を及ぼすプロモーターまたはエンハンサー配列、５’−非翻訳領域または、３’−非翻訳領域のような調節ＤＮＡ配列を含む可能性または含まない可能性がある。構造遺伝子ではない、いくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへ書き直される可能性があるが、アミノ酸配列には変えられない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調整剤として、またはＤＮＡ転写の調整剤として機能する可能性がある。
【００２７】
本明細書で使用される、「導入遺伝子」は、別の有機体のゲノムに伝わる外因性遺伝子に言及する。ヒト導入遺伝子は、非ヒト哺乳動物に伝わるヒト遺伝子である。
【００２８】
本明細書で使用される「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼを細胞内に結び付ける、およびコード配列の転写を開始する能力があるＤＮＡ調節領域である。一態様において、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端に結び付けられ、上記背景で検出可能な水準で転写を開始するために必要な基節または要素の最小数を含むため、上流（５’方向）へおよぶ。関連した態様において、プロモーター配列内に、ＲＮＡポリメラーゼの結びつきに対して関与するドメインを結び付けるタンパク質（合意配列）と同様に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１と共に位置することにより、便利に定義される）が発見される。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む、他の発現制御配列と作動的に関係がある可能性がある。
【００２９】
一態様において、プロモーターは以前、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号、および第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０，１９８１）、ラウス肉腫ウイルス（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７，１９８０）の３’長い末端反復に含まれているプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２，１９８２）、あるいは酵母または他のＧＡＬ４プロモーターのような菌類からのプロモーター要素、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロムターゼ キナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、あるいは視床下部に活性がある（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８，１９８６）ゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域のような、神経または脳特有の発現を示す転写制御領域、胸腺リンパ球１．２「全神経の」プロモーター、および神経に活性があるシナプシスＩプロモーター（Ｈｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １６：６８５−６９９，１９９５）、を含み遺伝子発現を制御したがそれには限定されない。プロモーターが内因性血液凝固因子プロモーターであるということも熟慮される。当業者は、当技術分野において知られているいずれのプロモーターが有用であり、発現が望まれることにおけるその細胞形式が特殊なプロモーターの使用を決定することが出来るということを理解するであろう。
【００３０】
本明細書で使用されるコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡへコード配列を書き直し、同時にトランス−ＲＮＡを挿入され（それがイントロンを含有する場合は）そして、ｍＲＮＡについて言えば、コード配列によってコード化されたタンパク質へ翻訳された際、細胞における、「その制御下の」、「〜に作動可能に連結される」または「作動可能なように関連する」転写および翻訳制御配列である。
【００３１】
本明細書で使用される用語「発現する」および「発現」は、例えば、対応遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に含まれる細胞機能の活性化によりタンパク質を生産することといった遺伝子またはＤＮＡ配列が明白になる、許可または情報の原因に言及する。ＤＮＡ配列は、タンパク質のような「発現生産」を形成することにおいて、またはそれによって発現される。発現生産それ自身は、例えば、結果として生じるタンパク質が、「発現された」とも言われる可能性がある。発現生産は、様々な態様において、細胞内に、細胞外にまたは隠されたと見なされる。用語「細胞内の」は細胞の内側を意味する。用語「細胞外」は、膜貫通タンパク質のような細胞の外側を意味する。実体は、それが細胞外、どこかからまたは細胞内に有意な尺度を現わす場合、細胞によって「隠された」。
【００３２】
本明細書で使用される「導入」は、細胞への異質の核酸の導入に言及する。用語「形質転換」は、「異質」の（つまり外因性、異種、外部のまたは細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列における胚幹（ＥＳ）細胞または前核の導入に言及し、細胞が、遺伝子導入の動物における目的の実体を生産するための遺伝子または配列を取り込む発現を出来るようにする。
【００３３】
本明細書で使用される用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、異質の遺伝子）が、宿主を変形し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を推進するために宿主細胞へ導入されることによる媒体に言及する。用語「ベクター」は本明細書では、用語「プラスミド」と相互に変化して使われた。
【００３４】
本明細書で使用される「選択可能なマーカー」は、マーカーの発現または活性が、（例えば、無制限だが、ネオ遺伝子のような陽性マーカー）のために選ばれた、または（例えば、無制限で、ジフテリア遺伝子のような陰性マーカー）に対して選ばれたというような薬物、抗生物質または他の薬剤に抵抗するような識別可能な表現型の変化が発現された細胞または有機体を与える酵素または他のタンパク質の遺伝子コード化に言及する。異種選択可能なマーカーは、通常見つけられるであろう動物のゲノムへ挿入されるという選択可能なマーカー遺伝子に言及する。
【００３５】
選択可能なマーカーの例は、ネオマイシン（ｎｅｏ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）、ジフテリア毒素、ホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ、キサンチン誘導ホスホリボシル トランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼのような抗生物質耐性遺伝子を含むがそれに限定されない。当業者は、その方法において有用であると知られている技術のいずれの選択可能なマーカーを理解すると考えられる。
【００３６】
本明細書で使用される「異種」は、それ自身において自然に生じず、および／または、非自然環境において発見される要素の組み合わせに言及する。例えば、異種ＤＮＡは、ＤＮＡが細胞において、または細胞の染色体部位おいて、自然に位置しないことに言及する。それは細胞を含む異種ＤＮＡを考慮する。異種発現調節要素は、自然中と作動的に関連するよりも異質遺伝子と作動的に関連するこのような要素である。
【００３７】
本明細書で使用される用語「同種」は、上科からのタンパク質（例えば、上科免疫グロブリン）を含む「共通の環境起源」を保有するタンパク質および異種（例えば、ミオシン軽鎖等）からの同種タンパク質間の関係に言及する（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５０：６６７，１９８７）。そのようなタンパク質（およびそれらのコード化遺伝子）は、類似率または保存タンパク質で特異残基またはモチーフの存在に関してどうであろうと、それらの類似配列の反映として同族配列を有する。
【００３８】
対照用に配列の最適アラインメントが、例えば無制限で、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局部同族アルゴリズムによって、あるいはＮｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の同族調整アルゴリズムによって、あるいはＰｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８の類似方法の探究によって、あるいはこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の電子化実施によって、または外観検査（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ、を参照のこと）によって、実施された。アルゴリズムの別例は、配列識別割合およびの究明に適しており、配列類似がＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０において記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である。配列識別割合の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７，１９９３、を参照のこと）間の類似の統計分析も実行する。
【００３９】
本明細書で使用される「内因性」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド宿主有機体において自然に発現された他の化合物に言及し、また細胞内部、組織または有機体に由来する。「外因性」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは他の細胞外部、組織または有機体に由来する化合物に言及する。
【００４０】
本明細書で使用される「ポリペプチド」は、ペプチド結合を経由して結合されたアミノ酸残基から成るポリマーに言及する。合成ポリペプチドは、一態様において、自動ポリペプチド合成器を使用して、合成される。用語「タンパク質」は、概して拡大ポリペプチドに言及する。用語「ペプチド」は概して短ポリペプチドに言及する。
【００４１】
本明細書で使用される、ポリペプチドの「断片」は、ポリペプチドのいずれの部分も、実物大のポリペプチドまたはタンパク質発現産物より小さいことに言及する。断片は概して、アミノ末端、および／または、実物大のポリペプチドのカルボキシ末端から除去された１つ以上のアミノ酸残基における実物大のポリペプチドの削除類似体である。従って、「断片」は以下に記載された削除類似体の小集団である。
【００４２】
本明細書で使用される「類似体」は、たとえ、異なる程度の場合、自然発生分子の場合であっても、実質的に類似した構造で同様の生物活性を有するポリペプチドに言及する。類似体は、その類似体から生成された自然発生ポリペプチドに比べてそれらのアミノ酸配列の組成物が異なり、以下を含む１つ以上の変異に基づく、（ｉ）１つ以上のポリペプチドの末端、および／または、自然発生ポリペプチド配列のより内部領域での１つ以上のアミノ酸残基の削除、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端（概して、「追加」類似体）、および／または、１つ以上の自然発生ポリペプチド配列の内部領域（概して、「挿入」類似体）、での１つ以上のアミノ酸の挿入または追加、あるいは（ｉｉｉ）自然発生ポリペプチド配列における他のアミノ酸のための１つ以上のアミノ酸の置換。置換は、物理化学または、置き換えられていて、そのアミノ酸がそれを置き換えるというアミノ酸の機能的同系性に基づく保存または非保存である。本明細書で留意すべきは、自然発生するアミノ酸配列の１つまたは両末端で、１つ以上のアミノ酸残基において、削除類似体が断片を含み取り除かる。また、追加類似体は、全てまたは部分的に別なタンパク質またはポリペプチド配列において、融合タンパク質を含む、自然発生のアミノ酸配列の１つまたは両方の末端へ加えられる。
【００４３】
本明細書で使用される「対立遺伝子多型」は、同様の遺伝子座を占領している遺伝子の２つ以上のいずれかの多形相に言及する。対立遺伝子の変化は、変異体を通じて自然に起こり、また個体群内の表現型多型をもたらす可能性がある。一態様において、遺伝子変異体は寡黙（コード化されたポリペプチドにおいて、変化しない）または、変貌したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性がある。「対立遺伝子多型」は、それらによってコード化されたタンパク質と同様に、対立遺伝子多型遺伝子のｍＲＮＡ転写物から生成されたｃＤＮＡｓにも言及する。
【００４４】
本明細書で使用される「変異体」は、ポリペプチド、タンパク質または通常分子の部分ではない追加的化学部分を含有するために修正された類似体に言及する。そのような部分は、様々な態様において、分子の溶解度、吸収、および／または生物学的半減期を調節する。他の様々な態様におけるその部分は、分子の毒性を選択的に減少し、分子等のいかなる望ましくない副作用をも、削除するまたは衰えさせる。そのような効果を仲介出来る部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）において開示さる。そのような部分を分子に連結するための手順は、その技術において周知されている。例えば、変異体は、長半減期インビボをタンパク質へ与える化学一時的変異を有する血液凝固因子である可能性がある。一実施形態において、ポリペプチドは、その技術において知られている水溶性のポリマーを追加することで修正される。関連する実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／または、ポリシアル化によって修正される。
【００４５】
本明細書で使用される「検出可能な部分」または「標識」は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の手段によって検出可能な組成物に言及する。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光性染料、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、一般に使用されるものとして、ＥＬＩＳＡ）、ビオチンストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテンおよび、抗血清もしくは単クローン性抗体を入手するためのタンパク質、または対象に補完的配列である核酸分子を含む。検出可能な部分は、サンプルにおける化合した検出可能な部分量をかつて計った放射性、発色性または蛍光性シグナルのような測定可能なシグナルをしばしば発生する。
【００４６】
血液凝固因子
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、哺乳動物の肝臓内に大量生産された分子、約２６０ｋＤａの血漿糖タンパク質である。それは血液凝固を導くという凝固反応の連鎖に重要な成分である。この連鎖内において、ＦＶＩＩＩと連結して、第Ｘ因子を第Ｘａ因子である活性形状へ変換する第ＩＸａ因子が存在する段階である。ＦＶＩＩＩはこの段階で共同因子として作動し、カルシウムイオンおよび第ＩＸａ因子の活性に対するリン脂質とともに要求される。２つの最も共通の血友病障害は、機能的な欠乏症ＦＶＩＩＩ（血友病Ａ、全ての症状の約８０％）または機能的第ＩＸａ因子（血友病Ｂまたはクリスマス因子病）によって生じる。
【００４７】
近年までは、血友病Ａの治療基準は、ヒト臓器提供者の血漿から生成されたＦＶＩＩＩ濃縮物の調製の頻繁な注入を含んでいた。この補充療法は一般に有効であるが、一方で、そのような治療は、肝炎およびエイズのような、ウイルス伝染性の病の危険がある状態に患者を置く。この危険性は、単クローン抗体を使用した免疫精製により血漿からＦＶＩＩＩのさらなる精製により減少しているが、有機的な溶媒または熱のどちらか一方との治療による不活化ウイルスにより、そのような調製は、危険性なしではない治療の費用を大いに増加した。これらの理由により、患者は予防的というよりはむしろ、偶発的に取り扱われてきた。
【００４８】
血友病Ａの治療における重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩのｃＤＮＡクローンコード化完全な２，３５１アミノ酸配列の単離（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０（１９８４）および、米国特許第４，７５７，００６号、１９８８月７月１２日、を参照）あるいはヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列およびその製品のための組み換え方法の提供である。しかしながら、組み換えＦＶＩＩＩを受けている患者は、病の治療を妨げるＦＶＩＩＩ特異的抗体を、まだ発現する可能性がある。血友病の治療のための第ＶＩＩＩ因子製品は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（抗血友病因子（組み換え）、血漿／アルブミンなしの方法、ｒＡＨＦ−ＰＦＭ）、組み換え抗血友病因子（ＢＩＯＣＬＡＴＥ（登録商標）ＧＥＮＡＲＣ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標））、あるいはＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の精製調製、抗血友病因子／フォンヴィレブランド因子合成物（ヒト）ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）およびＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、抗血友病因子／フォンヴィレブランド因子合成物（ヒト）、あるいはＨＹＡＴＥ Ｃ（登録商標）、精製ブタ第ＶＩＩＩ因子、を含むが限定はされない。
【００４９】
フォンヴィレブランド因子は、１×１０６から２０×１０６ダルトンの分子量のマルチマーを形状系の血漿において存在する。ＶＷＦは、哺乳動物の内皮細胞において主に形成され、その後血液循環内へ分泌される糖タンパク質である。この連結において、およそ２２０ｋＤの分子量を有するポリペプチド鎖を根幹として、５５０ｋＤの分子量を有するＶＷＦ二量体が、いくつかの硫黄結合の形成により細胞に生産される。さらに、分子量の増加を伴うＶＷＦのポリマーは、最大２０百万ダルトンまでで、連結によるＶＷＦ二量体から形成される。特殊な高分子ＶＷＦマルチマーが、血液凝固において非常に重要だと推定される。
【００５０】
ＶＷＦ症候群は、ＶＷＦの生産不足または過剰生産のどちらか、またはＶＷＦ（後天的なＶＷＤ）への抑制抗体を伴う自己免疫疾患の際は、臨床的に明らかにする。ＶＷＦの過剰生産は血栓症（血塊の形成または血管内の血栓、血流の閉塞性）を減少し、一方でＶＷＦの高分子形状水準の減少または欠損が出血の増加を引き起こし、血小板凝集の阻害および創縫合に起因する出血時間を増加する。
【００５１】
ＶＷＦ欠乏症は、ＶＷＦが機能的第ＶＩＩＩ因子の必須成分とされて以来、表現型血友病Ａも引き起こす可能性がある。これらの事例において、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血液凝固連鎖におけるその機能が正常に機能しないような限度に減少された。フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）またはＶＷＦ症候群に悩む患者は、欠乏症第ＶＩＩＩ因子を頻繁に示す。これらの患者において、減少された第ＶＩＩＩ因子活性は、Ｘ染色体の遺伝子の欠陥の結果ではないが、血漿におけるＶＷＦの 定量的および質的変化の間接的な結果である。血友病ＡおよびＶＷＤの間の分化は通常、ＶＷＦ抗原の測定またはリストセチン共同因子活性の決定により影響を及ぼされる可能性がある。ＶＷＦ抗原内容物およびリストセチン 共同因子活性の両方は、血友病Ａ患者においてそれらは通常であるのに対して、ほとんどのＶＷＤ患者において低下させられる。ＶＷＦ症候群の治療に対するＶＷＦ製品は、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐあるいは、血漿から濃縮されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦから成る療法であるＩＭＭＵＮＡＴＥ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＩＮＮＯＢＲＡＮＤ（登録商標）および、８Ｙ（登録商標）、を含むが限定されない。
【００５２】
付加的な血液因子は、無制限に第ＩＩ因子（トロンビンとしても当技術分野において知られている）（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００４９７）を含む発明の方法で使用するために修正可能で、血栓症およびプロントロンビン欠乏症を引き起こすような欠損症つまり、出血性素因または活性タンパク質Ｃ抵抗として知られている血栓性素因形状を引き起こす欠損症の第Ｖ因子（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００１２１）、ローザンタールの（症候群（血友病Ｃ）の欠損症を引き起こす第ＸＩ因子（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００１１９）、あるいは第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００１２０）およびサブユニットＢ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿００１９８５）、タイプＩ（欠乏症（ＡおよびＢ両サブユニットにおける欠乏症）あるいはタイプＩＩ（欠乏症（唯一Ａサブユニットにおける欠乏症）を特徴とする欠損症、生涯出血傾向をもたらすどちらか、欠陥品創傷治療、および習慣流産第ＸＩＩ因子（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００４９６）、あるいはタンパク質Ｃ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００３０３）、あるいは抗トロンビンＩＩＩ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００４７９）またはそれ自身の活性形状である。
【００５３】
ヒト血液凝固因子の断片、変異体および類似体
血液凝固障害の治療におけるヒト血液凝固因子タンパク質の治療的効果を評価するため、ヒト血液凝固因子ポリペプチドまたは断片の変異体もしくはその類似体は、前述された遺伝子導入のマウスへ投与される。
【００５４】
ポリペプチド断片、変異体または類似体を用意するための方法は、当技術分野において周知されている。ポリペプチドの断片は、酵素的切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン）を無制限に含み、さらに特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を生成するための組み換え手段を用いて用意される。目的の断片をコード化しているポリヌクレオチドを用い、ポリペプチド断片は、リガンド結合ドメイン、ドメインを結びつけている受容体、二重化もしくは多量体化ドメイン、または当技術分野において知られているいずれか他の識別可能なドメインのように、特定の活性を有するタンパク質の領域から成り生成される可能性がある。
【００５５】
ポリペプチド類似体の作成方法は、さらに周知されている。ポリペプチドのアミノ酸配列類似体は、置換、挿入または削除変異体である。ポリペプチドの断片を含む削除類似体は、機能または免疫活性にとって不可欠ではない天然タンパク質の１つ以上の残留物が欠損する。挿入類似体は、ポリペプチドにおいて非ターミナルポイントで原料の添加を含む。これは免疫反応性エピトープまたは単なる単体残留物の挿入を含む可能性がある。
【００５６】
類似体は、派生されるおよびここに記述される血液凝固因子と実質的に同種または実質的に同質である可能性がある。熟慮された類似体は、少なくともいくつかの野生型ポリペプチドの生物活性、例えば、血液凝固活性、を維持するそれらである。
【００５７】
置換類似体は、一般的に１つの野生型のアミノ酸と別のタンパク質内の１つ以上の部位を交換し、ここに記述されるように、他の機能または性質の損失なしに１つ以上のポリペプチドの性質を調節するよう作られる場合がある。一態様において、置換は保守的な置換である。「保守的なアミノ酸置換」とは、類似する化学的特性の側鎖を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換を意味する。保守的な置換を作成するための類似するアミノ酸は、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）、疎水性、脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）、芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、小型側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）、もしくは脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）を有するそれらを含む。
【００５８】
断片および類似体をコード化しているポリヌクレオチドは、自然発生分子に同一または類似する生物活性を所有する自然発生分子の、生物学的に活発な断片、変異体、または類似体をコードする当業者により、ただちに生成される可能性がある。これはＰＣＲ技法、分子をコード化しているＤＮＡの消化などにより行うことが出来る。従って、当業者は、ＤＮＡらせん構造における変化したコドンおよびミスセンス変異をもたらすため、単体の塩基の変化を生成することが出来る。
【００５９】
代表的な血液凝固因子類似体は、例えば、米国特許第６，３４６，５１３号、米国特許第６，３１６，２２６号、米国特許第６，１５６，８８８号、米国特許第６，１３０，２０３号、および米国特許第６，９５８，３２２号においてこれらを参照することにより本書に組み込まれ、記述された。
【００６０】
熟慮されたヒト血液凝固因子変異体は、ユビキチン化、グリコシル化、治療的であるための結合または診断薬のような技法によって、化学的に修正されたポリペプチド、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素と共に）、ペグ化（ポリエチレングリコールとの誘導体化）等の共有結合性のポリマー付属品、非加水分解結合の導入、および通常ヒトタンパク質に発生しないオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換を含む。変異体は、本発明の非修正分子の結合性質を保有する。
【００６１】
ペグ化血液凝固因子類似体の用意は、一般的にポリペプチドがポリエチレングリコール（反応性エステルまたはＰＥＧのアルデヒド誘導体、等）と、結合構造ポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に付着するようになる状況下で反応している（ａ）、および、反応性生物（ｓ）を得ている（ｂ）の段階から成る。概して、アシル化反応のための最適な反応条件は既知のパラメータおよび目的の結果に基づき決定される。例えば、ＰＥＧタンパク質の比率が大きくなるほど、ポリ−ペグ化生成物の割合が高くなる。同一の実施形態において、結合構造はＮ−末端に単体ＰＥＧ部分を有することになる。
【００６２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、長い半減期インビボを提供するため、血液凝固因子に付着される可能性がある。ＰＥＧ基は、いずれの都合の良い分子量のものになる可能性があり、線状または分岐する可能性がある。ＰＥＧの平均分子量は、約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤａまで、約５ｋＤａから約５０ｋＤａまでの範囲、または約５ｋＤａから約１０ｋＤａまでにおよぶ。ＰＥＧ基は、アシル化または還元的なアルキル化を介し、自然または改変反応基を通し、ＰＥＧ部分（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）上で、血液凝固因子（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）上の反応基へ、もしくはいずれかの当技術分野において知られている他の技法により、血液凝固因子へ付着される。
【００６３】
本発明の方法において有効であるポリペプチド変異体は、ポリシアル酸（ＰＳＡ）部分から成るポリペプチドを含む。ポリシアル酸ポリペプチドを用意するための方法は、米国特許公開２００６０１６０９４８およびＳａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：４２−５１、２００６において記載される。
【００６４】
本発明の方法における使用のためのヒト血液凝固因子は、ポリペプチドである第２物質で融合タンパク質を含むことは、さらになお熟慮される。一実施形態において、無制限のポリペプチドである第２物質は、酵素、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞−表面受容体、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、細胞粘着分子、もしくは断片、または前述されるタンパク質の活性ドメインである。関係のある実施形態において、第２物質は第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子およびフォンヴィレブランド因子のような血液凝固因子である。熟慮された融合タンパク質は、当技術分野において周知される化学または組み換え技法により作成される。
【００６５】
組み換えＶＷＦ
有用なｒＶＷＦの一形成は、少なくともインビボ−安定化の性質を有する、例えば、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子の結合、および、薬理学上許容可能であるグリコシル化パターンを随意的に有する結合。その具体例は、それによってタンパク質分解（Ｌａｎｋｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１００８−１０１３、１９９７）に耐性を示すＡ２ドメインなしに、糖タンパク質ｌｂ−結合ドメインおよびコラーゲンおよびヘパリン（Ｐｉｅｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：１３３９−１３４７、１９８９）のための結合部位を含むＶａｌ４４９からＡｓｎ７３０までのＶＷＦ断片およびＶＷＦを含む。少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を安定させるＶＷＦの能力の決定は、当技術分野で述べられる周知された方法によると、ＶＷＦ−欠乏哺乳動物において実施される。
【００６６】
本発明において有用であるｒＶＷＦは、当技術分野において知られているいずれかの方法により生成される場合がある。一具体例は１９８６年１０月２３日に公開されたＷＯ８６／０６０９６において開示され、産生組み換えＶＷＦの方法に関して１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願第０７／５５９，５０９号を参照することにより本書に組み込まれる。従って方法は当技術分野において、（ｉ）遺伝子工学による組み換えＤＮＡの産生、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅の経由、（ｉｉ）導入による原核または真核性細胞への組み換えＤＮＡの導入、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによる経由、（ｉｉｉ）上記変型細胞の培養、例えば持続的またはバッチ式様式における、（ｉｖ）発現ＶＷＦ、例えば構造的または誘導上で、および、（ｖ）孤立的上記ＶＷＦ、例えば培地からまたは変型細胞の収穫によるもの、（ｖｉ）精製ｒＶＷＦを得るために、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィー経由、として知られる。組み換えＶＷＦは、当技術分野において周知されている組み換えＤＮＡ技法を用いて、変型宿主細胞で作成されることがある。例として、ポリペプチドをコードする配列は適切な制限酵素を用いてＤＮＡから削除され得る。
【００６７】
あるいは、ＤＮＡ分子はアミド亜リン酸法のような化学合成技法を用いて合成される。さらに、これら技法の組み合わせは使用され得る。
【００６８】
投与のための血液凝固因子組成物
ここで記述される血液凝固因子ポリペプチド（断片、類似体または、変異体を含む）を被験対象へ投与するため、血液凝固因子ポリペプチドは１つ以上の薬学上許容可能な輸送体から成る組成物に調剤される。「薬学上または薬理学上許容可能」という表現は、下記に記述するように当技術分野において周知されている経路を用いて投与する際に、アレルギー、または他の拒絶反応を引き起こさない分子的実態および組成物に言及する。「薬学上許容可能な輸送体」は、いずれのおよび全ての臨床的有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌性および抗真菌性物質、等浸透圧ならびに物質が遅延する吸収およびそのようなものを含む。
【００６９】
その上、化合物は水または共通有機溶媒と反応して溶媒和物を生じる可能性がある。このような溶媒和物は同様に熟慮される。
【００７０】
血液凝固因子組成物は様々な態様において、経口的、局所的、経皮的、非経口的、吸入噴霧によるもの、経膣的、直腸的、または頭蓋的注射によって投与される。ここで使用されるように非経口な用語は、皮下注射、静脈、筋肉内、嚢内注射、または融合技法におけるものを含む。静脈、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射および／または特定の部位の外科的移植による投与は、よく熟慮される。通常、組成物は受容に有害となり得る他の不純物と同様に原則的にピロゲンが含まれない。
【００７１】
薬剤組成物の調合は、（例えば、溶液、乳剤）を選ばれた投与の経路によって変化するであろう。投与されるその組成物から成る適切な組成物は、生理的に許容可能な媒体または輸送体で用意される。適切な輸送体である溶液または乳剤として、例えば生理食塩水および緩衝媒体を含む、水性もしくはアルコール／水性溶液、乳剤または懸濁液を含む。非経口の媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油を含むことが出来る。静脈媒体は、様々な添加物、防腐剤、もしくは液体、栄養素または電解質補給を含むことが出来る。
【００７２】
活性成分として血液凝固因子から構成される本発明のその方法において有用である薬剤組成物は、様々な態様において、投与の経路によって薬学上許容可能輸送体または添加物を含む。このような輸送体または添加物の例は、水、薬剤的に許容可能な有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンゴム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学上許容可能な界面活性剤およびそのようなものを含む。使用された添加物は、本発明の投与形態によって適切なものとして上記またはその組み合わせから選ばれるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
種類豊富な水性輸送体、例えば、水、緩衝用水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、または水性懸濁液は、様々な態様において、水性懸濁液の製造に適している賦形剤で、混合剤において活性化合物を含む。このような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムの懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は自然発生リン脂質であることがある、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばポリオキシエチレンステアリン酸塩、またはエチレン酸化物と長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような脂肪酸およびヘキトールから誘導されたエチレン酸化物と部分的エステルとの縮合物、または脂肪酸およびヘキトール無水物から誘導されたエチレン酸化物と部分的エステルとの縮合物、例えばポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。水性懸濁液は、さらに１つ以上の防腐剤、例えばエチル、またはパラオキシ安息香酸であるｎ−プロピルを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、血液凝固因子組成物は保管のため凍結乾燥し使用するため適切な輸送体プライアーで再構成される。この技法は慣習の免疫グロブリンにおいて有効なであることが示された。いずれの当技術分野において知られている適切な凍結乾燥および再構成技法は採用される。当業者によって凍結乾燥および再構成が抗体活性の損失度の変化につながり、それらを相殺するため使用レベルを調整しなければならないようになると認められる。
【００７５】
水の添加による水性懸濁液の調製に適する分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の防腐剤との混合において活性化合物を生じる。適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤は、それら既に前述したものにより例示される。
【００７６】
ある実施形態において、これら調合における血液凝固因子の濃度には大きな差がある、例えば通常は約０．５％より少ない、または少なくとも約１％から１５または２０％と同程度まで重量で、また特定の選択される投与方法に従って液量、粘着性等に優先して基づき選択される。従って、例えば、無制限に、非経口の注射の代表的な薬剤組成物は、１ｍｌ滅菌緩衝用水、および５０ｍｇの血液凝固因子を含んで作られる。静脈注入のための代表的な組成物は、２５０ｍｌ滅菌リンゲル溶液、および１５０ｍｇ血液凝固因子を含んで作られることが出来る。非経口的投与可能な組成の用意における実際的方法は知れているまたは当業者に明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８０）においてより詳細に記載される。二重特異性抗体の効果的な投与量は、１回の投与、体重１ｋｇにつき０．０１ｍｇから１０００ｍｇの範囲内にある。
【００７７】
様々な態様において、薬剤組成物は、滅菌注射用溶液または分散の即時調製のため、滅菌注射用な水性、油性懸濁液、分散または滅菌粉末の形式である。懸濁液はそれら適切な分散剤または湿潤剤および前述された懸濁化剤を使用していると知られている当技術分野に従って調合される可能性がある。滅菌注射用調製は、さらに非毒性非経口的許容可能な希釈剤または溶媒における滅菌注射用溶液または懸濁液は、例えば１、３−溶液としてブタンジオールにある、という可能性がある。いくつかの実施形態において、輸送体は溶媒または分散の、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールのような）、適切なその混合物、植物油、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液、培地である。その上、滅菌、固定油は溶媒または懸濁化剤として従来的に採用される。この目的のため、いずれの無菌性の固定油は合成モノまたはジグリセリドを含んで採用される可能性がある。加えて、オレイン酸のような脂肪酸注射用の調製において使用することが出来る。
【００７８】
全ての場合において、形態は滅菌されなくてはならず、かつ容易に注射可能な存在である範囲になければならない。適した流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合において要求された粒径の維持により、および界面活性剤の使用によって、言及される。それは製造および保管の状況下で安定的でなければならなく、バクテリアおよび菌類のような微生物の活動の汚染に対し維持されなければならない。微生物の活動の防止は、様々な抗菌性および抗真菌性物質によってもたらされる、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど。多数の場合において、例えば糖または塩化ナトリウムといった等張剤を含むのが望ましい。ある態様において、注射用組成物の持続性吸収は吸収を遅延する物質の組成物における使用によってもたらされる、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン。
【００７９】
投与に有用な組成物は、それら有効性の増長のため摂取または吸収エンハンサーでの調合である可能性がある。このようなエンハンサーは、例えばサリチル酸塩、グリココール酸塩／リノール酸塩、グリコール酸塩、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプリン酸などを含む。例としてＦｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８５：１２８２−１２８５、１９９６）およびＯｌｉｙａｉならびにＳｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２：５２１−５４４、１９９３）を参照。
【００８０】
その上、このような均衡が欠損している他の組成物が実質上実用性にかける一方、インビトロおよび特にインビボの用途の両方に対するそれら実用性の増強し、組成物の親水性および疎水性の性質、もしくはその方法における使用を熟慮したため、この発明は均衡が取れたものである。具体的に、本発明における使用のため熟慮された組成物は、体内における吸収および生体利用効率を可能にする水性媒体での溶解の適した程度を有し、その一方で化合物が活動の推定部位に細胞膜を横切ることを可能とする脂質での溶解度の程度を有する。
【００８１】
組み換えＶＷＦの調合は共有のＰＣＴ／ＵＳ０８／８８２０１およびＰＣＴ／ＵＳ０８／０６２９１において開示され、これを参照することで本書に組み込まれる。
【００８２】
血液凝固因子ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの調製
タンパク質産生の発現のためのベクター構造の要素は、当業者で知られている。血液凝固因子ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、発現するよう作動的にヌクレオチド配列に関係している発現制御配列から成る組み換えポリヌクレオチドから成る発現ベクターにおいて発現する。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞もしくはインビトロ発現システムによって供給され得る。発現ベクターは、無制限のコスミッドを含んで全ての当業者を含み、プラスミド（例えば、剥き出しのまたはリポソームに含まれる）および組み換えポリヌクレオチドを合体するウイルスを含む。発現ベクターは、当技術分野において知られる技法を用いた形質転換または導入によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のため、（例えば、形質転換または形質導入を経由して）適切な宿主細胞に挿入される。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照。
【００８３】
形質転換は、有機体に従って、有機体の細胞およびその生態のもの特質上で種類豊富な知られている技法によって実施される。安定した形質転換は、細胞へのおよび細胞核へのＤＮＡ侵入を引き起こす。単体細胞（いくつかの哺乳動物を含む）より再生される有機体のため、形質転換はインビトロ培養において実施され、形質転換細胞の選択および形質転換細胞の再生が続く。ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への転送のためしばしば使用される方法は、マイクロインジェクション、パーティクルガン衝撃、陽イオン性脂質でのＤＮＡまたはＲＮＡ合体の形成、リポソームまたは他の輸送体原料、エレクトロポレーション、およびＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスベクターへの転入の組み込みを含む。他の技法は当技術分野において知られる。ＤＮＡの細胞核への転写は細胞過程によって起こり、細胞内のトランスポーゼースまたはリコンビナーゼによる上で作用する融合部位配列を含むことにより時には適切なベクターの選択によって促進し得る。（例として、［Ｃｒａｉｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８，２２：７７； Ｃｏｘ．Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，ｅｄｓ．） １９８８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐａｇｅｓ ４２９−４９３； Ｈｏｅｓｓ．Ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ｅｄｓ．） Ｖｏｌ．４，１９９０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ、ページ９９〜１０９を参照。
【００８４】
発現ベクターおよび核酸はいくつかの態様において血液凝固因子を発現するために使用され、組織特異的プロモーターを含む。このようなプロモーターは当技術分野おいて知られるおよびそれを含むが、肝臓特異的プロモーター（例えば、アルブミン； Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１：５１２４−３２，１９９７； α−ｆｅｔｏタンパク質）、筋特異的プロモーター（例えば、ミオシン軽鎖１（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：４０３−１０，１９９７，α−ａｃｔｉｎ）、膵臓特異的プロモーター（例えば、インスリンまたはグルカゴンプロモーター）、神経特異的プロモーター（例えば、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターまたは神経特異的エノラーゼプロモーター）、内皮細胞特異的プロモーター（例えば、フォンヴィレブランド因子；Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１４８３−９０，１９９６）および平滑筋細胞特異的プロモーター（例えば、２２ａ； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１００６−１４，１９９７）に限定されるものではない。他の組織特異的プロモーターは、ヒトアロマターゼシトクロムから派生される脂肪組織プロモーターであるチロシナーゼ特異的プロモーター（Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２：７８９−９５，１９９８）を含でいる、発展途上にある癌療法においてさらに使用されるプロモーターを含むｐ４５０（ｐ４５０ａｒｏｍ）（米国特許第５，４４６，１４３号；Ｍａｈｅｎｄｒｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９４６３ １９４７０，１９９３；ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：３１７ ３２４，１９９３）。プロモーターが内因性血液凝固因子プロモーターであることはさらになお熟慮される。本発明のその方法において有用であるベクターおよび他の核酸分子は、導入遺伝子の一時的な発現に限る配列をさらに含むことが出来る。例えばプロモーターにおいてｃＡＭＰ反応要素エンハンサーを含むおよびｃＡＭＰ修正剤で移入または感染細胞を処理することを含むことにより、例えば導入遺伝子は薬剤誘導プロモーターで制御される（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１８８３−９３，１９９６）。あるいは、リプレッサー要素は転写薬剤の存在における転写を防ぐことが出来る（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：３３３９−４３，１９９７）。発現の空間的な制御は、エルグ１遺伝子プロモーターとの結合においてイオン化放射（放射線治療）を使用することによりさらに達成されている（Ｓｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５５６１−５，１９９５）。
【００８５】
ヒト血液凝固因子をコード化している組み換え核酸構築物は、増幅のためいずれの適したプラスミド、バクテリオファージ、またはウイルス性のベクターへ挿入され、それによって、分子クローニング実習マニュアル，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）で記載されたそれらのように、当技術分野において知られている方法を用いて繁殖させる。一実施形態において、脊椎細胞のような真核性細胞と適合する発現ベクターは用いられる。真核性細胞発現ベクターは、当技術分野において周知され、商業的供給源から入手可能である。熟慮された発現ベクターは、原核配列（バクテリアにおけるベクターの伝播を促進するため）、および１つ以上の細胞における機能性である真核性転写単位の両方を含む。概して、このようなベクターは目的の組み換えＤＮＡ分子の挿入のため便利な制約部位を提供する。ベクターに派生したＰｃＤＮＡＩ、ｐＳＶ２、ｐＳＶＫ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＰＶＶ−１／ＰＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ番号３１２５５）は、非ヒト細胞の導入に適切な哺乳類発現ベクターの例である。いくつかのこれらベクターは、配列でｐＢＲ３２２のようなバクテリアプラスミドから、複製の促進もしくは原核および真核性細胞における薬剤抵抗選択へ修正される。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）のようなウイルスの誘導体、またはエプスタイン・バーウイルスウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）は、豚細胞におけるタンパク質の発現のため使用される。プラスミドの調整および宿主細胞の形質転換において採用される様々な方法は、当技術分野において周知さている。本発明において有用であるための他の適切な発現システムのため、通常の組み換え手順と同様に、分子クローニング実習マニュアル，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）を参照のこと。
【００８６】
レトロウイルスベクターからの効果的な発現は、ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーターのような「強力な」プロモーターが転写の制御に使用される際、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ ７：２６４，１９８９における再調査のように観測される。これらのプロモーターは、構成的でありおよび組織特異的発現を通常可能にしない。他の適切なプロモーターは、ここで詳述される。
【００８７】
パッケージング細胞株の使用は、産生した組み換えウイルスの有効性および伝染力を増大させる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５．Ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃを参照、またはＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：６６３あるいはＧｒｉｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．３：１６２，１９８７およびｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓを参照、例えばＬｅｍｉｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：９１７−９２７，１９８６； Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：１６５−１７０，１９８６を参照のこと。
【００８８】
以前の可能性より高いウイルスタイターの獲得を可能にする追加的なレトロウイルス技術は、同種指向性および両種性間のパッケージング細胞株の継続的な転写による増幅を含み、「ピンポン」方法と言われる、例えばＫｏｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３５００−３５０８，１９９０あるいは、例えばＢｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３１９：５８９−６００，１９８９を参照。その上、ウイルスタイターを増加させる技法は、効果的な形質導入を達成するために、ウイルス産生細胞株での直接的なインキュベーションよりむしろウイルスを含む上澄みの使用を可能とする、例えば、Ｂｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３１９：５８９−６００，１９８９を参照。通常のＤＮＡの複製はレトロウイルスベクターの宿主ゲノムへの統合に必要であるため、活発な循環である目的の幹細胞での頻度を増加させることが望ましい可能性がある。例えば、目的の細胞をインビトロでの治療による成長因子での分裂へ促すこと、例えば、Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：９１７−９２７，１９８６あるいは、Ｂｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：８８９７−８９０１，１９８９，ｏｒ ｔｏ ｅｘｐｏｓｅ ｔｈｅ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｔｏ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、あるいは、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４ Ｓｕｐｐｌ．１：４５７−４６３，１９８４を参照。
【００８９】
遺伝子導入動物調製
一般に、本発明の遺伝子導入動物は、ヒト以外の変形可能種をどれでも含有する。特に注目されるのは哺乳動物で、マウス、ネズミ、ラビット、ヒツジ、ハムスター、アレチネズミ、モルモットおよびブタ、あるいはウシおよび非ヒト霊長類を含む、形質転換方法として開発された他のような周知の変形可能な種を含む。
【００９０】
ある態様において、本発明の導入遺伝子動物は、複数の内因性血液凝固因子、特殊な因子ＶＩＩＩおよびフォンヴィレブランド因子の発現を防止するために、一般的に変更される。本発明の遺伝子導入動物は、少なくともある異質な遺伝子をゲノムに挿入され、例えば、ヒトＶＷＦが２重のノックアウトマウスＦＶＩＩＩ／ＶＷＦへ挿入され、一般的に修正された動物であるというさらなる意図がある。これらの動物は、系統的および他の研究システムで成功可能でない特殊な方法において、細胞水準での調節作業で研究されるおよび影響されることを許可する。
【００９１】
記載されている種類の遺伝子導入動物は、治療的血液凝固因子の投与でのインビボ効果を分析するために有用であり、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）を含むが限定されない。遺伝子導入動物は、推定耐性宿主免疫システムの関係において、抗自己抗体の発達の原因に対する、化合物、つまり精製された凝固タンパク質またはそれらの変異体、の効果を評価するための優れたモデルとして役目を果たす。そのような理解は、血液凝固障害の治療のための病因を考案および試験に必須であり、血友病、フォンヴィレブランド症候群および同類のものを含むがそれに限定されない。
【００９２】
本明細書で熟慮されたように、導入遺伝子発現ヒトポリヌクレオチド配列は、自然調節（発現調節）配列によりヒト血液凝固因子の側面に位置するため、または異種配列と関連するための、プロモーター、内部リボソーム参入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結束部位配列、エンハンサー、反応要素、化膿、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コード化領域あるいは同類のものを含むコード配列（例えば、ｃＤＮＡ、合成コード配列またはゲノムＤＮＡ）から成る。コード配列が、当技術分野において知られている多くの手段によって修正されることを意図している。そのような一時的変異の非制限例は、メチル化、「キャップス」、類似体を伴う自然発生のヌクレオチドの１つ以上の置換、あるいは、例えば、それらの非荷連鎖（例えば、メチルホスホン酸塩、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩、等）との、および荷電連鎖（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等）との、のようなヌクレオチド間の一時的変異を含む。遺伝子発現の制御は、当技術分野において周知の様々な手段によって完成された。導入遺伝子の発現は、周知の手段による、あるいは、一連の与えられた状況、例えば、与えられた化合物の存在、あるいは特定の実体、あるいは組織種類または温度のような環境条件においての変化に応答するという、概してプロモーターの選択による誘導または抑制を構成するまたは調節する。用語「誘導発現」は、宿主有機体のための利便性および妥当性に基づいて選択された手段および状況である定義された状況のもと起こる遺伝子発現を引き起こすためのいかなる手段におよぶ。
【００９３】
ある態様において、導入遺伝子は組み換えタンパク質の発現に対し前述されたプロモーターに関係すると熟慮される。
【００９４】
様々なＥＳ細胞が派生されるマウス系統の遺伝的背景は、亜系統１２９／Ｓｖおよび１２９／Ｓｖ−ＣＰ（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：８４２４−８，１９９３）の交配種からのマウス胚盤胞腔を起源とするマウス系統１２９：Ｒ１細胞を起源としているＥＳ細胞を含んだ当技術分野において知られており、ＧＳ１細胞は１２９／Ｓｖ／Ｅｖを起源とする。Ｄ３−細胞（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−８，１９８７）およびＪ１細胞は、１２９／Ｓｖまたは１２９／ｔｅｒＳｖを起源とする。さらにＥＳマウスを生じるＴＴ２細胞はＦ１交雑種（Ｃ５７ＢＬ／６ ｘ ＣＢＡ）を起源とする（Ｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：７０−６，１９９３）。
【００９５】
遺伝子導入動物、特にマウスまたはラットの創造のための技術は、広く知られている（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ １１５：１７１−２２９，１９８９）。導入遺伝子を導入するための、核酸の細胞へのマイクロインジェクション、レトロウイルスベクター法、および胚幹細胞への遺伝子移動を含む様々な手段が利用可能である。受精卵母細胞が遺伝子導入を評価するために使用される場合、目的の外来ＤＮＡまたは導入遺伝子が卵母細胞に組み込まれる。導入遺伝子の卵母細胞への組み込みは、適用レトロウイルスベクターなどのいくつかの方法、またはマイクロインジェクションによって行われる。遺伝子導入マウスは、Ｌｅｄｅｒらへ発行された米国特許第４，７３６，８６６号において記載されるように、またＢ．Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｎｔｉｔｌｅｄ “Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）において提供されるように、妊娠マウスから分離された胚盤胞腔へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって、先行技術において日常的に生成される。例えば、Ｈａｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２４５−２８１，１９９９； Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６６（３）：７２９−７３４，１９９９； Ｉｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｄ．，６０：９９−１３１，１９９９； Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２１：１５７−１７８ １９９７も参照。米国特許第６，４９２，５７５号は、胚幹細胞の変換によって遺伝子導入マウスを作製し、その変換細胞を４倍体胚盤胞腔に注射するための方法を説明する。同胞ヘテロ接合体を異種交配することによって、目的の遺伝子を持った同型の動物が得られる。
【００９６】
さらに、Ｃａｐｅｃｃｈｉらは、導入遺伝子が胚、胎児、または成体多性能幹細胞に組み込まれる方法を説明する（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２，１９９１）。この方法においては、胚幹細胞は、インビトロ培養された胚盤胞腔から分離される。これらの胚幹細胞は、分化なしに何細胞世代にもわたる培養において安定が保たれる。導入遺伝子は、その後エレクトロポレーションまたは他の形質転換方法によって、胚幹細胞に組み込まれる。導入遺伝子を持つ幹細胞は、胚盤胞腔の内細胞塊用に選択され、注射される。胚盤胞腔は、その後偽妊娠した雌に移植される。胚盤胞腔の全ての内細胞塊が導入遺伝子を持つわけではないため、その動物は導入遺伝子に対してキメラである。キメラ動物の異種交配は、導入遺伝子を持つ動物の生産を可能にする。その過程の概説はＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９８９，５：７０−７６により提供される。
【００９７】
導入遺伝子の送達は、レトロウイルス送達システム、例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２４１：１９，１９８８参照、によって行われる。一態様において、レトロウイルス構造は、ウイルスの構造遺伝子が単一遺伝子によって置き換えられ、その後ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）に含まれる調節要素の支配下で書き換えられるものである。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）を含む、様々な種類の単一遺伝子−ベクター骨格が使用される。一実施形態において、内部プロモーターの支配下で選択可能なマーカーのための遺伝子および当該の第二遺伝子のような異なる遺伝子の反復挿入を可能にするレトロウイルスベクターは、この種の骨格から派生される。例えば Ｇｉｌｂｏａ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２４１：２９，１９８８を参照。
【００９８】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の動物への導入時に、導入遺伝子が内因性遺伝子へ挿入されるため、内因性遺伝子の機能をノックアウトするということが、熟慮される。他の実施形態において、外因性遺伝子は、内因性遺伝子の発現が維持されるような位置において動物ゲノムへ挿入される。こうして、遺伝子導入動物は、動物に挿入されるヒト導入遺伝子ポリヌクレオチドに対応する全てまたは一部の内因性ポリヌクレオチドを発現する可能性がある。
【００９９】
外因性血液因子の投与
ここでヒト血液凝固因子と共に記載される条件を治療するための方法に含まれる投与計画は、薬の作用を変化させる様々な因子、例えば患者の年齢、条件、体重、性別、および食習慣、感染の重症度、投与時間および他の臨床学的因子を考慮して、担当医によって決定されるだろう。例として、本発明において有益な組み換えＶＷＦの投与量は、およそ５０Ｕ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇに等しく、およそ７５Ｕ／ｋｇ、およそ１００Ｕ／ｋｇ、およそ１５０Ｕ／ｋｇ、およそ２００Ｕ／ｋｇ、およそ２５０Ｕ／ｋｇ、およそ３００Ｕ／ｋｇ、およそ３５０Ｕ／ｋｇ、およそ４００Ｕ／ｋｇ、およそ４５０Ｕ／ｋｇもしくはおよそ５００Ｕ／ｋｇ、または対応するμｇ／ｋｇもしくはｍｇ／ｋｇである。
【０１００】
ある実施形態において、本発明の形状は、初回ボーラス投与によって投与され、その後に薬剤の治療的循環レベルを維持するための継続的な注入が続く。別の例として、本発明の化合物は、単回投与として投与される。当業者は、良い医療業務および各患者の病態によって決定された効果的な投与量および投与計画を、容易に最適化する。投与の頻度は、薬剤の薬物動態のパラメータおよび投与経路によって決まる。製剤は、投与経路および目的の投与量によって当業者により決められる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）１４３５から１７１２ページ、参照することによりここに組み込まれる開示を参照。このような形状は、投与物質の物理的状態、安定性、インビボ放出割合、およびインビボクリアランスの割合に影響する場合がある。投与経路次第で、適切な投与量が、体重、対表面積または器官の大きさによって計算される可能性がある。適した投与量は、適切な投与量−反応データと併せて、血液レベルの投与量を決定するための確立されたアッセイの使用を通して究明される可能性がある。最終投与計画は、薬の作用を変える様々な因子、例えばその薬の特異性活性、患者の損傷および反応の重症度、患者の年齢、状態、体重、性別および食習慣、感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的因子を考慮して、担当医により決定されるだろう。研究が実施されるにつれ、適切な投与量レベルならびに様々な疾病および条件のための治療の持続期間に関するより詳しい情報が明らかになるだろう。
【０１０１】
キット
追加態様として、本発明は、外因性血液因子の患者への投与のための、被険対象への投与のための使用を容易にする方法で包装された、１つ以上の製剤からなるキットを含む。一実施形態において、このようなキットはここで説明される製剤（例えば治療的タンパク質またはペプチドからなる組成物）から成り、その容器に貼られるまたはパッケージに含まれるこの方法を使用する際にその化合物または組成物の使用を説明する標識と共に、密閉ビンまたは密閉容器などの容器に包装される。一実施形態において、その製剤は、その容器中の頭部の空間の量（例えば、液体と容器の上部との間の空気量）がかなり小さいような容器に梱包される。好ましくは、その頭部空間の量がごくわずか（つまり、ほとんどない）である。一実施形態において、そのキットは、治療的タンパク質またはペプチド組成物を有する第１の容器、および組成物に対して生理的に受容可能な再構成溶液を有する第２の容器からなる。一態様において、その製剤は、ユニット剤形に包装される。そのキットは、特定の投与経路によって製剤の投与に適切な装置を含む可能性もある。好ましくは、キットは、製剤の使用を説明する標識を含む。
【０１０２】
以下の実施例は、非制限実施例とする意図はなく、本発明の特定の実施形態の例示である。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスに対する外因性ＶＷＦの効果
ヒト血友病Ａおよびフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）のマウスモデルは、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦの薬物動態的、薬力学的、および免疫学的研究に使用されている。ＦＶＩＩＩ欠損マウスは、ＦＶＩＩＩタンパク質が欠損しているが、ヒトＦＶＩＩＩとの併用でヒトＶＷＦとは異なった相互作用がある可能性のある、内因性マウスＶＷＦの正常なレベルを持っている。従って、ＦＶＩＩＩ欠乏症およびネズミＶＷＦの代わりにヒトＶＷＦを有するマウスモデルは、血友病の研究に有利となるだろう。血友病におけるヒトＶＷＦの効果を研究するために、遺伝子導入マウスの系列が、マウスの内因性ＦＶＩＩＩとＶＷＦ（ＦＶＩＩＩｘＶＷＤ）の両方における欠損に基づいて構築された。
【０１０４】
ヒトＶＷＦの静脈注射は、これらの動物における比較的短いヒトＶＷＦ インビボの半減期のため、徐々にＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ共欠損マウスをＶＷＦの正常循環レベルへ戻すために効果的な方法ではない（およそ５時間）。そのため、ヒトＶＷＦの投与の代替方法が開発された。
【０１０５】
高分子量ヒトＶＷＦは、これらの経路が欠損動物におけるＶＷＦの血漿レベルの回復において効果的であるかを究明するために、ＦＶＩＩＩｘＶＷＤマウスの腹腔内または皮下に注射された。マウスはｒＦＶＩＩＩおよびＶＷＦを共同発現しているＣＨＯ細胞から精製された組み換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を用いて治療された（Ｔｕｒｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈaｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ，２００９（ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）； Ｐｌａｉｍａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２７：３９５−４０３，２００１； Ｐａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １１：４９２−６，２００５； Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ．３：５５５−６５，２００７）。ｒＶＷＦ製品の開始原料は、Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ ＶＳ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＤ，Ｌｉｅｓｎｅｒ ＲＪ，Ｈｅｒｎaｎｄｅｚ Ｎａｖａｒｒｏ Ｆ，Ｗａｒｒｉｅｒ Ｉ，Ｓｃｈｒｏｔｈ ＰＣ，Ｓｐｏｔｔｓ Ｇ，Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ ＢＭ； ｒＡＨＦ−ＰＦＭ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ａｌｂｕｍｉｎ−ｆｒｅｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８； ６：１３１９−２６に記載のように、市販用ｒＦＶＩＩＩ製品ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の製造過程の中間体であった。
【０１０６】
マウスは、ヒトＶＷＦを腹腔内に４００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇ体重（１０ｍｌ／ｋｇ）で注射され、また最初の注射から９時間後に再注射された。製剤緩衝材が、制御装置として使用された。血液は、初回腹腔注射後、２、６、９、１１および２３にて（ｎ＝５）心臓穿刺により治療および対照動物から収集された。ＶＷＦ血漿レベルは、２つの多クローン性抗ＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定され、オルトフェニレンジアミンカラー現像を用いて現像された（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【０１０７】
腹腔内注射後２時間のマウス血漿において見られるＶＷＦ抗原のレベルは、１．７±０．９ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌ（図１Ｂ）の平均値を示し、腹腔内注射されたＶＷＦの１７％の血漿回復を示した。ｒＶＷＦの２回目の注射（９時間での）は、平均ＶＷＦ：Ａｇ値を２．１ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌへ増加させた。注射後２３時間においては、まだ測定可能なおよそ１．１ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌの循環ＶＷＦ：Ａｇの値があった。この研究は、２時間および９時間の同じ治療間隔で、より低い投与量２００Ｕ／ｋｇで繰り返された。より低い投与量で検証された血漿ＶＷＦ：Ａｇのレベルは、より高い投与量で見られるものよりおよそ３倍低く、およそ１２％の血液循環（図１Ａ）における回復を表した。
【０１０８】
驚くべきことに、血液循環において見られるＶＷＦは、注射されたＶＷＦ素材のマルチマーパターンに匹敵する無損傷マルチマーパターンを示した。マウスの治療に使用されたｒＶＷＦは、より低い二重体および対応分解帯の量を示したが、それでも９時間後に減少および分解され始めた高分子量マルチマーを有するマルチマーパターンを有していた（図２）。
【０１０９】
実験は、しばしば血友病患者の治療に使われる血漿派生ＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ）が、マルチマーを循環するため検出可能であるかを究明するために実施された。マウスは、２回のｐｄＶＷＦ腹腔内注射を用いた上記と同様の治療により治療され、ＶＷＦのレベルは上記のように測定された。組み換えＶＷＦを用いて検証した結果、ｐｄＶＷＦの注射は、ＶＷＦ抗原レベルを循環、および注射されたタンパク質のマルチマーパターンと同様の無損傷マルチマーをもたらした（図３および４）。
【０１１０】
これらの結果は、組み換え、血漿派生を問わずヒトＶＷＦは、早ければ腹腔内注射後２時間および遅ければ注射後２３時間のＦＶＩＩＩｘＶＷＤマウスの血液循環において検出可能であることを示す。従って、ＶＷＦの腹腔内注射は、腹腔内注射を、ＶＷＦ療法を受けている患者にとってより良い治療の選択肢にし、同溶液の静脈注射よりも長いインビボ半減期を実証する。
【０１１１】
実施例２
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤノックアウトマウスへのＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の投与
無損傷ＶＷＦマルチマーがｒＶＷＦまたはｐｄＶＷのＶＷＦ欠損マウスへの腹腔内注射後に観察されたということの発見は、ヒトｒＦＶＩＩＩとｒＶＷＦの複合体が、腹腔内注射によって同様の結果をもたらし投与され得るかどうかの調査につながった。
【０１１２】
それぞれ２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇと２００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの組み合わせたものが、上記の記載と同様の治療間隔で腹腔内に投与された。上記血液の分析は、循環ＶＷＦ：Ａｇのレベルが、ＶＷＦ単体で治療された動物と同様に、２４時間にわたり検出可能であったことを実証した（図５）。同じ時点で測定されたＦＶＩＩＩレベルは、ＦＶＩＩＩが３時間後に０．１±０．６単位／ｍｌで検出可能であり、９時間までこのレベルを維持したことを示した。ＦＶＩＩＩは、２４時間後には検出可能でなかった（図６）。これらの実験のために、腹腔内注射後のＶＷＦの回復は、ＦＶＩＩＩ回復がおよそ５％であったのに対し、注射された物質のおよそ１２％であった。繰り返し実験において、血液レベルは、４８時間まで測定された。２４時間まで見られたＦＶＩＩＩおよびＶＷＦレベルは、前の実験と同様であったが、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦは、４６時間以降の血液循環において検出可能ではなかった（図７）。
【０１１３】
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトは、また、２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇと２００ ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇを含む複合体の皮下注射によりｒＶＷＦまたはＦＶＩＩＩを投与された。皮下注射後、循環ＶＷＦ：Ａｇレベル（０．１４ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌ）においてわずかな増加があった（図１）。対応するＦＶＩＩＩレベルは低かったが、注射６時間後において検出可能（０．０４単位／ｍｌ）であった（図６）。
【０１１４】
これらの結果は、静脈または皮下注射よりも血液循環においてより良い回復を明示する腹腔内注射が、大きなＶＷＦ分子の投与に良好な経路であることを実証する。腹腔内注射は、ヒト種における薬理学的研究において、小分子薬の投与に広く使用されているが（例、エリスロポエチンの腹腔内注射）、タンパク質の腹腔内注射、特に大型ＶＷＦマルチマーは、現在まで調査されていなかった。多量体ＶＷＦの大きな分子量のため、タンパク質が、腹腔内注射後のマウスの血液循環において無傷で回復されるであろうことは予期されていなかった。これは、この大きな多量体タンパク質が、大きなＶＷＦタンパク質の構造と機能を維持しながら、中皮腫を通って脈管構造に運ばれることを示す。これは、ヒトＶＷＦの循環を用いた血友病の研究に対する新しい取り組みを提供するｒＶＷＦの脈管構造への運搬能力を新たに発見した。
【０１１５】
実施例３
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤノックアウトにおける血液凝固への外因性ヒトＶＷＦの評価
ヒト血友病と同様に、ＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスは、出血症状を伴う傾向を示す。外因性ヒトＶＷＦのＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスへの投与は、腹腔内、およびより狭い範囲の皮下へのｒＶＷＦまたはｐｄＶＷＦの注射が、ＶＷＦが脈管構造へ運ばれ、血液循環において検出可能な活性を示すことを可能にすることを実証した。この検証は、外因性ＶＷＦが、血管負傷の部位へ血小板を引き付けること、血小板相互作用を仲介すること、および血液循環における第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を安定させることを含む、特徴的なＶＷＦインビボ活性を恐らく示す（Ｐｌａｉｍａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２７：３９５−４０３，２００１）。
【０１１６】
コラーゲンは、ＶＷＦの生理学的結合パートナーである。Ｋｅｓｓｌｅｒらによる研究（Ｂｌｏｏｄ ６３：１２９１−１２９８，１９８４）は、ＶＷＦと第ＶＩＩＩ因子の複合体は、コラーゲン繊維を結合することを示した。米国特許第６，４１４，１２５号は、高または中分子量ＶＷＦのみが、コラーゲンを結合することを教示し、コラーゲンを結合するＶＷＦを検出する方法およびコラーゲン固定化を用いたＶＷＦの精製方法を提供する。そのため、ＶＷＦ−コラーゲン結合アッセイは、インビボのＶＷＦの腹腔内または皮下投与後の高分子量ＶＷＦ種の存在の測定法でもある。
【０１１７】
血液凝固および他の関係するＶＷＦ活性に対する外因性ＶＷＦの効果を究明するため、血小板粘着、血小板凝集、または血液凝固／血流を測定するために、インビボアッセイが当技術分野において知られている技術を用いて実施された。
【０１１８】
例えば、米国特許第６，００５，０７７号は、ＶＷＦなどの外因性血液凝固因子の投与前後の出血時間および血液の特徴（例、ヘモグロビン含有量、凝固因子の存在）に対する血液因子欠乏症の影響を究明するための方法を開示する。さらに、血小板粘着アッセイは、固定化した組み換えＶＷＦ断片を使用した流動条件下で血小板粘着を測定する方法を記載したＳｈｅｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．９６：１６０−６，２００６）において開示される。ｄｅ Ｒｏｍｅｕｆ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：２１１−６，１９９８）は、ｒＶＷＦ調製を用いたインビトロ血小板活性化および血小板凝集アッセイを開示する。
【０１１９】
これらのアッセイは、外因性血液凝固因子が血液凝固障害をもたらす能力の評価、および病気の改善のための外因性因子の投薬および投与に関する情報の提供に有用である。
【０１２０】
さらに、ＶＷＦを特徴付け、またＶＷＤを診断するためのアッセイは、他により記載されたように行われる。例えば、出血性障害および血栓障害におけるＶＷＦの役割を決める方法は、Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ．４４（２）：１１５−４９（２００７）において記載され、ＶＷＤおよびＶＷＦ療法の治療を評価する方法は、Ｂｕｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．Ｓｅｐ；３２（６）：６２６−３５（２００６），Ｆａｖａｌｏｒｏ Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．Ｓｅｐ；３２（６）：５６６−７６（２００６）およびＦａｖａｌｏｒｏ，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２００６ Ｊｕｌ；３２（５）：４５６−７１（２００６）において記載され、ＶＷＤの分類方法は、Ｓａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｏｃｔ；４（１０）：２１０３−１４（２００６）において記載され、ＶＷＤの特定方法はＫｏｕｉｄｅｓ Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．Ｊｕｌ；３２（５）：４８０−４（２００６）において記載されている。
【０１２１】
実施例４
外因性ヒト血液凝固因子を用いた血液凝固障害の治療
ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦなどの血液凝固因子において欠乏症のある被険対象は、ここに示されるように、血液因子組成物を用いて治療される。血液凝固障害の動物モデルへの血液因子の投与、および血液障害に苦しむヒトを治療するために当技術分野において知られているプロトコルの使用は、ここに記述される単独または他の治療薬、例えば化学療法または放射線療法、サイトカイン、成長因子、およびよく使われる他の治療学の薬との組み合わせ、の血液因子を被険対象に投与する基準を提供する。
【０１２２】
例えば、ＦＶＩＩＩにおいて欠乏症を持つ血友病Ａ患者は、治療を行う医師によって簡単に決められるような、低ペグ化ＦＶＩＩＩの治療効果のある投与量を用いて治療される。例えば、重度の血友病患者への代替ＦＶＩＩＩの２つの異なる調製の投与および比較を説明しているＤｉ Ｐａｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．１３：１２４−３０，２００７を参照。
【０１２３】
精製されたＶＷＦは、血友病Ａと同様に、フォンヴィレブランド病（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ４：１０３５−７，１９９３）に苦しむ患者を治療するためにも使用されている。ここに記述される組み換えまたは血漿派生ＶＷＦは、代替ＶＷＦの恩恵を受けるであろう患者を治療するための当技術分野で知られている養生法において使用されている。
【０１２４】
組み換えＶＷＦが単独またはＦＶＩＩＩとの複合体において投与されることを、本発明において熟慮された。一実施形態において、ＶＷＦは５０Ｕ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇの投与量範囲において投与された。例えば、ＶＷＦは、およそ５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００Ｕ／ｋｇで投与された。
【０１２５】
血液因子の投与は、１から２４時間、またはそれ以上続く可能性があり、日常実験を用いた最適化のために修正可能である。血液因子が、長期処置の必要がないよう期間中続けて投与されることも熟慮された。さらに、改良血液因子組成物は、毎日、毎週、隔週、または当業者によって決められるであろう他の効果的な頻度で投与される。
【０１２６】
改良血液因子が、他の化学療法もしくは放射線療法薬、または成長因子もしくはサイトカインなどの他の治療法と組み合わせて患者に投与されることが熟慮された。別の治療薬剤との組み合わせで投与される場合、改良血液因子の量は、必要に応じて適宜減らされる。第２物質はヒトの病気の改善に安全および効果的である決められた量で投与される。
【０１２７】
ある実施形態において、サイトカインまたは成長因子、および化学療法薬または放射線療法薬は、血液因子と同じ形状で投与され、同時に投与される。あるいは、その薬剤は、別の形状で投与されても、血液因子と同時に投与される。ここに使用されるように、同時に、それぞれ３０分以内に投与された薬剤に関連する。関連する実施形態において、第２物質は改良血液因子の投与に先立って投与される。先行投与は、改良血液因子の投与前一週間前から３０分前までの範囲で改良因子治療に先立って投与される。第２物質が、改良血液因子の投与の後に投与されることも、さらに熟慮された。後続の投与は、改良血液因子投与の３０分後から１週間後までの投与を説明することを意図されている。血液因子組成物は、血液凝固障害および癌の形状を有する被険対象における放射線療法の養生法と共に投与され、治療を行う医師により処方されることで治療が行われる。
【０１２８】
上の説明に役立つ実例において記載された、本発明における多数の改良および変異は、これらの当業者に想起することが期待される。従って、添付の特許請求の範囲に表れるような制限のみが、本発明とされるべきである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年８月４日に出願された米国特許仮出願第６１／２３１，２３０号の優先権の利益を主張し、参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して、血友病Ａ等の血液凝固障害の研究に有用な、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）を欠損する遺伝子導入非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固は、とりわけフィブリノゲン、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子の成分の一連の連続的な相互作用を含む複合過程である。それら１つの成分の損失、またはその機能性の阻害は、血液凝固の増加傾向または、一部の患者では生命を脅かす恐れがある凝固不能を引き起こす場合がある。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固へと導く反応の連鎖にある共同因子として作動する、血漿で築かれたタンパク質である。血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の量の欠乏は、遺伝性疾患で主に男性に影響を与える凝固障害血友病Ａをもたらす。血友病Ａはヒト血漿から抽出された、またはＤＮＡ組み換え技術を用いて製造された第ＶＩＩＩ因子の治療的調製で治療されている。そのような調製は出血症状に応えて、あるいは頻繁に、一定間隔でコントロール不可能である出血を防ぐために（予防法）投与される。
【０００５】
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、第ＶＩＩＩ因子と錯体を形成した血漿で循環する。第ＶＩＩＩ因子と錯体を形成したＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子タンパク質を安定させる、またはタンパク質分解から保護する。血小板凝集ではその機能に起因して、ＶＷＦは血液凝固にも直接的に干渉する。フォンヴィレブランド欠乏症（ＶＷＤ）（フォンヴィレブランド症候群としても知られている）は欠乏症あるいはＶＷＦの過剰発現に由来する。ＶＷＦの欠乏症は、ＶＷＦ共同因子が欠損した第ＶＩＩＩ因子の急速分解に起因する、血友病に似た病気をもたらす。
【０００６】
血友病Ａおよびフォンヴィレブランド症候群の療法の従来の方法は、第ＶＩＩＩ因子または血漿から回収された、もしくは組み換え源によって製造されたＶＷＦを使用し、そして精製された第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ、または第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体で患者を治療する多くの試みがある。
【０００７】
遺伝子導入動物技術は、非ヒト動物内のヒトタンパク質の特性を研究するただ一つの機会を提示する。組み換えＤＮＡおよび遺伝子工学技術は、内因性遺伝子の発現に干渉または導入する、そして目的配列または、とりわけインビボ分子の効果を研究し、そして分子に結合する薬剤を研究することを可能にしている受容動物内の遺伝子を発現することを可能にした。遺伝子導入マウスを製造する１つの方法は、新たに交尾した雌マウスからの受精卵の回収および、動物内の発現または卵の雄性前核の中の内因性遺伝子発現で干渉するための当該の遺伝子のＤＮＡのマイクロインジェクションが必要である。マイクロインジェクションを施された卵は、それから１日偽妊娠した育ての母の卵管内に植えつけ、出産に進ませる。例えば、非特許文献１，特許文献１および特許文献２を参照のこと。別の手順は当該遺伝子を導入された胚幹細胞を使用する。導入胚幹細胞はそれから、生殖細胞系を含む全組織形成に加わるマウス胚盤胞腔に注射されるので、それゆえ遺伝子導入子孫を生成する。同種組み換え技術と組み合わせたこの取り組みは、規制された方法で胚の胚幹細胞改造することの可能性を提供するので、それゆえ、規定のゲノムで遺伝子導入のマウスを生成する。例えば、非特許文献２、あるいは、非特許文献３、あるいは、非特許文献４を参照のこと。
【０００８】
遺伝子導入のマウスは、発現するため、または当該（ノックインマウス）タンパク質を過剰に発現する場合があり、もしくは当該（ノックアウトマウス）遺伝子を削除するために発生させる可能性がある。ヒトタンパク質分子を発現する遺伝子導入マウスは、インビボヒト分子の研究を考慮に入れる。例えば、非特許文献５は、遺伝子導入マウスが組み換えＦＶＩＩＩの活性を抑制するＦＶＩＩＩ抑制抗体の問題を回避するよう設計されている、修正されたヒトＦＶＩＩＩタンパク質（Ｂ−ドメイン欠損）を発現している、と記載する。ヒトＶＷＤと似た症状を示すＶＷＦノックアウトマウスは、ＶＷＦ欠乏症を治すためにマウスＶＷＦからなる遺伝子療法ベクターの投与を記載する、非特許文献６で開示された。
【０００９】
それゆえ、人間患者への研究なしにインビボヒト血液凝固因子活性の研究のための改良方法を発展する技術の必要性が存在する。さらにまた、血友病Ａのような血液凝固障害を有する患者に対する、外因性治療的タンパク質の投与の治療的効果を決定する技術の必要性が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，８７３，１９１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２９４，７５５号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗａｇｎｅｒｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３７６−６３８０（１９８１）
【非特許文献２】Ｂａｒｉｂａｕｌｔ ａｎｄ Ｋｅｍｌｅｒ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．６：４８１−９２，１９８９
【非特許文献３】Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｂ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：６０３−１３，２０００
【非特許文献４】Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ ａｎｄ Ｒａｄｆｏｒｄ．Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｔｈｅ ｎｅｗ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７５：２０８−１６，１９９７
【非特許文献５】Ｓｈｉら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：１９７４−８２，２００６
【非特許文献６】Ｐｅｒｇｏｌｉｚｚｉら，Ｂｌｏｏｄ．１０８：８６２−９，２００６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、インビボでの治療的養生法における効果の研究と、同様に外因性ヒト血液凝固因子の投与を用いてヒト血液凝固障害を治療する方法の発達に有益である遺伝子導入の非ヒト動物の提供による、血液凝固障害の治療に関連する当技術分野における１つ以上の必要性に取り組む。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、機能性が欠損しているゲノム、内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子、および内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子である機能性が欠損しているゲノムを有する遺伝子導入の非ヒト動物を提供する。一態様において、遺伝子導入動物は、ヒトＶＷＦをコード化しているヒト導入遺伝子ポリヌクレオチド配列から成るゲノムを有する。任意で、ポリヌクレオチド配列はプロモーターポリヌクレオチド配列と作動可能に連結され、および／または、ポリヌクレオチド配列はポリアデニル化ポリヌクレオチド配列から成る。様々な態様において動物は齧歯動物であり、特定の一態様において動物はマウスである。
【００１４】
本発明はまた、機能的な内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の欠損および機能的な内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子の欠損を有するゲノムを有する非ヒト遺伝子導入動物も提供し、このゲノムは、ヒトフォンヴィレブランド因子をコードするポリヌクレオチドを含み、このヒトＶＷＦは、ヒトＶＷＦの生理学的活性を有し、この遺伝子導入哺乳動物は、その遺伝子内に、転写制御ポリヌクレオチド配列、上述のヒトＶＷＦをコードするＤＮＡ、およびポリアデニル化シグナルを含む外因性導入遺伝子構築物を有し、転写制御ポリヌクレオチド配列、上述のヒトＶＷＦをコードするＤＮＡ、およびポリアデニル化シグナルは、ヒトＶＷＦまたはその断片の遺伝子導入動物中の産生を得るために、外因性遺伝子構築物内で作動可能に連結される。一態様において、転写制御ポリヌクレオチド配列は５’転写制御ポリヌクレオチド配列、３’転写制御ポリヌクレオチド配列、内部転写制御ポリヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。特定の態様において、５’制御配列は、任意選択でエンハンサー領域を含むプロモーターである。
【００１５】
提供される遺伝子導入の動物の様々な実施形態において、動物はヒト後天的血友病Ａの実験的モデルである。
【００１６】
さらに、先に述べたように治療有効量のヒトＶＷＦの動物への投与から成る内因性第ＶＩＩＩ因子および内因性ＶＷＦの欠乏した哺乳動物における、外因性ヒトフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の効果の評価、および臨床的読出しの改善が外因性ＶＷＦの治療的効果を示しているＶＷＦ活性の臨床的読出し測定のための方法が提供される。その方法のある態様において、ＶＷＦは腹腔内または皮下に投与される。他の態様において、ＶＷＦは５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇまでの範囲で投与される。さらに他の態様において、ＶＷＦ活性の臨床的読出しは血液組成、血小板凝集、血小板粘着および血小板活性化から構成される基より選ばれる。
【００１７】
本発明は、外因性多量体ヒトフォンヴィレブランド因子の血友病Ａの症状改善に効果的な量を、腹腔内または皮下に投与されることから成る血友病Ａを有する被験対象の治療のための方法を、さらになお提供する。一態様において、症状は出血性障害、自己免疫疾患、異常血小板凝集、異常血小板粘着および異常血小板活性化から構成される基から選ばれる。別の態様において、ＶＷＦは５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇまでの範囲で投与される。
【００１８】
前述で提供される方法の様々な実施形態において、ＶＷＦはヒト第ＶＩＩＩ因子と組み合わせて投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】２００ｒＶＷＦ／ｋｇ（図１Ａ）または４００ｒＶＷＦ／ｋｇ（図１Ｂ）の投与後のＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスの血漿における、組み換えＶＷＦ抗原のレベルを示す。
【図２】腹腔内に注射されたｒＶＷＦがＦＶＩＩＩｘＶＷＤマウスの血漿において高分子量マルチマーとして検出されたことを図示している低分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ａ）または高分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ｂ）を表す。
【図３】は、腹腔内に注射されたＶＷＦに由来する血漿がＦＶＩＩＩｘＶＷＤノックアウトマウスの血液循環において検出されたことを図示する。
【図４】腹腔内に注射されたＶＷＦに由来する血漿が、無傷マルチマーとして血液循環において保存されていることを示す。（Ａ）低分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（Ｂ）高分解能ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５】ｒＶＷＦ：Ａｇが２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇおよび２００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの腹腔内注射後２４時間まで血漿において検出可能であることを示す。
【図６】ＦＶＩＩＩが２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇおよび２００ ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの腹腔内注射後９時間まで血漿において検出可能であったが、２４時間以降は検出可能でなかったことを示す。
【図７】ＦＶＩＩＩ（図７Ａ）およびｒＶＷＦ：Ａｇ（図７Ｂ）の、２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇおよび２００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの腹腔内注射後４８時間までの血中濃度を図示する。ＦＶＩＩＩおよびｒＶＷＦは、４６時間以降は血液循環において検出可能ではなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、血液凝固障害を治療するために有用な改善された方法および組成物の当技術分野における必要性に取り組む。本発明は、さらに、ヒト血液凝固障害の治療における治療的組成物の有効性に取り組むために、内因性血液凝固因子が欠損している、および血液凝固因子内因性の代わりにヒト凝固因子が発現しているいくつかの症例において遺伝子導入動物を提供する。
【００２１】
定義
他に定義済みである場合を除いて、本明細書で使用された全ての技術および化学用語は、この発明が属する当業者によって一般に理解された同様の意味を有する。下記の参考文献は本発明において使われた多くの用語の通常の定義と共に、当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ ｅｄ．１９９４）； ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）； ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）； ａｎｄ Ｈａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００２２】
各出版物、特許出願、特許、および他の本明細書に引用された参照文献は、本開示と矛盾しない範囲全体中の参照文献によって連携される。
【００２３】
この明細書および添付の請求項において使用された、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに指し示さない限り、複数形を含むということをここに留意する。
【００２４】
本明細書で使用される、以下の用語は、他を特定しない限りそれらに属する意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用される、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素のような「コード配列」または配列「コード化」生成物は、発現した際、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産出をもたらす、ヌクレオチド配列である。つまりヌクレオチド配列がポリペプチド、タンパク質または酵素に必要なアミノ酸配列をコードする。タンパク質に対するコード配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）および終始コドンを含む可能性がある。
【００２６】
本明細書で使用される「遺伝子」は、コードするＤＮＡ配列または、１つ以上のポリペプチド、タンパク質または酵素の全てまたは一部から成る、アミノ酸の特定配列に言及し、イントロン、および、例えば、その遺伝子が発現される下の条件に影響を及ぼすプロモーターまたはエンハンサー配列、５’−非翻訳領域または、３’−非翻訳領域のような調節ＤＮＡ配列を含む可能性または含まない可能性がある。構造遺伝子ではない、いくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへ書き直される可能性があるが、アミノ酸配列には変えられない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調整剤として、またはＤＮＡ転写の調整剤として機能する可能性がある。
【００２７】
本明細書で使用される、「導入遺伝子」は、別の有機体のゲノムに伝わる外因性遺伝子に言及する。ヒト導入遺伝子は、非ヒト哺乳動物に伝わるヒト遺伝子である。
【００２８】
本明細書で使用される「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼを細胞内に結び付ける、およびコード配列の転写を開始する能力があるＤＮＡ調節領域である。一態様において、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端に結び付けられ、上記背景で検出可能な水準で転写を開始するために必要な基節または要素の最小数を含むため、上流（５’方向）へおよぶ。関連した態様において、プロモーター配列内に、ＲＮＡポリメラーゼの結びつきに対して関与するドメインを結び付けるタンパク質（合意配列）と同様に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１と共に位置することにより、便利に定義される）が発見される。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む、他の発現制御配列と作動的に関係がある可能性がある。
【００２９】
一態様において、プロモーターは以前、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号、および第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０，１９８１）、ラウス肉腫ウイルス（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７，１９８０）の３’長い末端反復に含まれているプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２，１９８２）、あるいは酵母または他のＧＡＬ４プロモーターのような菌類からのプロモーター要素、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロムターゼ キナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、あるいは視床下部に活性がある（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８，１９８６）ゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域のような、神経または脳特有の発現を示す転写制御領域、胸腺リンパ球１．２「全神経の」プロモーター、および神経に活性があるシナプシスＩプロモーター（Ｈｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １６：６８５−６９９，１９９５）、を含み遺伝子発現を制御したがそれには限定されない。プロモーターが内因性血液凝固因子プロモーターであるということも熟慮される。当業者は、当技術分野において知られているいずれのプロモーターが有用であり、発現が望まれることにおけるその細胞形式が特殊なプロモーターの使用を決定することが出来るということを理解するであろう。
【００３０】
本明細書で使用されるコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡへコード配列を書き直し、同時にトランス−ＲＮＡを挿入され（それがイントロンを含有する場合は）そして、ｍＲＮＡについて言えば、コード配列によってコード化されたタンパク質へ翻訳された際、細胞における、「その制御下の」、「〜に作動可能に連結される」または「作動可能なように関連する」転写および翻訳制御配列である。
【００３１】
本明細書で使用される用語「発現する」および「発現」は、例えば、対応遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に含まれる細胞機能の活性化によりタンパク質を生産することといった遺伝子またはＤＮＡ配列が明白になる、許可または情報の原因に言及する。ＤＮＡ配列は、タンパク質のような「発現生産」を形成することにおいて、またはそれによって発現される。発現生産それ自身は、例えば、結果として生じるタンパク質が、「発現された」とも言われる可能性がある。発現生産は、様々な態様において、細胞内に、細胞外にまたは隠されたと見なされる。用語「細胞内の」は細胞の内側を意味する。用語「細胞外」は、膜貫通タンパク質のような細胞の外側を意味する。実体は、それが細胞外、どこかからまたは細胞内に有意な尺度を現わす場合、細胞によって「隠された」。
【００３２】
本明細書で使用される「導入」は、細胞への異質の核酸の導入に言及する。用語「形質転換」は、「異質」の（つまり外因性、異種、外部のまたは細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列における胚幹（ＥＳ）細胞または前核の導入に言及し、細胞が、遺伝子導入の動物における目的の実体を生産するための遺伝子または配列を取り込む発現を出来るようにする。
【００３３】
本明細書で使用される用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、異質の遺伝子）が、宿主を変形し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を推進するために宿主細胞へ導入されることによる媒体に言及する。用語「ベクター」は本明細書では、用語「プラスミド」と相互に変化して使われた。
【００３４】
本明細書で使用される「選択可能なマーカー」は、マーカーの発現または活性が、（例えば、無制限だが、ネオ遺伝子のような陽性マーカー）のために選ばれた、または（例えば、無制限で、ジフテリア遺伝子のような陰性マーカー）に対して選ばれたというような薬物、抗生物質または他の薬剤に抵抗するような識別可能な表現型の変化が発現された細胞または有機体を与える酵素または他のタンパク質の遺伝子コード化に言及する。異種選択可能なマーカーは、通常見つけられるであろう動物のゲノムへ挿入されるという選択可能なマーカー遺伝子に言及する。
【００３５】
選択可能なマーカーの例は、ネオマイシン（ｎｅｏ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）、ジフテリア毒素、ホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ、キサンチン誘導ホスホリボシル トランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼのような抗生物質耐性遺伝子を含むがそれに限定されない。当業者は、その方法において有用であると知られている技術のいずれの選択可能なマーカーを理解すると考えられる。
【００３６】
本明細書で使用される「異種」は、それ自身において自然に生じず、および／または、非自然環境において発見される要素の組み合わせに言及する。例えば、異種ＤＮＡは、ＤＮＡが細胞において、または細胞の染色体部位おいて、自然に位置しないことに言及する。それは細胞を含む異種ＤＮＡを考慮する。異種発現調節要素は、自然中と作動的に関連するよりも異質遺伝子と作動的に関連するこのような要素である。
【００３７】
本明細書で使用される用語「同種」は、上科からのタンパク質（例えば、上科免疫グロブリン）を含む「共通の環境起源」を保有するタンパク質および異種（例えば、ミオシン軽鎖等）からの同種タンパク質間の関係に言及する（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５０：６６７，１９８７）。そのようなタンパク質（およびそれらのコード化遺伝子）は、類似率または保存タンパク質で特異残基またはモチーフの存在に関してどうであろうと、それらの類似配列の反映として同族配列を有する。
【００３８】
対照用に配列の最適アラインメントが、例えば無制限で、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局部同族アルゴリズムによって、あるいはＮｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の同族調整アルゴリズムによって、あるいはＰｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８の類似方法の探究によって、あるいはこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の電子化実施によって、または外観検査（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ、を参照のこと）によって、実施された。アルゴリズムの別例は、配列識別割合およびの究明に適しており、配列類似がＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０において記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である。配列識別割合の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７，１９９３、を参照のこと）間の類似の統計分析も実行する。
【００３９】
本明細書で使用される「内因性」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド宿主有機体において自然に発現された他の化合物に言及し、また細胞内部、組織または有機体に由来する。「外因性」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは他の細胞外部、組織または有機体に由来する化合物に言及する。
【００４０】
本明細書で使用される「ポリペプチド」は、ペプチド結合を経由して結合されたアミノ酸残基から成るポリマーに言及する。合成ポリペプチドは、一態様において、自動ポリペプチド合成器を使用して、合成される。用語「タンパク質」は、概して拡大ポリペプチドに言及する。用語「ペプチド」は概して短ポリペプチドに言及する。
【００４１】
本明細書で使用される、ポリペプチドの「断片」は、ポリペプチドのいずれの部分も、実物大のポリペプチドまたはタンパク質発現産物より小さいことに言及する。断片は概して、アミノ末端、および／または、実物大のポリペプチドのカルボキシ末端から除去された１つ以上のアミノ酸残基における実物大のポリペプチドの削除類似体である。従って、「断片」は以下に記載された削除類似体の小集団である。
【００４２】
本明細書で使用される「類似体」は、たとえ、異なる程度の場合、自然発生分子の場合であっても、実質的に類似した構造で同様の生物活性を有するポリペプチドに言及する。類似体は、その類似体から生成された自然発生ポリペプチドに比べてそれらのアミノ酸配列の組成物が異なり、以下を含む１つ以上の変異に基づく、（ｉ）１つ以上のポリペプチドの末端、および／または、自然発生ポリペプチド配列のより内部領域での１つ以上のアミノ酸残基の削除、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端（概して、「追加」類似体）、および／または、１つ以上の自然発生ポリペプチド配列の内部領域（概して、「挿入」類似体）、での１つ以上のアミノ酸の挿入または追加、あるいは（ｉｉｉ）自然発生ポリペプチド配列における他のアミノ酸のための１つ以上のアミノ酸の置換。置換は、物理化学または、置き換えられていて、そのアミノ酸がそれを置き換えるというアミノ酸の機能的同系性に基づく保存または非保存である。本明細書で留意すべきは、自然発生するアミノ酸配列の１つまたは両末端で、１つ以上のアミノ酸残基において、削除類似体が断片を含み取り除かる。また、追加類似体は、全てまたは部分的に別なタンパク質またはポリペプチド配列において、融合タンパク質を含む、自然発生のアミノ酸配列の１つまたは両方の末端へ加えられる。
【００４３】
本明細書で使用される「対立遺伝子多型」は、同様の遺伝子座を占領している遺伝子の２つ以上のいずれかの多形相に言及する。対立遺伝子の変化は、変異体を通じて自然に起こり、また個体群内の表現型多型をもたらす可能性がある。一態様において、遺伝子変異体は寡黙（コード化されたポリペプチドにおいて、変化しない）または、変貌したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性がある。「対立遺伝子多型」は、それらによってコード化されたタンパク質と同様に、対立遺伝子多型遺伝子のｍＲＮＡ転写物から生成されたｃＤＮＡｓにも言及する。
【００４４】
本明細書で使用される「変異体」は、ポリペプチド、タンパク質または通常分子の部分ではない追加的化学部分を含有するために修正された類似体に言及する。そのような部分は、様々な態様において、分子の溶解度、吸収、および／または生物学的半減期を調節する。他の様々な態様におけるその部分は、分子の毒性を選択的に減少し、分子等のいかなる望ましくない副作用をも、削除するまたは衰えさせる。そのような効果を仲介出来る部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）において開示さる。そのような部分を分子に連結するための手順は、その技術において周知されている。例えば、変異体は、長半減期インビボをタンパク質へ与える化学一時的変異を有する血液凝固因子である可能性がある。一実施形態において、ポリペプチドは、その技術において知られている水溶性のポリマーを追加することで修正される。関連する実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／または、ポリシアル化によって修正される。
【００４５】
本明細書で使用される「検出可能な部分」または「標識」は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の手段によって検出可能な組成物に言及する。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光性染料、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、一般に使用されるものとして、ＥＬＩＳＡ）、ビオチンストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテンおよび、抗血清もしくは単クローン性抗体を入手するためのタンパク質、または対象に補完的配列である核酸分子を含む。検出可能な部分は、サンプルにおける化合した検出可能な部分量をかつて計った放射性、発色性または蛍光性シグナルのような測定可能なシグナルをしばしば発生する。
【００４６】
血液凝固因子
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、哺乳動物の肝臓内に大量生産された分子、約２６０ｋＤａの血漿糖タンパク質である。それは血液凝固を導くという凝固反応の連鎖に重要な成分である。この連鎖内において、ＦＶＩＩＩと連結して、第Ｘ因子を第Ｘａ因子である活性形状へ変換する第ＩＸａ因子が存在する段階である。ＦＶＩＩＩはこの段階で共同因子として作動し、カルシウムイオンおよび第ＩＸａ因子の活性に対するリン脂質とともに要求される。２つの最も共通の血友病障害は、機能的な欠乏症ＦＶＩＩＩ（血友病Ａ、全ての症状の約８０％）または機能的第ＩＸａ因子（血友病Ｂまたはクリスマス因子病）によって生じる。
【００４７】
近年までは、血友病Ａの治療基準は、ヒト臓器提供者の血漿から生成されたＦＶＩＩＩ濃縮物の調製の頻繁な注入を含んでいた。この補充療法は一般に有効であるが、一方で、そのような治療は、肝炎およびエイズのような、ウイルス伝染性の病の危険がある状態に患者を置く。この危険性は、単クローン抗体を使用した免疫精製により血漿からＦＶＩＩＩのさらなる精製により減少しているが、有機的な溶媒または熱のどちらか一方との治療による不活化ウイルスにより、そのような調製は、危険性なしではない治療の費用を大いに増加した。これらの理由により、患者は予防的というよりはむしろ、偶発的に取り扱われてきた。
【００４８】
血友病Ａの治療における重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩのｃＤＮＡクローンコード化完全な２，３５１アミノ酸配列の単離（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０（１９８４）および、米国特許第４，７５７，００６号、１９８８月７月１２日、を参照）あるいはヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列およびその製品のための組み換え方法の提供である。しかしながら、組み換えＦＶＩＩＩを受けている患者は、病の治療を妨げるＦＶＩＩＩ特異的抗体を、まだ発現する可能性がある。血友病の治療のための第ＶＩＩＩ因子製品は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（抗血友病因子（組み換え）、血漿／アルブミンなしの方法、ｒＡＨＦ−ＰＦＭ）、組み換え抗血友病因子（ＢＩＯＣＬＡＴＥ（登録商標）ＧＥＮＡＲＣ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標））、あるいはＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の精製調製、抗血友病因子／フォンヴィレブランド因子合成物（ヒト）ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）およびＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、抗血友病因子／フォンヴィレブランド因子合成物（ヒト）、あるいはＨＹＡＴＥ Ｃ（登録商標）、精製ブタ第ＶＩＩＩ因子、を含むが限定はされない。
【００４９】
フォンヴィレブランド因子は、１×１０６から２０×１０６ダルトンの分子量のマルチマーを形状系の血漿において存在する。ＶＷＦは、哺乳動物の内皮細胞において主に形成され、その後血液循環内へ分泌される糖タンパク質である。この連結において、およそ２２０ｋＤの分子量を有するポリペプチド鎖を根幹として、５５０ｋＤの分子量を有するＶＷＦ二量体が、いくつかの硫黄結合の形成により細胞に生産される。さらに、分子量の増加を伴うＶＷＦのポリマーは、最大２０百万ダルトンまでで、連結によるＶＷＦ二量体から形成される。特殊な高分子ＶＷＦマルチマーが、血液凝固において非常に重要だと推定される。
【００５０】
ＶＷＦ症候群は、ＶＷＦの生産不足または過剰生産のどちらか、またはＶＷＦ（後天的なＶＷＤ）への抑制抗体を伴う自己免疫疾患の際は、臨床的に明らかにする。ＶＷＦの過剰生産は血栓症（血塊の形成または血管内の血栓、血流の閉塞性）を減少し、一方でＶＷＦの高分子形状水準の減少または欠損が出血の増加を引き起こし、血小板凝集の阻害および創縫合に起因する出血時間を増加する。
【００５１】
ＶＷＦ欠乏症は、ＶＷＦが機能的第ＶＩＩＩ因子の必須成分とされて以来、表現型血友病Ａも引き起こす可能性がある。これらの事例において、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血液凝固連鎖におけるその機能が正常に機能しないような限度に減少された。フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）またはＶＷＦ症候群に悩む患者は、欠乏症第ＶＩＩＩ因子を頻繁に示す。これらの患者において、減少された第ＶＩＩＩ因子活性は、Ｘ染色体の遺伝子の欠陥の結果ではないが、血漿におけるＶＷＦの 定量的および質的変化の間接的な結果である。血友病ＡおよびＶＷＤの間の分化は通常、ＶＷＦ抗原の測定またはリストセチン共同因子活性の決定により影響を及ぼされる可能性がある。ＶＷＦ抗原内容物およびリストセチン 共同因子活性の両方は、血友病Ａ患者においてそれらは通常であるのに対して、ほとんどのＶＷＤ患者において低下させられる。ＶＷＦ症候群の治療に対するＶＷＦ製品は、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐあるいは、血漿から濃縮されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦから成る療法であるＩＭＭＵＮＡＴＥ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＩＮＮＯＢＲＡＮＤ（登録商標）および、８Ｙ（登録商標）、を含むが限定されない。
【００５２】
付加的な血液因子は、無制限に第ＩＩ因子（トロンビンとしても当技術分野において知られている）（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００４９７）を含む発明の方法で使用するために修正可能で、血栓症およびプロントロンビン欠乏症を引き起こすような欠損症つまり、出血性素因または活性タンパク質Ｃ抵抗として知られている血栓性素因形状を引き起こす欠損症の第Ｖ因子（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００１２１）、ローザンタールの（症候群（血友病Ｃ）の欠損症を引き起こす第ＸＩ因子（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００１１９）、あるいは第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００１２０）およびサブユニットＢ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿００１９８５）、タイプＩ（欠乏症（ＡおよびＢ両サブユニットにおける欠乏症）あるいはタイプＩＩ（欠乏症（唯一Ａサブユニットにおける欠乏症）を特徴とする欠損症、生涯出血傾向をもたらすどちらか、欠陥品創傷治療、および習慣流産第ＸＩＩ因子（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００４９６）、あるいはタンパク質Ｃ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００３０３）、あるいは抗トロンビンＩＩＩ（核酸データベースのアクセス番号、ＮＰ＿０００４７９）またはそれ自身の活性形状である。
【００５３】
ヒト血液凝固因子の断片、変異体および類似体
血液凝固障害の治療におけるヒト血液凝固因子タンパク質の治療的効果を評価するため、ヒト血液凝固因子ポリペプチドまたは断片の変異体もしくはその類似体は、前述された遺伝子導入のマウスへ投与される。
【００５４】
ポリペプチド断片、変異体または類似体を用意するための方法は、当技術分野において周知されている。ポリペプチドの断片は、酵素的切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン）を無制限に含み、さらに特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を生成するための組み換え手段を用いて用意される。目的の断片をコード化しているポリヌクレオチドを用い、ポリペプチド断片は、リガンド結合ドメイン、ドメインを結びつけている受容体、二重化もしくは多量体化ドメイン、または当技術分野において知られているいずれか他の識別可能なドメインのように、特定の活性を有するタンパク質の領域から成り生成される可能性がある。
【００５５】
ポリペプチド類似体の作成方法は、さらに周知されている。ポリペプチドのアミノ酸配列類似体は、置換、挿入または削除変異体である。ポリペプチドの断片を含む削除類似体は、機能または免疫活性にとって不可欠ではない天然タンパク質の１つ以上の残留物が欠損する。挿入類似体は、ポリペプチドにおいて非ターミナルポイントで原料の添加を含む。これは免疫反応性エピトープまたは単なる単体残留物の挿入を含む可能性がある。
【００５６】
類似体は、派生されるおよびここに記述される血液凝固因子と実質的に同種または実質的に同質である可能性がある。熟慮された類似体は、少なくともいくつかの野生型ポリペプチドの生物活性、例えば、血液凝固活性、を維持するそれらである。
【００５７】
置換類似体は、一般的に１つの野生型のアミノ酸と別のタンパク質内の１つ以上の部位を交換し、ここに記述されるように、他の機能または性質の損失なしに１つ以上のポリペプチドの性質を調節するよう作られる場合がある。一態様において、置換は保守的な置換である。「保守的なアミノ酸置換」とは、類似する化学的特性の側鎖を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換を意味する。保守的な置換を作成するための類似するアミノ酸は、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）、疎水性、脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）、芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、小型側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）、もしくは脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）を有するそれらを含む。
【００５８】
断片および類似体をコード化しているポリヌクレオチドは、自然発生分子に同一または類似する生物活性を所有する自然発生分子の、生物学的に活発な断片、変異体、または類似体をコードする当業者により、ただちに生成される可能性がある。これはＰＣＲ技法、分子をコード化しているＤＮＡの消化などにより行うことが出来る。従って、当業者は、ＤＮＡらせん構造における変化したコドンおよびミスセンス変異をもたらすため、単体の塩基の変化を生成することが出来る。
【００５９】
代表的な血液凝固因子類似体は、例えば、米国特許第６，３４６，５１３号、米国特許第６，３１６，２２６号、米国特許第６，１５６，８８８号、米国特許第６，１３０，２０３号、および米国特許第６，９５８，３２２号においてこれらを参照することにより本書に組み込まれ、記述された。
【００６０】
熟慮されたヒト血液凝固因子変異体は、ユビキチン化、グリコシル化、治療的であるための結合または診断薬のような技法によって、化学的に修正されたポリペプチド、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素と共に）、ペグ化（ポリエチレングリコールとの誘導体化）等の共有結合性のポリマー付属品、非加水分解結合の導入、および通常ヒトタンパク質に発生しないオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換を含む。変異体は、本発明の非修正分子の結合性質を保有する。
【００６１】
ペグ化血液凝固因子類似体の用意は、一般的にポリペプチドがポリエチレングリコール（反応性エステルまたはＰＥＧのアルデヒド誘導体、等）と、結合構造ポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に付着するようになる状況下で反応している（ａ）、および、反応性生物（ｓ）を得ている（ｂ）の段階から成る。概して、アシル化反応のための最適な反応条件は既知のパラメータおよび目的の結果に基づき決定される。例えば、ＰＥＧタンパク質の比率が大きくなるほど、ポリ−ペグ化生成物の割合が高くなる。同一の実施形態において、結合構造はＮ−末端に単体ＰＥＧ部分を有することになる。
【００６２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、長い半減期インビボを提供するため、血液凝固因子に付着される可能性がある。ＰＥＧ基は、いずれの都合の良い分子量のものになる可能性があり、線状または分岐する可能性がある。ＰＥＧの平均分子量は、約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤａまで、約５ｋＤａから約５０ｋＤａまでの範囲、または約５ｋＤａから約１０ｋＤａまでにおよぶ。ＰＥＧ基は、アシル化または還元的なアルキル化を介し、自然または改変反応基を通し、ＰＥＧ部分（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）上で、血液凝固因子（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）上の反応基へ、もしくはいずれかの当技術分野において知られている他の技法により、血液凝固因子へ付着される。
【００６３】
本発明の方法において有効であるポリペプチド変異体は、ポリシアル酸（ＰＳＡ）部分から成るポリペプチドを含む。ポリシアル酸ポリペプチドを用意するための方法は、米国特許公開２００６０１６０９４８およびＳａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：４２−５１、２００６において記載される。
【００６４】
本発明の方法における使用のためのヒト血液凝固因子は、ポリペプチドである第２物質で融合タンパク質を含むことは、さらになお熟慮される。一実施形態において、無制限のポリペプチドである第２物質は、酵素、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞−表面受容体、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、細胞粘着分子、もしくは断片、または前述されるタンパク質の活性ドメインである。関係のある実施形態において、第２物質は第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子およびフォンヴィレブランド因子のような血液凝固因子である。熟慮された融合タンパク質は、当技術分野において周知される化学または組み換え技法により作成される。
【００６５】
組み換えＶＷＦ
有用なｒＶＷＦの一形成は、少なくともインビボ−安定化の性質を有する、例えば、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子の結合、および、薬理学上許容可能であるグリコシル化パターンを随意的に有する結合。その具体例は、それによってタンパク質分解（Ｌａｎｋｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１００８−１０１３、１９９７）に耐性を示すＡ２ドメインなしに、糖タンパク質ｌｂ−結合ドメインおよびコラーゲンおよびヘパリン（Ｐｉｅｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：１３３９−１３４７、１９８９）のための結合部位を含むＶａｌ４４９からＡｓｎ７３０までのＶＷＦ断片およびＶＷＦを含む。少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を安定させるＶＷＦの能力の決定は、当技術分野で述べられる周知された方法によると、ＶＷＦ−欠乏哺乳動物において実施される。
【００６６】
本発明において有用であるｒＶＷＦは、当技術分野において知られているいずれかの方法により生成される場合がある。一具体例は１９８６年１０月２３日に公開されたＷＯ８６／０６０９６において開示され、産生組み換えＶＷＦの方法に関して１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願第０７／５５９，５０９号を参照することにより本書に組み込まれる。従って方法は当技術分野において、（ｉ）遺伝子工学による組み換えＤＮＡの産生、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅の経由、（ｉｉ）導入による原核または真核性細胞への組み換えＤＮＡの導入、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによる経由、（ｉｉｉ）上記変型細胞の培養、例えば持続的またはバッチ式様式における、（ｉｖ）発現ＶＷＦ、例えば構造的または誘導上で、および、（ｖ）孤立的上記ＶＷＦ、例えば培地からまたは変型細胞の収穫によるもの、（ｖｉ）精製ｒＶＷＦを得るために、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィー経由、として知られる。組み換えＶＷＦは、当技術分野において周知されている組み換えＤＮＡ技法を用いて、変型宿主細胞で作成されることがある。例として、ポリペプチドをコードする配列は適切な制限酵素を用いてＤＮＡから削除され得る。
【００６７】
あるいは、ＤＮＡ分子はアミド亜リン酸法のような化学合成技法を用いて合成される。さらに、これら技法の組み合わせは使用され得る。
【００６８】
投与のための血液凝固因子組成物
ここで記述される血液凝固因子ポリペプチド（断片、類似体または、変異体を含む）を被験対象へ投与するため、血液凝固因子ポリペプチドは１つ以上の薬学上許容可能な輸送体から成る組成物に調剤される。「薬学上または薬理学上許容可能」という表現は、下記に記述するように当技術分野において周知されている経路を用いて投与する際に、アレルギー、または他の拒絶反応を引き起こさない分子的実態および組成物に言及する。「薬学上許容可能な輸送体」は、いずれのおよび全ての臨床的有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌性および抗真菌性物質、等浸透圧ならびに物質が遅延する吸収およびそのようなものを含む。
【００６９】
その上、化合物は水または共通有機溶媒と反応して溶媒和物を生じる可能性がある。このような溶媒和物は同様に熟慮される。
【００７０】
血液凝固因子組成物は様々な態様において、経口的、局所的、経皮的、非経口的、吸入噴霧によるもの、経膣的、直腸的、または頭蓋的注射によって投与される。ここで使用されるように非経口な用語は、皮下注射、静脈、筋肉内、嚢内注射、または融合技法におけるものを含む。静脈、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射および／または特定の部位の外科的移植による投与は、よく熟慮される。通常、組成物は受容に有害となり得る他の不純物と同様に原則的にピロゲンが含まれない。
【００７１】
薬剤組成物の調合は、（例えば、溶液、乳剤）を選ばれた投与の経路によって変化するであろう。投与されるその組成物から成る適切な組成物は、生理的に許容可能な媒体または輸送体で用意される。適切な輸送体である溶液または乳剤として、例えば生理食塩水および緩衝媒体を含む、水性もしくはアルコール／水性溶液、乳剤または懸濁液を含む。非経口の媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油を含むことが出来る。静脈媒体は、様々な添加物、防腐剤、もしくは液体、栄養素または電解質補給を含むことが出来る。
【００７２】
活性成分として血液凝固因子から構成される本発明のその方法において有用である薬剤組成物は、様々な態様において、投与の経路によって薬学上許容可能輸送体または添加物を含む。このような輸送体または添加物の例は、水、薬剤的に許容可能な有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンゴム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学上許容可能な界面活性剤およびそのようなものを含む。使用された添加物は、本発明の投与形態によって適切なものとして上記またはその組み合わせから選ばれるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
種類豊富な水性輸送体、例えば、水、緩衝用水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、または水性懸濁液は、様々な態様において、水性懸濁液の製造に適している賦形剤で、混合剤において活性化合物を含む。このような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムの懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は自然発生リン脂質であることがある、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばポリオキシエチレンステアリン酸塩、またはエチレン酸化物と長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような脂肪酸およびヘキトールから誘導されたエチレン酸化物と部分的エステルとの縮合物、または脂肪酸およびヘキトール無水物から誘導されたエチレン酸化物と部分的エステルとの縮合物、例えばポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。水性懸濁液は、さらに１つ以上の防腐剤、例えばエチル、またはパラオキシ安息香酸であるｎ−プロピルを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、血液凝固因子組成物は保管のため凍結乾燥し使用するため適切な輸送体プライアーで再構成される。この技法は慣習の免疫グロブリンにおいて有効なであることが示された。いずれの当技術分野において知られている適切な凍結乾燥および再構成技法は採用される。当業者によって凍結乾燥および再構成が抗体活性の損失度の変化につながり、それらを相殺するため使用レベルを調整しなければならないようになると認められる。
【００７５】
水の添加による水性懸濁液の調製に適する分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の防腐剤との混合において活性化合物を生じる。適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤は、それら既に前述したものにより例示される。
【００７６】
ある実施形態において、これら調合における血液凝固因子の濃度には大きな差がある、例えば通常は約０．５％より少ない、または少なくとも約１％から１５または２０％と同程度まで重量で、また特定の選択される投与方法に従って液量、粘着性等に優先して基づき選択される。従って、例えば、無制限に、非経口の注射の代表的な薬剤組成物は、１ｍｌ滅菌緩衝用水、および５０ｍｇの血液凝固因子を含んで作られる。静脈注入のための代表的な組成物は、２５０ｍｌ滅菌リンゲル溶液、および１５０ｍｇ血液凝固因子を含んで作られることが出来る。非経口的投与可能な組成の用意における実際的方法は知れているまたは当業者に明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８０）においてより詳細に記載される。二重特異性抗体の効果的な投与量は、１回の投与、体重１ｋｇにつき０．０１ｍｇから１０００ｍｇの範囲内にある。
【００７７】
様々な態様において、薬剤組成物は、滅菌注射用溶液または分散の即時調製のため、滅菌注射用な水性、油性懸濁液、分散または滅菌粉末の形式である。懸濁液はそれら適切な分散剤または湿潤剤および前述された懸濁化剤を使用していると知られている当技術分野に従って調合される可能性がある。滅菌注射用調製は、さらに非毒性非経口的許容可能な希釈剤または溶媒における滅菌注射用溶液または懸濁液は、例えば１、３−溶液としてブタンジオールにある、という可能性がある。いくつかの実施形態において、輸送体は溶媒または分散の、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールのような）、適切なその混合物、植物油、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液、培地である。その上、滅菌、固定油は溶媒または懸濁化剤として従来的に採用される。この目的のため、いずれの無菌性の固定油は合成モノまたはジグリセリドを含んで採用される可能性がある。加えて、オレイン酸のような脂肪酸注射用の調製において使用することが出来る。
【００７８】
全ての場合において、形態は滅菌されなくてはならず、かつ容易に注射可能な存在である範囲になければならない。適した流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合において要求された粒径の維持により、および界面活性剤の使用によって、言及される。それは製造および保管の状況下で安定的でなければならなく、バクテリアおよび菌類のような微生物の活動の汚染に対し維持されなければならない。微生物の活動の防止は、様々な抗菌性および抗真菌性物質によってもたらされる、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど。多数の場合において、例えば糖または塩化ナトリウムといった等張剤を含むのが望ましい。ある態様において、注射用組成物の持続性吸収は吸収を遅延する物質の組成物における使用によってもたらされる、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン。
【００７９】
投与に有用な組成物は、それら有効性の増長のため摂取または吸収エンハンサーでの調合である可能性がある。このようなエンハンサーは、例えばサリチル酸塩、グリココール酸塩／リノール酸塩、グリコール酸塩、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプリン酸などを含む。例としてＦｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８５：１２８２−１２８５、１９９６）およびＯｌｉｙａｉならびにＳｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２：５２１−５４４、１９９３）を参照。
【００８０】
その上、このような均衡が欠損している他の組成物が実質上実用性にかける一方、インビトロおよび特にインビボの用途の両方に対するそれら実用性の増強し、組成物の親水性および疎水性の性質、もしくはその方法における使用を熟慮したため、この発明は均衡が取れたものである。具体的に、本発明における使用のため熟慮された組成物は、体内における吸収および生体利用効率を可能にする水性媒体での溶解の適した程度を有し、その一方で化合物が活動の推定部位に細胞膜を横切ることを可能とする脂質での溶解度の程度を有する。
【００８１】
組み換えＶＷＦの調合は共有のＰＣＴ／ＵＳ０８／８８２０１およびＰＣＴ／ＵＳ０８／０６２９１において開示され、これを参照することで本書に組み込まれる。
【００８２】
血液凝固因子ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの調製
タンパク質産生の発現のためのベクター構造の要素は、当業者で知られている。血液凝固因子ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、発現するよう作動的にヌクレオチド配列に関係している発現制御配列から成る組み換えポリヌクレオチドから成る発現ベクターにおいて発現する。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞もしくはインビトロ発現システムによって供給され得る。発現ベクターは、無制限のコスミッドを含んで全ての当業者を含み、プラスミド（例えば、剥き出しのまたはリポソームに含まれる）および組み換えポリヌクレオチドを合体するウイルスを含む。発現ベクターは、当技術分野において知られる技法を用いた形質転換または導入によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のため、（例えば、形質転換または形質導入を経由して）適切な宿主細胞に挿入される。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照。
【００８３】
形質転換は、有機体に従って、有機体の細胞およびその生態のもの特質上で種類豊富な知られている技法によって実施される。安定した形質転換は、細胞へのおよび細胞核へのＤＮＡ侵入を引き起こす。単体細胞（いくつかの哺乳動物を含む）より再生される有機体のため、形質転換はインビトロ培養において実施され、形質転換細胞の選択および形質転換細胞の再生が続く。ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への転送のためしばしば使用される方法は、マイクロインジェクション、パーティクルガン衝撃、陽イオン性脂質でのＤＮＡまたはＲＮＡ合体の形成、リポソームまたは他の輸送体原料、エレクトロポレーション、およびＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスベクターへの転入の組み込みを含む。他の技法は当技術分野において知られる。ＤＮＡの細胞核への転写は細胞過程によって起こり、細胞内のトランスポーゼースまたはリコンビナーゼによる上で作用する融合部位配列を含むことにより時には適切なベクターの選択によって促進し得る。（例として、［Ｃｒａｉｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８，２２：７７； Ｃｏｘ．Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，ｅｄｓ．） １９８８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐａｇｅｓ ４２９−４９３； Ｈｏｅｓｓ．Ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ｅｄｓ．） Ｖｏｌ．４，１９９０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ、ページ９９〜１０９を参照。
【００８４】
発現ベクターおよび核酸はいくつかの態様において血液凝固因子を発現するために使用され、組織特異的プロモーターを含む。このようなプロモーターは当技術分野おいて知られるおよびそれを含むが、肝臓特異的プロモーター（例えば、アルブミン； Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１：５１２４−３２，１９９７； α−ｆｅｔｏタンパク質）、筋特異的プロモーター（例えば、ミオシン軽鎖１（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：４０３−１０，１９９７，α−ａｃｔｉｎ）、膵臓特異的プロモーター（例えば、インスリンまたはグルカゴンプロモーター）、神経特異的プロモーター（例えば、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターまたは神経特異的エノラーゼプロモーター）、内皮細胞特異的プロモーター（例えば、フォンヴィレブランド因子；Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１４８３−９０，１９９６）および平滑筋細胞特異的プロモーター（例えば、２２ａ； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１００６−１４，１９９７）に限定されるものではない。他の組織特異的プロモーターは、ヒトアロマターゼシトクロムから派生される脂肪組織プロモーターであるチロシナーゼ特異的プロモーター（Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２：７８９−９５，１９９８）を含でいる、発展途上にある癌療法においてさらに使用されるプロモーターを含むｐ４５０（ｐ４５０ａｒｏｍ）（米国特許第５，４４６，１４３号；Ｍａｈｅｎｄｒｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９４６３ １９４７０，１９９３；ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：３１７ ３２４，１９９３）。プロモーターが内因性血液凝固因子プロモーターであることはさらになお熟慮される。本発明のその方法において有用であるベクターおよび他の核酸分子は、導入遺伝子の一時的な発現に限る配列をさらに含むことが出来る。例えばプロモーターにおいてｃＡＭＰ反応要素エンハンサーを含むおよびｃＡＭＰ修正剤で移入または感染細胞を処理することを含むことにより、例えば導入遺伝子は薬剤誘導プロモーターで制御される（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１８８３−９３，１９９６）。あるいは、リプレッサー要素は転写薬剤の存在における転写を防ぐことが出来る（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：３３３９−４３，１９９７）。発現の空間的な制御は、エルグ１遺伝子プロモーターとの結合においてイオン化放射（放射線治療）を使用することによりさらに達成されている（Ｓｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５５６１−５，１９９５）。
【００８５】
ヒト血液凝固因子をコード化している組み換え核酸構築物は、増幅のためいずれの適したプラスミド、バクテリオファージ、またはウイルス性のベクターへ挿入され、それによって、分子クローニング実習マニュアル，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）で記載されたそれらのように、当技術分野において知られている方法を用いて繁殖させる。一実施形態において、脊椎細胞のような真核性細胞と適合する発現ベクターは用いられる。真核性細胞発現ベクターは、当技術分野において周知され、商業的供給源から入手可能である。熟慮された発現ベクターは、原核配列（バクテリアにおけるベクターの伝播を促進するため）、および１つ以上の細胞における機能性である真核性転写単位の両方を含む。概して、このようなベクターは目的の組み換えＤＮＡ分子の挿入のため便利な制約部位を提供する。ベクターに派生したＰｃＤＮＡＩ、ｐＳＶ２、ｐＳＶＫ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＰＶＶ−１／ＰＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ番号３１２５５）は、非ヒト細胞の導入に適切な哺乳類発現ベクターの例である。いくつかのこれらベクターは、配列でｐＢＲ３２２のようなバクテリアプラスミドから、複製の促進もしくは原核および真核性細胞における薬剤抵抗選択へ修正される。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）のようなウイルスの誘導体、またはエプスタイン・バーウイルスウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）は、豚細胞におけるタンパク質の発現のため使用される。プラスミドの調整および宿主細胞の形質転換において採用される様々な方法は、当技術分野において周知さている。本発明において有用であるための他の適切な発現システムのため、通常の組み換え手順と同様に、分子クローニング実習マニュアル，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）を参照のこと。
【００８６】
レトロウイルスベクターからの効果的な発現は、ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーターのような「強力な」プロモーターが転写の制御に使用される際、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ ７：２６４，１９８９における再調査のように観測される。これらのプロモーターは、構成的でありおよび組織特異的発現を通常可能にしない。他の適切なプロモーターは、ここで詳述される。
【００８７】
パッケージング細胞株の使用は、産生した組み換えウイルスの有効性および伝染力を増大させる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５．Ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃを参照、またはＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：６６３あるいはＧｒｉｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．３：１６２，１９８７およびｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓを参照、例えばＬｅｍｉｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：９１７−９２７，１９８６； Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：１６５−１７０，１９８６を参照のこと。
【００８８】
以前の可能性より高いウイルスタイターの獲得を可能にする追加的なレトロウイルス技術は、同種指向性および両種性間のパッケージング細胞株の継続的な転写による増幅を含み、「ピンポン」方法と言われる、例えばＫｏｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３５００−３５０８，１９９０あるいは、例えばＢｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３１９：５８９−６００，１９８９を参照。その上、ウイルスタイターを増加させる技法は、効果的な形質導入を達成するために、ウイルス産生細胞株での直接的なインキュベーションよりむしろウイルスを含む上澄みの使用を可能とする、例えば、Ｂｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３１９：５８９−６００，１９８９を参照。通常のＤＮＡの複製はレトロウイルスベクターの宿主ゲノムへの統合に必要であるため、活発な循環である目的の幹細胞での頻度を増加させることが望ましい可能性がある。例えば、目的の細胞をインビトロでの治療による成長因子での分裂へ促すこと、例えば、Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：９１７−９２７，１９８６あるいは、Ｂｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：８８９７−８９０１，１９８９，ｏｒ ｔｏ ｅｘｐｏｓｅ ｔｈｅ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｔｏ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、あるいは、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４ Ｓｕｐｐｌ．１：４５７−４６３，１９８４を参照。
【００８９】
遺伝子導入動物調製
一般に、本発明の遺伝子導入動物は、ヒト以外の変形可能種をどれでも含有する。特に注目されるのは哺乳動物で、マウス、ネズミ、ラビット、ヒツジ、ハムスター、アレチネズミ、モルモットおよびブタ、あるいはウシおよび非ヒト霊長類を含む、形質転換方法として開発された他のような周知の変形可能な種を含む。
【００９０】
ある態様において、本発明の導入遺伝子動物は、複数の内因性血液凝固因子、特殊な因子ＶＩＩＩおよびフォンヴィレブランド因子の発現を防止するために、一般的に変更される。本発明の遺伝子導入動物は、少なくともある異質な遺伝子をゲノムに挿入され、例えば、ヒトＶＷＦが２重のノックアウトマウスＦＶＩＩＩ／ＶＷＦへ挿入され、一般的に修正された動物であるというさらなる意図がある。これらの動物は、系統的および他の研究システムで成功可能でない特殊な方法において、細胞水準での調節作業で研究されるおよび影響されることを許可する。
【００９１】
記載されている種類の遺伝子導入動物は、治療的血液凝固因子の投与でのインビボ効果を分析するために有用であり、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）を含むが限定されない。遺伝子導入動物は、推定耐性宿主免疫システムの関係において、抗自己抗体の発達の原因に対する、化合物、つまり精製された凝固タンパク質またはそれらの変異体、の効果を評価するための優れたモデルとして役目を果たす。そのような理解は、血液凝固障害の治療のための病因を考案および試験に必須であり、血友病、フォンヴィレブランド症候群および同類のものを含むがそれに限定されない。
【００９２】
本明細書で熟慮されたように、導入遺伝子発現ヒトポリヌクレオチド配列は、自然調節（発現調節）配列によりヒト血液凝固因子の側面に位置するため、または異種配列と関連するための、プロモーター、内部リボソーム参入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結束部位配列、エンハンサー、反応要素、化膿、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コード化領域あるいは同類のものを含むコード配列（例えば、ｃＤＮＡ、合成コード配列またはゲノムＤＮＡ）から成る。コード配列が、当技術分野において知られている多くの手段によって修正されることを意図している。そのような一時的変異の非制限例は、メチル化、「キャップス」、類似体を伴う自然発生のヌクレオチドの１つ以上の置換、あるいは、例えば、それらの非荷連鎖（例えば、メチルホスホン酸塩、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩、等）との、および荷電連鎖（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等）との、のようなヌクレオチド間の一時的変異を含む。遺伝子発現の制御は、当技術分野において周知の様々な手段によって完成された。導入遺伝子の発現は、周知の手段による、あるいは、一連の与えられた状況、例えば、与えられた化合物の存在、あるいは特定の実体、あるいは組織種類または温度のような環境条件においての変化に応答するという、概してプロモーターの選択による誘導または抑制を構成するまたは調節する。用語「誘導発現」は、宿主有機体のための利便性および妥当性に基づいて選択された手段および状況である定義された状況のもと起こる遺伝子発現を引き起こすためのいかなる手段におよぶ。
【００９３】
ある態様において、導入遺伝子は組み換えタンパク質の発現に対し前述されたプロモーターに関係すると熟慮される。
【００９４】
様々なＥＳ細胞が派生されるマウス系統の遺伝的背景は、亜系統１２９／Ｓｖおよび１２９／Ｓｖ−ＣＰ（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：８４２４−８，１９９３）の交配種からのマウス胚盤胞腔を起源とするマウス系統１２９：Ｒ１細胞を起源としているＥＳ細胞を含んだ当技術分野において知られており、ＧＳ１細胞は１２９／Ｓｖ／Ｅｖを起源とする。Ｄ３−細胞（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−８，１９８７）およびＪ１細胞は、１２９／Ｓｖまたは１２９／ｔｅｒＳｖを起源とする。さらにＥＳマウスを生じるＴＴ２細胞はＦ１交雑種（Ｃ５７ＢＬ／６ ｘ ＣＢＡ）を起源とする（Ｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：７０−６，１９９３）。
【００９５】
遺伝子導入動物、特にマウスまたはラットの創造のための技術は、広く知られている（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ １１５：１７１−２２９，１９８９）。導入遺伝子を導入するための、核酸の細胞へのマイクロインジェクション、レトロウイルスベクター法、および胚幹細胞への遺伝子移動を含む様々な手段が利用可能である。受精卵母細胞が遺伝子導入を評価するために使用される場合、目的の外来ＤＮＡまたは導入遺伝子が卵母細胞に組み込まれる。導入遺伝子の卵母細胞への組み込みは、適用レトロウイルスベクターなどのいくつかの方法、またはマイクロインジェクションによって行われる。遺伝子導入マウスは、Ｌｅｄｅｒらへ発行された米国特許第４，７３６，８６６号において記載されるように、またＢ．Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｎｔｉｔｌｅｄ “Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）において提供されるように、妊娠マウスから分離された胚盤胞腔へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって、先行技術において日常的に生成される。例えば、Ｈａｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２４５−２８１，１９９９； Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６６（３）：７２９−７３４，１９９９； Ｉｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｄ．，６０：９９−１３１，１９９９； Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２１：１５７−１７８ １９９７も参照。米国特許第６，４９２，５７５号は、胚幹細胞の変換によって遺伝子導入マウスを作製し、その変換細胞を４倍体胚盤胞腔に注射するための方法を説明する。同胞ヘテロ接合体を異種交配することによって、目的の遺伝子を持った同型の動物が得られる。
【００９６】
さらに、Ｃａｐｅｃｃｈｉらは、導入遺伝子が胚、胎児、または成体多性能幹細胞に組み込まれる方法を説明する（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２，１９９１）。この方法においては、胚幹細胞は、インビトロ培養された胚盤胞腔から分離される。これらの胚幹細胞は、分化なしに何細胞世代にもわたる培養において安定が保たれる。導入遺伝子は、その後エレクトロポレーションまたは他の形質転換方法によって、胚幹細胞に組み込まれる。導入遺伝子を持つ幹細胞は、胚盤胞腔の内細胞塊用に選択され、注射される。胚盤胞腔は、その後偽妊娠した雌に移植される。胚盤胞腔の全ての内細胞塊が導入遺伝子を持つわけではないため、その動物は導入遺伝子に対してキメラである。キメラ動物の異種交配は、導入遺伝子を持つ動物の生産を可能にする。その過程の概説はＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９８９，５：７０−７６により提供される。
【００９７】
導入遺伝子の送達は、レトロウイルス送達システム、例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２４１：１９，１９８８参照、によって行われる。一態様において、レトロウイルス構造は、ウイルスの構造遺伝子が単一遺伝子によって置き換えられ、その後ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）に含まれる調節要素の支配下で書き換えられるものである。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）を含む、様々な種類の単一遺伝子−ベクター骨格が使用される。一実施形態において、内部プロモーターの支配下で選択可能なマーカーのための遺伝子および当該の第二遺伝子のような異なる遺伝子の反復挿入を可能にするレトロウイルスベクターは、この種の骨格から派生される。例えば Ｇｉｌｂｏａ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２４１：２９，１９８８を参照。
【００９８】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の動物への導入時に、導入遺伝子が内因性遺伝子へ挿入されるため、内因性遺伝子の機能をノックアウトするということが、熟慮される。他の実施形態において、外因性遺伝子は、内因性遺伝子の発現が維持されるような位置において動物ゲノムへ挿入される。こうして、遺伝子導入動物は、動物に挿入されるヒト導入遺伝子ポリヌクレオチドに対応する全てまたは一部の内因性ポリヌクレオチドを発現する可能性がある。
【００９９】
外因性血液因子の投与
ここでヒト血液凝固因子と共に記載される条件を治療するための方法に含まれる投与計画は、薬の作用を変化させる様々な因子、例えば患者の年齢、条件、体重、性別、および食習慣、感染の重症度、投与時間および他の臨床学的因子を考慮して、担当医によって決定されるだろう。例として、本発明において有益な組み換えＶＷＦの投与量は、およそ５０Ｕ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇに等しく、およそ７５Ｕ／ｋｇ、およそ１００Ｕ／ｋｇ、およそ１５０Ｕ／ｋｇ、およそ２００Ｕ／ｋｇ、およそ２５０Ｕ／ｋｇ、およそ３００Ｕ／ｋｇ、およそ３５０Ｕ／ｋｇ、およそ４００Ｕ／ｋｇ、およそ４５０Ｕ／ｋｇもしくはおよそ５００Ｕ／ｋｇ、または対応するμｇ／ｋｇもしくはｍｇ／ｋｇである。
【０１００】
ある実施形態において、本発明の形状は、初回ボーラス投与によって投与され、その後に薬剤の治療的循環レベルを維持するための継続的な注入が続く。別の例として、本発明の化合物は、単回投与として投与される。当業者は、良い医療業務および各患者の病態によって決定された効果的な投与量および投与計画を、容易に最適化する。投与の頻度は、薬剤の薬物動態のパラメータおよび投与経路によって決まる。製剤は、投与経路および目的の投与量によって当業者により決められる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）１４３５から１７１２ページ、参照することによりここに組み込まれる開示を参照。このような形状は、投与物質の物理的状態、安定性、インビボ放出割合、およびインビボクリアランスの割合に影響する場合がある。投与経路次第で、適切な投与量が、体重、対表面積または器官の大きさによって計算される可能性がある。適した投与量は、適切な投与量−反応データと併せて、血液レベルの投与量を決定するための確立されたアッセイの使用を通して究明される可能性がある。最終投与計画は、薬の作用を変える様々な因子、例えばその薬の特異性活性、患者の損傷および反応の重症度、患者の年齢、状態、体重、性別および食習慣、感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的因子を考慮して、担当医により決定されるだろう。研究が実施されるにつれ、適切な投与量レベルならびに様々な疾病および条件のための治療の持続期間に関するより詳しい情報が明らかになるだろう。
【０１０１】
キット
追加態様として、本発明は、外因性血液因子の患者への投与のための、被険対象への投与のための使用を容易にする方法で包装された、１つ以上の製剤からなるキットを含む。一実施形態において、このようなキットはここで説明される製剤（例えば治療的タンパク質またはペプチドからなる組成物）から成り、その容器に貼られるまたはパッケージに含まれるこの方法を使用する際にその化合物または組成物の使用を説明する標識と共に、密閉ビンまたは密閉容器などの容器に包装される。一実施形態において、その製剤は、その容器中の頭部の空間の量（例えば、液体と容器の上部との間の空気量）がかなり小さいような容器に梱包される。好ましくは、その頭部空間の量がごくわずか（つまり、ほとんどない）である。一実施形態において、そのキットは、治療的タンパク質またはペプチド組成物を有する第１の容器、および組成物に対して生理的に受容可能な再構成溶液を有する第２の容器からなる。一態様において、その製剤は、ユニット剤形に包装される。そのキットは、特定の投与経路によって製剤の投与に適切な装置を含む可能性もある。好ましくは、キットは、製剤の使用を説明する標識を含む。
【０１０２】
以下の実施例は、非制限実施例とする意図はなく、本発明の特定の実施形態の例示である。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスに対する外因性ＶＷＦの効果
ヒト血友病Ａおよびフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）のマウスモデルは、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦの薬物動態的、薬力学的、および免疫学的研究に使用されている。ＦＶＩＩＩ欠損マウスは、ＦＶＩＩＩタンパク質が欠損しているが、ヒトＦＶＩＩＩとの併用でヒトＶＷＦとは異なった相互作用がある可能性のある、内因性マウスＶＷＦの正常なレベルを持っている。従って、ＦＶＩＩＩ欠乏症およびネズミＶＷＦの代わりにヒトＶＷＦを有するマウスモデルは、血友病の研究に有利となるだろう。血友病におけるヒトＶＷＦの効果を研究するために、遺伝子導入マウスの系列が、マウスの内因性ＦＶＩＩＩとＶＷＦ（ＦＶＩＩＩｘＶＷＤ）の両方における欠損に基づいて構築された。
【０１０４】
ヒトＶＷＦの静脈注射は、これらの動物における比較的短いヒトＶＷＦ インビボの半減期のため、徐々にＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ共欠損マウスをＶＷＦの正常循環レベルへ戻すために効果的な方法ではない（およそ５時間）。そのため、ヒトＶＷＦの投与の代替方法が開発された。
【０１０５】
高分子量ヒトＶＷＦは、これらの経路が欠損動物におけるＶＷＦの血漿レベルの回復において効果的であるかを究明するために、ＦＶＩＩＩｘＶＷＤマウスの腹腔内または皮下に注射された。マウスはｒＦＶＩＩＩおよびＶＷＦを共同発現しているＣＨＯ細胞から精製された組み換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を用いて治療された（Ｔｕｒｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈaｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ，２００９（ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）； Ｐｌａｉｍａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２７：３９５−４０３，２００１； Ｐａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １１：４９２−６，２００５； Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ．３：５５５−６５，２００７）。ｒＶＷＦ製品の開始原料は、Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ ＶＳ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＤ，Ｌｉｅｓｎｅｒ ＲＪ，Ｈｅｒｎaｎｄｅｚ Ｎａｖａｒｒｏ Ｆ，Ｗａｒｒｉｅｒ Ｉ，Ｓｃｈｒｏｔｈ ＰＣ，Ｓｐｏｔｔｓ Ｇ，Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ ＢＭ； ｒＡＨＦ−ＰＦＭ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ａｌｂｕｍｉｎ−ｆｒｅｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８； ６：１３１９−２６に記載のように、市販用ｒＦＶＩＩＩ製品ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の製造過程の中間体であった。
【０１０６】
マウスは、ヒトＶＷＦを腹腔内に４００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇ体重（１０ｍｌ／ｋｇ）で注射され、また最初の注射から９時間後に再注射された。製剤緩衝材が、制御装置として使用された。血液は、初回腹腔注射後、２、６、９、１１および２３にて（ｎ＝５）心臓穿刺により治療および対照動物から収集された。ＶＷＦ血漿レベルは、２つの多クローン性抗ＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定され、オルトフェニレンジアミンカラー現像を用いて現像された（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【０１０７】
腹腔内注射後２時間のマウス血漿において見られるＶＷＦ抗原のレベルは、１．７±０．９ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌ（図１Ｂ）の平均値を示し、腹腔内注射されたＶＷＦの１７％の血漿回復を示した。ｒＶＷＦの２回目の注射（９時間での）は、平均ＶＷＦ：Ａｇ値を２．１ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌへ増加させた。注射後２３時間においては、まだ測定可能なおよそ１．１ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌの循環ＶＷＦ：Ａｇの値があった。この研究は、２時間および９時間の同じ治療間隔で、より低い投与量２００Ｕ／ｋｇで繰り返された。より低い投与量で検証された血漿ＶＷＦ：Ａｇのレベルは、より高い投与量で見られるものよりおよそ３倍低く、およそ１２％の血液循環（図１Ａ）における回復を表した。
【０１０８】
驚くべきことに、血液循環において見られるＶＷＦは、注射されたＶＷＦ素材のマルチマーパターンに匹敵する無損傷マルチマーパターンを示した。マウスの治療に使用されたｒＶＷＦは、より低い二重体および対応分解帯の量を示したが、それでも９時間後に減少および分解され始めた高分子量マルチマーを有するマルチマーパターンを有していた（図２）。
【０１０９】
実験は、しばしば血友病患者の治療に使われる血漿派生ＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ）が、マルチマーを循環するため検出可能であるかを究明するために実施された。マウスは、２回のｐｄＶＷＦ腹腔内注射を用いた上記と同様の治療により治療され、ＶＷＦのレベルは上記のように測定された。組み換えＶＷＦを用いて検証した結果、ｐｄＶＷＦの注射は、ＶＷＦ抗原レベルを循環、および注射されたタンパク質のマルチマーパターンと同様の無損傷マルチマーをもたらした（図３および４）。
【０１１０】
これらの結果は、組み換え、血漿派生を問わずヒトＶＷＦは、早ければ腹腔内注射後２時間および遅ければ注射後２３時間のＦＶＩＩＩｘＶＷＤマウスの血液循環において検出可能であることを示す。従って、ＶＷＦの腹腔内注射は、腹腔内注射を、ＶＷＦ療法を受けている患者にとってより良い治療の選択肢にし、同溶液の静脈注射よりも長いインビボ半減期を実証する。
【０１１１】
実施例２
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤノックアウトマウスへのＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の投与
無損傷ＶＷＦマルチマーがｒＶＷＦまたはｐｄＶＷのＶＷＦ欠損マウスへの腹腔内注射後に観察されたということの発見は、ヒトｒＦＶＩＩＩとｒＶＷＦの複合体が、腹腔内注射によって同様の結果をもたらし投与され得るかどうかの調査につながった。
【０１１２】
それぞれ２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇと２００ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇの組み合わせたものが、上記の記載と同様の治療間隔で腹腔内に投与された。上記血液の分析は、循環ＶＷＦ：Ａｇのレベルが、ＶＷＦ単体で治療された動物と同様に、２４時間にわたり検出可能であったことを実証した（図５）。同じ時点で測定されたＦＶＩＩＩレベルは、ＦＶＩＩＩが３時間後に０．１±０．６単位／ｍｌで検出可能であり、９時間までこのレベルを維持したことを示した。ＦＶＩＩＩは、２４時間後には検出可能でなかった（図６）。これらの実験のために、腹腔内注射後のＶＷＦの回復は、ＦＶＩＩＩ回復がおよそ５％であったのに対し、注射された物質のおよそ１２％であった。繰り返し実験において、血液レベルは、４８時間まで測定された。２４時間まで見られたＦＶＩＩＩおよびＶＷＦレベルは、前の実験と同様であったが、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦは、４６時間以降の血液循環において検出可能ではなかった（図７）。
【０１１３】
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトは、また、２００ＩＵ ｒＦＶＩＩＩ／ｋｇと２００ ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇを含む複合体の皮下注射によりｒＶＷＦまたはＦＶＩＩＩを投与された。皮下注射後、循環ＶＷＦ：Ａｇレベル（０．１４ＶＷＦ：Ａｇ単位／ｍｌ）においてわずかな増加があった（図１）。対応するＦＶＩＩＩレベルは低かったが、注射６時間後において検出可能（０．０４単位／ｍｌ）であった（図６）。
【０１１４】
これらの結果は、静脈または皮下注射よりも血液循環においてより良い回復を明示する腹腔内注射が、大きなＶＷＦ分子の投与に良好な経路であることを実証する。腹腔内注射は、ヒト種における薬理学的研究において、小分子薬の投与に広く使用されているが（例、エリスロポエチンの腹腔内注射）、タンパク質の腹腔内注射、特に大型ＶＷＦマルチマーは、現在まで調査されていなかった。多量体ＶＷＦの大きな分子量のため、タンパク質が、腹腔内注射後のマウスの血液循環において無傷で回復されるであろうことは予期されていなかった。これは、この大きな多量体タンパク質が、大きなＶＷＦタンパク質の構造と機能を維持しながら、中皮腫を通って脈管構造に運ばれることを示す。これは、ヒトＶＷＦの循環を用いた血友病の研究に対する新しい取り組みを提供するｒＶＷＦの脈管構造への運搬能力を新たに発見した。
【０１１５】
実施例３
ＦＶＩＩＩｘＶＷＤノックアウトにおける血液凝固への外因性ヒトＶＷＦの評価
ヒト血友病と同様に、ＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスは、出血症状を伴う傾向を示す。外因性ヒトＶＷＦのＦＶＩＩＩｘＶＷＤダブルノックアウトマウスへの投与は、腹腔内、およびより狭い範囲の皮下へのｒＶＷＦまたはｐｄＶＷＦの注射が、ＶＷＦが脈管構造へ運ばれ、血液循環において検出可能な活性を示すことを可能にすることを実証した。この検証は、外因性ＶＷＦが、血管負傷の部位へ血小板を引き付けること、血小板相互作用を仲介すること、および血液循環における第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を安定させることを含む、特徴的なＶＷＦインビボ活性を恐らく示す（Ｐｌａｉｍａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２７：３９５−４０３，２００１）。
【０１１６】
コラーゲンは、ＶＷＦの生理学的結合パートナーである。Ｋｅｓｓｌｅｒらによる研究（Ｂｌｏｏｄ ６３：１２９１−１２９８，１９８４）は、ＶＷＦと第ＶＩＩＩ因子の複合体は、コラーゲン繊維を結合することを示した。米国特許第６，４１４，１２５号は、高または中分子量ＶＷＦのみが、コラーゲンを結合することを教示し、コラーゲンを結合するＶＷＦを検出する方法およびコラーゲン固定化を用いたＶＷＦの精製方法を提供する。そのため、ＶＷＦ−コラーゲン結合アッセイは、インビボのＶＷＦの腹腔内または皮下投与後の高分子量ＶＷＦ種の存在の測定法でもある。
【０１１７】
血液凝固および他の関係するＶＷＦ活性に対する外因性ＶＷＦの効果を究明するため、血小板粘着、血小板凝集、または血液凝固／血流を測定するために、インビボアッセイが当技術分野において知られている技術を用いて実施された。
【０１１８】
例えば、米国特許第６，００５，０７７号は、ＶＷＦなどの外因性血液凝固因子の投与前後の出血時間および血液の特徴（例、ヘモグロビン含有量、凝固因子の存在）に対する血液因子欠乏症の影響を究明するための方法を開示する。さらに、血小板粘着アッセイは、固定化した組み換えＶＷＦ断片を使用した流動条件下で血小板粘着を測定する方法を記載したＳｈｅｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．９６：１６０−６，２００６）において開示される。ｄｅ Ｒｏｍｅｕｆ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：２１１−６，１９９８）は、ｒＶＷＦ調製を用いたインビトロ血小板活性化および血小板凝集アッセイを開示する。
【０１１９】
これらのアッセイは、外因性血液凝固因子が血液凝固障害をもたらす能力の評価、および病気の改善のための外因性因子の投薬および投与に関する情報の提供に有用である。
【０１２０】
さらに、ＶＷＦを特徴付け、またＶＷＤを診断するためのアッセイは、他により記載されたように行われる。例えば、出血性障害および血栓障害におけるＶＷＦの役割を決める方法は、Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ．４４（２）：１１５−４９（２００７）において記載され、ＶＷＤおよびＶＷＦ療法の治療を評価する方法は、Ｂｕｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．Ｓｅｐ；３２（６）：６２６−３５（２００６），Ｆａｖａｌｏｒｏ Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．Ｓｅｐ；３２（６）：５６６−７６（２００６）およびＦａｖａｌｏｒｏ，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２００６ Ｊｕｌ；３２（５）：４５６−７１（２００６）において記載され、ＶＷＤの分類方法は、Ｓａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｏｃｔ；４（１０）：２１０３−１４（２００６）において記載され、ＶＷＤの特定方法はＫｏｕｉｄｅｓ Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．Ｊｕｌ；３２（５）：４８０−４（２００６）において記載されている。
【０１２１】
実施例４
外因性ヒト血液凝固因子を用いた血液凝固障害の治療
ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦなどの血液凝固因子において欠乏症のある被険対象は、ここに示されるように、血液因子組成物を用いて治療される。血液凝固障害の動物モデルへの血液因子の投与、および血液障害に苦しむヒトを治療するために当技術分野において知られているプロトコルの使用は、ここに記述される単独または他の治療薬、例えば化学療法または放射線療法、サイトカイン、成長因子、およびよく使われる他の治療学の薬との組み合わせ、の血液因子を被険対象に投与する基準を提供する。
【０１２２】
例えば、ＦＶＩＩＩにおいて欠乏症を持つ血友病Ａ患者は、治療を行う医師によって簡単に決められるような、低ペグ化ＦＶＩＩＩの治療効果のある投与量を用いて治療される。例えば、重度の血友病患者への代替ＦＶＩＩＩの２つの異なる調製の投与および比較を説明しているＤｉ Ｐａｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．１３：１２４−３０，２００７を参照。
【０１２３】
精製されたＶＷＦは、血友病Ａと同様に、フォンヴィレブランド病（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ４：１０３５−７，１９９３）に苦しむ患者を治療するためにも使用されている。ここに記述される組み換えまたは血漿派生ＶＷＦは、代替ＶＷＦの恩恵を受けるであろう患者を治療するための当技術分野で知られている養生法において使用されている。
【０１２４】
組み換えＶＷＦが単独またはＦＶＩＩＩとの複合体において投与されることを、本発明において熟慮された。一実施形態において、ＶＷＦは５０Ｕ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇの投与量範囲において投与された。例えば、ＶＷＦは、およそ５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００Ｕ／ｋｇで投与された。
【０１２５】
血液因子の投与は、１から２４時間、またはそれ以上続く可能性があり、日常実験を用いた最適化のために修正可能である。血液因子が、長期処置の必要がないよう期間中続けて投与されることも熟慮された。さらに、改良血液因子組成物は、毎日、毎週、隔週、または当業者によって決められるであろう他の効果的な頻度で投与される。
【０１２６】
改良血液因子が、他の化学療法もしくは放射線療法薬、または成長因子もしくはサイトカインなどの他の治療法と組み合わせて患者に投与されることが熟慮された。別の治療薬剤との組み合わせで投与される場合、改良血液因子の量は、必要に応じて適宜減らされる。第２物質はヒトの病気の改善に安全および効果的である決められた量で投与される。
【０１２７】
ある実施形態において、サイトカインまたは成長因子、および化学療法薬または放射線療法薬は、血液因子と同じ形状で投与され、同時に投与される。あるいは、その薬剤は、別の形状で投与されても、血液因子と同時に投与される。ここに使用されるように、同時に、それぞれ３０分以内に投与された薬剤に関連する。関連する実施形態において、第２物質は改良血液因子の投与に先立って投与される。先行投与は、改良血液因子の投与前一週間前から３０分前までの範囲で改良因子治療に先立って投与される。第２物質が、改良血液因子の投与の後に投与されることも、さらに熟慮された。後続の投与は、改良血液因子投与の３０分後から１週間後までの投与を説明することを意図されている。血液因子組成物は、血液凝固障害および癌の形状を有する被険対象における放射線療法の養生法と共に投与され、治療を行う医師により処方されることで治療が行われる。
【０１２８】
上の説明に役立つ実例において記載された、本発明における多数の改良および変異は、これらの当業者に想起することが期待される。従って、添付の特許請求の範囲に表れるような制限のみが、本発明とされるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子欠損および機能的な内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子欠損を有するゲノムを有する、遺伝子導入非ヒト動物。
【請求項２】
ヒトＶＷＦをコードするヒト導入遺伝子ポリヌクレオチド配列を含むゲノムをさらに有する、請求項１に記載の遺伝子導入動物。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド配列がプロモーターポリヌクレオチド配列と作動可能に連結される、請求項２に記載の遺伝子導入動物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド配列がポリアデニル化ポリヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入動物。
【請求項５】
前記動物が齧歯動物である、請求項１に記載の遺伝子導入動物。
【請求項６】
前記動物がマウスである、請求項５に記載の遺伝子導入動物。
【請求項７】
機能的な内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子欠損および機能的な内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子欠損を有するゲノムを有する非ヒト遺伝子導入動物であって、前記ゲノムがヒトフォンヴィレブランド因子をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ヒトＶＷＦが前記ヒトＶＷＦの生理学的活性を有し、前記遺伝子導入哺乳動物が、そのゲノム中に
（ａ）転写制御ポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）前記ヒトＶＷＦをコードするＤＮＡと、
（ｃ）ポリアデニル化シグナルと
を含む外因性導入遺伝子構築物を有し、
（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）が、前記遺伝子導入動物中の前記ヒトＶＷＦまたはその断片の産生を得るために、前記外因性遺伝子構築物内で作動可能に連結される、非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項８】
前記転写制御ポリヌクレオチド配列が、５’転写制御ポリヌクレオチド配列、３’転写制御ポリヌクレオチド配列、内部転写制御ポリヌクレオチド配列、およびその組み合わせからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の遺伝子導入動物。
【請求項９】
５’制御配列は任意でエンハンサー領域を含むプロモーターである、請求項８に記載の遺伝子導入動物。
【請求項１０】
前記動物がヒト後天性血友病Ａの実験モデルである、請求項１または７に記載の遺伝子導入動物。
【請求項１１】
内因性第ＶＩＩＩ因子および内因性ヒトフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）を欠失する哺乳動物への、外因性ヒトフォンヴィレブランド因子の効果を評価するための方法であって、治療有効量のヒトＶＷＦを請求項１から１０のいずれか一項に記載の動物に投与することと、ＶＷＦ活性の臨床的読出しを測定することと、を含み、臨床的読出しの改善が外因性ＶＷＦの治療効果を示す、方法。
【請求項１２】
前記ＶＷＦが腹腔内または皮下に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＶＷＦが５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇの範囲で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＷＦ活性の臨床的読出しが、血液組成、血小板凝集、血小板粘着、および血小板活性化からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
血友病Ａの症状の改善に効果的な量で外因性多量体ヒトフォンヴィレブランド因子を投与することを含み、前記ＶＷＦが腹腔内または皮下に投与される、血友病Ａを有する被験者の治療のための方法。
【請求項１６】
前記症状が、出血性障害、自己免疫疾患、異常血小板凝集、異常血小板粘着、および異常血小板活性化からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＶＷＦが５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇの範囲で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＶＷＦがヒト第ＶＩＩＩ因子と組み合わせて投与される、請求項１１または１５に記載の方法。
【請求項１】
機能的な内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子欠損および機能的な内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子欠損を有するゲノムを有する、遺伝子導入非ヒト動物。
【請求項２】
ヒトＶＷＦをコードするヒト導入遺伝子ポリヌクレオチド配列を含むゲノムをさらに有する、請求項１に記載の遺伝子導入動物。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド配列がプロモーターポリヌクレオチド配列と作動可能に連結される、請求項２に記載の遺伝子導入動物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド配列がポリアデニル化ポリヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入動物。
【請求項５】
前記動物が齧歯動物である、請求項１に記載の遺伝子導入動物。
【請求項６】
前記動物がマウスである、請求項５に記載の遺伝子導入動物。
【請求項７】
機能的な内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子欠損および機能的な内因性フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）遺伝子欠損を有するゲノムを有する非ヒト遺伝子導入動物であって、前記ゲノムがヒトフォンヴィレブランド因子をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ヒトＶＷＦが前記ヒトＶＷＦの生理学的活性を有し、前記遺伝子導入哺乳動物が、そのゲノム中に
（ａ）転写制御ポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）前記ヒトＶＷＦをコードするＤＮＡと、
（ｃ）ポリアデニル化シグナルと
を含む外因性導入遺伝子構築物を有し、
（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）が、前記遺伝子導入動物中の前記ヒトＶＷＦまたはその断片の産生を得るために、前記外因性遺伝子構築物内で作動可能に連結される、非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項８】
前記転写制御ポリヌクレオチド配列が、５’転写制御ポリヌクレオチド配列、３’転写制御ポリヌクレオチド配列、内部転写制御ポリヌクレオチド配列、およびその組み合わせからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の遺伝子導入動物。
【請求項９】
５’制御配列は任意でエンハンサー領域を含むプロモーターである、請求項８に記載の遺伝子導入動物。
【請求項１０】
前記動物がヒト後天性血友病Ａの実験モデルである、請求項１または７に記載の遺伝子導入動物。
【請求項１１】
内因性第ＶＩＩＩ因子および内因性ヒトフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）を欠失する哺乳動物への、外因性ヒトフォンヴィレブランド因子の効果を評価するための方法であって、治療有効量のヒトＶＷＦを請求項１から１０のいずれか一項に記載の動物に投与することと、ＶＷＦ活性の臨床的読出しを測定することと、を含み、臨床的読出しの改善が外因性ＶＷＦの治療効果を示す、方法。
【請求項１２】
前記ＶＷＦが腹腔内または皮下に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＶＷＦが５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇの範囲で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＷＦ活性の臨床的読出しが、血液組成、血小板凝集、血小板粘着、および血小板活性化からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
血友病Ａの症状の改善に効果的な量で外因性多量体ヒトフォンヴィレブランド因子を投与することを含み、前記ＶＷＦが腹腔内または皮下に投与される、血友病Ａを有する被験者の治療のための方法。
【請求項１６】
前記症状が、出血性障害、自己免疫疾患、異常血小板凝集、異常血小板粘着、および異常血小板活性化からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＶＷＦが５０ＶＷＦ：ＡｇＵ／ｋｇから５００Ｕ／ｋｇの範囲で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＶＷＦがヒト第ＶＩＩＩ因子と組み合わせて投与される、請求項１１または１５に記載の方法。
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５００７４３（Ｐ２０１３−５００７４３Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２３７２８（Ｐ２０１２−５２３７２８）
【出願日】平成２２年８月４日（２０１０．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４３８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７４１４
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月４日（２０１０．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４３８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７４１４
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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