ＨＥＲ−２ペプチド
免疫系を刺激することができ、かつＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現を随伴する悪性疾患の治療に使用することができる組成物、方法およびワクチンを提供する。こうした組成物は、ＨＥＲ−２タンパク質のエピトープを含む。一部の実施形態において、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、免疫原性である。加えて、本発明は、１つまたはそれ以上のキメラペプチドを含む組成物を提供し、該キメラペプチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを含む。加えて、１つまたはそれ以上の多価ペプチドを有する組成物を提供する。これらの多価ペプチドは、２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００５年６月１５日に出願され、表題「HER-2 Peptides」の米国仮出願第60/690,574号（この全体が、本明細書に参考として援用される）への優先権およびあらゆるほかの利益を主張する。
【０００２】
（政府の支援）
本出願に記載する研究は、少なくとも一部は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの援助 ＮＩＨ ５ＲＯＩ ＣＡ ８４３５６による支援を受けている。米国連邦政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
現在、乳癌治療の最も一般的なアプローチは、手術、化学的介入および／または放射線療法を含む。癌が被定義領域に限定されなければ、手術のみで癌を除去することはできない。それ故、手術部位付近にあり、手術を免れた癌細胞を破壊するために、手術後、放射線治療を施すことが多い。こうした治療の副作用としては、皮膚の過敏性または痒み、免疫系への干渉、時として、吐き気、および希に、肺の患部が繊維性になる放射線肺線維症が挙げられる。化学療法が手術後に用いられることもある。化学療法には、癌細胞に対して傷害性である薬物が用いられる。これは、完全に選択的なシステムではないので、正常な細胞にも影響を及ぼす。負の副作用としては、悪心、疲労、脱毛、食欲不振および下痢が挙げられる。
【０００４】
こうした現在の治療に鑑みて、さらなる乳癌治療アプローチの発見が試みられている。１つのそうしたアプローチが、免疫療法である。免疫療法アプローチのターゲットの１つは、ＨＥＲ−２タンパク質である。ＨＥＲ−２タンパク質（ＨＥＲ−２癌遺伝子の産物）は、様々な癌の際に過剰発現される。これは、非侵潤性乳管癌の５０％〜６０％およびすべての乳癌の２０％〜４０％、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺において発生する腺癌の実質的な割合に認められる。ヒトでは、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、悪性形質転換と関係がある。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、悪性疾患の攻撃性にも密接に関連しており、これは、浸潤性乳癌の四分の一に認められる。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、乳癌においても、卵巣癌においても、予後不良と相関している。
【０００５】
最近の研究において、ＨＥＲ−２の細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体は、インビトロおよびインビボ動物モデルの腫瘍増殖に対して阻害作用をもたらすことが証明された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）。加えて、転移性ＨＥＲ−２過剰発現性乳癌を有する患者における組み換えヒト化抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体であるトラスツズマブのＩＩおよびＩＩＩ相臨床試験は、単一薬剤として１５％の全奏功率をもたらした。トラスツズマブは、細胞傷害性化学療法薬と併用されたとき生存を向上させることも証明された（非特許文献６；非特許文献７）。組み換えＨＥＲ−２タンパク質、ＨＥＲ−２ ＥＣＤ、またはＨＥＲ−２のラット同族体であるラットｎｅｕのＥＣＤをターゲットにする多数のワクチンアプローチも評価された。例えば、ＥＣＤラットｎｅｕを発現するワクシニアウイルス組み換え体で免疫したＮＦＳ細胞株マウスは、ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ ３Ｔ３細胞でのその後の攻撃に対して防護的抗体応答を発現した（非特許文献８）。しかし、同じ免疫原を有するＢＤＩＸラットの免疫化は、抗体応答を生じさせず、同系ｎｅｕ発現性Ｂ １０４神経芽腫細胞の増殖も阻害しなかった。これは、この戦略が、ラットにおいて免疫応答を誘導するには不十分であったことを示唆している。コレステリル基を有するマンナンおよびプルランと複合したＨＥＲ−２ ＥＣＤの１４７のアミノ末端アミノ酸から成る多糖類腫瘍性タンパク質複合体ワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＨＥＲ−２発現性肉腫の拒絶を媒介する細胞および体液性免疫応答を誘導した（非特許文献９）。部分的防護は、精製されたラットｎｅｕ ＥＣＤ（非特許文献１０）またはｎｅｕトランスフェクテッド同種異系マウス線維芽細胞（非特許文献１１）のいずれかで免疫することにより乳房腫瘍を発現するように運命づけられたラットｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて証明されている。
【０００６】
上に記載した研究の結果にもかかわらず、ＨＥＲ−２は非突然変異「自己」抗原であるのでＨＥＲ−２またはＨＥＲ−２ ＥＣＤをターゲットにした細胞またはタンパク質ベースのワクチン戦略を用いて、ヒトにおいて有効な免疫応答を生じさせることができるかどうかは、いまだ判然としない。従って、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現を随伴する乳癌および他の悪性疾患を治療または予防するための追加の免疫療法アプローチを有することが望ましい。
【非特許文献１】Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８９，９：１１−６５−７２
【非特許文献２】Ｔａｇｌｉａｂｕｅ，Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９１，４７：９３３−７
【非特許文献３】Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，１９８６，８３：９１２９−３３
【非特許文献４】Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９８８，２：２７３−７
【非特許文献５】Ｋａｔｓｕｍａｔａ，Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９５，１：６４４−８．
【非特許文献６】Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９６，１４：７３７−４４
【非特許文献７】Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９８８，１６：２６５９−７１
【非特許文献８】Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４：６８５４−８
【非特許文献９】Ｇｕ，Ｘ．Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８：３３８５−９０
【非特許文献１０】Ｅｓｓｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９９，４７：３３７−４２
【非特許文献１１】Ｃｅｆａｉ．Ｄ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８３：３９３−４００
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（概要）
実施形態に従って、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを提供する。該エピトープは、
【０００８】
【化３６】
の配列を有する。
【０００９】
本発明の追加の実施形態は、本明細書中でさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（発明の実施形態の詳細な説明）
さて、本発明の特定の実施形態を随時参照しながら本発明を説明する。しかし、本発明は、種々の形態で具体化することができ、本明細書に記載する実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が、詳細、且つ、完全になるように、ならびに当業者に本発明の範囲を十分に知らせるために提供するものである。
【００１１】
別に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書において本発明の説明に用いる専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明の限定とは解釈されない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈に明瞭に別の指示がない限り、それらの複数形も包含すると解釈する。本明細書において言及するすべての出版物、特許出願、特許および他の参照文献は、それら全体が参照により取り入れられている。
【００１２】
本発明は、ＨＥＲ−２タンパク質の単離されたポリペプチド（本明細書では、以後、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと呼ぶ）を提供する。一部の実施形態において、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、免疫原性である。加えて、本発明は、１つまたはそれ以上のキメラペプチドを含む組成物を提供し、該キメラペプチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを含む。加えて、１つまたはそれ以上の多価ペプチドを有する組成物を提供する。これらの多価ペプチドは、２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープを含む。被験者において免疫応答を刺激する方法および癌を治療する方法をさらに提供する。治療および予防用のワクチンも提供する。単独でまたはキメラペプチドに関連して本明細書に記載するようなＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと免疫反応性である抗体の産生を生じさせる体液性応答を引き起こせるもので有りうる。一部の実施形態によると、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドは、防護効果をもたらす。
【００１３】
ＨＥＲ−２タンパク質およびそのラット同族体ｎｅｕは、約１２５５個のアミノ酸（ａａ）の長さである、１８５ｋｄの相対分子量を有する膜貫通型タンパク質である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する４０％相同性を有する約６４５ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）と、高疎水性膜貫通アンカードメイン（ＴＭＤ）と、ＥＧＦＲに対して８０％相同性を有する約５８０ａａの末端カルボキシ細胞質ドメイン（ＣＤ）とを有する。ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸配列、およびそうしたアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１１７３０に示されている。図１は、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示すものである。
【００１４】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、次の配列（本明細書では、以後、「参照配列」と呼ぶ）のうちの１つを有するペプチドを包含し、その配列とは以下のとおりである。
【００１５】
【化３７】
【００１６】
【化３８】
。
【００１７】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、環化されていることもあり、または線状であることもある。環化されている場合、それらのエピトープは、任意の適する方法で環化され得る。例えば、選択されたシステイン（Ｃｙｓ）対の間にジスルフィド結合を形成して、所望の立体配座を生じさせることができる。環化エピトープの形成により、体液性応答を向上させる、従って、防護効果を向上させる立体配座を生じさせることができると考えられる。
【００１８】
配列番号２〜５によって特定されるＨＥＲ＿２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２細胞外ドメイン（配列番号１）のトラスツズマブ結合領域内のトラスツズマブと接触する３つの領域のうちの少なくとも１つの領域を含有する。２００３年、単独でのおよびトラスツズマブのＦａｂフラグメントと複合したＨＥＲ−２の細胞外領域の結晶構造が、発表された。トラスツズマブは、ループ１：５７９−５８３（Ｃ５６３−Ｃ５７６間、およびＣ５６７−Ｃ５８４間の２つのジスルフィド対合）、ループ２：５９２−５９５（Ｃ５８７−Ｃ５９６間のシステインジスルフィド対合）およびループ３：６１５−６２５（Ｃ６００−Ｃ６２３間のシステインジスルフィド）において配列番号１からの残基を含むサブドメインＩＶ内の３つのループと相互作用することが明らかになった。ループ１および３は、主として静電相互作用によるトラスツズマブとの相互作用によってさらに安定化され、これに対してループ２は、疎水性相互作用に参加する。
【００１９】
配列番号２によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質（配列番号１）の５６３〜５９８位を表す。配列番号２によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−５６３とＣｙｓ−５７６の間、Ｃｙｓ−５６７とＣｙｓ−５８４の間、および／またはＣｙｓ−５８７とＣｙｓ−５９６の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号３によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、５８５〜５９８位を表す。配列番号３によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−５８７とＣｙｓ−５９６の間のジスルフィド結合形成によって環化することができる。配列番号４によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、５９７〜６２６位を表し、下線が引かれているロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸は、ジスルフィド結合形成に干渉しないようにＣｙｓからＬｅｕに突然変異させた。配列番号４によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−６００とＣｙｓ−６２３の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号５によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、６１３〜６２６位を表し、太字Ｌｅｕアミノ酸は、本明細書中でさらに論じるように、ジスルフィド結合形成に干渉しないようにＣｙｓからＬｅｕに突然変異させた。配列番号４および５に示されているＬｅｕアミノ酸は、代替的にＣｙｓである場合があることは、理解されるであろう。
【００２０】
配列番号６〜８によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２（配列番号１）のペルツズマブ結合部位に類似した抗体を惹起するように設計された配列を表す。配列番号６によって特定されるＨＥＲ＿２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質（配列番号１）の３１５〜３３３位を表す。配列番号６によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−３１５とＣｙｓ−３３１の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号７によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、２９８〜３３３位を表す。配列番号７によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−２９９とＣｙｓ−３１１の間、および／またはＣｙｓ３１５とＣｙｓ３３１の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号８によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、２６６〜２９６位を表す。配列番号８によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−２６８とＣｙｓ−２９５の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。
【００２１】
配列番号９によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、６２６〜６４９位を表す。この配列は、Ｃｙｓ−６２６とＣｙｓ−６３４の間、および／またはＣｙｓ−６３０とＣｙｓ−６３４の間にジスルフィド結合を有することがある。１つより多くのＣｙｓを有する各エピトープが、環化されていることもあり、または線状であることもあることは、理解されるであろう。
【００２２】
本明細書に記載するようなＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、配列番号２〜９によって特定されるエピトープの機能的等価物であるペプチドも包含する。こうした機能的等価物は、対応するＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列におけるアミノ酸の１つもしくはそれ以上が置換されている、または１つもしくはそれ以上のアミノ酸が、対応する参照配列から欠失している、もしくは対応する参照配列に付加されている、改変配列を有する。例えば、１から３個のアミノ酸がアミノ末端、カルボキシ末端または両方に付加されていることがある。一部の例では、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、グリコシル化されている。
【００２３】
他の例では、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのレトロ−インベルソ異性体であり得る。このレトロ−インベルソ修飾は、ペプチド骨格内のすべてのアミド結合の逆転を含む。この逆転は、Ｄアミノ酸をＬアミノ酸の代わりに使用することにより、配列の方向を逆転させ、各アミノ酸残基のキラリティーを反転させることによって達成することができる。このレトロ−インベルソ異性体形は、少なくとも一部のペプチド結合の平面性および配座拘束を保持する。例えば、配列番号５の非レトロ−インベルソ形は、ＮＨ２−Ｌ［ＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＬ］−ＣＯＯＨと示すことができる。配列番号５のレトロ−インベルソ形は、ＮＨ２−Ｄ［ＬＰＱＣＡＧＥＥＤＰＦＫＷＩ］−ＣＯＯＨと示すことができる。
【００２４】
非保存的アミノ酸置換および／または保存的置換を行うことができる。置換は、置換されたアミノ酸が、参照配列内の対応するアミノ酸と同様の構造的または化学的特性を有する場合、保存的アミノ酸置換である。一例として、保護的アミノ酸置換は、ある脂肪族または疎水性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、の別の脂肪族または疎水性アミノ酸での置換；あるヒドロキシ含有アミノ酸、例えばセリンおよびトレオニン、の別のヒドロキシ含有アミノ酸での置換；ある酸性残基、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸、の別の酸性残基での置換；あるアミド含有残基、例えばアスパラギンおよびグルタミン、の別のアミド含有残基との交換；ある芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシン、と別の芳香族残基との交換；ある塩基性残基、例えばリシン、アルギニンおよびヒスチジン、と別の塩基性残基との交換；ならびにある小さなアミノ酸、例えばアラニン、セリン、トレオニン、メチオニンおよびグリシン、と別の小さなアミノ酸との交換を含む。
【００２５】
一部の例では、上に示す配列のうちの１つのアミノ末端、カルボキシ末端または両方に欠失および付加がある。例えば、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープ等価物は、対応するＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一である配列は、参照配列の１０個のアミノ酸当たり１つより多くの交代、すなわち、欠失、付加または置換の一切の組み合わせを有さない。同一率は、ＤＮＡ ＳＴＡＲプログラムのＭＥＧＡＬＩＧＮプロジェクトを使用して参照配列と変異体のアミノ酸配列を比較することにより決定する。
【００２６】
対応するＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列より長い機能的等価物の場合、その機能的等価物は、野生型ＨＥＲ−２タンパク質におけるＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列およびそのＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列に隣接する配列と、少なくとも９０％同一である配列を有し得る。
【００２７】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの機能的等価物は、そのエピトープの配列を修飾し、その得られたポリペプチドを、免疫応答を刺激する能力、例えば抗体の産生についてアッセイすることによって、特定することができる。例えば、一般に、こうしたアッセイは、修飾ポリペプチドおよびＴｈエピトープを含むキメラペプチドを作製し、そのキメラペプチドを試験動物に注射し、抗体についてアッセイすることによって行うことができる。こうした抗体は、血清および腹水をはじめとする様々な体液において見出すことができる。簡単に言うと、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドに特異的な抗体が存在するかどうか判定することが望まれる温血動物、例えばヒト、から体液サンプルを単離する。その体液を、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドとともに、そのポリペプチドとそのタンパク質に特異的な抗体との免疫複合体を形成させるために十分な条件下、形成させるために十分な時間、インキュベートし、その後、好ましくはＥＬＩＳＡ技術を用いて、アッセイする。こうした技術では、比色変化を４９０ｎｍで測定する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対して１０，０００またはそれ以上の力価を示す抗体の産生を誘導するエピトープが有用であり得る。本明細書で用いる場合、１０，０００の力価は、バックグラウンドより０．２高い吸収値を指す。
【００２８】
本発明の他の実施形態に従って、キメラペプチド、および１つまたはそれ以上のキメラペプチドを含む組成物を提供する。様々な実施形態によると、これらのキメラペプチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、そのＨＥＲ−２ ＢエピトープをそのＴｈエピトープに連結させるリンカーとを含む。任意の適するＴｈエピトープを使用できることは理解されるであろう。例えば、プロミスカスＴｈエピトープを使用することができる。本明細書で用いる場合、「プロミスカス」Ｔｈエピトープは、ＭＨＣ拘束の回避を補助するサイトカインの放出を促進するものである。さらに、任意の適するリンカーを使用できることは理解されるであろう。例えば、使用されるＴｈエピトープに依存して、ＨＥＲ−２ ＢエピトープをそのＴｈエピトープのアミノ末端に連結させることもあり、またはカルボキシ末端に連結させることもある。Ｔｈエピトープの位置および選択は、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの構造的特徴、αヘリカルであるのか、ベータ・ターンであるのか、鎖であるのか、に依存する。適するＴｈエピトープの選択方法は、Ｋａｕｍａｙａら、「ＤＥ ＮＯＶＯ」ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ ＡＮＤ ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ ＡＳ ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ，ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），ｐｐ．１３３−１６４に記載されている。これは、特に、本明細書に参照により取り入れてられている。Ｂ細胞エピトープキメラを含有する様々なＴｈエピトープを惹起した免疫応答の概要は、Ｋａｕｍａｙａらにより「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｄｒｅａｍ ｏｒ Ｒｅａｌｉｔｙ」と題する総説に提示されており、ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．（１９９６）において発表された。
【００２９】
一部の例では、Ｔｈエピトープは、約１４から約２２個、約１５から２１個、または約１６個のアミノ酸の長さであり得る。他の実施形態における、適するＴｈエピトープの例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００３０】
【化３９】
。
【００３１】
他の例では、リンカーは、約２から約１５個のアミノ酸、約２から約１０個のアミノ酸、または約２から約６個のアミノ酸の長さのペプチドであり得る。例えば、リンカーは、アミノ酸配列 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、配列番号１８を有するペプチドであり得る。このキメラペプチドは、線状であることもあり、または環化されていることもある。加えて、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープ、Ｔｈエピトープおよび／またはリンカーは、レトロ−インベルソ形であることがある。従って、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのみが、レトロ−インベルソ形である場合がある。あるいは、ＨＥＲ−２ ＢエピトープおよびＴｈエピトープが、レトロ−インベルソ形である場合がある。もう１つの例では、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープ、Ｔｈエピトープおよびリンカーが、レトロ−インベルソ形であり得る。
【００３２】
適するキメラペプチドの例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００３３】
【化４０】
。
【００３４】
配列番号１９〜２６のペプチドは、Ｔｈエピトープ、ＧＰＳＬリンカーおよびＨＥＲ−２ Ｂエピトープを有する。
【００３５】
前記キメラペプチドおよび該ペプチドを含む組成物は、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと相互作用し、それらに結合する抗体の産生を誘導するために有用な免疫原であり得る。前記キメラペプチドは、被験者の血清中のＨＥＲ−２タンパク質に対する抗体を検出するための実験ツールとしても有用であり得る。前記キメラペプチドは、被験者において抗体応答を引き起こすことができ、そうした抗体は、（ａ）ＨＥＲ−２タンパク質を免疫沈降させることができ、（ｂ）培養でのＥＲ−２過剰発現細胞上の無傷ＨＥＲ２受容体に結合することができ、および（ｃ）インビトロでＨＥＲ−２過剰発現細胞の増殖を減少させることができる。前記キメラペプチドを使用して、被験者を免疫し、腫瘍の発現を遅らせるまたは防止することもできる。前記キメラペプチドをワクチンで使用して、防護効果をもたらすことができる。
【００３６】
本発明の追加の実施形態に従って、２つまたはそれ以上のキメラペプチドの混合物を含む組成物を提供する。一部の例では、該２つまたはそれ以上のキメラペプチドのＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、異なる。他の例では、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの１つは、配列番号２〜５から選択され、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの別の１つは、配列番号６〜８から選択される。
【００３７】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、市販のペプチド合成装置を使用して合成することができる。例えば、Ｋａｕｍａｙａら、「ＤＥ ＮＯＶＯ」ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ ＡＮＤ ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ ＡＳ ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ，ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｄｅｓｉｇｎ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），ｐｐ １３３−１６４（これは、特に、本明細書に参照により取り入れられている）に記載されているキメラ法を使用することができる。
【００３８】
例えば、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープをＴｈエピトープと共直線的に合成して、キメラペプチドを形成することができる。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕｔ化学を用いて行うことができる。該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、任意の適する方法で環化することができる。例えば、ジスルフィド結合は、差次的に保護されたシステイン残基、ヨウ素酸化、Ａｃｍ除去およびジスルフィド結合の付随的形成を増進するための水の添加、ならびに／またはシリルクロライド−スルホキシド法を用いて実現することができる。
【００３９】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、無細胞翻訳系、および該エピトープまたはペプチドをコードしているＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ分子を使用して生産することもできる。あるいは、該エピトープまたはキメラペプチドは、それぞれのエピトープまたはキメラエピトープをコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、その後、その宿主細胞においてそれらのポリペプチドの発現を誘導することにより、作製することができる。組み換え生産については、該エピトープ、キメラペプチドまたはその変異体をコードしている配列を１つまたはそれ以上含む組み換え構築物を、従来の方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または感染、によって宿主細胞に導入する。
【００４０】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、従来の技術を用いて、適切なプロモーターの制御の下、例えば哺乳動物細胞、酵母、細菌、昆虫細胞または他の細胞などの適する宿主細胞において発現させることができる。適する宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｃｏｓ細胞および２９３ＨＥＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適する宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後、遠心分離によって細胞を回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を、エピトープまたはキメラペプチドのさらなる精製のために確保しておく。
【００４１】
形質転換宿主細胞から組み換えタンパク質を単離するための従来の手順、例えば、細胞ペレットまたは細胞培養基からの最初の抽出による単離、続いて、塩析そして水性イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー段階、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および親和クロマトグラフィーをはじめとする１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー段階、を用いて、組み換えポリペプチドを単離することができる。
【００４２】
グリコシル化エピトープおよびキメラペプチドを生産するには、組み換え技法を用いることができる。例えば、Ｃｏｓ−７およびＨｅｐ−Ｇ２細胞などの哺乳動物細胞をこの組み換え技法に用いることができる。あるいは、グリコシル化エピトープおよびキメラペプチドは、標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕｔ合成を用いて生産することができる。例えば、オリゴ糖転移のキー酵素としてエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いる化学酵素的アプローチを用いて、１つまたはそれ以上の糖単位をペプチドに付加させることができる。
【００４３】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの自然発生変異体も、例えば、そのポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列で適切なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、単離することができる。
【００４４】
さらなる実施形態に従って、複数の、すなわち、少なくとも２つの、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはそれらの機能的等価物とＴｈエピトープとを含む多価ペプチドを提供する。該ＨＥＲ−２ ＢエピトープおよびＴｈエピトープは、テンプレートに連結している。例えば、該ＨＥＲ−２ ＢエピトープおよびＴｈエピトープは、コアβシートテンプレートに連結していることがある。もう１つの例では、該テンプレートは、リンカーによって連結されている、交互のロイシンおよびリシン残基の２本の鎖であり得る。該リンカーは、１個のアミノ酸であるか、約２から約１５個のアミノ酸、約２から約１０個のアミノ酸、または約２から約６個のアミノ酸の長さのペプチドである。例えば、該リンカーは、アミノ酸配列 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、配列番号１８であり得る。
【００４５】
多価ペプチドは、任意の適する方法で合成することができる。例えば、多価ペプチドは、コンビナトリアルＦｍｏｃ／ｔ−ブチル、Ｆｍｏｃ／ベンジルおよびＢｏｃベンジル戦略、ならびに第四レベルの差次的保護基（Ｎｐｙｓ）戦略を用いることにより、作製することができる。こうしたアプローチの詳細は、Ｌａｒｉｍｏｒｅら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９：６０７７−６０８９（これは、特に、本明細書に参照により取り入れられている）に提示されている。
【００４６】
本発明のさらの他の実施形態に従って、本明細書で論じているＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドをコードしている、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本ポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件および／または高ストリンジェント条件下で、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列を有するポリヌクレオチドも包含する。ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されているように、その核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。本明細書で用いる用語「ストリンジェント条件」は、約Ｔｍ−５（そのプローブの融点より５℃下）からＴｍより約２０℃下までの範囲内で生ずる「ストリンジェンシー」である。本明細書で用いる「高ストリンジェント」条件は、少なくとも０．２×ＳＣＣ緩衝液および少なくとも６５℃を用いる。当該技術分野において認知されているように、ストリンジェンシー条件は、多数の因子、例えば、プローブの長さおよび性質、すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ；ターゲット配列の長さおよび性質、ハイブリダイゼーション溶液の塩および他の成分、例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール、の濃度、を変えることによって獲得することができる。すべてのこれらの因子は、上に挙げた条件と等価であるストリンジェンシー条件を生じさせるために変えることができる。
【００４７】
本発明のＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドをコードしている配列を含むポリヌクレオチドは、適する化学的方法または組み換え法を用いて、すべてまたは一部、合成することができる。ＨＥＲ−２ Ｂエピトープをコードしているポリヌクレオチドは、そのＨＥＲ−２タンパク質に免疫特異的な抗体でゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、そうしたポリヌクレオチドを含有するクローンを特定するにより、得ることができる。
【００４８】
前記ポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドの生産に有用である。例えば、多価キメラペプチドをコードしているＲＮＡ分子を無細胞翻訳系で使用して、そうしたポリペプチドを作製することができる。あるいは、ＨＥＲ−２ ＢエピトープまたはキメラペプチドをコードしているＤＮＡ分子を発現ベクターに導入し、使用して、細胞を形質転換させることができる。適する発現ベクターとしては、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター；ならびにワクシニアウイルス、アデノウイルス、伝染性上皮種ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、バキュロウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。該ＤＮＡ配列は、任意の適する手順によって発現ベクターに組み込むことができる。
【００４９】
さらなる実施形態に従って、１つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチドを１つまたはそれ以上含む組み換え構築物を提供する。適する構築物としては、例えば、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドをコードしている配列が挿入されたベクター、例えばプラスミド、ファージミドまたはウイルスベクター、が挙げられる。発現ベクターの場合、該エピトープまたはキメラペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、発現制御配列、すわなち、ｍＲＮＡ合成を指図するプロモーター、に機能的に作用するように連結されている。こうしたプロモーターの代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞におけるまたはウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。該発現ベクターは、翻訳開始および翻訳停止のためのリボソーム結合部位を含有することもある。例えば、該組み換え発現ベクターは、複製起点、および選択可能マーカー、例えば、形質転換細胞、すなわち異種ＤＮＡ配列を発現する細胞、の選択を可能にする大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子など、も含むことがある。ＨＥＲ−Ｂ細胞エピトープまたはキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を、翻訳開始および停止配列を有するフレーム内のベクターに組み込むことができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドのアミノ末端に機能的に作用するように連結されているシグナル配列をさらにコードしていることがある。
【００５０】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはそうしたエピトープを含むキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチドを使用して、適する技法を用いて組み換えペプチドを発現させることができる。こうした技法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはそうしたエピトープを含むキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチドを使用して、被験者を免疫することもできる。
【００５１】
尚さらなる実施形態に従って、癌の治療方法を提供する。本方法は、被験者に医薬組成物を投与することを含む。他の実施形態において、少なくとも１つのキメラペプチド、多価ペプチドもしくは両方またはそれらをコードしているポリヌクレオチドを含むワクチンを提供する。本医薬組成物は、本明細書において説明するような、医薬的に許容されるビヒクルおよび少なくとも１つのキメラペプチド、多価ペプチドもしくは両方またはそれらをコードしているポリヌクレオチドを含む。医薬的に許容されるビヒクルとしては、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、これらのビヒクルは、用いられる投薬量および濃度で被験者に対して非毒性である。
【００５２】
前記エピトープ、多価ペプチドおよびキメラペプチドまたはそれらをコードしているポリヌクレオチドに加えて、他の成分、例えば、抗原送達用のビヒクル、およびそのタンパク質の免疫原性を強化するように設計された免疫刺激物質が、本医薬組成物に含まれる。抗原送達用のビヒクルの例としては、アルミニウム塩、油中水型乳剤、生体分解性油性ビヒクル、水中油型乳剤、生体分解性マイクロカプセル、およびリポソームが挙げられる。キメラペプチドを含むワクチンのための、抗原送達に適するビヒクルは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）から成り得る生体分解性マイクロスフェアである。
【００５３】
任意の適するビヒクルを本発明の医薬組成物に用いることができるが、担体のタイプは、投与方式、および実質的な放出が望まれるかどうかに依存して変わるであろう。皮下注射などの非経口投与のための担体は、水、食塩水、アルコール、脂肪、蝋または緩衝液であり得る。生体分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）を本発明の医薬組成物用のビヒクルとして用いることもできる。一部の実施形態によると、本医薬組成物は、アジュバントを含む。
【００５４】
ＨＥＲ−２キメラおよび多価ペプチドならびにそれらをコードしているポリヌクレオチドは、被験者または細胞系統において、体液性応答および好ましくは細胞免疫応答（例えば、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞の産生）を増進または惹起するために有用であり得る。一部の例では、被験者は、ヒトである。被験者は、癌もしくはＨＥＲ−２を伴う他の癌、例えば乳癌に罹患していることあり、または正常である（すなわち、検出可能な疾病および感染がない）こともある。本医薬組成物およびワクチンは、乳癌の家族歴を有する女性または乳房腫瘍を除去した女性の治療に有用であり得る。一部の実施形態によると、「治療」は、腫瘍の増殖を阻害または遅速または遅延させることを意味する。こうした癌としては、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、三週間間隔での多数の筋肉内注射を用いて、本医薬組成物を投与する。
【実施例】
【００５５】
具体例としての方法を下で説明するが、本明細書において説明するものと同様または等価の方法および材料を本ペプチド、組成物および方法の実施または試験の際に使用することができる。本明細書において言及するすべての出版物および他の参照文献は、それら全体が参照により取り入れられている。これらの材料、方法および実施例は、単に実例となるものであり、限定と解釈しない。
【００５６】
ペプチド合成およびＨＰＬＣ精製。ペプチドは、以前に記載されている（Ｋａｕｍａｙａ １９９４）とおりに合成した。簡単に言うと、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を固体支持体（置換 ０．５４ｍｍ／ｇ）として使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００ ペプチドシンセサイザーでペプチドを合成した。４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸をリンカーとして使用するＦｍｏｃ／ｔ−ブチル合成法を用いた。最終脱保護段階後、結合した保護基およびペプチド樹脂を、９０％ＴＦＡ、５％アニソール、３％チオアニソール、２％エタンジチオールで切断した。３２．５℃でＶｙｄａｃ Ｃ４（１０ｍｍ×２５ｃｍ）カラムを使用する半分取ＨＰＬＣにより、粗製ペプチドを精製した。緩衝液は、Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡであった。ペプチドには、「プロミスカス」Ｔ細胞エピトープＭＶＦ２２８−３０２（Ｋａｕｍａｙａ １９９４）：ＤＷ１ＭＶＦ（ＨＥＲ−２ ３７６−３９５）、ＭＶＦＤＷ４（６２８−６４７）、ＤＷ５ＭＶＦ（１１５−１３６）、ＤＷ６ＭＶＦ（４１０−４２９）が組み込まれている。
【００５７】
ゲル濾過。２０ｍｇ／ｍＬの酸性化ペプチド溶液（ＤＴＴ中、０．１ｍｇ／ｍＬ）をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに充填し、５ｍＬの画分を０．１Ｍ ＨＯＡｃで溶出させた。ペプチドサンプルを２３５ｎｍで分光光度測定し、吸収値を時間に対してプロットした。０．１より高い吸収値を有し、且つ、ＤＴＴより前に溶出したサンプルをプールし、凍結乾燥させた。エルマン試薬により４１０ｎｍで反応の完了をモニターした。
【００５８】
キャピラリーゾーン電気泳動。キャピラリーゾーン電気泳動は、ＩＢＭコンピュータとインターフェースで接続されたＢｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ２１００を用いて行った。２０分にわたって５０ｃｍキャピラリーを使用して１００ｍＭホウ酸ナトリウム中でサンプルを電圧分離（１５ｋＶ）した。溶離液を２１４ｎｍでモニターした。
【００５９】
円偏光二色性および質量分析。ＩＢＭコンピュータとインターフェースで接続されたＪＡＳＣＯ Ｊ−５００分光偏光計を用いて測定を行った。この計器は、ｄ−１０−カンファースルホン酸アンモニウムの０．０６％（ｗ／ｖ）溶液で較正した。ペプチド（水でのペプチド原質の希釈により、６２．５〜２５０ｕＭ）のＣＤスペクトルを、０．１ｃｍの路長の円筒形石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ）において、周囲温度で測定した。平均残基楕円率（ｍｄｅｇ）は、［θ］＝１００θ／ｃｎｌの関係［この場合、 は、楕円率であり、ｃは、ペプチド濃度（ｍＭ）であり、ｎは、ペプチド中のアミノ酸の数であり、ｌは、路長（ｃｍ）である］を用いて計算した。高速原子衝突（ＦＡＢ）質量分光測定は、ｉｎｎｅｇａｎＭａｔ−９００装置を用いて行った。
【００６０】
酢酸水銀。ペプチドを最小量の水に溶解し、１００ｍｇ／ｍｍ Ｓ−ｔＢｕ溶液（２〜１０倍過剰）を添加した。ペプチドを真空下に置き、攪拌しながら５５℃の水浴内で２−メルカプトエタノールによって沈殿させた。湿らせたセライトに通して濾過した後、濾液を回転蒸発させ、水中の０．１％ＴＦＡで酸性化し、凍結乾燥させた。
【００６１】
生物学的手順
免疫化および動物。雌ニュージーランド白ウサギを、Ｍｏｃｈｉｃａｎ Ｖａｌｌｅｙ Ｒａｂｂｉｔｒｙ（オハイオ州、Ｌｏｕｄｅｎｖｉｌｌｅ）から入手した。ウサギを、ＣＦＡ中で乳化させた合計１ｇのペプチドで、多数の部位に皮下免疫した。初回免疫の３および６週間後、続いてブースター注射（ＰＢＳ中、１ｍｇおよび５００μｇ）を施した。血清を採取し、３０分間、５６℃に加熱することにより補体を不活性化した。血清アリコートを−５から−１５℃で保管した。抗体を硫酸アンモニウム沈殿法によって精製した：硫酸アンモニウム飽和溶液（ＳＡＳ）の保存溶液を調製し、オートクレーブで処理し、４℃に冷却した。冷室内で攪拌しながら３５％ ｖ／ｖまでＳＡＳをゆっくりと添加することにより、抗体を沈殿させた。サンプルを１４，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、上清を−２０℃で保存した。１／２原体積のペレットを０．１Ｍ ＰＢＳで溶解した。その後、画分をＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）内に配置し、＞２００体積のｐＨ８の０．１５Ｍ ＮａＣｌの頻繁な交換により透析した。数滴の０．１Ｍ ＮａＯＨでその食塩水をｐＨ８にした。ＩｇＧ濃度を、放射免疫拡散（ＲＩＤ）（英国、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）により決定した。モノクローナル抗体は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【００６２】
直接ＥＬＩＳＡ。Ｕ底ポリ塩化ビニルプラスチックアッセイプレートを、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬの１００μＬの抗原で、一晩、４℃で被覆した。非特異的結合部位を、１時間、２００μＬのＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックし、プレートをＰＢＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ウマ血清を含有するリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。ＰＢＴ中、ウサギ抗血清 １／５００またはマウス抗血清 １／５０を抗原被覆プレートに添加し、ＰＢＴ中１：２で系列希釈し、２時間、室温でインキュベートした。それらのプレートを洗浄した後、５０μＬの１／５００ ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を各ウエルに添加した。過剰な抗体コンジュゲートを除去し、５０μＬの、２４ｍＭ クエン酸中０．１５％ Ｈ２Ｏ２、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）と発色団として０．５ｍｇ／ｍＬ ２，２’−アミノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を使用して、結合抗体を検出した。発色を１０分間、進行させ、２５μＬの１％ドデシル硫酸ナトリウムで反応を停止させた。Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７００ ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４１０ｎｍで吸収を検出した。バックグラウンドを引いた後の二重反復試験ウエルの平均吸収度として結果を表示する。
【００６３】
細胞培養。保存株を５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で維持した。すべての細胞培養基、ＦＣＳおよび補足物は、ＧＥＢＣＯ（ニューヨーク州、グランドアイランド）から購入した。ヒト乳腺癌細胞系統ＳＫＢＲ−３およびＭＣＦ−７は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ＦＣＳおよびＬ−グルタミンを補足した、マッコイ５ＡまたはＤＭＥＭ中で二次培養した。１０％ＦＣＳおよびＬ−グルタミンを伴うＲＰＭＩ １６４０中でＣａｖ−１を維持した。Ｃａｖ− は、冷温保存された新鮮な結腸腫瘍検体から採取し、その後、培養した。これは、検出可能レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現しない。ＳＫＢＲ３は、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する乳房腫瘍細胞系統であるが、ＭＣＦ−７は、正常濃度のタンパク質を発現する。
【００６４】
免疫沈降法およびウエスタンブロッティング。第０日、１．０×１０７ ＳＫＢＲ３細胞を７５ｃｍ３細胞培養フラスコにプレーティングし、一晩放置して付着させた。抗ペプチド抗体（１００μｇ／ｍＬ）を４時間にわたって添加した。培地を吸引し、直ちに氷冷０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加することにより、反応を停止させた。細胞をトリプシン処理し、冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した。１００μＬのＨＢＳＳに再懸濁させた細胞に、３ｍＭのＮａ３ＶＯ４、各１０μｇ／ｍＬのアプロチニンおよびロイペプチンを含有する冷溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８；１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ）を添加した。４℃で２０分間、穏やかに回転させることによって、溶解を達成した。遠心分離（１４，０００×ｇ、２０分）して細胞破壊片を除去した後、溶解産物を３〜５μｇの抗体および３０μＬのプロテインＡ／プロテインＧ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）とともに一晩インキュベートした。遠心分離（１４，０００×ｇ、３０秒）によりビーズをペレット化し、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含有する溶解緩衝液中で２回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液中で５分、沸騰させた。
【００６５】
７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ニトロセルロースに転写し、抗体でプローブした。あらかじめ染色された分子量標準物質（ＢｉｏＲａｄ）でタンパク質転写をモニターした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを使用し、強化化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、免疫反応性ビーズを検出した。
【００６６】
間接的結合アッセイ。ＳＫＢＲ３細胞またはＭＣＦ−７細胞を、Ｖ底プレート（バージニア州、マクレーンのＬｉｎｂｒｏ）に、細胞数５，０００／ウエルでプレーティングした。それらの細胞を様々な濃度の抗体とともにインキュベートした。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス抗体とともに１時間インキュベートし、ホルマリンで固定した。マウスモノクローナルＡｂ（マサチューセッツ州、ケンブリッジのＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を正の対照として使用し、抗ＣＤ３ Ａｂを負の対照として使用した。４８８ｍｎでの励起用のアルゴンレーザーおよびＦＩＴＣ蛍光用の５２５ｒｕｎ帯域フィルターを有するＣｏｕｌｔｅｒ ＥＬＩＴＥフローサイトメーター（フロリダ州、ハイアレアのＣｏｕｌｔｅｒ）により細胞を分析し、各サンプルにつき５．０×１０３の細胞をカウントし、最終処理を行った。破壊片、細胞集塊および死滅細胞を光散乱評定により排除し、その後、単一パラメーターヒストグラムを描いた。
【００６７】
細胞増殖に対するＡｂの効果。ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７およびＣＡＶＩ細胞を、第０日に、様々濃度のＡｂとともに、Ｖ底プレートに細胞数５，０００／ウエルでプレーティングした。第３日、細胞を［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウエル）でパルスし、この時、それらを２０℃の冷凍器の中に１時間、置いた。室温で解凍した後、細胞をＰＨＤセルハーベスター（Ｃａｍｂｒｅｄｇｅ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で回収した。サンプルを５ｍＬのＲｅａｄｙ Ｓａｆｅ液体シンチレーションカクテル（Ｂｅｃｋｍａｎ）中でインキュベートし、ベータカウンターにより放射活性を判定した。結果を平均ＣＰＭ＋／−標準偏差（ＳＤ）として表示する。
【００６８】
ＣＴＬアッセイ：インビトロ刺激。鼠経および大動脈周囲リンパ節（ＬＮ）を免疫の７〜１０日後に除去する。その後、１μＭの適切なＣＴＬペプチドで１時間、予めパルスしておいた１．５×１０５の照射（１０，０００ｒａｄ）Ｐ８１５細胞と共培養することにより、ＬＮ細胞（４×１０６〜５ｘ１０６）をインビトロで刺激する。使用した培養基は、ｃＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ）である。上清は、３０Ｕ／ｍＬ（最終濃度のＩＬ−２、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５×１０５Ｍ−２−メルカプトエタノールを含有する。
【００６９】
インビトロ刺激の７日後、ＣＴＬ活性を標準的なクロム放出アッセイで試験する。Ｐ８１５細胞（１０６）を、１時間、３７℃で、適切なペプチド（１μＭ）の存在下または不在下、１５０μＣｉの［５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウムで標識し、３回洗浄する。標識されたターゲット（２×１０３）を、Ｖ底９６ウエルプレートで、２００μＬの体積で、所定の比率で刺激ＬＮ細胞とコ・インキュベートする。４時間、３７℃でインキュベートした後、上清（１００μＬ）をγ−カウンティングのために回収する。比溶解％は、１００×［（実験−自然放出）／（合計−自然放出）］（Ｖａｌｍｏｒｉら、１９９４）として計算する。
【００７０】
インビボでの抗体の効果。ＨＥＲ２細胞（３×１０６）を２５０μＬのＰＢＳに懸濁させ、氷上で２５０μＬのＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と混合し、マウスに皮下注射した。第９および１１日に、ポリクローナル抗体を２ｍｇ／マウスの合計濃度まで腹腔内注射した。週に２度、腫瘍体積は、カリパスで測定し、（長さ×幅×高さ）の式によって計算した。
【００７１】
（実施例１）
２つの天然ジスルフィド結合が組み込まれている配座ＨＥＲ−２細胞エピトープは、強化された腫瘍細胞結合を示す。
【００７２】
ヒトＥＧＦＲジスルフィド対合を規定した。ＥＧＦＲとＨＥＲ−２の間の高い相同性に基づき、Ｃｙｓ−６２６とＣｙｓ−６３４の間およびＣｙｓ−６３０とＣｙｓ−６４２の間に２つのジスルフィド結合を組み込むために６２６−６４９への６２８−６４７エピトープ。差次的側鎖保護、そして限定的脱保護、そして酸化を行うことにより、ＣＤによって判定して望ましい二次構造特性を有する環化生成物を首尾よく生成した。非近交系マウスにおいて、線状構築物と環化構築物は、両方とも、高度に免疫原性であった（力価＞２００，０００）。フローサイトメトリー分析は、環化エピトープに対する抗体が、非環化エピトープより高い親和性でＨＥＲ−２タンパク質に結合することを示した（それぞれ、平均対数蛍光２．２９および１．６５）。環化エピトープと非環化エピトープの両方に対する抗体は、足場非依存性増殖アッセイで測定したところ、ＨＥＲ−２を過剰発現する細胞において増殖を減少させることができた（それぞれ、３１および５８％阻害）。両方の構築物に対する抗体は、エフェクターヒトＰＢＭＣの存在下でＩＦＮ−γ放出を惹起することができ、環化抗体は、線状抗体と比較して２５％高いレベルのＩＦＮ−γを誘導した。環化抗体は、ＡＤＣＣアッセイでは非環化抗体と比較して２倍のレベルの特異的溶解を惹起した（それぞれ、１１および５．６％）。これらのペプチドワクチンのインビボ効果を調査するために、近交系ＦＶＢ／Ｎマウスをそれらの構築物で免疫した。両方の構築物が、これらのマウスにおいて免疫原性であり、環化構築物のほうが高い力価を生じさせた。その後、これらのマウスを、ＦＢＶ／Ｎバックグラウンドを有するＮＴ２．５腫瘍細胞系統で攻撃した。環化配座の構築物で免疫したマウスは、線状および対照ＭＶＦ免疫マウス両方と比較して、腫瘍体積の減少を有した。線状またはＭＶＦ対照ペプチド（それぞれ、４．３１および４．４８日）と比較して、環化ワクチンを投与したマウスは、最長の倍増時間（６．６３日）を有し、それにより、腫瘍増殖を妨げる最大能力を実証した。このように、これらの結果は、高親和性Ａｂを惹起するための配座ペプチドは、有効なＨｅｒ−２ワクチンの設計に直ぐに使うことができることを示している。
【００７３】
（実施例２）
新規ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープの設計および合成
表１に示すような４つの新規構築物を合成のために選択した。４つすべての構築物が、トラスツズマブと接触する３つの領域のうちの少なくとも１つの領域を含有する。ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを、ＭＶＦプロミスカスＴｈエピトープと共直線的に合成した。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕｔ化学を用いて行った。エピトープ５６３−５９８についての３つのジスルフィド結合の形成は、図２に示す差次的保護システイン残基を使用して達成した。第一のジスルフィド結合は、ヨウ素酸化を用いて形成する。水の添加により、Ａｃｍ除去、およびＣ５６７とＣ５８４の間のジスルフィド結合の付随的形成を増進する。Ｃ５６３とＣ５７６の間の最後のジスルフィド結合は、シリルクロライド−スルホキシド法を用いて形成する。
【００７４】
【化４１】
表１は、ＨＥＲ−２／ヘルセプチン構造からの候補ペプチドワクチンを示すものである。イタリック体で示されているプロミスカスＴヘルパーエピトープ配列は、４残基ターン配列（ＧＰＳＬ）によりＢ細胞エピトープに連結している。下線が引かれているアミノ酸は、天然ジスルフィド結合に緩衝しないように、ＣｙｓからＬｅｕに突然変異させた。
【００７５】
（実施例３）
ＨＥＲ−２ペプチドの免疫原性
表１に記載した４つの構築物の免疫原性は、ジスルフィド結合構築物と線状構築物の両方を使用し、ＦＢＶ／ｎマウス（ｎ＝４〜９）週齢６〜８週の群に免疫することにより判定した。５６３−５９８環化および非環化構築物の両方が、高度に免疫原性であった（図３Ａ）。第三回免疫の３週後には、すべてのマウスが、１２０，０００より高い力価を有し、環化構築物（ＭＶＦ５６３ＳＳ）での２匹のマウスは、２５０，０００より高い力価を有した。５８５−５９８構築物は、最小の免疫原性であることが判明し（図３Ｂ）、第三回免疫の３週間後、環化（ＳＳ）群と線状（ＮＣ）群の両方からの１匹のマウスだけが、１２０，０００より高い力価を有し、平均力価は、約５８，０００であった。５９７−６２６ペプチド構築物と６１３−６２６ペプチド構築物の両方が、高度に免疫原性であった（図３Ｃ、Ｄ）。環化形の５９７−６２６を受けた３匹のマウスは、１２０，０００より高い力価を有したが、線状形を受けたいずれのマウスも、１２０，０００より高い力価を有さなかった。
【００７６】
次に、本発明者らは、Ｇｕｙらによって開発されたｎｅｕ−ＮトランスジェニックマウスにおいてＢ細胞エピトープの免疫原性を試験した。これらのｎｅｕ−Ｎトランスジェニックマウスは、ｎｅｕ特異的全細胞ワクチンで免疫したとき、ｎｅｕ特異的ＩｇＧの基底レベルが低かったにもかかわらず、ＦＶＢ／ｎマウスにおいて見られるものと同様のペプチド構築物に対するＡｂの高い力価（データは示さない）を惹起した。
【００７７】
（実施例４）
ヘルセプチン結合ペプチドとヘルセプチン（トラスツズマブ）の交差反応性
ＥＬＩＳＡにより、トラスツズマブ結合部位からの配座ペプチドがヘルセプチンを認識できるかどうかを試験した。図４に示すように、５６３−６２６の結合領域内の様々なペプチドが、トラスツズマブと結合した。最大の結合は、３つのジスルフィド対合を有する環化エピトープ５６３−５９８で発生した。この結果は、グリコシル化に起因するＨＥＲ−２への抗体のＦＡＣＳ結合とは対照的である。
【００７８】
（実施例５）
ペプチド抗体とＨＥＲ−２タンパク質の交差反応性
ヘルセプチン−ペプチドエピトープにより惹起された抗体が、ＨＥＲ−２受容体を認識するそれらの能力に差を示すかどうかを判定するために、ＨＥＲ−２過剰発現ヒト乳癌細胞系統ＢＴ４７４へのＦＢＶ／ｎ精製抗体の結合を試験した。図５Ｃ、Ｄは、５９７−６２６構築物と６１３−６２６構築物の両方が、正常マウス抗体に比べてシフトしていることを示している。しかし、５６３−５９８および５８５−５９８構築物は、正常マウス抗体と比較して殆どシフトを示さなかった（図５Ａ、Ｂ）。５６３−５９８は、ＨＥＲ−２がトラスツズマブと共に作る３つの構築物のうちの２つを含有する。トラスツズマブとの最後の接点を含む５９７−６２６エピトープは、天然タンパク質を認識する１１のアミノ酸から成る（図５Ｃ）。この配列６１３−６２６のさらに短いバージョンも、同様に天然タンパク質を認識する（図５Ｄ）。エピトープ５６３−５９８および５８５−５９８の認識の欠如についての尤もらしい説明は、残基５７１−５７３に潜在的グリコシル化部位（ＮＧＳ）があり、その大きな嵩高い糖部分が立体的に干渉し、そのエピトープの結合を妨げるということである。
【００７９】
（実施例６）
腫瘍攻撃
Ｂ細胞エピトープワクチンへの配座拘束の導入に随伴する潜在的な臨床的利点をさらに良好に理解するために、ＦＶＢ／ｎマウスとｎｅｕ−Ｎトランスジェニックマウスの両方を、ｎｅｕ−Ｎトランスジェニックマウスから単離した自然発生乳房腫瘍から採取した腫瘍細胞系統ＮＴ２．５で攻撃した。ｎｅｕ過剰発現の結果として、これらのマウスは、ヒト乳癌患者において観察されるものと同様の様式で自然発生乳腺癌を発症し、従って、ヒト乳癌研究の適するモデルである。ＦＶＢ／ｎマウスの群を、最終免疫の２週間後に５×１０６のＮＴ２．５細胞で皮下攻撃した（下腹部）。第５５日まで週に２度、腫瘍測定を行った。腫瘍体積は、（長いほうの測定値×短いほうの測定値２）／２の式によって計算した。第３０日の後、ＦＢＶ／ｎマウスの腫瘍は退縮し始める（これは、腫瘍の拒絶を示す）ことに留意すること。ＦＢＶ／ｎマウスを使用するその後の腫瘍研究に関しては、第３０日まで腫瘍を測定した。５６３−５９８ＮＣおよびＳＳ構築物で免疫したマウスは、第３０日に、それぞれ、１６６．５１７および１７３．７２９２ｍｍ３の平均腫瘍体積を有し、一方、免疫しなかったマウスは、３４６．６５６３ｍｍ３の平均腫瘍体積を有した（データは示さない）。第３３日には、６１３−６２６および５８５−５９８ＣＹＣで免疫したマウスは、免疫しなかったマウスとＭＶＦで免疫したマウスの両方と比較して、腫瘍体積の低減を示した。トラスツズマブＢ細胞エピトープで免疫したマウスの腫瘍負荷の低減の点で何らかの適度な成功があるように見えるが、ほぼすべてのマウスが腫瘍を発症した。
【００８０】
（実施例７）
新規ペルツズマブ結合配座Ｂ細胞エピトープの設計および評価
表２に記載する３つのペプチド配列は、ペルツズマブ結合部位に類似した抗体を惹起する最小配列をさらに描写するために設計した。これらの複合配座ペプチドエピトープを合成し、首尾よく精製し、適正なジスルフィド対合で環化した。エピトープ２６６−２９６（Ｃｙｓ２６８−Ｃｙｓ２９５間のＳＨ結合）、エピトープ２９８−３３３（Ｃｙｓ２９９−Ｃｙｓ３１１間のＳＨ結合）およびエピトープ３１５−３３３（Ｃｙｓ３１５−Ｃｙｓ３３１間のＳＨ結合）により、最小ペルツズマブ結合エピトープを描写することができよう。
【００８１】
【化４２】
追加の結果は、図６〜３０に示す。
【００８２】
本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができ、本発明を、本明細書に記載することに限定されるものと見なすべきでないことは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
後続の「発明の実施形態の詳細な説明」は、以下の図面にともに読むと、最もよく理解することができる。以下の図面では、同じ構造は、同じ参照番号で示されている。
【図１】ＨＥＲ−２タンパク質配列を図示する図である。
【図２】３つのジスルフィド対合の合成戦略を示す図である。差次的システイン保護および選択的除去および酸化を用いて、図示されているような正しいジスルフィド対合を生じさせた。
【図３】ＦＶＢ／ｎマウスにおける免疫応答を示す図である。４から１０匹のＦＶＢ／ｎマウスの群を、線状（ＮＣ）もしくはジスルフィド結合（ＳＳ）ペプチド構築物（Ａ）ＭＶＦ５６３−５９８、（Ｂ）ＭＶＦ５８５−５９８、（Ｃ）ＭＶＦ５９７−６２６、または線状ペプチド（Ｄ）ＭＶＦ６１３−６２６で免疫した。各マウスを個々の棒として表す。ＡのスケールがＢ〜Ｄとは異なることに注意すること。
【図４】トラスツズマブが、ＨＥＲ−２のトラスツズマブ結合部位を模倣して設計されたペプチドエピトープを特異的に認識することを示す図である。これらのペプチド配列をｘ軸に与える。ＭＶＦ３１６−３３９は、Ｈｅｒ−２非該当対照ペプチドである。
【図５】ヒト乳癌細胞過剰発現性ＨＥＲ−２とペプチド特異的抗体のフローサイトメトリーを示す図である。フローサイトメトリーを用いて、様々な構築物により誘導されたＦＢＶ／ｎマウスからの抗体が天然ＨＥＲ−２を認識するかどうかを評定した。ＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞（ＨＥＲ−２ｈｉｇｈ）を、１０μｇ／ｍＬの正常マウスＩｇ（負の対照）、マウスモノクローナルＡｂ−２（正の対照）、またはＦＢＶ／ｎマウスにおいて産生させたペプチド抗体で処理した。
【図６】ＨＥＲ−２とのペルツズマブ結合部位を示す図である。
【図７】ヘルセプチンペプチドエピトープの３次元構造を示す図である。
【図８】Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標）（ペルツズマブ）に結合したＨＥＲ−２の構造を示す図である。
【図９】ＨＥＲ−２−トランスツズマブ結合部位を示す図である。（Ａ）ＨＥＲ−２とトラスツズマブのＨおよびＬ鎖との複合体のリボン図。（Ｂ）ＨＥＲ−２のトラスツズマブ結合部位。この領域にはジスルフィドが豊富である。トラスツズマブと相互作用する３つのループの配列を示す。
【図１０】ペプチドへのトラスツズマブの結合を示す図である。マイクロタイターウエルを２μｇ／ｍＬの様々なペプチドで一晩被覆し、その後、１％ＢＳＡで１時間ブロックした。その後、トラスツズマブを２０００μｇ／ｍＬの濃度でプレートに添加し、ＰＢＴで１：２系列希釈した。結合したトラスツズマブをＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧで検出し、その後、基質で検出した。（Ａ）２０００μｇ／ｍＬのトラスツズマブを使用した、表Ｉからのペプチドおよび非該当対照ペプチド（ＭＶＦ３１６−３３９）についてのＯＤ４１５値。示されている値は、二重反復試験サンプルの平均である。エラーバーによりＳＥＭを示す。（Ｂ）ジスルフィド結合（ＣＹＣ）および線状（ＮＣ）形のＭＶＦ５６３−５９８とともに非該当対照ペプチド（ＭＶＦ３１６−３３９）でのトラスツズマブの力価測定。
【図１１】ＭＴＴアッセイによる細胞増殖を示す図である。ＢＴ４７４細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートに細胞数２×１０４／ウエルでプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。指示濃度のペプチドを伴うまたは伴わない、トラスツズマブまたは正常ヒトＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを、各ウエルに添加した。それらのプレートを３日間、３７℃でインキュベートした。ＭＴＴを用い、ＯＤ５７０を読み取ることにより、生細胞数を測定した。阻害率は、（ＯＤ正常ヒトＩｇＧ − ＯＤトラスツズマブ ＋ ペプチド）／ＯＤ正常ヒトＩｇＧ × １００の式を用いて計算した。示されている値は、三重反復試験サンプルの平均である。エラーバーによりＳＥＭを示す。
【図１２】ＦＶＢ／ｎ（Ａ）およびＮｅｕ−Ｎ（Ｂ）トランスジェニックマウスにおけるペプチドに対する抗体応答を示す図である。環化（ＣＹＣ）および線状（ＮＣ）構築物で免疫したマウスからの血清に対して直接ＥＬＩＳＡを行って、免疫原性の差を判定した。対応する免疫原に対する抗体力価は、０．２以上の吸収度を有する最高希釈度の逆数と定義した。各棒は、個々のマウスを表す。ｘ軸上の記号は、血清をサンプリングした時間を表し、例えば、１ｙ＋３は、初回免疫から３週間後に採取した血清に対応する。Ｎｅｕ−Ｎは、ＦＶＢ／ｎバックグラウンドを有し、乳房特異的プロモーターの制御下で正常ラットｎｅｕ癌原遺伝子を発現する。これらのマウスは、非トランスジェニックマウスと比べてｎｅｕに対して耐性を示す。Ｂは、これらのマウスはラットｎｅｕに対して耐性であるが、ペプチド免疫原に対する免疫応答を生じさせることができることを明示している。
【図１３】ＨＥＲ−２に対するペプチド抗体の交差反応性を示す図である。免疫されたマウス血清からの精製抗体の反応性を、フローサイトメトリー分析を用いて、（Ａ）ＢＴ４７４および（Ｂ）ＳＫＢＲ−３乳癌細胞系統で試験した。Ａｂ結合が、ヤギ抗マウスＦＩＴＣコンジュゲート化ａｂで検出された。ｘ軸は、蛍光強度を表し、ｙ軸は、相対細胞数を表す。各ヒストグラムは、マウスプレＩｇＧと、ペプチド抗体と、ＡＢ２（ＨＥＲ−２に結合するマウスｍＡｂ）とのオーバーレイを含む。両方の細胞系統が、エピトープ５６３−５９８および５８５−５９８からのＡｂはＨＥＲ−２を認識しないが、エピトープ５９７−６２６および６１３−６２６からのＡｂはＨＥＲ−２を認識することを明示している。
【図１４】ＭＶＦおよびＢ細胞エピトープの独立した折り畳みを可能にするフレキシブルリンカー（ＧＰＳＬ）によりＢ細胞エピトープと共直線的に合成された「プロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔｈ細胞エピトープＭＶＦから成るキメラペプチドワクチン構築物の略図を示す。この組み合わせは、免疫系の体液性アームと生得的アームの両方の活性化による最適な抗体産生の惹起を助長し得る。
【図１５】ヨウ素酸化を用いて、Ｃｙｓ２６８とＣｙｓ２９５の間に自然発生ジスルフィド結合を形成したことを示す図である。
【図１６】ＭＶＦ ＨＥＲ２（２６６−２９６）非環化（ＮＣ）および環化（ＣＹＣ）ペプチドで免疫したＮＺＷウサギにおける免疫原性を示す図である。血清を週に１度採取し、診断試験に使用するために抗体を精製する。抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡによって決定する。
【図１７】Ａ）ＭＶＦ ＨＥＲ２（２６６−２９６）環化（ＣＹＣ）または非環化（ＮＣ）ペプチドのいずれかで免疫したＷＴ ＦＶＢ／ｎマウスにおける免疫原性（マウス数８／群）、Ｂ）ＦＶＢ／ｎバックグラウンドを有する３匹のＮｅｗ過剰発現マウスにおける免疫原性を示す図である。抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡによって決定する。
【図１８】ヘルセプチンと相互作用するＨＥＲ−２の細胞外ドメインのリボン構造を示す図である。矢印は、ＨＥＲ−２がヘルセプチンと接触する３つのループを示している。
【図１９】水中のＨｅｒ−２ ５６３−５９８ ＣＹＣおよびＨｅｒ−２ ５６３−５９８ ＮＣの１００ｕＭ溶液を使用して行ったＣＤ分光測定値を示す図である。３つのジスルフィド結合で拘束されているエピトープＨＥＲ−２ ５６３−５９８ ＣＹＣは、１９３ｎｍでＣＤ楕円率最小を示すが、エピトープＨＥＲ−２ ５６３−５９８ ＮＣ非拘束ペプチドは、２０４ｎｍでＣＤ楕円率最小を示す。これは、二次構造の有意な差を明示している。
【図２０】ＨＥＲ２ ５６３−５９８エピトープと、遊離スルフヒドリル基を攻撃し、よってジスルフィド対合の完成を判定するために用いることができるビオチン化剤を使用する選択的酸化、還元およびジスルフィド結合分析のための戦略とを示す図である。
【図２１】位置選択的ジスルフィド形成を示す図である。残基３１５および３３１についての側鎖保護は、トリチルであり、これを樹脂からの切断により適便に除去した。２９９および３１１のシステイン残基の側鎖は、Ａｃｍで保護した。これを、酸化（Ｉ２）により、第一環化後、選択的に除去し、環化することができる。
【図２２】非近交系ＮＺＷウサギ（Ａ）および近交系マウスＦＶＢ／ｎマウス（Ｂ）におけるペプチドに対する抗体応答を示す図である。環化（ＣＹＣ）および線状（ＮＣ）構築物で免疫した動物からの血清に対して直接ＥＬＩＳＡを行って、免疫原性の差を判定した。対応する免疫原に対する抗体力価は、０．２以上の吸収度を有する最高希釈度の逆数と定義した。各棒は、個々のマウスを表す。ｘ軸上の呼称は、血清をサンプリングした時間を表し、例えば、１ｙ＋３は、初回免疫の３週間後に採取した血清に対応する。
【図２３】ＨＥＲ−２に対するペプチド抗体の交差反応性を示す図である。免疫されたウサギ血清からの精製抗体の反応性を、フローサイトメトリー分析を用いて、（Ａ）ＢＴ４７４（ＨＥＲ−２ｈｉｇｈ）および（Ｂ）ＭＤＡ４６８（ＨＥＲ−２ｌｏｗ）乳癌細胞系統で試験した。Ａｂ結合が、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣコンジュゲート化ａｂで検出された。ｘ軸は、蛍光強度を表し、ｙ軸は、相対細胞数を表す。各ヒストグラムは、ウサギプレＩｇＧと、ペプチド抗体と、ヘルセプチン（ＨＥＲ−２に結合するヒトｍＡｂ）とのオーバーレイを含む。
【図２４】ペプチド抗体が、インビトロでＢＴ４７４乳癌細胞に対するＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）を誘導することを示す図である。ターゲット細胞系統ＢＴ４７４を、Ｎａ５１ＣｒＯ４の存在下で１時間、ウサギからのペプチド抗体、正常ウサギＩｇＧまたはヘルセプチンとともにインキュベートした。３回洗浄した後、ターゲット細胞をヒトＰＢＭＣエフェクター細胞とともに４時間、３７℃で培養して１００：１、２０：１および４：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比にした。その後、上清を回収し、γ−カウンターを使用して放射活性を決定した。細胞傷害性は、１００×（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）の式から計算した（この式中、Ａは、試験上清からの５１Ｃｒ（ｃｐｍ）を表し、Ｂは、単独での培養（自然発生）でのターゲットからの５１Ｃｒ（ｃｐｍ）を表し、およびＣは、５％ＳＤＳで溶解した細胞からの最大５１Ｃｒ放出を表す。
【図２５】ＭＶＦおよびＢ細胞エピトープの独立した折り畳みを可能にするフレキシブルリンカー（ＧＰＳＬ）によりＢ細胞エピトープ（ＨＥＲ−２（２６６−２９６））と共直線的に合成された麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ、残基２８８−３０２）から誘導された「プロミスカス」ＴＨ細胞エピトープから成るキメラペプチドワクチン構築物の略図である。
【図２６】前負荷Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＣＬＥＡＲ Ａｃｉｄ樹脂を使用して固相ペプチド合成を行ったことを示す図である。試薬Ｂ（ＴＦＡ：フェノール：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ、９０：４：４：１）を使用してペプチドを切断し、粗製ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ヨウ素酸化を用いて、Ｃｙｓ２６８とＣｙｓ２９５の間に自然発生ジスルフィド結合を形成した。
【図２７】Ａ）ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）非環化および環化ペプチドで免疫したＮＺＷウサギマウスの抗体力価、Ｂ）ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）非環化および環化ペプチドで免疫した野生型ＦＶＢ／ｎマウスの抗体力価、Ｃ）ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）で免疫したＮｅｕ過剰発現性ＦＢＶ／ｎマウスの抗体力価を示す図である。血清は、週に１度採取し、抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡによって決定した。
【図２８】ヒトＢＴ４７４ ＨＥＲ−２過剰発現性腫瘍細胞（Ａ）およびマウスＮＴ２．５ ｎｅｕ過剰発現性腫瘍細胞（Ｂ）上の天然タンパク質に結合する能力について試験した、精製ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２６９）環化および非環化抗体を示す図である。両方の抗体が、正常ＩｇＧアイソタイプ対照と比較してシフトしており、また正の対照（ＢＴ４７４についてはヘルセプチン、およびＮＴ２．５については抗−ｃ−ＥｒｂＢ２／ｃ−Ｎｅｕ（Ａｂ−４））と比較して同様の結合を有した。
【図２９】ＢＴＢ４７４細胞を、精製ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）環化および非環化抗体ならびに５１Ｃｒとともにインキュベートし、その後、それらの抗体結合細胞をヒトＰＢＭＣに暴露し、これによりＢＴ４７４細胞に関する免疫溶解を行うことによって判定した、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を示す図である。
【図３０】３×１０６のＮＴ２．５細胞で皮下攻撃し、腫瘍増殖を２４日間モニターした、図３Ｂからの野生型ＦＢＶ／ｎマウスを示す図である。ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）環化および非環化治療マウスでは、ＭＶＦのみで免疫したマウスと比較して、腫瘍発現（Ａ）および増殖（Ｂ）が遅延された。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００５年６月１５日に出願され、表題「HER-2 Peptides」の米国仮出願第60/690,574号（この全体が、本明細書に参考として援用される）への優先権およびあらゆるほかの利益を主張する。
【０００２】
（政府の支援）
本出願に記載する研究は、少なくとも一部は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの援助 ＮＩＨ ５ＲＯＩ ＣＡ ８４３５６による支援を受けている。米国連邦政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
現在、乳癌治療の最も一般的なアプローチは、手術、化学的介入および／または放射線療法を含む。癌が被定義領域に限定されなければ、手術のみで癌を除去することはできない。それ故、手術部位付近にあり、手術を免れた癌細胞を破壊するために、手術後、放射線治療を施すことが多い。こうした治療の副作用としては、皮膚の過敏性または痒み、免疫系への干渉、時として、吐き気、および希に、肺の患部が繊維性になる放射線肺線維症が挙げられる。化学療法が手術後に用いられることもある。化学療法には、癌細胞に対して傷害性である薬物が用いられる。これは、完全に選択的なシステムではないので、正常な細胞にも影響を及ぼす。負の副作用としては、悪心、疲労、脱毛、食欲不振および下痢が挙げられる。
【０００４】
こうした現在の治療に鑑みて、さらなる乳癌治療アプローチの発見が試みられている。１つのそうしたアプローチが、免疫療法である。免疫療法アプローチのターゲットの１つは、ＨＥＲ−２タンパク質である。ＨＥＲ−２タンパク質（ＨＥＲ−２癌遺伝子の産物）は、様々な癌の際に過剰発現される。これは、非侵潤性乳管癌の５０％〜６０％およびすべての乳癌の２０％〜４０％、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺において発生する腺癌の実質的な割合に認められる。ヒトでは、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、悪性形質転換と関係がある。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、悪性疾患の攻撃性にも密接に関連しており、これは、浸潤性乳癌の四分の一に認められる。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、乳癌においても、卵巣癌においても、予後不良と相関している。
【０００５】
最近の研究において、ＨＥＲ−２の細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体は、インビトロおよびインビボ動物モデルの腫瘍増殖に対して阻害作用をもたらすことが証明された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）。加えて、転移性ＨＥＲ−２過剰発現性乳癌を有する患者における組み換えヒト化抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体であるトラスツズマブのＩＩおよびＩＩＩ相臨床試験は、単一薬剤として１５％の全奏功率をもたらした。トラスツズマブは、細胞傷害性化学療法薬と併用されたとき生存を向上させることも証明された（非特許文献６；非特許文献７）。組み換えＨＥＲ−２タンパク質、ＨＥＲ−２ ＥＣＤ、またはＨＥＲ−２のラット同族体であるラットｎｅｕのＥＣＤをターゲットにする多数のワクチンアプローチも評価された。例えば、ＥＣＤラットｎｅｕを発現するワクシニアウイルス組み換え体で免疫したＮＦＳ細胞株マウスは、ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ ３Ｔ３細胞でのその後の攻撃に対して防護的抗体応答を発現した（非特許文献８）。しかし、同じ免疫原を有するＢＤＩＸラットの免疫化は、抗体応答を生じさせず、同系ｎｅｕ発現性Ｂ １０４神経芽腫細胞の増殖も阻害しなかった。これは、この戦略が、ラットにおいて免疫応答を誘導するには不十分であったことを示唆している。コレステリル基を有するマンナンおよびプルランと複合したＨＥＲ−２ ＥＣＤの１４７のアミノ末端アミノ酸から成る多糖類腫瘍性タンパク質複合体ワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＨＥＲ−２発現性肉腫の拒絶を媒介する細胞および体液性免疫応答を誘導した（非特許文献９）。部分的防護は、精製されたラットｎｅｕ ＥＣＤ（非特許文献１０）またはｎｅｕトランスフェクテッド同種異系マウス線維芽細胞（非特許文献１１）のいずれかで免疫することにより乳房腫瘍を発現するように運命づけられたラットｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて証明されている。
【０００６】
上に記載した研究の結果にもかかわらず、ＨＥＲ−２は非突然変異「自己」抗原であるのでＨＥＲ−２またはＨＥＲ−２ ＥＣＤをターゲットにした細胞またはタンパク質ベースのワクチン戦略を用いて、ヒトにおいて有効な免疫応答を生じさせることができるかどうかは、いまだ判然としない。従って、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現を随伴する乳癌および他の悪性疾患を治療または予防するための追加の免疫療法アプローチを有することが望ましい。
【非特許文献１】Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８９，９：１１−６５−７２
【非特許文献２】Ｔａｇｌｉａｂｕｅ，Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９１，４７：９３３−７
【非特許文献３】Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，１９８６，８３：９１２９−３３
【非特許文献４】Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９８８，２：２７３−７
【非特許文献５】Ｋａｔｓｕｍａｔａ，Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９５，１：６４４−８．
【非特許文献６】Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９６，１４：７３７−４４
【非特許文献７】Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９８８，１６：２６５９−７１
【非特許文献８】Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４：６８５４−８
【非特許文献９】Ｇｕ，Ｘ．Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８：３３８５−９０
【非特許文献１０】Ｅｓｓｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９９，４７：３３７−４２
【非特許文献１１】Ｃｅｆａｉ．Ｄ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８３：３９３−４００
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（概要）
実施形態に従って、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを提供する。該エピトープは、
【０００８】
【化３６】
の配列を有する。
【０００９】
本発明の追加の実施形態は、本明細書中でさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（発明の実施形態の詳細な説明）
さて、本発明の特定の実施形態を随時参照しながら本発明を説明する。しかし、本発明は、種々の形態で具体化することができ、本明細書に記載する実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が、詳細、且つ、完全になるように、ならびに当業者に本発明の範囲を十分に知らせるために提供するものである。
【００１１】
別に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書において本発明の説明に用いる専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明の限定とは解釈されない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈に明瞭に別の指示がない限り、それらの複数形も包含すると解釈する。本明細書において言及するすべての出版物、特許出願、特許および他の参照文献は、それら全体が参照により取り入れられている。
【００１２】
本発明は、ＨＥＲ−２タンパク質の単離されたポリペプチド（本明細書では、以後、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと呼ぶ）を提供する。一部の実施形態において、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、免疫原性である。加えて、本発明は、１つまたはそれ以上のキメラペプチドを含む組成物を提供し、該キメラペプチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを含む。加えて、１つまたはそれ以上の多価ペプチドを有する組成物を提供する。これらの多価ペプチドは、２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープを含む。被験者において免疫応答を刺激する方法および癌を治療する方法をさらに提供する。治療および予防用のワクチンも提供する。単独でまたはキメラペプチドに関連して本明細書に記載するようなＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと免疫反応性である抗体の産生を生じさせる体液性応答を引き起こせるもので有りうる。一部の実施形態によると、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドは、防護効果をもたらす。
【００１３】
ＨＥＲ−２タンパク質およびそのラット同族体ｎｅｕは、約１２５５個のアミノ酸（ａａ）の長さである、１８５ｋｄの相対分子量を有する膜貫通型タンパク質である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する４０％相同性を有する約６４５ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）と、高疎水性膜貫通アンカードメイン（ＴＭＤ）と、ＥＧＦＲに対して８０％相同性を有する約５８０ａａの末端カルボキシ細胞質ドメイン（ＣＤ）とを有する。ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸配列、およびそうしたアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１１７３０に示されている。図１は、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示すものである。
【００１４】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、次の配列（本明細書では、以後、「参照配列」と呼ぶ）のうちの１つを有するペプチドを包含し、その配列とは以下のとおりである。
【００１５】
【化３７】
【００１６】
【化３８】
。
【００１７】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、環化されていることもあり、または線状であることもある。環化されている場合、それらのエピトープは、任意の適する方法で環化され得る。例えば、選択されたシステイン（Ｃｙｓ）対の間にジスルフィド結合を形成して、所望の立体配座を生じさせることができる。環化エピトープの形成により、体液性応答を向上させる、従って、防護効果を向上させる立体配座を生じさせることができると考えられる。
【００１８】
配列番号２〜５によって特定されるＨＥＲ＿２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２細胞外ドメイン（配列番号１）のトラスツズマブ結合領域内のトラスツズマブと接触する３つの領域のうちの少なくとも１つの領域を含有する。２００３年、単独でのおよびトラスツズマブのＦａｂフラグメントと複合したＨＥＲ−２の細胞外領域の結晶構造が、発表された。トラスツズマブは、ループ１：５７９−５８３（Ｃ５６３−Ｃ５７６間、およびＣ５６７−Ｃ５８４間の２つのジスルフィド対合）、ループ２：５９２−５９５（Ｃ５８７−Ｃ５９６間のシステインジスルフィド対合）およびループ３：６１５−６２５（Ｃ６００−Ｃ６２３間のシステインジスルフィド）において配列番号１からの残基を含むサブドメインＩＶ内の３つのループと相互作用することが明らかになった。ループ１および３は、主として静電相互作用によるトラスツズマブとの相互作用によってさらに安定化され、これに対してループ２は、疎水性相互作用に参加する。
【００１９】
配列番号２によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質（配列番号１）の５６３〜５９８位を表す。配列番号２によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−５６３とＣｙｓ−５７６の間、Ｃｙｓ−５６７とＣｙｓ−５８４の間、および／またはＣｙｓ−５８７とＣｙｓ−５９６の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号３によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、５８５〜５９８位を表す。配列番号３によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−５８７とＣｙｓ−５９６の間のジスルフィド結合形成によって環化することができる。配列番号４によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、５９７〜６２６位を表し、下線が引かれているロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸は、ジスルフィド結合形成に干渉しないようにＣｙｓからＬｅｕに突然変異させた。配列番号４によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−６００とＣｙｓ−６２３の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号５によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、６１３〜６２６位を表し、太字Ｌｅｕアミノ酸は、本明細書中でさらに論じるように、ジスルフィド結合形成に干渉しないようにＣｙｓからＬｅｕに突然変異させた。配列番号４および５に示されているＬｅｕアミノ酸は、代替的にＣｙｓである場合があることは、理解されるであろう。
【００２０】
配列番号６〜８によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２（配列番号１）のペルツズマブ結合部位に類似した抗体を惹起するように設計された配列を表す。配列番号６によって特定されるＨＥＲ＿２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質（配列番号１）の３１５〜３３３位を表す。配列番号６によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−３１５とＣｙｓ−３３１の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号７によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、２９８〜３３３位を表す。配列番号７によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−２９９とＣｙｓ−３１１の間、および／またはＣｙｓ３１５とＣｙｓ３３１の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。配列番号８によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、２６６〜２９６位を表す。配列番号８によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、Ｃｙｓ−２６８とＣｙｓ−２９５の間のジスルフィド結合形成により環化することができる。
【００２１】
配列番号９によって特定されるＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、６２６〜６４９位を表す。この配列は、Ｃｙｓ−６２６とＣｙｓ−６３４の間、および／またはＣｙｓ−６３０とＣｙｓ−６３４の間にジスルフィド結合を有することがある。１つより多くのＣｙｓを有する各エピトープが、環化されていることもあり、または線状であることもあることは、理解されるであろう。
【００２２】
本明細書に記載するようなＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、配列番号２〜９によって特定されるエピトープの機能的等価物であるペプチドも包含する。こうした機能的等価物は、対応するＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列におけるアミノ酸の１つもしくはそれ以上が置換されている、または１つもしくはそれ以上のアミノ酸が、対応する参照配列から欠失している、もしくは対応する参照配列に付加されている、改変配列を有する。例えば、１から３個のアミノ酸がアミノ末端、カルボキシ末端または両方に付加されていることがある。一部の例では、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、グリコシル化されている。
【００２３】
他の例では、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのレトロ−インベルソ異性体であり得る。このレトロ−インベルソ修飾は、ペプチド骨格内のすべてのアミド結合の逆転を含む。この逆転は、Ｄアミノ酸をＬアミノ酸の代わりに使用することにより、配列の方向を逆転させ、各アミノ酸残基のキラリティーを反転させることによって達成することができる。このレトロ−インベルソ異性体形は、少なくとも一部のペプチド結合の平面性および配座拘束を保持する。例えば、配列番号５の非レトロ−インベルソ形は、ＮＨ２−Ｌ［ＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＬ］−ＣＯＯＨと示すことができる。配列番号５のレトロ−インベルソ形は、ＮＨ２−Ｄ［ＬＰＱＣＡＧＥＥＤＰＦＫＷＩ］−ＣＯＯＨと示すことができる。
【００２４】
非保存的アミノ酸置換および／または保存的置換を行うことができる。置換は、置換されたアミノ酸が、参照配列内の対応するアミノ酸と同様の構造的または化学的特性を有する場合、保存的アミノ酸置換である。一例として、保護的アミノ酸置換は、ある脂肪族または疎水性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、の別の脂肪族または疎水性アミノ酸での置換；あるヒドロキシ含有アミノ酸、例えばセリンおよびトレオニン、の別のヒドロキシ含有アミノ酸での置換；ある酸性残基、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸、の別の酸性残基での置換；あるアミド含有残基、例えばアスパラギンおよびグルタミン、の別のアミド含有残基との交換；ある芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシン、と別の芳香族残基との交換；ある塩基性残基、例えばリシン、アルギニンおよびヒスチジン、と別の塩基性残基との交換；ならびにある小さなアミノ酸、例えばアラニン、セリン、トレオニン、メチオニンおよびグリシン、と別の小さなアミノ酸との交換を含む。
【００２５】
一部の例では、上に示す配列のうちの１つのアミノ末端、カルボキシ末端または両方に欠失および付加がある。例えば、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープ等価物は、対応するＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一である配列は、参照配列の１０個のアミノ酸当たり１つより多くの交代、すなわち、欠失、付加または置換の一切の組み合わせを有さない。同一率は、ＤＮＡ ＳＴＡＲプログラムのＭＥＧＡＬＩＧＮプロジェクトを使用して参照配列と変異体のアミノ酸配列を比較することにより決定する。
【００２６】
対応するＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列より長い機能的等価物の場合、その機能的等価物は、野生型ＨＥＲ−２タンパク質におけるＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列およびそのＨＥＲ−２ Ｂエピトープ配列に隣接する配列と、少なくとも９０％同一である配列を有し得る。
【００２７】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの機能的等価物は、そのエピトープの配列を修飾し、その得られたポリペプチドを、免疫応答を刺激する能力、例えば抗体の産生についてアッセイすることによって、特定することができる。例えば、一般に、こうしたアッセイは、修飾ポリペプチドおよびＴｈエピトープを含むキメラペプチドを作製し、そのキメラペプチドを試験動物に注射し、抗体についてアッセイすることによって行うことができる。こうした抗体は、血清および腹水をはじめとする様々な体液において見出すことができる。簡単に言うと、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドに特異的な抗体が存在するかどうか判定することが望まれる温血動物、例えばヒト、から体液サンプルを単離する。その体液を、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドとともに、そのポリペプチドとそのタンパク質に特異的な抗体との免疫複合体を形成させるために十分な条件下、形成させるために十分な時間、インキュベートし、その後、好ましくはＥＬＩＳＡ技術を用いて、アッセイする。こうした技術では、比色変化を４９０ｎｍで測定する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対して１０，０００またはそれ以上の力価を示す抗体の産生を誘導するエピトープが有用であり得る。本明細書で用いる場合、１０，０００の力価は、バックグラウンドより０．２高い吸収値を指す。
【００２８】
本発明の他の実施形態に従って、キメラペプチド、および１つまたはそれ以上のキメラペプチドを含む組成物を提供する。様々な実施形態によると、これらのキメラペプチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、そのＨＥＲ−２ ＢエピトープをそのＴｈエピトープに連結させるリンカーとを含む。任意の適するＴｈエピトープを使用できることは理解されるであろう。例えば、プロミスカスＴｈエピトープを使用することができる。本明細書で用いる場合、「プロミスカス」Ｔｈエピトープは、ＭＨＣ拘束の回避を補助するサイトカインの放出を促進するものである。さらに、任意の適するリンカーを使用できることは理解されるであろう。例えば、使用されるＴｈエピトープに依存して、ＨＥＲ−２ ＢエピトープをそのＴｈエピトープのアミノ末端に連結させることもあり、またはカルボキシ末端に連結させることもある。Ｔｈエピトープの位置および選択は、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの構造的特徴、αヘリカルであるのか、ベータ・ターンであるのか、鎖であるのか、に依存する。適するＴｈエピトープの選択方法は、Ｋａｕｍａｙａら、「ＤＥ ＮＯＶＯ」ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ ＡＮＤ ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ ＡＳ ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ，ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），ｐｐ．１３３−１６４に記載されている。これは、特に、本明細書に参照により取り入れてられている。Ｂ細胞エピトープキメラを含有する様々なＴｈエピトープを惹起した免疫応答の概要は、Ｋａｕｍａｙａらにより「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｄｒｅａｍ ｏｒ Ｒｅａｌｉｔｙ」と題する総説に提示されており、ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．（１９９６）において発表された。
【００２９】
一部の例では、Ｔｈエピトープは、約１４から約２２個、約１５から２１個、または約１６個のアミノ酸の長さであり得る。他の実施形態における、適するＴｈエピトープの例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００３０】
【化３９】
。
【００３１】
他の例では、リンカーは、約２から約１５個のアミノ酸、約２から約１０個のアミノ酸、または約２から約６個のアミノ酸の長さのペプチドであり得る。例えば、リンカーは、アミノ酸配列 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、配列番号１８を有するペプチドであり得る。このキメラペプチドは、線状であることもあり、または環化されていることもある。加えて、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープ、Ｔｈエピトープおよび／またはリンカーは、レトロ−インベルソ形であることがある。従って、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのみが、レトロ−インベルソ形である場合がある。あるいは、ＨＥＲ−２ ＢエピトープおよびＴｈエピトープが、レトロ−インベルソ形である場合がある。もう１つの例では、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープ、Ｔｈエピトープおよびリンカーが、レトロ−インベルソ形であり得る。
【００３２】
適するキメラペプチドの例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００３３】
【化４０】
。
【００３４】
配列番号１９〜２６のペプチドは、Ｔｈエピトープ、ＧＰＳＬリンカーおよびＨＥＲ−２ Ｂエピトープを有する。
【００３５】
前記キメラペプチドおよび該ペプチドを含む組成物は、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと相互作用し、それらに結合する抗体の産生を誘導するために有用な免疫原であり得る。前記キメラペプチドは、被験者の血清中のＨＥＲ−２タンパク質に対する抗体を検出するための実験ツールとしても有用であり得る。前記キメラペプチドは、被験者において抗体応答を引き起こすことができ、そうした抗体は、（ａ）ＨＥＲ−２タンパク質を免疫沈降させることができ、（ｂ）培養でのＥＲ−２過剰発現細胞上の無傷ＨＥＲ２受容体に結合することができ、および（ｃ）インビトロでＨＥＲ−２過剰発現細胞の増殖を減少させることができる。前記キメラペプチドを使用して、被験者を免疫し、腫瘍の発現を遅らせるまたは防止することもできる。前記キメラペプチドをワクチンで使用して、防護効果をもたらすことができる。
【００３６】
本発明の追加の実施形態に従って、２つまたはそれ以上のキメラペプチドの混合物を含む組成物を提供する。一部の例では、該２つまたはそれ以上のキメラペプチドのＨＥＲ−２ Ｂエピトープは、異なる。他の例では、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの１つは、配列番号２〜５から選択され、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの別の１つは、配列番号６〜８から選択される。
【００３７】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、市販のペプチド合成装置を使用して合成することができる。例えば、Ｋａｕｍａｙａら、「ＤＥ ＮＯＶＯ」ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ ＡＮＤ ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ ＡＳ ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ，ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｄｅｓｉｇｎ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），ｐｐ １３３−１６４（これは、特に、本明細書に参照により取り入れられている）に記載されているキメラ法を使用することができる。
【００３８】
例えば、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープをＴｈエピトープと共直線的に合成して、キメラペプチドを形成することができる。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕｔ化学を用いて行うことができる。該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、任意の適する方法で環化することができる。例えば、ジスルフィド結合は、差次的に保護されたシステイン残基、ヨウ素酸化、Ａｃｍ除去およびジスルフィド結合の付随的形成を増進するための水の添加、ならびに／またはシリルクロライド−スルホキシド法を用いて実現することができる。
【００３９】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、無細胞翻訳系、および該エピトープまたはペプチドをコードしているＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ分子を使用して生産することもできる。あるいは、該エピトープまたはキメラペプチドは、それぞれのエピトープまたはキメラエピトープをコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、その後、その宿主細胞においてそれらのポリペプチドの発現を誘導することにより、作製することができる。組み換え生産については、該エピトープ、キメラペプチドまたはその変異体をコードしている配列を１つまたはそれ以上含む組み換え構築物を、従来の方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または感染、によって宿主細胞に導入する。
【００４０】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドは、従来の技術を用いて、適切なプロモーターの制御の下、例えば哺乳動物細胞、酵母、細菌、昆虫細胞または他の細胞などの適する宿主細胞において発現させることができる。適する宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｃｏｓ細胞および２９３ＨＥＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適する宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後、遠心分離によって細胞を回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を、エピトープまたはキメラペプチドのさらなる精製のために確保しておく。
【００４１】
形質転換宿主細胞から組み換えタンパク質を単離するための従来の手順、例えば、細胞ペレットまたは細胞培養基からの最初の抽出による単離、続いて、塩析そして水性イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー段階、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および親和クロマトグラフィーをはじめとする１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー段階、を用いて、組み換えポリペプチドを単離することができる。
【００４２】
グリコシル化エピトープおよびキメラペプチドを生産するには、組み換え技法を用いることができる。例えば、Ｃｏｓ−７およびＨｅｐ−Ｇ２細胞などの哺乳動物細胞をこの組み換え技法に用いることができる。あるいは、グリコシル化エピトープおよびキメラペプチドは、標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕｔ合成を用いて生産することができる。例えば、オリゴ糖転移のキー酵素としてエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いる化学酵素的アプローチを用いて、１つまたはそれ以上の糖単位をペプチドに付加させることができる。
【００４３】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの自然発生変異体も、例えば、そのポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列で適切なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、単離することができる。
【００４４】
さらなる実施形態に従って、複数の、すなわち、少なくとも２つの、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはそれらの機能的等価物とＴｈエピトープとを含む多価ペプチドを提供する。該ＨＥＲ−２ ＢエピトープおよびＴｈエピトープは、テンプレートに連結している。例えば、該ＨＥＲ−２ ＢエピトープおよびＴｈエピトープは、コアβシートテンプレートに連結していることがある。もう１つの例では、該テンプレートは、リンカーによって連結されている、交互のロイシンおよびリシン残基の２本の鎖であり得る。該リンカーは、１個のアミノ酸であるか、約２から約１５個のアミノ酸、約２から約１０個のアミノ酸、または約２から約６個のアミノ酸の長さのペプチドである。例えば、該リンカーは、アミノ酸配列 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、配列番号１８であり得る。
【００４５】
多価ペプチドは、任意の適する方法で合成することができる。例えば、多価ペプチドは、コンビナトリアルＦｍｏｃ／ｔ−ブチル、Ｆｍｏｃ／ベンジルおよびＢｏｃベンジル戦略、ならびに第四レベルの差次的保護基（Ｎｐｙｓ）戦略を用いることにより、作製することができる。こうしたアプローチの詳細は、Ｌａｒｉｍｏｒｅら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９：６０７７−６０８９（これは、特に、本明細書に参照により取り入れられている）に提示されている。
【００４６】
本発明のさらの他の実施形態に従って、本明細書で論じているＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよびキメラペプチドをコードしている、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本ポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件および／または高ストリンジェント条件下で、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列を有するポリヌクレオチドも包含する。ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されているように、その核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。本明細書で用いる用語「ストリンジェント条件」は、約Ｔｍ−５（そのプローブの融点より５℃下）からＴｍより約２０℃下までの範囲内で生ずる「ストリンジェンシー」である。本明細書で用いる「高ストリンジェント」条件は、少なくとも０．２×ＳＣＣ緩衝液および少なくとも６５℃を用いる。当該技術分野において認知されているように、ストリンジェンシー条件は、多数の因子、例えば、プローブの長さおよび性質、すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ；ターゲット配列の長さおよび性質、ハイブリダイゼーション溶液の塩および他の成分、例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール、の濃度、を変えることによって獲得することができる。すべてのこれらの因子は、上に挙げた条件と等価であるストリンジェンシー条件を生じさせるために変えることができる。
【００４７】
本発明のＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドをコードしている配列を含むポリヌクレオチドは、適する化学的方法または組み換え法を用いて、すべてまたは一部、合成することができる。ＨＥＲ−２ Ｂエピトープをコードしているポリヌクレオチドは、そのＨＥＲ−２タンパク質に免疫特異的な抗体でゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、そうしたポリヌクレオチドを含有するクローンを特定するにより、得ることができる。
【００４８】
前記ポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドの生産に有用である。例えば、多価キメラペプチドをコードしているＲＮＡ分子を無細胞翻訳系で使用して、そうしたポリペプチドを作製することができる。あるいは、ＨＥＲ−２ ＢエピトープまたはキメラペプチドをコードしているＤＮＡ分子を発現ベクターに導入し、使用して、細胞を形質転換させることができる。適する発現ベクターとしては、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター；ならびにワクシニアウイルス、アデノウイルス、伝染性上皮種ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、バキュロウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。該ＤＮＡ配列は、任意の適する手順によって発現ベクターに組み込むことができる。
【００４９】
さらなる実施形態に従って、１つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチドを１つまたはそれ以上含む組み換え構築物を提供する。適する構築物としては、例えば、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドをコードしている配列が挿入されたベクター、例えばプラスミド、ファージミドまたはウイルスベクター、が挙げられる。発現ベクターの場合、該エピトープまたはキメラペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、発現制御配列、すわなち、ｍＲＮＡ合成を指図するプロモーター、に機能的に作用するように連結されている。こうしたプロモーターの代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞におけるまたはウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。該発現ベクターは、翻訳開始および翻訳停止のためのリボソーム結合部位を含有することもある。例えば、該組み換え発現ベクターは、複製起点、および選択可能マーカー、例えば、形質転換細胞、すなわち異種ＤＮＡ配列を発現する細胞、の選択を可能にする大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子など、も含むことがある。ＨＥＲ−Ｂ細胞エピトープまたはキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を、翻訳開始および停止配列を有するフレーム内のベクターに組み込むことができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはキメラペプチドのアミノ末端に機能的に作用するように連結されているシグナル配列をさらにコードしていることがある。
【００５０】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはそうしたエピトープを含むキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチドを使用して、適する技法を用いて組み換えペプチドを発現させることができる。こうした技法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＥＲ−２ Ｂエピトープまたはそうしたエピトープを含むキメラペプチドをコードしているポリヌクレオチドを使用して、被験者を免疫することもできる。
【００５１】
尚さらなる実施形態に従って、癌の治療方法を提供する。本方法は、被験者に医薬組成物を投与することを含む。他の実施形態において、少なくとも１つのキメラペプチド、多価ペプチドもしくは両方またはそれらをコードしているポリヌクレオチドを含むワクチンを提供する。本医薬組成物は、本明細書において説明するような、医薬的に許容されるビヒクルおよび少なくとも１つのキメラペプチド、多価ペプチドもしくは両方またはそれらをコードしているポリヌクレオチドを含む。医薬的に許容されるビヒクルとしては、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、これらのビヒクルは、用いられる投薬量および濃度で被験者に対して非毒性である。
【００５２】
前記エピトープ、多価ペプチドおよびキメラペプチドまたはそれらをコードしているポリヌクレオチドに加えて、他の成分、例えば、抗原送達用のビヒクル、およびそのタンパク質の免疫原性を強化するように設計された免疫刺激物質が、本医薬組成物に含まれる。抗原送達用のビヒクルの例としては、アルミニウム塩、油中水型乳剤、生体分解性油性ビヒクル、水中油型乳剤、生体分解性マイクロカプセル、およびリポソームが挙げられる。キメラペプチドを含むワクチンのための、抗原送達に適するビヒクルは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）から成り得る生体分解性マイクロスフェアである。
【００５３】
任意の適するビヒクルを本発明の医薬組成物に用いることができるが、担体のタイプは、投与方式、および実質的な放出が望まれるかどうかに依存して変わるであろう。皮下注射などの非経口投与のための担体は、水、食塩水、アルコール、脂肪、蝋または緩衝液であり得る。生体分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）を本発明の医薬組成物用のビヒクルとして用いることもできる。一部の実施形態によると、本医薬組成物は、アジュバントを含む。
【００５４】
ＨＥＲ−２キメラおよび多価ペプチドならびにそれらをコードしているポリヌクレオチドは、被験者または細胞系統において、体液性応答および好ましくは細胞免疫応答（例えば、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞の産生）を増進または惹起するために有用であり得る。一部の例では、被験者は、ヒトである。被験者は、癌もしくはＨＥＲ−２を伴う他の癌、例えば乳癌に罹患していることあり、または正常である（すなわち、検出可能な疾病および感染がない）こともある。本医薬組成物およびワクチンは、乳癌の家族歴を有する女性または乳房腫瘍を除去した女性の治療に有用であり得る。一部の実施形態によると、「治療」は、腫瘍の増殖を阻害または遅速または遅延させることを意味する。こうした癌としては、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、三週間間隔での多数の筋肉内注射を用いて、本医薬組成物を投与する。
【実施例】
【００５５】
具体例としての方法を下で説明するが、本明細書において説明するものと同様または等価の方法および材料を本ペプチド、組成物および方法の実施または試験の際に使用することができる。本明細書において言及するすべての出版物および他の参照文献は、それら全体が参照により取り入れられている。これらの材料、方法および実施例は、単に実例となるものであり、限定と解釈しない。
【００５６】
ペプチド合成およびＨＰＬＣ精製。ペプチドは、以前に記載されている（Ｋａｕｍａｙａ １９９４）とおりに合成した。簡単に言うと、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を固体支持体（置換 ０．５４ｍｍ／ｇ）として使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００ ペプチドシンセサイザーでペプチドを合成した。４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸をリンカーとして使用するＦｍｏｃ／ｔ−ブチル合成法を用いた。最終脱保護段階後、結合した保護基およびペプチド樹脂を、９０％ＴＦＡ、５％アニソール、３％チオアニソール、２％エタンジチオールで切断した。３２．５℃でＶｙｄａｃ Ｃ４（１０ｍｍ×２５ｃｍ）カラムを使用する半分取ＨＰＬＣにより、粗製ペプチドを精製した。緩衝液は、Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡであった。ペプチドには、「プロミスカス」Ｔ細胞エピトープＭＶＦ２２８−３０２（Ｋａｕｍａｙａ １９９４）：ＤＷ１ＭＶＦ（ＨＥＲ−２ ３７６−３９５）、ＭＶＦＤＷ４（６２８−６４７）、ＤＷ５ＭＶＦ（１１５−１３６）、ＤＷ６ＭＶＦ（４１０−４２９）が組み込まれている。
【００５７】
ゲル濾過。２０ｍｇ／ｍＬの酸性化ペプチド溶液（ＤＴＴ中、０．１ｍｇ／ｍＬ）をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに充填し、５ｍＬの画分を０．１Ｍ ＨＯＡｃで溶出させた。ペプチドサンプルを２３５ｎｍで分光光度測定し、吸収値を時間に対してプロットした。０．１より高い吸収値を有し、且つ、ＤＴＴより前に溶出したサンプルをプールし、凍結乾燥させた。エルマン試薬により４１０ｎｍで反応の完了をモニターした。
【００５８】
キャピラリーゾーン電気泳動。キャピラリーゾーン電気泳動は、ＩＢＭコンピュータとインターフェースで接続されたＢｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ２１００を用いて行った。２０分にわたって５０ｃｍキャピラリーを使用して１００ｍＭホウ酸ナトリウム中でサンプルを電圧分離（１５ｋＶ）した。溶離液を２１４ｎｍでモニターした。
【００５９】
円偏光二色性および質量分析。ＩＢＭコンピュータとインターフェースで接続されたＪＡＳＣＯ Ｊ−５００分光偏光計を用いて測定を行った。この計器は、ｄ−１０−カンファースルホン酸アンモニウムの０．０６％（ｗ／ｖ）溶液で較正した。ペプチド（水でのペプチド原質の希釈により、６２．５〜２５０ｕＭ）のＣＤスペクトルを、０．１ｃｍの路長の円筒形石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ）において、周囲温度で測定した。平均残基楕円率（ｍｄｅｇ）は、［θ］＝１００θ／ｃｎｌの関係［この場合、 は、楕円率であり、ｃは、ペプチド濃度（ｍＭ）であり、ｎは、ペプチド中のアミノ酸の数であり、ｌは、路長（ｃｍ）である］を用いて計算した。高速原子衝突（ＦＡＢ）質量分光測定は、ｉｎｎｅｇａｎＭａｔ−９００装置を用いて行った。
【００６０】
酢酸水銀。ペプチドを最小量の水に溶解し、１００ｍｇ／ｍｍ Ｓ−ｔＢｕ溶液（２〜１０倍過剰）を添加した。ペプチドを真空下に置き、攪拌しながら５５℃の水浴内で２−メルカプトエタノールによって沈殿させた。湿らせたセライトに通して濾過した後、濾液を回転蒸発させ、水中の０．１％ＴＦＡで酸性化し、凍結乾燥させた。
【００６１】
生物学的手順
免疫化および動物。雌ニュージーランド白ウサギを、Ｍｏｃｈｉｃａｎ Ｖａｌｌｅｙ Ｒａｂｂｉｔｒｙ（オハイオ州、Ｌｏｕｄｅｎｖｉｌｌｅ）から入手した。ウサギを、ＣＦＡ中で乳化させた合計１ｇのペプチドで、多数の部位に皮下免疫した。初回免疫の３および６週間後、続いてブースター注射（ＰＢＳ中、１ｍｇおよび５００μｇ）を施した。血清を採取し、３０分間、５６℃に加熱することにより補体を不活性化した。血清アリコートを−５から−１５℃で保管した。抗体を硫酸アンモニウム沈殿法によって精製した：硫酸アンモニウム飽和溶液（ＳＡＳ）の保存溶液を調製し、オートクレーブで処理し、４℃に冷却した。冷室内で攪拌しながら３５％ ｖ／ｖまでＳＡＳをゆっくりと添加することにより、抗体を沈殿させた。サンプルを１４，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、上清を−２０℃で保存した。１／２原体積のペレットを０．１Ｍ ＰＢＳで溶解した。その後、画分をＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）内に配置し、＞２００体積のｐＨ８の０．１５Ｍ ＮａＣｌの頻繁な交換により透析した。数滴の０．１Ｍ ＮａＯＨでその食塩水をｐＨ８にした。ＩｇＧ濃度を、放射免疫拡散（ＲＩＤ）（英国、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）により決定した。モノクローナル抗体は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【００６２】
直接ＥＬＩＳＡ。Ｕ底ポリ塩化ビニルプラスチックアッセイプレートを、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬの１００μＬの抗原で、一晩、４℃で被覆した。非特異的結合部位を、１時間、２００μＬのＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックし、プレートをＰＢＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ウマ血清を含有するリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。ＰＢＴ中、ウサギ抗血清 １／５００またはマウス抗血清 １／５０を抗原被覆プレートに添加し、ＰＢＴ中１：２で系列希釈し、２時間、室温でインキュベートした。それらのプレートを洗浄した後、５０μＬの１／５００ ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を各ウエルに添加した。過剰な抗体コンジュゲートを除去し、５０μＬの、２４ｍＭ クエン酸中０．１５％ Ｈ２Ｏ２、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）と発色団として０．５ｍｇ／ｍＬ ２，２’−アミノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を使用して、結合抗体を検出した。発色を１０分間、進行させ、２５μＬの１％ドデシル硫酸ナトリウムで反応を停止させた。Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７００ ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４１０ｎｍで吸収を検出した。バックグラウンドを引いた後の二重反復試験ウエルの平均吸収度として結果を表示する。
【００６３】
細胞培養。保存株を５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で維持した。すべての細胞培養基、ＦＣＳおよび補足物は、ＧＥＢＣＯ（ニューヨーク州、グランドアイランド）から購入した。ヒト乳腺癌細胞系統ＳＫＢＲ−３およびＭＣＦ−７は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ＦＣＳおよびＬ−グルタミンを補足した、マッコイ５ＡまたはＤＭＥＭ中で二次培養した。１０％ＦＣＳおよびＬ−グルタミンを伴うＲＰＭＩ １６４０中でＣａｖ−１を維持した。Ｃａｖ− は、冷温保存された新鮮な結腸腫瘍検体から採取し、その後、培養した。これは、検出可能レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現しない。ＳＫＢＲ３は、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する乳房腫瘍細胞系統であるが、ＭＣＦ−７は、正常濃度のタンパク質を発現する。
【００６４】
免疫沈降法およびウエスタンブロッティング。第０日、１．０×１０７ ＳＫＢＲ３細胞を７５ｃｍ３細胞培養フラスコにプレーティングし、一晩放置して付着させた。抗ペプチド抗体（１００μｇ／ｍＬ）を４時間にわたって添加した。培地を吸引し、直ちに氷冷０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加することにより、反応を停止させた。細胞をトリプシン処理し、冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した。１００μＬのＨＢＳＳに再懸濁させた細胞に、３ｍＭのＮａ３ＶＯ４、各１０μｇ／ｍＬのアプロチニンおよびロイペプチンを含有する冷溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８；１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ）を添加した。４℃で２０分間、穏やかに回転させることによって、溶解を達成した。遠心分離（１４，０００×ｇ、２０分）して細胞破壊片を除去した後、溶解産物を３〜５μｇの抗体および３０μＬのプロテインＡ／プロテインＧ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）とともに一晩インキュベートした。遠心分離（１４，０００×ｇ、３０秒）によりビーズをペレット化し、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含有する溶解緩衝液中で２回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液中で５分、沸騰させた。
【００６５】
７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ニトロセルロースに転写し、抗体でプローブした。あらかじめ染色された分子量標準物質（ＢｉｏＲａｄ）でタンパク質転写をモニターした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを使用し、強化化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、免疫反応性ビーズを検出した。
【００６６】
間接的結合アッセイ。ＳＫＢＲ３細胞またはＭＣＦ−７細胞を、Ｖ底プレート（バージニア州、マクレーンのＬｉｎｂｒｏ）に、細胞数５，０００／ウエルでプレーティングした。それらの細胞を様々な濃度の抗体とともにインキュベートした。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス抗体とともに１時間インキュベートし、ホルマリンで固定した。マウスモノクローナルＡｂ（マサチューセッツ州、ケンブリッジのＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を正の対照として使用し、抗ＣＤ３ Ａｂを負の対照として使用した。４８８ｍｎでの励起用のアルゴンレーザーおよびＦＩＴＣ蛍光用の５２５ｒｕｎ帯域フィルターを有するＣｏｕｌｔｅｒ ＥＬＩＴＥフローサイトメーター（フロリダ州、ハイアレアのＣｏｕｌｔｅｒ）により細胞を分析し、各サンプルにつき５．０×１０３の細胞をカウントし、最終処理を行った。破壊片、細胞集塊および死滅細胞を光散乱評定により排除し、その後、単一パラメーターヒストグラムを描いた。
【００６７】
細胞増殖に対するＡｂの効果。ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７およびＣＡＶＩ細胞を、第０日に、様々濃度のＡｂとともに、Ｖ底プレートに細胞数５，０００／ウエルでプレーティングした。第３日、細胞を［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウエル）でパルスし、この時、それらを２０℃の冷凍器の中に１時間、置いた。室温で解凍した後、細胞をＰＨＤセルハーベスター（Ｃａｍｂｒｅｄｇｅ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で回収した。サンプルを５ｍＬのＲｅａｄｙ Ｓａｆｅ液体シンチレーションカクテル（Ｂｅｃｋｍａｎ）中でインキュベートし、ベータカウンターにより放射活性を判定した。結果を平均ＣＰＭ＋／−標準偏差（ＳＤ）として表示する。
【００６８】
ＣＴＬアッセイ：インビトロ刺激。鼠経および大動脈周囲リンパ節（ＬＮ）を免疫の７〜１０日後に除去する。その後、１μＭの適切なＣＴＬペプチドで１時間、予めパルスしておいた１．５×１０５の照射（１０，０００ｒａｄ）Ｐ８１５細胞と共培養することにより、ＬＮ細胞（４×１０６〜５ｘ１０６）をインビトロで刺激する。使用した培養基は、ｃＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ）である。上清は、３０Ｕ／ｍＬ（最終濃度のＩＬ−２、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５×１０５Ｍ−２−メルカプトエタノールを含有する。
【００６９】
インビトロ刺激の７日後、ＣＴＬ活性を標準的なクロム放出アッセイで試験する。Ｐ８１５細胞（１０６）を、１時間、３７℃で、適切なペプチド（１μＭ）の存在下または不在下、１５０μＣｉの［５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウムで標識し、３回洗浄する。標識されたターゲット（２×１０３）を、Ｖ底９６ウエルプレートで、２００μＬの体積で、所定の比率で刺激ＬＮ細胞とコ・インキュベートする。４時間、３７℃でインキュベートした後、上清（１００μＬ）をγ−カウンティングのために回収する。比溶解％は、１００×［（実験−自然放出）／（合計−自然放出）］（Ｖａｌｍｏｒｉら、１９９４）として計算する。
【００７０】
インビボでの抗体の効果。ＨＥＲ２細胞（３×１０６）を２５０μＬのＰＢＳに懸濁させ、氷上で２５０μＬのＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と混合し、マウスに皮下注射した。第９および１１日に、ポリクローナル抗体を２ｍｇ／マウスの合計濃度まで腹腔内注射した。週に２度、腫瘍体積は、カリパスで測定し、（長さ×幅×高さ）の式によって計算した。
【００７１】
（実施例１）
２つの天然ジスルフィド結合が組み込まれている配座ＨＥＲ−２細胞エピトープは、強化された腫瘍細胞結合を示す。
【００７２】
ヒトＥＧＦＲジスルフィド対合を規定した。ＥＧＦＲとＨＥＲ−２の間の高い相同性に基づき、Ｃｙｓ−６２６とＣｙｓ−６３４の間およびＣｙｓ−６３０とＣｙｓ−６４２の間に２つのジスルフィド結合を組み込むために６２６−６４９への６２８−６４７エピトープ。差次的側鎖保護、そして限定的脱保護、そして酸化を行うことにより、ＣＤによって判定して望ましい二次構造特性を有する環化生成物を首尾よく生成した。非近交系マウスにおいて、線状構築物と環化構築物は、両方とも、高度に免疫原性であった（力価＞２００，０００）。フローサイトメトリー分析は、環化エピトープに対する抗体が、非環化エピトープより高い親和性でＨＥＲ−２タンパク質に結合することを示した（それぞれ、平均対数蛍光２．２９および１．６５）。環化エピトープと非環化エピトープの両方に対する抗体は、足場非依存性増殖アッセイで測定したところ、ＨＥＲ−２を過剰発現する細胞において増殖を減少させることができた（それぞれ、３１および５８％阻害）。両方の構築物に対する抗体は、エフェクターヒトＰＢＭＣの存在下でＩＦＮ−γ放出を惹起することができ、環化抗体は、線状抗体と比較して２５％高いレベルのＩＦＮ−γを誘導した。環化抗体は、ＡＤＣＣアッセイでは非環化抗体と比較して２倍のレベルの特異的溶解を惹起した（それぞれ、１１および５．６％）。これらのペプチドワクチンのインビボ効果を調査するために、近交系ＦＶＢ／Ｎマウスをそれらの構築物で免疫した。両方の構築物が、これらのマウスにおいて免疫原性であり、環化構築物のほうが高い力価を生じさせた。その後、これらのマウスを、ＦＢＶ／Ｎバックグラウンドを有するＮＴ２．５腫瘍細胞系統で攻撃した。環化配座の構築物で免疫したマウスは、線状および対照ＭＶＦ免疫マウス両方と比較して、腫瘍体積の減少を有した。線状またはＭＶＦ対照ペプチド（それぞれ、４．３１および４．４８日）と比較して、環化ワクチンを投与したマウスは、最長の倍増時間（６．６３日）を有し、それにより、腫瘍増殖を妨げる最大能力を実証した。このように、これらの結果は、高親和性Ａｂを惹起するための配座ペプチドは、有効なＨｅｒ−２ワクチンの設計に直ぐに使うことができることを示している。
【００７３】
（実施例２）
新規ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープの設計および合成
表１に示すような４つの新規構築物を合成のために選択した。４つすべての構築物が、トラスツズマブと接触する３つの領域のうちの少なくとも１つの領域を含有する。ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを、ＭＶＦプロミスカスＴｈエピトープと共直線的に合成した。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕｔ化学を用いて行った。エピトープ５６３−５９８についての３つのジスルフィド結合の形成は、図２に示す差次的保護システイン残基を使用して達成した。第一のジスルフィド結合は、ヨウ素酸化を用いて形成する。水の添加により、Ａｃｍ除去、およびＣ５６７とＣ５８４の間のジスルフィド結合の付随的形成を増進する。Ｃ５６３とＣ５７６の間の最後のジスルフィド結合は、シリルクロライド−スルホキシド法を用いて形成する。
【００７４】
【化４１】
表１は、ＨＥＲ−２／ヘルセプチン構造からの候補ペプチドワクチンを示すものである。イタリック体で示されているプロミスカスＴヘルパーエピトープ配列は、４残基ターン配列（ＧＰＳＬ）によりＢ細胞エピトープに連結している。下線が引かれているアミノ酸は、天然ジスルフィド結合に緩衝しないように、ＣｙｓからＬｅｕに突然変異させた。
【００７５】
（実施例３）
ＨＥＲ−２ペプチドの免疫原性
表１に記載した４つの構築物の免疫原性は、ジスルフィド結合構築物と線状構築物の両方を使用し、ＦＢＶ／ｎマウス（ｎ＝４〜９）週齢６〜８週の群に免疫することにより判定した。５６３−５９８環化および非環化構築物の両方が、高度に免疫原性であった（図３Ａ）。第三回免疫の３週後には、すべてのマウスが、１２０，０００より高い力価を有し、環化構築物（ＭＶＦ５６３ＳＳ）での２匹のマウスは、２５０，０００より高い力価を有した。５８５−５９８構築物は、最小の免疫原性であることが判明し（図３Ｂ）、第三回免疫の３週間後、環化（ＳＳ）群と線状（ＮＣ）群の両方からの１匹のマウスだけが、１２０，０００より高い力価を有し、平均力価は、約５８，０００であった。５９７−６２６ペプチド構築物と６１３−６２６ペプチド構築物の両方が、高度に免疫原性であった（図３Ｃ、Ｄ）。環化形の５９７−６２６を受けた３匹のマウスは、１２０，０００より高い力価を有したが、線状形を受けたいずれのマウスも、１２０，０００より高い力価を有さなかった。
【００７６】
次に、本発明者らは、Ｇｕｙらによって開発されたｎｅｕ−ＮトランスジェニックマウスにおいてＢ細胞エピトープの免疫原性を試験した。これらのｎｅｕ−Ｎトランスジェニックマウスは、ｎｅｕ特異的全細胞ワクチンで免疫したとき、ｎｅｕ特異的ＩｇＧの基底レベルが低かったにもかかわらず、ＦＶＢ／ｎマウスにおいて見られるものと同様のペプチド構築物に対するＡｂの高い力価（データは示さない）を惹起した。
【００７７】
（実施例４）
ヘルセプチン結合ペプチドとヘルセプチン（トラスツズマブ）の交差反応性
ＥＬＩＳＡにより、トラスツズマブ結合部位からの配座ペプチドがヘルセプチンを認識できるかどうかを試験した。図４に示すように、５６３−６２６の結合領域内の様々なペプチドが、トラスツズマブと結合した。最大の結合は、３つのジスルフィド対合を有する環化エピトープ５６３−５９８で発生した。この結果は、グリコシル化に起因するＨＥＲ−２への抗体のＦＡＣＳ結合とは対照的である。
【００７８】
（実施例５）
ペプチド抗体とＨＥＲ−２タンパク質の交差反応性
ヘルセプチン−ペプチドエピトープにより惹起された抗体が、ＨＥＲ−２受容体を認識するそれらの能力に差を示すかどうかを判定するために、ＨＥＲ−２過剰発現ヒト乳癌細胞系統ＢＴ４７４へのＦＢＶ／ｎ精製抗体の結合を試験した。図５Ｃ、Ｄは、５９７−６２６構築物と６１３−６２６構築物の両方が、正常マウス抗体に比べてシフトしていることを示している。しかし、５６３−５９８および５８５−５９８構築物は、正常マウス抗体と比較して殆どシフトを示さなかった（図５Ａ、Ｂ）。５６３−５９８は、ＨＥＲ−２がトラスツズマブと共に作る３つの構築物のうちの２つを含有する。トラスツズマブとの最後の接点を含む５９７−６２６エピトープは、天然タンパク質を認識する１１のアミノ酸から成る（図５Ｃ）。この配列６１３−６２６のさらに短いバージョンも、同様に天然タンパク質を認識する（図５Ｄ）。エピトープ５６３−５９８および５８５−５９８の認識の欠如についての尤もらしい説明は、残基５７１−５７３に潜在的グリコシル化部位（ＮＧＳ）があり、その大きな嵩高い糖部分が立体的に干渉し、そのエピトープの結合を妨げるということである。
【００７９】
（実施例６）
腫瘍攻撃
Ｂ細胞エピトープワクチンへの配座拘束の導入に随伴する潜在的な臨床的利点をさらに良好に理解するために、ＦＶＢ／ｎマウスとｎｅｕ−Ｎトランスジェニックマウスの両方を、ｎｅｕ−Ｎトランスジェニックマウスから単離した自然発生乳房腫瘍から採取した腫瘍細胞系統ＮＴ２．５で攻撃した。ｎｅｕ過剰発現の結果として、これらのマウスは、ヒト乳癌患者において観察されるものと同様の様式で自然発生乳腺癌を発症し、従って、ヒト乳癌研究の適するモデルである。ＦＶＢ／ｎマウスの群を、最終免疫の２週間後に５×１０６のＮＴ２．５細胞で皮下攻撃した（下腹部）。第５５日まで週に２度、腫瘍測定を行った。腫瘍体積は、（長いほうの測定値×短いほうの測定値２）／２の式によって計算した。第３０日の後、ＦＢＶ／ｎマウスの腫瘍は退縮し始める（これは、腫瘍の拒絶を示す）ことに留意すること。ＦＢＶ／ｎマウスを使用するその後の腫瘍研究に関しては、第３０日まで腫瘍を測定した。５６３−５９８ＮＣおよびＳＳ構築物で免疫したマウスは、第３０日に、それぞれ、１６６．５１７および１７３．７２９２ｍｍ３の平均腫瘍体積を有し、一方、免疫しなかったマウスは、３４６．６５６３ｍｍ３の平均腫瘍体積を有した（データは示さない）。第３３日には、６１３−６２６および５８５−５９８ＣＹＣで免疫したマウスは、免疫しなかったマウスとＭＶＦで免疫したマウスの両方と比較して、腫瘍体積の低減を示した。トラスツズマブＢ細胞エピトープで免疫したマウスの腫瘍負荷の低減の点で何らかの適度な成功があるように見えるが、ほぼすべてのマウスが腫瘍を発症した。
【００８０】
（実施例７）
新規ペルツズマブ結合配座Ｂ細胞エピトープの設計および評価
表２に記載する３つのペプチド配列は、ペルツズマブ結合部位に類似した抗体を惹起する最小配列をさらに描写するために設計した。これらの複合配座ペプチドエピトープを合成し、首尾よく精製し、適正なジスルフィド対合で環化した。エピトープ２６６−２９６（Ｃｙｓ２６８−Ｃｙｓ２９５間のＳＨ結合）、エピトープ２９８−３３３（Ｃｙｓ２９９−Ｃｙｓ３１１間のＳＨ結合）およびエピトープ３１５−３３３（Ｃｙｓ３１５−Ｃｙｓ３３１間のＳＨ結合）により、最小ペルツズマブ結合エピトープを描写することができよう。
【００８１】
【化４２】
追加の結果は、図６〜３０に示す。
【００８２】
本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができ、本発明を、本明細書に記載することに限定されるものと見なすべきでないことは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
後続の「発明の実施形態の詳細な説明」は、以下の図面にともに読むと、最もよく理解することができる。以下の図面では、同じ構造は、同じ参照番号で示されている。
【図１】ＨＥＲ−２タンパク質配列を図示する図である。
【図２】３つのジスルフィド対合の合成戦略を示す図である。差次的システイン保護および選択的除去および酸化を用いて、図示されているような正しいジスルフィド対合を生じさせた。
【図３】ＦＶＢ／ｎマウスにおける免疫応答を示す図である。４から１０匹のＦＶＢ／ｎマウスの群を、線状（ＮＣ）もしくはジスルフィド結合（ＳＳ）ペプチド構築物（Ａ）ＭＶＦ５６３−５９８、（Ｂ）ＭＶＦ５８５−５９８、（Ｃ）ＭＶＦ５９７−６２６、または線状ペプチド（Ｄ）ＭＶＦ６１３−６２６で免疫した。各マウスを個々の棒として表す。ＡのスケールがＢ〜Ｄとは異なることに注意すること。
【図４】トラスツズマブが、ＨＥＲ−２のトラスツズマブ結合部位を模倣して設計されたペプチドエピトープを特異的に認識することを示す図である。これらのペプチド配列をｘ軸に与える。ＭＶＦ３１６−３３９は、Ｈｅｒ−２非該当対照ペプチドである。
【図５】ヒト乳癌細胞過剰発現性ＨＥＲ−２とペプチド特異的抗体のフローサイトメトリーを示す図である。フローサイトメトリーを用いて、様々な構築物により誘導されたＦＢＶ／ｎマウスからの抗体が天然ＨＥＲ−２を認識するかどうかを評定した。ＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞（ＨＥＲ−２ｈｉｇｈ）を、１０μｇ／ｍＬの正常マウスＩｇ（負の対照）、マウスモノクローナルＡｂ−２（正の対照）、またはＦＢＶ／ｎマウスにおいて産生させたペプチド抗体で処理した。
【図６】ＨＥＲ−２とのペルツズマブ結合部位を示す図である。
【図７】ヘルセプチンペプチドエピトープの３次元構造を示す図である。
【図８】Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標）（ペルツズマブ）に結合したＨＥＲ−２の構造を示す図である。
【図９】ＨＥＲ−２−トランスツズマブ結合部位を示す図である。（Ａ）ＨＥＲ−２とトラスツズマブのＨおよびＬ鎖との複合体のリボン図。（Ｂ）ＨＥＲ−２のトラスツズマブ結合部位。この領域にはジスルフィドが豊富である。トラスツズマブと相互作用する３つのループの配列を示す。
【図１０】ペプチドへのトラスツズマブの結合を示す図である。マイクロタイターウエルを２μｇ／ｍＬの様々なペプチドで一晩被覆し、その後、１％ＢＳＡで１時間ブロックした。その後、トラスツズマブを２０００μｇ／ｍＬの濃度でプレートに添加し、ＰＢＴで１：２系列希釈した。結合したトラスツズマブをＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧで検出し、その後、基質で検出した。（Ａ）２０００μｇ／ｍＬのトラスツズマブを使用した、表Ｉからのペプチドおよび非該当対照ペプチド（ＭＶＦ３１６−３３９）についてのＯＤ４１５値。示されている値は、二重反復試験サンプルの平均である。エラーバーによりＳＥＭを示す。（Ｂ）ジスルフィド結合（ＣＹＣ）および線状（ＮＣ）形のＭＶＦ５６３−５９８とともに非該当対照ペプチド（ＭＶＦ３１６−３３９）でのトラスツズマブの力価測定。
【図１１】ＭＴＴアッセイによる細胞増殖を示す図である。ＢＴ４７４細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートに細胞数２×１０４／ウエルでプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。指示濃度のペプチドを伴うまたは伴わない、トラスツズマブまたは正常ヒトＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを、各ウエルに添加した。それらのプレートを３日間、３７℃でインキュベートした。ＭＴＴを用い、ＯＤ５７０を読み取ることにより、生細胞数を測定した。阻害率は、（ＯＤ正常ヒトＩｇＧ − ＯＤトラスツズマブ ＋ ペプチド）／ＯＤ正常ヒトＩｇＧ × １００の式を用いて計算した。示されている値は、三重反復試験サンプルの平均である。エラーバーによりＳＥＭを示す。
【図１２】ＦＶＢ／ｎ（Ａ）およびＮｅｕ−Ｎ（Ｂ）トランスジェニックマウスにおけるペプチドに対する抗体応答を示す図である。環化（ＣＹＣ）および線状（ＮＣ）構築物で免疫したマウスからの血清に対して直接ＥＬＩＳＡを行って、免疫原性の差を判定した。対応する免疫原に対する抗体力価は、０．２以上の吸収度を有する最高希釈度の逆数と定義した。各棒は、個々のマウスを表す。ｘ軸上の記号は、血清をサンプリングした時間を表し、例えば、１ｙ＋３は、初回免疫から３週間後に採取した血清に対応する。Ｎｅｕ−Ｎは、ＦＶＢ／ｎバックグラウンドを有し、乳房特異的プロモーターの制御下で正常ラットｎｅｕ癌原遺伝子を発現する。これらのマウスは、非トランスジェニックマウスと比べてｎｅｕに対して耐性を示す。Ｂは、これらのマウスはラットｎｅｕに対して耐性であるが、ペプチド免疫原に対する免疫応答を生じさせることができることを明示している。
【図１３】ＨＥＲ−２に対するペプチド抗体の交差反応性を示す図である。免疫されたマウス血清からの精製抗体の反応性を、フローサイトメトリー分析を用いて、（Ａ）ＢＴ４７４および（Ｂ）ＳＫＢＲ−３乳癌細胞系統で試験した。Ａｂ結合が、ヤギ抗マウスＦＩＴＣコンジュゲート化ａｂで検出された。ｘ軸は、蛍光強度を表し、ｙ軸は、相対細胞数を表す。各ヒストグラムは、マウスプレＩｇＧと、ペプチド抗体と、ＡＢ２（ＨＥＲ−２に結合するマウスｍＡｂ）とのオーバーレイを含む。両方の細胞系統が、エピトープ５６３−５９８および５８５−５９８からのＡｂはＨＥＲ−２を認識しないが、エピトープ５９７−６２６および６１３−６２６からのＡｂはＨＥＲ−２を認識することを明示している。
【図１４】ＭＶＦおよびＢ細胞エピトープの独立した折り畳みを可能にするフレキシブルリンカー（ＧＰＳＬ）によりＢ細胞エピトープと共直線的に合成された「プロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔｈ細胞エピトープＭＶＦから成るキメラペプチドワクチン構築物の略図を示す。この組み合わせは、免疫系の体液性アームと生得的アームの両方の活性化による最適な抗体産生の惹起を助長し得る。
【図１５】ヨウ素酸化を用いて、Ｃｙｓ２６８とＣｙｓ２９５の間に自然発生ジスルフィド結合を形成したことを示す図である。
【図１６】ＭＶＦ ＨＥＲ２（２６６−２９６）非環化（ＮＣ）および環化（ＣＹＣ）ペプチドで免疫したＮＺＷウサギにおける免疫原性を示す図である。血清を週に１度採取し、診断試験に使用するために抗体を精製する。抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡによって決定する。
【図１７】Ａ）ＭＶＦ ＨＥＲ２（２６６−２９６）環化（ＣＹＣ）または非環化（ＮＣ）ペプチドのいずれかで免疫したＷＴ ＦＶＢ／ｎマウスにおける免疫原性（マウス数８／群）、Ｂ）ＦＶＢ／ｎバックグラウンドを有する３匹のＮｅｗ過剰発現マウスにおける免疫原性を示す図である。抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡによって決定する。
【図１８】ヘルセプチンと相互作用するＨＥＲ−２の細胞外ドメインのリボン構造を示す図である。矢印は、ＨＥＲ−２がヘルセプチンと接触する３つのループを示している。
【図１９】水中のＨｅｒ−２ ５６３−５９８ ＣＹＣおよびＨｅｒ−２ ５６３−５９８ ＮＣの１００ｕＭ溶液を使用して行ったＣＤ分光測定値を示す図である。３つのジスルフィド結合で拘束されているエピトープＨＥＲ−２ ５６３−５９８ ＣＹＣは、１９３ｎｍでＣＤ楕円率最小を示すが、エピトープＨＥＲ−２ ５６３−５９８ ＮＣ非拘束ペプチドは、２０４ｎｍでＣＤ楕円率最小を示す。これは、二次構造の有意な差を明示している。
【図２０】ＨＥＲ２ ５６３−５９８エピトープと、遊離スルフヒドリル基を攻撃し、よってジスルフィド対合の完成を判定するために用いることができるビオチン化剤を使用する選択的酸化、還元およびジスルフィド結合分析のための戦略とを示す図である。
【図２１】位置選択的ジスルフィド形成を示す図である。残基３１５および３３１についての側鎖保護は、トリチルであり、これを樹脂からの切断により適便に除去した。２９９および３１１のシステイン残基の側鎖は、Ａｃｍで保護した。これを、酸化（Ｉ２）により、第一環化後、選択的に除去し、環化することができる。
【図２２】非近交系ＮＺＷウサギ（Ａ）および近交系マウスＦＶＢ／ｎマウス（Ｂ）におけるペプチドに対する抗体応答を示す図である。環化（ＣＹＣ）および線状（ＮＣ）構築物で免疫した動物からの血清に対して直接ＥＬＩＳＡを行って、免疫原性の差を判定した。対応する免疫原に対する抗体力価は、０．２以上の吸収度を有する最高希釈度の逆数と定義した。各棒は、個々のマウスを表す。ｘ軸上の呼称は、血清をサンプリングした時間を表し、例えば、１ｙ＋３は、初回免疫の３週間後に採取した血清に対応する。
【図２３】ＨＥＲ−２に対するペプチド抗体の交差反応性を示す図である。免疫されたウサギ血清からの精製抗体の反応性を、フローサイトメトリー分析を用いて、（Ａ）ＢＴ４７４（ＨＥＲ−２ｈｉｇｈ）および（Ｂ）ＭＤＡ４６８（ＨＥＲ−２ｌｏｗ）乳癌細胞系統で試験した。Ａｂ結合が、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣコンジュゲート化ａｂで検出された。ｘ軸は、蛍光強度を表し、ｙ軸は、相対細胞数を表す。各ヒストグラムは、ウサギプレＩｇＧと、ペプチド抗体と、ヘルセプチン（ＨＥＲ−２に結合するヒトｍＡｂ）とのオーバーレイを含む。
【図２４】ペプチド抗体が、インビトロでＢＴ４７４乳癌細胞に対するＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）を誘導することを示す図である。ターゲット細胞系統ＢＴ４７４を、Ｎａ５１ＣｒＯ４の存在下で１時間、ウサギからのペプチド抗体、正常ウサギＩｇＧまたはヘルセプチンとともにインキュベートした。３回洗浄した後、ターゲット細胞をヒトＰＢＭＣエフェクター細胞とともに４時間、３７℃で培養して１００：１、２０：１および４：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比にした。その後、上清を回収し、γ−カウンターを使用して放射活性を決定した。細胞傷害性は、１００×（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）の式から計算した（この式中、Ａは、試験上清からの５１Ｃｒ（ｃｐｍ）を表し、Ｂは、単独での培養（自然発生）でのターゲットからの５１Ｃｒ（ｃｐｍ）を表し、およびＣは、５％ＳＤＳで溶解した細胞からの最大５１Ｃｒ放出を表す。
【図２５】ＭＶＦおよびＢ細胞エピトープの独立した折り畳みを可能にするフレキシブルリンカー（ＧＰＳＬ）によりＢ細胞エピトープ（ＨＥＲ−２（２６６−２９６））と共直線的に合成された麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ、残基２８８−３０２）から誘導された「プロミスカス」ＴＨ細胞エピトープから成るキメラペプチドワクチン構築物の略図である。
【図２６】前負荷Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＣＬＥＡＲ Ａｃｉｄ樹脂を使用して固相ペプチド合成を行ったことを示す図である。試薬Ｂ（ＴＦＡ：フェノール：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ、９０：４：４：１）を使用してペプチドを切断し、粗製ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ヨウ素酸化を用いて、Ｃｙｓ２６８とＣｙｓ２９５の間に自然発生ジスルフィド結合を形成した。
【図２７】Ａ）ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）非環化および環化ペプチドで免疫したＮＺＷウサギマウスの抗体力価、Ｂ）ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）非環化および環化ペプチドで免疫した野生型ＦＶＢ／ｎマウスの抗体力価、Ｃ）ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）で免疫したＮｅｕ過剰発現性ＦＢＶ／ｎマウスの抗体力価を示す図である。血清は、週に１度採取し、抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡによって決定した。
【図２８】ヒトＢＴ４７４ ＨＥＲ−２過剰発現性腫瘍細胞（Ａ）およびマウスＮＴ２．５ ｎｅｕ過剰発現性腫瘍細胞（Ｂ）上の天然タンパク質に結合する能力について試験した、精製ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２６９）環化および非環化抗体を示す図である。両方の抗体が、正常ＩｇＧアイソタイプ対照と比較してシフトしており、また正の対照（ＢＴ４７４についてはヘルセプチン、およびＮＴ２．５については抗−ｃ−ＥｒｂＢ２／ｃ−Ｎｅｕ（Ａｂ−４））と比較して同様の結合を有した。
【図２９】ＢＴＢ４７４細胞を、精製ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）環化および非環化抗体ならびに５１Ｃｒとともにインキュベートし、その後、それらの抗体結合細胞をヒトＰＢＭＣに暴露し、これによりＢＴ４７４細胞に関する免疫溶解を行うことによって判定した、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を示す図である。
【図３０】３×１０６のＮＴ２．５細胞で皮下攻撃し、腫瘍増殖を２４日間モニターした、図３Ｂからの野生型ＦＢＶ／ｎマウスを示す図である。ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）環化および非環化治療マウスでは、ＭＶＦのみで免疫したマウスと比較して、腫瘍発現（Ａ）および増殖（Ｂ）が遅延された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
から選択される配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
線状である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
環化された、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
レトロ−インベルソ形である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
グリコシル化されている、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
【化２】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
【化３】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
【化４】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
【化５】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
【化６】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
【化７】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
【化８】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
キメラペプチドを含む組成物であって、
該キメラペプチドが、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含み、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化９】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化１０】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、１〜１５アミノ酸である、組成物。
【請求項１４】
２つまたはそれ以上の前記キメラペプチドの混合物をさらに含む組成物であって、該２つまたはそれ以上のキメラペプチドの各々のＨＥＲ−２ Ｂエピトープが異なる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの１つが、
【化１１】
から選択され、且つ、前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの別の１つが、
【化１２】
【化１３】
から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの少なくとも１つ、前記Ｔｈエピトープまたは前記リンカーが、レトロ−インベルソ形である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１４】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リンカーが、２から１５個のアミノ酸を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リンカーが、
【化１５】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１６】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１７】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１８】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２３】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１９】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２０】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２１】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２２】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２３】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２８】
ＨＥＲ−２タンパク質の免疫応答を刺激するための組成物であって、該組成物は、多価ペプチドであり、２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ ＢエピトープとＴｈ細胞エピトープとテンプレートとを含み、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々が、互いに異なり、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々の配列が、
【化２４】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化２５】
から選択される配列を含み；
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよび該Ｔｈ細胞エピトープが、該テンプレートに結合しており；ならびに
該テンプレートが、１〜１５アミノ酸のリンカーによって連結された交互のロイシンおよびリシン残基の２本の鎖を含む、
組成物。
【請求項２９】
キメラペプチドを被験者に投与することを含む、該被験者における免疫応答を刺激する方法であって、
該キメラペプチドが、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含み、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化２６】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化２７】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、２〜１５アミノ酸である、方法。
【請求項３０】
多価ペプチドを被験者に投与することを含む、該被験者における免疫応答を刺激する方法であって、
該多価ペプチドが、２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープ、Ｔｈ細胞エピトープおよびテンプレートを含み、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々が、互いに異なり、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々の配列が、
【化２８】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化２９】
から選択される配列を含み；
該ＨＥＲ−２タンパク質の免疫原性エピトープおよび該Ｔｈ細胞エピトープが、該テンプレートに結合しており；ならびに
該テンプレートが、１〜１５アミノ酸のリンカーによって連結された交互のロイシンおよびリシン残基の２本の鎖を含む、方法。
【請求項３１】
医薬的に許容されるビヒクルとキメラペプチドとを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、該被験者において癌を治療する方法であって、
該キメラペプチドが、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含み、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化３０】
【化３１】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化３２】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、２〜１５アミノ酸である、方法。
【請求項３２】
前記被験者が、ヒトであり、かつ乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌および大腸癌のうちの１つを有する、または乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌および大腸癌のうちの１つについての素因を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、乳癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬組成物が、キメラペプチドの混合物をさらに含み；
該混合物が、２つまたはそれ以上のキメラペプチドを含み；および
該２つまたはそれ以上のキメラペプチドの各々が、前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、前記Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結する前記リンカーとを含み、該２つまたはそれ以上のキメラペプチドの各々のＨＥＲ−２ Ｂエピトープが、互いに異なる、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含むワクチンであって、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化３３】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化３４】
【化３５】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、１〜１５アミノ酸である、ワクチン。
【請求項３６】
少なくとも１つの追加のＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該追加のＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとをさらに含み、該少なくとも１つの追加のＨＥＲ−２ Ｂエピトープが、前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープとは異なる、請求項３５に記載のワクチン。
【請求項１】
【化１】
から選択される配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
線状である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
環化された、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
レトロ−インベルソ形である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
グリコシル化されている、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
【化２】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
【化３】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
【化４】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
【化５】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
【化６】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
【化７】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
【化８】
の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
キメラペプチドを含む組成物であって、
該キメラペプチドが、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含み、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化９】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化１０】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、１〜１５アミノ酸である、組成物。
【請求項１４】
２つまたはそれ以上の前記キメラペプチドの混合物をさらに含む組成物であって、該２つまたはそれ以上のキメラペプチドの各々のＨＥＲ−２ Ｂエピトープが異なる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの１つが、
【化１１】
から選択され、且つ、前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの別の１つが、
【化１２】
【化１３】
から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープのうちの少なくとも１つ、前記Ｔｈエピトープまたは前記リンカーが、レトロ−インベルソ形である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１４】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リンカーが、２から１５個のアミノ酸を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リンカーが、
【化１５】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１６】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１７】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１８】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２３】
前記Ｔｈエピトープが、
【化１９】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２０】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２１】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２２】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記Ｔｈエピトープが、
【化２３】
の配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２８】
ＨＥＲ−２タンパク質の免疫応答を刺激するための組成物であって、該組成物は、多価ペプチドであり、２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ ＢエピトープとＴｈ細胞エピトープとテンプレートとを含み、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々が、互いに異なり、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々の配列が、
【化２４】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化２５】
から選択される配列を含み；
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープおよび該Ｔｈ細胞エピトープが、該テンプレートに結合しており；ならびに
該テンプレートが、１〜１５アミノ酸のリンカーによって連結された交互のロイシンおよびリシン残基の２本の鎖を含む、
組成物。
【請求項２９】
キメラペプチドを被験者に投与することを含む、該被験者における免疫応答を刺激する方法であって、
該キメラペプチドが、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含み、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化２６】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化２７】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、２〜１５アミノ酸である、方法。
【請求項３０】
多価ペプチドを被験者に投与することを含む、該被験者における免疫応答を刺激する方法であって、
該多価ペプチドが、２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープ、Ｔｈ細胞エピトープおよびテンプレートを含み、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々が、互いに異なり、
該２つまたはそれ以上のＨＥＲ−２ Ｂエピトープの各々の配列が、
【化２８】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化２９】
から選択される配列を含み；
該ＨＥＲ−２タンパク質の免疫原性エピトープおよび該Ｔｈ細胞エピトープが、該テンプレートに結合しており；ならびに
該テンプレートが、１〜１５アミノ酸のリンカーによって連結された交互のロイシンおよびリシン残基の２本の鎖を含む、方法。
【請求項３１】
医薬的に許容されるビヒクルとキメラペプチドとを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、該被験者において癌を治療する方法であって、
該キメラペプチドが、ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含み、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化３０】
【化３１】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化３２】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、２〜１５アミノ酸である、方法。
【請求項３２】
前記被験者が、ヒトであり、かつ乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌および大腸癌のうちの１つを有する、または乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌および大腸癌のうちの１つについての素因を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、乳癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬組成物が、キメラペプチドの混合物をさらに含み；
該混合物が、２つまたはそれ以上のキメラペプチドを含み；および
該２つまたはそれ以上のキメラペプチドの各々が、前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、前記Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結する前記リンカーとを含み、該２つまたはそれ以上のキメラペプチドの各々のＨＥＲ−２ Ｂエピトープが、互いに異なる、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとを含むワクチンであって、
該ＨＥＲ−２ Ｂエピトープの配列が、
【化３３】
から選択され；
該Ｔｈエピトープが、
【化３４】
【化３５】
から選択される配列を含み；および
該リンカーが、１〜１５アミノ酸である、ワクチン。
【請求項３６】
少なくとも１つの追加のＨＥＲ−２ Ｂエピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、該追加のＨＥＲ−２ Ｂエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するリンカーとをさらに含み、該少なくとも１つの追加のＨＥＲ−２ Ｂエピトープが、前記ＨＥＲ−２ Ｂエピトープとは異なる、請求項３５に記載のワクチン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公表番号】特表２００９−５００２９８（Ｐ２００９−５００２９８Ａ）
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１７１９３（Ｐ２００８−５１７１９３）
【出願日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３６７２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３８６７５
【国際公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【出願人】（５０４３２５２８７）ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３６７２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３８６７５
【国際公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【出願人】（５０４３２５２８７）ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション (24)
【Ｆターム（参考）】
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