Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の改善
本発明は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼポリペプチドを含む組換え宿主細胞、特に酵母細胞に関する。また本発明は、ポリペプチドの発現の増大、細胞のＦｅ−Ｓクラスター生合成の調節、またはこれらの組み合わせの結果として、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼポリペプチドの比活性が増大された組換え宿主細胞にも関する。また本発明は、宿主細胞の使用方法と、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドの同定方法とを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異および／もしくは置換；および／または
（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；
を含む組換え宿主細胞。
【請求項２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、
（ａ）高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むか；または
（ｂ）組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている；
請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、該少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、上記組換え宿主細胞。
【請求項４】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、該少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている、組換え宿主細胞。
【請求項５】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、表８および表９中の遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、表７中の遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＣＣＣ１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項５または６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、構成的突然変異株であるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記構成的突然変異株が、ＡＦＴ１ Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１ Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１ Ｃ２９１Ｆ、ＡＦＴ１ Ｃ２９３Ｆ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、またはＣＣＣ１である、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、またはＣＣＣ１である、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換が、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＣＣＣ１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが多コピーで発現される、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成が、内因性Ｆｅ−Ｓクラスター生合成を有する組換え宿主細胞と比較して増大された、請求項１、２、または５〜１６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１９】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、前記宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、配列番号１６８または配列番号２３２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２３】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約５倍よりも大きい比活性、
（ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約８倍よりも大きい比活性、および
（ｃ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約１０倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
（ａ）約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｂ）約０．３Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｃ）約０．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｄ）約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｅ）約１．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｆ）約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｇ）約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｈ）約４．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｉ）約５．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｊ）約６．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｋ）約７．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｌ）約８．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｍ）約９．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｎ）約１０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｏ）約２０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、および
（ｐ）約５０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性
からなる群から選択される比活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２５】
前記組換え宿主細胞がイソブタノールを産生する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６】
前記組換え宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
生産物を製造する方法であって、
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）上記生産物が産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含み、該生産物が、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含む、イソブタノールの製造方法。
【請求項２９】
２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換方法であって、
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主を備えるステップと、
（ｂ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートに変換される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含み、２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートへ変換される、上記方法。
【請求項３０】
組換え宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法であって、
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）上記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、該異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む、上記方法。
【請求項３１】
宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法であって、
（ａ）請求項３〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）該宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む、上記方法。
【請求項３２】
組換え宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を増大させる方法であって、
（ａ）Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）該宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
（ｃ）上記Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で（ｂ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む、上記方法。
【請求項３３】
前記活性の増大が、
（ａ）約１０％よりも多い量、
（ｂ）約２０％よりも多い量、
（ｃ）約３０％よりも多い量、
（ｄ）約４０％よりも多い量、
（ｅ）約５０％よりも多い量、
（ｆ）約６０％よりも多い量、
（ｇ）約７０％よりも多い量、
（ｈ）約８０％よりも多い量、
（ｉ）約９０％よりも多い量、および
（ｊ）約９５％よりも多い量
からなる群から選択される量である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性の増大が、
（ａ）約５倍よりも多い量、
（ｂ）約８倍よりも多い量、および
（ｃ）約１０倍よりも多い量
からなる群から選択される量である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
（ｂ）異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性と、ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップと
を含み、異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の増大が、上記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す、上記方法。
【請求項３６】
宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
（ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップと
を含み、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大が、上記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す、上記方法。
【請求項３７】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の前記変化が、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および／または補因子添加を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質がジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有し、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する該Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質が、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＣＣＣ１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法によって同定されたポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞がさらに、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記異種ポリヌクレオチドが多コピーで発現される、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４３】
前記異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４４】
前記異種ポリヌクレオチドが、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４５】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組換え宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５０】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項４９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５１】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される、請求項４０〜４４または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む、請求項４０〜４４または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５３】
前記組換え宿主細胞が、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される生産物を産生する、請求項４０〜４４または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５４】
前記組換え宿主細胞がイソブタノールを産生する、請求項５３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５５】
前記組換え宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項５４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５６】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約３倍よりも大きい比活性、および
（ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約６倍よりも大きい比活性
からなる群から選択される比活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５７】
前記活性の増大が、
（ａ）約３倍よりも多い量、および
（ｂ）約６倍よりも多い量
からなる群から選択される量である、請求項３２に記載の方法。
【請求項５８】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドのモノマーが、
（ａ）少なくとも約１０％、
（ｂ）少なくとも約１５％、
（ｃ）少なくとも約２０％、
（ｄ）少なくとも約２５％、
（ｅ）少なくとも約３０％、
（ｆ）少なくとも約３５％、
（ｇ）少なくとも約４０％、
（ｈ）少なくとも約４５％、
（ｉ）少なくとも約５０％、
（ｊ）少なくとも約６０％、
（ｋ）少なくとも約７０％、
（ｌ）少なくとも約８０％、
（ｍ）少なくとも約９０％、および
（ｎ）少なくとも約９５％
からなる群から選択されるＦｅ−Ｓクラスター負荷を有する、請求項１〜２２、４０〜４４、または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５９】
２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの前記変換が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する対照宿主細胞と比較して、
（ａ）少なくとも約５％、
（ｂ）少なくとも約１０％、
（ｃ）少なくとも約１５％、
（ｄ）少なくとも約２０％、
（ｅ）少なくとも約２５％、
（ｆ）少なくとも約３０％、
（ｇ）少なくとも約３５％、
（ｈ）少なくとも約４０％、
（ｉ）少なくとも約４５％、
（ｊ）少なくとも約５０％、
（ｋ）少なくとも約６０％、
（ｌ）少なくとも約７０％、
（ｍ）少なくとも約８０％、
（ｎ）少なくとも約９０％、および
（ｏ）少なくとも約９５％
からなる群から選択される量で増大される、請求項２９に記載の方法。
【請求項６０】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＲＮ１、ＡＲＮ２、ＡＴＸ１、ＣＣＣ２、ＣＯＴ１、ＥＮＢ１、ＦＥＴ３、ＦＥＴ５、ＦＩＴ１、ＦＩＴ２、ＦＩＴ３、ＦＲＥ１、ＦＲＥ２、ＦＲＥ３、ＦＲＥ４、ＦＲＥ５、ＦＲＥ６、ＦＴＨ１、ＦＴＲ１、ＨＭＸ１、ＳＩＴ１、ＳＭＦ３、ＴＩＳ１１、ＶＨＴ１、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＡＩＭ１、ＡＲＨ１、ＡＴＭ１、ＢＵＤ３２、ＣＡＤ１、ＣＣＣ１、ＣＦＤ１、ＣＩＡ１、ＣＭＫ１、ＣＴＨ１、ＣＴＩ６、ＣＹＣ８、ＤＡＰ１、ＤＲＥ２、ＥＲＶ１、ＥＳＡ１、ＦＥＴ４、ＦＲＡ１、ＦＲＡ２、ＧＥＦ１、ＧＧＣ１、ＧＲＸ１、ＧＲＸ２、ＧＲＸ４、ＧＲＸ５、ＨＤＡ１、ＩＢＡ５７、ＩＳＡ１、ＩＳＡ２、ＩＳＵ１、ＩＳＵ２、ＪＡＣ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ３、ＭＲＳ４、ＭＳＮ５、ＮＡＲ１、ＮＦＳ１、ＮＦＵ１、ＮＨＰ６ａ、ＮＨＰ６ｂ、ＰＳＥ１、ＳＭＦ１、ＳＮＦ１、ＳＮＦ２、ＳＮＦ３、ＳＮＦ４、ＳＳＱ１、ＴＩＭ１２、ＴＵＰ１、ＮＰ＿０１１９１１．１、ＶＰＳ４１、ＹＡＰ５、ＹＦＨ１、ＹＲＡ１、ＺＰＲ１、ｉｓｃＡｎｉｆ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｃｙｓＥ１、ｃｙｓＥ２、ｉｓｃＳ、ｉｓｃＵ、ｉｓｃＡ、ｈｓｃＢ、ｈｓｃＡ、Ｆｄｘ、ｓｕｆＳ、ｓｕｆＥ、ｃｙｓＥ３、ｓｕｆＳ２、ｉｓｃＡ２、Ｎｆｕ、ｎｆｕＡ、ｎｆｕＶ、ｎｆｕ、ｓｕｆＡ、ｓｕｆＢ、ｓｕｆＣ、ｓｕｆＤ、ｓｕｆＥ１、ｓｕｆＳ２、またはｓｕｆＥ２によってコードされる、請求項１、２または５〜２６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６１】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの形態の濃度を測定する方法であって、
（ａ）第１のクロマトグラフィ手順を用いて、該ポリペプチドを含有する画分を粗抽出物から分離するステップと、
（ｂ）第２のクロマトグラフィ手順を用いて、該ポリペプチドの形態を含有する画分を（ａ）から分離するステップと、
（ｃ）（ｂ）で得られた該ポリペプチドの該形態の濃度を測定するステップと
を含む、上記方法。
【請求項１】
（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異および／もしくは置換；および／または
（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；
を含む組換え宿主細胞。
【請求項２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、
（ａ）高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むか；または
（ｂ）組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている；
請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、該少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、上記組換え宿主細胞。
【請求項４】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、該少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている、組換え宿主細胞。
【請求項５】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、表８および表９中の遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、表７中の遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＣＣＣ１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項５または６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、構成的突然変異株であるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記構成的突然変異株が、ＡＦＴ１ Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１ Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１ Ｃ２９１Ｆ、ＡＦＴ１ Ｃ２９３Ｆ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、またはＣＣＣ１である、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、またはＣＣＣ１である、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換が、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＣＣＣ１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが多コピーで発現される、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成が、内因性Ｆｅ−Ｓクラスター生合成を有する組換え宿主細胞と比較して増大された、請求項１、２、または５〜１６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１９】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、前記宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、配列番号１６８または配列番号２３２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２３】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約５倍よりも大きい比活性、
（ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約８倍よりも大きい比活性、および
（ｃ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約１０倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
（ａ）約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｂ）約０．３Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｃ）約０．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｄ）約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｅ）約１．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｆ）約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｇ）約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｈ）約４．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｉ）約５．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｊ）約６．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｋ）約７．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｌ）約８．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｍ）約９．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｎ）約１０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
（ｏ）約２０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、および
（ｐ）約５０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性
からなる群から選択される比活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２５】
前記組換え宿主細胞がイソブタノールを産生する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６】
前記組換え宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
生産物を製造する方法であって、
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）上記生産物が産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含み、該生産物が、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含む、イソブタノールの製造方法。
【請求項２９】
２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換方法であって、
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主を備えるステップと、
（ｂ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートに変換される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含み、２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートへ変換される、上記方法。
【請求項３０】
組換え宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法であって、
（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）上記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、該異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む、上記方法。
【請求項３１】
宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法であって、
（ａ）請求項３〜２４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）該宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む、上記方法。
【請求項３２】
組換え宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を増大させる方法であって、
（ａ）Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）該宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
（ｃ）上記Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で（ｂ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む、上記方法。
【請求項３３】
前記活性の増大が、
（ａ）約１０％よりも多い量、
（ｂ）約２０％よりも多い量、
（ｃ）約３０％よりも多い量、
（ｄ）約４０％よりも多い量、
（ｅ）約５０％よりも多い量、
（ｆ）約６０％よりも多い量、
（ｇ）約７０％よりも多い量、
（ｈ）約８０％よりも多い量、
（ｉ）約９０％よりも多い量、および
（ｊ）約９５％よりも多い量
からなる群から選択される量である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性の増大が、
（ａ）約５倍よりも多い量、
（ｂ）約８倍よりも多い量、および
（ｃ）約１０倍よりも多い量
からなる群から選択される量である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
（ｂ）異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性と、ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップと
を含み、異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の増大が、上記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す、上記方法。
【請求項３６】
宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
（ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップと
を含み、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大が、上記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す、上記方法。
【請求項３７】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の前記変化が、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および／または補因子添加を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質がジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有し、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する該Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質が、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＣＣＣ１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法によって同定されたポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞がさらに、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記異種ポリヌクレオチドが多コピーで発現される、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４３】
前記異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４４】
前記異種ポリヌクレオチドが、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４５】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組換え宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５０】
前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項４９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５１】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される、請求項４０〜４４または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５２】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む、請求項４０〜４４または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５３】
前記組換え宿主細胞が、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される生産物を産生する、請求項４０〜４４または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５４】
前記組換え宿主細胞がイソブタノールを産生する、請求項５３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５５】
前記組換え宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項５４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５６】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約３倍よりも大きい比活性、および
（ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約６倍よりも大きい比活性
からなる群から選択される比活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５７】
前記活性の増大が、
（ａ）約３倍よりも多い量、および
（ｂ）約６倍よりも多い量
からなる群から選択される量である、請求項３２に記載の方法。
【請求項５８】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドのモノマーが、
（ａ）少なくとも約１０％、
（ｂ）少なくとも約１５％、
（ｃ）少なくとも約２０％、
（ｄ）少なくとも約２５％、
（ｅ）少なくとも約３０％、
（ｆ）少なくとも約３５％、
（ｇ）少なくとも約４０％、
（ｈ）少なくとも約４５％、
（ｉ）少なくとも約５０％、
（ｊ）少なくとも約６０％、
（ｋ）少なくとも約７０％、
（ｌ）少なくとも約８０％、
（ｍ）少なくとも約９０％、および
（ｎ）少なくとも約９５％
からなる群から選択されるＦｅ−Ｓクラスター負荷を有する、請求項１〜２２、４０〜４４、または４９〜５０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５９】
２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの前記変換が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する対照宿主細胞と比較して、
（ａ）少なくとも約５％、
（ｂ）少なくとも約１０％、
（ｃ）少なくとも約１５％、
（ｄ）少なくとも約２０％、
（ｅ）少なくとも約２５％、
（ｆ）少なくとも約３０％、
（ｇ）少なくとも約３５％、
（ｈ）少なくとも約４０％、
（ｉ）少なくとも約４５％、
（ｊ）少なくとも約５０％、
（ｋ）少なくとも約６０％、
（ｌ）少なくとも約７０％、
（ｍ）少なくとも約８０％、
（ｎ）少なくとも約９０％、および
（ｏ）少なくとも約９５％
からなる群から選択される量で増大される、請求項２９に記載の方法。
【請求項６０】
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ＡＲＮ１、ＡＲＮ２、ＡＴＸ１、ＣＣＣ２、ＣＯＴ１、ＥＮＢ１、ＦＥＴ３、ＦＥＴ５、ＦＩＴ１、ＦＩＴ２、ＦＩＴ３、ＦＲＥ１、ＦＲＥ２、ＦＲＥ３、ＦＲＥ４、ＦＲＥ５、ＦＲＥ６、ＦＴＨ１、ＦＴＲ１、ＨＭＸ１、ＳＩＴ１、ＳＭＦ３、ＴＩＳ１１、ＶＨＴ１、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＡＩＭ１、ＡＲＨ１、ＡＴＭ１、ＢＵＤ３２、ＣＡＤ１、ＣＣＣ１、ＣＦＤ１、ＣＩＡ１、ＣＭＫ１、ＣＴＨ１、ＣＴＩ６、ＣＹＣ８、ＤＡＰ１、ＤＲＥ２、ＥＲＶ１、ＥＳＡ１、ＦＥＴ４、ＦＲＡ１、ＦＲＡ２、ＧＥＦ１、ＧＧＣ１、ＧＲＸ１、ＧＲＸ２、ＧＲＸ４、ＧＲＸ５、ＨＤＡ１、ＩＢＡ５７、ＩＳＡ１、ＩＳＡ２、ＩＳＵ１、ＩＳＵ２、ＪＡＣ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ３、ＭＲＳ４、ＭＳＮ５、ＮＡＲ１、ＮＦＳ１、ＮＦＵ１、ＮＨＰ６ａ、ＮＨＰ６ｂ、ＰＳＥ１、ＳＭＦ１、ＳＮＦ１、ＳＮＦ２、ＳＮＦ３、ＳＮＦ４、ＳＳＱ１、ＴＩＭ１２、ＴＵＰ１、ＮＰ＿０１１９１１．１、ＶＰＳ４１、ＹＡＰ５、ＹＦＨ１、ＹＲＡ１、ＺＰＲ１、ｉｓｃＡｎｉｆ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｃｙｓＥ１、ｃｙｓＥ２、ｉｓｃＳ、ｉｓｃＵ、ｉｓｃＡ、ｈｓｃＢ、ｈｓｃＡ、Ｆｄｘ、ｓｕｆＳ、ｓｕｆＥ、ｃｙｓＥ３、ｓｕｆＳ２、ｉｓｃＡ２、Ｎｆｕ、ｎｆｕＡ、ｎｆｕＶ、ｎｆｕ、ｓｕｆＡ、ｓｕｆＢ、ｓｕｆＣ、ｓｕｆＤ、ｓｕｆＥ１、ｓｕｆＳ２、またはｓｕｆＥ２によってコードされる、請求項１、２または５〜２６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６１】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの形態の濃度を測定する方法であって、
（ａ）第１のクロマトグラフィ手順を用いて、該ポリペプチドを含有する画分を粗抽出物から分離するステップと、
（ｂ）第２のクロマトグラフィ手順を用いて、該ポリペプチドの形態を含有する画分を（ａ）から分離するステップと、
（ｃ）（ｂ）で得られた該ポリペプチドの該形態の濃度を測定するステップと
を含む、上記方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５１９３９７（Ｐ２０１３−５１９３９７Ａ）
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４０２６（Ｐ２０１２−５５４０２６）
【出願日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５２５８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３３００
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（３１００１１３１０）ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５２５８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３３００
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（３１００１１３１０）ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー (24)
【Ｆターム（参考）】
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