Ｈ．ピロリ菌の接着性測定キットおよびＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法
【課題】本発明は、被験者の胃に存在するＨ．ピロリ菌の情報を得るためのものであり、その情報を胃・十二指腸疾患の病態（疾患の種類や重篤度）の把握や予後の推定などの補助診断に役立て得る、Ｈ．ピロリ菌の接着性測定キット、およびＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットは、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とする。
【解決手段】本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットは、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ．ピロリ菌の接着性測定するためのキット、およびＨ．ピロリ菌の接着性を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（以下、「Ｈ．ピロリ菌」という）は、微好気性のグラム陰性桿菌であり、ヒトの胃に定着する。このＨ．ピロリ菌は、持続感染により胃炎や胃潰瘍を引き起こし、さらには慢性萎縮性胃炎やＭＡＬＴリンパ腫、胃癌を誘発する。それにも関わらず、世界人口の半分以上が感染しているとのデータもあり、問題となっている。
【０００３】
Ｈ．ピロリ菌は、ヒトからヒトへ感染し得るが、胃への定着には、主に外膜に露出している接着因子が関与すると考えられている。
【０００４】
Ｈ．ピロリ菌の接着因子のうち、対応する宿主側の接着分子も明らかにされているのは、２組のみである。１つはＢａｂＡ（Blood-group Antigen Binding Adhesion）であり、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原と結合する。もう一方はＳａｂＡ（Sialic Acid Binding Adhesion）であり、ノイラミン酸誘導体であるシアル酸、特にＳｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原と結合する。
【０００５】
ＢａｂＡをコードする遺伝子であるｂａｂＡ２については、胃・十二指腸疾患との関係に関する研究が為されている。例えば非特許文献１には、ブラジルにおけるｂａｂＡ２の存在と慢性胃炎との関係が示されている。その一方で、非特許文献２では、日本において、ｂａｂＡ２と臨床結果には何の関連性も見出せないとの報告もされている。これらの結果と整合するともいえるが、非特許文献３には、ＢａｂＡの接着能力は、菌株によって、１５００倍もの差があると記載されている。
【０００６】
また、ＢａｂＡの結合力の有無とＢａｂＡ遺伝子（ｂａｂＡ２）の保有率の関連性に関しては、矛盾した実験結果も開示されている。例えば、非特許文献４では、スウェーデンにおいて、ｂａｂＡ２陰性菌株の４４％が、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原と結合したとされている一方で、ポルトガルでは、ｂａｂＡ２陽性菌株の４５％が、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原との結合能を有さないとの記載がある。
【０００７】
以上の通り、ＢａｂＡの接着能力には多様性があり、また、その遺伝子を検出しても、胃・十二指腸疾患における病原性や病態の把握、診断等には適用できないと考えられる。また、同じくＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡに関しては、接着能力についての報告はない。
【非特許文献１】Gatti LIら，Diagn．Macrobiol．Infect．Dis．，51，p.231-235（2005年）
【非特許文献２】Mizushima Tら，J．Clin．Microbiol．，39，p.2463-2465（2001年）
【非特許文献３】Aspholm-Hurtig Mら，Science，305，p.519-522（2004年）
【非特許文献４】Olfat FOら，FEMS Immunol．Med．Microbiol．，44，p.151-156（2005年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した様に、胃に定着するＨ．ピロリ菌は、胃・十二指腸疾患との関連性が強く示唆されており、Ｈ．ピロリ菌の接着因子としては、ＢａｂＡとＳａｂＡが知られている。これら接着因子は、Ｈ．ピロリ菌の定着に関係することが予測されるが、被験者から得られたＨ．ピロリ菌のＢａｂＡ遺伝子保有率と胃・十二指腸疾患との関係は一定ではなく、ＢａｂＡ遺伝子を診断等に用いても、正確な結果は得られないと考えられる。
【０００９】
そこで、本発明が解決すべき課題は、被験者の胃に存在するＨ．ピロリ菌の情報を得るためのものであり、その情報を胃・十二指腸疾患の病態（疾患の種類や重篤度）の把握や予後の推定などの補助診断に役立て得る、Ｈ．ピロリ菌の接着性測定キット、およびＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を進めた。その結果、被験者の胃に存在するＨ．ピロリ菌のＢａｂＡまたはＳａｂＡの何れか一方の接着能力を測定するのみでは必ずしも有用な情報は得られないが、ＢａｂＡおよびＳａｂＡの両方の接着能力の情報は、胃・十二指腸疾患と有意な関係があることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットは、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とする。
【００１２】
上記エピトープは、細胞培養器表面に固定化されていることが好ましい。対象となるＨ．ピロリ菌を当該培養器で培養し、表面に結合するＨ．ピロリ菌を検出することにより、これらエピトープに対する接着性を測定できるからである。
【００１３】
上記ＢａｂＡのエピトープとしては、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原が、また、ＳａｂＡのエピトープとしては、シアル酸を含む糖鎖が好適である。これらエピトープは、ＢａｂＡおよびＳａｂＡのエピトープとして、既に研究実績がある。
【００１４】
また、本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法は、Ｈ．ピロリ菌を標識する工程；標識されたＨ．ピロリ菌を、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる工程；および、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌をそれぞれ検出する工程；を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡの接着能力を測定することができる。その結果得られた情報により、胃・十二指腸疾患の病態（疾患の種類や重篤度）の把握や予後の推定などの補助診断に役立て得る。
【００１６】
従って、本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットとＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法は、世界中の人々の半数以上が感染しているといわれており、胃・十二指腸疾患との関連性が強く示唆されているＨ．ピロリ菌の情報を得ることができることから、Ｈ．ピロリ菌の接着機能に伴う悪性度の鑑別や胃・十二指腸疾患の病態把握等の補助診断に用い得るものとして、極めて重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットは、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とする。
【００１８】
ＢａｂＡとＳａｂＡは、Ｈ．ピロリ菌の細胞表面に発現する接着性タンパク質であり、Ｈ．ピロリ菌の胃細胞表面への結合を促進する。これら接着因子のエピトープの種類は、特に制限されないが、ＢａｂＡまたはＳａｂＡへ特異的に結合できるものが好ましい。また、当該エピトープは、既知のもののみならず、将来見出されるであろう未知のものも含む。
【００１９】
ＢａｂＡのエピトープのうち既知のものとしては、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原を挙げることができる。Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原は、糖鎖中にフコースを含む糖タンパク質であり、
代表的な天然型のＬｅｗｉｓ ｂ抗原は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｌｅb）という構造を有するが、天然型の中にも、ＡＬｅbなど異なった構造を有するものがある。また、ＢａｂＡへ結合するものである限り、ＢＬｅbなど、人工的なＬｅｗｉｓ ｂ抗原を用いてもよい。
【００２０】
ＳａｂＡのエピトープのうち既知のものとしては、シアル酸を含む糖鎖を挙げることができる。より具体的には、５−アセチルノイラミンを糖鎖中に含む、ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原（ｓＬｅx）を用いることができる。ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原（ｓＬｅx）は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒという構造を有する。
【００２１】
本発明のキットにおいて、上記エピトープは、細胞培養器表面に固定化されていることが好ましい。当該培養器を用いて、標識したＨ．ピロリ菌を培養することによって、これらエピトープに結合できるＨ．ピロリ菌を検出できるからである。ただし、ＢａｂＡのエピトープが固定化されているエリアとＳａｂＡのエピトープが固定化されているエリアは、培養液が混ざらない様に仕切られている必要がある。１つのエリアにＢａｂＡとＳａｂＡのエピトープの両方が固定化されていると、Ｈ．ピロリ菌が、何れか一方のエピトープに結合したのか、両方のエピトープに結合したのか区別できず、正確な判断ができないことによる。
【００２２】
細胞培養器の種類は、Ｈ．ピロリ菌の標識基に応じたものとすればよい。例えば、ＥＬＩＳＡで検出し得る標識基を用いる場合には、ＥＬＩＳＡ用のウェルプレートを用いればよいし、蛍光発色基を標識基として用いる場合には、蛍光測定装置にそのまま用い得る培養器を用いれば効率が良い。
【００２３】
エピトープの細胞培養器への固定化は、エピトープや細胞培養器の種類に応じて、適宜選択すればよい。例えば、エピトープとして糖タンパク質を用いる場合、タンパク質が変性しない様にリン酸緩衝液生理食塩水などを溶媒にし、適度な温度で、１〜１０％程度のパラホルムアルデヒドなどを用いればよい。また、タンパク質が変性しない程度の紫外線を照射してもよい。
【００２４】
本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法は、Ｈ．ピロリ菌を標識する工程；標識されたＨ．ピロリ菌を、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる工程；および、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌をそれぞれ検出する工程；を含むことを特徴とする。当該方法は、上記本発明キットを用いて実施することができる。以下、実施の順番に従って、本発明方法を説明する。
【００２５】
本発明方法では、先ず、Ｈ．ピロリ菌を標識する。標識方法は、Ｈ．ピロリ菌の量や濃度を測定できるものであれば特に制限されず、一般的な生化学的標識方法を採用することができる。例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスターゼ、ビオチンなど、ＥＬＩＳＡで検出し得る標識基や；アミノメチルクマリン系、フルオロセイン系、テトラメチルローダミン系、アントラニロイル系、ニトロベンゾオキサジアオール系、ジメチルアミノナフタレン系などの蛍光発色基；放射性同位体含有基などを用いることができる。これら標識基の導入方法は、各標識基に応じた方法を用いればよい。
【００２６】
本発明方法を胃・十二指腸疾患の病態を把握するための補助診断に利用する場合には、被験者からＨ．ピロリ菌を単離精製し、これを用いる。Ｈ．ピロリ菌の単離精製方法は、常法を用いればよい。
【００２７】
標識したＨ．ピロリ菌は、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる。使用するエピトープは、上記で説明した通りである。ここで、「それぞれ」とは、標識したＨ．ピロリ菌を分け、各エピトープへ別々に接触させることを意味する。例えば、両方のエピトープが固定化されたウェルにＨ．ピロリ菌を加えることはしない。後続する工程において、結合したＨ．ピロリ菌が、両方のエピトープに結合しているのか、或いは何れか一方のエピトープに結合しているのか区別ができず、正確な判断ができないからである。
【００２８】
具体的には、標識したＨ．ピロリ菌の懸濁液を、上記エピトープを固定化した細胞培養器などに加え、インキュベートすればよい。インキュベートの条件は、Ｈ．ピロリ菌に適したものとし、例えば、３０〜４０℃程度で３０分間〜２時間程度とすればよい。
【００２９】
この際、Ｈ．ピロリ菌の濃度は、７．５×１０8ＣＦＵ／ｍｌ以上とすることが好ましい。エピトープに結合したＨ．ピロリ菌を検出する際、その測定値は、当然に使用したＨ．ピロリ菌の濃度にも影響を受けて用量依存的になり得る。しかし、本発明者らによる検討によれば、５．０×１０8ＣＦＵ／ｍｌ程度までは、エピトープに対する結合は用量依存的になるが、７．５×１０8ＣＦＵ／ｍｌ以上の濃度であれば、Ｈ．ピロリ菌は十分量存在するので、用量に依存せず、Ｈ．ピロリ菌のＢａｂＡまたはＳａｂＡの結合能力のみに依存した測定値が得られる。なお、使用するエピトープの量も測定値に影響する可能性はあるものの、通常、プラスチック製の細胞培養器に結合し得るエピトープの量は限られており、その量にはほとんど変動はないと考えられるので、無視することができる。
【００３０】
また、使用するＨ．ピロリ菌は、前培養することにより量を確保する必要があるが、その培養時間は２０〜３０時間程度にすることが好ましく、２４時間程度がより好ましい。本発明者らによる検討によれば、前培養の時間が長過ぎると、その理由は必ずしも明らかではないが、おそらく菌の活性が低下することにより、エピトープへの親和性まで低下する傾向がある。しかし、２０〜３０時間程度であれば、菌の活性も高く、使用する菌の増殖サイクルも同調することができ、エピトープに対する結合能力をより正確に測定することができ得る。
【００３１】
次いで、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌を、それぞれ検出する。「それぞれ」とは、ＢａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌と、ＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌とを、別々に検出するとの意味である。
【００３２】
具体的には、先ず、エピトープに結合しなかったＨ．ピロリ菌を除去する。例えば、培養液を除去した後、使用した細胞培養器等を洗浄液で洗浄すればよい。次に、Ｈ．ピロリ菌を標識基に応じた方法で、各エピトープに結合したＨ．ピロリ菌の量や濃度を、それぞれ測定する。
【００３３】
事前に、様々な種類や重篤度の胃・十二指腸疾患患者、或いは、自覚症状や他覚症状のない被験者からＨ．ピロリ菌を採取し、上記各エピトープに対する結合能力を測定し、得られたデータと胃・十二指腸疾患との関係を明らかにしておく。かかる知見と測定値とを比較することにより、本発明方法を胃・十二指腸疾患の病態把握の補助診断に適用し得る。
【００３４】
本発明方法では、Ｈ．ピロリ菌のＢａｂＡエピトープおよびＳａｂＡエピトープに対する結合性を測定する。よって、特に、ＢａｂＡエピトープとＳａｂＡエピトープの両方に対する結合性が高い場合、および両方に対する結合性が低い場合における診断の精度は、Ｈ．ピロリ菌を利用した従来の診断方法に比べて格段に高い。本発明方法は、特に、胃または十二指腸の癌の診断において、有用である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３６】
実施例１
（１）使用したＨ．ピロリ菌とその培養条件
Ｈ．ピロリ菌２６６９５株、ＮＣＴＣ１１６３７株（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＦ２０２９７３）、ＨＰＫ５株、並びに、胃癌（ｎ＝２６）および癌以外（胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍）の消化管疾患（ｎ＝２４）の診断歴のある日本人患者から得られた、臨床分離株５０株を使用した。
【００３７】
これらＨ．ピロリ菌は、１０％の馬血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品名：カールスバード）を添加したブルセラ培地（日本ベクトン・ディキンソン株式会社）中で振盪培養（１１０ｒｐｍ）するか、或いはバンコマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含み、１．４％の寒天（和光純薬工業社製）で凝固させたブルセラ培地（日本ベクトン・ディキンソン社製）上で、３７℃の微好気条件下で培養した。培養時間は、２４時間とした。振盪培養による菌の増殖度は、分光光度計（GE Healthcare Bio-Science Corp.製）を用いて、６００ｎｍの光強度（ＯＤ600）を測定することにより判断した。また、必要に応じて、生菌数を把握するために、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した。
【００３８】
（２） Ｈ．ピロリ菌のラベリング
上記Ｈ．ピロリ菌を、フルオレセインイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ社製、以下、「ＦＩＴＣ」という。）により、ラベリングした。より詳しくは、培養２４時間後（ＯＤ600が１．０前後）の上記培養液１ｍｌを５分間遠心分離して、Ｈ．ピロリ菌を集菌した。このＨ．ピロリ菌に、ＦＩＴＣを０．１μｇ／ｍｌの割合で含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍlを加え、ボルテックスでよく懸濁した。室温で３０分間反応後、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＦＩＴＣでラベルされたＨ．ピロリ菌を、ブロッキングバッファー（２．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＣａＣｌ2および１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））１ｍｌに懸濁した。
【００３９】
（３） ネオグリコプロテインの固定化
Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡは、それぞれフコシル化されているＬｅｗｉｓ ｂ抗原、およびシアル酸（特に、シアリル Ｌｅｗｉｓ ｘ抗原）に結合する。そこで、これら抗原を、培養プレート上に固定化した。具体的には、Ｌｅｗｉｓ ｂ−ヒト血清アルブミン（Ｌｅｂ−ＨＳＡ）または３’−シアリルラクトース−ＨＳＡ（Ｉｓｏ Ｓｅｐ ＡＢ社製Ｔｕｌｌｉｎｇｅ， Ｓｗｅｄｅｎ）を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳへ、最終濃度２０μｇ／ｍｌで溶解した。当該溶液５０μｌを、９６−ウェル細胞培養プレート（住友ベークライト社製、製品名：Ｓｕｍｉｌｏｎ）に注いだ。当該プレートを紫外線架橋装置（ＵＶＰ社製）に挿入し、０．１２Ｊ／ｃｍ2の紫外線を照射しつつ、室温で４０分間静置することによって、上記ネオグリコプロテインを固定化した。各ウェルは、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００４０】
（４） 接着結合アッセイ−ＥＬＩＳＡ（ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡ）
上記（２）で得られた、ラベルされたＨ．ピロリ菌懸濁液５０μｌを、上記（３）のネオグリコプロテイン固定化プレートに注入し、振盪することなく３７℃で１時間培養した。その後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＣａＣｌ2、および１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＴＢＳ）で３回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＨＲＰ）標識ヒツジ抗ＦＩＴＣ抗体（Southern Biotechnology Asscoates社製）溶液（０．５％ＢＳＡを含むＴＢＳ）を各ウェルに加え、室温で、約６５ｒｐｍで１時間攪拌しながら反応させた後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＴＭＢ基質（BioLegend社製）１００μｌを各ウェルに加え、１５分間暗所で反応させた。その後２Ｎ硫酸１００μｌを加えることにより、反応を停止した。Ｈ．ピロリ菌のネオグリコプロテインへの結合度は、マイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、４５０ｎｍの光の強度（ＯＤ450）を測定することにより決定した。ネガティブコントロールウェルと、非ネオグリコプロテイン固定化ウェルのデータで調整後に、測定値を評価した。
【００４１】
本発明では、得られた接着結合親和性の評価を、以下の通り定義した。即ち、ＯＤ450が１．０を超えた場合は強い接着と評価し、０．５未満の場合は弱い接着とし、１．０〜０．５の場合は中程度の接着とした。
【００４２】
（５） ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果と消化管疾患との相関性
胃・十二指腸疾患患者から得たＨ．ピロリ菌におけるＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を、図１に示す。なお、消化管疾患患者５０名の内訳は、胃癌患者が２６名で平均年齢６８．３１±９．９４歳であり、非胃癌患者が２４名で平均年齢６１．２９±１１．６４歳、全員の平均年齢は６２．９４±１１．２５歳であった。なお、以下の実験結果は、平均値±標準偏差および９５％信頼区間を伴う平均値として表される。また、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−テストにより、癌群および非癌群におけるＢａｂＡまたは ＳａｂＡ接着親和性の値を比較した。マン−ホイットニーのＵ検定を用いて、強い、中程度、および弱いと分類された各群の有病率を統計的に分析した。データが連続的なものである場合、ピアソンの相関係数検定によって対合を検討した。統計的に有意な値をＰ値＜０．０５とした。
【００４３】
図１の通り、癌群におけるＢａｂＡ接着性の値は非癌群に比べて高い傾向にあった（０．８７４±０．３０４に対して０．７０７±０．３３６；ｐ＝０．０６９）。一方、ＳａｂＡ接着性においては、癌群と非癌群との間で有意な差異は見られなかった（０．７５７±０．４７８に対して０．６４０±０．４５２；ｐ＝０．３８）。
【００４４】
癌群および非癌群における、ＢａｂＡとＳａｂＡの接着親和性の強度を、図２に示す。癌群におけるＢａｂＡの接着性は、非癌群に比べて有意に高かった（ｐ＝０．０１３）。一方、ＳａｂＡの接着性は、２つの群の間での有意な差はみられなかった（ｐ＝０．１７）。
【００４５】
次に、ＢａｂＡおよびＳａｂＡの接着性を合わせた結果を、臨床分離株５０株について評価した。結果を図３に示す。図３の通り、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方が強い接着性を示す分離株６株全てが癌群に属する一方で、両方が弱い接着性を示す分離株７株全てが非癌群に属していた。ＢａｂＡとＳａｂＡの両方を合わせた癌群の接着性は、非癌群に対して有意に高かった（ｐ＝０．０００３３）。
【００４６】
さらに、癌群と非癌群において、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着性が強い場合、両方の接着性が弱い場合、およびその他の場合の分布数をまとめた。結果を図４に示す。
【００４７】
図４の通り、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着性が強い場合は、何れも癌群に属し、この場合の非癌群に対する有意差は、ｐ＝０．０００３３と極めて高かった。
【００４８】
従って、被験者から単離されたＨ．ピロリ菌におけるＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着性を測定することによって、被験者の疾患の有無や種類、重篤度などを診断できる可能性があることが実証された。
【００４９】
実施例２
上記ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡにおいて、Ｈ．ピロリ菌の結合がネオグリコプロテインに特異的なものであるか否かを確認した。
【００５０】
先ず、実施例１（３）で得たネオグリコプロテイン固定化プレートを、α−フコシダーゼ（ウシ腎臓より抽出したもの。ＰＲＯｚｙｍｅ）またはノイラミニダーゼ（Ｘ型Clostridium perfringens由来のもの。Ｓｉｇｍａ社製）で前処理した。α−フコシダーゼは、フコースと他の糖との結合を選択的に切断し、ノイラミニダーゼは、ノイラミン酸およびノイラミン酸誘導体（シアル酸）と他の糖との結合を切断する。よって、これら酵素により、プレート表面に固定化されたネオグリコプロテインを切断することができる。
【００５１】
より具体的には、α−フコシダーゼを、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2と０．１Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に、０．２Ｕ／ｍｌの割合で溶解した。別途、ノイラミニダーゼを、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に０．２Ｕ／ｍｌの割合で溶解した。当該α−フコシダーゼ溶液またはノイラミニダーゼ溶液５０μｌを、ネオグリコプロテイン固定化プレートに加え、３７℃で１時間反応させた。その後、ＰＢＳで３回洗浄した。
【００５２】
得られたプレートと、Ｈ．ピロリ菌２６６９５株、ＮＣＴＣ１１６３７株またはＨＰＫ５株を用いた以外は実施例１（４）と同様の条件で、ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡを行った。結果を図５に示す。
【００５３】
図５の通り、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡが結合するネオグリコプロテインの糖鎖が切断された場合、Ｈ．ピロリ菌の結合は明確に低減している。よって、Ｈ．ピロリ菌の結合は、ネオグリコプロテイン中の糖鎖に特異的であることが明らかとなった。
【００５４】
実施例３
上記ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡにおいて、ネオグリコプロテイン固定化プレートへのＨ．ピロリ菌の結合は、接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡによるものであるか否かを確認した。
【００５５】
Ｈ．ピロリ菌ＨＰＫ５株において、カナマイシン抵抗性遺伝子を用いて、ＢａｂＡ遺伝子（ｂａｂＡ２）またはＳａｂＡ遺伝子（ｓａｂＡ）をノックアウトした。当該Ｈ．ピロリ菌を用いた以外は実施例１（４）と同様の条件で、ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡを行った。結果を図６に示す。
【００５６】
図６の通り、ＢａｂＡ遺伝子をノックアウトした場合はＬｅｂ−ＨＳＡ、ＳａｂＡ遺伝子をノックアウトした場合は３’−シアリルラクトース−ＨＳＡに対する結合度が明らかに低下した。よって、Ｈ．ピロリ菌のネオグリコプロテイン固定化プレートに対する結合は、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡおよびＳａｂＡによるものであることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】胃・十二指腸疾患患者から得たＨ．ピロリ菌におけるＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】癌群および非癌群における、ＢａｂＡとＳａｂＡの接着強度（強い、中間、弱い）の分布数を示す図である。
【図３】臨床分離株５０株に関する、ＢａｂＡおよびＳａｂＡを合わせたＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図４】癌群と非癌群において、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着強度（両方強い、両方弱い、およびその他）の分布数をまとめた図である。
【図５】ネオグリコプロテイン固定化プレート表面上のネオグリコプロテインを切断した上で実施したＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図６】ＢａｂＡ遺伝子またはＳａｂＡ遺伝子をノックアウトしたＨ．ピロリ菌を用いて実施したＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ．ピロリ菌の接着性測定するためのキット、およびＨ．ピロリ菌の接着性を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（以下、「Ｈ．ピロリ菌」という）は、微好気性のグラム陰性桿菌であり、ヒトの胃に定着する。このＨ．ピロリ菌は、持続感染により胃炎や胃潰瘍を引き起こし、さらには慢性萎縮性胃炎やＭＡＬＴリンパ腫、胃癌を誘発する。それにも関わらず、世界人口の半分以上が感染しているとのデータもあり、問題となっている。
【０００３】
Ｈ．ピロリ菌は、ヒトからヒトへ感染し得るが、胃への定着には、主に外膜に露出している接着因子が関与すると考えられている。
【０００４】
Ｈ．ピロリ菌の接着因子のうち、対応する宿主側の接着分子も明らかにされているのは、２組のみである。１つはＢａｂＡ（Blood-group Antigen Binding Adhesion）であり、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原と結合する。もう一方はＳａｂＡ（Sialic Acid Binding Adhesion）であり、ノイラミン酸誘導体であるシアル酸、特にＳｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原と結合する。
【０００５】
ＢａｂＡをコードする遺伝子であるｂａｂＡ２については、胃・十二指腸疾患との関係に関する研究が為されている。例えば非特許文献１には、ブラジルにおけるｂａｂＡ２の存在と慢性胃炎との関係が示されている。その一方で、非特許文献２では、日本において、ｂａｂＡ２と臨床結果には何の関連性も見出せないとの報告もされている。これらの結果と整合するともいえるが、非特許文献３には、ＢａｂＡの接着能力は、菌株によって、１５００倍もの差があると記載されている。
【０００６】
また、ＢａｂＡの結合力の有無とＢａｂＡ遺伝子（ｂａｂＡ２）の保有率の関連性に関しては、矛盾した実験結果も開示されている。例えば、非特許文献４では、スウェーデンにおいて、ｂａｂＡ２陰性菌株の４４％が、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原と結合したとされている一方で、ポルトガルでは、ｂａｂＡ２陽性菌株の４５％が、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原との結合能を有さないとの記載がある。
【０００７】
以上の通り、ＢａｂＡの接着能力には多様性があり、また、その遺伝子を検出しても、胃・十二指腸疾患における病原性や病態の把握、診断等には適用できないと考えられる。また、同じくＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡに関しては、接着能力についての報告はない。
【非特許文献１】Gatti LIら，Diagn．Macrobiol．Infect．Dis．，51，p.231-235（2005年）
【非特許文献２】Mizushima Tら，J．Clin．Microbiol．，39，p.2463-2465（2001年）
【非特許文献３】Aspholm-Hurtig Mら，Science，305，p.519-522（2004年）
【非特許文献４】Olfat FOら，FEMS Immunol．Med．Microbiol．，44，p.151-156（2005年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した様に、胃に定着するＨ．ピロリ菌は、胃・十二指腸疾患との関連性が強く示唆されており、Ｈ．ピロリ菌の接着因子としては、ＢａｂＡとＳａｂＡが知られている。これら接着因子は、Ｈ．ピロリ菌の定着に関係することが予測されるが、被験者から得られたＨ．ピロリ菌のＢａｂＡ遺伝子保有率と胃・十二指腸疾患との関係は一定ではなく、ＢａｂＡ遺伝子を診断等に用いても、正確な結果は得られないと考えられる。
【０００９】
そこで、本発明が解決すべき課題は、被験者の胃に存在するＨ．ピロリ菌の情報を得るためのものであり、その情報を胃・十二指腸疾患の病態（疾患の種類や重篤度）の把握や予後の推定などの補助診断に役立て得る、Ｈ．ピロリ菌の接着性測定キット、およびＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を進めた。その結果、被験者の胃に存在するＨ．ピロリ菌のＢａｂＡまたはＳａｂＡの何れか一方の接着能力を測定するのみでは必ずしも有用な情報は得られないが、ＢａｂＡおよびＳａｂＡの両方の接着能力の情報は、胃・十二指腸疾患と有意な関係があることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットは、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とする。
【００１２】
上記エピトープは、細胞培養器表面に固定化されていることが好ましい。対象となるＨ．ピロリ菌を当該培養器で培養し、表面に結合するＨ．ピロリ菌を検出することにより、これらエピトープに対する接着性を測定できるからである。
【００１３】
上記ＢａｂＡのエピトープとしては、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原が、また、ＳａｂＡのエピトープとしては、シアル酸を含む糖鎖が好適である。これらエピトープは、ＢａｂＡおよびＳａｂＡのエピトープとして、既に研究実績がある。
【００１４】
また、本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法は、Ｈ．ピロリ菌を標識する工程；標識されたＨ．ピロリ菌を、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる工程；および、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌をそれぞれ検出する工程；を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡの接着能力を測定することができる。その結果得られた情報により、胃・十二指腸疾患の病態（疾患の種類や重篤度）の把握や予後の推定などの補助診断に役立て得る。
【００１６】
従って、本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットとＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法は、世界中の人々の半数以上が感染しているといわれており、胃・十二指腸疾患との関連性が強く示唆されているＨ．ピロリ菌の情報を得ることができることから、Ｈ．ピロリ菌の接着機能に伴う悪性度の鑑別や胃・十二指腸疾患の病態把握等の補助診断に用い得るものとして、極めて重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性測定キットは、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とする。
【００１８】
ＢａｂＡとＳａｂＡは、Ｈ．ピロリ菌の細胞表面に発現する接着性タンパク質であり、Ｈ．ピロリ菌の胃細胞表面への結合を促進する。これら接着因子のエピトープの種類は、特に制限されないが、ＢａｂＡまたはＳａｂＡへ特異的に結合できるものが好ましい。また、当該エピトープは、既知のもののみならず、将来見出されるであろう未知のものも含む。
【００１９】
ＢａｂＡのエピトープのうち既知のものとしては、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原を挙げることができる。Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原は、糖鎖中にフコースを含む糖タンパク質であり、
代表的な天然型のＬｅｗｉｓ ｂ抗原は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｌｅb）という構造を有するが、天然型の中にも、ＡＬｅbなど異なった構造を有するものがある。また、ＢａｂＡへ結合するものである限り、ＢＬｅbなど、人工的なＬｅｗｉｓ ｂ抗原を用いてもよい。
【００２０】
ＳａｂＡのエピトープのうち既知のものとしては、シアル酸を含む糖鎖を挙げることができる。より具体的には、５−アセチルノイラミンを糖鎖中に含む、ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原（ｓＬｅx）を用いることができる。ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗原（ｓＬｅx）は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒという構造を有する。
【００２１】
本発明のキットにおいて、上記エピトープは、細胞培養器表面に固定化されていることが好ましい。当該培養器を用いて、標識したＨ．ピロリ菌を培養することによって、これらエピトープに結合できるＨ．ピロリ菌を検出できるからである。ただし、ＢａｂＡのエピトープが固定化されているエリアとＳａｂＡのエピトープが固定化されているエリアは、培養液が混ざらない様に仕切られている必要がある。１つのエリアにＢａｂＡとＳａｂＡのエピトープの両方が固定化されていると、Ｈ．ピロリ菌が、何れか一方のエピトープに結合したのか、両方のエピトープに結合したのか区別できず、正確な判断ができないことによる。
【００２２】
細胞培養器の種類は、Ｈ．ピロリ菌の標識基に応じたものとすればよい。例えば、ＥＬＩＳＡで検出し得る標識基を用いる場合には、ＥＬＩＳＡ用のウェルプレートを用いればよいし、蛍光発色基を標識基として用いる場合には、蛍光測定装置にそのまま用い得る培養器を用いれば効率が良い。
【００２３】
エピトープの細胞培養器への固定化は、エピトープや細胞培養器の種類に応じて、適宜選択すればよい。例えば、エピトープとして糖タンパク質を用いる場合、タンパク質が変性しない様にリン酸緩衝液生理食塩水などを溶媒にし、適度な温度で、１〜１０％程度のパラホルムアルデヒドなどを用いればよい。また、タンパク質が変性しない程度の紫外線を照射してもよい。
【００２４】
本発明に係るＨ．ピロリ菌の接着性の測定方法は、Ｈ．ピロリ菌を標識する工程；標識されたＨ．ピロリ菌を、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる工程；および、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌をそれぞれ検出する工程；を含むことを特徴とする。当該方法は、上記本発明キットを用いて実施することができる。以下、実施の順番に従って、本発明方法を説明する。
【００２５】
本発明方法では、先ず、Ｈ．ピロリ菌を標識する。標識方法は、Ｈ．ピロリ菌の量や濃度を測定できるものであれば特に制限されず、一般的な生化学的標識方法を採用することができる。例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスターゼ、ビオチンなど、ＥＬＩＳＡで検出し得る標識基や；アミノメチルクマリン系、フルオロセイン系、テトラメチルローダミン系、アントラニロイル系、ニトロベンゾオキサジアオール系、ジメチルアミノナフタレン系などの蛍光発色基；放射性同位体含有基などを用いることができる。これら標識基の導入方法は、各標識基に応じた方法を用いればよい。
【００２６】
本発明方法を胃・十二指腸疾患の病態を把握するための補助診断に利用する場合には、被験者からＨ．ピロリ菌を単離精製し、これを用いる。Ｈ．ピロリ菌の単離精製方法は、常法を用いればよい。
【００２７】
標識したＨ．ピロリ菌は、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる。使用するエピトープは、上記で説明した通りである。ここで、「それぞれ」とは、標識したＨ．ピロリ菌を分け、各エピトープへ別々に接触させることを意味する。例えば、両方のエピトープが固定化されたウェルにＨ．ピロリ菌を加えることはしない。後続する工程において、結合したＨ．ピロリ菌が、両方のエピトープに結合しているのか、或いは何れか一方のエピトープに結合しているのか区別ができず、正確な判断ができないからである。
【００２８】
具体的には、標識したＨ．ピロリ菌の懸濁液を、上記エピトープを固定化した細胞培養器などに加え、インキュベートすればよい。インキュベートの条件は、Ｈ．ピロリ菌に適したものとし、例えば、３０〜４０℃程度で３０分間〜２時間程度とすればよい。
【００２９】
この際、Ｈ．ピロリ菌の濃度は、７．５×１０8ＣＦＵ／ｍｌ以上とすることが好ましい。エピトープに結合したＨ．ピロリ菌を検出する際、その測定値は、当然に使用したＨ．ピロリ菌の濃度にも影響を受けて用量依存的になり得る。しかし、本発明者らによる検討によれば、５．０×１０8ＣＦＵ／ｍｌ程度までは、エピトープに対する結合は用量依存的になるが、７．５×１０8ＣＦＵ／ｍｌ以上の濃度であれば、Ｈ．ピロリ菌は十分量存在するので、用量に依存せず、Ｈ．ピロリ菌のＢａｂＡまたはＳａｂＡの結合能力のみに依存した測定値が得られる。なお、使用するエピトープの量も測定値に影響する可能性はあるものの、通常、プラスチック製の細胞培養器に結合し得るエピトープの量は限られており、その量にはほとんど変動はないと考えられるので、無視することができる。
【００３０】
また、使用するＨ．ピロリ菌は、前培養することにより量を確保する必要があるが、その培養時間は２０〜３０時間程度にすることが好ましく、２４時間程度がより好ましい。本発明者らによる検討によれば、前培養の時間が長過ぎると、その理由は必ずしも明らかではないが、おそらく菌の活性が低下することにより、エピトープへの親和性まで低下する傾向がある。しかし、２０〜３０時間程度であれば、菌の活性も高く、使用する菌の増殖サイクルも同調することができ、エピトープに対する結合能力をより正確に測定することができ得る。
【００３１】
次いで、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌を、それぞれ検出する。「それぞれ」とは、ＢａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌と、ＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌とを、別々に検出するとの意味である。
【００３２】
具体的には、先ず、エピトープに結合しなかったＨ．ピロリ菌を除去する。例えば、培養液を除去した後、使用した細胞培養器等を洗浄液で洗浄すればよい。次に、Ｈ．ピロリ菌を標識基に応じた方法で、各エピトープに結合したＨ．ピロリ菌の量や濃度を、それぞれ測定する。
【００３３】
事前に、様々な種類や重篤度の胃・十二指腸疾患患者、或いは、自覚症状や他覚症状のない被験者からＨ．ピロリ菌を採取し、上記各エピトープに対する結合能力を測定し、得られたデータと胃・十二指腸疾患との関係を明らかにしておく。かかる知見と測定値とを比較することにより、本発明方法を胃・十二指腸疾患の病態把握の補助診断に適用し得る。
【００３４】
本発明方法では、Ｈ．ピロリ菌のＢａｂＡエピトープおよびＳａｂＡエピトープに対する結合性を測定する。よって、特に、ＢａｂＡエピトープとＳａｂＡエピトープの両方に対する結合性が高い場合、および両方に対する結合性が低い場合における診断の精度は、Ｈ．ピロリ菌を利用した従来の診断方法に比べて格段に高い。本発明方法は、特に、胃または十二指腸の癌の診断において、有用である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３６】
実施例１
（１）使用したＨ．ピロリ菌とその培養条件
Ｈ．ピロリ菌２６６９５株、ＮＣＴＣ１１６３７株（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＦ２０２９７３）、ＨＰＫ５株、並びに、胃癌（ｎ＝２６）および癌以外（胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍）の消化管疾患（ｎ＝２４）の診断歴のある日本人患者から得られた、臨床分離株５０株を使用した。
【００３７】
これらＨ．ピロリ菌は、１０％の馬血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品名：カールスバード）を添加したブルセラ培地（日本ベクトン・ディキンソン株式会社）中で振盪培養（１１０ｒｐｍ）するか、或いはバンコマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含み、１．４％の寒天（和光純薬工業社製）で凝固させたブルセラ培地（日本ベクトン・ディキンソン社製）上で、３７℃の微好気条件下で培養した。培養時間は、２４時間とした。振盪培養による菌の増殖度は、分光光度計（GE Healthcare Bio-Science Corp.製）を用いて、６００ｎｍの光強度（ＯＤ600）を測定することにより判断した。また、必要に応じて、生菌数を把握するために、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した。
【００３８】
（２） Ｈ．ピロリ菌のラベリング
上記Ｈ．ピロリ菌を、フルオレセインイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ社製、以下、「ＦＩＴＣ」という。）により、ラベリングした。より詳しくは、培養２４時間後（ＯＤ600が１．０前後）の上記培養液１ｍｌを５分間遠心分離して、Ｈ．ピロリ菌を集菌した。このＨ．ピロリ菌に、ＦＩＴＣを０．１μｇ／ｍｌの割合で含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍlを加え、ボルテックスでよく懸濁した。室温で３０分間反応後、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＦＩＴＣでラベルされたＨ．ピロリ菌を、ブロッキングバッファー（２．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＣａＣｌ2および１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））１ｍｌに懸濁した。
【００３９】
（３） ネオグリコプロテインの固定化
Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡは、それぞれフコシル化されているＬｅｗｉｓ ｂ抗原、およびシアル酸（特に、シアリル Ｌｅｗｉｓ ｘ抗原）に結合する。そこで、これら抗原を、培養プレート上に固定化した。具体的には、Ｌｅｗｉｓ ｂ−ヒト血清アルブミン（Ｌｅｂ−ＨＳＡ）または３’−シアリルラクトース−ＨＳＡ（Ｉｓｏ Ｓｅｐ ＡＢ社製Ｔｕｌｌｉｎｇｅ， Ｓｗｅｄｅｎ）を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳへ、最終濃度２０μｇ／ｍｌで溶解した。当該溶液５０μｌを、９６−ウェル細胞培養プレート（住友ベークライト社製、製品名：Ｓｕｍｉｌｏｎ）に注いだ。当該プレートを紫外線架橋装置（ＵＶＰ社製）に挿入し、０．１２Ｊ／ｃｍ2の紫外線を照射しつつ、室温で４０分間静置することによって、上記ネオグリコプロテインを固定化した。各ウェルは、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００４０】
（４） 接着結合アッセイ−ＥＬＩＳＡ（ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡ）
上記（２）で得られた、ラベルされたＨ．ピロリ菌懸濁液５０μｌを、上記（３）のネオグリコプロテイン固定化プレートに注入し、振盪することなく３７℃で１時間培養した。その後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＣａＣｌ2、および１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＴＢＳ）で３回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＨＲＰ）標識ヒツジ抗ＦＩＴＣ抗体（Southern Biotechnology Asscoates社製）溶液（０．５％ＢＳＡを含むＴＢＳ）を各ウェルに加え、室温で、約６５ｒｐｍで１時間攪拌しながら反応させた後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＴＭＢ基質（BioLegend社製）１００μｌを各ウェルに加え、１５分間暗所で反応させた。その後２Ｎ硫酸１００μｌを加えることにより、反応を停止した。Ｈ．ピロリ菌のネオグリコプロテインへの結合度は、マイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、４５０ｎｍの光の強度（ＯＤ450）を測定することにより決定した。ネガティブコントロールウェルと、非ネオグリコプロテイン固定化ウェルのデータで調整後に、測定値を評価した。
【００４１】
本発明では、得られた接着結合親和性の評価を、以下の通り定義した。即ち、ＯＤ450が１．０を超えた場合は強い接着と評価し、０．５未満の場合は弱い接着とし、１．０〜０．５の場合は中程度の接着とした。
【００４２】
（５） ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果と消化管疾患との相関性
胃・十二指腸疾患患者から得たＨ．ピロリ菌におけるＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を、図１に示す。なお、消化管疾患患者５０名の内訳は、胃癌患者が２６名で平均年齢６８．３１±９．９４歳であり、非胃癌患者が２４名で平均年齢６１．２９±１１．６４歳、全員の平均年齢は６２．９４±１１．２５歳であった。なお、以下の実験結果は、平均値±標準偏差および９５％信頼区間を伴う平均値として表される。また、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−テストにより、癌群および非癌群におけるＢａｂＡまたは ＳａｂＡ接着親和性の値を比較した。マン−ホイットニーのＵ検定を用いて、強い、中程度、および弱いと分類された各群の有病率を統計的に分析した。データが連続的なものである場合、ピアソンの相関係数検定によって対合を検討した。統計的に有意な値をＰ値＜０．０５とした。
【００４３】
図１の通り、癌群におけるＢａｂＡ接着性の値は非癌群に比べて高い傾向にあった（０．８７４±０．３０４に対して０．７０７±０．３３６；ｐ＝０．０６９）。一方、ＳａｂＡ接着性においては、癌群と非癌群との間で有意な差異は見られなかった（０．７５７±０．４７８に対して０．６４０±０．４５２；ｐ＝０．３８）。
【００４４】
癌群および非癌群における、ＢａｂＡとＳａｂＡの接着親和性の強度を、図２に示す。癌群におけるＢａｂＡの接着性は、非癌群に比べて有意に高かった（ｐ＝０．０１３）。一方、ＳａｂＡの接着性は、２つの群の間での有意な差はみられなかった（ｐ＝０．１７）。
【００４５】
次に、ＢａｂＡおよびＳａｂＡの接着性を合わせた結果を、臨床分離株５０株について評価した。結果を図３に示す。図３の通り、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方が強い接着性を示す分離株６株全てが癌群に属する一方で、両方が弱い接着性を示す分離株７株全てが非癌群に属していた。ＢａｂＡとＳａｂＡの両方を合わせた癌群の接着性は、非癌群に対して有意に高かった（ｐ＝０．０００３３）。
【００４６】
さらに、癌群と非癌群において、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着性が強い場合、両方の接着性が弱い場合、およびその他の場合の分布数をまとめた。結果を図４に示す。
【００４７】
図４の通り、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着性が強い場合は、何れも癌群に属し、この場合の非癌群に対する有意差は、ｐ＝０．０００３３と極めて高かった。
【００４８】
従って、被験者から単離されたＨ．ピロリ菌におけるＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着性を測定することによって、被験者の疾患の有無や種類、重篤度などを診断できる可能性があることが実証された。
【００４９】
実施例２
上記ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡにおいて、Ｈ．ピロリ菌の結合がネオグリコプロテインに特異的なものであるか否かを確認した。
【００５０】
先ず、実施例１（３）で得たネオグリコプロテイン固定化プレートを、α−フコシダーゼ（ウシ腎臓より抽出したもの。ＰＲＯｚｙｍｅ）またはノイラミニダーゼ（Ｘ型Clostridium perfringens由来のもの。Ｓｉｇｍａ社製）で前処理した。α−フコシダーゼは、フコースと他の糖との結合を選択的に切断し、ノイラミニダーゼは、ノイラミン酸およびノイラミン酸誘導体（シアル酸）と他の糖との結合を切断する。よって、これら酵素により、プレート表面に固定化されたネオグリコプロテインを切断することができる。
【００５１】
より具体的には、α−フコシダーゼを、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2と０．１Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に、０．２Ｕ／ｍｌの割合で溶解した。別途、ノイラミニダーゼを、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に０．２Ｕ／ｍｌの割合で溶解した。当該α−フコシダーゼ溶液またはノイラミニダーゼ溶液５０μｌを、ネオグリコプロテイン固定化プレートに加え、３７℃で１時間反応させた。その後、ＰＢＳで３回洗浄した。
【００５２】
得られたプレートと、Ｈ．ピロリ菌２６６９５株、ＮＣＴＣ１１６３７株またはＨＰＫ５株を用いた以外は実施例１（４）と同様の条件で、ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡを行った。結果を図５に示す。
【００５３】
図５の通り、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡが結合するネオグリコプロテインの糖鎖が切断された場合、Ｈ．ピロリ菌の結合は明確に低減している。よって、Ｈ．ピロリ菌の結合は、ネオグリコプロテイン中の糖鎖に特異的であることが明らかとなった。
【００５４】
実施例３
上記ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡにおいて、ネオグリコプロテイン固定化プレートへのＨ．ピロリ菌の結合は、接着因子であるＢａｂＡとＳａｂＡによるものであるか否かを確認した。
【００５５】
Ｈ．ピロリ菌ＨＰＫ５株において、カナマイシン抵抗性遺伝子を用いて、ＢａｂＡ遺伝子（ｂａｂＡ２）またはＳａｂＡ遺伝子（ｓａｂＡ）をノックアウトした。当該Ｈ．ピロリ菌を用いた以外は実施例１（４）と同様の条件で、ＡＢＡ−ＥＬＩＳＡを行った。結果を図６に示す。
【００５６】
図６の通り、ＢａｂＡ遺伝子をノックアウトした場合はＬｅｂ−ＨＳＡ、ＳａｂＡ遺伝子をノックアウトした場合は３’−シアリルラクトース−ＨＳＡに対する結合度が明らかに低下した。よって、Ｈ．ピロリ菌のネオグリコプロテイン固定化プレートに対する結合は、Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡおよびＳａｂＡによるものであることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】胃・十二指腸疾患患者から得たＨ．ピロリ菌におけるＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】癌群および非癌群における、ＢａｂＡとＳａｂＡの接着強度（強い、中間、弱い）の分布数を示す図である。
【図３】臨床分離株５０株に関する、ＢａｂＡおよびＳａｂＡを合わせたＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図４】癌群と非癌群において、ＢａｂＡとＳａｂＡの両方の接着強度（両方強い、両方弱い、およびその他）の分布数をまとめた図である。
【図５】ネオグリコプロテイン固定化プレート表面上のネオグリコプロテインを切断した上で実施したＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図６】ＢａｂＡ遺伝子またはＳａｂＡ遺伝子をノックアウトしたＨ．ピロリ菌を用いて実施したＡＢＡ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とするＨ．ピロリ菌の接着性測定キット。
【請求項２】
ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープが、細胞培養器表面に固定化されている請求項１に記載の接着性測定キット。
【請求項３】
ＢａｂＡのエピトープが、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原である請求項１または２に記載の接着性測定キット。
【請求項４】
ＳａｂＡのエピトープが、シアル酸を含む糖鎖である請求項１〜３の何れかに記載の接着性測定キット。
【請求項５】
Ｈ．ピロリ菌の接着性を測定する方法であって、
Ｈ．ピロリ菌を標識する工程；
標識されたＨ．ピロリ菌を、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる工程；および
ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌をそれぞれ検出する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
Ｈ．ピロリ菌の接着因子であるＢａｂＡのエピトープ、およびＨ．ピロリ菌の接着因子であるＳａｂＡのエピトープを含むことを特徴とするＨ．ピロリ菌の接着性測定キット。
【請求項２】
ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープが、細胞培養器表面に固定化されている請求項１に記載の接着性測定キット。
【請求項３】
ＢａｂＡのエピトープが、Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原である請求項１または２に記載の接着性測定キット。
【請求項４】
ＳａｂＡのエピトープが、シアル酸を含む糖鎖である請求項１〜３の何れかに記載の接着性測定キット。
【請求項５】
Ｈ．ピロリ菌の接着性を測定する方法であって、
Ｈ．ピロリ菌を標識する工程；
標識されたＨ．ピロリ菌を、ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープそれぞれに接触させる工程；および
ＢａｂＡのエピトープおよびＳａｂＡのエピトープに結合したＨ．ピロリ菌をそれぞれ検出する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２０６４２６（Ｐ２００８−２０６４２６Ａ）
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４４４７２（Ｐ２００７−４４４７２）
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
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