Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法
【課題】Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法の提供。
【解決手段】以下の塩基配列（ａ）及び（ｂ）から成るインナープライマーセット、並びに、以下の塩基配列（ｃ）及び（ｄ）から成るアウタープライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（ａ）５’−（配列番号４９の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５０の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５２の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５３の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（ｃ）配列番号５１の塩基配列。
（ｄ）配列番号５７の塩基配列。
【解決手段】以下の塩基配列（ａ）及び（ｂ）から成るインナープライマーセット、並びに、以下の塩基配列（ｃ）及び（ｄ）から成るアウタープライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（ａ）５’−（配列番号４９の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５０の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５２の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５３の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（ｃ）配列番号５１の塩基配列。
（ｄ）配列番号５７の塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出法方法に関し、さらに詳しくは、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、当該プライマーを用いたＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法、インフルエンザの診断方法及びインフルエンザを診断するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは流行性のウイルス性呼吸器感染症であり、乳幼児から高齢者まで幅広い年齢層が罹患し、しばしば致命的である。現在、トリに感染して問題となっているＨ５型トリインフルエンザウイルスは、本来ならばヒトに感染しないものである。しかし、１９９７年に香港でヒトへの感染が確認され、１８名の患者のうち６名が死亡するまでの流行となった。それ以降のヒトへの感染は幸い確認されていなかったが、２００４年に入ってから、タイやベトナムでヒトへの感染が確認されており、タイでは８名、ベトナムでは１６名の死亡者が出ている。
【０００３】
高病原性のトリインフルエンザウイルスは、Ｈ５型のほかにＨ７型が存在し、Ｈ７型は、その配列によって、ユーラシア型とアメリカ型に大きく２分される。２００３年にオランダで流行した際には死亡者が１名報告されており、アメリカでも２００３年から２００４年にかけてＨ７型トリインフルエンザウイルスの流行が報告されている。
【０００４】
現在、トリインフルエンザウイルスの検出には、ヒトのＡ型インフルエンザウイルス迅速診断キットが用いられている。しかし、どの亜型のウイルスに感染したかの同定には、分離されたウイルスの抗原解析や遺伝子検査などのさらに詳しい解析を必要としていた。
【０００５】
確実な結果が得られるウイルス分離培養による診断は、数日を要するために迅速な診断を行うことができない。ウイルス分離と比較して迅速な診断が可能な方法がいくつかあるが、その中でもＲＴ−ＰＣＲ法は、他の方法と比較して検出感度が高いとされている。しかし、現在公開されているＲＴ−ＰＣＲ法では、ウイルスの感染価と比較して高い感度でウイルスを検出することができないとの報告があり、ＲＴ−ＰＣＲ法による検査で陰性となってもトリインフルエンザウイルスへの感染が否定されるわけではない。
【０００６】
そこで、迅速かつ高感度にＨ５型及びＨ７型トリインフルエンザウイルスを検出できる検査法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１３１０５６５号明細書
【特許文献２】公表２００４−５０９６４８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lau LT., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., vol. 313, p.336-342 (2004)
【非特許文献２】Shang S., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., vol. 302, p.377-383 (2003)
【非特許文献３】Collins RA., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., vol. 300, p.507-515 (2003)
【非特許文献４】Lee MS., et al., J. Virol.Methods, vol. 97, p.13-22 (2001)
【非特許文献５】Munch M., et al., Arch.Virol., vol. 146, p.87-97 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification）法によりＨ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、６９３番〜９５９番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２〜７で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（３） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（４） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（５） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（６） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（７） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（８） インフルエンザを診断するための、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１１】
本発明は、また、以下の（９）〜（１６）を提供する。
（９） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、１９番〜２２０番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（１０） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（９）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号１３〜１８で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（１１） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（９）〜（１０）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（１２） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（９）〜（１１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号１３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１４の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号１６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（１３） （９）〜（１２）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（１４） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（１３）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（１５） （９）〜（１２）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（１６） インフルエンザを診断するための、（９）〜（１２）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１２】
本発明は、また、以下の（１７）〜（２４）を提供する。
（１７） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、１１４番〜３３３番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（１８） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（１７）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２４〜２９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（１９） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１７）〜（１８）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（２０） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１７）〜（１９）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号２４の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２５の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号２７の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２８の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（２１） （１７）〜（２０）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（２２） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（２１）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（２３） （１７）〜（２０）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（２４） インフルエンザを診断するための、（１７）〜（２０）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１３】
本発明は、また、以下の（２５）〜（３２）を提供する。
（２５） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、８７４番〜１０６５番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２６） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（２５）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号３５〜４０で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（２７） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（２５）〜（２６）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（２８） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（２５）〜（２７）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号３５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３６の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号３８の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３９の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（２９） （２５）〜（２８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３０） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（２９）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３１） （２５）〜（２８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（３２） インフルエンザを診断するための、（２５）〜（２８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１４】
本発明は、さらに以下の（３３）〜（４０）を提供する。
（３３） 配列番号４８で示されるＨ７型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、１０１６番〜１２２５番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（３４） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（３３）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号４９〜５４で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（３５） Ｈ７型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（３３）〜（３４）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（３６） Ｈ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（３３）〜（３５）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号４９の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５０の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５２の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５３の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（３７） （３３）〜（３６）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３８） Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（３７）記載のＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３９） （３３）〜（３６）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ７型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（４０） インフルエンザを診断するための、（３３）〜（３６）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＨ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスを高感度かつ迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの特異性試験の結果を表すグラフである。（ａ），（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、プライマーセットＡ，Ｂ，Ｃ及びＤを用いた場合の結果を表している。ＮＣはネガティブコントロールを、Ｈ１はNew Caledoniaを、Ｈ３はPanamaを、ＰＣはポジティブコントロール（Ｈ５型プラスミドＤＮＡ）を表す。
【図２】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの感度試験の結果を表すグラフである。（ａ），（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、プライマーセットＡ，Ｂ，Ｃ及びＤを用いた場合の結果を表している。１０３〜１０６は、ＲＮＡ抽出物の希釈率を表す
【図３】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の電気泳動の結果を表す図である。レーン１は100bp ladder markerであり、レーン２はＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン３はＬＡＭＰ産物をDdeIで処理したサンプルである。
【図４】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの交差試験の結果を表すグラフである。B-sdはB/Shangdong/07/97を、B-shはB/Shanghai/361/2002を、AIV-H1等はトリインフルエンザウイルスＨ１等を、それぞれ表す。
【図５】Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性確認試験の結果を表すグラフである。２５０、１００、５０はＲＮＡの添加量（コピー／アッセイ）を表し、ＮＣは陰性対照を表す。
【図６】Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の電気泳動の結果を表す図である。レーンＭは100bp ladder markerであり、レーン１はＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン２はＬＡＭＰ産物をPstIで処理したサンプルである。
【図７】Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの交差性試験の結果を表すグラフである。H1及びH3はヒトインフルエンザウイルスＨ１型及びＨ３型を表し、B-sdはB/Shangdong/07/97を表し、B-shはB/Shanghai/361/2002を表し、AIV-H1等はトリインフルエンザウイルスＨ１等を表し、ＰＣは陽性対照を表し、ＮＣは陰性対照を表す。
【図８】様々な株に対するＨ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の結果を表すグラフである。（ａ）はA/Netherlands/219/2003を表し、（ｂ）はA/Netherlands/33/2003を表す。１０５〜１０８は、ＲＮＡ抽出物の希釈率を表す。
【図９】様々な株に対するＨ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の結果を表すグラフである。（ａ）はA/mallard/Netherlands/12/00を表し、（ｂ）はA/wigeon/Osaka/1/2001を表す。１０５〜１０８は、ＲＮＡ抽出物の希釈率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において使用される試料としては、インフルエンザウイルス感染が疑われる人間又は他の動物の生体由来の検体、例えば、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む検体なども試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行っても良い。
【００１８】
このような核酸の増幅は、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）で達成される。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法は、最低６つの領域を認識する４つのプライマーを使う特異性の高い核酸増幅法である。
【００１９】
ＬＡＭＰ法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＢとアウタープライマーＦ及びＢと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の相補鎖をＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＦＩＰと略す）、そして「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＢＩＰと略す）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の「インナープライマーが認識する領域よりも３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域」を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、Ｆ３と略す）、「Ｂ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３と略す）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｂとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００２０】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマー(Loop Primer)は、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（二本鎖を構成する各々について１つずつ）をいう。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。
【００２１】
オリゴヌクレオチドは、公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、所望の塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組合せて、かかるオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。
【００２２】
本明細書における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、一般に知られたものを選択することができる。ストリンジェントな条件として、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄する、という条件があげられる。
【００２３】
インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスである。ＬＡＭＰ法は鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で、同様に核酸増幅反応を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。
【００２４】
本発明者らはＨ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの塩基配列（配列番号１で示される塩基配列）から、プライマーセットとして次のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４組を選定した。なお、これらのプライマーの配列は、既に報告されている（例えば、特許文献２）、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの検出のためのＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）用のプライマーの配列とは全く異なる。
（プライマーセットＡ）
ＦＩＰ１９ｃ：5'-ACCATATTCCAACTCACTTTTCATAATTTCATTGCTCCAGAATATGC-3' （配列番号８）
ＢＩＰ５：5'-CAAACTCCAATGGGGGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3' （配列番号９）
Ｆ３ｍ６：5'-GGAGTTCTTCTGGACAA-3' （配列番号４）
Ｂ３ｍ：5'-GTCGCAAGGACTAATCT-3' （配列番号１０）
ＬＦ２４：5'-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3' （配列番号１１）
ＬＢ１：5'-GATAAACTCTAGTATGCCA-3' （配列番号１２）
（プライマーセットＢ）
ＦＩＰ：5'-GGGCATGTGTAACAGTAACGTTAAACAACTCGACAGAGCA-3' （配列番号１９）
ＢＩＰ：5'-TGGAAAAGACACACAATGGGAACATCCAGCTACACTACAATC-3' （配列番号２０）
Ｆ３：5'-CAGATTTGCATTGGTTACCA-3' （配列番号１５）
Ｂ３：5'-CGTCACACATTGGGTTTC-3' （配列番号２１）
ＬＦ：5'-TTCCATTATTGTGTCAACC-3' （配列番号２２）
ＬＢ８：5'-CGATCTAGATGGAGTGAAGC-3' （配列番号２３）
（プライマーセットＣ）
ＦＩＰ：5'-CACATTGGGTTTCCGAGGAGATCTAGATGGAGTGAAGCC-3' （配列番号３０）
ＢＩＰ：5'-TTCATCAATGTGCCGGAATGGGTTGAAATCCCCTGGGTA-3' （配列番号３１）
Ｆ３：5'-GGAAAAGACACACAATGGG-3' （配列番号２６）
Ｂ３：5'-GCTCAATAGGTGTTTCAGTT-3' （配列番号３２）
ＬＦ６：5'-CCAGCTACACTACAATCTCT-3' （配列番号３３）
ＬＢ６：5'-TCCAGCCAATGACCTCTG-3' （配列番号３４）
（プライマーセットＤ）
ＦＩＰ：5'-TCGCAAGGACTAATCTGTTTGACATACACCCTCTCACCAT-3' （配列番号４１）
ＢＩＰ：5'-TACCCCTCAAAGAGAGAGAAGATCCTCCCTCTATAAAACCTG-3' （配列番号４２）
Ｆ３：5'-TCTAGTATGCCATTCCACAA-3' （配列番号３７）
Ｂ３：5'-ACCATCTACCATTCCCTG-3' （配列番号４３）
ＬＦ８：5'-TCACATATTTGGGGCATTCC-3' （配列番号４４）
ＬＢ８：5'-AGAGAGGACTATTTGGAGCT-3' （配列番号４５）
【００２５】
さらに、本発明者らはＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列（配列番号４８で示される塩基配列）から、以下のプライマーセットＥを選定した。
（プライマーセットＥ）
２２ＦＩＰ：5'-ACCACCCATCAATCAAACCTTCTATTTGGTGCTATAGCGG-3' （配列番号５５）
２２ＢＩＰ：5'-TTCAGGCATCAAAATGCACAAGCCTGTTATTTGATCAATTGCTG-3' （配列番号５６）
２２Ｆ３ｍ：5'-TTCCCGAAATCCCAAA-3' （配列番号５１）
２２Ｂ３：5'-GGTTAGTTTTTTCTATAAGCCG-3' （配列番号５７）
２２−９ＬＦ：5'-CCCATCCATTTTCAATGAAAC-3' （配列番号５８）
２２−９ＬＢ：5'-ACTGCTGCAGATTACAAAAG-3' （配列番号５９）
【００２６】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Bst ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはBstＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)が挙げられる。
【００２７】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法に用いる逆転写酵素としては、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、AMV、Cloned AMV、MMLVの逆転写酵素、SuperscriptII、ReverTraAce、Thermoscript等が挙げられ、好ましくは、AMV又はClonedAMV逆転写酵素が挙げられる。またBca ＤＮＡポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応を１つの酵素で行うことができる。
【００２８】
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌などから精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
【００２９】
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）を用いて検出することができ、また、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００３０】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化する事ができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ、核酸合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の確認
プライマーの反応性の確認を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法により核酸の増幅を行うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成はＱＩＡＧＥＮ社に依頼し、ＯＰＣ（逆相カラムカートリッジ）精製したものを使用した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＦＩＰ
１．６μＭ ＢＩＰ
０．２μＭ Ｆ３
０．２μＭ Ｂ３
０．８μＭ ＬＦ
０．８μＭ ＬＢ
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ２Ｕ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）
Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １６Ｕ（ＮＥＢ）
【００３３】
上記反応溶液に、Ｈ５型プラスミドＤＮＡ（HK/213/03；国立感染症研究所から供与）を１０４コピー加えて、６２．５℃で６０分間ＲＴ−ＬＡＭＰ反応を行った。リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−３２０Ｃ（栄研化学）を用いて、リアルタイムに反応を検出した。その結果、４つのプライマーセット（プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）について増幅が確認された。
【００３４】
さらに、その４セットについて、培養ウイルスであるNew Caledonia（Ｈ１Ｎ１）及びPanama（Ｈ３Ｎ２）から抽出したＲＮＡを鋳型に使って特異性試験を行った。図１は、特異性試験の結果を表すグラフである。図１に示したように、いずれのプライマーセットを用いた場合も、Ｈ１型及びＨ３型の増幅は確認されなかった。以上の結果から、いずれのプライマーセットも、Ｈ５型に対する特異性が高いことが明らかとなった。
【００３５】
次に、培養ウイルスであるVetnam/JP1203/04（Ｈ５Ｎ１）から抽出したＲＮＡを使って、感度試験を行った。抽出ＲＮＡは鋳型量が不明であるため、RNasefreeの滅菌水で１０３〜１０６倍希釈したものを鋳型サンプルとして用いた。図２は、感度試験の結果を表すグラフである。プライマーセットＡを用いた場合、１０５倍希釈したサンプルでも増幅が確認されており、最も高感度であることが明らかとなった。
【００３６】
実施例２：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の確認
プライマーセットＡで増幅したＬＡＭＰ産物について、電気泳動及び制限酵素DdeIでの確認を行った。図３は、電気泳動の結果を表す図である。図３のレーン２から明らかなように、ＬＡＭＰ産物特有のラダーパターンが確認された。また、DdeIで処理したサンプル（レーン３）では、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に増幅されていることが明らかとなった。
【００３７】
実施例３：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（交差性試験）
ヒトインフルエンザウイルスのA/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１）、A/Panama/2007/99（Ｈ３Ｎ２）、B/Shangdong/07/97及びB/Shanghai/361/2002並びにトリインフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１５（Ｈ５を除く）の合計１８種類をサンプルとした。それぞれ、培養ウイルスからQIAampViral RNA Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行い、５μＬの抽出液をＲＴ−ＬＡＭＰ反応（プライマーセットＡをプライマーとして用いた）に用いた。
【００３８】
図４（ａ）及び（ｂ）から分かるように、ＲＴ−ＬＡＭＰ法ではいずれのサンプルにおいても増幅が認められなかった。したがって、ＲＴ−ＬＡＭＰ法は特異性が高いことが明らかとなった。
【００３９】
実施例４：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（感度試験）
２００４年に山口県で感染が確認されたトリインフルエンザＨ５型株（CH/Yamaguchi7/04）及び２００４年にベトナムで感染が確認されたＨ５型株（VN/JP1203/04）を鋳型サンプルとして用いた。それぞれ、培養ウイルスから抽出したＲＮＡをRNasefreeの滅菌水で段階希釈（１０４〜１０８）を行い、ＲＴ−ＰＣＲ法には１０μＬ、ＲＴ−ＬＡＭＰ法（プライマーセットＡをプライマーとして用いた）には５μＬの希釈液を使用した。
【００４０】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、国立感染症研究所の感染症情報センターのウェブサイトに掲載されている条件を修正して行った。すなわち、市販のキット（TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)）を使用し、５０℃３０分で逆転写反応を行い、９４℃で２分間処理した後、９４℃１分、４５℃１分、７２℃１分のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間伸長反応を行い、４℃で保存した。
【００４１】
ＲＴ−ＰＣＲ法に用いたプライマー及び反応溶液の組成は以下の通りである。
プライマー（ＰＣＲ産物の長さ：７０８ｂｐ）
Ｈ５ ５１５ｆ： 5'-CATACCCAACAATAAAGAGG-3' （配列番号４６）
Ｈ５ １２２０ｒ： 5'-GTGTTCATTTTGTTAATGAT-3' （配列番号４７）
反応溶液
ＲＮＡ抽出液 １０μＬ
１０×Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μＬ
ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μＬ
ＡＭＶ ＲＴａｓｅ １μＬ
ＡＭＶ−Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｔａｑ １μＬ
Ｈ５ ５１５ｆ（１０μＭ） ２μＬ
Ｈ５ １２２０ｒ（１０μＭ） ２μＬ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ滅菌水 適宜添加して反応液を５０μＬに調整
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ法及びＲＴ−ＬＡＭＰ法による増幅の結果を表１にまとめた。表１中、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の欄には増幅が確認されたサンプルの割合を示した。また、ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅は電気泳動の結果を目視により確認した（表１中、○は増幅が検出できたことを表し、×は増幅が検出できなかったことを表す）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法とＲＴ−ＰＣＲ法とを比較した場合、いずれの株でも、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の方が１０〜１００倍感度が高かった。
【００４５】
実施例５：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の確認
プライマーセットＥの反応性の確認を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法により核酸の増幅を行うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成はＱＩＡＧＥＮ社に依頼し、ＯＰＣ（逆相カラムカートリッジ）精製したものを使用した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＦＩＰ
１．６μＭ ＢＩＰ
０．２μＭ Ｆ３
０．２μＭ Ｂ３
０．８μＭ ＬＦ
０．８μＭ ＬＢ
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ２Ｕ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）
Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １６Ｕ（ＮＥＢ）
【００４６】
A/Netherlands/219/2003（Ｈ７Ｎ７）（オランダで死亡例が出た際に分離された株）の塩基配列（配列番号４８に示す塩基配列を含む断片）をクローニングベクターに組み込み、転写反応によりＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡを２５０、１００又は５０コピー／アッセイとなるように上記反応溶液に加え、６２．５℃で３５分間、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス）を用いて、増幅反応及び検出を行った。
【００４７】
ＲＮＡの添加量が２５０、１００及び５０コピー／アッセイの場合並びに陰性対照のリアルタイム検出の結果を図５に示した。この結果より５０コピー／アッセイまで検出されることが分かった。
【００４８】
実施例６：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の確認
プライマーセットＥで増幅したＬＡＭＰ産物について、電気泳動及び制限酵素PstIでの確認を行った。図６は、電気泳動の結果を表す図である。Ｍは１００ｂｐのラダーマーカーを表し、レーン１は未処理のＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン２はＬＡＭＰ産物をPstIで消化したサンプルである。図６のレーン１から明らかなように、ＬＡＭＰ産物特有のラダーパターンが確認された。また、PstIで処理したサンプル（レーン２）では、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に増幅されていることが明らかとなった。
【００４９】
実施例７：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（交差性試験）
ヒトインフルエンザウイルスのA/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１）、A/Panama/2007/99（Ｈ３Ｎ２）、B/Shangdong/07/97及びB/Shanghai/361/2002並びにトリインフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１５（Ｈ７を除く）の合計１８種類をサンプルとし、プライマーの特異性を調べた。それぞれ、培養ウイルスからQIAampViral RNA Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行い、１００倍希釈した抽出ＲＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ反応に用いた。なお、陽性対照（ＰＣ）には実施例５で調製したＲＮＡを用い、陰性対照には蒸留水を用いた。
【００５０】
図７から分かるように、いずれのサンプルにおいても増幅が認められなかった。したがって、本発明のプライマーセットは特異性が高いことが明らかとなった。
【００５１】
実施例８：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（様々な株に対する反応性）
４種類のＨ７型トリインフルエンザウイルスゲノムを鋳型サンプルとして用いて、各ウイルスに対する感度を調べた。それぞれ、培養ウイルスから抽出したＲＮＡをRNase freeの滅菌水で段階希釈（１０５〜１０８）を行い、５μＬの希釈液を使用した。
【００５２】
各ウイルスゲノムを鋳型サンプルとした場合のリアルタイム検出の結果を図８及び９に示す。A/Netherlands/219/2003（Ｈ７Ｎ７）及びA/Netherlands/33/2003（Ｈ７Ｎ７）については、１０７希釈まで検出でき（図８を参照）、A/mallard/Netherlands/12/00（Ｈ７Ｎ３）及びA/wigeon/Osaka/1/2001（Ｈ７Ｎ７）については、１０６希釈まで検出できた（図９を参照）。以上より本発明のプライマーセットは、上記４種類の株に反応することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスを高感度かつ迅速に検出することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出法方法に関し、さらに詳しくは、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、当該プライマーを用いたＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法、インフルエンザの診断方法及びインフルエンザを診断するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは流行性のウイルス性呼吸器感染症であり、乳幼児から高齢者まで幅広い年齢層が罹患し、しばしば致命的である。現在、トリに感染して問題となっているＨ５型トリインフルエンザウイルスは、本来ならばヒトに感染しないものである。しかし、１９９７年に香港でヒトへの感染が確認され、１８名の患者のうち６名が死亡するまでの流行となった。それ以降のヒトへの感染は幸い確認されていなかったが、２００４年に入ってから、タイやベトナムでヒトへの感染が確認されており、タイでは８名、ベトナムでは１６名の死亡者が出ている。
【０００３】
高病原性のトリインフルエンザウイルスは、Ｈ５型のほかにＨ７型が存在し、Ｈ７型は、その配列によって、ユーラシア型とアメリカ型に大きく２分される。２００３年にオランダで流行した際には死亡者が１名報告されており、アメリカでも２００３年から２００４年にかけてＨ７型トリインフルエンザウイルスの流行が報告されている。
【０００４】
現在、トリインフルエンザウイルスの検出には、ヒトのＡ型インフルエンザウイルス迅速診断キットが用いられている。しかし、どの亜型のウイルスに感染したかの同定には、分離されたウイルスの抗原解析や遺伝子検査などのさらに詳しい解析を必要としていた。
【０００５】
確実な結果が得られるウイルス分離培養による診断は、数日を要するために迅速な診断を行うことができない。ウイルス分離と比較して迅速な診断が可能な方法がいくつかあるが、その中でもＲＴ−ＰＣＲ法は、他の方法と比較して検出感度が高いとされている。しかし、現在公開されているＲＴ−ＰＣＲ法では、ウイルスの感染価と比較して高い感度でウイルスを検出することができないとの報告があり、ＲＴ−ＰＣＲ法による検査で陰性となってもトリインフルエンザウイルスへの感染が否定されるわけではない。
【０００６】
そこで、迅速かつ高感度にＨ５型及びＨ７型トリインフルエンザウイルスを検出できる検査法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１３１０５６５号明細書
【特許文献２】公表２００４−５０９６４８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lau LT., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., vol. 313, p.336-342 (2004)
【非特許文献２】Shang S., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., vol. 302, p.377-383 (2003)
【非特許文献３】Collins RA., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., vol. 300, p.507-515 (2003)
【非特許文献４】Lee MS., et al., J. Virol.Methods, vol. 97, p.13-22 (2001)
【非特許文献５】Munch M., et al., Arch.Virol., vol. 146, p.87-97 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification）法によりＨ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、６９３番〜９５９番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２〜７で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（３） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（４） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（５） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（６） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（７） （１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（８） インフルエンザを診断するための、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１１】
本発明は、また、以下の（９）〜（１６）を提供する。
（９） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、１９番〜２２０番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（１０） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含む、（９）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号１３〜１８で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（１１） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（９）〜（１０）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（１２） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（９）〜（１１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号１３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１４の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号１６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（１３） （９）〜（１２）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（１４） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（１３）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（１５） （９）〜（１２）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（１６） インフルエンザを診断するための、（９）〜（１２）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１２】
本発明は、また、以下の（１７）〜（２４）を提供する。
（１７） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、１１４番〜３３３番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（１８） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（１７）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号２４〜２９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（１９） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１７）〜（１８）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（２０） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１７）〜（１９）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号２４の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２５の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号２７の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２８の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（２１） （１７）〜（２０）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（２２） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（２１）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（２３） （１７）〜（２０）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（２４） インフルエンザを診断するための、（１７）〜（２０）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１３】
本発明は、また、以下の（２５）〜（３２）を提供する。
（２５） 配列番号１で示されるＨ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、８７４番〜１０６５番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２６） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（２５）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号３５〜４０で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（２７） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（２５）〜（２６）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（２８） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（２５）〜（２７）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号３５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３６の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号３８の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３９の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（２９） （２５）〜（２８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３０） Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（２９）記載のＨ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３１） （２５）〜（２８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ５型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（３２） インフルエンザを診断するための、（２５）〜（２８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１４】
本発明は、さらに以下の（３３）〜（４０）を提供する。
（３３） 配列番号４８で示されるＨ７型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列の、１０１６番〜１２２５番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（３４） 以下の（ａ）〜（ｃ）より選ばれたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする（３３）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）配列番号４９〜５４で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
（３５） Ｈ７型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（３３）〜（３４）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（３６） Ｈ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（３３）〜（３５）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号４９の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５０の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５２の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５３の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（３７） （３３）〜（３６）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３８） Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（３７）記載のＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
（３９） （３３）〜（３６）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ７型トリインフルエンザウイルス感染の有無を診断することを特徴とするインフルエンザの診断方法。
（４０） インフルエンザを診断するための、（３３）〜（３６）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＨ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスを高感度かつ迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの特異性試験の結果を表すグラフである。（ａ），（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、プライマーセットＡ，Ｂ，Ｃ及びＤを用いた場合の結果を表している。ＮＣはネガティブコントロールを、Ｈ１はNew Caledoniaを、Ｈ３はPanamaを、ＰＣはポジティブコントロール（Ｈ５型プラスミドＤＮＡ）を表す。
【図２】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの感度試験の結果を表すグラフである。（ａ），（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、プライマーセットＡ，Ｂ，Ｃ及びＤを用いた場合の結果を表している。１０３〜１０６は、ＲＮＡ抽出物の希釈率を表す
【図３】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の電気泳動の結果を表す図である。レーン１は100bp ladder markerであり、レーン２はＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン３はＬＡＭＰ産物をDdeIで処理したサンプルである。
【図４】Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの交差試験の結果を表すグラフである。B-sdはB/Shangdong/07/97を、B-shはB/Shanghai/361/2002を、AIV-H1等はトリインフルエンザウイルスＨ１等を、それぞれ表す。
【図５】Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性確認試験の結果を表すグラフである。２５０、１００、５０はＲＮＡの添加量（コピー／アッセイ）を表し、ＮＣは陰性対照を表す。
【図６】Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の電気泳動の結果を表す図である。レーンＭは100bp ladder markerであり、レーン１はＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン２はＬＡＭＰ産物をPstIで処理したサンプルである。
【図７】Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの交差性試験の結果を表すグラフである。H1及びH3はヒトインフルエンザウイルスＨ１型及びＨ３型を表し、B-sdはB/Shangdong/07/97を表し、B-shはB/Shanghai/361/2002を表し、AIV-H1等はトリインフルエンザウイルスＨ１等を表し、ＰＣは陽性対照を表し、ＮＣは陰性対照を表す。
【図８】様々な株に対するＨ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の結果を表すグラフである。（ａ）はA/Netherlands/219/2003を表し、（ｂ）はA/Netherlands/33/2003を表す。１０５〜１０８は、ＲＮＡ抽出物の希釈率を表す。
【図９】様々な株に対するＨ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の結果を表すグラフである。（ａ）はA/mallard/Netherlands/12/00を表し、（ｂ）はA/wigeon/Osaka/1/2001を表す。１０５〜１０８は、ＲＮＡ抽出物の希釈率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において使用される試料としては、インフルエンザウイルス感染が疑われる人間又は他の動物の生体由来の検体、例えば、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む検体なども試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行っても良い。
【００１８】
このような核酸の増幅は、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）で達成される。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法は、最低６つの領域を認識する４つのプライマーを使う特異性の高い核酸増幅法である。
【００１９】
ＬＡＭＰ法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＢとアウタープライマーＦ及びＢと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の相補鎖をＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＦＩＰと略す）、そして「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＢＩＰと略す）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の「インナープライマーが認識する領域よりも３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域」を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、Ｆ３と略す）、「Ｂ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３と略す）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｂとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００２０】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマー(Loop Primer)は、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（二本鎖を構成する各々について１つずつ）をいう。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。
【００２１】
オリゴヌクレオチドは、公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、所望の塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組合せて、かかるオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。
【００２２】
本明細書における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、一般に知られたものを選択することができる。ストリンジェントな条件として、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄する、という条件があげられる。
【００２３】
インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスである。ＬＡＭＰ法は鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で、同様に核酸増幅反応を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。
【００２４】
本発明者らはＨ５型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの塩基配列（配列番号１で示される塩基配列）から、プライマーセットとして次のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４組を選定した。なお、これらのプライマーの配列は、既に報告されている（例えば、特許文献２）、Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの検出のためのＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）用のプライマーの配列とは全く異なる。
（プライマーセットＡ）
ＦＩＰ１９ｃ：5'-ACCATATTCCAACTCACTTTTCATAATTTCATTGCTCCAGAATATGC-3' （配列番号８）
ＢＩＰ５：5'-CAAACTCCAATGGGGGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3' （配列番号９）
Ｆ３ｍ６：5'-GGAGTTCTTCTGGACAA-3' （配列番号４）
Ｂ３ｍ：5'-GTCGCAAGGACTAATCT-3' （配列番号１０）
ＬＦ２４：5'-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3' （配列番号１１）
ＬＢ１：5'-GATAAACTCTAGTATGCCA-3' （配列番号１２）
（プライマーセットＢ）
ＦＩＰ：5'-GGGCATGTGTAACAGTAACGTTAAACAACTCGACAGAGCA-3' （配列番号１９）
ＢＩＰ：5'-TGGAAAAGACACACAATGGGAACATCCAGCTACACTACAATC-3' （配列番号２０）
Ｆ３：5'-CAGATTTGCATTGGTTACCA-3' （配列番号１５）
Ｂ３：5'-CGTCACACATTGGGTTTC-3' （配列番号２１）
ＬＦ：5'-TTCCATTATTGTGTCAACC-3' （配列番号２２）
ＬＢ８：5'-CGATCTAGATGGAGTGAAGC-3' （配列番号２３）
（プライマーセットＣ）
ＦＩＰ：5'-CACATTGGGTTTCCGAGGAGATCTAGATGGAGTGAAGCC-3' （配列番号３０）
ＢＩＰ：5'-TTCATCAATGTGCCGGAATGGGTTGAAATCCCCTGGGTA-3' （配列番号３１）
Ｆ３：5'-GGAAAAGACACACAATGGG-3' （配列番号２６）
Ｂ３：5'-GCTCAATAGGTGTTTCAGTT-3' （配列番号３２）
ＬＦ６：5'-CCAGCTACACTACAATCTCT-3' （配列番号３３）
ＬＢ６：5'-TCCAGCCAATGACCTCTG-3' （配列番号３４）
（プライマーセットＤ）
ＦＩＰ：5'-TCGCAAGGACTAATCTGTTTGACATACACCCTCTCACCAT-3' （配列番号４１）
ＢＩＰ：5'-TACCCCTCAAAGAGAGAGAAGATCCTCCCTCTATAAAACCTG-3' （配列番号４２）
Ｆ３：5'-TCTAGTATGCCATTCCACAA-3' （配列番号３７）
Ｂ３：5'-ACCATCTACCATTCCCTG-3' （配列番号４３）
ＬＦ８：5'-TCACATATTTGGGGCATTCC-3' （配列番号４４）
ＬＢ８：5'-AGAGAGGACTATTTGGAGCT-3' （配列番号４５）
【００２５】
さらに、本発明者らはＨ７型トリインフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン塩基配列（配列番号４８で示される塩基配列）から、以下のプライマーセットＥを選定した。
（プライマーセットＥ）
２２ＦＩＰ：5'-ACCACCCATCAATCAAACCTTCTATTTGGTGCTATAGCGG-3' （配列番号５５）
２２ＢＩＰ：5'-TTCAGGCATCAAAATGCACAAGCCTGTTATTTGATCAATTGCTG-3' （配列番号５６）
２２Ｆ３ｍ：5'-TTCCCGAAATCCCAAA-3' （配列番号５１）
２２Ｂ３：5'-GGTTAGTTTTTTCTATAAGCCG-3' （配列番号５７）
２２−９ＬＦ：5'-CCCATCCATTTTCAATGAAAC-3' （配列番号５８）
２２−９ＬＢ：5'-ACTGCTGCAGATTACAAAAG-3' （配列番号５９）
【００２６】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Bst ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはBstＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)が挙げられる。
【００２７】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法に用いる逆転写酵素としては、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、AMV、Cloned AMV、MMLVの逆転写酵素、SuperscriptII、ReverTraAce、Thermoscript等が挙げられ、好ましくは、AMV又はClonedAMV逆転写酵素が挙げられる。またBca ＤＮＡポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応を１つの酵素で行うことができる。
【００２８】
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌などから精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
【００２９】
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）を用いて検出することができ、また、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００３０】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化する事ができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ、核酸合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の確認
プライマーの反応性の確認を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法により核酸の増幅を行うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成はＱＩＡＧＥＮ社に依頼し、ＯＰＣ（逆相カラムカートリッジ）精製したものを使用した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＦＩＰ
１．６μＭ ＢＩＰ
０．２μＭ Ｆ３
０．２μＭ Ｂ３
０．８μＭ ＬＦ
０．８μＭ ＬＢ
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ２Ｕ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）
Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １６Ｕ（ＮＥＢ）
【００３３】
上記反応溶液に、Ｈ５型プラスミドＤＮＡ（HK/213/03；国立感染症研究所から供与）を１０４コピー加えて、６２．５℃で６０分間ＲＴ−ＬＡＭＰ反応を行った。リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−３２０Ｃ（栄研化学）を用いて、リアルタイムに反応を検出した。その結果、４つのプライマーセット（プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）について増幅が確認された。
【００３４】
さらに、その４セットについて、培養ウイルスであるNew Caledonia（Ｈ１Ｎ１）及びPanama（Ｈ３Ｎ２）から抽出したＲＮＡを鋳型に使って特異性試験を行った。図１は、特異性試験の結果を表すグラフである。図１に示したように、いずれのプライマーセットを用いた場合も、Ｈ１型及びＨ３型の増幅は確認されなかった。以上の結果から、いずれのプライマーセットも、Ｈ５型に対する特異性が高いことが明らかとなった。
【００３５】
次に、培養ウイルスであるVetnam/JP1203/04（Ｈ５Ｎ１）から抽出したＲＮＡを使って、感度試験を行った。抽出ＲＮＡは鋳型量が不明であるため、RNasefreeの滅菌水で１０３〜１０６倍希釈したものを鋳型サンプルとして用いた。図２は、感度試験の結果を表すグラフである。プライマーセットＡを用いた場合、１０５倍希釈したサンプルでも増幅が確認されており、最も高感度であることが明らかとなった。
【００３６】
実施例２：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の確認
プライマーセットＡで増幅したＬＡＭＰ産物について、電気泳動及び制限酵素DdeIでの確認を行った。図３は、電気泳動の結果を表す図である。図３のレーン２から明らかなように、ＬＡＭＰ産物特有のラダーパターンが確認された。また、DdeIで処理したサンプル（レーン３）では、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に増幅されていることが明らかとなった。
【００３７】
実施例３：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（交差性試験）
ヒトインフルエンザウイルスのA/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１）、A/Panama/2007/99（Ｈ３Ｎ２）、B/Shangdong/07/97及びB/Shanghai/361/2002並びにトリインフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１５（Ｈ５を除く）の合計１８種類をサンプルとした。それぞれ、培養ウイルスからQIAampViral RNA Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行い、５μＬの抽出液をＲＴ−ＬＡＭＰ反応（プライマーセットＡをプライマーとして用いた）に用いた。
【００３８】
図４（ａ）及び（ｂ）から分かるように、ＲＴ−ＬＡＭＰ法ではいずれのサンプルにおいても増幅が認められなかった。したがって、ＲＴ−ＬＡＭＰ法は特異性が高いことが明らかとなった。
【００３９】
実施例４：Ｈ５型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（感度試験）
２００４年に山口県で感染が確認されたトリインフルエンザＨ５型株（CH/Yamaguchi7/04）及び２００４年にベトナムで感染が確認されたＨ５型株（VN/JP1203/04）を鋳型サンプルとして用いた。それぞれ、培養ウイルスから抽出したＲＮＡをRNasefreeの滅菌水で段階希釈（１０４〜１０８）を行い、ＲＴ−ＰＣＲ法には１０μＬ、ＲＴ−ＬＡＭＰ法（プライマーセットＡをプライマーとして用いた）には５μＬの希釈液を使用した。
【００４０】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、国立感染症研究所の感染症情報センターのウェブサイトに掲載されている条件を修正して行った。すなわち、市販のキット（TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)）を使用し、５０℃３０分で逆転写反応を行い、９４℃で２分間処理した後、９４℃１分、４５℃１分、７２℃１分のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間伸長反応を行い、４℃で保存した。
【００４１】
ＲＴ−ＰＣＲ法に用いたプライマー及び反応溶液の組成は以下の通りである。
プライマー（ＰＣＲ産物の長さ：７０８ｂｐ）
Ｈ５ ５１５ｆ： 5'-CATACCCAACAATAAAGAGG-3' （配列番号４６）
Ｈ５ １２２０ｒ： 5'-GTGTTCATTTTGTTAATGAT-3' （配列番号４７）
反応溶液
ＲＮＡ抽出液 １０μＬ
１０×Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μＬ
ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μＬ
ＡＭＶ ＲＴａｓｅ １μＬ
ＡＭＶ−Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｔａｑ １μＬ
Ｈ５ ５１５ｆ（１０μＭ） ２μＬ
Ｈ５ １２２０ｒ（１０μＭ） ２μＬ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ滅菌水 適宜添加して反応液を５０μＬに調整
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ法及びＲＴ−ＬＡＭＰ法による増幅の結果を表１にまとめた。表１中、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の欄には増幅が確認されたサンプルの割合を示した。また、ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅は電気泳動の結果を目視により確認した（表１中、○は増幅が検出できたことを表し、×は増幅が検出できなかったことを表す）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法とＲＴ−ＰＣＲ法とを比較した場合、いずれの株でも、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の方が１０〜１００倍感度が高かった。
【００４５】
実施例５：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの反応性の確認
プライマーセットＥの反応性の確認を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法により核酸の増幅を行うための反応溶液の組成は以下の通りである。なお、プライマーの合成はＱＩＡＧＥＮ社に依頼し、ＯＰＣ（逆相カラムカートリッジ）精製したものを使用した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＦＩＰ
１．６μＭ ＢＩＰ
０．２μＭ Ｆ３
０．２μＭ Ｂ３
０．８μＭ ＬＦ
０．８μＭ ＬＢ
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ２Ｕ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）
Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １６Ｕ（ＮＥＢ）
【００４６】
A/Netherlands/219/2003（Ｈ７Ｎ７）（オランダで死亡例が出た際に分離された株）の塩基配列（配列番号４８に示す塩基配列を含む断片）をクローニングベクターに組み込み、転写反応によりＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡを２５０、１００又は５０コピー／アッセイとなるように上記反応溶液に加え、６２．５℃で３５分間、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス）を用いて、増幅反応及び検出を行った。
【００４７】
ＲＮＡの添加量が２５０、１００及び５０コピー／アッセイの場合並びに陰性対照のリアルタイム検出の結果を図５に示した。この結果より５０コピー／アッセイまで検出されることが分かった。
【００４８】
実施例６：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットで増幅した産物の確認
プライマーセットＥで増幅したＬＡＭＰ産物について、電気泳動及び制限酵素PstIでの確認を行った。図６は、電気泳動の結果を表す図である。Ｍは１００ｂｐのラダーマーカーを表し、レーン１は未処理のＬＡＭＰ産物のサンプルであり、レーン２はＬＡＭＰ産物をPstIで消化したサンプルである。図６のレーン１から明らかなように、ＬＡＭＰ産物特有のラダーパターンが確認された。また、PstIで処理したサンプル（レーン２）では、消化が確認された。以上の結果から、標的配列が特異的に増幅されていることが明らかとなった。
【００４９】
実施例７：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（交差性試験）
ヒトインフルエンザウイルスのA/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１）、A/Panama/2007/99（Ｈ３Ｎ２）、B/Shangdong/07/97及びB/Shanghai/361/2002並びにトリインフルエンザウイルスＨ１〜Ｈ１５（Ｈ７を除く）の合計１８種類をサンプルとし、プライマーの特異性を調べた。それぞれ、培養ウイルスからQIAampViral RNA Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行い、１００倍希釈した抽出ＲＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ反応に用いた。なお、陽性対照（ＰＣ）には実施例５で調製したＲＮＡを用い、陰性対照には蒸留水を用いた。
【００５０】
図７から分かるように、いずれのサンプルにおいても増幅が認められなかった。したがって、本発明のプライマーセットは特異性が高いことが明らかとなった。
【００５１】
実施例８：Ｈ７型トリインフルエンザウイルス用プライマーセットの評価（様々な株に対する反応性）
４種類のＨ７型トリインフルエンザウイルスゲノムを鋳型サンプルとして用いて、各ウイルスに対する感度を調べた。それぞれ、培養ウイルスから抽出したＲＮＡをRNase freeの滅菌水で段階希釈（１０５〜１０８）を行い、５μＬの希釈液を使用した。
【００５２】
各ウイルスゲノムを鋳型サンプルとした場合のリアルタイム検出の結果を図８及び９に示す。A/Netherlands/219/2003（Ｈ７Ｎ７）及びA/Netherlands/33/2003（Ｈ７Ｎ７）については、１０７希釈まで検出でき（図８を参照）、A/mallard/Netherlands/12/00（Ｈ７Ｎ３）及びA/wigeon/Osaka/1/2001（Ｈ７Ｎ７）については、１０６希釈まで検出できた（図９を参照）。以上より本発明のプライマーセットは、上記４種類の株に反応することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、Ｈ５型又はＨ７型トリインフルエンザウイルスを高感度かつ迅速に検出することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の塩基配列（ａ）及び（ｂ）から成るインナープライマーセット、並びに、以下の塩基配列（ｃ）及び（ｄ）から成るアウタープライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（ａ）５’−（配列番号４９の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５０の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５２の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５３の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（ｃ）配列番号５１の塩基配列。
（ｄ）配列番号５７の塩基配列。
【請求項２】
（ｉ）配列番号５５及び配列番号５６の塩基配列から成るインナープライマーセット、並びに、（ｉｉ）配列番号５１及び配列番号５７の塩基配列から成るアウタープライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３】
（ｉ）配列番号５５及び配列番号５６の塩基配列から成るインナープライマーセット、（ｉｉ）配列番号５１及び配列番号５７の塩基配列から成るアウタープライマーセット、並びに、（ｉｉｉ）配列番号５８及び配列番号５９の塩基配列から成るループプライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行い、該増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とするＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
【請求項５】
請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いてＨ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ７型トリインフルエンザウイルス感染の有無を判断することを特徴とするインフルエンザの判断方法。
【請求項６】
インフルエンザを診断するための、請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
以下の塩基配列（ａ）及び（ｂ）から成るインナープライマーセット、並びに、以下の塩基配列（ｃ）及び（ｄ）から成るアウタープライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（ａ）５’−（配列番号４９の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５０の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号５２の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号５３の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（ｃ）配列番号５１の塩基配列。
（ｄ）配列番号５７の塩基配列。
【請求項２】
（ｉ）配列番号５５及び配列番号５６の塩基配列から成るインナープライマーセット、並びに、（ｉｉ）配列番号５１及び配列番号５７の塩基配列から成るアウタープライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３】
（ｉ）配列番号５５及び配列番号５６の塩基配列から成るインナープライマーセット、（ｉｉ）配列番号５１及び配列番号５７の塩基配列から成るアウタープライマーセット、並びに、（ｉｉｉ）配列番号５８及び配列番号５９の塩基配列から成るループプライマーセット、を備えることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて、Ｈ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行い、該増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とするＨ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法。
【請求項５】
請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いてＨ７型トリインフルエンザウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、Ｈ７型トリインフルエンザウイルス感染の有無を判断することを特徴とするインフルエンザの判断方法。
【請求項６】
インフルエンザを診断するための、請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含むことを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１６７２０７（Ｐ２０１１−１６７２０７Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２５５０７（Ｐ２０１１−１２５５０７）
【出願日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【分割の表示】特願２００６−５４３２１８（Ｐ２００６−５４３２１８）の分割
【原出願日】平成１７年１０月２６日（２００５．１０．２６）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【分割の表示】特願２００６−５４３２１８（Ｐ２００６−５４３２１８）の分割
【原出願日】平成１７年１０月２６日（２００５．１０．２６）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【Ｆターム（参考）】
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