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Fcレセプターの精製方法
説明

Fcレセプターの精製方法

【課題】疎水クロマトグラフィーを用いてFcγRIを精製する際、より高純度かつ回収率高くFcγRIを精製する方法を提供する。
【解決手段】大腸菌を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒトFcレセプターFcγRI含有培養液から、該ヒトFcレセプターFcγRIを精製するにあたり、疎水クロマトグラフィー用担体に吸着させ、該ヒトFcレセプターFcγRIを溶出させる際に、10%(w/v)以上のグリセロールを含む緩衝液で溶出させることで、ヒトFcレセプターFcγRIを高純度にかつ高回収率で精製することができた。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子工学的手法により得られた、Fcレセプターを発現する宿主の培養液から、Fcレセプターを精製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Fcレセプターは、免疫グロブリン分子のFc領域に結合する一群の分子である。Fcレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、IgGのFc領域に結合するFcγレセプター、IgEのFc領域に結合するFcεレセプター、IgAのFc領域に結合するFcαレセプター等がある(非特許文献1)。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Fcγレセプターの場合、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIの存在が報告されている(非特許文献1)。
【0003】
Fcγレセプターの一つであるFcγRIは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される(非特許文献1)。また、FcγRIはIgGに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数(K)は10−8M以下である(非特許文献2)。FcγRIは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、IgGとの結合は、IgGのFc領域とFcγRIの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。FcγRIはIgGとの結合に直接関わる分子量約42000のα鎖と、γ鎖の2種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している(非特許文献3)。FcγRIはIgG1からIgG4まであるサブクラスのうち、特にIgG1およびIgG3と強く結合し、IgG2およびIgG4との結合は弱いことが知られている。
【0004】
ヒトFcγRIのアミノ酸配列および遺伝子配列(配列番号1)はExPASy(Primary accession number:P12314)などの公的データベースに公表されている。また、FcγRIの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図1にヒト型FcγRIの構造略図を示す。なお、図1中のアミノ酸番号は配列番号1に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号1中の1番目のメチオニン(Met)から15番目のグリシン(Gly)までがシグナル配列、16番目のグルタミン(Gln)から289番目のバリン(Val)までが細胞外領域、290番目のトリプトファン(Trp)から374番目のスレオニン(Thr)までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【0005】
FcγRIα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列(非特許文献4)はJanet等により明らかにされ、その後、遺伝子工学的手法により、大腸菌(特許文献1)または動物細胞を利用した発現が報告されている。
【0006】
近年になり、Fcレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある(非特許文献2)。また、FcγRIの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィー担体の捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。しかしながら、前記目的でFcγRIを利用するには、FcγRIを高純度に精製することが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特表2004−530419号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】J.V.Ravetch等,Annu.Rev.Immunol.,9,457,1991
【非特許文献2】Toshiyuki Takai,Jpn.J.Clin.Immunol.,28,318,2005
【非特許文献3】A.Paetz等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,338,1811,2005
【非特許文献4】J.M.Allen等,Science,243,378,1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
遺伝子工学的手法を用いたFcγRIの生産は、通常、FcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することにより宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することでFcγRIを発現し生産する。培養液中には、培養する際の栄養源(アミノ酸類、糖類、微量金属類など)や、宿主自身が生産する副生成物といった様々な夾雑物が存在する。そのため、前記形質転換体により形質転換体外へFcγRIを発現する場合は、培養液を遠心分離するなどにより培養上清を得た後、前記夾雑物を除去する精製を行なう必要がある。一方、前記形質転換体により形質転換体内にFcγRIを発現する場合は、培養液を遠心分離するなどにより培養細胞を得た後、機械的せん断、浸透圧ショック、酵素処理、薬剤処理などにより培養細胞を破砕する必要がある。なお、前記破砕操作により、細胞内の全ての内容物が破砕液中に放出するため、形質転換体外へ発現する場合よりも複雑な精製方法が必要となる場合がある。
【0010】
通常、培養液から目的とするタンパク質を精製分離するには、硫安分画や限外ろ過による大まかな分離を行なった後、モードの異なる2種類以上のクロマトグラフィーを組み合わせて行なわれる。クロマトグラフィーによる精製分離は、電荷、親水性/疎水性の差、タンパク質分子の大きさなどにより目的タンパク質を精製分離する。なお、各クロマトグラフィーにおける溶媒の種類や吸着/洗浄/溶出方法は、適宜検討の上行なわれる。クロマトグラフィーによる精製分離の中でも、疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィー(疎水クロマトグラフィー)は、試料溶液中に高濃度の塩類が添加されている場合であっても希釈や透析による塩濃度を下げる操作が不要であり、低い塩濃度の緩衝液で目的タンパク質の溶出が行なえるなどの利点があるため、第一段階または第二段階のカラムとして好ましく用いられる。しかしながら、疎水クロマトグラフィーを用いてFcγRIを精製する際、通常の溶出で用いられる塩化ナトリウムや硫酸アンモニウムなどの塩類を含まない緩衝液で溶出させると、FcγRIの回収率が著しく低くなる問題があった。また、前記問題を解決するため、従来から知られているエタノールや塩酸グアニジンを添加する方法を検討したものの、エタノールを添加すると塩が析出する問題が新たに発生し、塩酸グアニジンを添加すると腐食性の問題が新たに発生した。また、これらの方法によってもFcγRIの回収率は十分ではなかった。
【0011】
そこで本発明は、疎水クロマトグラフィーを用いてFcγRIを精製する際、より高純度かつ高い回収率でFcγRIを精製する方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、疎水クロマトグラフィー用担体を用いてFcγRIを精製する際、前記担体からFcγRIを溶出させる際に用いる緩衝液に添加する成分および濃度について鋭意検討した結果、本発明を見出した。
【0013】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する:
(1)ヒトFcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトFcレセプターFcγRIを精製する方法であって、前記担体に吸着したヒトFcレセプターFcγRIを溶出させる際に10%(w/v)以上のグリセロールを含む緩衝液で溶出させる、ヒトFcレセプターFcγRIの精製方法。
【0014】
(2)宿主が大腸菌である、(1)に記載の精製方法。
【0015】
(3)疎水クロマトグラフィー用担体がフェニル基を導入した担体である、(1)または(2)に記載の精製方法。
【0016】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【0017】
本発明における、ヒトFcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換する宿主とは、COS細胞やCHO細胞に代表される動物細胞、バチルス属(ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む)や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。
【0018】
前記宿主の培養液から、疎水クロマトグラフィー用担体に吸着させるヒトFcγRIを含む溶液(アプライ液)を取得するには、例えば、宿主細胞外にFcγRIが発現する場合は培養液を遠心分離して得られる培養上清から、宿主細胞内にFcγRIが発現する場合は培養液を遠心分離して得られる培養細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕(物理的破砕、薬剤による破砕など)後遠心分離により破砕残渣を除去することで得られる細胞破砕液から、それぞれ所定濃度の塩類(硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなど)を含んだ緩衝液を添加後、遠心分離により夾雑タンパク質を除去することで取得することができる。
【0019】
本発明の精製方法で用いる、疎水クロマトグラフィー用担体は、フェニル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、エーテル基といった疎水基を担体に結合したものであり、一例として、TOYOPEARL Phenyl−650、TOYOPEARL Butyl−650、TOYOPEARL Hexyl−650、TOYOPEARL Ether−650(以上、東ソー株式会社製)、Octyl Sepharose(GEヘルスケア社製)があげられる。中でも本発明の精製方法は、フェニル基を導入した担体を用いた精製に好ましい。なお、前記疎水クロマトグラフィー用担体を用いて本発明の精製を行なう際は、アプライ液の導入量や前記担体のタンパク吸着性能などによって決定した量の担体を、適切なオープンカラムに充填して行なえばよい。また、前記疎水クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を導入する前に、あらかじめ適切な塩(硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなど)を含む適切な緩衝液(Tris−HCl、グリシン(Gly)−NaOH、リン酸塩など)により平衡化しておく。
【0020】
前述の方法で得られたアプライ液を、平衡化した疎水クロマトグラフィー用担体に導入することでヒトFcγRIを含むタンパク質を担体に吸着させ、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄する。その後、緩衝液を用いて吸着したヒトFcγRIを溶出させるが、通常の溶出で用いられる塩化ナトリウムや硫酸アンモニウムなどの塩類を含まない緩衝液で溶出させると、FcγRIの回収率が著しく低くなる問題があった。そこで、疎水性相互作用を弱める働きがあるグリセロール、エタノール、塩酸グアニジンを添加し、ヒトFcγRIの精製度および回収率を検討した結果、グリセロール、特に10%(w/v)以上のグリセロールを緩衝液に添加することにより、高純度かつ高い回収率でヒトFcγRIを精製することを実現した(実施例1、比較例1から4、表1参照)。
【0021】
本発明の精製方法において、溶出した画分中のヒトFcγRIの分析方法は、従来から知られている安定かつ効率的に定量できる方法の中から適宜選択すればよいが、ELISA法(酵素結合免疫吸着法)による分析方法が好ましい。
【0022】
本発明の精製方法により得られたヒトFcγRIは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド(分離剤)など様々な用途に用いることができる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、本発明の方法によって精製したものをそのまま用いてもよいし、さらに高度に精製したものを用いてもよいし、またその中間の純度の精製度合いのものを用いてもよい。
【発明の効果】
【0023】
本発明はヒトFcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトFcγRIを精製する際に、10%(w/v)以上のグリセロールを含む緩衝液で前記担体に吸着したヒトFcγRIを溶出させることを特徴としている。本発明の精製方法により、高純度かつ高い回収率でヒトFcγRIを精製することができる。また、本発明の精製方法は前記担体に導入するヒトFcγRIを含む溶液量(アプライ量)に係わらず適用可能な方法であるため、ヒトFcγRIの分析目的に適用できることはもちろん、工業的なヒトFcγRI生産の一工程にも適用することができる。
【0024】
本発明の精製方法で得られたヒトFcγRIは、そのまま、またはさらなる精製により、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド(分離剤)など様々な用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ヒトFcレセプターFcγRIの構造を示す図。
【実施例】
【0026】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0027】
実施例1
(1)ヒトFcレセプターFcγRIをコードするDNA配列を含む発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を2YT培地(Tryptone 16g/L、酵母エキス 10g/L、塩化ナトリウム 5g/L)に植菌し、30℃でOD(Abs:660nm)=3になるまで培養した。
(2)15℃に冷却後、IPTG(イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド)を0.05mMになるように添加し、さらに一晩培養した。
(3)培養液より菌体を回収後、抽出液(0.6% Triton X−100、0.02% デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA、0.1mM PMSF、0.3mg/mL リゾチーム、0.001% Benzonaseを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))に菌体を懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出後、遠心分離により無細胞抽出液(アプライ液)を調製した。
(4)1mLのTOYOPEARL Phenyl−650C(東ソー株式会社製)ゲルをオープンカラムに充填し、5mLの緩衝液A(6%硫酸アンモニウムを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))にてゲルを平衡化した。
(5)(3)で調製したヒトFcγRIを含む無細胞抽出液(アプライ液)10mLを導入し、10mLの緩衝液Aにより洗浄後、5mLの10%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)によりヒトFcγRIを溶出させた。
【0028】
10%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)にて溶出させることにより、77%のヒトFcγRIを回収することができた。なお、本精製により比活性(総タンパク質中[g]のヒトFcγRI含有量[mg])は1.31から3.37に上昇した。
【0029】
比較例1
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は30%であり、比活性は1.50であった。
【0030】
比較例2
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの5%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、5%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は46%であり、比活性は4.57であった。
【0031】
比較例3
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの10%(v/v)エタノールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、10%(v/v)エタノールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は45%であり、比活性は1.71であった。
【0032】
比較例4
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの0.5M塩酸グアニジンを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、0.5M塩酸グアニジンを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は63%であり、比活性は4.69であった。
【0033】
実施例1および比較例1から4までの結果を表1にまとめる。
【0034】
【表1】

【0035】
実施例2
(1)実施例1の(1)から(2)の操作により得られた培養液から菌体を回収(菌体収量:1400g)した。
(2)(1)で得られた菌体を、以下の示す方法で2回に分けてヒトFcγRIを精製した(1回の処理量700g)。
(2−1)700gの菌体ペレットに5倍量となるよう抽出液(0.6% TritonX−100、0.02% デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA、0.1mM PMSF、0.3mg/mL リゾチーム、0.001% Benzonaseを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))を加え、室温で30分撹拌し、菌体内タンパク質を抽出した。
(2−2)遠心分離(7500rpm、30分、4℃)により菌体破砕物を除去後、上清を回収して無細胞抽出液を3500mL得た。
(2−3)無細胞抽出液に210gの硫酸アンモニウム(終濃度6%)を撹拌しながら徐々に加え、1時間撹拌を継続した。
(2−4)遠心分離(7500rpm、30分、4℃)により上清を回収後、次工程の疎水性クロマトグラフィーに供するために、pHを8.0へ調整後、全量を7000mLとなるよう希釈し、これをアプライ液とした。
(2−5)緩衝液Aで平衡化した500mLのTOYOPEARL Phenyl−650C(東ソー株式会社製)ゲルをオープンカラムに充填後、(2−4)のアプライ液を導入し、ヒトFcγRIを含むタンパク質をゲルに吸着させた。
(2−6)2000mLの緩衝液Aにてゲルを洗浄後、10%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)にて100mLずつの画分に溶出させた。
【0036】
結果、ヒトFcγRIの回収率は83%であり、比活性は1.21から7.09に約6倍上昇した。表2に全菌体(1400g)からの精製テーブルを示す。
【0037】
【表2】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトFcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から、疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトFcレセプターFcγRIを精製する方法であって、
前記担体に吸着したヒトFcレセプターFcγRIを溶出させる際に、10%(w/v)以上のグリセロールを含む緩衝液で溶出させる、ヒトFcレセプターFcγRIの精製方法。
【請求項2】
宿主が大腸菌である、請求項1に記載の精製方法。
【請求項3】
疎水クロマトグラフィー用担体がフェニル基を導入した担体である、請求項1または2に記載の精製方法。

【図1】
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【公開番号】特開2011−126827(P2011−126827A)
【公開日】平成23年6月30日(2011.6.30)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−287774(P2009−287774)
【出願日】平成21年12月18日(2009.12.18)
【出願人】(000003300)東ソー株式会社 (1,901)
【Fターム(参考)】